JP2004505635A - 変異天花粉蛋白 - Google Patents
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Abstract
本発明は変異天花粉（ＭＴＣＳ）蛋白およびその製造法に関する。本発明の生成物は天然の天花粉（ＴＣＳ）に比べて抗原性が著しく減弱されているが、天然のＴＣＳの生物活性、例えば抗腫瘍、抗ウィルス、人工流産、リボソーム−不活化蛋白活性、を保持している。本発明のＭＴＣＳは、癌、ＡＩＤＳ、子宮外妊娠、中期の流産誘発などの治療のために、高い有効性および低い毒性をもつ治療剤として有用である。低い抗原性はＭＴＣＳの安全な多回注射投与を可能にする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は変異天花粉（ＭＴＣＳ）蛋白、その製造法及びその使用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
天花粉（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ：ＴＣＳ）は、最初は、漢方生薬である▲かつ▼楼（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ Ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ Ｍａｘｉｍｏｗｉｃｚ）と呼ばれる植物の根茎部から抽出されたものであり、２０００年以前より書物に記載され、臨床的に使用されている漢方薬、ティアン フア フェン（Ｔｉａｎ Ｈｕａ Ｆｅｎ）の活性成分として同定されている。
【０００３】
化学的に、ＴＣＳは分子量が２７ｋＤａでタイプ１のリボソーム−不活化蛋白（ＲＩＰ）である。これは真核細胞のリボソームの６０Ｓサブユニットを不活性化するＲＮＡ−Ｎ−グリコシダーゼ活性を有している（Ｚｈａｎｇ ＪＳ，Ｌｉｕ ＷＹ， Ｔｈｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ ｏｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ ＲＮＡ Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０ （６）：１２７１−１２７５， １９９２）。天然のＴＣＳは２４７個のアミノ酸残基によって構成されている。その一次構造が図１に示されている（Ｎｉｅ ＨＬ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ Ｇｅｎｅ， Ｔｈｅ ４ｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｇｅｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｈａｉｋｏｕ， Ａ−２３， １９９１）。
【０００４】
ＴＣＳは、１９７０年代から中国において、妊娠中期における流産の誘発や絨毛性臓器の疾患、例えば、胞状奇胎の治療に、臨床で使用されている（Ｓｅｃｏｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒｏｕｐ ｏｆ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ，１９：８１１−８３０，１９７６）。
【０００５】
１９８９年、ＴＣＳがＨＩＶに感染した人のＴリンパ細胞と貪食細胞の両細胞中でＨＩＶ−１の複製を抑制を示したとの実験室的な報告がなされると（Ｍｃｇｒａｔｈ ＭＳ， Ｈｗａｎｇ ＫＭ， Ｃａｌｄｗｅｌｌ ＳＥ， ｅｔ ａｌ．， ＧＬＱ２２３：Ａｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｃｕｔｅｌｙ ａｎｄ Ｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙ Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｐｈａｇｏｃｙｔｅ Ｌｉｎｅａｇｅ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８６： ２８４４−２８４８，１９８９）、すぐにエイズの治療可能性についてＴＣＳの臨床試験が行われた。ＨＩＶに加え、ＴＣＳは他の型のウィルスを攻撃できるものである。
【０００６】
また、白血病細胞や他の癌細胞に対する毒性も発見された（ＫｏｎｇＭ，Ｋｅ ＹＢ，Ｚｈｏｕ ＭＹ， ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｐｐｏｔｏｓｉｓ ｏｆ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｋ５６２ Ｃｅｌｌｓ，Ａｃｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉａｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ Ｓｉｎｉｃａ，３１ （３）：２３３−２４３ １９９８； Ｚｈｅｎｇ ＹＴ，Ｚｈａｎｇ ＫＬ，Ｂｅｎ ＫＬ，ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ Ａｇａｉｎｓｔ Ｈｕｍａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ−ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｃｅｌｌｓ， Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，１７ （１） ： ６９−７９， １９９５；Ｗｕ ＹＸ， Ｘｉａｎｇ ＤＮ， Ｚｈａｎｇ ＳＰ，ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｔｏｘｉｃ Ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｔｏｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ Ａｇａｉｎｓｔ Ｓｔｏｍａｃｈ ａｎｄ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ， １３（３）：２６３−２６６，１９９３）。
【０００７】
しかし、臨床上の使用において、この薬剤による重篤な合併症が観察された。これは稀に、イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体を介する即時型アレルギー反応を引き起こす。ＴＣＳ特異的ＩｇＥが体内でＴＣＳと反応することによるＩ型の過敏症の攻撃の開始は、アレルギー性蕁麻疹、血管神経性水腫、およびアナフィラキシーショック−急性の、重篤な生命にかかわるアレルギー反応で、数分で死亡する−のような合併症として臨床的に現れた。このＴＣＳに対する免疫応答不全は一般に多年の間患者の体内に強陽性として残る。
【０００８】
そのために、妊娠中絶薬としては一生で一回しか使えないというふうに規制されている。妊娠中絶だけでなく、他の疾患の治療にＴＣＳを用いた時にもアレルギー反応が見られた。従って、その適用は、強く制限されていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、安全に何度も投与できるような抗原性が少ない新しい天花粉蛋白製品の開発することによって、ＴＣＳの副作用を除去することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は天然の天花粉（ＴＣＳ）のアミノ酸配列の３つの領域：１７４−１８０、２０３−２２６および２３０−２４４のアミノ酸残基：の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変した、抗原性の低い変異天花粉（ＭＴＣＳ）蛋白または、該改変および天然のＴＣＳの生物活性を実質的に保持しているＭＴＣＳ蛋白の断片もしくは誘導体を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、本発明のＭＴＣＳをコードする核酸も提供する。
本発明はさらに、本発明の核酸を含むベクター、特に発現ベクターおよび本発明の核酸または本発明のベクターによって形質変換された宿主細胞に関する。
【００１２】
本発明はさらに、本発明の宿主細胞をＭＴＣＳを発現させるための好ましい条件下で培養し、その培養物からＭＴＣＳを回収することからなる、本発明のＭＴＣＳの製造方法にも関する。
【００１３】
本発明はさらに、本発明のＭＴＣＳおよび薬物学的に許容される担体もしくは賦形剤からなる、医薬組成物に関する。
本発明はさらに、医薬としての本発明のＭＴＣＳにも関する。
本発明はさらに、ウイルス性疾患の治療、癌の治療、子宮外妊娠の治療および／または流産の誘発のための医薬を製造するための本願発明のＭＴＣＳの使用にも関する。
【００１４】
最後に、本発明は、哺乳類に本発明のＭＴＣＳの治療的有効量を投与することからなる、哺乳類の流産の誘発、子宮外妊娠の治療、ウイルス性疾患の治療および／または癌の治療のための方法に関する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明者らは鋭意研究の後、ＴＣＳの免疫活性に関する領域は構造的に１７４−１８０位、２０３−２０６および２３０−２４４位間のアミノ酸の残基にあることを見出した。これらの３領域中の少なくとも一つのアミノ酸の残基の改変は、優れた性質を持つ新規なＭＴＣＳを製造することができる。
【００１６】
ＴＣＳの生物学的活性はＭＴＣＳ中に実質的に保持されているにもかかわらず、ＴＣＳの抗原性はＭＴＣＳ中では著しく低下している。
本願発明のＭＴＣＳは、少なくともリボソーム不活性化蛋白（ＲＩＰ）活性およびおよび人工流産活性を保持しており、好ましくは抗癌、抗ウイルス活性などの全ての活性を保持している。
【００１７】
従って、本発明は、ＴＣＳのアミノ酸残基の３領域：１７４―１８０位、２０３―２２６位と２３０―２４４位：の少なくとも１つのアミノ酸の残基が改変された低抗原性のＴＣＳを提供するものである。
【００１８】
本願の明細書および特許請求の範囲中でのアミノ酸の残基の位置に関する番号は、図１で示されている番号を参照している。
【００１９】
本発明のＭＴＣＳは、本発明で定義されたアミノ酸残基の少なくとも一つの改変を含有する全長の成熟蛋白または断片もしくは誘導体であってもよい。
【００２０】
本願で用いられている、アミノ酸残基の「改変」とは、アミノ酸の残基の欠失、挿入、付加、置換または化学的改変のことを言う。
【００２１】
好ましい態様では、アミノ酸残基の改変が、改変されたアミノ酸部位の電荷の変化を引き起こす。
【００２２】
「置換」という語は好ましくは、親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸で置換、疎水性アミノ酸を親水性アミノ酸で置換、酸性アミノ酸を塩基性アミノ酸で置換および塩基性アミノ酸を酸性アミノ酸で置換することを言う。
【００２３】
ここで用いる「親水性アミノ酸」と言う語は、特にセリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）およびヒスチジン（Ｈｉｓ）を指す。これらの親水性アミノ酸のうちで、Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎが酸性アミノ酸、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓが塩基性性のアミノ酸である。
【００２４】
「疎水性アミノ酸」と言う語は、特にグリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｙ）およびメチオニン（Ｍｅｔ）を指す。
【００２５】
本発明の好ましい態様においては、ＭＴＣＳの領域１７４―１８０位が、表１から選ばれる少なくとも１個以上のアミノ酸残基の改変を含有している。
【００２６】
【表１】
【００２７】
本発明の他の好ましい態様においては、ＭＴＣＳの領域２０３−２２６位が、表２から選ばれる少なくとも１個以上のアミノ酸残基の改変を含有している。
【００２８】
【表２】
【００２９】
本発明の他の好ましい態様においては、ＭＴＣＳの領域２３０−２４４位が、表３から選ばれる少なくとも１個以上のアミノ酸残基の改変を含有している。
【００３０】
【表３】
【００３１】
好ましくは、本発明のＭＴＣＳは上述の三つの領域、１７４−１８０、２０３−２２６および２３０−２４４でアミノ酸残基の改変を含有している。さらに好ましい態様においては、それぞれの領域における改変は、表１、表２および表３からそれぞれ選択される。
【００３２】
好ましい態様において、本発明のＭＴＣＳは、下記の両方のアミノ酸残基改変を有する：１７７位のＬｙｓをＧＬＵで、２０３位のＳｅｒをＧｌｙで置換。
さらに好ましい態様において、本発明のＭＴＣＳは、下記の３つのアミノ酸残基改変を有する：１７７位のＬｙｓをＧｌｕで、２０３位のＳｅｒをＧｌｙで、２３６位のＡｓｎをＧｌｙで置換。
【００３３】
本発明は、さらに本願発明のＭＴＣＳをコードする核酸に関する。
【００３４】
本発明のＭＴＣＳは、共に当業者にとってはよく知られた、遺伝子工学方法またはペプチド合成法、例えば固相ペプチド合成法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｊ．Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５： ２１４９−２１５４． １９６３）によって製造できる。好ましくは、ＭＴＣＳは天然ＴＣＳの遺伝子を改変し、次いで適切な生物学的宿主中で改変した遺伝子を発現させて製造される。
【００３５】
ＭＴＣＳをコードする本発明の核酸は、適当なベクター、特にプラスミドベクターｐＥＴ−２ｄまたはｐＥＴ−３ａのようなプラスミドベクター中でクローン化することができる。
【００３６】
本発明の核酸あるいはその核酸を含有するベクターは、適切な宿主細胞、例えば大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ．）を形質転換するために用いることができる。得られた形質転換された宿主細胞は、本発明のＭＴＣＳを生産するために培養することができる。本発明は、こような宿主細胞にも関する。
【００３７】
したがって、本発明は、本発明の宿主細胞をＭＴＣＳの発現のための好ましい条件下で培養し、培養物からＭＴＣＳを回収することからなる本発明のＭＴＣＳの製造法にも関する。
【００３８】
天然のＴＣＳの遺伝子の配列はＡＴＧ（開始コドン）からＴＡＧ（終始コドン）までの８７０の塩基対からなっている。当業者にとっては、その遺伝子はその配列に関する公表された情報に基き、下記の標準方法、例えば、染色体ＤＮＡライブラリー（Ｃｈｏｗ ＴＰ， Ｆｅｌｄｍａｎ ＲＡ， Ｌｏｖｅｔｔ Ｍ， Ｐｉａｔａｋ Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ Ｇｅｎｅ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ａｌｐｈａ−ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ， ａ Ｔｙｐｅ Ｉ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５（１５）： ８６７０−８６７４， １９９０） またはｃＤＮＡライブラリー（Ｓｈａｗ ＰＣ， Ｙｕｎｇ ＭＨ， Ｚｈｕ ＲＨ， Ｈｏ ＷＫ， Ｎｇ ＴＢ， Ｙｅｕｎｇ ＨＷ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ ｃＤＮＡ ａｎｄ ｉｔｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ， Ｇｅｎｅ， ９７（２）： ２６７−７２， １９９１）からの分離による方法、あるいはＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を用いる方法（Ｎｉｅ ＨＬ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ Ｇｅｎｅ， Ｔｈｅ ４ｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｇｅｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｈａｉｋｏｕ， Ａ−２３， １９９１）、あるいは化学的合成する方法によって得ることができる。
【００３９】
この遺伝子は２８９個のアミノ酸より構成されるプレプロ−蛋白をコードする。２４７個のアミノ酸の残基を有する成熟した天然のＴＣＳに加え、このプレプロ−蛋白は、Ｎ−末端に２３個のシグナルペプチドおよびＣ−末端に１９個の末端ペプチドを有している。
【００４０】
ＴＣＳのプレプロ−蛋白をコードするｃＤＮＡは、先に発表された方法を用いて都合よくクローン化できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｄｉｔｉｏｎ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８２）。このｃＤＮＡを含有するプラスミドも直接用いることもできる。
【００４１】
天然のＴＣＳの遺伝子は、当業者によく知られている位置特異的突然変異処理を利用して、改変することができる。本発明の１態様において、この改変は次のとおりである。
【００４２】
ａ）必要に応じ、成熟天然ＴＣＳをコードするＤＮＡ配列の５’末端の前で、３’末端の後の適切な制限酵素位置を構築し、開始コドンと終止コドンをそれぞれ導入する。例えば、成熟天然ＴＣＳをコードするＤＮＡ配列の５’末端の前の制限酵ＮｃｏＩ位置（ＣＣＡＴＧＧ）を開始コドンＡＴＧを導入し、成熟天然ＴＣＳの１位にＭｅｔを付加するように構築するか、制限酵素ＮｄｅＩ位置（ＣＡＴＡＴＧ）を、成熟天然ＴＣＳの１位をＡｓｐからＭｅｔにアミノ酸残基を置換するように構築できる。成熟天然ＴＣＳをコードするＤＮＡ配列の３’末端の後に、制限酵素ＢａｍＨＩ位置（ＧＧＡＴＣＣ）を、終止コドンを導入するようにに構築することができる；そして
【００４３】
ｂ）本願発明のＭＴＣＳの遺伝子を得るために、変異させるアミノ酸配列（１７４−１８０、２０３−２２６および２３０−２４０領域のアミノ酸残基）をコードするＤＮＡ配列を改変する。コドンの縮重により、１個のアミノ酸を改変するために複数の遺伝突然変異方法を用いることができる。市販のキット、例えばバイオ−ラード社のＭｕｔａ−Ｇｅｎｅ Ｐｈａｇｅｍｉｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ は特定のＤＮＡ部位の突然変異を行うのによくデザインされている。手順は製造会社の取扱説明書に従うことができる。
