CN101469016B - 天花粉蛋白衍生肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一组中药天花粉蛋白衍生肽及其应用。本发明的技术方案如下：天花粉蛋白衍生肽p18，其氨基酸序列如SEQ ID NO；1所示。天花粉蛋白衍生肽p18四聚体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。天花粉蛋白衍生肽p14，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。天花粉蛋白衍生肽在治疗免疫应答亢进的自身免疫性疾病实验研究中已取得效果。本发明优点表现在：突破传统的方法，从天花粉蛋白分子结构上去除具有毒副作用的部分而保留其有效生物活性，发展真正能用于多种临床疾病治疗的低毒高效新型制剂。

Description

天花粉蛋白衍生肽及其应用

技术领域

本发明涉及一组中药天花粉蛋白衍生肽及其应用。

背景技术

天花粉蛋白(Trichosanthin，Tk)是从中药栝楼(Trichothansuskirilowii Max)块根中提取的植物蛋白。我国上世纪60年代起获得结晶纯的Tk制剂并大量用于临床中期引产。后发现Tk还具有多种生物学功能，包括抗肿瘤、诱导细胞凋亡、抗病毒(包括艾滋病毒)增殖，和诱导免疫抑制等。

有关天花粉蛋白的分离和制备技术，以往主要涉及两方面。一是从括楼块根中对该植物蛋白全分子进行提取和纯化。有关技术由中科院上海有机化学研究所发展并提供，由上海金山制药厂用于批量制备和生产。其技术要点为榨取新鲜天花粉块根原汁，在酸性条件下(pH4)用丙酮分级沉淀，通过pH8.6的巴比妥缓冲液透析，制备结晶天花粉蛋白后，从电荷性质、免疫沉淀、N末端氨基酸测定等鉴定纯度，并确定其物理化学特性。二是采用分段水解的方法，用溴化氢或羟胺从纯化的Tk分子裂解出2～4个肽段。

天花粉蛋白作为一种临床应用药物，其缺点目前已不在纯化技术本身，而在于自身的生物学特点，即除了显示治疗效应，尚具有明显的副作用。包括：①过敏反应，早期曾有注射Tk制剂因过敏反应致死的病例。现已通过提高制剂纯度和用前作皮试剔除过敏者避免此类负作用。②毒性反应。包括作为核糖体灭活蛋白所表现的细胞毒性和体内应用所产生的神经毒性。上世纪80年代Tk曾用于治疗艾滋病，因严重毒性作用而被美国FDA禁用。

据此，保留天花粉蛋白的治疗效果，包括诱导免疫抑制和抗病毒增殖，而去除其过敏和毒性作用，构成了该中药制剂构效关系研究的主要方面，也是获取本制剂的主要目的。

因而，单纯制备和纯化Tk全分子的技术已不能满足应用和治疗上的需要，因为全分子作为药物，毒性太大。第二方面关于采用化学药物裂解Tk以获取相应肽段的技术也已不再应用，主要缺点，一是药物的裂解点恒定，如果裂解点位于抗原表位中，有可能破坏表位的完整结构，无法显示其生物学功能；二是裂解条件较难掌握，纯度难以达标。

发明内容

本发明的目的在于采用新的技术从天花粉蛋白获取抗原肽，既保留其抑制活性，又去除其毒性作用：

(1)提供高效低毒的天花粉蛋白衍生肽；

(2)提供该天花粉蛋白衍生肽的应用效果。

本发明的目标是通过以下技术和方法来实现的：

(1)应用mutilpin技术合成基于Tk全长序列的重叠性合成肽库，每条肽包含有15个氨基酸残基。采用两步法分开测定各肽段的细胞毒性和抑制活性，分别选出显示强毒性和无毒(低毒)但有抑制能力的肽段，同时比较在人体细胞和小鼠细胞实验系统中的测定结果，最终得到两类肽段。典型者为p14(毒性肽)和p18(无毒抑制肽)。确认低毒和有抑制能力的15肽分别坐落于Tk分子的中段和羧基端。同时将片段p18以四聚体形式聚合为高纯度的60肽复合物(制备方法详后)。三种Tk衍生肽的机构为：

