CN109705194B - 一种促进aiv和/或ndv疫苗的免疫反应的法氏囊活性五肽及应用 - Google Patents
一种促进aiv和/或ndv疫苗的免疫反应的法氏囊活性五肽及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种促进AIV和/或NDV疫苗的免疫反应的法氏囊活性五肽及应用。本发明所述的法氏囊活性五肽，氨基酸组成为Met Pro Pro Thr His，结构简单，免疫原性极弱。本发明活性肽具有促进疫苗免疫反应的功能，在小鼠免疫实验中，不仅促进免疫小鼠产生AIV特异的抗体反应，而且促进免疫小鼠产生NDV特异的抗体反应。此外，还促进细胞免疫反应、抗原递呈反应，并提高免疫鸡的疫苗免疫效力，可作为疫苗佐剂或免疫增强剂应用于动物疫苗应用研究，以提高动物机体针对特异抗原的免疫应答能力，提高疫苗的免疫效力，从而提高动物机体抗疫病感染的能力。
Description
技术领域
本发明属于兽医生物制品技术领域，具体涉及一种具有促进疫苗AIV和/或与NDV二联疫苗的免疫反应的法氏囊活性五肽及其应用。
背景技术
禽流感(avian influenza，AI)是由正粘病毒科A型流感病毒(Avian influenzavirus，AIV)引起的禽类高度接触性传染病,其临床症状不均一，有的不表现出临床症状，有的表现为产蛋下降和呼吸道疾病，甚至导致全身性疾病，死亡率可达100％。根据致病性的不同，可分为高致病性禽流感病毒和低致病性禽流感病毒。目前，中国的低致病性禽流感疫情主要以H9亚型为主。该亚型禽流感病毒虽然不引起感染的禽类大量死亡，但是由于该病毒传播能力极强，存在范围极广，导致产蛋下降、免疫抑制病、与其他病原共感染时常导致高死亡率，给我国养禽业造成了巨大的经济损失。
禽流感是传播速度快，感染率高变异性极高的一种急性传染病。随着药物用量加大，病毒变异的能力也在加强。令人关注的是2013年中国暴发的H7N9禽流感，其能感染人并导致人类死亡。通过对其各个片段的基因分析发现，发现其内部基因与H9N2高度同源，也证实了该病毒已经发生了重组。这些大量报道禽流感病毒跨越种间障碍直接传播给了人类的事件，已经越来越多的引起了社会的关注，而其对应的公共卫生意义也日益突显。
禽流感不仅禽类发生，人类也会被感染，随着候鸟迁徙以及牲畜间的相互传播，使禽流感防控日益严峻。近年来由于我国农业产业结构不断调整，畜牧规模化水平不断提高，尤其是养鸡场数量不断增加，鸡的染病率升高，尤其禽流感风险极大。因此国家必须加大对禽流感的研究与防控。
接种疫苗是预防禽流感发生与传播最有效的手段之一，对提高我国的禽病防制水平，和保障我国养禽业的健康发展有十分积极的意义。临床应用表明，现有的H9N2亚型AIV灭活疫苗免疫鸡只后，尽管能使鸡只产生较高的抗体，但已经不能有效地保护其免受当前H9N2亚型AIV流行株的攻击。而且，使用单苗免疫会消耗大量人力物力，免疫次数的增加的同时会加强鸡群的应激反应。因而，提供一种价格低、安全、无残留的高效促进疫苗免疫效果的新型活性肽，可作为疫苗佐剂或免疫增强剂应用于动物疫苗应用研究，以提高动物机体针对特异抗原的免疫应答能力，提高疫苗的免疫效力，从而提高动物机体抗疫病感染的能力，可应用于基础免疫研究、临床应用研究等领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种安全可靠、价格低廉、无残留的高效促进疫苗免疫效果的新型活性肽，作为疫苗佐剂或免疫增强剂应用于动物疫苗应用研究，以此提高动物机体针对特异抗原的免疫应答能力，从而提高动物机体抗疫病感染的能力，可应用于基础免疫研究、临床应用研究等领域。