【００４４】
位置特異的突然変異誘発によって得られたＭＴＣＳをコードするＤＮＡ配列は、適当な制限酵素、例えばＮｃｏＩ（またはＮｄｅＩ）およびＢａｍＨＩで消化し、次いで発現ベクター、例えばプラスミドベクターｐＥＴ−２ｄ（またはｐＥＴ−３ａ）にクローンする。得られた突然変異発現ベクターは、標準操作に従って、適当な宿主細胞、例えばＥ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐＬｙｓＳ）の形質転換に用いることができる。この形質転換体は次いで適当な培地中で培養される。誘導剤、例えばイソプロピル−ベータ−Ｄ−チオ−ガラクロシド（ＩＰＴＧ）を必要に応じ、ＭＴＣＳの発現を誘導するために、培地中に適当な時間に加えることができ、このＭＴＣＳは次いで、宿主細胞の溶解、溶解物の遠心分離そしてカラムクロマトグラフィーなどで精製することを含む通常の方法で培地から採取することができる。
【００４５】
ＭＴＣＳの活性に関する実験
本発明のＭＴＣＳの免疫反応性および生物活性の確認試験をその結果とともに以下に記す。
【００４６】
１．欠失ＴＣＳ変異蛋白および改変ＴＣＳ変異蛋白の性質
一次構造と生物学的活性および免疫学的反応性との関係を調べるために、表１から表３に示した変異に従って、ＴＣＳの分子を遺伝子的に改変した。遺伝子はＣ末端の配列の欠失（欠失変異体）または複数のアミノ酸配列の改変（改変変異体）させたＴＣＳをコードして得られた。変異蛋白は大腸菌を発現し、ついでこれを純化して、欠失変異体および改変変異体の何れかに対応して得られた。
【００４７】
ＴＣＳおよびその変異体は、リボソームを不活性化し、細胞蛋白合成を阻害するＲＮＡ Ｎ−グリコシダ−ゼ活性を有する。生物学活性および免疫学的反応性は、これらの欠失変異体および改変変異体について測定を行った。
ＴＣＳの活性断片に対する構造的基盤は、ＴＣＳの三次元構造から得られる情報とともに、これらの測定結果によって解析することができる。
【００４８】
ＲＩＰ活性はＰｅｌｈｅｍ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎの記載によって決定した （Ｈ． Ｋ． Ｂ． Ｐｅｌｈｅｍ ａｎｄ Ｒ． Ｊ． Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６７： ２４７−２５６． １９７６）。人工流産活性の測定は下記に示す本発明者らの研究室の標準手順に従って行った （Ｎｉｅ ＨＬ， Ｃａｉ ＸＦ ｅｔ ａｌ．， Ｐｏｓｉｔｉｏｎ １２０−１２３， ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｃｔｉｖｅ Ｓｉｔｅ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ６２ （６）： ４９１−５００， １９９８）。試験管内（ ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における免疫学的反応性は、競争的エライザ（ＥＬＩＳＡ）法（ＸＨ Ｈｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｙｓｉｎｅ ａｎｄ Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ ｏｎ ｉｔｓ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｉｙ ｗｉｔｈ ＩｇＥ， Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ， ２６： ６５７−６６２， １９９４）で測定した。結果は表４に示した。
【００４９】
【表４】
【００５０】
欠失ＴＣＳ変異体および改変ＴＣＳ変異体の性質に関する上記測定の結果は下記のことを示す。
欠失ＴＣＳ変異体においては、Ｃ末端から３個のアミノ酸残基を欠失した場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）とＩｇＥの反応性は天然のＴＣＳと同様に強陽性である。アミノ酸の残基を５個まで欠失させると、免疫反応性が減少するが、ＲＩＰ活性と人工流産活性に影響は認められない。２９個を越えてアミノ酸を失乏させた場合、生物学活性が減少する。
【００５１】
ＴＣＳの生物活性中心は１１０−１７４位の間にあることが、本発明者らによって報告されている（Ｋｅ ＹＢ， Ｃｈｅｎ ＪＫ， Ｎｉｅ ＨＬ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ６０ （７）： ４６５−４７２， １９９７）。Ｃ末端配列の欠失による三次元構造の変化もまたこの活性中心に対して影響する。アミノ酸残基の欠乏が活性の中心に近いほど、生物活性に対する影響が一層大きくなる。免疫反応性の部分は生物活性の中心より、Ｃ末端に近いことが発見された。従って、Ｃ末端配列の欠失によってさらに容易に影響される。
【００５２】
表４の改変変異体Ｍ７ＴＣＳ（１−２４７）［１７４−１８０位の間のアミノ酸酸残基の一つを変異させた］、Ｍ２４ＴＣＳ（１−２４７）［２０３−２２６位の間のアミノ酸酸残基の一つを変異させた］およびＭ１５ＴＣＳ（１−２４７）［２３０−２４４位の間のアミノ酸酸残基の一つを変異させた］は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける弱いＩｇＧとＩｇＥの反応性、およびＲＩＰと人工流産活性を含むある程度の生物活性を示した。この結果はこの改変した三つのアミノ酸配列（１８０−１７４、２２６−２０３、２４４−２３０位）は免疫反応性に関連することを示している。これらの領域のどのような構造変化も免疫反応性の減弱を引き起こす。
【００５３】
これらの構造変化は、少なくとも１個のアミノ酸残基の除去；二つの隣接したアミノ酸残基の間の少なくとも１個のアミノ酸残基の挿入；これらの配列に少なくとも１個のアミノ酸残基を付加；少なくとも１個の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基で置換；一個以上の疎水性アミノ酸残基を親水性アミノ酸残基で置換； 一個以上の酸性アミノ酸残基を塩基性アミノ酸残基で置換；一個以上の塩基性アミノ酸残基が酸性アミノ酸残基で置換；一個以上のアミノ酸残基の化学物質でのカップリング；および／またはこの改変がなされたアミノ酸側の電荷を変化させることができる少なくとも一個のアミノ酸の残基の挿入を含むいかなる改変を含む。
【００５４】
改変変異体Ｍ３１ＴＣＳ（１−２４７）［１７４から１８０位の間の１個のアミノ酸残基および２０３から２２６位の間の１個のアミノ酸残基が変異されている］とＭ４６ＴＣＳ（１−２４７）［１７４から１８０位の間の１個のアミノ酸残基、２０３から２２６位の間の１個のアミノ酸残基および２３０から２４４位の間の１個のアミノ酸残基が変異されている］は、ネガティブの免疫反応性および元来のＲＩＰおよび人工流産活性を含む生物活性を示しいる。これらの二つは優れた性質を有する改変体である。天然のＴＣＳの抗原性が大きく減弱されている。しかしながら、天然のＴＣＳの生物活性は保持されている。Ｍ４６ＴＣＳ（１−２４７）の抗原性は、Ｍ３１ＴＣＳ（１−２４７）に比較するとやや弱い。
【００５５】
２．本発明のＭＴＣＳの性質
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＩＰの活性試験、妊娠中期のマウスの人工流産についての試験、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＩｇＧおよびＩｇＥの反応性試験を、先に述べた手順に従い、本発明のＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）（１７７位のＬｙｓをＧｌｕで置換および２０３位のＳｅｒをＧｌｙで置換）について行った。培養癌細胞に対する毒性試験は本発明者らの実験室での次の標準手順に従って行った（Ｋｏｎｇ Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｋ５６２ Ｃｅｌｌｓ， Ａｃｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉａｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ Ｓｉｎｉｃａ， ３１ （３）： ２３３−２４３， １９９８）。
【００５６】
ａ）ＭＴＣＳと天然のＴＣＳの免疫反応性および生物学的活性の比較を表５に示す。
【００５７】
【表５】
【００５８】
ｂ）異なったセルラインに対するＭＴＣＳの毒性を表６に示す。
【００５９】
【表６】
【００６０】
ＭＴＣＳの白血病セルラインＫ５６２、ＨＬ６０、ＭＬＴ、Ｕ９３７および絨毛性癌セルラインＪａｒに対する平均致死量（ＬＣ５０）は３０ｕｇ／ｍｌより少ない。ＬＣ５０≦５０のセルラインを最高感作セルラインとする。ＭＴＣＳのＬＣ５０が３０ｕｇ／ｍｌ以上の癌細胞セルラインＢ１６、Ａ４３１、Ｂ７−３２５、ＳＰＣＡ１および７４０４等を中等度感作セルラインとする。ＭＴＣＳのＬＣ５０が１０００ｕｇ／ｍｌ以上の正常体細胞セルラインすなわち、ＨＭＰＬＣおよびＷｉｓｈ（羊膜の細胞）を非感作セルラインとする。このデータは、ある範囲の濃度では、ＭＴＣＳは白血病細胞および他のタイプの癌細胞に対して強い毒となるが、正常細胞は無傷のままであることを明確に示している。この結果は先のＴＣＳに対する同様な研究と一致している。
【００６１】
ｃ）動物モデル実験
ｃ−ｉ）抗腫瘍活性
８週令のヌードマウスにヒト慢性骨髄性白血病細胞Ｋ５６２の１×１０７細胞を皮下に接種する。接種１０日後に５０％の動物で生体内で接種細胞が発育して、肉眼で観察できる固形癌を形成する。異種の癌を移植された動物を無作為に４群に分ける。３群の動物には異なった用量のＭＴＣＳを注射投与する。他の群には、コントロールとして生理食塩水を与える。治療群に投与するＭＴＣＳの投与量は人工流産有効量より少ないか同量であり、３群それぞれに１５ｎｍ／Ｋｇ、４５ｎｍ／Ｋｇおよび７５ｎｍ／Ｋｇである。ＭＴＣＳは毎４日間に１回合計４回投与する。異なった腫瘍抑制の値、それぞれで（４０±３）％、（７１±２）％および（９２±４）％の抑制比が３投与群で観察された。
【００６２】
ＴおよびＢリンパ球を欠如しているＳＣＩＤ（ｓｅｖｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）マウスを、Ｋ５６２細胞に対するＭＴＣＳの毒性を検討するために選択する。９週齢のＳＣＩＤマウスにＫ５６２細胞１×１０７個を皮下接種する。接種された動物の１００％が固形癌を発生する。接種５日後に、動物を無作為に４群に分ける。それらの３群が投与群である。その他が生理食塩水のコントロール群である。異なった投与群の動物に、それぞれ高用量、中用量および低用量の異なった用量でＭＴＣＳを投与する。高用量群は１５０ｎｍ／Ｋｇを１回投与；中用量群は７５ｎｍ／Ｋｇを２回（週１回）投与；低用量群は３７ｎｍ／Ｋｇを３回（４日毎に投与）投与。全ての群で合計投与量は１５０ｎｍ／Ｋｇである。腫瘍の抑制比は高、中および低用量群でそれぞれ（４３±６）％、（６４±８）％および（９４±３）％である。
【００６３】
両実験動物の結果の結論は、人工流産の有効量で、ＭＴＣＳは明らかな腫瘍抑制効果を有するということである。上記９０％の腫瘍抑制比は、人工流産有効量の半量を４回投与することによって得ることができる。少量の多回投与は優れた結果をもたらす。
【００６４】
ＭＴＣＳは、ヒト慢性骨髄性白血病細胞を異種移植された動物モデルの上記の両実験において、優れた抗腫瘍効果を示す。これらの動物モデルに基いて、他の異種移植ＳＣＩＤ−ヒト慢性骨髄性白血病モデルを確立する。Ｋ５６２細胞の接種後に液癌がネズミ宿主中に形成され、これはネズミ宿主中の白血球の計測および他の血液生化学的変化によって証明される。異種移植されたマウスの３投与群それぞれに、３．７５ｎｍ／Ｋｇ、７．５ｎｍ／Ｋｇおよび１５ｎｍ／Ｋｇの用量でＭＴＣＳを静脈内投与する。３回投与後、計測白血球細胞が正常範囲に戻ったマウスのパーセンテージは、投与３群それぞれで、（２５＋６）％、（７５＋８）％および（９４＋３）％である。このデータは、固形癌の治療においてより、液癌の治療においての方がより少量のＭＴＣＳを用いることができることを示唆している。そして固形癌よりも液癌の方が一層良い結果を達成することができる。
【００６５】
ｃ−ｉｉ） マウスに対する急性毒性試験
マウスに対する急性毒性は下記の標準手順で行った。８週齢のＦｉマウス（ＩＣＲ／Ｂａｌｂ−ｃ）を用いた。それぞれの動物に天然のＴＣＳまたはＭＴＣＳを１回注射投与した。天然のＴＣＳとＭＴＣＳの間の平均致死量（ＬＤ５０）を比較するために、動物を７日間観察した。同用量において、ＭＴＣＳ群の動物に比べて、天然のＴＣＳを注射投与した動物の方が高い死亡率および早い死が観察される。ＬＤ５０（天然のＴＣＳ）＝１８．４ｍｇ／Ｋｇ、ＬＤ５０（ＭＴＣＳ）＝２７．５ｍｇ／Ｋｇ。ＭＴＣＳの急性毒性は天然のＴＣＳのそれよりも約５０％低い。
【００６６】
ｃ−ｉｉｉ）モルモット対する急性アレルギー毒性試験
天然のＴＣＳとＭＴＣＳについて別々にモルモット対する急性アレルギー毒性試験を行う。モルモットは、ヒト人工流産有効量の４．５倍量を皮下投与して感作する。１４日後、動物にヒト人工流産有効量の１０倍量を静脈内投与誘発する。アレルゲン投与後３０分間、アナフィラキシー反応および死亡を観察した。天然のＴＣＳ群の死亡数／全動物数比は１２／１４、約８６％である。ＭＴＣＳ群のこの比は３／１５、約２０％である。有意な差が存在した。ＭＴＣＳは天然のＴＣＳに比べて、モルモットにおける急性アレルギー反応を非常に弱く引き起こす。
【００６７】
ｃ−ｉｖ）ラットに対する受動性皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）
ラットに対するＰＣＡをＯｖａｒｙ の方法 （Ｏｖａｒｙ Ｚ， ｅｔ ａｌ．， ＰＣＡ Ｒｅａｃｔｉｏｎｗ ｗｉｔｈ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｒａｔｓ， Ｉｎｔｅｒ Ａｒｃｈｓ ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎ， ４８： １６−２１， １９７５）で行う。２群のマウスを天然のＴＣＳおよびＭＴＣＳで別々に感作する。１４日後に、天然のＴＣＳおよびＭＴＣＳに対して生成されたマウス抗血清を得る。２群のラットを麻酔し、毛を剃った背部に、天然のＴＣＳおよびＭＴＣＳに対する抗血清をそれぞれ皮内投与し、対応する天然のＴＣＳまたはＭＴＣＳの１％エンバンスブルーを含有する溶液を静脈内投与して誘発する。３０分後、動物を殺して背部の青斑の直径を測定してＰＣＡ反応を判定する。青斑が０．５ｃｍ以上のものを陽性反応とみなす。天然のＴＣＳ群の動物は全て陽性反応を示す。ＭＴＣＳ群の動物は全て陰性である。天然のＴＣＳによって引き起こされる生体内ＩｇＥ反応はＭＴＣＳの場合には劇的に低減する。
【００６８】
３．ＭＴＣＳの抗腫瘍のメカニズム
ａ） ＭＴＣＳは感作細胞中でアポートシスを誘発する。
先の２ａおよび２ｂで述べたように、ＭＴＣＳは正常な体細胞を傷つけないが、培養白血病細胞に対して高毒性である。Ｋ５６２細胞に対するＭＴＣＳの作用を例として挙げることができるが、多数の研究がそのメカニズムを解明するために行われている。電子顕微鏡下でＫ５６２細胞にＭＴＣＳを作用させると、プログラム細胞死またはアポトーシスした細胞形態の特徴的な変化を観察することができる：細胞体の縮小、細胞質の凝縮、小胞体の膨張、核小体の消失、核染色質の分離した塊への辺縁化、および細胞の幾つかの膜結合体（すなわちアポトーシス体）への崩壊。ＭＴＣＳ処理された細胞はまた、生化学的なアポトーシスの証明であるオリゴヌクレオゾームのＤＮＡラダーおよび蛍光活性化セルソート（ＦＡＣＳ）分析でアポトーシスの二重ピークを示す。この結果はＭＴＣＳがＫ５６２細胞においてアポトーシスの引きがねになることを示している。
【００６９】
ｂ） 感作細胞の細胞膜にはＭＴＣＳの特異的結合部位が存在する。
本研究では、リアルタイムの バイオモレキュラー・インターアクション・アナライシス（ＢＩＡ）を用いる。ＭＴＣＳはマイクロフローセルの壁を形成しているセンサーチップ上のデキストランマトリックスに固定される。次いで、細胞膜抽出物をコントロールフローの表面に注入する。相互作用によるいずれの表面濃度の変化も表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ）信号として検出し、共鳴ユニット（ＲＵ）で表わす。異なったタイプの感作細胞は、ＭＴＣＳが細胞膜蛋白に強力に結合していることを示す１００−３００ＲＵの応答を与える。正常体細胞、例えば羊膜の細胞、を相互作用試験に用いると、意味のある結合はない。
【００７０】
ｃ）共焦点レーザー顕微鏡により、ＭＴＣＳは受容体介在エンドサイトーシスを介してＫ５６２に取り込まれることが観察される。
【００７１】
ｄ）ＧＴＰ−ガンマー３５Ｓ結合試験において、ＭＴＣＳは感作細胞中でＧ−蛋白を介するシグナル伝達を活性化する。このような現象は、非感作細胞中では観察されない。
【００７２】
ｅ）共焦点レーザー顕微鏡により、ＭＴＣＳは感作細胞中で、細胞内貯留カルシウムから、細胞内カルシウム放出を誘発することが観察される。
【００７３】
抗腫瘍メカニズム研究の結論は次のとおりである。感作細胞中に存在する膜レセプターはＭＴＣＳのエンドサイトシスを伝え、次いでＲＩＰ効果を働かせる。一方、ＭＴＣＳも細胞シグナル伝達を妨げる。これらの二つの効果が結びついて感作細胞をアポトーシスに導く。
感作細胞の大部分は腫瘍細胞であるから、腫瘍を阻害すると同時に正常な体組織にも障害を与える細胞障害性または細胞分裂抑制性の化学療法剤に比べて、ＭＴＣＳは腫瘍に対する作用メカニズムがユニークである。これは、新規な抗腫瘍剤としてのＭＴＣＳに臨床適用の理論的根拠を提供する。
【００７４】
上で述べたように、本発明のＭＴＣＳは、天然のＴＣＳの生物学的活性を実質的に保持しているにもかかわらず、天然のＴＣＳに比べて、抗原性が著しく低下している。低抗原性であるので、安全な多回投与用および天然のＴＣＳによって処置できる全ての医療適用において、より好ましい処置をすることができる。より具体的には、これらに制限されるものでないが次の適用を含む。
【００７５】
１．白血病およびその他の固形癌。標的細胞に選択的に取り込まれるメカニズムにより、ＭＴＣＳの低用量のたった数回の投与のみが臨床治療で必要とされる。ＭＴＣＳは腫瘍細胞には高毒性であるが、一定の用量範囲内では、正常の体細胞にはそのままとするので、副作用を非常に少なくしている。