毒性肽(p14)：ALDSA ITTLF YYNAN；

抑制肽(p18)：IGKRV DKTFL PSLAI；

抑制肽p18四聚体：(IGKRV DKTFL PSLAI)×4。

(2)采用锥兰排斥实验(检测细胞膜是否破损)和体外凋亡诱导实验，确认后两种Tk衍生肽在引起免疫抑制的剂量范围内，对活细胞不显示毒性。同时采用树突状细胞(DC)将所获得的衍生肽递呈给T细胞，通过测定其对T细胞增殖系统的抑制活性，确认这些肽段是否包括T抑制性表位，并比较对Tk免疫抑制敏感和不敏感小鼠近交系中抑制能力的差异，从功能上鉴定具有免疫抑制功能的Tk衍生肽。发现天花粉衍生肽p18或其四聚体处理后的DC，可以改变CD8 T细胞的细胞因子分泌格局，明显抑制I类细胞因子IFN-Y的分泌，而II类细胞因子IL-4、IL-10分泌明显增加。提出Tk及其衍生肽可通过激活一群分泌IL-4和IL-10细胞因子的CD8 T细胞可抑制Th1细胞介导的免疫应答(Th1亢进类免疫反应)而无细胞毒性。天花粉蛋白衍生肽(Tk)刺激后，C57BL/6小鼠中分泌IL-4的CD8阳性细胞(IL-4⁺CD8⁺T)细胞的比例从对照组的0.5％上升至12.6％，Tk非易感性C3H/He小鼠中无此现象。表明达到预期目标。

(3)比较天花粉全蛋白和相关衍生肽在体内所发挥的生物学活性，发现可治疗Th1型T细胞诱发的自身免疫病，即小鼠类风湿性关节炎(RA)。

本发明的技术方案如下：天花粉蛋白衍生肽p18，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。天花粉蛋白衍生肽p18四聚体，其氨基酸序列如SEQID NO：2所示。天花粉蛋白衍生肽p14，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。天花粉蛋白衍生肽在制备治疗免疫应答亢进的自身免疫性疾病药物中的应用。免疫应答亢进的免疫性疾病主要指：器官移植排斥反应、过敏性疾病、Th1功能亢进相关的自身免疫病、艾滋病毒增殖引起的免疫缺陷病，和调节性T细胞失控相关的疾病。上面应用的类风湿性关节炎(RA)属于Th1功能亢进相关的自身免疫病。

本发明涉及的天花粉蛋白衍生肽及其应用，其优点表现在：(1)不是采用完整的Tk分子，而是应用分段表达的Tk片段和覆盖全分子的人工合成肽进行分析，有利于鉴别Tk不同片段和部位在功能行使上的不同特点，从而寻找功能独特的Tk衍生肽；(2)分别评估Tk相关肽的细胞毒性和抑制活性。由此，可以做到在排除毒性干扰的基础上，寻找并确认天花粉蛋白的抑制活性，并作抑制能力的T表位初略定位。(3)以Tk对T细胞增殖活性的抑制能力来判别该中药制剂及其衍生肽的免疫抑制能力，即著眼于寻找T细胞表位，有助于将Tk及其衍生物的临床应用范围扩大到各种T细胞介导或T细胞相关的疾病。(4)国内外首次得到各自发挥毒性作用和具有免疫抑制能力的Tk衍生肽段，并进一步获得抑制能力超越Tk全分子的肽四聚体而不显示毒性。上述制剂有助于从分子和细胞水平全面了解我国中药制剂天花粉蛋白的特性，及其发挥多种生物学活性的机制，为这一植物蛋白及其衍生肽用于治疗更大范围的临床疾病，包括各种免疫应答亢进的免疫性疾病展示新的前景，并可能发展成治疗性药物。而单独发挥毒性作用的肽段则具有抗肿瘤应用价值。(5)突破传统的方法，从天花粉蛋白分子结构上去除具有毒副作用的部分而保留其有效生物活性，发展真正能用于多种临床疾病治疗的低毒高效新型制剂。

