CN1208343C - 天花粉蛋白突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种天花粉蛋白突变体(MTCS)产品及其制备方法。本发明的产品相比天然天花粉蛋白显著地降低了过敏原性，而保留了天然天花粉蛋白的生物活性，如抗肿瘤、抗病毒、引产及核糖体失活蛋白活性。根据本发明的天花粉蛋白突变体能用于作为高效低毒地治疗肿瘤、艾滋病、宫外孕和中期引产等的药物。其低免疫原性允许天花粉蛋白突变体安全多次使用。

Description

天花粉蛋白突变体
发明领域
本发明涉及天花粉蛋白突变体(Mutant Trichosanthin，MTCS)，其制备方法，及其用途。
发明背景
天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)原是从葫芦科植物栝楼(Trichosanthes Kirilowii M.)的根中分离得到，经鉴定为中国传统中药天花粉的活性成分，天花粉已有二千余年医学临床应用历史。天花粉蛋白的化学本质是一种分子量为27KDa的I型核糖体失活蛋白(RibosomeInactivating Protein，RIP)，具有RNA-N-糖苷酶活性，能使真核细胞核糖体的60S亚基失活(Zhang JS，Liu WY，The Mechanism of ActionTrichosanthin on Eukaryotic Ribosome RNA N-glycosidase of the Cytotoxin，Nucleic Acids Res，20(6)：1271-1275，1992)。天然天花粉蛋白是由247个氨基酸残基组成。其氨基酸序列的一级结构如图1所示(聂慧玲等，天花粉蛋白基因的克隆及结构分析，第四次中国基因结构、克隆与表达学术讨论会，海口，A-32，1991)。十九世纪七十年代天花粉蛋白在中国被临床应用于中期引产和治疗滋养层来源的疾病，例如葡萄胎(上海实验生物学研究所第二研究室，中国科学，19：811-830，1976)。1989年实验室里发现天花粉蛋白能抑制1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)在急性感染的T淋巴细胞和慢性感染的巨噬细胞中复制(McGrath MS，Hwang KM，Caldwell SE，et al.，GLQ233：An Inhibitor of Human ImmunodeficiencyVirus Replication in Acutely and Chronically Infected Cells of Lymphocyteand Mononuclear Phagocyte Lineage，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：2844-2848，1989)，此后开始进行天花粉蛋白试用于治疗艾滋病的临床试验。除HIV外，天花粉蛋白还具抗其它种类病毒的能力。还发现TCS对白血病细胞和其它类型的肿瘤细胞具有毒性(孔梅，柯一保，周美云等，天花粉蛋白诱发白血病细胞K562凋亡的研究，实验生物学报，31(3)：233-243，1998；Zheng YT，Zhang KL，Ben KL，et al.，In VitroImmunotoxicity and Cytotoxicity of Trichosanthin Against Human NormalImmunocytes and Leukemia-lymphoma Cells，Immunopharmacology andImmunotoxicology，17(1)：69-79，1995；吴裕新，项丹妮，章水平等，天花粉蛋白对胃结肠癌细胞的杀伤作用及其机制的研究，中华消化杂志，13(3)：263-266，1993)。但在天花粉蛋白临床应用时观察到它有一个较为危险的毒副作用。它偶尔会引起通过IgE介导的速发性过敏反应。特异性IgE抗体与天花粉蛋白结合，导致I型变态反应的发生，临床表现为荨麻疹、血管神经性水肿、以及过敏性休克--一种可在几分钟危及生命的过敏反应。个体内这种对天花粉蛋白的免疫异常应答常在多年内均呈高反应水平，因而天花粉蛋白作为引产药物每个引产个体一生中只能使用一次。除引产外，使用天花粉蛋白治疗其他适应症时同样存在过敏反应，极大地限制了它的应用。
本发明的目的在于克服天花粉蛋白的副作用，提供免疫原性低、能反复安全使用的新天花粉蛋白产品。
发明概述
本发明提供了低免疫原性的天花粉蛋白突变体，其含有天然天花粉蛋白的氨基酸序列，且在以下三个区域有至少一个氨基酸残基的修饰：氨基酸残基第174位到180位，203位到226位，和230位到244位；或包含所述修饰并基本保留天花粉蛋白生物活性的所述天花粉蛋白突变体的片段或衍生物。
本发明还涉及编码本发明天花粉蛋白突变体的核酸。
本发明还涉及含有本发明核酸的载体、特别是表达载体，以及用本发明的核酸或本发明的载体转化的宿主细胞。
本发明还涉及制备本发明天花粉蛋白突变体的方法，包括在有利于所述天花粉蛋白突变体表达的条件下培养本发明的宿主细胞，及从培养物中回收所述天花粉蛋白突变体。
本发明还涉及含有本发明天花粉蛋白突变体和药物可接受载体或赋型剂的药物组合物。
本发明还涉及作为药物的本发明的天花粉蛋白突变体。
本发明还涉及本发明天花粉蛋白突变体在制备治疗病毒性疾病、治疗肿瘤、治疗宫外孕和/或引产的药物中的应用。
最后，本发明涉及一种在哺乳动物中引产、治疗宫外孕、治疗病毒性疾病和/或治疗肿瘤的方法，包括给予需要治疗的哺乳动物治疗有效量的本发明的天花粉蛋白突变体。
附图简述
图1列出了天然天花粉蛋白的氨基酸序列(序列表中SEQ ID NO.1)及编码该氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)。位点1至247区域显示成熟天然天花粉蛋白的氨基酸序列。
发明详述
经大量的研究，本发明人发现天花粉蛋白中免疫活性相关区域在结构上位于第174位到180位、203位到226位、230位到244位氨基酸残基内。通过修饰这三个区域中的至少一个氨基酸残基可以得到具有优秀性能的新的天花粉蛋白突变体。它显著地降低了天花粉蛋白的过敏原性，但基本保留了天花粉蛋白的生物学活性。本发明的天花粉蛋白突变体至少保留核糖体失活和引产两种活性，优选保留天然天花粉蛋白的全部生物活性，包括抗肿瘤和抗病毒等活性。
因此，本发明提供了一种低免疫原性天花粉蛋白突变体，其中在天花粉蛋白的以下三个氨基酸序列区域中至少一个氨基酸残基被修饰：氨基酸残基第174位到180位、203位到226位、230位到244位。
在本申请说明书和权利要求中，氨基酸残基的位置编号参照图1中的残基编号。
本发明的天花粉蛋白突变体可以是一个全长的成熟蛋白，或其包含至少一个本发明中定义的氨基酸残基修饰的片段或衍生物。
在本申请中，所述氨基酸残基的“修饰”指氨基酸残基的缺失、插入、添加、置换或化学修饰。氨基酸残基的修饰优选能引起在被修饰的氨基酸位点的电荷改变。术语氨基酸残基的“置换”优选指用疏水性氨基酸残基置换亲水性氨基酸残基、用亲水性氨基酸残基置换疏水性氨基酸残基、用碱性氨基酸残基置换酸性氨基酸残基，或用酸性氨基酸残基置换碱性氨基酸残基。
本发明中所用术语“亲水性氨基酸”特别是指丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天门冬氨酸(Asp)、天门冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、和组氨酸(His)。其中，Asp、Asn、Glu、Gln为酸性氨基酸，Lys、Arg、His为碱性氨基酸。术语“疏水性氨基酸”特别是指甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Try)和甲硫氨酸(Met)。
在本发明的一个优选实施方案中，天花粉蛋白突变体在174-180区域中含有至少一个选自表1中的氨基酸残基修饰。
表1
    原氨基酸残基及其序号         优选的修饰
    Arg174Val175Asp176Lys177Thr178Phe179Leu180     被Glu、Asp或Gly置换缺失被Lys或Gly置换被Glu、Asp或Gly置换被Gly或Ala置换缺失缺失
在本发明的另一个选优实施方案中，天花粉蛋白突变体在203-226区域中含有至少一个选自表2中的氨基酸残基修饰：表2
    原氨基酸残基及其序号        优选的修饰