本发明所述的法氏囊多肽可用于H9N2亚型禽流感病毒、新城疫经典毒株(LaSota)的二联灭活疫苗，H9N2亚型禽流感灭活疫苗、新城疫灭活疫苗等，并对它们的免疫效果进行初探，以期为后续的灭活疫苗研制提供依据。
本发明所述的目的通过以下方案实现：
一种法氏囊多肽五肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，为：5’-Met Pro ProThr His-3’。
本发明所述法氏囊多肽五肽在制备免疫疫苗药物中的应用，优选的在制备畜禽免疫疫苗中的应用，特别优选在制备预防禽流感和/或新城疫的疫苗佐剂中的应用。
一种预防禽流感的免疫组合物，包含禽流感疫苗和/或新城疫的疫苗，及本发明所述的法氏囊多肽五肽。
本发明所述法氏囊多肽五肽优选以2～255μg/mL计量存在于免疫组合物中，更优选10～250μg/mL，进一步优选50～250μg/mL。在一种具体的实施方式中，本发明所述的法氏囊多肽五肽可以以以下计量存在于免疫组合物中：50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL、200ug/mL、250ug/mL。
本发明通过超滤、分子筛等技术，回收分子量小于1kDa的有效成分(即粗提物)。经真空干燥浓缩，然后采用反向高效液相色谱(RP-HPLC)进行分离、纯化，收获洗脱峰值时间为10.067分钟的法氏囊多肽成分。经MODIL-TOF质谱分析，测定该法氏囊活性肽的分子量为581.30(m/z)，并进一步通过MS/MS分析，获得了完整的氨基酸序列，MPPTH(即5’-Met ProPro Thr His-3’，序列1)，并命名为法氏囊五肽(五肽)。
本发明还提供一种更为具体的法氏囊多肽五肽的制备：
以50g健康肉鸡法氏囊组织为原料，剪去脂肪组织后，采用冷冻、超声破碎、高速离心、液体上清分子筛分离等技术，获得分子量小于1KDa的法氏囊多肽粗提物。经真空冷冻干燥，用超纯水稀释法氏囊粗提物样品进行反向高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化，收获洗脱峰值比较高的滞留峰组分。本发明中样品的滞留时间为10.067分钟。利用蛋白质氨基酸质谱分析系统(MALDI-TOF-MS)分析该样品的氨基酸序列，测定该法氏囊活性肽的分子量为581.30(m/z)，并采用MS/MS分析，获得该法氏囊多肽的完整氨基酸序列，即MPPTH。通过人工合成五肽，纯度为97％，接着进行免疫实验验证其免疫调节功能及应用。
本发明所述的法氏囊多肽五肽促进禽流感和新城疫二联疫苗的小鼠免疫实验证明：将新分离的法氏囊多肽五肽按照10、50和250μg/mL三种剂量添加至禽流感和新城疫二联疫苗中进行联合接种小鼠；免疫后的小鼠的AIV抗体水平、NDV抗体亚型高于疫苗组，且T细胞亚型发生了变化，而且树突状细胞表面分子表达水平高于疫苗组。在小鼠免疫中，添加50μg/mL剂量五肽的实验组AIV疫苗免疫效力显著高于未加该组分的疫苗对照组，且添加50μg/mL剂量五肽的实验组NDV疫苗的抗体水平显著高于未加该组分的疫苗对照组。
本发明所述的法氏囊多肽五肽促进禽流感和新城疫二联疫苗的鸡免疫实验证明：将新分离的法氏囊多肽五肽按照50μg/mL添加至禽流感和新城疫二联疫苗中进行联合接种21日龄鸡；免疫后的鸡的AIV抗体水平、NDV抗体亚型高于疫苗组，且鸡群精神状态正常，无不良反应。
本发明的积极意义：