附图说明

图1：p18的HPLC分析报告。

图2：抑制肽P18处理对细胞凋亡的影响。A：OVA组为加OVA培养的对照组细胞，P18组为加OVA和P18肽培养的细胞，P18四聚体组为加OVA和P18四聚体培养的细胞。B：抑制肽P18四聚体和天花粉全长(TK)处理对细胞凋亡的影响。

图3：p-18四聚体对OVA致敏T细胞增殖的抑制作用。

图4：Real-time PCR检测p-18四聚体对细胞因子表达的影响。

图5：p-18四聚体选择性诱导CD8⁺CD28-CTLA4⁺Treg细胞

左：未刺激CD8⁺T细胞；右：M-Tk(p-18四聚体)处理后的CD8⁺T细胞。

图6：封闭抗体对M-Tk免疫抑制作用的影响

Ts：M-Tk处理后的CD8⁺T；aIL-10：抗IL-10单抗；aIL-4：抗IL-4单抗；Ig-control：同型对照抗体。

图7：p18四聚体对MOG35-55诱导EAE的治疗效应

A.B：T-control：无关肽段处理的CD8⁺T细胞；T-Tk-peptide：p18四聚体诱导的CD8⁺T细胞，C：从左至右：正常脑组织，MOG35-55诱导EAE发病脑组织，T-(p18四聚体)治疗组脑组织。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

制备毒性肽(p14)、抑制肽(p18)、抑制肽p18四聚体

(一)材料

固相萃取小柱(Waters公司)；芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸(Merck公司)；1-氧-3-双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐(TBTU)、1-羟基苯并三氮唑(HOBT)(ABI公司)；线性多聚赖氨酸、DIEA、三氟乙酸(TFA)(Sigma公司)；G-10，G-25凝胶(Pharmacia公司)；乙腈(Fisher公司)。

(二)方法

1.线性肽的合成

将PAC-PEG-PS树脂0.5g(替代度0.2mmol/g)用N-N二甲基甲酰胺(DMF)浸泡30min进行活化。采用对称酸酐法将已经活化的树脂进行第一个氨基酸的连接。称取待连接的氨基酸195mg，加入1.5ml二氯甲烷(DCM)和3滴DMF使之溶解，加入1mol/L二环己基碳化二亚胺(DCC)/N-甲基吡咯烷酮(NMP)275mL，磁力搅拌，室温下反应15min，反应完毕，过滤除去沉淀，蒸发掉过滤液中的溶剂，得到对称酐。将得到的对称酐溶于最少量的DMF中(保证最大浓度)，加入到活化的树脂中，摇动1min，然后加入0.1mol/L二甲氨基吡啶(DMAP)/DMF 460ul，摇动反应90min，吹去反应液，用10mL DMF洗涤3次，吹干。

其余14个氨基酸的连接采用原位活化法。将连接有第一个氨基酸的树脂放入反应瓶中，加入300ml/L哌啶/DMF溶液50ml，反应15min，以脱去FMOC保护基团。取2.0mmol保护氨基酸，用1mol/L DIEA/DMF5ml溶解，加入4.0mmol TBTU和4.0mmol HOBT(DMF为溶剂)预反应15～20min，然后和氨基酸树脂一起反应2h，去反应液，50ml DMF冲洗3次，吹干。

将已合成好连接有全部氨基酸序列的树脂放入裂解容器中。按照TFA∶水＝95∶5(V/V)切割试剂，使用时按25ml切割试剂与1g树脂反应的比例进行切割，反应时间为2h。将反应液快速倒入150ml乙醚中，收集沉淀，所用乙醚需预先放在低温冰箱中冷却。将沉淀重新加蒸馏水溶解，再转移到冻干机中冻干。

2.线性肽的脱盐

用5ml固相萃取小柱，先用蒸馏水、500ml/L甲醇、蒸馏水各15ml进行平衡，每次上样0.5ml(1～2g/L)，用蒸馏水15ml进行脱盐，按甲醇∶水＝85∶15(V/V)的比例配置洗脱液，15ml洗脱液进行样品的洗脱，洗脱液冻干后得样品。