        Ser203，Ser211Thr204，Thr224，Thr226Asn205，Asn206，Asn217，Asn220Gly207Gln208，Gln219，Gln221Phe209Glu210Pro212Val213，Val214，Val215，Val223Ile216，Ile225Ala218Arg222       被Gly或Ala置换被Gly或Ala置换被Lys或Gly置换缺失被Lys或Gly置换缺失被Lys或Gly置换缺失缺失缺失缺失被Glu，Asp或Gly置换
在另一优选实施方案中，天花粉蛋白突变体在230-244区域中含有至少一个选自表3中的氨基酸残基修饰：
表3
    原氨基酸残基及其序号         优选的修饰
        Ala230，Ala238Gly231Val232，Val233Thr234Ser235Asn236，Asn242，Asn244Ile237Leu239，Leu240，Leu241Arg243             缺失缺失缺失被Gly或Ala置换被Gly或Ala置换被Lys或Gly置换缺失缺失被Glu，Asp或Gly置换
优选地，本发明的天花粉蛋白突变体在所述174-180，203-226和230-244三个区域中的2个或3个区域中都含有氨基酸残基的修饰。在这种情况下，更优选每个区域中的氨基酸残基的修饰分别选自表1、2和3中所列出的那些。
在一个优选的实施方案中，本发明的天花粉蛋白突变体含有如下2个氨基酸残基的修饰：第177位的Lys被Glu置换，以及第203位的Ser被Gly置换。
在另一个特别优选的实施方案中，本发明的天花粉蛋白突变体含有如下所有3个氨基酸残基的修饰：第177位的Lys被Glu置换，以及第203位的Ser被Gly置换，以及第236位的Asn被Gly置换。
本发明还涉及编码本发明天花粉蛋白突变体的核酸。
本发明的天花粉蛋白突变体可以按本领域技术人员已知的基因工程或肽合成方法制备，例如固相肽合成(Merrifield J，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154.1963)。优选通过对天然天花粉蛋白基因的改造和在适当生物宿主中表达上述改造好的基因来制备。
本发明编码上述天花粉蛋白突变体的核酸可以克隆在适当的载体中，特别是表达载体如质粒载体pET-2d或pET-3a。
本发明的核酸或含有该核酸的载体可被用来转化适当的宿主细胞，如大肠杆菌(E.Coli.)。这种转化了的宿主细胞可用于培养生产本发明的天花粉蛋白突变体。本发明同样涉及这种被转化了的宿主细胞。
因此，本发明还涉及一种制备本发明天花粉蛋白突变体的方法，包括在有利于所述天花粉蛋白突变体表达的条件下培养本发明的宿主细胞，及从培养物中回收所述天花粉蛋白突变体。
天然天花粉蛋白的基因是从ATG(起始密码子)到TAG(终止密码子)共计870碱基对。本技术领域人员可根据已发表的序列信息，用常规的方法得到该基因。如从基因组DNA文库(Chow TP，Feldman RA，Lovett M，Piatak M，et al.，Isolation and DNA Sequence of a GeneEncoding Alpha-trichosanthin，a Type I Ribosome-inactivating Protein，J.Biol.Chem.265(15)：8670-8674，1990)或cDNA文库筛取(Shaw PC，Yung MH，Zhu RH，Ho WK，Ng TB，Yeung HW，et al.，Cloning ofTrichosanthin cDNA and its Expression in Escherichia Coli，Gene，97(2)：267-72，1991)，或利用聚合酶链式反应(PCR)方法吊取(聂慧玲等，天花粉蛋白基因的克隆及结构分析，第四次中国基因结构、克隆与表达学术讨论会，海口，A-32，1991)，也可以利用化学方法合成。该基因编码了一个由289个氨基酸残基组成的前体蛋白。它除了编码成熟的247氨基酸残基的天花粉蛋白外，前体蛋白在N端前还包含一个23肽的信号肽，在C端后还包含一个19肽的尾肽。方便地，可以利用已发表的方法(Sambrook J，et al.，Molecular Cloning，A laboratoryManual(Second Edition)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1982)克隆编码天然天花粉蛋白前体蛋白的cDNA，或者直接使用含有该cDNA的质粒。
利用本技术领域人员均已知的DNA定点突变方法，可对天然天花粉蛋白基因进行修饰。在一个具体实施方案中，所述修饰包括
a)必要时在编码成熟天然天花粉蛋白的DNA序列的5’端前和3’端后分别引进适当的限制性内切酶位点，引入起始密码子和终止密码子。例如在编码成熟天然天花粉蛋白的DNA序列的5’端引入NcoI位点(CCATGG)，从而引进了起始密码子ATG，同时在成熟天然天花粉蛋白的第-1位加了一个甲硫氨酸；或引进限制性内切酶NdeI位点(CATATG)，从而使成熟天然天花粉蛋白的第1位氨基酸残基从天门冬氨酸改为甲硫氨酸。在编码成熟天花粉蛋白的DNA序列的3，端后可引进限制性内切酶BamHI位点(GGATCC)，从而引进了终止密码子；以及
b)对编码待突变部位氨基酸序列(在174-180、203-226、230-244区域的氨基酸残基)的DNA序列进行修饰，以获得编码本发明天花粉蛋白突变体的基因。由于氨基酸遗传编码子的简并性，对一个氨基酸位置的突变在基因水平上可以有多个方案。对特定部位的DNA序列的定点改造可以利用商业上可买到的试剂盒，例如Bio-Rad公司的Muta-Gene Phagemid in vitro Mutagenesis Kit，按厂家提供的说明来进行。
将定点突变得到的编码天花粉蛋白突变体的DNA序列用适当的限制性内切酶如NcoI(或NdeI)和BamHI酶切，然后克隆进表达载体如质粒载体pET-2d(或pET-3a)。所得的突变表达载体用常规方法转化合适的宿主细胞如大肠杆菌BL21(DE3，plysS)。将转化子在适当的培养基中培养，若需要在适当时加诱导剂如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导天花粉蛋白突变体表达。然后通过常规方法，包括宿主细胞裂解、对裂解液离心、柱层析分离纯化等，从培养物中分离所表达的天花粉蛋白突变体。
MTCS的活性实验
以下所列为本发明天花粉蛋白突变体的免疫反应能力及生物活性的测试方法和结果。
1.TCS缺失型突变体和TCS修饰型突变体的性质
为了探索一级结构与生物学活性和免疫反应能力的关系，按表1至3中所示突变，从基因水平将天花粉蛋白进行改造，获得了多个编码天花粉蛋白C末端序列缺失(缺失型突变体)或多个氨基酸残基被修饰(修饰型突变体)的基因。经大肠杆菌表达、纯化后分别获得了相应的多个缺失型突变体或修饰型突变体。天花粉蛋白及其突变体具有RNA N-糖苷酶活性，可使核糖体失活，从而阻断细胞蛋白质的合成。对这些缺失型突变体和修饰型突变体的生物学活性和免疫反应能力进行检测。根据这些检测的结果，结合天花粉蛋白的空间结构信息，分析TCS活性区域的结构基础。RIP活性依Pelhem和Jackson的方法进行(H.K.B.Pelhem and R.J.Jackson，Eur.J.Biochem.67：247-256，1976)。引产活性按发明人实验室的常规方法进行(Nie HL，et al.，Position 120-123，a Potential Active Site of Trichosanthin，Life Sciences，62(6)：491-500，1998)。体外免疫反应活性用竞争性ELISA方法检测(He XH，et al.，Effects of Chemical Modification of Lysine and ArginineResidues of Trichosanthin on its Reactivity with IgE，Acta Biochemicaet Biophysica Sinica，26：657-662，1994)。结果列于表4。
表4：TCS缺失型突变体和TCS修饰型突变体的性质检测
    产品    氨基酸缺失位点 氨基酸修饰位点   RIP活性*   引产活性** 体外与IgG反应能力*** 体外与IgE反应能力***