【００７６】
２．ウイルス性疾患および特にエイズ。ＭＴＣＳは、天然のＴＣＳによるエイズの治療に比べて副作用が少ないので患者に対して安全である。
【００７７】
３．子宮外妊娠および中期における流産の誘発。人工妊娠中絶薬として患者の生涯に一度だけの投与に限定されているＴＣＳとは異なり、ＭＴＣＳは低抗原性であるため、安全な多回投与が可能である
【００７８】
本願発明のＭＴＣＳは、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤と共に、医薬組成物中に包含させることができる。従って、本願発明は治療的有効量の本願発明のＭＴＣＳを薬学的に許容される担体もしくは賦形剤と組合わせてなる医薬組成物も提供する。このような薬学的に許容される担体もしくは賦形剤の例としては、これに限定されるものではないが、単独でまたは組合わせて、生理食塩水、水性緩衝溶液、ブドウ糖溶液、水、グリセリンおよびエタノール等が含まれる。このような医薬組成物は選ばれる投与ルートに適合させるべきである。
【００７９】
本願発明はまた、本願発明の医薬組成物の１またはそれ以上の成分を充填した１またはそれ以上の容器よりなる、医薬包装物またはキットを提供する。本願発明のＭＴＣＳおよびその断片または誘導体もまた、さらなる他の治療薬と組合わせて用いることができる。
【００８０】
本願発明の医薬組成物は、ヒトの患者のような哺乳類に種々の投与ルート例えば、経口、局所、静脈内、腸管内、筋肉内、腫瘍内、皮下、鼻内または皮内投与などで投与することができる。この医薬組成物の有効量は、病気や体調の本質に基き、特定の病気や体調の治療または予防おいて使用するのに必要なものである。本願発明のＭＴＣＳの適切な用量は天然のＴＣＳの有効量を参考にして決定することができる。
【００８１】
【実施例】
以下に実施例を示すが、本発明を限定することを意図するものではない。
【００８２】
実 施 例 １
この実施例は、ＴＣＳ遺伝子の部位特異的突然変異誘発および成熟天然ＴＣＳのｃＤＮＡのクローニングを説明する。
当業者にとって、天然ＴＣＳの遺伝子は下記の標準的な方法すなわち、天然ＴＣＳ蛋白をプローブとして用いて▲かつ▼楼のｃＤＮＡライブラリーから単離することにより（Ｓｈａｗ ＰＣ，Ｙｕｎｇ ＭＨ，Ｚｈｕ ＲＨ， Ｈｏ ＷＫ， Ｎｇ ＴＢ， Ｙｅｕｎｇ ＨＷ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ ｃＤＮＡ ａｎｄ ｉｔｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ， Ｇｅｎｅ， ９７（２）：２６７−７２，１９９１）、適切にデザインされたＤＮＡをプローブとして用いて▲かつ▼楼のゲノミックＤＮＡライブラリーから単離することにより（Ｃｈｏｗ ＴＰ， Ｆｅｌｄｍａｎ ＲＡ， Ｌｏｖｅｔｔ Ｍ， Ｐｉａｔａｋ Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ Ｇｅｎｅ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ａｌｐｈａ−ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ， ａ Ｔｙｐｅ Ｉ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５ （１５）： ８６７０−８６７４， １９９０）、または適切にデザインされたプライマーを用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）により（Ｎｉｅ ＨＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ Ｇｅｎｅ， Ｔｈｅ ４ｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｇｅｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｈａｉｋｏｕ， Ａ−２３，１９９９１）容易に得ることができる。
【００８３】
シグナルペプチドおよびテイルペプチドを含有しているＴＣＳプレプロ蛋白のｃＤＮＡ（配列を図１に示す）の部位特異的変異を、変異原プライマーＩおよびＩＩを用い、成熟天然ＴＣＳをコードするＤＮＡ配列の５’末端の前に開始コドンを構築し、３’末端の後に終止コドンを構築する方法で行った。成熟天然ＴＣＳをコードするＤＮＡは次いで、発現ベクターにクローンした。この実験のために二つの変異原プライマーがデザインされた。
【００８４】
プライマーＩ． ５’ＧＴＧ ＣＡＧ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＴＴ
ＡＧＧ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）
プライマーＩＩ．５’ＡＡＣ ＡＡＴ ＡＴＧ ＧＣＡ ＴＡＧ ＧＡＴ ＣＣＣ
ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＡＣ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）
プライマーＩは、開始コドン（ＡＴＧ）を導入し、成熟天然ＴＣＳの１位にメチオニンを付加するために、制限酵素ＮｃｏＩの認識部位（ＧＧＡＴＣＣ）を含有しているという特徴がある。
プライマーＩＩは、成熟天然ＴＣＳをコードするＤＮＡの３’末端の後に終止コドン（ＴＡＧ）を付加するために、制限酵素ＢａｍＨＩの認識部位（ＧＧＡＴＣＣ）を含有しているという特徴がある。
【００８５】
突然変異は、ビオーラッド社の、Ｍｕｔａ−Ｇｅｎｅ Ｐｈａｇｅｍｉｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（カタログ番号 １７０−３５７６）を用いて行った。手順は、製造会社の指示に従った。変異は配列分析で確認した。詳細は製造会社の指示書を参照されたし。
手短にいうと、この方法は下記の工程からなる。
【００８６】
ウラシル含有鋳型ＤＮＡの抽出
ＴＣＳ プレプロ−蛋白をコードする天然遺伝子を、ファージミドベクター ｐＴＺ−１９Ｕにクローンし、鋳型ＤＮＡとしてｐＴＺ−１９Ｕ−ＴＣＳ’を得た（Ｎｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｉｎ Ｇｅｎｅ， Ｔｈｅ ４ｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｇｅｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｈａｉｋｏｕ，Ａ−２３， １９９１）。クロラムフェニコール含有培地中で生育しているＥ．ｃｏｌｉ．ＣＪ２３６をｐＴＺ−１９Ｕ−ＴＣＳ’で形質転換させ、個々のコロニーを採取するために、アンピシリン含有プレートに塗抹した。ファージミド保持バクテリア細胞をアンピシリン含有培地５０ｍｌ中でＯ．Ｄ６００が約０．３になるまで培養した。次いで、ヘルパーファージ Ｍ１３Ｋ０７を１×１０１０ｐｆｕで培地に加え、通気下、３７℃で１時間培養し、更にカナマイシン ３．５ｍｇを加えた。更に、４ないし６時間培養した後、培地を遠心分離して上澄液をＲＮａｓｅ １００ｕｇと混合して再び３０分培養した。この培養混合物を酢酸アンモニウム／ＰＥＧを用いて氷冷下で３０分沈殿させてから、遠心分離した。析出物を高塩緩衝液２００ｕｌ中で再度けん濁させ、氷上で３０分放置し、再び遠心分離した。次いで、上澄液中のウラシル含有鋳型ＤＮＡを、フェノール、フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムで抽出した。最後に、このウラシル含有鋳型ＤＮＡを酢酸アンモニウム／エタノールで−７０℃で再度沈殿させ、７０％エタノールで洗浄して、１０−２０ｕｌのＴＥ緩衝液中で再度けん濁させた。
【００８７】
突然変異原ストランドの合成
上で得られたウラシル含有鋳型ＤＮＡを０．１−０．３ ｐｍｏｌの変異原プライマー、アニーリング緩衝液および水と混合した。この混合物を７０℃に加熱し、次いで４０分間で３０℃まで冷却した。この冷却した混合物を氷浴に入れ、３単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼと１単位のＴ４ ＤＮＡポリメラ−ゼを添加した。この合成混合物を氷上で５分、次いで２５℃で５分、最後に３７℃で９０分培養した。合成反応を停止緩衝液９０ｕｌを加えて終結した。この変異させたＤＮＡを、塩化カルシウムで処理したコンピテント Ｅ． ｃｏｌｉ． ＭＶ１１９０の形質変換に用いた。この形質変換体をアンピシリンプレート上で、３７℃で終夜培養した。数個のコロニーをプレートから採取した。プラスミドＤＮＡは、これらの各コロニーから抽出した。最後に、変異を配列分析で確認した。この実施例においては、該プラスミドＤＮＡはｐＴＺ−１９Ｕ−ＴＣＳであり、５’末端にＮｃｏＩ認識部位を、３’末端にＢａｍＨＩ認識部位を持つ天然のＴＣＳをコードするＤＮＡ配列を含有している。
【００８８】
プライマーＩおよびプライマーＩＩで変異させて得られたプラスミドｐＴＺ−１９Ｕ−ＴＣＳは、更に、実施例２から６において鋳型ＤＮＡとして用いられた。一方、プラスミドｐＴＺ−１９Ｕ−ＴＣＳは、次にＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩを用い、３７℃で２時間、二重消化をした。消化された混合物を低融点アガロースゲル電気泳動に付し、長さ約７５０ｂｐのＴＣＳ遺伝子のＤＮＡ断片を得た。次にこの断片を、Ｔ４ ＤＮＡを用い、前もってＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで二重消化してある発現ベクターｐＥＴ−２ｄと４℃でライゲートし、発現で用いるｐＥＴ−２ｄ−ＴＣＳを得た。
【００８９】
実 施 例 ２
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）をコードするＤＮＡの突然変異およびクローニン
グ：
突然変異はビオ−ラッド社の、Ｍｕｔａ−Ｇｅｎｅ Ｐｈａｇｅｍｉｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いて行った。手順は、製造会社の指示に従った。実施例１で得られたｐＴＺ−１９Ｕ−ＴＣＳを鋳型ＤＮＡとして用いた。変異原プライマーＩＩＩを部位特異的突然変異誘発に用いた。簡単に述べると、Ｅ．ｃｏｌｉ．ＣＪ２３６をｐＴＺ−１９Ｕ−ＴＣＳで形質変換させた。次いで、ウラシル含有鋳型ＤＮＡをヘルパーファージの存在下で抽出した。次に、変異原ストランドを、ウラシル含有鋳型ＤＮＡを変異原プライマーと混合する、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを添加する、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを添加するなどを含む一連の操作で合成した。この変異したＤＮＡをコンピテントＥ．ｃｏｌｉ．ＭＶ１１９０の形質転換に用いた。最後に、突然変異コロニーを採取し、変異を配列分析で確認してｐＴＺ−１９Ｕ−ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）を得た。
【００９０】
変異原プライマーＩＩＩは本実験のためにデザインされた。
プライマーＩＩＩ ５’ＡＡＧ ＣＧＴ ＧＴＴ ＧＡＣ ＧＡＡ ＡＣＣ ＴＴＣ
ＣＴＡ ＣＣＡ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）
プライマーＩＩＩは、天然のＴＣＳの１７７位のＬｙｓをコードするコドンが、Ｇｌｕをコードするコドンに置き換わるという特徴がある。コドンの縮重により、アンダーラインをしたコドンは、Ｇｌｕをコードする他のコドン、すなわちＧＡＧで置き換えることもできる。
【００９１】
こうして得られたｐＴＺ−１９Ｕ−ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）は、次いでＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで二重消化し、ＭＴＣＳ（１７７）をコードするＤＮＡ断片を得た。次いで、この断片を前もってＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで二重消化した発現プラスミドベクターｐＥＴ−２ｄとライゲートして、ｐＥＴ−２ｄ−ＭＴＣＳ（１７７）を得た。
【００９２】
実 施 例 ３
ＭＴＣＳ（２０３）をコードするＤＮＡの突然変異およびクローニング：
突然変異およびクローニングするために、異なった突然変異原プライマーＩＶをデザインし実験に用いた以外は、実施例２に記載した手順に従い、ｐＥＴ−２ｄ−ＭＴＣＳ（２０３）を得た。
突然変異原プライマーＩＶは本実験のためにデザインされた。
プライマーＩＶ ５’ＡＴＴ ＣＡＧ ＡＴＡ ＧＣＧ ＧＧＴ ＡＣＴ ＡＡＴ
ＡＡＴ ＧＧＡ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）
プライマーＩＶは、天然ＴＣＳの２０３位のＳｅｒをコードするコドンをＧｌｙをコードするコドンに置き換えるようにデザインされている。コドンの縮重により、アンダーラインを引いたコドンはＧｌｙをコードする他のコドン、例えばＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧに置き換えることができる。すなわち、Ｇｌｙをコードするコドンには４種の代替があるということである。
【００９３】
実 施 例 ４
ＭＴＣＳ（２３６）をコードするＤＮＡの突然変異およびクローニング：
突然変異およびクローニングするために、異なった突然変異原プライマーＶをデザインし、実験に用いた以外は、実施例２に記載した手順に従い、ｐＥＴ−２ｄ−ＭＴＣＳ（２３６）を得た。
突然変異原プライマーＶは本実験のためにデザインされた。
プライマーＶ ５’ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＣＣ ＴＣＣ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＣＧ
ＴＴＧ ＣＴＧ３’（ＳＥＱＩＤ ＮＯ．７）
プライマーＶは、天然ＴＣＳの２３６位のＡｓｎをコードするコドンをＧｌｙをコードするコドンに置き換えるようにデザインされている。コドンの縮重により、アンダーラインを引いたコドンはＧｌｙをコードする他のコドン、例えばＧＧＡ、ＧＧＧ、ＧＧＴに置き換えることができる。
【００９４】
実 施 例 ５
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）をコードするＤＮＡの突然変異およびクロ
ーニング：
突然変異およびクローニングするために、異なった突然変異原プライマーＩＩＩおよびＩＶをデザインし、実験に用いた以外は、実施例２に記載した手順に従い、ｐＥＴ−２ｄ−ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）を得た。
プライマーＩＩＩ ５’ＡＡＧ ＣＧＴ ＧＴＴ ＧＡＣ ＧＡＡ ＡＣＣ ＴＴＣ
ＣＴＡ ＣＣＡ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）
プライマーＩＶ ５’ＡＴＴ ＣＡＧ ＡＴＡ ＧＣＧ ＧＧＴ ＡＣＴ ＡＡＴ
ＡＡＴ ＧＧＡ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）
プライマーＩＩＩは、天然のＴＣＳの１７７位のＬｙｓをコードするコドンが、Ｇｌｕをコードするコドンに置き換わるという特徴がある。コドンの縮重により、アンダーラインをしたコドンは、Ｇｌｕをコードする他のコドン、すなわちＧＡＧで置き換えることもできる。
プライマーＩＶは、天然ＴＣＳの２０３位のＳｅｒをコードするコドンをＧｌｙをコードするコドンに置き換えるようにデザインされている。コドンの縮重により、アンダーラインを引いたコドンはＧｌｙをコードする他のコドン、例えばＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧに置き換えることができる。
【００９５】
実 施 例 ６
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）をコードするＤＮＡの突然変異お
よびクローニング：
突然変異およびクローニングするために、異なった突然変異原プライマーＩＩＩ、ＩＶおよびＶをデザインし、実験に用いた以外は、実施例２に記載した手順に従い、ｐＥＴ−２ｄ−ＭＴＣＳ（Ｍ１７７、２０３、２３６）を得た。
プライマーＩＩＩ ５’ＡＡＧ ＣＧＴ ＧＴＴ ＧＡＣ ＧＡＡ ＡＣＣ ＴＴＣ
ＣＴＡ ＣＣＡ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）
プライマーＩＶ ５’ＡＴＴ ＣＡＧ ＡＴＡ ＧＣＧ ＧＧＴ ＡＣＴ ＡＡＴ
ＡＡＴ ＧＧＡ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）
プライマーＶ ５’ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＣＣ ＴＣＣ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＣＧ
ＴＴＧ ＣＴＧ３’（ＳＥＱＩＤ ＮＯ．７）
プライマーＩＩＩは、天然のＴＣＳの１７７位のＬｙｓをコードするコドンが、Ｇｌｕをコードするコドンに置き換わるという特徴がある。コドンの縮重により、アンダーラインをしたコドンは、Ｇｌｕをコードする他のコドン、すなわちＧＡＧで置き換えることもできる。
プライマーＩＶは、天然ＴＣＳの２０３位のＳｅｒをコードするコドンをＧｌｙをコードするコドンに置き換えるようにデザインされている。コドンの縮重により、アンダーラインを引いたコドンはＧｌｙをコードする他のコドン、例えばＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧに置き換えることができる。
プライマーＶは、天然ＴＣＳの２３６位のＡｓｎをコードするコドンをＧｌｙをコードするコドンに置き換えるようにデザインされている。コドンを縮重により、アンダーラインを引いたコドンはＧｌｙをコードする他のコドン、例えばＧＧＡ、ＧＧＧ、ＧＧＴに置き換えることができる。
【００９６】
実 施 例 ７
ＴＣＳの発現：