3.在分支状多聚赖氨酸支架上用顺序法合成四分支肽

将赖氨酸作为第一个氨基酸按步骤(1)的方法进行连接。每次均脱保护15min以上，偶联60min。连接3次，得到四分支多聚赖氨酸骨架，将此支架上的赖氨酸作为合成肽的C端第一个氨基酸，依次进行四肽的连接。

4.在分支状多聚赖氨酸支架上用片段合成法制备八分支肽

将分支状多聚赖氨酸做为第一个氨基酸，把已合成并纯化好的线性肽作为待连接的氨基酸按照片断合成法连接到该支架上。将5.5mg(0.007mmol/L)线形肽和5mg(0.007mmol/L)线形多聚赖氨酸按照10∶1的比例混合，加PBS缓冲液(pH7.4)5～10ml溶解；加少量20g/L戊二醛进行连接，每10min加入2ml，加入3～4次，中间要摇晃或者采用磁力搅拌，反应完毕将溶液过G-25凝胶柱子，收集，冻干，得到3～5mg左右连接好的复合物。

5.八分支肽的脱盐

用G-25凝胶15g，溶胀后装柱，装好后的柱子先用蒸馏水50ml进行平衡，每次上样3～5ml，蒸馏水进行洗脱，用核酸蛋白检测仪检测220nm处紫外吸收，按峰收集组分，将第一个峰的组分收集，冻干，成为脱盐的样品，冻干后备用。

6.HPLC纯化多肽

用半制备HPLC，洗脱系统为：A液：50ml/L乙腈/H₂O₂溶液；B液：950ml/L乙腈/H₂O₂溶液；手动进样，每次1ml，流速4ml/min，线性梯度，45min内。B液从50ml/L升到500ml/L，然后5min内升到950ml/L，B液做最后洗脱。220nm处检测紫外吸收，按峰收集组分，用于质谱检测。将分子质量检测正确的组分收集，冻干，成为需要的纯品，备用。图1为p18的HPLC分析报告。表明所获制剂的纯度良好。

实施例2

锥兰排斥实验和体外凋亡诱导实验

(一)锥兰排斥实验(Trypan blue test)

该实验是检测待检细胞细胞膜是否破裂即细胞是否死亡的简易方法。外周血单个核细胞(PBMCs)自血液中以OptiPrep淋巴细胞分离液(AXIS-SHIELD)分取和洗涤后，悬浮与RPMI 1640细胞培养液(Gibco)，浓度调至10⁶/ml，加入1-2滴锥蓝染色液(The British DrugHouses.LTD)，5分钟后显微镜下计数。活细胞为透明状，死细胞因膜损伤，染料进入胞质成为蓝色不透明细胞。计数100个细胞中蓝色细胞的数量，即细胞死亡百分率。

(二)AnnexinV/PI双染色法检测细胞凋亡。

采用Annexin-V/PI细胞凋亡试剂盒(BD PharMingen)。

实验步骤为：

1.细胞收集：悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，每样本细胞数为1×10⁶/ml，1000rpm/min离心10min，弃去培养液。

2.用冷PBS洗涤1次，1000rpm/min离心10min。

3.用100ul的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育15min。

4.补加100ul的1X binding buffer，上机分析。

5.流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于56nm的滤器检测PI。

结果：图2是天花粉衍生肽细胞毒性检测结果，并以完整的天花粉蛋白(Tk)为对照。结果以检测处理24小时后的凋亡率进行判断。原理是凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有荧光信号。正常活细胞与此相似。图2的散点图上，左下象限为活细胞(FITC^-/PI^-)；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为(FITC⁺/PI⁺)；而右下象限为凋亡细胞(以圈标出)(FITC⁺/PI^-)。图2表明，p18四聚体和Tk显示相同抑制率(75％)时，Tk可引起部分T细胞发生凋亡，凋亡率为15.03％，而P18和P18四聚体不引起细胞凋亡，其凋亡率6.28％～8.03％，和OVA处理组(阳性对照)的7.23％没有区别。表明P18和P18四聚体抑制T细胞增殖不是因为其毒性作用，而是免疫抑制作用。