 NTCS(1-247)       无关   无关   ++   ++   ++   ++
 L3TCS(1-244)     247-245   无关   ++   ++   ++   ++
 L5TCS(1-242)     247-243   无关   ++   ++   +   +
    L10TCS(1-237)     247-238   无关   ++   ++   +   +
    L14TCS(1-233)     247-234   无关   ++   ++   +   +
    L29TCS(1-218)     247-219   无关   +   +   -   -
    L46TCS(1-201)     247-202   无关   +   +   -   -
    L52TCS(1-195)     247-196   无关   ±   ±   -   -
    L67TCS(1-180)     247-181   无关   -   -   -   -
     L74TCS(1-173)     247-174   无关   -   -   -   -
    L7TCS(1-173，181-247)     180-174   无关   ±   ±   ±   ±
    L52TCS(1-173，181-202)     247-203，180-174   无关   -   -   -   -
  M7TCS(1-247)     无关   180-174之一   ++   ++   ±   ±
    M24TCS(1-247)     无关   226-203之一   ++   ++   ±   ±
    M15TCS(1-247)     无关   244-230之一   ++   ++   +   +
M31TCS(1-247) 无关 226-203之一，和180-174之一 ++ ++ -(a) -(a)
M46TCS(1-247) 无关 244-230之一，和226-203之一，和180-174之一 ++ ++ - (b) - (b)
NTCS--天然天花粉蛋白
LTCS--天花粉蛋白缺失型突变体
MTCS--为天花粉蛋白修饰型突变体
*RIP活性IC50(ng/ml)：
++≤50，50＜+≤500，500＜±≤5000，-＞5000
**引产活性(％)：
++≥80，80＞+≥30，30＞±≥5，-＜5
***体外免疫反应能力％：
++＞80，80≥+＞30，30≥±＞10，10≥-(a)＞
5，-(b)≤5
上述天花粉蛋白缺失型突变体和天花粉蛋白修饰型突变体的性质检测结果表明：
对于天花粉蛋白缺失型突变体，当3个氨基酸残基从C末端缺失时，它的体外与IgG和与IgE反应的能力如同天然天花粉蛋白一样呈现强阳性。当缺失程度加大至5个氨基酸残基时，免疫活性下降，但此时尚未观察到对核糖体失活和引产活性的影响。直至缺失29个氨基酸残基，它的生物学活性才出现下降。按本发明人以往所报道，天花粉蛋白的生物学活性中心位于位点110至174之间的区域(Ke YB，Chen JK，Nie HL，et al.，Structure-function Relationship ofTrichosanthin，Life Sciences，60(7)：465-472，1997)。C末端序列的缺失引起的空间结构的变化对此活性区域同样有影响。这种缺失序列越接近活性中心，生物学活性下降越大。现发现免疫反应区域较生物学活性区域结构排列接近羧基末端，因而它较易受到C末端序列缺失的影响。表4中修饰型突变体M7TCS(1-247)[位点174至180间的一个氨基酸残基被突变]，M24TCS(1-247)[位点203至226间一个氨基酸残基被突变]和M15TCS(1-247)[位点230至244间一个氨基酸残基被突变]表现出弱的与IgG和IgE相关的体外免疫反应能力，但仍然保留着包括RIP和引产的强生物学活性。这个结果表明这三个被修饰的氨基酸序列区域(第180-174，226-203，244-230位)与免疫反应能力相关。在这些区域中任何结构改变均可导致免疫反应能力的下降。这些结构改变包括至少一个氨基酸残基被缺失；相邻两个氨基酸残基间插入至少一个氨基酸残基；这些序列被加上至少一个氨基酸残基；用疏水性氨基酸残基置换至少一个亲水性氨基酸残基；用亲水性氨基酸残基置换至少一个疏水性氨基酸残基；用碱性氨基酸残基置换至少一个酸性氨基酸残基；用酸性氨基酸残基置换至少一个碱性氨基酸残基；至少一个氨基酸残基被接上其它化学基团；和/或包括插入至少一个氨基酸残基的任何修饰，此修饰能引起被修饰氨基酸位点的电荷改变。修饰型突变体M31TCS(1-247)[位点174至180间的一个氨基酸残基和位点203至226间的一个氨基酸残基被突变]和M46TCS(1-247)[位点174至180间的一个氨基酸残基，位点203至226间的一个氨基酸残基和位点230至244间的一个氨基酸残基被突变]两种蛋白突变体免疫反应能力为阴性而仍然保留包括RIP和引产在内的强生物学活性。这是两类性质优秀的天花粉蛋白突变体。极大地降低了天然天花粉蛋白的免疫原性，而无损生物学活性。其中M46TCS(1-247)的免疫原性比M31TCS(1-247)更低。
2.本发明天花粉蛋白突变体的性质：
按上文所述方法检测本发明的MTCS(M177、203)(177位Lys被Glu置换，且203位Ser被Gly置换)的体外RIP活性、怀孕小白鼠中期引产活性、体外与IgG和IgE的反应能力。体外培养下对肿瘤细胞的毒性作用的检测按本发明人实验室的常规方法进行(Kong M，et al.，Studyon Trichosanthin Induced Apoptosis of Leukemia K562 Cells，ActaBiologiae Experimentalis Sinica，31(3)：233-243，1998)。
a)天花粉蛋白突变体与天然天花粉蛋白的免疫与生物学活性的比较列于表5。
表5：天花粉蛋白突变体与天然天花粉蛋白的免疫与生物学活性的比较
  天然TCS   MTCS
    RIP活性(％)     ++     ++
    引产活性(％)     ++     ++
    对肿瘤细胞毒性(K562细胞株)     ++     ++
    体外与IgE反应能力(％)     ++     -(a)
    体外与IgG反应能力(％)     ++     -(a)
    诱发大鼠体内IgE应答*     ++     -
    诱发豚鼠体内急性过敏**     ++     ±
*详见(c-iv)
**详见(c-iii)
b)天花粉蛋白突变体对不同细胞株的毒性列于表6。
表6：天花粉蛋白突变体对不同细胞株的毒性
  细胞株     LC50(ug/ml)   细胞株    LC50(ug/ml)   细胞株    LC50(ug/ml)
    Jar     7.0   B16   69.2    Wish    ＞1000
    HL60     8.1   A431   77.6    HMPLC*    ＞1000
    MLT     10.0   B7-325   218.8
    K562     11.0   SPCA1   257.0
    U937     17.0   7404   354.8
*为人正常外周血淋巴细胞，从临床采集。
天花粉蛋白突变体对K562、HL60、MLT、U937等白血病细胞株和Jar绒癌细胞株的半数致死浓度LC50低于30ug/ml。这些LC50≤30ug/ml的细胞株被视为最敏感的细胞株。天花粉蛋白突变体对B16、A431、B7-325、SPCA1、7404等癌细胞的LC50高于30ug/ml，这些细胞为中度敏感型细胞株。天花粉蛋白突变体对正常体细胞，如人外周血淋巴细胞和人羊膜细胞(Wish细胞)的LC50高于1000ug/ml以上，称为非敏感型细胞株。这些数据清楚地表明在一定的剂量条件下，天花粉蛋白突变体对白血病细胞和其它种类的癌细胞有强烈的毒性，而不损伤正常体细胞。这结果与以往对天花粉蛋白的类似研究相符。
c)动物模型的研究
c-i)抗肿瘤研究