下記の標準手順によって、塩化カルシウムで処理したコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐｌｙｓＳ）を、実施例１で得たＴＣＳ遺伝子を含有するプラスミドｐＥＴ−２ｄ−ＴＣＳで形質転換した。要約すると、１−１００ｎｇのｐＥＴ−２ｄ−ＴＣＳを、１００ｕｌのコンピテント細胞と静かに混合した。３０ないし６０分氷の上で保持した後、混合物に４２℃で９０秒熱ショックを与え、次いで氷に戻した。５分後、混合物に０．５ｍｌのＬＢ培地を加え、次いで３７℃で１時間通気下で培養した。培養した混合物の１０分の１を０．１ｍｌのＬＢ培地で希釈し、アンピシリンおよびクロラムフェニコールを含有するＢプレートに広げた。これらのプレートを３７℃で終夜培養し、個々のコロニーを均一の大きさ、形で採取した。形質転換体を、アンピシリンおよびクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地で３７℃で終夜培養し、次いで更に大きなスケールで、アンピシリンおよびクロラムフェニコールを含有するＭ９ＺＢ培地中、同温度で、細胞濃度がＡ５７０＝０．８になるまで培養した。次いで、ＩＰＴＧを最終濃度が０．５ｍＭになるまで加え、細胞を更に３時間培養した。次に、細胞を集め、超音波で溶菌した。溶解液を遠心分離し上澄液をＣＭセファデックスまたはＣＭセファロースのカラムにかけた。カラムを０．１ｍＭのフェニルメタンスルフォニルフロライド（ＰＭＳＦ）を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で、Ａ２８０が基底値になるまで洗浄した後、洗浄緩衝液に０．１−０．４Ｍ食塩を加えた溶液を用いる線型濃度勾配法で溶出した。最も高いピーク中の物質がリコンビナントＴＣＳを示した。リコンビナントＴＣＳのアミノ酸配列は図１中の１位にＭｅｔが付加した１から２４７のアミノ酸残基で示される。
【００９７】
実 施 例 ８
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）の発現：
実施例２で得られたＭＴＣＳ（Ｍ１７７）をコードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＴ−２ｄ−ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐｌｙｓＳ）の形質転換に用いた。実施例７に記載された手順に従って、遺伝子の形質転換、発現およびタンパク質を精製を行い、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）を得た。ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）のアミノ酸配列は、１７７位のＬｙｓがＧｌｕに置き換わった以外は実施例７のリコンビナントＴＣＳと同一である。
【００９８】
実 施 例 ９
ＭＴＣＳ（Ｍ２０３）の発現：
実施例３で得られたＭＴＣＳ（Ｍ２０３）をコードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＴ−２ｄ−ＭＴＣＳ（Ｍ２０３）をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐｌｙｓＳ）の形質転換に用いた。実施例７に記載された手順に従って、遺伝子の形質転換、発現およびタンパク質を精製を行い、ＭＴＣＳ（Ｍ２０３）を得た。ＭＴＣＳ（Ｍ２０３）のアミノ酸配列は、２０３位のＳｅｒがＧｌｙに置き換わった以外は実施例７のリコンビナントＴＣＳと同一である。
【００９９】
実 施 例 １０
ＭＴＣＳ（Ｍ２３６）の発現：
実施例４で得られたＭＴＣＳ（Ｍ２３６）をコードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＴ−２ｄ−ＭＴＣＳ（Ｍ２３６）をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐｌｙｓＳ）の形質転換に用いた。実施例７に記載された手順に従って、遺伝子の形質転換、発現およびタンパク質を精製を行い、ＭＴＣＳ（Ｍ２３６）を得た。ＭＴＣＳ（Ｍ２３６）のアミノ酸配列は、２６３位のＡｓｎがＧｌｙに置き換わった以外は実施例７のリコンビナントＴＣＳと同一である。
【０１００】
実 施 例 １１
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）の発現：
実施例５で得られたＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）をコードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＴ−２ｄ−ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐｌｙｓＳ）の形質転換に用いた。実施例７に記載された手順に従って、遺伝子の形質転換、発現およびタンパク質を精製を行い、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）を得た。ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）のアミノ酸配列は、１７７位のＬｙｓがＧｌｕに、２０３位のＳｅｒがＧｌｙに置き換わった以外は実施例７のリコンビナントＴＣＳと同一である。
【０１０１】
実 施 例 １２
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）の発現：
実施例６で得られたＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）をコードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＴ−２ｄ−ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐｌｙｓＳ）の形質転換に用いた。実施例７に記載された手順に従って、遺伝子の形質転換、発現およびタンパク質を精製を行い、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）を得た。ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）のアミノ酸配列は、１７７位のＬｙｓがＧｌｕに、２０３位のＳｅｒがＧｌｙに、２３６位のＡｓｎがＧｌｙに置き換わった以外は実施例７のリコンビナントＴＣＳと同一である。
【０１０２】
実 施 例 １３
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）の生物活性および免疫反応性の試験：
ＲＩＰ活性はＰｅｌｈｅｍ ＆Ｊａｃｋｓｏｎの記載によって決定した（Ｈ． Ｋ． Ｂ． Ｐｅｌｈｅｍ ａｎｄ Ｒ． Ｊ． Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６７： ２４７−２５６． １９７６）。ウサギ網状赤血球の溶解物はプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から入手した。［３Ｈ］−ロイシンはニュウー イングランド ヌクレアー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）から入手した。人工流産活性試験は本発明者らの研究室の標準手順に従って、妊娠１１日のＩＣＲマウスを用いて行われた （Ｎｉｅ ＨＬ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｏｓｉｔｉｏｎ １２０−１２３， ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｃｔｉｖｅ Ｓｉｔｅ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ６２ （６）： ４９１−５００， １９９８）。動物は、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）の７５ｎｍｏｌ／Ｋｇを背部に注射で投与した４８時間後に屠殺し、解剖した。総数および死亡した胎児数（吸着胚を含む）を記録し、胎児死亡比を計算した。
【０１０３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ 免疫反応性は競合ＥＬＩＳＡ法で測定した。ＩｇＧ抗体および抗ＩｇＥモノクローナル抗体は本願発明者らの研究室で作成、精製した（Ｈｅ ＸＨ， ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ， ２６：６５７−６６２， １９９４）。抗体はイムノアフィニティークロマトグラフィーで精製した。本実施例に記載された全ての試験で天然ＴＣＳを陽性コントロールとして用いた。結果を表７に掲載する。
【０１０４】
【表７】
【０１０５】
実 施 例 １４
ＭＴＣＳ（Ｍ２０３）の生物活性および免疫反応性の試験：
実施例１３に記載されたのと同じ方法を、ＭＴＣＳ（Ｍ２０３）のＲＩＰ活性、人工流産活性および ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫反応性を決定するために用いた。本試験の全てで、天然ＴＣＳを陽性コントロールとして用いた。結果を８に掲載する。
【０１０６】
【表８】
【０１０７】
実 施 例 １５
ＭＴＣＳ（Ｍ２３６）の生物活性および免疫反応性の試験：
実施例１３に記載されたのと同じ方法を、ＭＴＣＳ（Ｍ２３６）のＲＩＰ活性、人工流産活性および ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫反応性を決定するために用いた。本試験の全てで、天然ＴＣＳを陽性コントロールとして用いた。結果を９に掲載する。
【０１０８】
【表９】
【０１０９】
実 施 例 １６
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）の生物活性および免疫反応性の試験：
実施例１３に記載されたのと同じ方法を、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７， ２０３）のＲＩＰ活性、人工流産活性および ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫反応性を決定するために用いた。本試験の全てで、天然ＴＣＳを陽性コントロールとして用いた。結果を１０に掲載する。
【０１１０】
【表１０】
【０１１１】
実 施 例 １７
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）の生物活性および免疫反応性の
試験：
実施例１３に記載されたのと同じ方法を、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）のＲＩＰ活性、人工流産活性および ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫反応性を決定するために用いた。本試験の全てで、天然ＴＣＳを陽性コントロールとして用いた。結果を１１に掲載する。
【０１１２】
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）の生物活性および免疫反応性の試験
【表１１】
【０１１３】
実 施 例 １８
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）のＫ５６２細胞に対する毒性：
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）のヒト慢性骨髄性白血病Ｋ５６２細胞およびヒト正常リンパ球に対する毒性を、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチル−チアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル テトラゾリウム ブロマイド）細胞毒性試験を行うことにより試験した。１０％牛胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で成育中の約２００，０００個の各タイプの細胞を、それぞれ培養プレートのウェルに３７℃、５％ＣＯ２で接種し、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）と培養した。ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）の濃度は、それぞれ１、５、１０、２０、５０および１００ｕｇ／ｍｌである。試験は、４８時間後に２５ｕｌのＭＴＴ（シグマ社製、５ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加して終結させ、さらに２時間培養し、最後にライジング緩衝液を各ウェルに添加し、細胞を溶解した。３７℃で終夜培養した後、プレートを分光学的に、５７０ｎｍで測定した。ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）のＫ５６２細胞に対するＬＣ５０は、３０ｕｇ／ｍｌより少ないと算出された。ヒト正常リンパ球は、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）の濃度が１０００ｕｇ／ｍｌのように高いときでもＬＣ５０値を得られなかったので、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）に対して感受性がなかった。
【０１１４】
実 施 例 １９
ＭＴＣＳ（Ｍ２０３）のＫ５６２細胞に対する毒性：
実施例１８に記載されたのと同じ方法を、ＭＴＣＳ（Ｍ２０３）のヒト慢性骨髄性白血病Ｋ５６２細胞およびヒト正常リンパ球に対する毒性を測定するために用いた。ＭＴＣＳ（Ｍ２０３）のＫ５６２細胞に対するＬＣ５０は３０ｕｇ／ｍｌより少ないと算出された。ヒト正常リンパ球は、ＭＴＣＳ（Ｍ２０３）の濃度が１０００ｕｇ／ｍｌのように高いときでもＩＣ５０値を得られなかったので、ＭＴＣＳ（Ｍ２０３）に対して感受性がなかった。
【０１１５】
実 施 例 ２０
ＭＴＣＳ（Ｍ２３６）のＫ５６２細胞に対する毒性：
実施例１８に記載されたのと同じ方法を、ＭＴＣＳ（Ｍ２３６）のヒト慢性骨髄性白血病Ｋ５６２細胞およびヒト正常リンパ球に対する毒性を測定するために用いた。ＭＴＣＳ（Ｍ２０３）のＫ５６２細胞に対するＬＣ５０は３０ｕｇ／ｍｌより少ないと算出された。ヒト正常リンパ球は、ＭＴＣＳ（Ｍ２３６）の濃度が１０００ｕｇ／ｍｌのように高いときでもＩＣ５０値を得られなかったので、ＭＴＣＳ（Ｍ２３６）に対して感受性がなかった。
【０１１６】
実 施 例 ２１
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）のＫ５６２細胞に対する毒性：
実施例１８に記載されたのと同じ方法を、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）のヒト慢性骨髄性白血病Ｋ５６２細胞およびヒト正常リンパ球に対する毒性を測定するために用いた。ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）のＫ５６２細胞に対するＬＣ５０は３０ｕｇ／ｍｌより少ないと算出された。ヒト正常リンパ球は、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）の濃度が１０００ｕｇ／ｍｌのように高いときでもＩＣ５０値を得られなかったので、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）に対して感受性がなかった。
【０１１７】
実 施 例 ２２
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）のＫ５６２細胞に対する毒性：
実施例１８に記載されたのと同じ方法を、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）のヒト慢性骨髄性白血病Ｋ５６２細胞およびヒト正常リンパ球に対する毒性を測定するために用いた。ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）のＫ５６２細胞に対するＬＣ５０は３０ｕｇ／ｍｌより少ないと算出された。ヒト正常リンパ球は、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）の濃度が１０００ｕｇ／ｍｌのように高いときでもＩＣ５０値を得られなかったので、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）に対して感受性がなかった。
【０１１８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】天然ＴＣＳのアミノ酸配列（配列表中の配列番号１）およびこれをコードする塩基配列（配列表中の配列番号２）を示す。第１から２４７位の部分は成熟天然ＴＣＳのアミノ酸配列を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は変異天花粉（ＭＴＣＳ）蛋白、その製造法及びその使用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
天花粉（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ：ＴＣＳ）は、最初は、漢方生薬である▲かつ▼楼（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ Ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ Ｍａｘｉｍｏｗｉｃｚ）と呼ばれる植物の根茎部から抽出されたものであり、２０００年以前より書物に記載され、臨床的に使用されている漢方薬、ティアン フア フェン（Ｔｉａｎ Ｈｕａ Ｆｅｎ）の活性成分として同定されている。
【０００３】
化学的に、ＴＣＳは分子量が２７ｋＤａでタイプ１のリボソーム−不活化蛋白（ＲＩＰ）である。これは真核細胞のリボソームの６０Ｓサブユニットを不活性化するＲＮＡ−Ｎ−グリコシダーゼ活性を有している（Ｚｈａｎｇ ＪＳ，Ｌｉｕ ＷＹ， Ｔｈｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ ｏｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ ＲＮＡ Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０ （６）：１２７１−１２７５， １９９２）。天然のＴＣＳは２４７個のアミノ酸残基によって構成されている。その一次構造が図１に示されている（Ｎｉｅ ＨＬ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ Ｇｅｎｅ， Ｔｈｅ ４ｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｇｅｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｈａｉｋｏｕ， Ａ−２３， １９９１）。