实施例3

比较天花粉全蛋白和相关衍生肽在体内外所发挥的生物学活性实验

(一)材料

卵清蛋白OVA、完全弗氏佐剂CFA(Sigma)；胎牛血清(Hyclone Lab，Inc)，RPMI 1640培养液(Invitrogen Corp)；³H-TdR(上海原子核研究所)；结晶纯天花粉蛋白(上海金山制药厂)，天花粉蛋白衍生肽p18四聚体和P18肽(实施例1制得)，MOG_35-55(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)(上海GL Biochem公司合成)。无关肽为结构和p18四聚体一样的四聚体肽段，相对分子量和p18四聚体相当为13.7kDa。实验同时应用下列试剂：OptiPrep淋巴细胞分离液(AXIS-SHIELD)；小鼠CD4、CD8磁珠分选试剂(Miltenyi Biotech)；PE-Cy5-CD3、FITC-CD8、PE-CD28、APC-CTLA4流式抗体(BD PharMingen)，抗CD3、CD28单抗、抗IL-10和IL-4封闭抗体单抗、抗CTLA-4单抗(BD PharMingen)；百日咳毒素(Sigma，St.Louis，MO，USA)；Real-time PCR引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)。

(二)方法

1.小鼠OVA免疫及淋巴结单个核细胞(LNMC)的分离

将CFA和OVA(2mg/m1)以1∶1比例充分混匀至“油包水”状。双侧足垫注射，每只小鼠注射0.1ml。将上述OVA免疫7～9d的小鼠断颈处死，浸泡在75％的乙醇中5min，取腹股沟和胭窝淋巴结，置于含2％FCS、2mmol/L EDTA 1640培养液的平皿中，经尼龙滤网碾碎后，再用200目筛网过滤除去组织块，Ficoll密度离心法分离单个核细胞，用含10％FCS、50μmol/ml 2-ME的1640培养液重悬，以每孔2×10⁵的数量接种于96孔圆底培养板中。

2.p18四聚体对OVA特异性T细胞增殖抑制的剂量依赖实验

实验组为LNMC加入OVA(100μg/ml)和不同浓度的p18四聚体(0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0ug/ml)，对照组加入OVA和剂量相对应的无关肽或Tk。同时设仅加OVA的阳性对照组以及不加p18四聚体、无关肽、Tk、OVA的阴性对照组，每组实验设5复孔，在37℃、5％CO₂的环境中分别培养1～5d。培养结束前18h加入³H-TdR，以多头细胞收集仪收集细胞至玻璃纤维膜上，液体闪烁仪测定cpm值。Tk的抑制率以[1-(实验组cpm值/阳性对照组cpm值)]×100表示。

3.流式细胞术分析

分别以单抗测定CD8⁺T细胞表面CD28、CTLA-4表达。

4.Real-time PCR检测M-Tk对细胞因子mRNA表达的影响引物设计如下：

β-actin：forward：5’-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3’，

reverse：5’-CCTTCACCGTTCCAGTTT-3’；

IFN-Y：forward：5’-TGAGACAGAAGTTCTGGGCTTCT-3’；

reverse：5’-CAAGATGCAGTGTGTAGCGTTCA-3’；

IL-10：forward：5’-ACCTGGTAGAAGTGATGC-3’.

reverse：5’-AAGGAGTTGTTTCCGTTA-3’；

IL-4：forward：5’-CTCGCAGCAAAGCAAGGTAA-3’，

reverse：5’-CATGAGTGGAGACACCAGC-3’。

5.CD4⁺T细胞的制备和CD8⁺T细胞的纯化

CD4⁺T细胞的制备和纯化

实验材料：

MACS-磁性激活细胞分离器；小鼠CD4⁺T细胞分离Kit(小鼠CD4⁺T细胞分离Kit同以下操作)；1ml生物素-抗体复合物；2ml抗生物素微珠。

1.MACS分离原理

使用小鼠CD4⁺T细胞分离Kit，通过清除非CD4⁺T细胞(负性选择)，小鼠CD4⁺T细胞被分离出。非CD4⁺T细胞由一个生物素结合的单克隆抗体复合物(是主要的标记试剂)和结合微珠的抗生物素单克隆抗体(作为第二标记试剂)间接磁性标记。在两次标记间不需要清脱试剂。把细胞放入MACS柱中并置于MACS分离器的磁场中，被磁性标记的非CD4⁺T细胞能被清除，而未标记的CD4⁺T细胞则可通过柱子。

