CN112707959B - 一种多肽、制备方法及应用 - Google Patents

一种多肽、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种多肽、制备方法及应用。该多肽为SjDX5‑53或SjDX5‑271，所述SjDX5‑53的氨基酸序列为Seq IDNO.1，所述SjDX5‑271的氨基酸序列为Seq IDNO.3，其可以通过基因工程方法人工合成，或日本血吸虫卵通过细胞破碎分离纯化方法直接获得，或通过化学合成制备。该多肽可以显著增加CD4+CD25+CD127lowT细胞的数量，增强了Tregs的抑制功能。本发明提供的多肽，可有效诱导免疫抑制，应用于治疗移植物抗宿主(GVHD)、实体器官移植、1型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、炎症性肠病、过敏性气道炎症等。

Description

一种多肽、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种多肽、制备方法及应用。
背景技术
“卫生假说”认为，在低收入的热带国家蠕虫感染率高，而在发达国家随着经济卫生条件的逐步改善，寄生虫感染率明显下降，相应地过敏和自身免疫性疾病的发生与日俱增(Okada et al.,2010)。寄生虫感染宿主后，可通过多种机制逃避宿主免疫系统攻击，在宿主体内长期存活。这种持续慢性感染状态与Tregs诱导的抑制性免疫应答密切相关。Tregs是形成外周免疫耐受的关键，具有免疫抑制和免疫无能两大特征。在自身免疫性疾病、肿瘤免疫、移植耐受及感染性疾病的免疫致病机制中均发挥关键的调控作用，具有潜在的治疗应用前景。
Tregs是一类具有负调控功能的相对独立的T细胞亚群。Treg细胞表达转录因子Foxp3，对自身抗原有很高亲和力，可以通过分泌抑制性细胞因子IL-10、TGF-β等抑制其他T细胞增殖和活化，也可以通过细胞接触依赖的方式抑制B细胞、NK细胞、T细胞以及DC的增殖、分化发挥抑制功能。天然Tregs占全部CD4+细胞的5-10％，在外周血不到2％。因此，如何获得足够数量的有功能的Tregs成为其临床应用的瓶颈。目前尝试诱导或扩大Tregs的调节功能主要有两种途径：分离患者的Tregs在体外扩增后回输，或利用生物制剂在体内增强Tregs功能。
目前，Tregs在移植物抗宿主(GVHD)、实体器官移植、1型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、炎症性肠病和多发性硬化的各种临床前模型中都显示出治疗潜力。因此，寻求能在体内活化Tregs并增强其抑制功能的无毒副作用的生物制剂成为当下研究的热点。
发明内容
本发明旨在提供一种能够诱导Tregs的多肽，该多肽可以有效诱导免疫抑制，应用于治疗移植物抗宿主(GVHD)、实体器官移植、1型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、炎症性肠病、过敏性气道炎症等。
为了实现上述目的，本发明具体采用如下技术方案：
一种多肽，所述多肽为SjDX5-53或SjDX5-271，所述SjDX5-53的氨基酸序列为SeqIDNO.1；所述SjDX5-271的氨基酸序列为Seq IDNO.3。
优选的，编码所述多肽SjDX5-53的核苷酸序列为Seq IDNO.2，编码所述多肽SjDX5-271的核苷酸序列为Seq IDNO.4。
优选的，所述多肽SjDX5-53或SjDX5-271来源于日本血吸虫卵。
前述所述的多肽的制备方法，所述多肽SjDX5-53或SjDX5-271通过基因工程方法人工合成，或日本血吸虫卵通过细胞破碎分离纯化方法直接获得，或通过化学合成制备。
优选的，所述多肽SjDX5-53或SjDX5-271的具体制备方法包括如下步骤：
(1)获得虫卵蛋白：将日本血吸虫虫卵研磨，采用PBS溶液溶解研磨后的虫卵得虫卵蛋白；
(2)凝胶过滤层析：以磷酸盐缓冲液作为洗脱液进行初步分离纯化，收集能诱导Treg细胞的组分；
(3)反向高效液相层析：以乙腈和含1‰三氟乙酸的水构成的洗脱体系进行梯度洗脱，收集能诱导Treg细胞的组分；