本发明从鸡法氏囊组织中分离、鉴定出一个新的免疫活性肽五肽，结构简单，由五个氨基酸组成，促进疫苗免疫反应，可作为畜禽疫苗免疫增强剂，如促进AIV灭活疫苗和新城疫灭活疫苗的免疫活性，同时在小鼠免疫实验中，不仅促进免疫小鼠产生针对AIV抗原的强烈抗体反应，而且促进小鼠产生针对NDV抗原的强烈抗体反应。此外，还促进小鼠T细胞免疫反应、抗原递呈反应和提高疫苗免疫效力作用。再者，该多肽促进及鸡产生针对AIV抗原和NDV抗原的强烈免疫反应，以提高动物机体针对特异抗原的免疫应答能力，从而提高动物机体抗疫病感染的能力，可应用于基础免疫研究、临床应用研究等领域。本发明所述的活性肽是一种来源于法氏囊的小分子多肽，安全、副作用小、无残留、具有促进广泛的免疫增强作用，对多种畜禽具有刺激抗体生成、调节细胞免疫反应和提高疫苗免疫效力作用，该多肽的氨基酸序列为：5’-MPPTH-3’，可作为疫苗佐剂或免疫增强剂应用于动物疫苗应用研究，以提高动物机体针对特异抗原的免疫应答能力，提高疫苗的免疫效力，从而提高动物机体抗疫病感染的能力。
附图说明
图1：法氏囊五肽的分离和纯化。反向高效液相色谱图中，箭头所指，五肽的洗脱峰10.067min。
图2：多肽五肽的MALDI-TOF-MS/MS分析。
图3：免疫后4周，小鼠AIV ELISA特异抗体水平，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)。
图4：免疫后4周，小鼠AIV HI抗体水平，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)。
图5：免疫后4周，小鼠NDV ELISA特异抗体水平，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)。
图6：免疫后4周，小鼠NDV HI特异抗体水平，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)。
图7：二免后1周，小鼠T细胞亚型，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)。
图8：二免后1周，小鼠脾脏淋巴细胞活性，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)。
图9：二免后1周，小鼠树突状细胞CD40+CD11c+，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)。
图10：二免后1周，小鼠树突状细胞MHCII+CD11c+，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)。
图11：二免后2周，鸡AIV HI抗体水平，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)。
图12：二免后2周，鸡NDV HI抗体水平，用不同字母标记的各组之间差异显著(p<0.05)。
具体实施方式
本发明的实施例为进一步描述本发明的技术方案，但不构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买得到的。
实施例1
1.五肽的分离及鉴定
用0.85％的生理盐水(预冷至4-10℃)洗涤无筋膜和脂肪组织的50gAA肉鸡法氏囊组织一次。沥干后，将法氏囊组织置于组织捣碎机中，再加入预冷的生理盐水，高速匀浆三次，每次三十秒，匀浆过程保持在0-10℃。然后将匀浆液在4℃条件下超声裂解处理2次，5min/次。然后将裂解液加热至80℃，保温5min，之后迅速置于冰上，冷却至10℃。然后将裂解液冷冻离心30分钟(4000×g/min)。收集上清液，反复冻融两次。然后将上清液高速离心，条件为12000g/min，4℃，30min。收集上清液进行超滤操作，收集1000Da以下分子量的超滤液，即法氏囊组织粗提物。冻干后，超纯水稀释，然后0.22um滤膜过滤，经反向高效液相纯化分析，收获洗脱峰值时间为10.067min的活性峰(见图1)，经MALDI-TOF-MS/MS分析，分子量为581.30(m/z)，氨基酸序列MPPTH(见图2)。