样品准备

(1)使用标准的方法制备脾脏或淋巴结单个细胞悬液。

为获得最佳结果，在磁珠分离前制备单个细胞悬液是很重要的。为了除去可能阻塞MACS柱的细胞团块，在制备细胞后需将细胞从30μm的尼龙网中过滤一遍。死细胞可以和MACS微珠非特异的结合。因此，假如死细胞数较高，建议用密度梯度离心法或死细胞移除Kit来除去死细胞。

(2)细胞中加入适量的缓冲液进行细胞计数，并确定所用的细胞数。

(3)300xg离心10分钟使细胞沉淀(1100rpm×10min)。

2.磁性标记

为了避免标记过程中分离细胞表面覆盖上抗体以及非特异性细胞被标记，需要操作快速，保持细胞低温状态并只使用冰冻溶液。

当标记细胞少于10⁷个时，使用指定的体积。当细胞多于10⁷个时，需要按比例增加试剂体积和总体积(eg.标记2×10⁷个细胞时，所有指定的试剂体积和总体积均用2倍)。

标记时增加温度和延长孵育时间可能会使非特异性CD4⁺T细胞被标记并降低产量。在冰上操作需要增加孵育时间。孵育温度为4°～8℃，在冰箱内进行。

(1)完全移除上清液并重悬细胞(每10⁷细胞用40μl缓冲液)。

(2)每10⁷细胞加10μl Biotin-Antibody Cocktail.

(3)混匀后4°-8℃孵育10分钟。

(4)每10⁷细胞加30μl缓冲液和20ul Anti-Biotin MicroBeads.

(5)混匀后4°～8℃再孵育15分钟。

(6)加10～20x标记体积的缓冲液清洗细胞，300xg离心10分钟(1100rpm×10min)。

(7)移除上清液。

(8)10⁸细胞加500μl缓冲液重悬细胞(少于10⁸细胞时也使用500μl缓冲液)。

注意：如细胞数更多时，在细胞通过分离柱时按比例增加缓冲液体积。每500μl缓冲液能加的最大细胞浓度为10⁸个。

(9)选择一个MACS柱和MACS分离器并准备进行磁性分离。

3.磁性分离(用MS和LS柱进行磁性分离)

(1)把MS柱(磁性标记细胞最多为10⁷个)或LS柱(磁性标记细胞最多为10⁸个)放在适用于MACS分离器的磁场中。

(2)用适量缓冲液洗柱：MS：500μl    LS：3ml

(3)用适量缓冲液配制细胞悬液通过柱子：

MS：500-1000μl    LS：1-10ml

允许细胞通过柱子并搜集流出的细胞悬液作为未标记细胞——代表富集的CD4⁺T细胞。

(4)再用适量缓冲液洗柱：MS：3×500μl；LS：4×3ml

搜集所有流出液入第3步同一管流出液中。

(供选择)把剩余细胞从磁场中洗脱作为磁性标记部分(非CD4⁺T细胞部分)。富集的CD4⁺T细胞通过流式细胞仪检测纯度＞95％以上。

CD8⁺T细胞的制备和纯化：小鼠CD8⁺T细胞分离Kit，方法同上。

6.抗IL-10、IL-4封闭抗体对p18四聚体对T细胞增殖抑制作用的影响

培养体系为：分离纯化的C57BL/6小鼠CD4⁺T细胞(Th)加上经照光处理的BALB/c小鼠脾细胞(APC)，分别加p18四聚体处理的CD8⁺T细胞(Ts)、抗IL-10单抗、抗IL-4单抗(详见图例说明)，同时设置同型对照抗体(IgG)与空白对照组(none)，在37℃、5％CO₂的环境中培养3d，培养结束前18h加入³H-TdR，测定cpm值。

7.Transwell共培养

利用Transwell双层非接触共培养系统，分四组(表1)，p18四聚体处理后得到的CD8⁺T细胞为Ts细胞，在37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱内培养，共培养3d，培养结束前18h加入³H-TdR，测定cpm值。Transwell共培养检测p18四聚体处理的CD8⁺T细胞的体外抑制功能见表1