(4)质谱检测：质谱测序法检测步骤(3)所得的能诱导Treg细胞的组分，最终得到多肽SjDX5-53的氨基酸序列：Seq IDNO.1或多肽SjDX5-271的氨基酸序列：Seq IDNO.3。
优选的，所述步骤(2)中磷酸盐缓冲液的浓度选自0.08mol/L～0.13mol/L；步骤(3)中反向高效液相层析所用的反相高效液相色谱柱选自C4柱。
优选的，所述的步骤(3)中梯度洗脱包括：
Figure BDA0002773353990000021
Figure BDA0002773353990000031
前述所述的多肽的应用，所述的多肽SjDX5-53或SjDX5-271在制备免疫抑制药物中的应用。
优选的，所述的多肽SjDX5-53或SjDX5-271在制备治疗移植物抗宿主、实体器官移植、1型糖尿病、系统性红斑狼疮、炎症性肠病、过敏性气道炎症用药物中的应用。
有益效果：
本发明所述的多肽具有增强CD4+及CD25+调节性T细胞抑制效应；
本发明所述的多肽刺激人PBMC后，显著增加了CD4+CD25+CD127lowT细胞的数量，显著增强了Tregs的抑制功能。该多肽体外处理小鼠脾单个核细胞后，显著增加了CD4+CD25+Foxp3+T细胞的数量，增加了IL-10的水平。
附图说明
图1凝胶过滤层析分离日本血吸虫虫卵蛋白；
图2凝胶过滤层析分离的日本血吸虫虫卵蛋白增加人PBMC中CD4+CD25+CD127lowTregs；
图3反向高效液相色谱(RP-HPLC)分离凝胶过滤层析得到的日本血吸虫虫卵蛋白；
图4反向高效液相色谱(RP-HPLC)分离的日本血吸虫虫卵蛋白增加人PBMC中CD4+CD25+CD127lowTregs；
图5SjDX5-53和SjDX5-271增加了人PBMC中CD4+CD25+CD127lowTregs；
图6SjDX5-53和SjDX5-271增加了人PBMC中IL-10的分泌；
图7不同浓度SjDX5-53和SjDX5-271体外处理小鼠脾单个核细胞后，显著增加了CD4+CD25+Foxp3+T细胞的数量；
图8SjDX5-53增加了小鼠脾单个核细胞中IL-10的分泌。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面结合附图对本发明进行详细说明，以方便本领域技术人员理解本发明。
本发明中所述的日本血吸虫，其中文学名为日本裂体吸虫，拉丁学名为Schistosoma japonicum Katsurada，1904。
实施例1日本血吸虫卵通过细胞破碎分离纯化方法获得本发明所述的多肽。
I建立日本血吸虫感染新西兰兔模型
选取活力较好的含日本血吸虫阳性钉螺置于盛有去氯水的烧杯中，室温25℃左右普通光照下逸出尾蚴。用无菌接种环挑取尾蚴，移至12mm×12mm的盖玻片上，并在解剖镜下计数，每只新西兰兔接种1000条日本血吸虫尾蚴。用兔板固定新西兰兔，使其腹部朝上，将腹部体毛剔除，用去氯水湿润该部位皮肤，将沾有尾蚴的盖玻片贴于其上并保留15-20min。
II日本血吸虫虫卵的制备与处理
感染45天后，解剖感染的新西兰兔，取兔肝，去除胆管、结缔组织、大血管，洗去兔血，将肝剪碎、匀浆、离心、过筛、沉降，得到金黄色虫卵。镜检可见纯化后虫卵卵壳完整，内部结构清晰，整个视野中仅见虫卵，无明显肝渣残留。
III日本血吸虫虫卵多肽的分离纯化
下述实施例中的blank组均为不加分离的虫卵蛋白样品和增长因子组，ck组为不加分离的虫卵蛋白样品和加入PBS和增长因子组。
(1)获得虫卵蛋白
将步骤II得到的虫卵置于研钵中，加入少量液氮研磨，以少量PBS(含蛋白酶磷酸酶抑制剂)溶解研磨过的虫卵，得到虫卵蛋白。
(2)凝胶过滤层析
将500mg虫卵蛋白稀释于20ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH＝6.0)，用0.22μm滤膜过滤，用平衡好的Waters Protein-Pak 60A凝胶过滤柱(7.8mm×30cm)进行初步分离纯化，用同样缓冲液洗脱，并按峰收集样品，流速为0.5ml/min，于280nm紫外检测收集液中蛋白质或多肽的浓度，收集到No.1-No.4号的4个组分，SDS-PAGE验证条带大小，如图1所示，从图1可以看出存在4个主要峰No.1-No.4。
