CN101230339B - 大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物和基因及制法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物和基因及制法及用途。其天然表观分子量为72kDa，由α亚基和β亚基按αβ₂的分子形式以非共价键连接而成，为一类新的ATPase和GTPase酶，具有多种细胞生物活性，在体外纳摩尔水平能够杀死多种肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞脱落和凋亡。在皮摩尔水平具有促进创伤修复的活性。在细胞外经单泛素化修饰，能够直接转运到细胞核中进行基因表达的调控从而调节细胞状态，包括细胞迁移、脱落、生长。本发明的蛋白复合物提供了非晶状体βγ-晶状体蛋白全新的细胞生物学功能及其能够与三叶因子蛋白协同作用的机制，可应用于生物医学试剂制备和抗肿瘤以及促进创伤修复制药。

Description

大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物和基因及制法及用途

技术领域：

本发明涉及一种大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物和基因及制法及用途，属生物医学领域。

背景技术

组织伤口修复是一个由血细胞，细胞外基质和多种细胞调节因子参与，交互作用的动态过程。组织伤口修复包括三个阶段：炎症反应，组织形成和组织再造。在炎症反应阶段，通过周围的受损的血管，从血清中释放各种生长因子，细胞因子和低分子量的小分子化合物，引起炎症反应，与受损血管周围的细胞外基质相互胶联，凝结，形成一道防御外界微生物的屏障，也作为早期创伤修复过程中生长因子作用的支架。同时，释放的各种生长因子和细胞因子能够启动伤口修复中的细胞增殖和迁移。在组织形成和组织再造阶段，在各种生长因子和细胞因子的作用下，在伤口周围出现由新形成的毛细血管长出物组成的肉芽组织，最终肉芽组织结痂，形成疤痕，修复伤口。

最新研究表明，组织伤口修复反应与肿瘤发生过程有密切关系，肿瘤生长也可以被视为一种不受调节的组织修复过程。在正常的组织中，组织修复反应被诱导发生，在完成损伤组织修复后，它能够被调控停止下来。但是在有致癌性的突变的情况下，最初的肿瘤生长被认为是对组织的损害而激发组织修复反应的发生。这就导致了一个恶性循环：组织修复产生的细胞会被用于肿瘤团的生长，而更大的肿瘤团将被认为是更大的组织损害，从而导致组织修复反应提供更多的细胞用于肿瘤的生长。如果能够鉴定出启动因子信号及其负控制因子信号，就能试着去中和它，从而阻止肿瘤组织修复程序，进而也能帮助来抑制或阻止肿瘤的生长。因此，寻找肿瘤所利用的触发组织修复反应的重要启动因子信号及其负控制因子信号成为目前和未来的肿瘤研究的热点方向之一。

脊椎动物中，晶状体蛋白(crystallin)是眼球晶状体的结构蛋白(C.T.Morner于1893年最早发现)，决定了晶状体的折光性和通光性。晶状体蛋白分为α和βγ两大类，α-晶状体蛋白属于广泛分布的小的热休克蛋白质家族。βγ-晶状体蛋白具有特征性的希腊钥匙模体(Greek key motifs)，每个模体由40个氨基酸残基组成，而两个结构模体可通过不对称性排列形成一个结构域，故将它们归为βγ-晶状体蛋白超家族。除了晶状体外，非晶状体βγ-晶状体蛋白质(non-lens βγ-crystallin)广泛分布在其他组织中。在微生物中，非晶状体βγ-晶状体蛋白质主要为压力诱导表达的相关蛋白质。例如Protein S和Spherulin3a。Protein S是一种来源于土壤中革兰氏阴性细菌Myxococcus xanthus的孢子专一蛋白，当处于营养缺乏的恶劣条件下，Protein S被诱导大量分泌表达，并结合钙离子通过寡聚化作用在细菌表面组装形成多层衣壳，在恶劣条件下保护自身。Spherulin 3a，来源于细菌Physarum polycephalum的囊泡形成蛋白，在各种压力环境下合成，参与形成胞囊和休眠。在脊椎动物中，已知的非晶状体βγ-晶状体蛋白质包括ep37和AIM1。EP37(epidermis-specific protein 37，表皮分化蛋白37)是表达在两栖动物Cynopspyrrhogaster(日本蝾螈，潮汕蝾螈或称赤腹蝾螈)的胚胎表皮，皮肤腺和胃表皮细胞中的蛋白质。黑色素瘤缺失蛋白1(AIM1，absent in melanoma 1)，为一类首先在人黑色素瘤疾病模型中缺失的与肿瘤抑制相关的新基因。AIM1在哺乳动物的胚胎发育过程中时空特异性的表达调节，具有不同大小的转录本，在成体中AIM1大量表达于皮肤，肺，心脏，肝和肾等器官，认为是一个潜在的肿瘤抑制基因。尽管EP37蛋白和AIM1基因被认为可能参与表皮发育和肿瘤抑制，但是目前对于他们的分子特性，生理功能和分子作用机制还知之甚少。

三叶因子(trefoil factor，TFF)为一类含有一个或者多个三叶因子结构域(或称为P-结构域，该结构域由大约38～39个氨基酸残基组成，含有6个半胱氨酸，以1-5，2-4，3-6的形式形成二硫键)的分泌型的蛋白质，广泛地分布在哺乳动物的胃肠道上皮及其他的上皮系统中，被认为与粘膜保护，损伤修复和肿瘤抑制密切相关。第一个三叶因子多肽pS2/TFF1发现于人乳腺癌MCF7细胞中，在基因敲除三叶因子，小鼠的肿瘤发生率升高，同时三叶因子能够引起肿瘤细胞凋亡，因此推测三叶因子为潜在的肿瘤抑制因子。三叶因子能够引起趋化反应，促进表皮细胞的细胞迁移和伤口修复，在胃粘膜的损伤修复中起到重要的作用，因此，三叶因子还作为促进生长蛋白。例如，目前报导重组人源三叶因子2(hTFF2)可以以3-6倍的效率增加大鼠小肠隐窝上皮细胞(rat intestinalepithelial cell Lines，IEC-6)的细胞迁移能力，但是其所需要的浓度约为80多微摩尔。但是，自三叶因子蛋白发现以来一直作为孤儿配体存在，与三叶因子作用的受体和详细的信号转导通路不清楚，也没有文献报道三叶因子家族蛋白和非晶状体βγ-晶状体蛋白质能够联合协同作用。

细胞内泛素化修饰信号的具有多种功能，例如多泛素化修饰信号认为是蛋白酶体降解蛋白的信号，单泛素化修饰信号则参与了其他不依赖于蛋白酶体降解的重要的细胞生理功能，包括介导细胞外分子内吞，转运到细胞核调节。最近研究表明，蛋白激素，生长因子和细胞因子可通过单泛素化修饰，经过一系列信号分子的调节，能够直接转运到细胞核，调节细胞基因表达，发挥着重要的生理作用。例如，成纤维成长因子(fibroblastgrowth factors，FGFs)，血小板生长因子(platelet derived growth factors，PDGF)，表皮生长因子(epithelial growth factors，EGF)，和血管生长因子(vascular endothelial growthfactors，VEGF)结合受体后，经过单泛素化修饰，能够被细胞内吞，直接转运到细胞核，调节基因表达，刺激细胞生长，增殖和分化，在胚胎发育，组织再生等生理过程中发挥重要作用。

大蹼铃蟾(Bombina maxima)主要分布在中国西南的云南省和四川省，是我国特有的资源性两栖动物种类，也是特色的民族民间药物。大蹼铃蟾皮肤分泌物中已经发现了大量的小分子量的肽类活性组分，如具有调节或者激素的功能的肽类，为哺乳动物激素分子，神经递质和生长因子的类似物；抗菌肽类，作为两栖动物天然免疫系统的重要组成部分。目前，在两栖类动物皮肤中寻找活性单体化合物和大分子先导化合物已成为了国内外新药和研究工具性探针的热点之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物，还提供这种蛋白复合物的基因，以及其制备方法，还提供这种蛋白复合物及其基因的用途。大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物在体外具有ATPase和GTPase活性，为一类新的ATPase和GTPase酶。其具有多种细胞生物活性：在体外纳摩尔水平能够杀死多种肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞脱落和凋亡；在皮摩尔水平具有促进创伤修复的活性；在细胞外经单泛素化修饰，能够直接转运到细胞核中进行基因表达的调控从而调节细胞状态，包括细胞迁移、脱落，生长。本发明的大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物提供了非晶状体βγ-晶状体蛋白全新的细胞生物学功能及其能够与三叶因子蛋白协同作用的机制，可应用于生物医学试剂制备和抗肿瘤以及促进创伤修复制药。

本发明的大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物是从两栖类皮肤中纯化得到的天然大分子蛋白质，其天然分子量为72kDa，由两种类型的亚基所组成，α亚基和β亚基按αβ2的分子形式以非共价键连接而成。序列测定表明其α亚基由336个氨基酸残基组成，具有SEQ ID NO：1中的氨基酸序列，为非晶状体βγ-晶状体蛋白质超家族成员。β亚基成熟肽由146个氨基酸残基组成，包含三个三叶因子结构域，具有SEQ IDNO：2中的氨基酸序列。该蛋白质被命名为：大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物(complex of non lens-βγ crystallin and trefoil factor)，缩写为：βγ-CAT。

本发明的大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物是从两栖类皮肤中得到的天然存在的非晶状体βγ-晶状体蛋白家族成员与三叶因子家族成员的蛋白质复合物，也是非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子在天然条件下联合协同作用。

编码本发明大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物的α亚基的cDNA由1251个核苷酸组成，该cDNA的核苷酸序列自5’端至3’端为SEQ ID NO：3，其特征在于编码成熟的βγ-CAT的α亚基蛋白为SEQ ID NO：3中第22-1029位核苷酸，其编码相对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