【０００４】
ＴＣＳは、１９７０年代から中国において、妊娠中期における流産の誘発や絨毛性臓器の疾患、例えば、胞状奇胎の治療に、臨床で使用されている（Ｓｅｃｏｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒｏｕｐ ｏｆ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ，１９：８１１−８３０，１９７６）。
【０００５】
１９８９年、ＴＣＳがＨＩＶに感染した人のＴリンパ細胞と貪食細胞の両細胞中でＨＩＶ−１の複製を抑制を示したとの実験室的な報告がなされると（Ｍｃｇｒａｔｈ ＭＳ， Ｈｗａｎｇ ＫＭ， Ｃａｌｄｗｅｌｌ ＳＥ， ｅｔ ａｌ．， ＧＬＱ２２３：Ａｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｃｕｔｅｌｙ ａｎｄ Ｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙ Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｐｈａｇｏｃｙｔｅ Ｌｉｎｅａｇｅ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８６： ２８４４−２８４８，１９８９）、すぐにエイズの治療可能性についてＴＣＳの臨床試験が行われた。ＨＩＶに加え、ＴＣＳは他の型のウィルスを攻撃できるものである。
【０００６】
また、白血病細胞や他の癌細胞に対する毒性も発見された（ＫｏｎｇＭ，Ｋｅ ＹＢ，Ｚｈｏｕ ＭＹ， ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｐｐｏｔｏｓｉｓ ｏｆ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｋ５６２ Ｃｅｌｌｓ，Ａｃｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉａｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ Ｓｉｎｉｃａ，３１ （３）：２３３−２４３ １９９８； Ｚｈｅｎｇ ＹＴ，Ｚｈａｎｇ ＫＬ，Ｂｅｎ ＫＬ，ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ Ａｇａｉｎｓｔ Ｈｕｍａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ−ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｃｅｌｌｓ， Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，１７ （１） ： ６９−７９， １９９５；Ｗｕ ＹＸ， Ｘｉａｎｇ ＤＮ， Ｚｈａｎｇ ＳＰ，ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｔｏｘｉｃ Ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｔｏｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ Ａｇａｉｎｓｔ Ｓｔｏｍａｃｈ ａｎｄ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ， １３（３）：２６３−２６６，１９９３）。
【０００７】
しかし、臨床上の使用において、この薬剤による重篤な合併症が観察された。これは稀に、イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体を介する即時型アレルギー反応を引き起こす。ＴＣＳ特異的ＩｇＥが体内でＴＣＳと反応することによるＩ型の過敏症の攻撃の開始は、アレルギー性蕁麻疹、血管神経性水腫、およびアナフィラキシーショック−急性の、重篤な生命にかかわるアレルギー反応で、数分で死亡する−のような合併症として臨床的に現れた。このＴＣＳに対する免疫応答不全は一般に多年の間患者の体内に強陽性として残る。
【０００８】
そのために、妊娠中絶薬としては一生で一回しか使えないというふうに規制されている。妊娠中絶だけでなく、他の疾患の治療にＴＣＳを用いた時にもアレルギー反応が見られた。従って、その適用は、強く制限されていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、安全に何度も投与できるような抗原性が少ない新しい天花粉蛋白製品の開発することによって、ＴＣＳの副作用を除去することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は天然の天花粉（ＴＣＳ）のアミノ酸配列の３つの領域：１７４−１８０、２０３−２２６および２３０−２４４のアミノ酸残基：の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変した、抗原性の低い変異天花粉（ＭＴＣＳ）蛋白または、該改変および天然のＴＣＳの生物活性を実質的に保持しているＭＴＣＳ蛋白の断片もしくは誘導体を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、本発明のＭＴＣＳをコードする核酸も提供する。
本発明はさらに、本発明の核酸を含むベクター、特に発現ベクターおよび本発明の核酸または本発明のベクターによって形質変換された宿主細胞に関する。
【００１２】
本発明はさらに、本発明の宿主細胞をＭＴＣＳを発現させるための好ましい条件下で培養し、その培養物からＭＴＣＳを回収することからなる、本発明のＭＴＣＳの製造方法にも関する。
【００１３】
本発明はさらに、本発明のＭＴＣＳおよび薬物学的に許容される担体もしくは賦形剤からなる、医薬組成物に関する。
本発明はさらに、医薬としての本発明のＭＴＣＳにも関する。
本発明はさらに、ウイルス性疾患の治療、癌の治療、子宮外妊娠の治療および／または流産の誘発のための医薬を製造するための本願発明のＭＴＣＳの使用にも関する。
【００１４】
最後に、本発明は、哺乳類に本発明のＭＴＣＳの治療的有効量を投与することからなる、哺乳類の流産の誘発、子宮外妊娠の治療、ウイルス性疾患の治療および／または癌の治療のための方法に関する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明者らは鋭意研究の後、ＴＣＳの免疫活性に関する領域は構造的に１７４−１８０位、２０３−２０６および２３０−２４４位間のアミノ酸の残基にあることを見出した。これらの３領域中の少なくとも一つのアミノ酸の残基の改変は、優れた性質を持つ新規なＭＴＣＳを製造することができる。
【００１６】
ＴＣＳの生物学的活性はＭＴＣＳ中に実質的に保持されているにもかかわらず、ＴＣＳの抗原性はＭＴＣＳ中では著しく低下している。
本願発明のＭＴＣＳは、少なくともリボソーム不活性化蛋白（ＲＩＰ）活性およびおよび人工流産活性を保持しており、好ましくは抗癌、抗ウイルス活性などの全ての活性を保持している。
【００１７】
従って、本発明は、ＴＣＳのアミノ酸残基の３領域：１７４―１８０位、２０３―２２６位と２３０―２４４位：の少なくとも１つのアミノ酸の残基が改変された低抗原性のＴＣＳを提供するものである。
【００１８】
本願の明細書および特許請求の範囲中でのアミノ酸の残基の位置に関する番号は、図１で示されている番号を参照している。
【００１９】
本発明のＭＴＣＳは、本発明で定義されたアミノ酸残基の少なくとも一つの改変を含有する全長の成熟蛋白または断片もしくは誘導体であってもよい。
【００２０】
本願で用いられている、アミノ酸残基の「改変」とは、アミノ酸の残基の欠失、挿入、付加、置換または化学的改変のことを言う。
【００２１】
好ましい態様では、アミノ酸残基の改変が、改変されたアミノ酸部位の電荷の変化を引き起こす。
【００２２】
「置換」という語は好ましくは、親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸で置換、疎水性アミノ酸を親水性アミノ酸で置換、酸性アミノ酸を塩基性アミノ酸で置換および塩基性アミノ酸を酸性アミノ酸で置換することを言う。
【００２３】
ここで用いる「親水性アミノ酸」と言う語は、特にセリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）およびヒスチジン（Ｈｉｓ）を指す。これらの親水性アミノ酸のうちで、Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎが酸性アミノ酸、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓが塩基性性のアミノ酸である。
【００２４】
「疎水性アミノ酸」と言う語は、特にグリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｙ）およびメチオニン（Ｍｅｔ）を指す。
【００２５】
本発明の好ましい態様においては、ＭＴＣＳの領域１７４―１８０位が、表１から選ばれる少なくとも１個以上のアミノ酸残基の改変を含有している。
【００２６】
【表１】
本発明の他の好ましい態様においては、ＭＴＣＳの領域２０３−２２６位が、表２から選ばれる少なくとも１個以上のアミノ酸残基の改変を含有している。
【００２８】
【表２】
本発明の他の好ましい態様においては、ＭＴＣＳの領域２３０−２４４位が、表３から選ばれる少なくとも１個以上のアミノ酸残基の改変を含有している。
【００３０】
【表３】
好ましくは、本発明のＭＴＣＳは上述の三つの領域、１７４−１８０、２０３−２２６および２３０−２４４でアミノ酸残基の改変を含有している。さらに好ましい態様においては、それぞれの領域における改変は、表１、表２および表３からそれぞれ選択される。
【００３２】
好ましい態様において、本発明のＭＴＣＳは、下記の両方のアミノ酸残基改変を有する：１７７位のＬｙｓをＧＬＵで、２０３位のＳｅｒをＧｌｙで置換。
さらに好ましい態様において、本発明のＭＴＣＳは、下記の３つのアミノ酸残基改変を有する：１７７位のＬｙｓをＧｌｕで、２０３位のＳｅｒをＧｌｙで、２３６位のＡｓｎをＧｌｙで置換。
【００３３】
本発明は、さらに本願発明のＭＴＣＳをコードする核酸に関する。
【００３４】
本発明のＭＴＣＳは、共に当業者にとってはよく知られた、遺伝子工学方法またはペプチド合成法、例えば固相ペプチド合成法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｊ．Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５： ２１４９−２１５４． １９６３）によって製造できる。好ましくは、ＭＴＣＳは天然ＴＣＳの遺伝子を改変し、次いで適切な生物学的宿主中で改変した遺伝子を発現させて製造される。
【００３５】
ＭＴＣＳをコードする本発明の核酸は、適当なベクター、特にプラスミドベクターｐＥＴ−２ｄまたはｐＥＴ−３ａのようなプラスミドベクター中でクローン化することができる。
【００３６】
本発明の核酸あるいはその核酸を含有するベクターは、適切な宿主細胞、例えば大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ．）を形質転換するために用いることができる。得られた形質転換された宿主細胞は、本発明のＭＴＣＳを生産するために培養することができる。本発明は、こような宿主細胞にも関する。
【００３７】
したがって、本発明は、本発明の宿主細胞をＭＴＣＳの発現のための好ましい条件下で培養し、培養物からＭＴＣＳを回収することからなる本発明のＭＴＣＳの製造法にも関する。
【００３８】
天然のＴＣＳの遺伝子の配列はＡＴＧ（開始コドン）からＴＡＧ（終始コドン）までの８７０の塩基対からなっている。当業者にとっては、その遺伝子はその配列に関する公表された情報に基き、下記の標準方法、例えば、染色体ＤＮＡライブラリー（Ｃｈｏｗ ＴＰ， Ｆｅｌｄｍａｎ ＲＡ， Ｌｏｖｅｔｔ Ｍ， Ｐｉａｔａｋ Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ Ｇｅｎｅ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ａｌｐｈａ−ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ， ａ Ｔｙｐｅ Ｉ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５（１５）： ８６７０−８６７４， １９９０） またはｃＤＮＡライブラリー（Ｓｈａｗ ＰＣ， Ｙｕｎｇ ＭＨ， Ｚｈｕ ＲＨ， Ｈｏ ＷＫ， Ｎｇ ＴＢ， Ｙｅｕｎｇ ＨＷ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ ｃＤＮＡ ａｎｄ ｉｔｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ， Ｇｅｎｅ， ９７（２）： ２６７−７２， １９９１）からの分離による方法、あるいはＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を用いる方法（Ｎｉｅ ＨＬ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ Ｇｅｎｅ， Ｔｈｅ ４ｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｇｅｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｈａｉｋｏｕ， Ａ−２３， １９９１）、あるいは化学的合成する方法によって得ることができる。
【００３９】
この遺伝子は２８９個のアミノ酸より構成されるプレプロ−蛋白をコードする。２４７個のアミノ酸の残基を有する成熟した天然のＴＣＳに加え、このプレプロ−蛋白は、Ｎ−末端に２３個のシグナルペプチドおよびＣ−末端に１９個の末端ペプチドを有している。
【００４０】
ＴＣＳのプレプロ−蛋白をコードするｃＤＮＡは、先に発表された方法を用いて都合よくクローン化できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｄｉｔｉｏｎ）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８２）。このｃＤＮＡを含有するプラスミドも直接用いることもできる。
【００４１】
天然のＴＣＳの遺伝子は、当業者によく知られている位置特異的突然変異処理を利用して、改変することができる。本発明の１態様において、この改変は次のとおりである。
【００４２】
ａ）必要に応じ、成熟天然ＴＣＳをコードするＤＮＡ配列の５’末端の前で、３’末端の後の適切な制限酵素位置を構築し、開始コドンと終止コドンをそれぞれ導入する。例えば、成熟天然ＴＣＳをコードするＤＮＡ配列の５’末端の前の制限酵ＮｃｏＩ位置（ＣＣＡＴＧＧ）を開始コドンＡＴＧを導入し、成熟天然ＴＣＳの１位にＭｅｔを付加するように構築するか、制限酵素ＮｄｅＩ位置（ＣＡＴＡＴＧ）を、成熟天然ＴＣＳの１位をＡｓｐからＭｅｔにアミノ酸残基を置換するように構築できる。成熟天然ＴＣＳをコードするＤＮＡ配列の３’末端の後に、制限酵素ＢａｍＨＩ位置（ＧＧＡＴＣＣ）を、終止コドンを導入するようにに構築することができる；そして
【００４３】
ｂ）本願発明のＭＴＣＳの遺伝子を得るために、変異させるアミノ酸配列（１７４−１８０、２０３−２２６および２３０−２４０領域のアミノ酸残基）をコードするＤＮＡ配列を改変する。コドンの縮重により、１個のアミノ酸を改変するために複数の遺伝突然変異方法を用いることができる。市販のキット、例えばバイオ−ラード社のＭｕｔａ−Ｇｅｎｅ Ｐｈａｇｅｍｉｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ は特定のＤＮＡ部位の突然変異を行うのによくデザインされている。手順は製造会社の取扱説明書に従うことができる。
【００４４】
位置特異的突然変異誘発によって得られたＭＴＣＳをコードするＤＮＡ配列は、適当な制限酵素、例えばＮｃｏＩ（またはＮｄｅＩ）およびＢａｍＨＩで消化し、次いで発現ベクター、例えばプラスミドベクターｐＥＴ−２ｄ（またはｐＥＴ−３ａ）にクローンする。得られた突然変異発現ベクターは、標準操作に従って、適当な宿主細胞、例えばＥ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐＬｙｓＳ）の形質転換に用いることができる。この形質転換体は次いで適当な培地中で培養される。誘導剤、例えばイソプロピル−ベータ−Ｄ−チオ−ガラクロシド（ＩＰＴＧ）を必要に応じ、ＭＴＣＳの発現を誘導するために、培地中に適当な時間に加えることができ、このＭＴＣＳは次いで、宿主細胞の溶解、溶解物の遠心分離そしてカラムクロマトグラフィーなどで精製することを含む通常の方法で培地から採取することができる。
【００４５】
ＭＴＣＳの活性に関する実験
本発明のＭＴＣＳの免疫反応性および生物活性の確認試験をその結果とともに以下に記す。
【００４６】
１．欠失ＴＣＳ変異蛋白および改変ＴＣＳ変異蛋白の性質
一次構造と生物学的活性および免疫学的反応性との関係を調べるために、表１から表３に示した変異に従って、ＴＣＳの分子を遺伝子的に改変した。遺伝子はＣ末端の配列の欠失（欠失変異体）または複数のアミノ酸配列の改変（改変変異体）させたＴＣＳをコードして得られた。変異蛋白は大腸菌を発現し、ついでこれを純化して、欠失変異体および改変変異体の何れかに対応して得られた。
【００４７】
ＴＣＳおよびその変異体は、リボソームを不活性化し、細胞蛋白合成を阻害するＲＮＡ Ｎ−グリコシダ−ゼ活性を有する。生物学活性および免疫学的反応性は、これらの欠失変異体および改変変異体について測定を行った。
ＴＣＳの活性断片に対する構造的基盤は、ＴＣＳの三次元構造から得られる情報とともに、これらの測定結果によって解析することができる。
【００４８】