将人慢性髓细胞白血病的K562细胞接种至八周龄裸小鼠皮下，接种细胞数量为1×107细胞。接种10天后，可见接种细胞在50％动物中体内生长并形成实体肿瘤。选择肿瘤生成鼠并随机分为四组。三组动物给予不同剂量的天花粉蛋白突变体注射治疗。另一组以生理盐水注射作为对照。在治疗剂量≤引产剂量(三组分别为：15nm/Kg、45nm/Kg、75nm/Kg)条件下，每四天注射一次，以四次治疗为限，均可见不同程度的抑瘤效应。各治疗组的抑瘤率分别为(40±3)％、(71±2)％和(92±4)％。选用另一种T和B淋巴细胞双缺陷的免疫严重陷动物SCID小鼠，研究天花粉蛋白突变体对K562细胞的毒性。选用九周龄SCID小鼠皮下接种1×107的K562细胞，100％的接种动物长出了实体肿瘤。在接种后第五天，随机将小鼠分为四组，其中三组为治疗组，另一组为生理盐水对照组。治疗组按高、中、低不同剂量进行天花粉蛋白突变体注射治疗。高剂量组一次注射150nm/kg；中剂量组二次治疗注射，每次75nm/kg，每周注射一次；低剂量组三次注射，每次37nm/kg，每四天注射一次。每组的总剂量均为150nm/kg。高、中、低三组抑瘤率分别为(43±6)％、(64±8)％、和(94±3)％。两种动物模型的实验结论是天花粉蛋白突变体在引产剂量条件下，便可见明显的抑瘤效应。一半引产剂量四次注射便可见90％以上的抑瘤效果，即小剂量多次注射效果尤佳。
上述为人慢性髓细胞型白血病的细胞接种至两种动物机体形成实体瘤后，天花粉蛋白突变体的治疗效果均佳。在此两种动物模型的基础上，继续用SCID小鼠建立了另一种与临床表现更为接近的人慢性髓细胞型白血病的动物模型。接种K562细胞后小鼠体内生成液体瘤，并通过小鼠血液白血球数量和其它生化指标的变化得到反映。在三个治疗组中，从小鼠尾静脉注射3.75nm/kg、7.5nm/kg、和15nm/kg剂量的天花粉蛋白突变体，用以治疗移植瘤模型小鼠。经三次注射后，三个治疗组中小鼠白血球总数恢复至正常值的百分比分别为(25±6)％、(75±8)％和(94±3)％。这些数据表明MTCS治疗液体瘤的剂量可小于实体瘤，而治疗液体瘤的效果却优于实体瘤。
c-ii)小白鼠急性毒性试验
按常规方法进行小鼠急性毒性试验。选用八周龄F1小鼠(ICR/Balb-c)，每只动物一次注射天然天花粉蛋白或天花粉蛋白突变体，观察动物7天，比较天然天花粉蛋白和天花粉蛋白突变体的半致死剂量(LD50)。在同一剂量下，天然天花粉蛋白组相对天花粉蛋白突变体组可见较高的动物死亡率和较早的动物死亡时间。LD50(天然天花粉蛋白)＝18.4mg/Kg，LD50(天花粉蛋白突变体)＝27.5mg/Kg，天花粉蛋白突变体的急性毒性比天然天花粉蛋白几乎下降了50％。
c-iii)豚鼠体内急性过敏试验
将天然天花粉蛋白和天花粉蛋白突变体分别作豚鼠体内急性过敏试验。致敏用量为一次皮内注射人引产剂量的4.5倍剂量，14天后对动物进行攻击，攻击剂量为一次静脉注射人引产剂量的10倍。观察动物在受过敏原攻击后30分钟内的过敏反应和死亡情况。天然天花粉蛋白组死亡动物数与试验动物总数之比为12/14，大约86％。天花粉蛋白突变体组为3/15，大约20％。两者相较差异显著。即天花粉蛋白突变体引起的豚鼠体内急性过敏程度比天然天花粉蛋白显著降低。
c-iv)大鼠被动皮肤过敏试验
按Ovary的方法(Ovary Z，et al.，PCA Reactions with MouseAntibodies in Mice and Rats，Inter Archs Allergy Appl Immun，48：16-21，1975)，作大鼠被动皮肤过敏(Passive Cutaneous anaphylaxis，PCA)试验。两组小鼠分别用天然天花粉蛋白和天花粉蛋白突变体致敏。14天后，分别得到抗天然天花粉蛋白和天花粉蛋白突变体的小鼠抗血清。将两种抗血清分别注入麻醉了的大鼠剃去毛的背部皮内，并分别用含天然天花粉蛋白和天花粉蛋白突变体的1％伊文思蓝注射入大鼠的静脉进行攻击。30分钟后，处死动物，观查大鼠背部皮肤蓝斑形成情况，以蓝斑直径大于0.5cm者为PCA阳性反应。天然天花粉蛋白组的所有动物均显阳性，天花粉蛋白突变体组的所有动物均显阴性。天花粉蛋白突变体诱发大鼠体内IgE应答较天然天花粉蛋白锐减。
3.天花粉蛋白突变体抗肿瘤机理
a)天花粉蛋白突变体诱导敏感细胞的凋亡
如上文2a和2b所述，天花粉蛋白突变体对体外培养中的白血病细胞有极强的毒性，而无损正常细胞。以天花粉蛋白突变体对K562细胞的作用为例，经多种手段研究其机理。通过电子显微镜观察可见用天花粉蛋白突变体治疗后K562细胞发生了典型的凋亡形态学改变：细胞变小，胞浆浓缩，内质网扩张，核仁消失，染色质凝聚浓缩为数个团块，和形成有外膜包绕的凋亡小体。天花粉蛋白突变体治疗组细胞还表现出DNA“阶梯状”条带，这是凋亡的生化指标。以及利用流式细胞仪(FACS)检测到的凋亡细胞出现的二倍体凋亡峰。这些结果表明天花粉蛋白突变体诱导了K562细胞的凋亡。
b)敏感细胞的细胞膜上存在着与天花粉蛋白突变体专一结合的部位
用生物分子相互作用分析系统(Real-time BiomolecularInteraction Analysis，BIA)研究。天花粉蛋白突变体被固相化在传感片上的葡聚糖基质中，形成一面微流细胞墙(Wall of Micro-flow Cell)。细胞膜抽提液控制地流经表面，反应所导致的任何表面浓度的变化被作为SPR(Surface Plasmon Resonance)信号测出，并以RU(ResonanceUnit)来衡量。不同种类的敏感细胞有100至300不等的RU变化，表明天花粉蛋白突变体与细胞膜蛋白结合甚强。而同样测试的正常细胞如人子宫羊膜细胞则无明显结合发生。
c)通过激光共聚焦扫描显微镜研究，观察到天花粉蛋白突变体可以通过受体介导形式被内吞到K562细胞内。
d)在[35S]GTPγS的结合实验里，天花粉蛋白突变体激活敏感细胞的G蛋白介导的信号转导。不敏感细胞观察不到此激活现象。
e)通过激光共聚焦扫描显微镜，观察到天花粉蛋白突变体诱导敏感细胞细胞内钙库中游离钙离子的释放和浓度变化。
以上研究得出的结论为：敏感细胞的细胞膜上存在着天花粉蛋白突变体的受体，能介导天花粉蛋白突变体进入细胞内，发挥致核糖体失活作用。同时，天花粉蛋白突变体还干扰了细胞的信号转导。上述双重作用导致了敏感细胞的凋亡。敏感细胞极大多数是肿瘤细胞，因而天花粉蛋白突变体治疗肿瘤与细胞毒型和细胞抑制型的化疗药物使肿瘤和正常组织两败俱伤的杀伤机理完全不同。为天花粉蛋白突变体作为新抗肿瘤药物的临床应用提供了理论基础。
如上所述，本发明的天花粉蛋白突变体与天然天花粉蛋白相比大大降低了免疫原性，而基本保留了天然天花粉蛋白的生物活性。低免疫原性使之可以被多次安全地使用，能更好地治疗天然天花粉蛋白的适应症。更具体地，这些适应症包括但不局限于以下项目。
1.白血病和其它种类的实体肿瘤。由于天花粉蛋白突变体选择性地进入靶细胞的机理，临床上使用天花粉蛋白突变体只需少次数地小剂量给药。在一定的剂量范围内，天花粉蛋白突变体对肿瘤细胞有强烈毒性作用，而不损伤正常细胞，故不良反应极微。
2.病毒性疾病，特别是艾滋病。在艾滋病的治疗上天花粉蛋白突变体较天然天花粉蛋白毒副反应低，对病人更安全。
3.宫外孕和中期引产。与天花粉蛋白作为引产药物时每个个体一生中只能使用一次不同，因其低免疫原性，可以多次安全地使用天花粉蛋白突变体。
本发明的天花粉蛋白突变体可以与药学上可接受的载体或赋型剂一起形成药物组合物。相应地，本发明还提供了这样的药物组合物，其包括治疗有效量的天花粉蛋白突变体和药学上可接受的载体或赋形剂。这样的载体或赋型剂的实例包括但不局限于：盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油及乙醇等或其组合。这样的药物组合物的剂型与所选择的给药方式相适应。
本发明也提供了一种药物包装或试剂盒，包括一个或多个装有一种或多种本发明的药物组合物的成分的容器。根据本发明的天花粉蛋白突变体及其片段或其衍生物也可与其它的治疗化合物组合使用。
根据本发明的药物组合物可用多种方式，诸如口服、局部、静脉内、腹膜内、肌肉内、肿瘤内、皮下、鼻内或真皮内途径，给药于哺乳动物宿主，例如人类。这些药物组合物用于治疗或预防具体疾病或症状时，应按根据该疾病或症状的特性的有效剂量使用。本发明天花粉蛋白突变体的使用剂量可以参照天然天花粉蛋白的有效剂量确定。
以下实施例的目的是举例说明，但无意限制本发明。
实施例
实施例1
本实施例的目的是举例说明天花粉蛋白基因的定点突变和成熟天然天花粉蛋白cDNA的克隆。