编码本发明大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物的β亚基的cDNA由1830个核苷酸组成，该cDNA的核苷酸序列自5’端至3’端为SEQ ID NO：4。其特征在于编码成熟的βγ-CAT的β亚基蛋白为SEQ ID NO：4中第82-519位核苷酸，其编码相对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明提供的大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物，其制备方法可以通过生物化学分离纯化方法，从中国特产两栖动物大蹼铃蟾皮肤中分离纯化得到：将野外采集的活体大蹼铃蟾饲养于实验室内，用清水冲洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加适量的无水乙醚刺激，密闭容器3～5分钟，待大蹼铃蟾皮肤表面有大量的泡沫状分泌物产生，打开容器，轻柔按摩动物背部皮肤，并用含5mM EDTA的生理盐水溶液冲洗大蹼铃蟾，收集皮肤分泌物，离心处理(5000rpm，4℃，20分钟)，上清液冷冻干燥，即得皮肤分泌物。

将皮肤分泌物液经过冻干，溶解，透析和离心处理，分别通过分子凝胶层析(AKTASephadex superfine G-100分子筛层析柱)和离子交换柱(AKTA Mono-Q HR5/5阴离子层析柱)两道分离纯化流程，即可获得纯化的大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物。

大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物的α亚基和β亚基的基因的克隆包括：大蹼铃蟾皮肤总RNA提取，mRNA的纯化及反转录，构建皮肤cDNA文库，分别根据两个亚基的N端已知序列和部分内肽片段序列，设计引物，利用PCR筛选法筛选编码大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物的α亚基和β亚基的基因，根据βγ-CAT的α亚基的全cDNA推导出对应的蛋白序列，结合肽指纹图谱和已知内肽片段序列进行验证，确认编码βγ-CAT的α亚基的全cDNA。

大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物的α亚基和β亚基的全cDNA作为基因工程制备大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物的应用。

本发明提供的大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物具有ATPase和GTPase活性，还具有核苷酸结合活性，为一类全新的尚未报道过的ATPase和GTPase，

可用于生物医学试剂制备和制药

本发明提供的大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物在纳摩尔水平能够选择性的杀死肿瘤细胞，并且能够诱导癌细胞发生脱落和凋亡。

本发明提供的大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物在皮摩尔水平(50pM)就能够显著抑制肿瘤细胞的生长。

本发明提供的大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物在皮摩尔水平就能够促进细胞迁移，具有促进创伤修复的活性。目前报导的重组人源三叶因子2(hTFF2)可以以3-6倍的效率增加大鼠小肠隐窝上皮细胞(rat intestinal epithelial cellLines，IEC-6)的细胞迁移能力，但是其所需要的浓度太高，约为80多微摩尔(83μM)。本发明提供的大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物诱导细胞迁移时候所需要的浓度仅在皮摩尔水平，活性比其他报道的哺乳动物来源的单链三叶因子蛋白要高一百万倍左右。

本发明提供的大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物能够通过单泛素化修饰，以囊泡化的方式，直接迅速转运到细胞核中进行基因表达的调控从而调节细胞状态，包括细胞迁移、脱落，生长。

本发明提供的大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物揭示脊椎动物非晶状体βγ-晶状体蛋白全新的细胞生物学功能及其能够与三叶因子蛋白协同作用的协同机制。

下面结合附图，通过具体实施例来详细阐述本发明，但是本发明的内容并不仅局限于此。

附图说明

图1为本发明蛋白复合物βγ-CAT的分离制备流程，A图为分子筛凝胶层析分离图谱，B图为阴离子凝胶层析图谱。

图2为本发明蛋白复合物βγ-CAT的α亚基的氨基酸全序列表。

图3为本发明蛋白复合物βγ-CAT的β亚基的氨基酸全序列表。

图4为本发明蛋白复合物βγ-CAT的α亚基基因的核苷酸全序列表。

图5为本发明蛋白复合物βγ-CAT的β亚基的基因的核苷酸全序列表

图6为本发明蛋白复合物βγ-CAT体外测定ATPase和GTPase，核苷酸结合活性，A和B图为核苷酸结合测定，C图为ATPase和GTPase活性测定。

图7为本发明蛋白复合物βγ-CAT体外选择性对多种肿瘤细胞细胞毒杀伤作用。

图8为本发明蛋白复合物βγ-CAT诱导人结肠肿瘤细胞HCT116发生凋亡。

图9为本发明蛋白复合物βγ-CAT抑制黑色素瘤A375细胞生长。

图10为本发明蛋白复合物βγ-CAT诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移和伤口修复，A图为βγ-CAT诱导HUVEC细胞迁移的量效关系图，B图为βγ-CAT诱导HUVEC伤口修复的量效关系图。

图11为本发明蛋白复合物βγ-CAT诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)产生囊泡化，A图为活体观察βγ-CAT的囊泡化效应，B图为氯化铵对βγ-CAT的囊泡化效应的影响，C图为βγ-CAT的囊泡化效应的量效和时效曲线。

图12为本发明蛋白复合物βγ-CAT通过囊泡化，经单泛素化修饰，直接转运到人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞核，A图为Cy3标记βγ-CAT显示细胞核定位，B图为FITC标记抗体原位杂交显示βγ-CAT的细胞核定位，C图为抗体免疫杂交分析βγ-CAT在细胞内的转运中间体及其单泛素化修饰。

具体实施方式

实施例1：大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物的分离纯化，结构测定和α亚基和β亚基基因的分子克隆

(一)大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物的分离纯化

第一步：将野外采集的活体大蹼铃蟾饲养于实验室内，用清水冲洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加适量的无水乙醚刺激，密闭容器3～5分钟，待大蹼铃蟾皮肤表面有大量的泡沫状分泌物产生，打开容器，轻柔按摩动物背部皮肤，并用含5mM EDTA的生理盐水溶液冲洗大蹼铃蟾，收集皮肤分泌物，离心处理(5000rpm，4℃，20分钟)，上清液冷冻干燥，即得皮肤分泌物。

第二步：分子筛Sephadex superfine G-100层析：将皮肤分泌物液冻干粉溶于缓冲液(50mM Tris-HCl buffer，pH7.8，containing 150mM NaCl and 5mM EDTA)，4℃过夜充分溶解后离心处理(5000rpm，4℃，20分钟)取上清。上清液经0.45μm滤头过滤后，上样于以相同的缓冲液预先平衡好的AKTA Sephadex superfine G-100分子筛层析柱(2.6×100cm)，流速为1.0ml/min。按检测器280nm的光吸收值收集第二峰初样(见图1A)。

第三步：AKTA Mono-Q HR5/5阴离子层析柱：经冻干浓缩和透析处理后(20mMTris-HCl，pH7.8，4℃透析24小时)，上样于以透析缓冲液预先平衡好的AKTA Mono-QHR5/5阴离子层析柱，通过盐梯度进行洗脱(A液：20mM Tris-HCl，pH8.3；B液：20mM Tris-HCl，pH8.3，containing 1M NaCl；A和B为等体积)。收集箭头所示峰，即得大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物，见图1B。

纯化得到的大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物的纯度采用SDS-PAGE/NATIVE-PAGE测定，电泳方法参照Laemmli(Laemmli 1970)，蛋白条带纯度采用银染方式检测。

(二)大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物的结构测定

1.βγ-CAT分子量测定：βγ-CAT的表观分子量采用Gel Pro V3.0软件对银染的SDS-PAGE(T＝10％)电泳胶进行分析。天然分子量测定采用分子筛排阻层析(Sephadexsuperfine G-100，2.6×100cm)，Phosphatase B(97.4kDa)，BSA(66.2kDa)，Ovalbumin(45.0kDa)，Chymotrypsin(25.0kDa)作为内参分子量标准，取1mg βγ-CAT上样，流速为0.2ml/min，按5min/tube收集，计算βγ-CAT天然分子量，同时采用基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测βγ-CAT的精确分子量。

2.βγ-CAT的蛋白定量：βγ-CAT的蛋白定量测试采用BIO-RAD公司的PROTEIN ASSAYKIT，采用考马斯亮兰G-250染料，BSA做为浓度梯度标准校正曲线，依照产品技术手册进行。

3.βγ-CAT的α亚基和β亚基的N末端氨基酸序列测定：纯化的βγ-CAT经SDS-PAGE(T＝10％)电泳后，转移到PVDF膜上，使用美国Applied Biosystems 476A型蛋白多肽序列仪，用Edman降解法分别测定βγ-CAT的α亚基和β亚基的N末端氨基酸序列。

4.βγ-CAT的α亚基和β亚基的拆分：采用HPLC1100系统Vydac C4 RP-HPLC层析柱来实现拆分βγ-CAT的两个亚基。流动相分别为30％乙腈-70％去离子水-0.1％三氟乙酸和30％异丙醇-70％乙腈-0.1％三氟乙酸。

5.βγ-CAT的α亚基和β亚基的内肽序列分析：将用VydacC4 RP-HPLC拆分得到的βγ-CAT的α亚基和β亚基采用胰蛋白酶/Endoprotease Glu-CV8消化参照产品指导进行，通过Applied Biosystems 476A型蛋白多肽序列仪进行序列分析。

6.βγ-CAT的α亚基和β亚基肽质量指纹图谱的鉴定：先将βγ-CAT的α亚基和β亚基先进行二硫键的还原及巯基保护(碘乙酰胺化)，处理方法为：将0.1mg βγ-CAT溶解于100μl 0.5M pH8.5 NaHCO₃中，再加入10μl 0.1 M DTT，于42℃反应60分钟，然后加入20μl 0.2M碘乙酰胺室温暗处反应2小时。再将处理的βγ-CAT经10％SDS-PAGE分离，用考马斯亮兰R-250染色，待脱色至背景清晰后切下采用PEBiosystems Voyager System 6192进行胰蛋白酶酶解肽质量指纹图谱的测定。

(三)大蹼铃蟾非晶状体βr-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物的α亚基和β亚基编码基因的分子克隆

技术路线：包括大蹼铃蟾皮肤总RNA提取，mRNA的纯化及反转录，构建皮肤cDNA文库，分别根据两个亚基的N端已知序列和部分内肽片段序列，设计引物，利用PCR筛选法筛选编码大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子复合物βγ-CAT的α亚基和β亚基的基因。