ＲＩＰ活性はＰｅｌｈｅｍ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎの記載によって決定した （Ｈ． Ｋ． Ｂ． Ｐｅｌｈｅｍ ａｎｄ Ｒ． Ｊ． Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６７： ２４７−２５６． １９７６）。人工流産活性の測定は下記に示す本発明者らの研究室の標準手順に従って行った （Ｎｉｅ ＨＬ， Ｃａｉ ＸＦ ｅｔ ａｌ．， Ｐｏｓｉｔｉｏｎ １２０−１２３， ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｃｔｉｖｅ Ｓｉｔｅ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ６２ （６）： ４９１−５００， １９９８）。試験管内（ ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における免疫学的反応性は、競争的エライザ（ＥＬＩＳＡ）法（ＸＨ Ｈｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｙｓｉｎｅ ａｎｄ Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ ｏｎ ｉｔｓ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｉｙ ｗｉｔｈ ＩｇＥ， Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ， ２６： ６５７−６６２， １９９４）で測定した。結果は表４に示した。
【００４９】
【表４】
欠失ＴＣＳ変異体および改変ＴＣＳ変異体の性質に関する上記測定の結果は下記のことを示す。
欠失ＴＣＳ変異体においては、Ｃ末端から３個のアミノ酸残基を欠失した場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）とＩｇＥの反応性は天然のＴＣＳと同様に強陽性である。アミノ酸の残基を５個まで欠失させると、免疫反応性が減少するが、ＲＩＰ活性と人工流産活性に影響は認められない。２９個を越えてアミノ酸を失乏させた場合、生物学活性が減少する。
【００５１】
ＴＣＳの生物活性中心は１１０−１７４位の間にあることが、本発明者らによって報告されている（Ｋｅ ＹＢ， Ｃｈｅｎ ＪＫ， Ｎｉｅ ＨＬ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ６０ （７）： ４６５−４７２， １９９７）。Ｃ末端配列の欠失による三次元構造の変化もまたこの活性中心に対して影響する。アミノ酸残基の欠乏が活性の中心に近いほど、生物活性に対する影響が一層大きくなる。免疫反応性の部分は生物活性の中心より、Ｃ末端に近いことが発見された。従って、Ｃ末端配列の欠失によってさらに容易に影響される。
【００５２】
表４の改変変異体Ｍ７ＴＣＳ（１−２４７）［１７４−１８０位の間のアミノ酸酸残基の一つを変異させた］、Ｍ２４ＴＣＳ（１−２４７）［２０３−２２６位の間のアミノ酸酸残基の一つを変異させた］およびＭ１５ＴＣＳ（１−２４７）［２３０−２４４位の間のアミノ酸酸残基の一つを変異させた］は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける弱いＩｇＧとＩｇＥの反応性、およびＲＩＰと人工流産活性を含むある程度の生物活性を示した。この結果はこの改変した三つのアミノ酸配列（１８０−１７４、２２６−２０３、２４４−２３０位）は免疫反応性に関連することを示している。これらの領域のどのような構造変化も免疫反応性の減弱を引き起こす。
【００５３】
これらの構造変化は、少なくとも１個のアミノ酸残基の除去；二つの隣接したアミノ酸残基の間の少なくとも１個のアミノ酸残基の挿入；これらの配列に少なくとも１個のアミノ酸残基を付加；少なくとも１個の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基で置換；一個以上の疎水性アミノ酸残基を親水性アミノ酸残基で置換； 一個以上の酸性アミノ酸残基を塩基性アミノ酸残基で置換；一個以上の塩基性アミノ酸残基が酸性アミノ酸残基で置換；一個以上のアミノ酸残基の化学物質でのカップリング；および／またはこの改変がなされたアミノ酸側の電荷を変化させることができる少なくとも一個のアミノ酸の残基の挿入を含むいかなる改変を含む。
【００５４】
改変変異体Ｍ３１ＴＣＳ（１−２４７）［１７４から１８０位の間の１個のアミノ酸残基および２０３から２２６位の間の１個のアミノ酸残基が変異されている］とＭ４６ＴＣＳ（１−２４７）［１７４から１８０位の間の１個のアミノ酸残基、２０３から２２６位の間の１個のアミノ酸残基および２３０から２４４位の間の１個のアミノ酸残基が変異されている］は、ネガティブの免疫反応性および元来のＲＩＰおよび人工流産活性を含む生物活性を示しいる。これらの二つは優れた性質を有する改変体である。天然のＴＣＳの抗原性が大きく減弱されている。しかしながら、天然のＴＣＳの生物活性は保持されている。Ｍ４６ＴＣＳ（１−２４７）の抗原性は、Ｍ３１ＴＣＳ（１−２４７）に比較するとやや弱い。
【００５５】
２．本発明のＭＴＣＳの性質
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＩＰの活性試験、妊娠中期のマウスの人工流産についての試験、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＩｇＧおよびＩｇＥの反応性試験を、先に述べた手順に従い、本発明のＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）（１７７位のＬｙｓをＧｌｕで置換および２０３位のＳｅｒをＧｌｙで置換）について行った。培養癌細胞に対する毒性試験は本発明者らの実験室での次の標準手順に従って行った（Ｋｏｎｇ Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｋ５６２ Ｃｅｌｌｓ， Ａｃｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉａｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ Ｓｉｎｉｃａ， ３１ （３）： ２３３−２４３， １９９８）。
【００５６】
ａ）ＭＴＣＳと天然のＴＣＳの免疫反応性および生物学的活性の比較を表５に示す。
【００５７】
【表５】
ｂ）異なったセルラインに対するＭＴＣＳの毒性を表６に示す。
【００５９】
【表６】
ＭＴＣＳの白血病セルラインＫ５６２、ＨＬ６０、ＭＬＴ、Ｕ９３７および絨毛性癌セルラインＪａｒに対する平均致死量（ＬＣ５０）は３０ｕｇ／ｍｌより少ない。ＬＣ５０≦５０のセルラインを最高感作セルラインとする。ＭＴＣＳのＬＣ５０が３０ｕｇ／ｍｌ以上の癌細胞セルラインＢ１６、Ａ４３１、Ｂ７−３２５、ＳＰＣＡ１および７４０４等を中等度感作セルラインとする。ＭＴＣＳのＬＣ５０が１０００ｕｇ／ｍｌ以上の正常体細胞セルラインすなわち、ＨＭＰＬＣおよびＷｉｓｈ（羊膜の細胞）を非感作セルラインとする。このデータは、ある範囲の濃度では、ＭＴＣＳは白血病細胞および他のタイプの癌細胞に対して強い毒となるが、正常細胞は無傷のままであることを明確に示している。この結果は先のＴＣＳに対する同様な研究と一致している。
【００６１】
ｃ）動物モデル実験
ｃ−ｉ）抗腫瘍活性
８週令のヌードマウスにヒト慢性骨髄性白血病細胞Ｋ５６２の１×１０７細胞を皮下に接種する。接種１０日後に５０％の動物で生体内で接種細胞が発育して、肉眼で観察できる固形癌を形成する。異種の癌を移植された動物を無作為に４群に分ける。３群の動物には異なった用量のＭＴＣＳを注射投与する。他の群には、コントロールとして生理食塩水を与える。治療群に投与するＭＴＣＳの投与量は人工流産有効量より少ないか同量であり、３群それぞれに１５ｎｍ／Ｋｇ、４５ｎｍ／Ｋｇおよび７５ｎｍ／Ｋｇである。ＭＴＣＳは毎４日間に１回合計４回投与する。異なった腫瘍抑制の値、それぞれで（４０±３）％、（７１±２）％および（９２±４）％の抑制比が３投与群で観察された。
【００６２】
ＴおよびＢリンパ球を欠如しているＳＣＩＤ（ｓｅｖｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）マウスを、Ｋ５６２細胞に対するＭＴＣＳの毒性を検討するために選択する。９週齢のＳＣＩＤマウスにＫ５６２細胞１×１０７個を皮下接種する。接種された動物の１００％が固形癌を発生する。接種５日後に、動物を無作為に４群に分ける。それらの３群が投与群である。その他が生理食塩水のコントロール群である。異なった投与群の動物に、それぞれ高用量、中用量および低用量の異なった用量でＭＴＣＳを投与する。高用量群は１５０ｎｍ／Ｋｇを１回投与；中用量群は７５ｎｍ／Ｋｇを２回（週１回）投与；低用量群は３７ｎｍ／Ｋｇを３回（４日毎に投与）投与。全ての群で合計投与量は１５０ｎｍ／Ｋｇである。腫瘍の抑制比は高、中および低用量群でそれぞれ（４３±６）％、（６４±８）％および（９４±３）％である。
【００６３】
両実験動物の結果の結論は、人工流産の有効量で、ＭＴＣＳは明らかな腫瘍抑制効果を有するということである。上記９０％の腫瘍抑制比は、人工流産有効量の半量を４回投与することによって得ることができる。少量の多回投与は優れた結果をもたらす。
【００６４】
ＭＴＣＳは、ヒト慢性骨髄性白血病細胞を異種移植された動物モデルの上記の両実験において、優れた抗腫瘍効果を示す。これらの動物モデルに基いて、他の異種移植ＳＣＩＤ−ヒト慢性骨髄性白血病モデルを確立する。Ｋ５６２細胞の接種後に液癌がネズミ宿主中に形成され、これはネズミ宿主中の白血球の計測および他の血液生化学的変化によって証明される。異種移植されたマウスの３投与群それぞれに、３．７５ｎｍ／Ｋｇ、７．５ｎｍ／Ｋｇおよび１５ｎｍ／Ｋｇの用量でＭＴＣＳを静脈内投与する。３回投与後、計測白血球細胞が正常範囲に戻ったマウスのパーセンテージは、投与３群それぞれで、（２５＋６）％、（７５＋８）％および（９４＋３）％である。このデータは、固形癌の治療においてより、液癌の治療においての方がより少量のＭＴＣＳを用いることができることを示唆している。そして固形癌よりも液癌の方が一層良い結果を達成することができる。
【００６５】
ｃ−ｉｉ） マウスに対する急性毒性試験
マウスに対する急性毒性は下記の標準手順で行った。８週齢のＦｉマウス（ＩＣＲ／Ｂａｌｂ−ｃ）を用いた。それぞれの動物に天然のＴＣＳまたはＭＴＣＳを１回注射投与した。天然のＴＣＳとＭＴＣＳの間の平均致死量（ＬＤ５０）を比較するために、動物を７日間観察した。同用量において、ＭＴＣＳ群の動物に比べて、天然のＴＣＳを注射投与した動物の方が高い死亡率および早い死が観察される。ＬＤ５０（天然のＴＣＳ）＝１８．４ｍｇ／Ｋｇ、ＬＤ５０（ＭＴＣＳ）＝２７．５ｍｇ／Ｋｇ。ＭＴＣＳの急性毒性は天然のＴＣＳのそれよりも約５０％低い。
【００６６】
ｃ−ｉｉｉ）モルモット対する急性アレルギー毒性試験
天然のＴＣＳとＭＴＣＳについて別々にモルモット対する急性アレルギー毒性試験を行う。モルモットは、ヒト人工流産有効量の４．５倍量を皮下投与して感作する。１４日後、動物にヒト人工流産有効量の１０倍量を静脈内投与誘発する。アレルゲン投与後３０分間、アナフィラキシー反応および死亡を観察した。天然のＴＣＳ群の死亡数／全動物数比は１２／１４、約８６％である。ＭＴＣＳ群のこの比は３／１５、約２０％である。有意な差が存在した。ＭＴＣＳは天然のＴＣＳに比べて、モルモットにおける急性アレルギー反応を非常に弱く引き起こす。
【００６７】
ｃ−ｉｖ）ラットに対する受動性皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）
ラットに対するＰＣＡをＯｖａｒｙ の方法 （Ｏｖａｒｙ Ｚ， ｅｔ ａｌ．， ＰＣＡ Ｒｅａｃｔｉｏｎｗ ｗｉｔｈ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｒａｔｓ， Ｉｎｔｅｒ Ａｒｃｈｓ ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎ， ４８： １６−２１， １９７５）で行う。２群のマウスを天然のＴＣＳおよびＭＴＣＳで別々に感作する。１４日後に、天然のＴＣＳおよびＭＴＣＳに対して生成されたマウス抗血清を得る。２群のラットを麻酔し、毛を剃った背部に、天然のＴＣＳおよびＭＴＣＳに対する抗血清をそれぞれ皮内投与し、対応する天然のＴＣＳまたはＭＴＣＳの１％エンバンスブルーを含有する溶液を静脈内投与して誘発する。３０分後、動物を殺して背部の青斑の直径を測定してＰＣＡ反応を判定する。青斑が０．５ｃｍ以上のものを陽性反応とみなす。天然のＴＣＳ群の動物は全て陽性反応を示す。ＭＴＣＳ群の動物は全て陰性である。天然のＴＣＳによって引き起こされる生体内ＩｇＥ反応はＭＴＣＳの場合には劇的に低減する。
【００６８】
３．ＭＴＣＳの抗腫瘍のメカニズム
ａ） ＭＴＣＳは感作細胞中でアポートシスを誘発する。
先の２ａおよび２ｂで述べたように、ＭＴＣＳは正常な体細胞を傷つけないが、培養白血病細胞に対して高毒性である。Ｋ５６２細胞に対するＭＴＣＳの作用を例として挙げることができるが、多数の研究がそのメカニズムを解明するために行われている。電子顕微鏡下でＫ５６２細胞にＭＴＣＳを作用させると、プログラム細胞死またはアポトーシスした細胞形態の特徴的な変化を観察することができる：細胞体の縮小、細胞質の凝縮、小胞体の膨張、核小体の消失、核染色質の分離した塊への辺縁化、および細胞の幾つかの膜結合体（すなわちアポトーシス体）への崩壊。ＭＴＣＳ処理された細胞はまた、生化学的なアポトーシスの証明であるオリゴヌクレオゾームのＤＮＡラダーおよび蛍光活性化セルソート（ＦＡＣＳ）分析でアポトーシスの二重ピークを示す。この結果はＭＴＣＳがＫ５６２細胞においてアポトーシスの引きがねになることを示している。
【００６９】
ｂ） 感作細胞の細胞膜にはＭＴＣＳの特異的結合部位が存在する。
本研究では、リアルタイムの バイオモレキュラー・インターアクション・アナライシス（ＢＩＡ）を用いる。ＭＴＣＳはマイクロフローセルの壁を形成しているセンサーチップ上のデキストランマトリックスに固定される。次いで、細胞膜抽出物をコントロールフローの表面に注入する。相互作用によるいずれの表面濃度の変化も表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ）信号として検出し、共鳴ユニット（ＲＵ）で表わす。異なったタイプの感作細胞は、ＭＴＣＳが細胞膜蛋白に強力に結合していることを示す１００−３００ＲＵの応答を与える。正常体細胞、例えば羊膜の細胞、を相互作用試験に用いると、意味のある結合はない。
【００７０】
ｃ）共焦点レーザー顕微鏡により、ＭＴＣＳは受容体介在エンドサイトーシスを介してＫ５６２に取り込まれることが観察される。
【００７１】
ｄ）ＧＴＰ−ガンマー３５Ｓ結合試験において、ＭＴＣＳは感作細胞中でＧ−蛋白を介するシグナル伝達を活性化する。このような現象は、非感作細胞中では観察されない。
【００７２】
ｅ）共焦点レーザー顕微鏡により、ＭＴＣＳは感作細胞中で、細胞内貯留カルシウムから、細胞内カルシウム放出を誘発することが観察される。
【００７３】
抗腫瘍メカニズム研究の結論は次のとおりである。感作細胞中に存在する膜レセプターはＭＴＣＳのエンドサイトシスを伝え、次いでＲＩＰ効果を働かせる。一方、ＭＴＣＳも細胞シグナル伝達を妨げる。これらの二つの効果が結びついて感作細胞をアポトーシスに導く。
感作細胞の大部分は腫瘍細胞であるから、腫瘍を阻害すると同時に正常な体組織にも障害を与える細胞障害性または細胞分裂抑制性の化学療法剤に比べて、ＭＴＣＳは腫瘍に対する作用メカニズムがユニークである。これは、新規な抗腫瘍剤としてのＭＴＣＳに臨床適用の理論的根拠を提供する。
【００７４】
上で述べたように、本発明のＭＴＣＳは、天然のＴＣＳの生物学的活性を実質的に保持しているにもかかわらず、天然のＴＣＳに比べて、抗原性が著しく低下している。低抗原性であるので、安全な多回投与用および天然のＴＣＳによって処置できる全ての医療適用において、より好ましい処置をすることができる。より具体的には、これらに制限されるものでないが次の適用を含む。
【００７５】
１．白血病およびその他の固形癌。標的細胞に選択的に取り込まれるメカニズムにより、ＭＴＣＳの低用量のたった数回の投与のみが臨床治療で必要とされる。ＭＴＣＳは腫瘍細胞には高毒性であるが、一定の用量範囲内では、正常の体細胞にはそのままとするので、副作用を非常に少なくしている。
【００７６】
２．ウイルス性疾患および特にエイズ。ＭＴＣＳは、天然のＴＣＳによるエイズの治療に比べて副作用が少ないので患者に対して安全である。
【００７７】
３．子宮外妊娠および中期における流産の誘発。人工妊娠中絶薬として患者の生涯に一度だけの投与に限定されているＴＣＳとは異なり、ＭＴＣＳは低抗原性であるため、安全な多回投与が可能である
【００７８】
本願発明のＭＴＣＳは、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤と共に、医薬組成物中に包含させることができる。従って、本願発明は治療的有効量の本願発明のＭＴＣＳを薬学的に許容される担体もしくは賦形剤と組合わせてなる医薬組成物も提供する。このような薬学的に許容される担体もしくは賦形剤の例としては、これに限定されるものではないが、単独でまたは組合わせて、生理食塩水、水性緩衝溶液、ブドウ糖溶液、水、グリセリンおよびエタノール等が含まれる。このような医薬組成物は選ばれる投与ルートに適合させるべきである。
【００７９】
本願発明はまた、本願発明の医薬組成物の１またはそれ以上の成分を充填した１またはそれ以上の容器よりなる、医薬包装物またはキットを提供する。本願発明のＭＴＣＳおよびその断片または誘導体もまた、さらなる他の治療薬と組合わせて用いることができる。
【００８０】
本願発明の医薬組成物は、ヒトの患者のような哺乳類に種々の投与ルート例えば、経口、局所、静脈内、腸管内、筋肉内、腫瘍内、皮下、鼻内または皮内投与などで投与することができる。この医薬組成物の有効量は、病気や体調の本質に基き、特定の病気や体調の治療または予防おいて使用するのに必要なものである。本願発明のＭＴＣＳの適切な用量は天然のＴＣＳの有効量を参考にして決定することができる。
【００８１】
【実施例】
以下に実施例を示すが、本発明を限定することを意図するものではない。
【００８２】
実 施 例 １
この実施例は、ＴＣＳ遺伝子の部位特異的突然変異誘発および成熟天然ＴＣＳのｃＤＮＡのクローニングを説明する。