本领域的技术人员可按照常规的方法，方便地获得天然天花粉蛋白基因。例如以天然天花粉蛋白为探针，从植物栝蒌的cDNA库中筛选(Shaw PC，Yung MH，Zhu RH，Ho WK，Ng TB，Yeung HW，et al.，Cloning of Trichosanthin cDNA and its Expression in Escherichia Coli，Gene，97(2)：267-72，1991)；又例如设计合适的DNA探针，从植物栝蒌的基因文库中筛选(Chow TP，Feldman RA，Lovett M，Piatak M，etal.，Isolation and DNA Sequence of a Gene EncodingAlpha-trichosanthin，a Type I Ribosome-inactivating Protein，J.Biol.Chem.265(15)：8670-8674，1990)；再例如设计合适的DNA引物，利用PCR方法吊取(聂慧玲等，天花粉蛋白基因的克隆及结构分析，第四次中国基因结构、克隆与表达学术讨论会，海口，A-32，1991)。
利用突变引物1和2对天花粉蛋白包含信号肽和尾肽的前体蛋白的cDNA(序列见图1)进行定点突变，使得编码成熟天然天花粉蛋白的DNA序列的5’端前引入起始密码于，并在3’端后引进终止密码子。然后编码成熟天然天花粉蛋白的DNA被克隆进一个表达载体。为本实验设计了两个引物。
引物1  5’GTG CAG GCC ATG GAT GTT AGG 3’(SEQ IDNO.3)
引物2  5’AAC AAT ATG GCA TAG GAT CCC ATG GAT GAC3’(SEQ ID NO.4)
引物1的特点是含限制性内切酶NcoI位点(CCATGG)，同时引进起始密码子(ATG)，并在成熟天然天花粉蛋白的-1位加了一个Met。
引物2的特点是含限制性内切酶BamHI位点(GGATCC)，结果在编码成熟天然天花粉蛋白的3’端后引进终止密码子(TAG)。
选用Bio-Rad公司提供的利用噬菌粒进行的体外突变药盒(Muta-Gene Phagemid in vitro Mutagenesis Kit，目录号170-3576)，按药盒中所附的说明进行操作。通过DNA序列分析验证所获突变。详见该药盒厂家说明。
简言之，该方法包括以下步骤。
含Uracil的模板DNA的抽提
编码天花粉前体蛋白的原始基因先被克隆进噬菌粒载体pTZ-19U，得到模板DNA pTZ-19U-TCS′(聂慧玲等，天花粉蛋白基因的克隆及结构分析，第四次中国基因结构、克隆与表达学术讨论会，海口，A-32，1991)。在含氯霉素培养液里生长的大肠杆菌CJ236用pTZ-19U-TCS′转化，然后铺在含青霉素的平板上挑选单菌落。含噬菌粒的转化子在含青霉素的50ml培养液培养至O.D.600为0.3左右。接着加入M13K07辅助噬菌体(Halper Phage)1×1010 pfu(噬斑形成单位)后，在37℃振荡培养1小时，再加入卡那霉素3.5mg。继续培养4-6小时后离心，上清液中加入100ug Rnase并保温30分钟，在冰浴中用醋酸铵/PEG沉淀30分钟后离心。沉淀用高盐缓冲液200ul再悬浮一次，冰浴中放置30分钟后再次离心。取含Uracil的模板DNA的上清液，先后用酚、酚/氯仿、氯仿抽提。最后该含Uracil的模板DNA用醋酸铵/乙醇在-70℃沉淀，用70％乙醇洗沉淀，并溶解于10-20ul的TE缓冲液。
突变链的合成
上述含Uracil的模板DNA与0.1到0.3pmol突变引物、退火缓冲液和水混合，混合物先加热至70℃，在40分钟时间内缓缓冷却到30℃。如此冷却后的混合物放入冰浴中，加入3单位的T4 DNA连接酶和1单位的T4 DNA聚合酶。该合成混合物在冰浴中放置5分钟，然后在25℃放置5分钟，最后在37℃放置90分钟。加入90ul终止缓冲液终止合成反应。用该经突变后的DNA产物转化用氯化钙处理的感受态大肠杆菌MV1190。将转化子铺板于含青霉素的平板上，37℃培养过夜。挑选数个单菌落，分别抽提质粒，最后经DNA序列测定证实符合突变设计。在本实施例情况下该质粒为pTZ-19U-TCS，即其5’端含有NcoI位点，3’端含有BamHI位点的编码成熟天花粉蛋白的DNA序列。
用引物1和引物2突变后得到的质粒pTZ-19U-TCS可用于作为实施例2至6中的模板DNA。另一方面，质粒pTZ-19U-TCS接着经NcoI和BamHI在37℃双酶解2小时，通过低熔点琼脂醣凝胶电泳分离和回收长度约750bp的天花粉蛋白基因片段。然后该片段利用T4 DNA连接酶在4℃与事先同样经NcoI和BamHI双酶解的表达型质粒pET-2d连接过夜，得到可供表达用的pET-2d-TCS。
实施例2
编码MTCS(M177)的DNA的突变和克隆
利用Bio-Rad公司的Muta-Gene Phagemid in vitro MutagenesisKit进行突变。按厂家说明的步骤操作。使用实施1中得到的质粒pTZ-19U-TCS作为模板DNA。使用引物3进行定点突变。简言之，用pTZ-19U-TCS转化大肠杆菌CJ236。然后在辅助噬菌体存在下抽提出含Uracil的突变模板DNA。接着通过一系列的操作合成突变链。这些操作包括混合含Uracil的模板DNA和突变引物、加T4 DNA连接酶、加T4 DNA聚合酶等。如此突变了的DNA被用来转化感受态大肠杆菌MV1190。最后挑选突变体克隆并经DNA序列测定证实突变位点，得到pTZ-19U-MTCS(M177)。
为本实验设计了突变引物3。
引物3  5’AAG CGT GTT GAC  GAA ACC TTC CTA CCA  3’(SEQ ID NO.5)
引物3的特点是将天然天花粉蛋白177位的Lys的密码子置换成Glu的密码子。由于密码子的简并性，下划线部位的密码子还可以用其它编码Glu的碱基替代，如GAG。
如此取得的pTZ-19U-MTCS(M177)接着被NcoI和BamHI双酶解，得到编码MTCS(M177)的DNA片段。然后该片段与事先经NcoI和BamHI双酶解后的质粒pET-2d连接，从而得到pET-2d-MTCS(M177)。
实施例3
编码MTCS(M203)的DNA的突变和克隆
除根据实验设计和使用了一个不同的引物4外，突变和克隆的操作步骤均按实施例2中所描述的方法进行，从而得到pET-2d-MTCS(M203)。
为本实验设计了突变引物4。
引物4  5’ATT CAG ATA GCG  GGT ACT AAT AAT GGA 3’(SEQ ID NO.6)
引物4的特点是将天然天花粉蛋白203位的Ser的密码子改变成Gly的密码子。由于密码子的简并性，下划线部位的碱基还可以用其它编码Gly的碱基替代，如GGA、GGC和GGG。即共有4种替代方式。
实施例4
编码MTCS(M236)的DNA的突变和克隆
除根据实验设计和使用了一个不同的引物5外，突变和克隆的操作步骤均按实施例2中所描述的方法进行，从而得到pET-2d-MTCS(M236)。
为本实验设计了突变引物5。
引物5  5’GTT GTA ACC TCC  GGC ATC GCG TTG CTG3’(SEQ ID NO.7)
引物5的特点是将天然天花粉蛋白236位的Asn的密码子改变成Gly的密码子。由于密码子的简并性，下划线部位的碱基还可以用其它编码Gly的碱基替代，如GGA、GGG和GGT。
实施例5
编码MTCS(M177，203)的DNA的突变和克隆
除根据实验设计和使用了两个不同的引物3和4外，突变和克隆的操作步骤均按实施例2中所描述的方法进行，从而得到pET-2d-MTCS(M177，203)。
引物3  5’AAG CGT GTT GAC  GAA ACC TTC CTA CCA 3’(SEQ ID NO.5)
引物4  5’ATT CAG ATA GCG  GGT ACT AAT AAT GGA 3’(SEQ ID NO.6)
引物3的特点是将天然天花粉蛋白177位的Lys的密码子置换成Glu的密码子。由于密码子的简并性，下划线部位的密码子还可以用其它编码Glu的碱基替代，如GAG。
引物4的特点是将天然天花粉蛋白203位的Ser的密码子改变成Gly的密码子。由于密码子的简并性，下划线部位的碱基还可以用其它编码Gly的碱基替代，如GGA、GGC和GGG。
实施例6
编码MTCS(M177，203，236)的DNA的突变和克隆
除根据实验设计和使用了三个不同的引物3、4和5外，突变和克隆的操作步骤均按实施例2中所描述的方法进行，从而得到pET-2d-MTCS(M177，203，236)。
引物3  5’AAG CGT GTT GAC  GAA ACC TTC CTA CCA3’(SEQ ID NO.5)
引物4  5’ATT CAG ATA GCG  GGT ACT AAT AAT GGA3’(SEQ ID NO.6)