1.大蹼铃蟾皮肤总RNA提取：活体大蹼铃蟾用水清洗干净，快速捣毁脑、脊髓处死动物，迅速剥皮，放入液氮中速冻4h，取150mg皮肤组织，加入2ml总RNA提取缓冲液，于20ml玻璃匀浆器中匀浆30min，加入等体积酚/氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10min，4℃，12,000rpm离心10min，取上清，加入等体积异丙醇，室温放置10min，4℃，12,000rpm离心10min，弃上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，沉淀物即为大蹼铃蟾皮肤总RNA。

2.大蹼铃蟾皮肤mRNA的纯化：采用美国Invitrogen公司的mRNA分离纯化试剂盒进行纯化。取大蹼铃蟾皮肤总RNA 500μg溶于500μl经过DEPC处理的灭菌水中，65℃水浴10min，加人3μl的Oligo(dT)探针和13μl 20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。磁珠(SA-PMP)的洗涤：将磁珠(随mRNA分离纯化试剂盒)轻弹混匀，至磁力架吸附30sec，弃上清，加0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30sec，最后加0.1ml0.5×SSC悬浮，称之为B液。将A液加入B液中，室温放置10min，至磁力架吸附30sec，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.1ml DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30sec，将上清移至新的离心管，再加入0.15ml DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30sec，移上清至上述离心管，上清中为纯化的大蹼铃蟾皮肤mRNA。加入1/10体积3 M乙酸钠，pH5.2，等体积异戊醇，于-70℃放置30min，然后于4℃，12,000rpm离心10min，弃上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。

3.大蹼铃蟾皮肤cDNA文库的构建：采用SuperScript^TM Plasmid cloning System(GIBCO/BRL)试剂盒来构建皮肤cDNA文库，但是操作方法有所改进。cDNA第一链合成(mRNA反转录)，于1.5ml试管中加入2μl NotI引物和7μl mRNA，3μl DEPC水，70℃保温10分钟，立即放入冰浴冷却，然后加入4μl 5X第一链合成缓冲液，2μl0.1M DTT，1μl 10mM dNTP混合物，再加入1μl SuperScript II反转录酶，于37℃保温1小时后放入冰浴。cDNA第二链合成，在第一链合成试管中加入：95μl DEPC水，30μl 5X第二链合成缓冲液，3μl 10mM dNTP混合物，1μl大肠杆菌DNA连接酶，4μl大肠杆菌DNA多聚酶I，1μl大肠杆菌RNA酶，反应总体积150μl，混匀后于16℃保温2小时；加入2μl T₄DNA多聚酶继续保温5分钟。DNA的抽提和乙醇沉淀，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)混合物抽提，12000rpm离心5分钟，取140μl上层溶液转移到干净试管中，加入70μl 7.5 M乙酸铵，0.5ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干。Sal I adapter的连接，上述沉淀溶于25μl DEPC水中，加入10μl 5XT₄DNA连接酶缓冲液，10μl Sal I adapter，5μl T₄DNA连接酶，反应总体积50μl，于16℃保温16小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于41μlDEPC水中。Not I酶切，于cDNA溶液中加入5μl酶切缓冲液，4μl Not I酶，反应体积50μl，于37℃保温2小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于100μlTEN缓冲液中。将cDNA样品过DNA分级分离柱(试剂盒含有)后，去除小于300bp核苷酸的cDNA。cDNA大于300bp核苷酸的组分合并，体积为20μl，加入5μl酵母tRNA，100μl 7.5M乙酸铵，0.6ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，沉淀溶于20μl TEN缓冲液中。合成的cDNA连接酶缓冲液，1μlpSPORT1质粒(Not I-Sal I酶水解，50ng)，4μl 5X T₄DNA连接酶，反应体积20μl，室温反应3小时，可准备转化大肠杆菌HB101感受态细胞。感受态细胞的制备，挑取单个HB101菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接种于50ml LB培养液中，37℃振荡2小时，待菌液540nm 0.D.值为0.4时，4℃，2000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀用0.1M CaCl₂重悬，分装后置冰浴内备用。连接产物的转化：取上述连接产物5μl加入50μl感受态细胞冰浴20分钟，42℃热休克60秒，再置冰浴5分钟，加入无氨苄青霉素的SOC培养基0.4ml，37℃培养1小时，取200μl涂布于含氨苄青霉素的LB平皿(15cm直径)，37℃培养16小时，每个LB平皿用5ml LB液体培养基洗涤菌落，加10％甘油冻存构建的cDNA大约含4×10⁵个单独克隆。

4.βγ-CAT的β亚基的分子克隆：按测定的N未端及内肽序列，我们设计了两条引物，上游引物P_1F和下游引物P_3R，P_1F：5’-TT(CT)TCNGA(CT)(CT)TNCA(AG)ATAGG-3’，对应于βγ-CAT-β N端的1-7氨基酸残基，P_3R：5’-ATNGGNTCNGC(TG)CT(TC)TTCCT-3’，对应于内肽102-108氨基酸残基。以5μg mRNA为模板，以oligo-d(T)₁₈为引物，获得cDNA第一链。利用P_1F和P_3R两条引物进行部分序列的PCR扩增。PCR条件为：94℃ 2min，92℃10sec，50℃ 30sec，72℃90sec，共35个循环，72℃ 10min。所得片段克隆到pGEM-T载体(Promega)，测序，获得目的序列。根据该序列设计特异引物，上游引物P8：5’-AGTCTGAAGTGTGCAGTTGCA-3’对应于β亚基成熟肽的8-14氨基酸残基，和下游引物P_86R：5’-TAATGCATGAAAACAGCAGCC-3’，对应于β亚基成熟肽的80-86氨基酸残基。以P₈和P_86R为特异性引物，参照张云文章中所述方法，在所构建的大蹼铃蟾皮肤cDNA文库中筛选βγ-CAT的β亚基全长cDNA克隆。筛选阳性克隆的方法：细菌接种于96孔板上以8×8矩阵排列的方式培养于LB培养基(内含有100μg/ml胺苄青霉素)，总共64孔，每孔100μl 37℃培养过夜。第一轮筛选将细菌稀释到1000个细菌/100μl，第二轮筛选稀释至50个细菌/100μl。于64个培养孔按照横竖方式分别合并细菌，由64孔合并为16孔，然后用引物进行PCR扩增，找出具有阳性克隆的孔再进行第二轮筛选，第二轮筛选结束后，将含目的克隆的培养细菌划线培养，挑取单克隆进行PCR测定，最后筛选出阳性单克隆进行核苷酸序列测定。PCR条件：94℃，2min；92℃10sec，50℃ 30sec，72℃ 40sec，共35个循环。

5.βγ-CAT的α亚基的分子克隆：根据测序获得的内肽片段序列，共设计合成15条正义引物和17条反义引物，将这些引物以一定的排列组合进行嵌套PCR，将PCR产物亚克隆进pGEM-T载体(Promega)，进行测序，筛选出含有βγ-CAT的α亚基内肽片段的亚克隆。以引物BMT-H-23(5’-ATTATT CTT TA(CT)gA(CT)gA(Ag)CC-3’)和BMT-H-23R(5’-gg(CT)TC(gA)TC(gA)TAA AgA ATA AT-3’)扩增出一个确定含有内肽的0.8kb片段。第二步，基于此cDNA片段序列设计专一引物进行cDNA筛库。从获得的cDNA片段序列，设计两条专一引物：正义引物P₉(5’-GGTCTGAGCTTAGAACTCACCAGG-3’)，对应于βγ-CAT的α亚基的16-23氨基酸残基，和反义引物P_9R(5’-GAGCACCTGCCAAGAAGAAGC-3’)，对应于βγ-CAT的α亚基的121-127氨基酸残基，进行下一伦筛库以获得阳性单克隆。获得的克隆采用ABIPRISM 377 DNA(Applied Biosystems)测序仪进行测序。

6.编码βγ-CAT的α亚基和β亚基的基因的确认：

将由cDNA推导出的亚基全序列进行已获得的亚基肽质量指纹图谱进行验证。将全序列和已有的亚基肽质量指纹图谱数据输入EXPASY FindPep Tool进行分析确认(http://au.expasy.org/cgi-bin/findpept.pl)。

从大蹼铃蟾皮肤分泌物中纯化的βγ-CAT，在SDS-PAGE胶中，还原与非还原条件下βγ-CAT均由两条蛋白条带组成，表观分子量一条为18kDa(β亚基)，另一条为38kDa(α亚基)，表明两个亚基通过非共价键形式存在。通过Gel Pro V3.0对两条蛋白条带含量分析表明，α亚基含量占55.5％，β亚基含量占44.5％，α和β亚基含量比例接近1∶1。在Native-PAGE胶中，银染的βγ-CAT显示只有一条带，并且在浓缩胶中未观察到有未进胶的蛋白条带，表明在天然状态下α和β两个亚基是以非共价键形成βγ-CAT复合物。天然分子量测定实验表明，βγ-CAT的天然分子量为72kDa。通过C4 RP-HPLC层析柱实现了βγ-CAT的两个亚基的拆分，表明两个亚基之间是通过疏水相互作用形成复合物。

通过测序分析获得β亚基N末端15个氨基酸(FSDLQIGSLLHAVAA)，βγ-CAT的α亚基六段内肽片段，共102个氨基酸；β亚基四段内肽片段，共65个氨基酸。最终分别得到编码βγ-CAT的α亚基和β亚基的cDNA全克隆(SEQ ID NO：3编码α亚基，见图4；SEQ ID NO：4编码β亚基，见图5)。根据cDNA推导出对应的α亚基(SEQ ID NO：1，见图2)和β亚基(SEQ ID NO：2，见图3)氨基酸全序列，能够与已经获得的N末端氨基酸序列和内肽序列片段完全匹配。同时，将由cDNA推导出的亚基氨基酸全序列输入EXPASY FindPep Tool进行肽质量指纹图谱分析，同已有的亚基肽质量指纹图谱数据进行比较分析，得到的结果表明从获得的全cDNA推导出的氨基酸序列的肽质量指纹图谱与已获得的亚基肽质量指纹图谱匹配完全，即获得的cDNA确切分别编码βγ-CAT的α和β亚基。