收集的组分刺激人PBMC，分组为blank、ck(加入PBS和CD3、CD28、IL-2刺激三种增长因子)、1、2、3+4(由于3、4组分浓度低，所以合并为一组)，流式检测各组CD4+CD25+CD127low细胞数量变化(具体方法见“日本血吸虫虫卵多肽对人外周血单核细胞Tregs的影响”)。冻干具有促进Treg的活性的2号、3+4号组分，-20℃保存备用。
日本血吸虫虫卵多肽组分对人外周血单核细胞PBMC的Tregs的影响实验具体采用如下步骤：
I.第一天：1μg/ml的anti-CD3包被24孔板，4℃过夜备用，使用前PBS洗三遍。
II.第二天：采取健康献血者外周血，使用Ficoll分离液分离外周血单核细胞(PBMC)，并用红细胞裂解液对红细胞进行裂解。PBMC计数5×106细胞/ml接种24孔板。样品浓度为10μg/ml，每组设置3个重复。为促进T细胞的增殖和分化，加入200ng/ml的anti-CD28和200ng/ml hIL-2，设置blank组(不加分离的虫卵蛋白样品和增长因子)，ck组(加入PBS和增长因子)。共培养三天。所述增长因子指的是CD3、CD28、IL-2。
III.第五天：观察细胞的密度、形态、生长情况。收集细胞，流式检测CD4+CD25+CD127low细胞的变化情况。收集处理后的人PBMC，加Fc阻断剂，阻断抗体的非特异性结合后在4℃条件下用表面抗体APC-CD4、FITC-CD25和PEcy7-CD127反应30min，然后用stainingbuffer(2％FBS+PBS)缓冲液洗涤2次。将染色后的PBMC重新悬浮在staining buffer缓冲液中，进行流式细胞仪(BD FACSVerse)检测。
检测结果如图2所示，(图2，*表明1、2或3+4vs ck，#表明ck vs blank)，图2A为图B所示流式细胞术检测Treg的圈门示意图，图2B为流式细胞术检测blank、ck、1、2、3+4刺激PBMC后CD4+CD25+CD127low细胞亚群变化，图2C为blank、ck、1、2、3+4刺激PBMC后CD4+CD25+CD127low比例统计图。从图2可以看出，2号组分诱导Treg效果最显著。
(3)离子交换
由于2号组分促进Treg效果最明显，将其继续分离。将2号组分用PH＝8、9、10的缓冲液透析。用阴离子交换Q柱将2号峰进行分离，用同样缓冲液(PH＝8、9、10)洗脱，并按峰收集样品，流速为2ml/min。结果显示，PH＝8、9、10时，均出现穿透峰，无法挂柱。因此，此方法不适合分离血吸虫虫卵来源多肽。
(4)反向高压液相层析(RP-HPLC)
将所得到的2号活性峰所对应的蛋白用2ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH＝6.0)重新溶解，用0.22μm滤膜过滤，收集滤液上样于反相高压液相C4柱，以水(含1‰三氟乙酸)和乙腈构成的洗脱系统进行梯度洗脱，洗脱速度为1.5ml/min。由于突出的峰较少，选择按时间收集样品。于280nm紫外检测收集液中多肽的浓度。结果如图3所示，由于峰形不明显，我们按照时间收集样品：2-1(12-15min)、2-2(15-21min)、2-3(21-26min)、2-4(26-31min)、2-5(31-37min)、2-6(37-47min)、2-7(47-58min)、2-8(58-66min)、2-9(66-70min)、2-10(70-80min)、2-11(80-86min)。
收集到组分2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-11。收集的组分以及设计的blank组和ck组分别刺激人PBMC，流式检测CD4+CD25+CD127low细胞数量变化(具体方法检测方法同上，见上述日本血吸虫虫卵多肽组分对人外周血单核细胞PBMC的Tregs的影响实验部分)。将组分2-1～2-11分别处理PBMC时发现，2-1～2-4具有强烈毒性，PBMC细胞大量死亡无法进行流式检测。2-5～2-11组分中，如图4所示(图4中A组图为图4B所示的流式细胞术检测Treg的圈门示意图，B组图为刺激PBMC后CD4+CD25+CD127low比例统计图，B图中的“*”表示2-5至2-11组分中的一种vs ck，“#”表示ck vs blank)，从图中可以看出，2-7组CD4+CD25+CD127low比例最高。冻干具有促进Treg的活性组分，-20℃保存备用。