实施例2
1.人工合成五肽
委托商业化多肽合成公司按照MPPTH序列(SEQ ID No.1)合成多肽，纯度为99.936％。
2.疫苗
禽流感和新城疫二联灭活疫苗(购自南京天邦生物科技有限公司)。
3.小鼠免疫实验
3.1实验动物小鼠分组
将BALB/C小鼠随机分为五组，每组10只：(I)PBS对照组(每只免疫0.2ml PBS)；(II)AIV+NDV二联灭活疫苗免疫组(每只免疫灭活疫苗0.2ml)；(III～V)AIV+NDV二联灭活疫苗+五肽组(五肽浓度分别为10、50、250μg/mL)；采用腹腔注射的方式对相应组小鼠分别进行两次免疫。免疫间隔两周，0.2ml/每只/每次(表1)。
表1五肽与AIV+NDV二联灭活疫苗混合免疫程序
| 0周(第一次免疫) | 2周(第二次免疫) | |
| 1 | PBS | PBS |
| 2 | 二联疫苗 | 二联疫苗 |
| 3 | 五肽(10μg/mL)+二联疫苗 | 五肽(10μg/mL)+二联疫苗 |
| 4 | 五肽(50μg/mL)+二联疫苗 | 五肽(50μg/mL)+二联疫苗 |
| 5 | 五肽(250μg/mL)+二联疫苗 | 五肽(250μg/mL)+二联疫苗 |
3.2免疫小鼠抗体检测
小鼠二免后两周，眼眶采血，8000×g离心10min分离血清，分别采用ELISA技术和血凝抑制实验检测禽流感病毒特异的抗体IgG和HI抗体水平，以及新城疫病毒特异的抗体IgG和HI抗体水平，所有检测结果进行统计分析。
3.3免疫小鼠细胞亚型检测
并于第二次免疫后1周，无菌采免疫小鼠脾脏，分离脾脏淋巴细胞，采用流式细胞术检测细胞T细胞亚型、淋巴细胞活性、树突状细胞亚型等的情况，所有检测结果进行统计分析。
实施例3
1.人工合成五肽
委托商业化多肽合成公司按照MPPTH序列(SEQ ID No.1)合成多肽，纯度为99.936％。
2.疫苗
禽流感和新城疫二联灭活疫苗(购自南京天邦生物科技有限公司)。
3.鸡免疫实验
3.1实验动物鸡分组
将21日龄鸡随机分为三组，每组20只：(I)PBS对照组(每只免疫0.5ml PBS)；(II)AIV+NDV二联灭活疫苗免疫组(每只免疫灭活疫苗0.5ml)；(III)AIV+NDV二联灭活疫苗+五肽组(五肽浓度为50μg/mL,0.5ml/只)；采用颈部皮下注射的方式对相应组鸡分别进行两次免疫。免疫间隔两周，0.5ml/每只/每次(表2)。
表2五肽与AIV+NDV二联灭活疫苗混合免疫程序
| 0周(第一次免疫) | 2周(第二次免疫) | |
| 1 | PBS | PBS |
| 2 | 二联疫苗 | 二联疫苗 |
| 3 | 五肽(50μg/mL)+二联疫苗 | 五肽(50μg/mL)+二联疫苗 |
3.2免疫鸡抗体检测
鸡二免后两周，翅静脉采血，8000×g离心10min分离血清，采用血凝抑制实验检测AIV和NDV特异的HI抗体水平，所有检测结果进行统计分析。
4.结果
(1)免疫小鼠的禽流感IgG抗体和HI水平检测结果
采用间接ELISA方法测定了小鼠免疫后4周的血清中针对AIV抗原的抗体水平，结果见图3。实验显示，第4周，法氏囊五肽联合免疫组与疫苗组对照小鼠相比，10和50μg/mL五肽联合免疫组抗体水平显著高于疫苗对照组，而250μg/mL五肽联合免疫的抗体水平与疫苗对照相似(图3)。与此同时，用血凝抑制方法对各组小鼠血清中AIV特异的抗体亚型检测检测。结果表明，与疫苗组相比，50μg/mL五肽联合免疫组的AIV的HI抗体水平明显高于疫苗对照组，而10和250μg/mL五肽联合免疫的AIV的HI抗体水平与疫苗组无显著差异(图4)。
(2)免疫小鼠的新城疫IgG抗体和HI水平检测结果