分别将βγ-CAT的α亚基和β亚基的氨基酸全序列通过NCBI BLAST进行搜索分析，结果显示在世界范围内尚未有氨基酸序列相同的蛋白质或cDNA序列相同的基因报道。βγ-CAT的α亚基由336个氨基酸残基组成，为非晶状体βγ-晶状体蛋白质超家族成员；而其β亚基成熟肽由146个氨基酸残基，包含三个三叶因子结构域，因而将该蛋白质被命名为：大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物(complex of non lens-βγ crystallin and trefoil factor)，缩写为：βγ-CAT。

实施例2：大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物βγ-CAT体外ATPase和GTPase，核苷酸结合活性测定

核苷酸结合活性测试

βγ-CAT与核苷酸结合活性测试具体实验流程为：将βγ-CAT与10μM TNP-GTP/ATP(溶解于溶液50mM Tris-HCl(pH7.8)+20％(v/v)glycerol)在室温孵育5分钟，然后进行荧光激发测试(激发为410nm，发射为565-600nm)，与核苷酸类似物结合能力由575nm TNP-GTP/ATP荧光发射强度的改变来判断。

GTPase/ATPase活性测试

βγ-CAT的GTPase/ATPase活性测试采用GTPase/ATPase比色kit(Innova Biosciences，UK，high sensitivity)，参照KIT指南进行，酶活单位为nmol/min。

结果表明βγ-CAT能够与GTP/ATP的类似物TNP-GTP/TNP-ATP在体外实验体系中结合，表明βγ-CAT具有GTP/ATP结合活性(见图6A-B)。结合βγ-CAT在HUVEC中能够快速转运到细胞核中，调节基因表达，表明βγ-CAT可通过其GTPase/ATPase酶活性和NTP结合活性来发挥其转录激活，调节基因表达的功能。

同时βγ-CAT在体外检测到了GTPase/ATPase活性，其酶活性分别为0.23nM/min和0.15nM/min(见图6C)，通过WEB OF SCIENCE检索，在世界范围内尚未有相关报道，表明βγ-CAT为一类全新的GTPase/ATPase，。

实施例3：大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物βγ-CAT对多种肿瘤细胞株的细胞毒作用

肿瘤细胞株HCT116，AGS，K562购自中国科学院上海细胞库；肿瘤细胞株Hela，HT29，MCF-7，THP-1，A375，Hacat购自中国科学院昆明动物所细胞库。

倒置显微镜(Olympus，USA)；激光共聚焦显微镜(Zeiss，German)；35mm细胞培养皿(Corning，美国)，各种规格的细胞培养瓶(Corning，美国)。胶原酶(Sigma，美国)；胰酶(Sigma，美国)；青霉素，链霉素，四环素(Sigma，美国)；台盼蓝(Sigma，美国)；胎牛血清(Hyclone，美国血源)；各种培养基(M199，McCoy’s 5a，MEM，Ham’sF12K，RP1640)(Gibco，美国)，血栓调节蛋白抗体(Invitrogen，美国)，荧光素FITC-标记的羊抗兔二抗(Invitrogen，美国)；荧光素标记的低密度脂蛋白(Invitrogen，美国)；生化试剂(EDTA，DMSO，丙酮，Triton-100，NaCl，KCl，NaHCO₃，KH2PO₄等，Amersco)。

(一).各种肿瘤细胞的培养

1.1结肠癌细胞株：HCT116，HT29。

1.购买结肠癌细胞株：HCT116，HT29。置倒置显微镜下观察，细胞状态良好，无微生物污染。

2.更换培养基为：McCoy’s 5a培养基(含有1.5mM L-谷氨酰胺，2.2g/L碳酸氢钠，10％胎牛血清)。置37℃，5％CO₂培养箱中培养几天，持续观察无任何污染，至细胞长至90％满度。

3.弃培养基。PBS清洗两次。

4.0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)清洗一次。

5.加入0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)消化5min。

6.加入适量McCoy’s 5a培养基(含有1.5mM L-谷氨酰胺，2.2g/L碳酸氢钠，10％胎牛血清)，重悬浮细胞，分入2-3个培养瓶中。

7.置37℃，5％CO₂培养箱中培养，至细胞长至90％满度，进行实验测试。

1.2乳腺癌细胞株：MCF-7。

1.购买乳腺癌细胞株：MCF-7。置倒置显微镜下观察，细胞状态良好，无其他微生物污染。

2.更换培养基为：MEM(Eagle)培养基(含有2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氢钠，0.1M非必须氨基酸，1mM丙酮酸钠，0.01mg/ml牛胰岛素，10％胎牛血清)。置37℃，5％CO₂培养箱中培养几天，持续观察无任何污染，至细胞长至90％满度。

3.弃培养基。PBS清洗两次。

4.0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)清洗一次。

5.加入0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)消化5min。

6.加入适量MEM(Eagle)培养基(含有2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氢钠，0.1M非必须氨基酸，1mM丙酮酸钠，0.01mg/ml牛胰岛素，10％胎牛血清)，重悬浮细胞，分入2-3个培养瓶中。

7.置37℃，5％CO₂培养箱中培养，至细胞长至90％满度，进行实验测试。

1.3胃腺癌细胞株：AGS。

1.购买胃腺癌细胞株：AGS。置倒置显微镜下观察，细胞状态良好，无其他微生物污染。

2.更换培养基为：Ham’s F12K培养基(含有2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氢钠，10％胎牛血清)。置37℃，5％CO₂培养箱中培养几天，持续观察无任何污染，至细胞长至90％满度。

3.弃培养基。PBS清洗两次。

4.0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)清洗一次。

5.加入0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)消化5min。

6.加入适量Ham’s F12K培养基(含有2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氢钠，10％胎牛血清)，重悬浮细胞，分入2-3个培养瓶中。

7.置37℃，5％CO₂培养箱中培养，至细胞长至90％满度，进行实验测试。

1.4宫颈癌表皮细胞株：Hela。

1.购买宫颈癌表皮细胞株：Hela。置倒置显微镜下观察，细胞状态良好，无其他微生物污染。

2.更换培养基为：RP1640培养基(含有10％胎牛血清)。置37℃，5％CO₂培养箱中培养几天，持续观察无任何污染，至细胞长至90％满度。

3.弃培养基。PBS清洗两次。

4.0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)清洗一次。

5.加入0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)消化5min。

6.加入适量RP1640培养基(含有10％胎牛血清)，重悬浮细胞，分入2-3个培养瓶中。

7.置37℃，5％CO₂培养箱中培养，至细胞长至90％满度，进行实验测试。

1.5急性白血病单核细胞株：THP-1；慢性髓原白血病细胞株：K562。

1.购买急性白血病单核细胞株：THP-1。复苏本实验室保存慢性髓原白血病细胞株：K562。置倒置显微镜下观察，细胞状态良好，无其他微生物污染。

2.更换培养基为：RP1640培养基(含有10％胎牛血清)。置37℃，5％CO₂培养箱中培养几天，持续观察无任何污染，悬浮培养至细胞数明显增加。

3.加入新鲜RP1640培养基(含有10％胎牛血清)，重悬浮细胞，分入2-3个培养瓶中。

4.置37℃，5％CO₂培养箱中悬浮培养，至细胞长至90％满度，进行实验测试。

1.6皮肤癌细胞株：恶性黑色素瘤细胞株：A375；病毒转染的永生化角质细胞：Hacat。

1.购买皮肤癌恶性黑色素瘤细胞株：A375；病毒转染的永生化角质细胞：Hacat。置倒置显微镜下观察，细胞状态良好，无其他微生物污染。

2.更换培养基为：RP1640培养基(含有10％胎牛血清)。置37℃，5％CO₂培养箱中培养几天，持续观察无任何污染，至细胞长至90％满度。

3.弃培养基。PBS清洗两次。

4.0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)清洗一次。

5.加入0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)消化5min。

6.加入适量RP1640培养基(含有10％胎牛血清)，重悬浮细胞，分入2-3个培养瓶中。

7.置37℃，5％CO₂培养箱中培养，至细胞长至90％满度，进行实验测试。

(二)MTT法测定βγ-CAT对肿瘤细胞的细胞毒作用

1.分别消化长至90％满度的肿瘤细胞株HCT116，HT29，MCF-7，AGS，Hela，A375，Hacat，THP-1，K562。调整细胞悬液浓度至2.5×10⁵ cell/ml。接种于96孔板中，每孔200μl。

2.置37℃、5％CO₂培养箱中过夜培养。

3.更换新鲜培养基，37℃、5％CO₂培养箱中放置2小时。

4.加入βγ-CAT至终浓度分别为0，5nM，25nM和100nM。同时设置凋零孔，对照孔，每组设定3复孔。37℃、5％CO₂培养箱中孵育30min。

5.离心，小心吸去上清。PBS轻轻洗涤，再次离心，弃上清。

6.每孔加入180ul新鲜M199培养液，再加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，继续培养4h。

7.终止培养，离心，小心吸去孔内培养液。PBS轻轻洗涤，再次离心，弃上清。

8.每孔加入150μlDMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪595nm处测量各孔的吸光值。

9.计算细胞存活率：[(对照孔-凋零孔)-(实验孔-凋零孔)]/(对照孔-凋零孔)×100％。

MTT法测定结果显示，βγ-CAT对9种不同的肿瘤细胞表现出明显的细胞毒选择性。如图7所示，图中横坐标为βγ-CAT的浓度，纵坐标为癌细胞的存活率。βγ-CAT在0，5，25，100nM四个浓度时对5种不同的肿瘤细胞表现出显著的体外细胞毒作用，随着βγ-CAT浓度增加，癌细胞存活率降低，细胞毒作用增强，显示出明显的量效关系，即具有剂量依赖性。βγ-CAT在0，5，25，100nM四个浓度内对肿瘤细胞AGS，Hacat，A375和K562无明显的细胞毒活性。βγ-CAT对具有细胞毒作用的癌细胞表现出高效的细胞毒活性，其对低分化结肠腺癌细胞HCT116的CC₅₀为3nM，为最敏感；对结肠腺癌细胞HT29的CC₅₀为3nM；对乳腺癌细胞MCF-7的CC₅₀为75nM；对急性白血病单核细胞THP-1的CC₅₀为60nM；对宫颈癌表皮细胞Hela的CC₅₀为100nM。