上述反向高压液相层析实验的洗脱梯度如下所示：
Figure BDA0002773353990000071
Figure BDA0002773353990000081
(4)质谱检测与表位分析
将2-7号峰组的多肽进行质谱测序检测氨基酸序列(南京医科大学分析测试中心)。获取的氨基酸序列进行CD4+T细胞表位分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/)。得到在人和小鼠中得分高且强结合的氨基酸序列：GQMQQQQRPQQMQPSQQYATNQMTNSR(SjDX5-53)和YKNLGGQQQSGSSQGQFPSGQMQQQQRPQQ(SjDX5-271)。
IV多肽SjDX5-53和SjDX5-271的验证
I.多肽SjDX5-53和SjDX5-271对PBMC中Treg的诱导功能
分离人PBMC，SjDX5-53、SjDX5-271处理人PBMC后，流式细胞术检测CD4+CD25+CD127low细胞比例。结果如图5所示，结果显示SjDX5-53、SjDX5-271可以显著增加CD4+CD25+CD127low细胞比例。同时，ELISA试剂盒(MultiSciences)检测SjDX5-53、SjDX5-271处理后的细胞上清中IL-10、IL-4、IFN-γ水平，检测结果如图6所示，结果表明多肽SjDX5-53、SjDX5-271组IL-10蛋白水平显著增加，且SjDX5-53组IL-10水平比SjDX5-271组更高。
II.多肽SjDX5-53和SjDX5-271对小鼠脾脏淋巴细胞中Treg的诱导功能
分离小鼠脾细胞，多肽SjDX5-53和SjDX5-271处理后，流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+细胞比例。如图7A所示，SjDX5-53和SjDX5-271增加了CD4+CD25+Foxp3+细胞比例，且SjDX5-53效果更显著。同时，ELISA检测SjDX5-53、SjDX5-271处理后的细胞上清中IL-10、IL-4、IFN-γ水平，检测结果如图7B-图7D所示，结果表明多肽SjDX5-53组和SjDX5-271组IL-10蛋白水平显著增加，且SjDX5-53处理组IL-10水平更高。
由于SjDX5-53效果优于SjDX5-271，我们分离小鼠脾细胞，采用不同浓度的多肽SjDX5-53处理后，流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+细胞比例。结果如图8所示，结果显示5ug/ml及以上浓度的多肽SjDX5-53可以显著增加CD4+CD25+Foxp3+细胞比例。
以上实验说明SjDX5-53和SjDX5-271均可以诱导产生CD4+CD25+CD127low、CD4+CD25+Foxp3+Tregs，促进IL-10的分泌，增强其免疫抑制功能，具有广阔的应用前景。
Seq IDNO.1：GQMQQQQRPQQMQPSQQYATNQMTNSR
Seq IDNO.2：ggtcaaatgcagcaacaacaacgaccacaacagatgcagcctagccaacagtatgcaacaaatcagatgacaaatagtaga
Seq IDNO.3：YKNLGGQQQSGSSQGQFPSGQMQQQQRPQQ
Seq IDNO.4：tataaaaatctcggtggtcaacaacagtctgggtcatcacagggtcagttcccctctggtcaaatgcagcaacaacaacgaccacaacag
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京医科大学、中国科学院昆明动物研究所
<120> 一种多肽、制备方法及应用
<130> 2020
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Gly Gln Met Gln Gln Gln Gln Arg Pro Gln Gln Met Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Gln Tyr Ala Thr Asn Gln Met Thr Asn Ser Arg