引物5  5’GTT GTA ACC TCC  GGC ATC GCG TTG CTG3’(SEQ ID NO.7)
引物3的特点是将天然天花粉蛋白177位的Lys的密码子置换成Glu的密码子。由于密码子的简并性，下划线部位的密码子还可以用其它编码Glu的碱基替代，如GAG。
引物4的特点是将天然天花粉蛋白203位的Ser的密码子改变成Gly的密码子。由于密码子的简并性，下划线部位的碱基还可以用其它编码Gly的碱基替代，如GGA、GGC和GGG。
引物5的特点是将天然天花粉蛋白236位的Asn的密码子改变成Gly的密码子。由于密码子的简并性，下划线部位的碱基还可以用其它编码Gly的碱基替代，如GGA、GGG和GGT。
实施例7
天花粉蛋白的表达
按常规操作步骤，用实施例1中所得含天花粉蛋白基因的质粒pET-2d-TCS转化经氯化钙处理过的感受态大肠杆菌BL21(DE3，plysS)。简言之，轻轻混合1-100ng pET-2d-TCS和100ul感受态细胞。经在冰浴中放置30-60分钟，该混合物在42℃热休克90秒后，再放回冰浴中。5分钟后在该混合物中加入0.5ml的LB培养液，接着在37℃振荡培养1小时。取1/10该培养后的混合物用0.1ml LB培养液稀释后铺在含青霉素和氯霉素的LB培养板上。这些板在37℃培养过夜，然后挑取大小形态均匀的单菌落。转化子在37℃用含青霉素和氯霉素的LB培养液培养过夜后，再用含青霉素和氯霉素的M9ZB培养液在同样温度放大培养至A570＝0.8。加IPTG至终浓度为0.5mM，继续培养3小时后离心收集菌体。菌体经超声破碎后，离心取上清液加载于CM-Sephadex或CM-Sephorose柱层析。用含0.1mM苯基甲磺酰氟(PMSF)的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)洗柱，直至A280下降到基线，然后用0.1-0.4M线性梯度的NaCl洗脱液洗脱。其主峰即为表达的重组天花粉蛋白。重组天花粉蛋白的氨基酸序列在图1中如氨基酸残基1至247所示，在其-1位加上了一个Met。
实施例8
MTCS(M177)的表达
用实施例2中所得含有编码MTCS(M177)的DNA的质粒pET-2d-MTCS(M177)转化大肠杆菌BL21(DE3，plysS)。基因转化、表达和蛋白纯化按实施例7所用相同的步骤操作，藉此得到MTCS(M177)。MTCS(M177)的氨基酸序列除了第177位Lys被Glu置换外，与实施例7中的重组天花粉蛋白的氨基酸序列一致。
实施例9
MTCS(M203)的表达
用实施例3中所得含有编码MTCS(M203)的DNA的质粒pET-2d-MTCS(M203)转化大肠杆菌BL21(DE3，plysS)。基因转化、表达和蛋白纯化按实施例7所用相同的步骤操作，藉此得到MTCS(M203)。MTCS(M203)的氨基酸序列除了第203位Ser被Gly置换外，与实施例7中的重组天花粉蛋白的氨基酸序列一致。
实施例10
MTCS(M236)的表达
用实施例4中所得含有编码MTCS(M236)的DNA的质粒pET-2d-MTCS(M236)转化大肠杆菌BL21(DE3，plysS)。基因转化、表达和蛋白纯化按实施例7所用相同的步骤操作，藉此得到MTCS(M236)。MTCS(M236)的氨基酸序列除了第236位Asn被Gly置换外，与实施例7中的重组天花粉蛋白的氨基酸序列一致。
实施例11
MTCS(M177，203)的表达
用实施例5中所得含有编码MTCS(M177，203)的DNA的质粒pET-2d-MTCS(M177，203)转化大肠杆菌BL21(DE3，plysS)。基因转化、表达和蛋白纯化按实施例7所用相同的步骤操作，藉此得到MTCS(M177，203)。MTCS(M177，203)的氨基酸序列除了第177位Lys被Glu置换，且第203位Ser被Gly置换外，与实施例7中的重组天花粉蛋白的氨基酸序列一致。
实施例12
MTCS(M177，203，236)的表达
用实施例6中所得含有编码MTCS(M177，203，236)的DNA的质粒pET-2d-MTCS(M177，203，236)转化大肠杆菌BL21(DE3，plysS)。基因转化、表达和蛋白纯化按实施例7所用相同的步骤操作，藉此得到MTCS(M177，203，236)。MTCS(M177，203，236)的氨基酸序列除了第177位Lys被Glu置换、第203位Ser被Gly置换，且第236位Asn被Gly置换外，与实施例7中的重组天花粉蛋白的氨基酸序列一致。
实施例13
MTCS(M177)生物学活性和免疫反应能力的检测
RIP活性按Pelhem & Jackson方法测定(H.K.B.Pelhem and R.J.Jackson，Eur.J.Biochem.67：247-256，1976)。兔网织红细胞裂解液为Promega产品。[3H]亮氨酸为New England Nuclear产品。引产活性测定按本发明人实验室常规方法进行(Nie HL，et al.，Position 120-123，aPotential Active Site of Trichosanthin，Life Sciences，62(6)：491-500，1998)，以怀孕11天的ICR小鼠为模型。动物背部注射75nmol/KgMTCS(M177)，48小时后处死。解剖记录总胎鼠数及死亡胎鼠数(包括胎儿吸收点)，计算胎鼠死亡率。体外免疫反应能力用ELISA方法检测。IgG抗体和单克隆抗体IgE为本发明人实验室自行制备和纯化(He XH，et al.，Acta Biochemia et Biophysica Sinica，26：657-662，1994)。抗体用免疫亲和层析柱纯化。本实施例所有实验均用天然天花粉蛋白作为阳性对照。结果列于表7。
           表7：MTCS(M177)生物学活性和免疫反应能力的检测
    产品 氨基酸修饰位点   RIP活性(％) 引产活性(％) 体外与IgG反应能力 体外与IgE反应能力
  天然TCS     0     ++     ++     ++     ++
  MTCS(M177)     177     ++     ++     ±     ±
*实施例13至17中的“+”、“-”等所代表的数值参见表4。
实施例14
MTCS(M203)生物学活性和免疫反应能力的检测
按实施例13同样方法测定MTCS(M203)的RIP活性、引产活性和体外免疫反应能力。各项实验均用天然天花粉蛋白为阳性对照。结果列于表8。
表8：MTCS(M203)生物学活性和免疫反应能力的检测
    产品 氨基酸修饰位点   RIP活性(％) 引产活性(％) 体外与IgG反应能力 体外与IgE反应能力
  天然TCS     0     ++     ++     ++     ++
 MTCS(M203)     203     ++     ++     ±     ±
实施例15
MTCS(M236)生物学活性和免疫反应能力的检测
按实施例13同样方法测定MTCS(M236)的RIP活性、引产活性和体外免疫反应能力。各项实验均用天然天花粉蛋白为阳性对照。结果列于表9。
表9：MTCS(M236)生物学活性和免疫反应能力的检测
    产品 氨基酸修饰位点 RIP活性(％) 引产活性(％) 体外与IgG反应能力 体外与IgE反应能力
  天然TCS     0     ++     ++     ++     ++
  MTCS(M236)     236     ++     ++     +     +
实施例16
MTCS(M177，203)生物学活性和免疫反应能力的检测
按实施例13同样方法测定MTCS(M177，203)的RIP活性、引产活性和体外免疫反应能力。各项实验均用天然天花粉蛋白为阳性对照。结果列于表10。
表10：MTCS(M177，203)生物学活性和免疫反应能力的检测
    产品 氨基酸修饰位点 RIP活性(％) 引产活性(％) 体外与IgG反应能力 体外与IgE反应能力
    NTCS     0     ++     ++     ++     ++
 MTCS(M177，203)   177，203     ++     ++     -(a)     -(a)
实施例17
MTCS(M177，203，236)生物学活性和免疫反应能力的检测
按实施例13同样方法测定MTCS(M177，203，236)的RIP活性、引产活性和体外免疫反应能力。各项实验均用天然天花粉蛋白为阳性对照。结果列于表11。