实施例4：大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物体外诱导结肠癌细胞株HCT116细胞凋亡

凋亡DNA抽提试剂盒(上海华舜)；琼脂糖；乙醇(Amresco)；UV凝胶成像仪(Bio-Rad，美国)，TUNEL染色试剂盒，细胞色素c释放检测试剂盒(Invitrogen，美国)；Caspases酶活性测定试剂盒(Calbiochem)；PI，Hoechst(Sigma，美国)；流式细胞仪(FACSVantage SE，Becton Dickinson)；荧光分光光度计(Perkin Elmer LS50B)所需溶液：

1)PI溶液：将PI溶于PBS(pH7.4)中，终浓度为100μg/ml，含RNase 100μg/m用棕色瓶4℃避光保存。

2)Hoechst染色液：用双蒸水配成1mg/ml，pH7.0。使用时，将Hoechst 33342储液加入培养的细胞中，终浓度为10μg/ml。

3)D-Hanks液配方(g/L)：KCl，0.4g；KH₂PO₄，0.06g；NaCl，8.0g；NaHCO₃，0.35g；Na₂HPO₄·7H₂O，0.09g；酚红，0.01g。

4)PBS缓冲液配方(g/L)：NaCl，8.0g；KCl，0.2g；Na₂HPO₄·H2O，1.56g；KH₂PO₄，0.2g。

1.流式细胞法检测细胞凋亡的发生

在长到90％满度的HCT116细胞中，加βγ-CAT后，在37℃、5％CO₂培养箱中分别孵育30min和2h，同时设立阴性对照(加入PBS)。中止培养后，平行组细胞分别用下述的PI单染色法和PI/Hochest染色法染色，在流式细胞仪上检测HCT116，HT29，A375，THP-1的细胞凋亡情况。

A.PI单染色法测定经βγ-CAT处理后二倍体亚峰的产生：

1.在长到90％满度的细胞培养瓶中，加βγ-CAT至终浓度为25nM，在37℃、5％CO₂培养箱中孵育不同时间：0h，2h，4h，12h。设立阳性对照(加入H₂O₂)和阴性对照(加入PBS)。

2.收集细胞：离心，弃上清液。

3.PBS清洗一次。

4.离心弃去PBS，加入预冷的70％的乙醇固定，4℃，15min。

5.离心弃去固定液，PBS缓冲液重悬。

6.用1ml PI染液，4℃避光，染色30min。

7.流式细胞仪上检测。

B.PI和Hochest双染色法测定经βγ-CAT处理后二倍体亚峰的产生：

1.在长到90％满度的细胞培养瓶中，加βγ-CAT至终浓度分别为0nM，5nM，30nM，100nM。在37℃、5％CO₂培养箱中孵育2h。

2.中止培养，倾出上层培养基。PBS清洗两次，与上层培养基合并。

3.胰酶溶液消化贴壁细胞，收集细胞悬液与2中的溶液合并。

4.离心，弃上清液。

5.PBS清洗一次。

6.加入Hochest染色液，4℃避光，染色10min。

7.加入0.5ml PI染液，4℃避光，染色10min。

8.流失细胞仪上检测。

2.TUNEL染色法检测

培养HCT116细胞于盖玻片上，加入βγ-CAT(终浓度分别为5nM，25nM，100nM)，在37℃、5％CO₂培养箱中分别孵育2小时。设立阴性对照(只加入PBS缓冲液)。中止培养。按TUNEL KIT中染色法进行染色，通过激光共聚焦显微镜观察。

3.试剂盒检测细胞色素c释放

培养HCT116细胞于盖玻片上。加βγ-CAT至终浓度分别为5nM，25nM，100nM，在37℃、5％CO₂培养箱中分别孵育2小时。设立阴性对照(只加入PBS缓冲液)。中止培养，吸出上层培养基，PBS清洗两次。按照试剂盒操作步骤对细胞进行固定，透明，封闭，染色等步骤。激光共聚焦显微镜下观察。

4.Caspases酶活性测定

在长到90％满度的HCT116细胞中，分别加入不同浓度的βγ-CAT，在37℃、5％CO₂培养箱中孵育2h。设立阴性对照(加入PBS)。中止培养，倾出上层培养基。PBS清洗两次，与上层培养基合并。离心，弃上清液收集细胞。实验分为两个平行组。一个组中仅检测贴壁细胞；一个组中检测贴壁细胞和上清液所有收集细胞。裂解液裂解收集的所有细胞，测定并调整总蛋白质的浓度。处理细胞，分别加入试剂盒中的各种底物。37℃孵育2小时。荧光分光光度计检测。结果计算：Caspases酶活性表示为每μg总蛋白每个小时的最大荧光净增量。

结果表明，βγ-CAT能够诱导HCT116肿瘤细胞发生凋亡。βγ-CAT(浓度为0nM，5nM，30nM，100nM)分别处理30分钟和2小时，通过PI/Hochest双染料染色法染色能够明显地看到死亡细胞数随着剂量的增加、孵育时间的延长而增加(被PI穿透的细胞数明显增多)，即βγ-CAT能够以剂量，时间依赖的方式诱导HCT116发生凋亡。

HCT116经βγ-CAT处理后，TUNEL染色阳性，能够检测到线粒体细胞色素c的释放和caspases酶激活。在整体细胞(包括脱落的细胞和贴壁细胞)中，caspase-1/2/6/8/9被大量的激活，表明βγ-CAT能够诱导肿瘤细胞HCT116通过经典凋亡途径发生凋亡(见图8)。

实施例5：大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物βγ-CAT体外抑制恶性黑色素瘤细胞株A375的生长

MTT法测定βγ-CAT对黑色素瘤细胞株A375的生长的状态影响

1.消化长至90％满度的黑色素瘤细胞株A375，调整细胞悬液浓度至10⁴cells/ml。接种于96孔板中，每孔200μl。同时设定已知的不同细胞浓度的孔以作对照。

2.置37℃、5％CO₂培养箱中培养约6小时，至细胞贴壁后，更换含有βγ-CAT不同终浓度的培养基(从0-25nM)，培养不同的时间(共7天)。每隔24小时，MTT法测定当天的细胞数，并更换一次含有相应浓度的βγ-CAT培养基。每个剂量和时间点都设定三个复孔。

3.计算每天细胞的存活率。并作生长曲线。

如图9所示，在体外βγ-CAT能够显著的抑制皮肤癌恶性黑色素瘤细胞A375的生长。随着βγ-CAT浓度的增加(25pM，50pM，250pM，1nM，5nM，25nM)，细胞数减少，细胞生长受到明显抑制，表现出明显的量效关系，即具有剂量依赖性。

实施例6：大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物βγ-CAT促进人源脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞迁移和伤口修复测定

婴儿脐带来自自愿捐赠者；胶原包被的Boyden chamber细胞迁移测定试剂盒；VEGF(Singma，美国)；EGF(Singma，美国)。

1)Harvesting缓冲液：含有2mM EDTA的PBS缓冲液。

2)Quenching Medium：含有5％BSA的无血清完全培养基。

3)饥饿培养基：HUVEC饥饿培养基：含有2％胎牛血清的HUVEC完全培养基。

HUVEC的培养和鉴定

(一).HUVEC的原代培养

1.在无菌条件下，取健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带，(长20cm以上，不宜超过6小时)，选择无夹痕，无扭曲，无凝血阻塞的部分。

2.在脐静脉两端开口处，分别用丝线扎紧并固定在50ml注射器和带输液胶管的玻璃插管上，注入D-Hanks液冲洗脐静脉，至无血迹。

3.从一端的注射器向脐静脉徐徐注入0.1％胶原酶溶液，至血管充盈。注意两端封闭，以防止液体返流。立即放入37℃的无菌D-Hanks液中，10min后取出。

4.通过注射器吸取收集酶液，同时注入含20％胎牛血清的199培养液冲洗静脉。合并于同一离心管中，以1000rpm/min离心7-10min。

5.弃去离心沉淀后的上清液，加入20％胎牛血清的199培养液重新悬浮细胞，并调整至细胞密度为1.5-2.0×10⁵个/ml，接种于培养瓶中或培养皿中，置37℃、5％CO₂培养箱中培养。

6.第2天弃培养液，用D-Hanks液轻轻洗1次，以去除不贴壁的细胞或死细胞，换入新鲜含20％胎牛血清、抗生素的199培养液。继续置37℃、5％CO₂培养箱中培养。

7.每2-3天换液一次。每次换1/2-2/3量。待细胞长至融合状态后，即可传代。

(二).HUVEC的传代培养

1.待原代培养的细胞长至融合状态后，弃培养液，用预温的D-Hanks液清洗2次，加入0.125％胰蛋白酶-0.01％EDTA混合消化液，正好形成一浅层液面将细胞覆盖，室温下消化1-2min。

2.镜下见细胞变圆，细胞间隙增宽后，立即翻转培养瓶，弃酶液。

3.可再用D-Hanks液轻轻洗1次，加入新鲜含10％胎牛血清，和抗生素的M199培养液。

4.用吸管吸取培养液，轻轻将细胞捶打下来，调整细胞密度至1.5×10⁵cells/ml，按实验需要接种到新的培养瓶或其他培养器皿中。一般按照1∶2-1∶3的比例传代。

5.每隔2-3天换液一次，每次换掉2/3量。待细胞长至融合状态，又可传代。

(三).HUVEC的鉴定

1.光镜下观察。就培养瓶在倒置显微镜下直接观察。内皮细胞成扁平的短梭形或多角形，大小均匀，胞核清晰，呈卵圆形。有核的区域较无核的区域突出，细胞呈单层鹅卵石样或铺路石样镶嵌状排列生长，并有接触抑制现象。

2.血栓调节蛋白抗体免疫荧光染色。

2.1胰酶消化已经长至90％满度的HUVEC为单细胞悬液。

2.2使用血球计数板上计算细胞浓度，调整细胞浓度到1×10⁵细胞每毫升培养基。

2.3接种1ml细胞悬液到放置于35mm小皿中盖玻片上，置37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜。