当業者にとって、天然ＴＣＳの遺伝子は下記の標準的な方法すなわち、天然ＴＣＳ蛋白をプローブとして用いて▲かつ▼楼のｃＤＮＡライブラリーから単離することにより（Ｓｈａｗ ＰＣ，Ｙｕｎｇ ＭＨ，Ｚｈｕ ＲＨ， Ｈｏ ＷＫ， Ｎｇ ＴＢ， Ｙｅｕｎｇ ＨＷ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ ｃＤＮＡ ａｎｄ ｉｔｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ， Ｇｅｎｅ， ９７（２）：２６７−７２，１９９１）、適切にデザインされたＤＮＡをプローブとして用いて▲かつ▼楼のゲノミックＤＮＡライブラリーから単離することにより（Ｃｈｏｗ ＴＰ， Ｆｅｌｄｍａｎ ＲＡ， Ｌｏｖｅｔｔ Ｍ， Ｐｉａｔａｋ Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ Ｇｅｎｅ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ａｌｐｈａ−ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ， ａ Ｔｙｐｅ Ｉ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５ （１５）： ８６７０−８６７４， １９９０）、または適切にデザインされたプライマーを用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）により（Ｎｉｅ ＨＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ Ｇｅｎｅ， Ｔｈｅ ４ｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｇｅｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｈａｉｋｏｕ， Ａ−２３，１９９９１）容易に得ることができる。
【００８３】
シグナルペプチドおよびテイルペプチドを含有しているＴＣＳプレプロ蛋白のｃＤＮＡ（配列を図１に示す）の部位特異的変異を、変異原プライマーＩおよびＩＩを用い、成熟天然ＴＣＳをコードするＤＮＡ配列の５’末端の前に開始コドンを構築し、３’末端の後に終止コドンを構築する方法で行った。成熟天然ＴＣＳをコードするＤＮＡは次いで、発現ベクターにクローンした。この実験のために二つの変異原プライマーがデザインされた。
【００８４】
プライマーＩ． ５’ＧＴＧ ＣＡＧ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＴＴ
ＡＧＧ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）
プライマーＩＩ．５’ＡＡＣ ＡＡＴ ＡＴＧ ＧＣＡ ＴＡＧ ＧＡＴ ＣＣＣ
ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＡＣ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）
プライマーＩは、開始コドン（ＡＴＧ）を導入し、成熟天然ＴＣＳの１位にメチオニンを付加するために、制限酵素ＮｃｏＩの認識部位（ＧＧＡＴＣＣ）を含有しているという特徴がある。
プライマーＩＩは、成熟天然ＴＣＳをコードするＤＮＡの３’末端の後に終止コドン（ＴＡＧ）を付加するために、制限酵素ＢａｍＨＩの認識部位（ＧＧＡＴＣＣ）を含有しているという特徴がある。
【００８５】
突然変異は、ビオーラッド社の、Ｍｕｔａ−Ｇｅｎｅ Ｐｈａｇｅｍｉｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（カタログ番号 １７０−３５７６）を用いて行った。手順は、製造会社の指示に従った。変異は配列分析で確認した。詳細は製造会社の指示書を参照されたし。
手短にいうと、この方法は下記の工程からなる。
【００８６】
ウラシル含有鋳型ＤＮＡの抽出
ＴＣＳ プレプロ−蛋白をコードする天然遺伝子を、ファージミドベクター ｐＴＺ−１９Ｕにクローンし、鋳型ＤＮＡとしてｐＴＺ−１９Ｕ−ＴＣＳ’を得た（Ｎｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｉｎ Ｇｅｎｅ， Ｔｈｅ ４ｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｇｅｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｈａｉｋｏｕ，Ａ−２３， １９９１）。クロラムフェニコール含有培地中で生育しているＥ．ｃｏｌｉ．ＣＪ２３６をｐＴＺ−１９Ｕ−ＴＣＳ’で形質転換させ、個々のコロニーを採取するために、アンピシリン含有プレートに塗抹した。ファージミド保持バクテリア細胞をアンピシリン含有培地５０ｍｌ中でＯ．Ｄ６００が約０．３になるまで培養した。次いで、ヘルパーファージ Ｍ１３Ｋ０７を１×１０１０ｐｆｕで培地に加え、通気下、３７℃で１時間培養し、更にカナマイシン ３．５ｍｇを加えた。更に、４ないし６時間培養した後、培地を遠心分離して上澄液をＲＮａｓｅ １００ｕｇと混合して再び３０分培養した。この培養混合物を酢酸アンモニウム／ＰＥＧを用いて氷冷下で３０分沈殿させてから、遠心分離した。析出物を高塩緩衝液２００ｕｌ中で再度けん濁させ、氷上で３０分放置し、再び遠心分離した。次いで、上澄液中のウラシル含有鋳型ＤＮＡを、フェノール、フェノール／クロロホルムおよびクロロホルムで抽出した。最後に、このウラシル含有鋳型ＤＮＡを酢酸アンモニウム／エタノールで−７０℃で再度沈殿させ、７０％エタノールで洗浄して、１０−２０ｕｌのＴＥ緩衝液中で再度けん濁させた。
【００８７】
突然変異原ストランドの合成
上で得られたウラシル含有鋳型ＤＮＡを０．１−０．３ ｐｍｏｌの変異原プライマー、アニーリング緩衝液および水と混合した。この混合物を７０℃に加熱し、次いで４０分間で３０℃まで冷却した。この冷却した混合物を氷浴に入れ、３単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼと１単位のＴ４ ＤＮＡポリメラ−ゼを添加した。この合成混合物を氷上で５分、次いで２５℃で５分、最後に３７℃で９０分培養した。合成反応を停止緩衝液９０ｕｌを加えて終結した。この変異させたＤＮＡを、塩化カルシウムで処理したコンピテント Ｅ． ｃｏｌｉ． ＭＶ１１９０の形質変換に用いた。この形質変換体をアンピシリンプレート上で、３７℃で終夜培養した。数個のコロニーをプレートから採取した。プラスミドＤＮＡは、これらの各コロニーから抽出した。最後に、変異を配列分析で確認した。この実施例においては、該プラスミドＤＮＡはｐＴＺ−１９Ｕ−ＴＣＳであり、５’末端にＮｃｏＩ認識部位を、３’末端にＢａｍＨＩ認識部位を持つ天然のＴＣＳをコードするＤＮＡ配列を含有している。
【００８８】
プライマーＩおよびプライマーＩＩで変異させて得られたプラスミドｐＴＺ−１９Ｕ−ＴＣＳは、更に、実施例２から６において鋳型ＤＮＡとして用いられた。一方、プラスミドｐＴＺ−１９Ｕ−ＴＣＳは、次にＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩを用い、３７℃で２時間、二重消化をした。消化された混合物を低融点アガロースゲル電気泳動に付し、長さ約７５０ｂｐのＴＣＳ遺伝子のＤＮＡ断片を得た。次にこの断片を、Ｔ４ ＤＮＡを用い、前もってＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで二重消化してある発現ベクターｐＥＴ−２ｄと４℃でライゲートし、発現で用いるｐＥＴ−２ｄ−ＴＣＳを得た。
【００８９】
実 施 例 ２
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）をコードするＤＮＡの突然変異およびクローニン
グ：
突然変異はビオ−ラッド社の、Ｍｕｔａ−Ｇｅｎｅ Ｐｈａｇｅｍｉｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いて行った。手順は、製造会社の指示に従った。実施例１で得られたｐＴＺ−１９Ｕ−ＴＣＳを鋳型ＤＮＡとして用いた。変異原プライマーＩＩＩを部位特異的突然変異誘発に用いた。簡単に述べると、Ｅ．ｃｏｌｉ．ＣＪ２３６をｐＴＺ−１９Ｕ−ＴＣＳで形質変換させた。次いで、ウラシル含有鋳型ＤＮＡをヘルパーファージの存在下で抽出した。次に、変異原ストランドを、ウラシル含有鋳型ＤＮＡを変異原プライマーと混合する、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを添加する、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを添加するなどを含む一連の操作で合成した。この変異したＤＮＡをコンピテントＥ．ｃｏｌｉ．ＭＶ１１９０の形質転換に用いた。最後に、突然変異コロニーを採取し、変異を配列分析で確認してｐＴＺ−１９Ｕ−ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）を得た。
【００９０】
変異原プライマーＩＩＩは本実験のためにデザインされた。
プライマーＩＩＩ ５’ＡＡＧ ＣＧＴ ＧＴＴ ＧＡＣ ＧＡＡ ＡＣＣ ＴＴＣ
ＣＴＡ ＣＣＡ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）
プライマーＩＩＩは、天然のＴＣＳの１７７位のＬｙｓをコードするコドンが、Ｇｌｕをコードするコドンに置き換わるという特徴がある。コドンの縮重により、アンダーラインをしたコドンは、Ｇｌｕをコードする他のコドン、すなわちＧＡＧで置き換えることもできる。
【００９１】
こうして得られたｐＴＺ−１９Ｕ−ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）は、次いでＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで二重消化し、ＭＴＣＳ（１７７）をコードするＤＮＡ断片を得た。次いで、この断片を前もってＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで二重消化した発現プラスミドベクターｐＥＴ−２ｄとライゲートして、ｐＥＴ−２ｄ−ＭＴＣＳ（１７７）を得た。
【００９２】
実 施 例 ３
ＭＴＣＳ（２０３）をコードするＤＮＡの突然変異およびクローニング：
突然変異およびクローニングするために、異なった突然変異原プライマーＩＶをデザインし実験に用いた以外は、実施例２に記載した手順に従い、ｐＥＴ−２ｄ−ＭＴＣＳ（２０３）を得た。
突然変異原プライマーＩＶは本実験のためにデザインされた。
プライマーＩＶ ５’ＡＴＴ ＣＡＧ ＡＴＡ ＧＣＧ ＧＧＴ ＡＣＴ ＡＡＴ
ＡＡＴ ＧＧＡ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）
プライマーＩＶは、天然ＴＣＳの２０３位のＳｅｒをコードするコドンをＧｌｙをコードするコドンに置き換えるようにデザインされている。コドンの縮重により、アンダーラインを引いたコドンはＧｌｙをコードする他のコドン、例えばＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧに置き換えることができる。すなわち、Ｇｌｙをコードするコドンには４種の代替があるということである。
【００９３】
実 施 例 ４
ＭＴＣＳ（２３６）をコードするＤＮＡの突然変異およびクローニング：
突然変異およびクローニングするために、異なった突然変異原プライマーＶをデザインし、実験に用いた以外は、実施例２に記載した手順に従い、ｐＥＴ−２ｄ−ＭＴＣＳ（２３６）を得た。
突然変異原プライマーＶは本実験のためにデザインされた。
プライマーＶ ５’ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＣＣ ＴＣＣ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＣＧ
ＴＴＧ ＣＴＧ３’（ＳＥＱＩＤ ＮＯ．７）
プライマーＶは、天然ＴＣＳの２３６位のＡｓｎをコードするコドンをＧｌｙをコードするコドンに置き換えるようにデザインされている。コドンの縮重により、アンダーラインを引いたコドンはＧｌｙをコードする他のコドン、例えばＧＧＡ、ＧＧＧ、ＧＧＴに置き換えることができる。
【００９４】
実 施 例 ５
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）をコードするＤＮＡの突然変異およびクロ
ーニング：
突然変異およびクローニングするために、異なった突然変異原プライマーＩＩＩおよびＩＶをデザインし、実験に用いた以外は、実施例２に記載した手順に従い、ｐＥＴ−２ｄ−ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）を得た。
プライマーＩＩＩ ５’ＡＡＧ ＣＧＴ ＧＴＴ ＧＡＣ ＧＡＡ ＡＣＣ ＴＴＣ
ＣＴＡ ＣＣＡ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）
プライマーＩＶ ５’ＡＴＴ ＣＡＧ ＡＴＡ ＧＣＧ ＧＧＴ ＡＣＴ ＡＡＴ
ＡＡＴ ＧＧＡ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）
プライマーＩＩＩは、天然のＴＣＳの１７７位のＬｙｓをコードするコドンが、Ｇｌｕをコードするコドンに置き換わるという特徴がある。コドンの縮重により、アンダーラインをしたコドンは、Ｇｌｕをコードする他のコドン、すなわちＧＡＧで置き換えることもできる。
プライマーＩＶは、天然ＴＣＳの２０３位のＳｅｒをコードするコドンをＧｌｙをコードするコドンに置き換えるようにデザインされている。コドンの縮重により、アンダーラインを引いたコドンはＧｌｙをコードする他のコドン、例えばＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧに置き換えることができる。
【００９５】
実 施 例 ６
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）をコードするＤＮＡの突然変異お
よびクローニング：
突然変異およびクローニングするために、異なった突然変異原プライマーＩＩＩ、ＩＶおよびＶをデザインし、実験に用いた以外は、実施例２に記載した手順に従い、ｐＥＴ−２ｄ−ＭＴＣＳ（Ｍ１７７、２０３、２３６）を得た。
プライマーＩＩＩ ５’ＡＡＧ ＣＧＴ ＧＴＴ ＧＡＣ ＧＡＡ ＡＣＣ ＴＴＣ
ＣＴＡ ＣＣＡ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）
プライマーＩＶ ５’ＡＴＴ ＣＡＧ ＡＴＡ ＧＣＧ ＧＧＴ ＡＣＴ ＡＡＴ
ＡＡＴ ＧＧＡ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）
プライマーＶ ５’ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＣＣ ＴＣＣ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＣＧ
ＴＴＧ ＣＴＧ３’（ＳＥＱＩＤ ＮＯ．７）
プライマーＩＩＩは、天然のＴＣＳの１７７位のＬｙｓをコードするコドンが、Ｇｌｕをコードするコドンに置き換わるという特徴がある。コドンの縮重により、アンダーラインをしたコドンは、Ｇｌｕをコードする他のコドン、すなわちＧＡＧで置き換えることもできる。
プライマーＩＶは、天然ＴＣＳの２０３位のＳｅｒをコードするコドンをＧｌｙをコードするコドンに置き換えるようにデザインされている。コドンの縮重により、アンダーラインを引いたコドンはＧｌｙをコードする他のコドン、例えばＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧに置き換えることができる。
プライマーＶは、天然ＴＣＳの２３６位のＡｓｎをコードするコドンをＧｌｙをコードするコドンに置き換えるようにデザインされている。コドンを縮重により、アンダーラインを引いたコドンはＧｌｙをコードする他のコドン、例えばＧＧＡ、ＧＧＧ、ＧＧＴに置き換えることができる。
【００９６】
実 施 例 ７
ＴＣＳの発現：
下記の標準手順によって、塩化カルシウムで処理したコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐｌｙｓＳ）を、実施例１で得たＴＣＳ遺伝子を含有するプラスミドｐＥＴ−２ｄ−ＴＣＳで形質転換した。要約すると、１−１００ｎｇのｐＥＴ−２ｄ−ＴＣＳを、１００ｕｌのコンピテント細胞と静かに混合した。３０ないし６０分氷の上で保持した後、混合物に４２℃で９０秒熱ショックを与え、次いで氷に戻した。５分後、混合物に０．５ｍｌのＬＢ培地を加え、次いで３７℃で１時間通気下で培養した。培養した混合物の１０分の１を０．１ｍｌのＬＢ培地で希釈し、アンピシリンおよびクロラムフェニコールを含有するＢプレートに広げた。これらのプレートを３７℃で終夜培養し、個々のコロニーを均一の大きさ、形で採取した。形質転換体を、アンピシリンおよびクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地で３７℃で終夜培養し、次いで更に大きなスケールで、アンピシリンおよびクロラムフェニコールを含有するＭ９ＺＢ培地中、同温度で、細胞濃度がＡ５７０＝０．８になるまで培養した。次いで、ＩＰＴＧを最終濃度が０．５ｍＭになるまで加え、細胞を更に３時間培養した。次に、細胞を集め、超音波で溶菌した。溶解液を遠心分離し上澄液をＣＭセファデックスまたはＣＭセファロースのカラムにかけた。カラムを０．１ｍＭのフェニルメタンスルフォニルフロライド（ＰＭＳＦ）を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で、Ａ２８０が基底値になるまで洗浄した後、洗浄緩衝液に０．１−０．４Ｍ食塩を加えた溶液を用いる線型濃度勾配法で溶出した。最も高いピーク中の物質がリコンビナントＴＣＳを示した。リコンビナントＴＣＳのアミノ酸配列は図１中の１位にＭｅｔが付加した１から２４７のアミノ酸残基で示される。
【００９７】
実 施 例 ８
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）の発現：
実施例２で得られたＭＴＣＳ（Ｍ１７７）をコードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＴ−２ｄ−ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐｌｙｓＳ）の形質転換に用いた。実施例７に記載された手順に従って、遺伝子の形質転換、発現およびタンパク質を精製を行い、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）を得た。ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）のアミノ酸配列は、１７７位のＬｙｓがＧｌｕに置き換わった以外は実施例７のリコンビナントＴＣＳと同一である。
【００９８】
実 施 例 ９
ＭＴＣＳ（Ｍ２０３）の発現：