表11：MTCS(M177，203，236)生物学活性和免疫反应能力的检测
    产品 氨基酸修饰位点   RIP活性(％) 引产活性(％) 体外与IgG反应能力 体外与IgE反应能力
    NTCS     0     ++     ++     ++     ++
   MTCS(M177，203，236)     177，203，236     ++     ++     -(b)     -(b)
实施例18
MTCS(M177)对K562细胞的毒性
用MTT(3-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物细胞毒试验测定MTCS(M177)对人慢性髓细胞型白血病K562细胞和正常人淋巴细胞的毒性。每种细胞，以在含有10％小牛血清的RPMI-1640培养液内培养的200000数量级细胞，于37℃、5％CO2条件下接种细胞。分别加入1、5、10、20、50、100ug/ml的MTCS(M177)进行培养。培养48小时后每孔加入25ulMTT(购自Sigma)(5mg/ml)终止反应，继续培养2小时后每孔加入裂解缓冲液以裂解细胞。37℃放置过夜，用分光光度计测定培养板各孔A570值。经计算MTCS(M177)对K562的LC50＜30ug/ml。对正常人外周血淋巴细胞对MTCS(M177)不敏感，因为在MTCS(M177)的浓度高达1000ug/ml条件下，测不出LC50值。
实施例19
MTCS(M203)对K562细胞的毒性
用实施例18相同方法测定MTCS(M203)对人慢性髓细胞型白血病K562细胞和正常人淋巴细胞的毒性。经计算MTCS(M203)对K562的LC50＜30ug/ml。正常人外周血淋巴细胞不敏感，因为在MTCS(M203)的浓度高达1000ug/ml条件下，测不出LC50值。
实施例20
MTCS(M236)对K562细胞的毒性
用实施例18相同方法测定MTCS(M236)对人慢性髓细胞型白血病K562细胞和正常人淋巴细胞的毒性。经计算MTCS(M236)对K562的LC50＜30ug/ml。正常人外周血淋巴细胞不敏感，因为在MTCS(M236)的浓度高达1000ug/ml条件下，测不出LC50值。
实施例21
MTCS(M177，203)对K562细胞的毒性
用实施例18相同方法测定MTCS(M177，203)对人慢性髓细胞型白血病K562细胞和正常人淋巴细胞的毒性。经计算MTCS(M177，203)对K562的LC50＜30ug/ml。正常人外周血淋巴细胞不敏感，因为在MTCS(M177，203)的浓度高达1000ug/ml条件下，测不出LC50值。
实施例22
MTCS(M177，203，236)对K562细胞的毒性
用实施例18相同方法测定MTCS(M177，203，236)对人慢性髓细胞型白血病K562细胞和正常人淋巴细胞的毒性。经计算MTCS(M177，203，236)对K562的LC50＜30ug/ml。正常人外周血淋巴细胞不敏感，因为在MTCS(M177，203，236)的浓度高达1000ug/ml条件下，测不出LC50值。
                          序列表
<110>  北京翔天牧生物科技有限公司
       柯一保
       聂慧玲
<120>  天花粉蛋白突变体
<130>  US0158
<150>  CN 00119553.0
<151>  2000-08-02
<150>  CN 01103102.6
<151>  2001-01-18
<160>  7
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  289
<212>  PRT
<213>  栝楼
<400>  1
Met Ile Arg Phe Leu Val Leu Ser Leu Leu Ile Leu Thr Leu Phe Leu
1               5                   10                  15
Thr Thr Pro Ala Val Glu Gly Asp Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Ala
            20                  25                  30
Thr Ser Ser Ser Tyr Gly Val Phe Ile Ser Asn Leu Arg Lys Ala Leu
        35                  40                  45
Pro Asn Glu Arg Lys Leu Tyr Asp Ile Pro Leu Leu Arg Ser Ser Leu
    50                  55                  60
Pro Gly Ser Gln Arg Tyr Ala Leu Ile His Leu Thr Asn Tyr Ala Asp
65                  70                  75                  80
Glu Thr Ile Ser Val Ala Ile Asp Val Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly
                85                  90                  95
Tyr Arg Ala Gly Asp Thr Ser Tyr Phe Phe Asn Glu Ala Ser Ala Thr
            100                 105                 110
Glu Ala Ala Lys Tyr Val Phe Lys Asp Ala Met Arg Lys Val Thr Leu
        115                 120                 125
Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu Arg Leu Gln Thr Ala Ala Gly Lys Ile
    130                 135                 140
Arg Glu Asn Ile Pro Leu Gly Leu Pro Ala Leu Asp Ser Ala Ile Thr
145                 150                 155                 160
Thr Leu Phe Tyr Tyr Asn Ala Asn Ser Ala Ala Ser Ala Leu Met Val
                165                 170                 175
Leu Ile Gln Ser Thr Ser Glu Ala Ala Arg Tyr Lys Phe Ile Glu Gln
            180                 185                 190
Gln Ile Gly Lys Arg Val Asp Lys Thr Phe Leu Pro Ser Leu Ala Ile
        195                 200                 205
Ile Ser Leu Glu Asn Ser Trp Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile Gln Ile
    210                 215                 220
Ala Ser Thr Asn Asn Gly Gln Phe Glu Ser Pro Val Val Leu Ile Asn
225                 230                 235                 240
Ala Gln Asn Gln Arg Val Thr Ile Thr Asn Val Asp Ala Gly Val Val
                245                 250                 255