2.4光镜下观察，细胞贴壁状态及生长状态正常。更换培养基，置37℃，5％CO₂培养箱中稳定2小时。

2.5弃上层培养基，用D-Hanks清洗两次。

2.6丙酮固定。用D-Hanks清洗。Triton-100穿透。用D-Hanks清洗。

2.7加入抗血栓调节蛋白抗体，4℃，孵育过夜。

2.8 D-Hanks清洗三次。加入商业化FITC-标记的羊抗兔二抗，4℃，孵育过夜。

2.9 D-Hanks清洗三次。封片。

2.10激光共聚焦显微镜下观察。

细胞迁移活性测定(Cell migration assay)

采用Boyden Chamber(Chemicon，美国)系统来测定细胞迁移活性，具体操作步骤如下：

1.准备和收集实验细胞：HUVEC培养到约80％满度。更换细胞培养基为无血清培养基，饥饿细胞约18小时。倒置显微镜下观察细胞状态。PBS清洗细胞。加入Harvesting缓冲液消化细胞5min。加入足量Quenching Medium中和消化液中的胰酶和EDTA。离心，弃上清。加入少量Quenching Medium重新悬浮细胞。计数，调整细胞浓度至2.5×10⁶cells/ml。

2.药物处理：按照试剂盒说明将细胞300μl加入到所需的chamber室里同时加入VEGF25pM作为阳性对照，PBS，作为阴性对照；加入25pM βγ-CAT，50pM βγ-CAT。在37℃、5％CO₂培养箱中孵育24小时。中止培养。倒置显微镜下，拍照。

3.细胞染色和分析：用枪头和棉签完全移走chamber室内朝里面的所有培养基和细胞。使用试剂盒内部提供的结晶紫染色液，室温下对细胞染色30min。染色结束后，用PBS清洗3次，并完全浸入去离水中清洗。倒置显微镜下，拍照。加入抽提缓冲液，抽提细胞内色素结晶紫。分光光度计，550nm波长读数。计算并比较不同药物浓度下的细胞迁移率。

伤口修复活性测定(Wound healing assay)

采用人工划伤模型来测定βγ-CAT的体外伤口修复活性，具体操作步骤如下：

1.消化并收集HUVEC，调整细胞浓度为1×10⁶cells/ml。接种2ml细胞悬液至胶原预铺被的6孔培养板中，在37℃、5％CO₂培养箱中过夜培养。

2.倒置显微镜下，观察至细胞完全贴壁，铺满培养板底。

3.用200μl枪头划线，造成人工的“伤口”模型。PBS清洗去除漂浮的、死亡的细胞，更换培养基为饥饿培养基。在37℃、5％CO₂培养箱中稳定2小时。倒置显微镜下，拍照。

4.在HUVEC中，加入βγ-CAT至终浓度为25pM；50pM。设立阳性对照，HUVEC中加入VEGF 25pM。设立阴性对照，加入体积相同的PBS。在37℃、5％CO₂培养箱中孵育。每隔24小时，更换一次饥饿培养基，并补充药物至相应的浓度；倒置显微镜下，拍照，记录下“伤口”的闭合情况。

5.持续观察72小时。

6.以上的实验重复3次以上。

在倒置显微镜下观察到原代培养的人脐静脉内皮细胞呈扁平的短梭形或多角形，大小均匀，胞核清晰，呈卵圆形。有核的区域较无核的区域突出，细胞呈单层鹅卵石样或铺路石样镶嵌状排列生长，并有接触抑制现象。血栓调节蛋白抗体免疫荧光染色呈阳性。表明体外原代培养人脐静脉内皮细胞成功。在整个实验的过程中，使用的都是第二代到第三代的HUVEC进行实验。

结果表明，在胶原包被的基质上，βγ-CAT能够诱导HUVEC细胞迁移和伤口修复。在极低浓度(25pM和50pM)的下，βγ-CAT能够以剂量依赖的方式诱导HUVEC细胞穿过胶原铺被的Boyden chamber的板底面(图10A左)。25pM浓度下，发生迁移而穿过膜底面的细胞大约为阴性对照的1.5倍；50pM浓度下，发生迁移的细胞数量增大为阴性对照的3倍左右；高于25pM的血管内皮生长因子(VEGF)对HUVEC细胞的迁移诱导作用。在倒置显微镜下，可以清晰地看到穿过膜底面的细胞数明显增加(图10A右)。

伤口修复(Wound healing)结果表明，βγ-CAT能够以剂量依赖的方式诱导HUVEC细胞在胶原铺被的基质上完成“人工伤口”的闭合。在阴性对照中，72小时后，伤口”仍然保持比较大的开放状态，迁移到伤口面上的细胞也非常少；在VEGF处理阳性对照中，随着时间的推移，过伤口逐渐变小，72小时后，“伤口”基本上已经合拢。βγ-CAT处理的伤口随着时间的增加逐渐闭合，50pMβγ-CAT处理的效果比25pMβγ-CAT处理的效果明显。72小时后，50pMβγ-CAT处理的“伤口”基本上接近闭合(图10B)。

同时，将拆分的βγ-CAT的α亚基和β亚基分别进行细胞迁移和伤口修复活性测试，结果表明在100nM的浓度下，未观察到单独的βγ-CAT的α亚基和β亚基具有明显的上述活性，从而进一步表明βγ-CAT的α亚基和β亚基需要协同作用，才能发挥其高效的生物学活性。

目前报导的重组人源三叶因子2(hTFF2)可以以3-6倍的效率增加大鼠小肠隐窝上皮细胞(rat intestinal epithelial cell Lines，IEC-6)的细胞迁移能力，但是其所需要的浓度太高，约为83μM。本发明提供的大蹼铃蟾创伤修复和抗肿瘤蛋白βγ-CAT诱导细胞迁移时候所需要的浓度仅在皮摩尔(pM)水平，活性比其他报道的单链三叶因子蛋白大约要高一百万倍左右。

实施例7：大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物βγ-CAT通过囊泡化直接转运到人源脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞核，调节基因表达

(一).βγ-CAT诱导人源脐静脉内皮细胞(HUVEC)发生囊泡化

1.活体观察：生长在35mm细胞培养皿中的HUVEC，观察状态良好后，更换新鲜培养基。稳定2小时。放置于激光共聚焦显微镜的二氧化碳培养小室中，培养，拍照。

加入βγ-CAT 30nM，活体观察HUVEC的细胞形态变化。放大倍数200倍，每隔10秒连续拍照。

2.中性红染色：生长在35mm细胞培养皿中的HUVEC，观察状态良好后，更换新鲜培养基。稳定2小时。加入βγ-CAT 30nM处理细胞30min，中性红染色液100μl染色4min。用150μl 0.9％的生理盐水洗涤两次，移去含有药物的培养基。激光共聚焦显微镜下观察。

3.剂量效应：生长在35mm细胞培养皿中的HUVEC，观察状态良好后，更换新鲜培养基。稳定2小时。加入不同浓度的βγ-CAT(nM)处理细胞30min，中性红染色液100μl染色4min。用150μl 0.9％的生理盐水洗涤两次，移去含有药物的培养基。然后每孔加入100 ul的酸化乙醇(50％ethanol in 1％acetic acid)以提取中性红。540nm读数。设置3个复孔；设置对照孔和凋零孔。阳性对照，NH₄Cl 8mM作用18小时；

阴性对照，PBS孵育18小时。

4.NH₄Cl依赖实验：生长在35mm细胞培养皿中的HUVEC，观察状态良好后，更换新鲜培养基。稳定2小时。分别对细胞进行4种处理：1)PBS，2)PBS和NH₄Cl，3)PBS和βγ-CAT，4)NH₄Cl和βγ-CAT。作用30min后，中性红染色液100μl染色4min。用150μl 0.9％的生理盐水洗涤两次，移去含有药物的培养基。然后每孔加入100ul的酸化乙醇(50％ethanol in 1％acetic acid)以提取中性红。540nm读数。

(二).βγ-CAT转运到人源脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞核

1.βγ-CAT标记荧光染料Cy3，细胞核定位观察

荧光染料Cy3标记按照试剂说明标记βγ-CAT分子，并经过G50分子筛分离纯化。生长在35mm细胞培养皿中的HUVEC，观察状态良好后，更换新鲜培养基。放置于激光共聚焦显微镜的二氧化碳培养小室中，培养，拍照。加入Cy3标记-βγ-CAT 30nM，荧光下实时观察βγ-CAT分子的细胞定位。放大倍数200倍，每隔10秒连续拍照。

2.荧光染料FITC标记轻重链抗体，37℃条件下对βγ-CAT轻链和重链的细胞定位

2.1βγ-CAT的α和β亚基兔源多克隆抗体的生产：新西兰大白兔耳静脉采血，分离血清，作为抗血清的阴性对照。经多步骤分离纯化的βγ-CAT蛋白质在12％SDS-PAGE上电泳，电泳结束后，分别割下约位于1.8kDa和3.6kDa分子量处的βγ-CAT的α和β亚基条带，进行胶回收。回收蛋白质，测定蛋白浓度，并用磷酸缓冲液调整蛋白质浓度为1mg/ml。与同体积的弗氏完全佐剂充分混合乳化。背部皮下多点注射，免疫新西兰大白兔，注射8-10点，总体积为400μl。以后每隔10天，用与第一次同等剂量的βγ-CAT与不完全佛氏佐剂的乳化液进行加强免疫，共四次。最末一次免疫后五天，耳缘静脉取血，分离血清，用免疫酶联吸附(ELISA)实验测定抗体效价。当抗体效价达到为1/5000左右时，处死免疫兔，收集血液。将血液置于37℃保温1h后于4℃放置过夜，2,000g离心5min，收集血清。通过硫酸胺沉淀法，去除非IgG免疫球蛋白质。纯化抗体溶解于PBS缓冲液中，小量分装并保存于-20℃，用于实验。

2.2 FITC分别标记α和β亚基抗体：用碳酸钠缓冲液(sodium carbonate buffer，0.1M，pH9)将兔源的βγ-CAT的α和β亚基多克隆IgG抗体的蛋白质浓度调节到2mg/ml。FITC按照1mg/ml的浓度溶解于DMSO中。每毫升的蛋白质溶液，加入50微升的FITC。