実施例３で得られたＭＴＣＳ（Ｍ２０３）をコードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＴ−２ｄ−ＭＴＣＳ（Ｍ２０３）をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐｌｙｓＳ）の形質転換に用いた。実施例７に記載された手順に従って、遺伝子の形質転換、発現およびタンパク質を精製を行い、ＭＴＣＳ（Ｍ２０３）を得た。ＭＴＣＳ（Ｍ２０３）のアミノ酸配列は、２０３位のＳｅｒがＧｌｙに置き換わった以外は実施例７のリコンビナントＴＣＳと同一である。
【００９９】
実 施 例 １０
ＭＴＣＳ（Ｍ２３６）の発現：
実施例４で得られたＭＴＣＳ（Ｍ２３６）をコードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＴ−２ｄ−ＭＴＣＳ（Ｍ２３６）をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐｌｙｓＳ）の形質転換に用いた。実施例７に記載された手順に従って、遺伝子の形質転換、発現およびタンパク質を精製を行い、ＭＴＣＳ（Ｍ２３６）を得た。ＭＴＣＳ（Ｍ２３６）のアミノ酸配列は、２６３位のＡｓｎがＧｌｙに置き換わった以外は実施例７のリコンビナントＴＣＳと同一である。
【０１００】
実 施 例 １１
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）の発現：
実施例５で得られたＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）をコードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＴ−２ｄ−ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐｌｙｓＳ）の形質転換に用いた。実施例７に記載された手順に従って、遺伝子の形質転換、発現およびタンパク質を精製を行い、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）を得た。ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）のアミノ酸配列は、１７７位のＬｙｓがＧｌｕに、２０３位のＳｅｒがＧｌｙに置き換わった以外は実施例７のリコンビナントＴＣＳと同一である。
【０１０１】
実 施 例 １２
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）の発現：
実施例６で得られたＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）をコードするＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＴ−２ｄ−ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐｌｙｓＳ）の形質転換に用いた。実施例７に記載された手順に従って、遺伝子の形質転換、発現およびタンパク質を精製を行い、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）を得た。ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）のアミノ酸配列は、１７７位のＬｙｓがＧｌｕに、２０３位のＳｅｒがＧｌｙに、２３６位のＡｓｎがＧｌｙに置き換わった以外は実施例７のリコンビナントＴＣＳと同一である。
【０１０２】
実 施 例 １３
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）の生物活性および免疫反応性の試験：
ＲＩＰ活性はＰｅｌｈｅｍ ＆Ｊａｃｋｓｏｎの記載によって決定した（Ｈ． Ｋ． Ｂ． Ｐｅｌｈｅｍ ａｎｄ Ｒ． Ｊ． Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６７： ２４７−２５６． １９７６）。ウサギ網状赤血球の溶解物はプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から入手した。［３Ｈ］−ロイシンはニュウー イングランド ヌクレアー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）から入手した。人工流産活性試験は本発明者らの研究室の標準手順に従って、妊娠１１日のＩＣＲマウスを用いて行われた （Ｎｉｅ ＨＬ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｏｓｉｔｉｏｎ １２０−１２３， ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｃｔｉｖｅ Ｓｉｔｅ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ６２ （６）： ４９１−５００， １９９８）。動物は、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）の７５ｎｍｏｌ／Ｋｇを背部に注射で投与した４８時間後に屠殺し、解剖した。総数および死亡した胎児数（吸着胚を含む）を記録し、胎児死亡比を計算した。
【０１０３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ 免疫反応性は競合ＥＬＩＳＡ法で測定した。ＩｇＧ抗体および抗ＩｇＥモノクローナル抗体は本願発明者らの研究室で作成、精製した（Ｈｅ ＸＨ， ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ， ２６：６５７−６６２， １９９４）。抗体はイムノアフィニティークロマトグラフィーで精製した。本実施例に記載された全ての試験で天然ＴＣＳを陽性コントロールとして用いた。結果を表７に掲載する。
【０１０４】
【表７】
実 施 例 １４
ＭＴＣＳ（Ｍ２０３）の生物活性および免疫反応性の試験：
実施例１３に記載されたのと同じ方法を、ＭＴＣＳ（Ｍ２０３）のＲＩＰ活性、人工流産活性および ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫反応性を決定するために用いた。本試験の全てで、天然ＴＣＳを陽性コントロールとして用いた。結果を８に掲載する。
【０１０６】
【表８】
実 施 例 １５
ＭＴＣＳ（Ｍ２３６）の生物活性および免疫反応性の試験：
実施例１３に記載されたのと同じ方法を、ＭＴＣＳ（Ｍ２３６）のＲＩＰ活性、人工流産活性および ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫反応性を決定するために用いた。本試験の全てで、天然ＴＣＳを陽性コントロールとして用いた。結果を９に掲載する。
【０１０８】
【表９】
実 施 例 １６
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）の生物活性および免疫反応性の試験：
実施例１３に記載されたのと同じ方法を、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７， ２０３）のＲＩＰ活性、人工流産活性および ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫反応性を決定するために用いた。本試験の全てで、天然ＴＣＳを陽性コントロールとして用いた。結果を１０に掲載する。
【０１１０】
【表１０】
実 施 例 １７
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）の生物活性および免疫反応性の
試験：
実施例１３に記載されたのと同じ方法を、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）のＲＩＰ活性、人工流産活性および ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫反応性を決定するために用いた。本試験の全てで、天然ＴＣＳを陽性コントロールとして用いた。結果を１１に掲載する。
【０１１２】
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）の生物活性および免疫反応性の試験
【表１１】
実 施 例 １８
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）のＫ５６２細胞に対する毒性：
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）のヒト慢性骨髄性白血病Ｋ５６２細胞およびヒト正常リンパ球に対する毒性を、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチル−チアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル テトラゾリウム ブロマイド）細胞毒性試験を行うことにより試験した。１０％牛胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で成育中の約２００，０００個の各タイプの細胞を、それぞれ培養プレートのウェルに３７℃、５％ＣＯ２で接種し、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）と培養した。ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）の濃度は、それぞれ１、５、１０、２０、５０および１００ｕｇ／ｍｌである。試験は、４８時間後に２５ｕｌのＭＴＴ（シグマ社製、５ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加して終結させ、さらに２時間培養し、最後にライジング緩衝液を各ウェルに添加し、細胞を溶解した。３７℃で終夜培養した後、プレートを分光学的に、５７０ｎｍで測定した。ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）のＫ５６２細胞に対するＬＣ５０は、３０ｕｇ／ｍｌより少ないと算出された。ヒト正常リンパ球は、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）の濃度が１０００ｕｇ／ｍｌのように高いときでもＬＣ５０値を得られなかったので、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７）に対して感受性がなかった。
【０１１４】
実 施 例 １９
ＭＴＣＳ（Ｍ２０３）のＫ５６２細胞に対する毒性：
実施例１８に記載されたのと同じ方法を、ＭＴＣＳ（Ｍ２０３）のヒト慢性骨髄性白血病Ｋ５６２細胞およびヒト正常リンパ球に対する毒性を測定するために用いた。ＭＴＣＳ（Ｍ２０３）のＫ５６２細胞に対するＬＣ５０は３０ｕｇ／ｍｌより少ないと算出された。ヒト正常リンパ球は、ＭＴＣＳ（Ｍ２０３）の濃度が１０００ｕｇ／ｍｌのように高いときでもＩＣ５０値を得られなかったので、ＭＴＣＳ（Ｍ２０３）に対して感受性がなかった。
【０１１５】
実 施 例 ２０
ＭＴＣＳ（Ｍ２３６）のＫ５６２細胞に対する毒性：
実施例１８に記載されたのと同じ方法を、ＭＴＣＳ（Ｍ２３６）のヒト慢性骨髄性白血病Ｋ５６２細胞およびヒト正常リンパ球に対する毒性を測定するために用いた。ＭＴＣＳ（Ｍ２０３）のＫ５６２細胞に対するＬＣ５０は３０ｕｇ／ｍｌより少ないと算出された。ヒト正常リンパ球は、ＭＴＣＳ（Ｍ２３６）の濃度が１０００ｕｇ／ｍｌのように高いときでもＩＣ５０値を得られなかったので、ＭＴＣＳ（Ｍ２３６）に対して感受性がなかった。
【０１１６】
実 施 例 ２１
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）のＫ５６２細胞に対する毒性：
実施例１８に記載されたのと同じ方法を、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）のヒト慢性骨髄性白血病Ｋ５６２細胞およびヒト正常リンパ球に対する毒性を測定するために用いた。ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）のＫ５６２細胞に対するＬＣ５０は３０ｕｇ／ｍｌより少ないと算出された。ヒト正常リンパ球は、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）の濃度が１０００ｕｇ／ｍｌのように高いときでもＩＣ５０値を得られなかったので、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３）に対して感受性がなかった。
【０１１７】
実 施 例 ２２
ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）のＫ５６２細胞に対する毒性：
実施例１８に記載されたのと同じ方法を、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）のヒト慢性骨髄性白血病Ｋ５６２細胞およびヒト正常リンパ球に対する毒性を測定するために用いた。ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）のＫ５６２細胞に対するＬＣ５０は３０ｕｇ／ｍｌより少ないと算出された。ヒト正常リンパ球は、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）の濃度が１０００ｕｇ／ｍｌのように高いときでもＩＣ５０値を得られなかったので、ＭＴＣＳ（Ｍ１７７，２０３，２３６）に対して感受性がなかった。
【０１１８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】天然ＴＣＳのアミノ酸配列（配列表中の配列番号１）およびこれをコードする塩基配列（配列表中の配列番号２）を示す。第１から２４７位の部分は成熟天然ＴＣＳのアミノ酸配列を示す。
Claims (21)
- 天然の天花粉（ＴＣＳ）アミノ酸配列の、アミノ酸残基の１７４−１８０、２０３−２２６、２３０−２４４番目の３つの領域のうち、少なくとも一つのアミノ酸残基が改変されているアミノ酸配列を含む低抗原性変異天花粉蛋白または上記改変を含み実質的に天然天花粉蛋白の生物活性を保有する上記変異天花粉蛋白の断片または誘導体である低抗原性変異天花粉蛋白（ＭＴＣＳ）。
- 改変が、欠失、挿入、付加、置換および化学改変からなる群より選ばれるものである、請求項１記載の変異蛋白、その断片またはその誘導体。
- 置換が、親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸で置換、疎水性アミノ酸を親水性アミノ酸で置換、酸性アミノ酸を塩基性アミノ酸で置換および塩基性アミノ酸を酸性アミノ酸で置換する群から選ばれるものである、請求項２記載の変異蛋白、その断片またはその誘導体。
- 改変が、改変がなされたアミノ酸部位の電荷の変化を引き起こすものである、請求項１記載の変異蛋白、その断片またはその誘導体。
- １７４位のアルギニン、１７７位のリジン、２２２位のアルギニンおよび２４３位のアルギニンよりなる群から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸残基ががそれぞれグルタミン酸、アスパラギン酸又はグリシンで置換されたものである、請求項１記載の変異蛋白、その断片またはその誘導体。
- １７６位のアスパラギン酸、２０５位のアスパラギン、２０６位のアスパラギン、２０８位のグルタミン、２１０位のグルタミン酸、２１７位のアスパラギン、２１９位のグルタミン、２２０位のアスパラギン、２２１位のグルタミン、２３６位のアスパラギン、２４２位のアスパラギンおよび２４４位のアスパラギンからなる群から選ばれる少なくとも１つが、それぞれ独立にリジンまたはグリシンで置換されたものである、請求項１記載の変異蛋白、その断片またはその誘導体。
- １７８位のスレオニン、２０３位のセリン、２０４位のスレオニン、２１１位のセリン、２２４位のスレオニン、２２６位のスレオニン、２３４位のスレオニンおよび２３５位のセリンよりなる群から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基がそれぞれ独立にグリシンまたはアラニンで置換されたものである、請求項１記載の変異蛋白、その断片またはその誘導体。
- １７５位のバリン、１７９位のフェニルアラニン、１８０位のロイシン、２０７位のグリシン、２０９位のフェニルアラニン、２１２位のプロリン、２１３位のバリン、２１４位のバリン、２１５位のバリン、２２３位のバリン、２１６位のイソロイシン、２２５位のイソロイシン、２１８位のアラニン、２３０位のアラニン、２３８位のアラニン、２３１位のグリシン、２３２位のバリン、２３３位のバリン、２３７位のイソロイシン、２３９位のロイシン、２４０位のロイシンおよび２４１位のロイシンからなる群から選ばれる少なくとも一つのアミノ酸残基が独立に欠失している、請求項１記載の変異蛋白、その断片またはその誘導体。
- ３領域のうちの２または３領域中で、少なくとも１つのアミノ酸残基が改変されている、請求項１記載の変異蛋白、その断片またはその誘導体。
- １７７位のリジンがグルタミン酸で置換され、２０３位のセリンがグリシンで置換されている、請求項９記載の変異蛋白、その断片またはその誘導体。
- １７７位のリジンがグルタミン酸で置換され、２０３位のセリンがグリシンで置換され、２３６位のアスパラギンがグリシンで置換されている、請求項９記載の変異蛋白、その断片またはその誘導体。
- 請求項１ないし１１記載の変異蛋白、その断片またはその誘導体をコードする核酸。
- 請求項１２記載の核酸を含有するベクター。
- 請求項１２記載の核酸または請求項１３記載のベクターによって形質転換された宿主細胞。
- 請求項１４記載の宿主細胞を、前記変異蛋白を発現するための好ましい条件下で培養し、該変異蛋白を該培養物より回収することを特徴とする、請求項１ないし１１記載の変異蛋白、その断片またはその誘導体の製造方法。
- 請求項１ないし１１記載の変異蛋白、その断片またはその誘導体と、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤とを含有する医薬組成物。
- 治療剤としての請求項１ないし１１記載の変異蛋白、その断片またはその誘導体。
- ウイルス性疾患の治療、癌の治療、流産の誘発および／または子宮外妊娠の治療のための医薬を製造するための、請求項１ないし１１記載の変異蛋白、その断片またはその誘導体の使用。
- 該医薬が流産の誘発のためのものである、請求項１８記載の使用。
- 該医薬がエイズの治療のためのものである、請求項１８記載の使用。
- 該医薬が白血病の治療のためのものである、請求項１８記載の使用。
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