Thr Ser Asn Ile Ala Leu Leu Leu Asn Arg Asn Asn Met Ala Ala Met
            260                 265                 270
Asp Asp Asp Val Pro Met Thr Gln Ser Phe Gly Cys Gly Ser Tyr Ala
        275                 280                 285
Leu
<210>  2
<211>  870
<212>  DNA
<213>  栝楼
<400>  2
atgatcagat tcttagacct ctctttgcta attctcaccc tcttcctaac aactcctgct     60
gtggagggcg atgttagctt ccgtttatca ggtgcaacaa gcagttccta tggagttttc    120
atttcaaatc tgagaaaagc tcttccaaat gaaaggaaac tgtacgatat ccctctgtta    180
cgttccagtc ttccaggttc tcaacgctac gcattgatcc atctcacaaa ttacgccgat    240
gaaaccattt cagtggccat agacgtaacg aacgtctata ttatgggata tcgcgctggc    300
gatacatcct attttttcaa cgaggcttct gcaacagaag ctgcaaaata tgtattcaaa    360
gacgctatgc gaaaagttac gcttccatat tctggcaatt acgaaaggct tcaaactgct    420
gcaggcaaaa taagggaaaa tattccgctt ggactccctg ctttggacag tgccattacc    480
actttgtttt actacaacgc caattctgct gcgtcggcac ttattgtact cattcagtcg    540
acgtctgagg ctgcgaggta taaatttatt gagcaacaaa ttgggaagcg tgttgacaaa    600
accttcctac caagtttagc aattataagt ttggaaaata gttggtctgc tctctccaag    660
caaattcaga tagcgagtac taataatgga cagtttgaaa gtcctgttgt gcttataaat    720
gctcaaaacc aacgagtcac gataaccaat gttgatgctg gagttgtaac ctccaacatc    780
gcgttgctgc tgaatagaaa caatatggca gccatggatg acgatgttcc tatgacacag    840
agctttggat gtggaagtta tgctatttag                                     870
<210>  3
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物
<400>  3
gtgcaggcca tggatgttag g                                           21
<210>  4
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物
<400>  4
aacaatatgg cataggatcc catggatgac                                  30
<210>  5
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物
<400>  5
aagcgtgttg acgaaacctt cctacca                                     27
<210>  6
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物
<400>  6
attcagatag cgggtactaa taatgga                                     27
<210>  7
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  引物
<400>  7
gttgtaacct ccggcatcgc gttgctg                                     27

Claims (21)

1.一种低免疫原性的天花粉蛋白突变体，其含有天然天花粉蛋白的氨基酸序列，且在以下三个区域有至少一个氨基酸残基的修饰：氨基酸残基第174位到180位，203位到226位，和230位到244位。
2.根据权利要求1的蛋白突变体，其中所述修饰是选自缺失、插入、添加、置换，和化学修饰。
3.根据权利要求2的蛋白突变体，其中所述置换选自用疏水性氨基酸残基置换亲水性氨基酸残基、用亲水性氨基酸残基置换疏水性氨基酸残基、用碱性氨基酸残基置换酸性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基置换碱性氨基酸残基。
4.根据权利要求1的蛋白突变体，其中所述修饰能引起被修饰氨基酸位点的电荷改变。
5.根据权利要求1的蛋白突变体，其中选自174位精氨酸、177位赖氨酸、222位精氨酸、和243位精氨酸的至少一个氨基酸残基被相互独立地用谷氨酸、门冬氨酸或甘氨酸置换。
6.根据权利要求1的蛋白突变体，其中选自176位门冬氨酸、205位门冬酰胺、206位门冬酰胺、208位谷氨酰胺、210位谷氨酸、217位门冬酰胺、219位谷氨酰胺、220位门冬酰胺、221位谷氨酰胺、236位门冬酰胺、242位门冬酰胺和244位门冬酰胺的至少一个氨基酸残基被相互独立地用赖氨酸或甘氨酸置换。
7.根据权利要求1的蛋白突变体，其中选自178位苏氨酸、203位丝氨酸、204位苏氨酸、211位丝氨酸、224位苏氨酸、226位苏氨酸、234位苏氨酸，和235位丝氨酸的至少一个氨基酸残基被相互独立地用甘氨酸或丙氨酸置换。
8.根据权利要求1的蛋白突变体，其中选自175位缬氨酸、179位苯丙氨酸、180位亮氨酸、207位甘氨酸、209位苯丙氨酸、212位脯氨酸、213位缬氨酸、214位缬氨酸、215位缬氨酸、223位缬氨酸、216位异亮氨酸、225位异亮氨酸、218位丙氨酸、230位丙氨酸、238位丙氨酸、231位甘氨酸、232位缬氨酸、233位缬氨酸、237位异亮氨酸、239位亮氨酸、240位亮氨酸和241位亮氨酸的至少一个氨基酸残基被相互独立地缺失。
9.根据权利要求1的蛋白突变体，其中所述三个区域的二个或三个中的每一个区域中至少一个氨基酸残基被修饰。
10.根据权利要求9的蛋白突变体，其中177位赖氨酸被谷氨酸置换，且203位丝氨酸被甘氨酸置换。
11.根据权利要求9的蛋白突变体，其中177位赖氨酸被谷氨酸置换，203位丝氨酸被甘氨酸置换，且236位谷氨酰胺被甘氨酸置换。
12.编码权利要求1至11之任一项的蛋白突变体的核酸。
13.包含根据权利要求12的核酸的载体。
14.用根据权利要求12的核酸或根据权利要求13的载体转化的宿主细胞。
15.一种制备权利要求1至11之任一项的蛋白突变体的方法，包括在有利于所述蛋白突变体表达的条件下培养根据权利要求14的宿主细胞，并从培养物中回收所述蛋白突变体。
16.包含权利要求1至11之任一项的蛋白突变体和制药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
17.作为药物的根据权利要求1至11之任一项的蛋白突变体。
18.权利要求1至11之任一项的蛋白突变体在制备治疗病毒性疾病、治疗肿瘤、引产和/或治疗宫外孕的药物中的应用。
19.根据权利要求18的应用，其中所述药物为用于引产的药物。
20.根据权利要求18的应用，其中所述药物为用于治疗艾滋病的药物。
21.根据权利要求18的应用，其中所述药物为用于治疗白血病的药物。
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