每次缓慢的加入5ul的溶液，同时轻轻的不断的摇晃。加完所有的FITC后，将混合物置于黑暗中，4℃，反应8小时。加入NH₄Cl至终浓度为50mM，4℃孵育2小时，封闭未结合的FITC。加入二甲苯青至0.1％，甘油至5％。分子筛(G50)层析分离未结合的FITC和已标记的蛋白质分子。标记好的蛋白质分子先流出，而二甲苯青和未标记的FITC则后流出。4℃避光保存。可加入叠氮钠至终浓度为15mM。产物的蛋白质的荧光比例可由495nm和280nm的吸收值来计算。

3.细胞培养和药物处理：消化HUVEC，接种于盖玻片上。倒置显微镜下观察，细胞长到约90％满度时，加入βγ-CAT至终浓度为10nM，分别在37℃，5％CO₂培养箱中和4℃的条件下，孵育不同的时间：5min；30min；2h。孵育结束后中止培养。

4.显微镜观察：小心吸走上层培养基。磷酸缓冲液清洗细胞表面两次。4％多聚甲醛固定细胞，室温下放置20min。磷酸缓冲液清洗细胞表面两次。0.1％Triton-X 100透明，室温下放置10min。磷酸缓冲液清洗细胞表面两次。2％BSA封闭，4℃，过夜孵育。加入2％牛血清白蛋白稀释的标记抗体(1/200)100μl，室温下避光放置，1小时。2％BSA清洗细胞表面三次。磷酸缓冲液清洗细胞表面三次。PI染液复染核，室温下避光放置5min，封片。激光共聚焦显微镜下观察。

(三).Western Blot检测βγ-CAT的细胞定位。

3.1药物处理细胞：在长至90％满度的HUVEC株中，加入βγ-CAT至终浓度为25nM，在37℃，5％CO₂培养箱中孵育30min，中止培养。吸出上层培养基，用磷酸缓冲液清洗两次贴壁细胞表面，与上层培养基合并。离心(1000rpm，5min)，弃上清，用磷酸缓冲液洗涤三次，离心。然后加入细胞裂解液(SIGMA，美国)裂解细胞沉淀及培养瓶壁的贴壁细胞，冰上放置15min。吸出细胞裂解液，加入6×SDS加样缓冲液，10％SDS-PAGE上电泳，100V，2小时。电泳结束后，转膜。

3.2 Western Blot分析：Western Blot分析按标准实验流程进行，分别用抗-βγ-CAT，抗-βγ-CATα亚基和抗-βγ-CAT β亚基多克隆兔源抗体和兔源抗单泛素的(rabbitanti-mono-ubiquitin)单克隆抗体作为一抗，二抗为羊抗兔的辣根过氧化物酶偶联的抗体(conjugated-HRP goat anti-rabbit antibody)，采用ECL(PIERCE)化学发光底物检测信号，采用X-胶片压片显影。

(四).采用人基因组Human Genome U133 Plus 2.0 Array(Affymetrix，USA)RNA芯片分析βγ-CAT对HUVEC细胞基因表达的调节

4.1βγ-CAT处理HUVEC，抽提总RNA：将βγ-CAT(25nM)加入75cm²培养瓶中的HUVEC(三代之内，95％满度)中，37℃孵育2小时，按照TRIzol KIT中步骤抽提总RNA，阴性对照为溶剂对照。抽提得到的总RNA，用1％琼脂电泳进行分析。

4.2.RNA芯片杂交实验：

1)将抽提的HUVEC总RNA进行定量和质检，满足要求的RNA样品备用；

2)利用双轮cRNA扩增，生物素标记法对样品进行靶标制备，然后用于芯片杂交；

3)用Fluidics Station 450进行洗脱和染色，然后用Scanner3000扫描芯片；

4)用GeneChip Operating software(GCOS 1.4)分析软件对芯片图像进行分析，

把图像信号转化为数字信号。

4.3.芯片数据分析：将原始数据采用dChip3.0软件做校正和归一化处理，筛选出信号值＞100并且P Value值为P和M的检测值。

4.4.表达差异基因的筛选和展示：采用SAM3.0软件对四次生物学重复的芯片配对进行表达差异性分析，设定筛选域值为：fold change≥3，q value＝0，(false discoveryrate)FDR＝0，共获得123个显著性差异表达的基因。用Cluster和Treeview来展示显著性差异表达的基因。

结果表明：

1.通过活体观察显示，βγ-CAT能够诱导HUVEC在10min内发生快速囊泡化。中性红染色可观察到明显的囊泡化(图11A)，而且βγ-CAT形成的囊泡化是不依赖于NH₄Cl的，但在低浓度的NH₄Cl的存在下，能够增强βγ-CAT的囊泡化(图11B)。当βγ-CAT的终浓度为2nM时，能够引起HUVEC的最大的囊泡化。以后，随着浓度的增高，测量到的囊泡化程度反而降低(图11C)，这可能是由于高浓度的βγ-CAT直接引起HUVEC的脱落造成活细胞数目下降的缘故。实验数据表明βγ-CAT能够通过囊泡化直接转运到HUVEC的细胞中。

2.分别通过荧光染料Cy3标记βγ-CAT和荧光染料FITC标记βγ-CAT的α和β亚基抗体，在激光共聚焦显微镜下实时观察可见，βγ-CAT被迅速转运到HUVEC细胞核。在37℃条件下，可见βγ-CAT快速内吞进入细胞内，30min时被转运到细胞核中，2小时观察βγ-CAT-α亚基完全集中细胞核区域，而βγ-CAT-β亚基主要分布在细胞核外周区域(图12A-B)。

3.βγ-CAT(10nM)37℃ 30分钟处理HUVEC后，分别采用抗-βγ-CAT，抗-βγ-CAT-α亚基和抗-βγ-CAT-β亚基兔源多克隆抗体作为检测探针，通过免疫杂交(Western Blot)来分析βγ-CAT在HUVEC内的细胞核定位。结果表明，βγ-CAT能够形成了SDS稳定的，分子量为150kDa的大分子复合物。同时通过单泛素的兔源单克隆抗体检测到150kDa的大分子复合物中有泛素化修饰。同时结合免疫荧光共聚焦显微镜，可观察到荧光染料Cy3标记的单泛素的兔源单克隆抗体荧光信号与FITC标记βγ-CAT-α亚基抗体信号重合，表明βγ-CAT能够被单泛素修饰后形成(图12C)。

4.βγ-CAT(25nM，2小时)处理HUVEC后，引起显著性差异表达变化的基因共有123个，主要集中为：细胞转录因子，DNA结合转录调节因子，细胞炎症相关的细胞因子，细胞生长和凋亡相关调节蛋白和细胞组织重建相关的金属蛋白酶等，例如早期生长反应相关家族因子，细胞转录因子(如IL-6，IL-8，IL-1α)，DNA结合转录调节因子，核受体亚家族4受体，金属蛋白酶，Kruppel-like factors和Fos members。这些基因都与细胞有丝分裂，分化和生长，以及组织的再生和修复等基本生命活动有密切联系。数据表明βγ-CAT通过调节细胞上述基因的差异表达，从而促进细胞生长，迁移和创伤修复。

序列表

<110>中国科学院昆明动物研究所

<120>大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物和基因及制法及用途

<160>4

<210>1

<211>336

<212>PRT

<213>大蹼铃蟾(Bombina maxima)

<400>1

Met Ser Glu Asn Lys Ile Ile Leu Tyr Asp Glu Pro Ser Phe Glu Gly

 1               5                   10                 15

Leu Ser Leu Glu Leu Thr Arg Ser Gln Thr Lys Leu Ala Arg Gln Asn

             20                  25                  30

Phe Ser Lys Ala Ala Ser Ser Leu Arg Val Ile Gly Gln Pro Trp Val

        35                  40                  45

Ala Tyr Thr Gln Asn Phe Phe Lys Gly Glu Ala Arg Val Tyr Glu Glu

     50                 55                  60

Gly Ser Tyr Ser Asn Ile Asp Val Asp Asn Lys Ile Met Ser Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Ile Leu Ala Ser Leu Gly Asp Pro Val Ile Lys Leu Phe Glu Gly

                85                  90                  95

Gln Ser Leu Ser Gly Lys Ser Ile Val Val Asn Glu Ala Ala Ile Leu

            100                 105                 110

Asn Phe Gly Lys Leu Glu Asn Gly Ala Ser Ser Trp Gln Val Leu Ser

        115                 120                 125

Gly Ala Trp Lys Ile Cys Asp Glu Val Lys Asp Asn Pro Arg Tyr Lys

    130                 135                 140

Val Ser Asn Val Ala Asp Met Val Phe His Tyr Ser Glu Thr Gly Leu

145                 150                 155                 160

Ser His Ser Ala Leu Ser Ile Tyr Pro Leu Leu Ala Gly Lys Pro Lys

                165                 170                 175

Leu Thr Thr Asn Val Gln Trp Asp Arg Lys Lys Glu Leu Ser Asn Arg

            180                 185                 190

Val Ser Gln Leu Asp Glu Ile Ile Val Val Asn Lys Ser Lys His Glu

        195                 200                 205

Gln Asp Phe Ser His Ser Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Ser Ser Leu Glu

    210                 215                 220

Val Glu Met Lys Phe Ser Asn Glu Thr Thr Ile Glu Leu Gly Ala Ser

225                 230                 235                 240

Phe Lys Val Pro Leu Ile Gly Glu Leu Ser Thr Thr Leu Thr Gln Thr

                245                 250                 255

Ile Ser Ile Glu Lys Gly Lys Thr Glu Gly Thr Ser Thr Thr Val Thr

            260                 265                 270

Asn Lys Val Thr Ile Pro Val Thr Val Pro Ala Asn Thr Lys Val Thr

        275                 280                 285

Ile Asn Val Met Arg Arg Asp Ile Ser Tyr Ser Val Pro Val Glu Ile

    290                 295                 300

Ile Ile Glu Arg Asn Asn Ala Arg Lys Ala Glu Tyr Ala Glu Leu Ile

305                 310                 315                 320

Cys Arg Asp Gly Thr Asp Val His Ile Ser Arg Asn Asp Glu Ala Val

                325                 330                 335

<210>2

<211>166

<212>PRT

<213>大蹼铃蟾(Bombina maxima)