表1

	组1	组2	组3	组4
					上层下层	培养液Th+APC	培养液Ts+APC	培养液Th+Ts+APC	Ts+APCTh+APC

8.MOG_35-55诱导EAE

为了诱导实验变态反应性脑脊髓膜炎(experimental allergicencephalomyelitis，EAE)，6-10周龄的雌性C57BL/6小鼠，以200μlFreund’s完全佐剂(CFA)乳化后的碱性髓鞘蛋白(BMP)相关肽MOG_35-55共200μg，背部皮下注射4点。在0天和2天时，每只小鼠尾静脉注射200ng/200μl PBS百日咳毒素。临床分数的判断依据Tompkins的方法分为0～5级。0：无异常；1：尾部麻痹；2：尾部麻痹和后肢无力；3：后肢麻痹；4：后肢麻痹和前肢无力；5：死亡。并记录平均每日临床分数。

过继实验诱导EAE采用如下方法：取MOG_35-55刺激7～11天的淋巴结，将10⁷/ml淋巴结细胞与40μg/ml MOG_35-55和rmIL-2(20ng/ml)共同培养72小时。收集这种MOG_35-55-致敏的细胞，洗涤并重悬于RPMI1640培养基(1×10⁷/ml)后，以这些细胞注射naive C56BL/6小鼠，1×10⁷cells/只，在0天和2天的时候，注射200ng/200μl PBS百日咳毒素。

9.T-(P18四聚体)对MOG_35-55诱导EAE的影响

取EAE小鼠淋巴结细胞以MACS分离得到MOG_35-55致敏CD4⁺T细胞，在96孔培养板中，按5×10⁵/孔加入MOG_35-55致敏的CD4⁺T细胞、4000rads照光的同品系APC’s(5×10⁶/孔)，及数量递增的T-(P18四聚体)或T-(control)细胞和MOG_35-55(40μg/ml)。通过淋巴细胞增殖反应检测T-(P18四聚体)对致敏CD4⁺T细胞对MOG_35-55的二次反应的抑制效果。

T-(P18四聚体)对EAE的体内治疗效果。首先，在MOG_35-55加CFA开始诱导EAE前3天，尾静脉注射1×10⁷T-(p18四聚体)或T-(control)细胞。随后记录临床分数，并将小鼠脊椎以10％福尔马林固定并作组织切片。石蜡包埋组织切片以H-E检测单核细胞的浸润。

(三)结果

1.T-(P18四聚体)诱导体外免疫抑制，由图3可见，M-Tk(p-18四聚体)在低剂量范围内(0.10～10.0μg/ml)，对特异性抗原OVA增殖系统显示强烈的抑制作用，并呈剂量依赖性递增效应，当M-Tk(p-18四聚体)浓度为2μg/ml时其抑制率已经达到60.8％。次效应高于未修饰肽段及Tk在相同剂量范围内的抑制率。

2.T-(P18四聚体)诱导和增强II型细胞因子的表达，图4显示，M-Tk(p-18四聚体)处理24小时后，IL-4及IL-10mRNA表达上调(P＜0.05)，与此同时，IFN-Y mRNA在M-Tk(p-18四聚体)处理组表达明显降低(P＜0.01)，说明M-Tk(p-18四聚体)抑制细胞因子IFN-Y及上调IL-4和IL-10的表达。

3.T-(P18四聚体)激活特定的调节性T细胞

流式检测的结果(见图5)显示M-Tk(p-18四聚体)处理T细胞后，CD8⁺T细胞亚群明显增加(53.32％)，其中绝大多数为CD8⁺CD28^-T细胞(90％)，与阴性对照组(1.13％)相比有明显升高，统计学比较有显著差异(P＜0.01)。低剂量的Tk处理T细胞后，CD8⁺T细胞亚群也明显增加，其中CD8⁺CD28^-T细胞的比例占17.68％，这也从另外一方面表明，M-Tk(p-18四聚体)比Tk具有更强的免疫抑制作用。当以流式检测CTLA4的表达时发现，在M-Tk(p-18四聚体)诱导的CD8⁺T细胞亚群中，CTLA4表达明显升高(78％)，与对照组相比有明显的差异(P＜0.01)，抗CTLA4单抗能明显逆转M-Tk的抑制作用(见图6)，这说明CTLA4有可能作为M-Tk(p-18四聚体)诱导的CD8⁺抑制性T细胞的一个特征性标志。