20 25
<210> 2
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ggtcaaatgc agcaacaaca acgaccacaa cagatgcagc ctagccaaca gtatgcaaca 60
aatcagatga caaatagtag a 81
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Tyr Lys Asn Leu Gly Gly Gln Gln Gln Ser Gly Ser Ser Gln Gly Gln
1 5 10 15
Phe Pro Ser Gly Gln Met Gln Gln Gln Gln Arg Pro Gln Gln
20 25 30
<210> 4
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
tataaaaatc tcggtggtca acaacagtct gggtcatcac agggtcagtt cccctctggt 60
caaatgcagc aacaacaacg accacaacag 90

Claims (9)

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽为SjDX5-53或SjDX5-271，所述SjDX5-53的氨基酸序列为Seq IDNO.1；所述SjDX5-271的氨基酸序列为Seq IDNO.3。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，编码所述多肽SjDX5-53的核苷酸序列为Seq IDNO.2，编码所述多肽SjDX5-271的核苷酸序列为Seq IDNO.4。
3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽SjDX5-53或SjDX5-271来源于日本血吸虫卵。
4.权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，所述多肽SjDX5-53或SjDX5-271通过基因工程方法人工合成，或日本血吸虫卵通过细胞破碎分离纯化方法直接获得，或通过化学合成制备。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述多肽SjDX5-53或SjDX5-271的具体制备方法包括如下步骤：
（1）获得虫卵蛋白：将日本血吸虫虫卵研磨，采用PBS溶液溶解研磨后的虫卵得虫卵蛋白；
（2）凝胶过滤层析：以磷酸盐缓冲液作为洗脱液进行初步分离纯化，收集能诱导Treg细胞的组分；
（3）反向高效液相层析：以乙腈和含1‰三氟乙酸的水构成的洗脱体系进行梯度洗脱，收集能诱导Treg细胞的组分；
（4）质谱检测：质谱测序法检测步骤（3）所得的能诱导Treg细胞的组分，最终得到多肽SjDX5-53的氨基酸序列：Seq IDNO.1或多肽SjDX5-271的氨基酸序列：Seq IDNO.3。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中磷酸盐缓冲液的浓度选自0.08mol/L~0.13mol/L；步骤（3）中反向高效液相层析所用的反相高效液相色谱柱选自C4柱。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（3）中梯度洗脱包括：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
8.权利要求1-3任一项所述的多肽的应用，其特征在于，所述的多肽SjDX5-53或SjDX5-271在制备免疫抑制药物中的应用。
9.权利要求1-3任一项所述的多肽的应用，其特征在于，所述的多肽SjDX5-53或SjDX5-271在制备治疗移植物抗宿主、实体器官移植、1型糖尿病、炎症性肠病、过敏性气道炎症用药物中的应用。
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