<400>2

Met Ala Ser Lys Met Phe Phe Ile Val Thr Ile Ala Leu Ala Ile Gly

-20                 -15                 -10                 -5

Cys Gly His Gly Phe Ser Asp Leu Gln Ile Gly Ser Leu Lys Cys Ala

             -1  1               5                  10

Val Ala Ala Tyr Asp Arg Ile Ala Cys Pro Gly Asn Thr Lys Glu Gln

        15                  20                  25

Cys Asn Ala Arg Arg Cys Cys Tyr Asp Asn Arg Gln Ser Gly Ala Ile

     30                 35                  40

Trp Cys Phe Arg Gln Arg Asp Leu Arg Pro Gly Cys Tyr Ile Asp Pro

45                  50                  55                  60

Ala Glu Arg Val Gly Cys Ala Gly Glu Gly Val Thr Pro Thr Glu Cys

                65                  70                  75

Arg Glu Lys Gly Cys Cys Phe His Ala Leu Thr Gly His Val Trp Cys

            80                  85                  90

Tyr Lys Leu Asn Glu Ser Glu Asp Ala Trp Lys Cys Ala Val Pro Ile

        95                  100                 105

Lys Arg Arg Val Ala Cys Ala Gly Ser Gly Val Thr Ala Ala Glu Cys

    110                 115                 120

Lys Ala Lys Gly Cys Cys Tyr Asn Ser Ser Thr Tyr Asn Thr Ile Trp

125                 130                 135                 140

Cys Phe Arg Pro Gln Val

                145

<210>3

<211>1251

<212>DNA

<213>大蹼铃蟾(Bombina maxima)

<400>3

TTCACATTCT GAAGAGGTAA AATGAGTGAA AACAAAATTA TTTTATATGA TGAGCCCTCA  60

TTTGAAGGTC TGAGCTTAGA ACTCACCAGG TCTCAGACTA AATTGGCTCG TCAAAATTTT  120

TCAAAGGCTG CTTCCTCTCT GCGTGTGATT GGCCAGCCAT GGGTCGCTTA TACTCAAAAC  180

TTCTTTAAGG GTGAAGCACG TGTGTATGAG GAGGGCAGTT ACAGTAATAT TGATGTTGAC  240

AACAAAATCA TGTCTTTATA TCTCATCCTT GCAAATCTGG GGAACCCAGT TATCAAGCTC  300

TTTGAAGGCC AAAGCTTGTC TGGCAAATCC ACTGTGGTGA ACGAAGCAGC TATTCTGAAC  360

TTTGGAAAAC TAGAAAATGG AGCTTCTTCT TGGCAGGTGC TCAGTGGTGC CTGGAAAATA  420

TGCGATGAAG TGAAGGATAA CCCCAGATAC AAGGTATCAA ACGTTGCAGA TATGGTTTTT  480

CATTACTCTG AAACAGGCTT GAGTCACTCA GCGTTAAGTA TTTATCCTCT ATTGGCTGGG  540

AAGCCTAAAC TTACAACAAA TGTCCAGTGG GACAGAAAGA AGGAGCTCAG TAACCGTGTT  600

GGCCAACTAG ATGAGATCAT TGTTGTTAAT AAGTCTAAGC ATGAACAGGA TTTTAGCCAC  660

AGTTCAGGCC GGGACTATAC CTCCAGTCCT GAAGTTGAAA TGAAATTTAG CAATGAAACT  720

ACTATCGAGT TGGGAACAGG CTTTAAGGTT CCTCTGATTG GTGAACTGAG TACCACTTTG  780

ACCCAAACCA TATCCATAGA GAAAGGAAAA ACTGAGGGCA CGTCTACCAC TGTCACCAAC  840

AAAGTGACCA TTCCTGTGAC GGTTCCAGCA AATACTAAAG TCACCATCAA TGTCATGAGA  900

AGAGACATCA GCTACTCTGT CCCAGTAGAA ATAATTATAG AAAGAAACAA TGCGAGGAAG  960

ACAGAATATG CTGAGCTTAT ATGCAGAGAT GGTACAGACG TGCACATCTC CCGAAATGAT  1020

GAGGCTGTTT AATCCTAAAA CTCCAAAGCA ACAAGAGACA GAAGATAGTG GTCTGATCTT  1080

TATTACTGGC AATAGAAGAC ATGTCCACAT CAGATTGTGC TAACTCTTCA AGTTATAAAT  1140

AGCTGCCCCT ACAACACCTT AAGGCTTGTA TCAGTATATA CCATACTGGG GCTGAACTCA  1200

CTGAACCATC AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A           1251

<210>4

<211>1830

<212>DNA

<213>大蹼铃蟾(Bombina maxima)

<400>4

TGTCTATTTT GTTGCATTTT CATGGCAAGC AAGATGTTCT TCATAGTGAC AATAGCATTG  60

GCTATTGGCT GTGGCCATGG ATTTTCAGAC CTTCAGATAG GTAGTCTGAA GTGTGCAGTT  120

GCAGCATATG ACAGAATTGC ATGTCCTGGA AATACAAAAG AACAATGCAA TGCCAGGCGG  180

TGTTGTTATG ATAATAGGCA ATCTGGTGCA ATCTGGTGCT TTAGACAAAG AGATCTCAGA  240

CCTGGATGCT ATATTGACCC TGCAGAAAGA GTTGGATGTG CAGGCGAAGG AGTGACACCC  300

ACTGAATGCA GGGAGAAAGG CTGCTGTTTT CATGCATTAA CTGGTCATGT TTGGTGCTAT  360

AAACTTAACG AATCAGAGGA TGCCTGGAAA TGTGCTGTCC CTATCAAACG GAGAGTTGCA  420

TGCGCTGGCT CAGGCGTCAC AGCTGCTGAG TGCAAGGCAA AAGGTTGTTG TTACAATTCA  480

AGCACCTACA ATACCATATG GTGCTTTAGA CCTCAAGTAT AACTGATCTA TAAAATGGAA  540

TTGTTCAGGT GTTCAAGATG AGAACAAGGT TGAAGATTAG TGAAGAATTC CTCTTCAATC  600

TAGTGATTTC TTTTTTTTGT GCTAAACCTA ACAATGATTT AAATTATATT CTTTCTCAGA  660

TGTATGTTCC CTCTAAGGCA TAAGAATGTG CATGCTGTTA TTGAACGTTT AGGGCTATAT  720

TACAAGAGGC ACGCTATTGC TAACGCGGGT CACAATATCC AATATCGCAA CTGTGCTAAC  780

CTGTGCACAT ATTACAAGTT GAAAGGAAAC GGGTGAGCTT GTGCGTAAAT AAATTTGCGG  840

TTGTTGGGTT AGAGGTTACC GTAAAGAATA GAGTGCACCA AACACAACAT AAATACATTA  900

ATATCAAGTG TTACACTCAT ATATATACAC CATCTGATAA CAATTATTTA TATCAATATT  960

AAGAAAATAT TTTTAGAAGG GTTTAAAGGT ATATGGTAAT TATGTAGGGT GACCATGTTG  1020

CCGCTTTGGA AGGGGACACA TGTGTGTTTT TCATGTGTGT CCCTTTTTGA AGCGGCAGTG  1080

TGGTCAGCCT AGGTATATGT ATAAGTTTAA ATGTGTGTGT GTGAATATAT ATATATATAT  1140

ATATATATAT ATATATTAAC AATGTGGGGT CAAGCACTCA CGACACTGAT AATCCAATGC  1200

CCCAGGTGCA GTCCTGACAA TAGTATACAC AGTTTCGGGA GGGCAAGGAA GAGGTGCTCT  1260

CACGGGGTCT TTAGTGGATA TGGGAATGAA ACCCATGTTT GTTGAGGACC CCGTGGGTGT  1320

GCCTCTTTTT TGCCTTCTTG AAATTGTGTA TATATATATA TATATATATA TATATATATT  1380

GTATATACAT GTGTATTTAT GTATTTATAT ATGTATATGC ATACATATAT GTACACAAAT  1440

TAACACATAT GTATAGACAT ATACACACAC ACACACATAT ATACATATAT ATATATATAT  1500

GTATATATAT ATATACACAC ACGCTTTGGA GGCCTTTCCA CTCAAATACC TTAAAACATG  1560

TAAAATAATT TTTAAAAATG TTAATATTTT ATAATGGGCC AGATTACAAG TGGAGCACAA  1620

ATTAATGCTT CAGCTTGAGC ATTAATTGCT CTAGAAGTAA GCTTTATTGC GCTTGTTGGG  1680

TTGCACTCGT ATTACAAGTT AAAAAGTAAA CTCTATTGGC TCTTGCGCTA AACCGACACG  1740

CACAAAAGCC GAAGTTAGAA TATCACGTGC ACGTTCACGT ATTCCCCCAT AGAAGTCAAT  1800

GAAGAAAAAA AAGTTAAAAA AAAAAAAAAA                                   1830

Claims (6)

1.大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物，其特征在于：其分子量为72kDa，由两种类型的α和β亚基，按αβ₂的分子形式以非共价键连接而成，其α亚基由336个氨基酸残基组成，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1；其成熟β亚基由146个氨基酸残基组成，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

2.大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物的基因，其特征在于：编码大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物的α亚基的基因由1251个核苷酸组成，其自5’端至3’端核苷酸序列为SEQ ID NO：3，对应的编码其成熟的α亚基蛋白为SEQ ID NO：3中第22-1029位核苷酸，其编码相对应的氨基酸序列为SEQ IDNO：1；编码大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物的β亚基的基因由1830个核苷酸组成，其自5’端至3’端核苷酸序列为SEQ ID NO：4，对应的编码其成熟的β亚基蛋白为SEQ IDNO：4中第82-519位核苷酸，其编码相对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

3.如权利要求1所述的大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物的制备方法，其特征在于：从中国特产两栖动物大蹼铃蟾皮肤中分离纯化得到。

4.如权利要求1所述的大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物的用途，其特征在于：可用于生物医学试剂制备。

5.如权利要求1所述的大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物的用途，其特征在于：该蛋白复合物在抗肿瘤制药中的应用。

6.如权利要求1所述的大蹼铃蟾非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物的用途，其特征在于：该蛋白复合物在创伤修复制药中的应用。

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