图6显示，M-Tk(p-18四聚体)浓度在5μg/ml时，对T细胞增殖的抑制作用幅度在83.7％。抗IL-10、IL-4抗体单独封闭后可以削弱M-Tk(p-18四聚体)的免疫抑制作用，在IL-4和IL-10同时封闭后，cpm值回升幅度(抗抑制作用)较大(p＜0.05)。与此同时，同型对照抗体(controlIg)与空白对照组(no Ig)没有明显差异。这些结果提示M-Tk(p-18四聚体)可以通过上调II型细胞因子IL-10和IL-4的分泌，发挥免疫抑制作用。

Transwell实验结果显示M-Tk(p-18四聚体)诱导的CD8⁺T细胞和T细胞共培养的时候能显著抑制T细胞的增殖，抑制率为70.1％，在非接触式培养的时候，不能明显抑制T细胞的增殖，抑制率为18.2％(P＞0.05)(见图7)，这说明M-Tk(p-18四聚体)发挥其免疫抑制作用必须通过细胞间的接触。

4.T-(P18四聚体)的免疫抑制作用对治疗自身免疫病的效果

为了进一步证实T-(p18四聚体)在体内的功能，我们以MOG_35-55在C57BL/6小鼠中诱导并建成了EAE模型。见图7，A所示，T-(p18四聚体)能够以剂量依赖性的特点抑制MOG_35-55-特异性T细胞的增殖反应。体内实验表明(见图7，B所示)，在主动诱导EAE模型的前3天，过继输入T-(p18四聚体)能够明显保护临床EAE的发生或减轻其症状，导致临床症状分值降低61％。因此我们认为T-(p18四聚体)能对抗EAE的发生，具有治疗自身免疫性疾病的前景。图7，C中进一步显示，取EAE脊椎组织固定后，以苏木素-伊红(HE)染色检测单个核细胞的浸润状况(EAE的中枢神经系统炎症特征)。T-(p18四聚体)治疗小鼠的单个核细胞浸润降低。

SEQUENCE LISTING

<110>上海交通大学医学院

<120>天花粉蛋白衍生肽及其应用

<130>/

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>15

<212>PRT

<213>中药栝楼(Trichothansus kirilowii Max)

<400>1

Ile Gly Lys Arg Val Asp Lys Thr Phe Leu Pro Ser Leu Ala lle

1               5                   10                   15

<210>2

<211>60

<212>PRT

<213>中药栝楼(Trichothansus kirilowii Max)

<400>2

Ile Gly Lys Arg Val Asp Lys Thr Phe Leu Pro Ser Leu Ala Ile Ile

1               5                   10                  15

Gly Lys Arg Val Asp Lys Thr Phe Leu Pro Ser Leu Ala Ile Ile Gly

            20                  25                      30

Lys Arg Val Asp Lys Thr Phe Leu Pro Ser Leu Ala Ile Ile Gly Lys

        35                  40                      45

Arg Val Asp Lys Thr Phe Leu Pro Ser Leu Ala Ile

    50                  55                  60

<210>3

<211>15

<212>PRT

<213>中药栝楼(Trichothansus kirilowii Max)

<400>3

Ala Leu Asp Ser Ala Ile Thr Thr Leu Phe Tyr Tyr Asn Ala Asn

1                 5                 10                   15

Claims (2)

1.天花粉蛋白衍生肽p18四聚体，其制备方法为将赖氨酸作为第一个氨基酸，得到四分支多聚赖氨酸骨架，将此支架上的赖氨酸作为合成肽的C端第一个氨基酸，依次进行单肽的连接，所述单肽序列为IGKRV DKTFL PSLAI。

2.根据权利要求1所述的天花粉蛋白衍生肽p18四聚体在制备治疗多发性硬化病药物中的应用。

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