免疫后4周采血分离血清，采用间接ELISA方法和血凝抑制方法检测免疫小鼠体内针对NDV抗原的IgG抗体和HI抗体水平。结果表明，与疫苗组相比，三种剂量的五肽联合免疫组的IgG抗体水平明显高于疫苗组，且250μg/mL五肽联合免疫组新城疫的IgG抗体水平最高(图5)。而且，与疫苗组相比，50μg/mL五肽联合免疫组的HI抗体水平高于疫苗对照组，而10和250μg/mL五肽联合免疫组的HI抗体水平稍微高于疫苗对照组(图6)；这说明法氏囊五肽促进禽流感和新城疫二联灭活疫苗免疫的抗体水平。
(3)免疫小鼠的T细胞亚型
第二次免疫后一周，分离小鼠脾脏淋巴细胞，采用三色流式细胞术分析T细胞亚型，结果如图7所示。与疫苗组相比，五肽联合免疫组的CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞比例均升高，其中在所有实验组中，50μg/mL五肽联合免疫组的CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞比例最高。
(4)免疫小鼠的淋巴细胞增殖结果
采用了MTT比色法检测了五肽联合免疫对淋巴细胞增殖的影响情况，结果见图8。实验结果表明，与疫苗组相比较，LPS或PHA刺激后，五肽联合疫苗组的淋巴细胞增殖与疫苗对照相似。因此，可以推测，该法氏囊五肽可能对淋巴细胞的增殖影响不大。
(5)免疫小鼠的CD11c+亚型细胞结果
第二次免疫一周，分离脾脏淋巴细胞，采用流式细胞术方法检测树突状细胞中CD40+亚型细胞比例。结果如图9所示，250μg/mL五肽联合免疫组的CD11c+CD40+亚型细胞的比例明显高于疫苗组。而且，还检测了MHCII+亚型细胞的比例，如图10所示。与疫苗组相比，三种剂量五肽免疫组的CD11c+MHCII+亚型细胞比例与疫苗对照组相似，无明显差异。
(6)免疫鸡HI水平检测结果
采用血凝抑制方法对各组鸡血清中AIV抗原和NDV抗原特异的HI抗体进行检测。结果表明，与疫苗组相比，50μg/mL五肽联合免疫组的AIV的HI抗体水平明显高于疫苗对照组(图11)，而且50μg/mL五肽联合免疫组的NDV的HI抗体水平也明显高于疫苗对照组(图12)。
小鼠免疫和鸡免疫实验结果表明，该法氏囊五肽作为疫苗免疫增强剂的潜力与其剂量有很大关系，也暗示了法氏囊五肽是一种的能够促进疫苗免疫反应的免疫活性分子。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种促进AIV和/或NDV疫苗的免疫反应的法氏囊活性五肽及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Pro Pro Thr His
1 5
Claims (7)
1.一种法氏囊多肽五肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述法氏囊多肽五肽在制备预防禽流感和/或新城疫的疫苗佐剂中的应用。
3.一种免疫组合物，其特征在于，包含禽流感和/或新城疫疫苗，及权利要求1所述的法氏囊多肽五肽。
4.根据权利要求3所述的免疫组合物，其特征在于，所述法氏囊多肽五肽以2～255μg/mL计量存在于免疫组合物中。
5.根据权利要求4所述的免疫组合物，其特征在于，所述法氏囊多肽五肽以10～250μg/mL计量存在于免疫组合物中。
6.根据权利要求5所述的免疫组合物，其特征在于，所述法氏囊多肽五肽以50～250μg/mL计量存在于免疫组合物中。
7.根据权利要求6所述的免疫组合物，其特征在于，所述法氏囊多肽五肽以50μg/mL计量存在于免疫组合物中。
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