ES2534308T3 - Uso de formas solubles de CD83 y ácidos nucleicos que las codifican para el tratamiento o prevención de enfermedades - Google Patents

Abstract

Una proteína CD83 soluble que es una proteína CD83 monomérica en la que uno o más de los restos de cisteína se han sustituido por un resto de aminoácido diferente.

Description

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lac). Cuando se clona en sistemas de células de mamíferos, se pueden utilizar promotores constitutivos tales como SV40, RSV, CMV, entre ellos CMV-IE, y similares, o promotores inducibles procedentes del genoma de las células de mamíferos (p. ej., promotor de la metalotioneína) o de virus de mamíferos (p. ej., la repetición terminal larga del virus del tumor de mama de ratón; el promotor tardío del adenovirus). También pueden utilizarse promotores producidos mediante técnicas sintéticas o de ADN recombinante para garantizar la transcripción de las secuencias del ácido nucleico de la invención.

Se pueden construir por ingeniería genética sistemas de expresión de mamíferos mediante el uso de virus recombinantes o elementos víricos para la expresión directa. Por ejemplo, al utilizar vectores de expresión de adenovirus, el ácido nucleico de interés puede estar ligado a un complejo de control de la transcripción/traducción del adenovirus, p. ej., la secuencia del promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Alternativamente, puede utilizarse el promotor 7,5K del virus de la variolovacuna.

De interés particular son los vectores basados en el virus del papiloma bovino (VPB) que tienen la capacidad de replicarse como los elementos extracromosómicos. Poco después de la entrada de un vector extracromosómico en las células de ratón, el vector se replica hasta unas 100 a 200 copias por célula. Dado que la transcripción del ADNc insertado no requiere la integración del plásmido en el cromosoma del hospedador, se produce un nivel alto de expresión. Estos vectores pueden utilizarse para la expresión estable al incluir un marcador de selección en el plásmido, tal como el gen neo, por ejemplo. Alternativamente, el genoma retrovírico puede modificarse para utilizarlo como un vector capaz de introducir y dirigir la expresión del ácido nucleico de interés en las células hospedadoras. También puede conseguirse un nivel alto de expresión mediante el uso de promotores inducibles, que incluyen, pero sin limitarse a ellos, el promotor RA de la metalotioneína y los promotores de choque térmico.

En la levadura pueden utilizarse una serie de vectores que contienen promotores inducibles o constitutivos. Se puede utilizar un promotor de levadura constitutivo, tal como ADH o LEU2, o un promotor inducible, tal como GAL. Alternativamente, se conocen en la técnica y pueden utilizarse una serie de vectores que facilitan la integración de secuencias de ácido nucleico foráneo en un cromosoma de levadura, mediante la recombinación homóloga, por ejemplo.

Un ácido nucleico de interés que codifica una proteína CD83 soluble para el uso de acuerdo con la presente invención se puede insertar en un vector de expresión para la expresión in vitro (p. ej., mediante ensayos de transcripción/traducción in vitro o kits disponibles comercialmente) o se pueden insertar en un vector de expresión que contiene una secuencia promotora que facilita la transcripción y/o traducción en procariotas o eucariotas (p. ej., una célula de insecto) mediante la transferencia de un ácido nucleico apropiado en una célula adecuada. Una célula en la cual se puede propagar un vector y se puede transcribir su ácido nucleico, o se puede expresar un polipéptido codificado, se denomina en la presente memoria una «célula hospedadora».

La terminología también incluye a toda progenie de la célula hospedadora en cuestión. Además, un ácido nucleico de interés de acuerdo con la presente invención puede insertarse en un vector de expresión para la expresión in vivo para una genoterapia somática. Gracias a estos vectores, por ejemplo, vectores retrovíricos, vectores de adenovirus, vectores del virus adenoasociado, vectores de expresión plasmídicos, los ácidos nucleicos de la invención se expresan tras la infección/introducción del vector en la célula dendrítica.

Las células hospedadoras incluyen, pero sin limitarse a ellos, microorganismos tales como bacterias, levadura, insecto y organismos mamíferos. Por ejemplo, bacterias transformadas con ácido nucleico de bacteriófago recombinante, vectores de expresión de ácido nucleico cosmídico o de ácido nucleico plasmídico que contienen un ácido nucleico de interés; levadura transformada con vectores de expresión de levadura recombinante que contienen un ácido nucleico de interés; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión recombinantes de virus (p. ej., virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión plasmídicos recombinantes (p. ej., el plásmido Ti) que contienen un ácido nucleico de interés; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión recombinantes de virus (p. ej., baculovirus) que contienen un ácido nucleico de interés; o sistemas de células animales infectadas con vectores de expresión recombinantes de virus (p. ej., retrovirus, adenovirus, virus de la variolovacuna) que contienen un ácido nucleico de interés o sistemas de células animales transformadas que se modifican genéticamente para la expresión estable.

Para la expresión duradera de la proteína CD83 soluble en las células hospedadoras, se prefiere la expresión estable. Así pues, mediante el uso vectores de expresión que contienen orígenes de replicación víricos, por ejemplo, las células pueden transformarse con un ácido nucleico de interés controlado mediante los elementos de control apropiados (p. ej., secuencias promotoras/potenciadoras, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc). Opcionalmente, el vector de expresión también puede contener un ácido nucleico que codifica un marcador de selección o identificable que confiere resistencia a una presión selectiva, lo que permite identificar las células que tienen el vector, hacerlas crecer y expandirlas. Alternativamente, el marcador de selección puede estar en un segundo vector que se cotransfecta en una célula hospedadora con un primer vector que contiene un polinucleótido de la invención.

Pueden utilizarse una serie de sistemas de selección, que incluyen, pero sin limitarse a ellos, el gen de la timidina

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cinasa del virus del herpes simple, el gen de la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa y los genes de la adenina fosforribosiltransferasa en células tk-, hgprt o aprt, respectivamente. Adicionalmente, puede utilizarse la resistencia a los antimetabolitos como base para la selección del gen dhfr, que confiere resistencia al metotrexato; del gen gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico; del gen de la neomicina, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418; y del gen de la higromicina, que confiere resistencia a la higromicina. Se han descrito otros genes de selección, a saber, trpB, que permite que las células utilicen el indol en lugar de triptófano; hisD, que permite que las células usen histinol en vez de histidina; y ODC (ornitina descarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor de la ornitina descarboxilasa , la 2-(dlfluorometil)-DL-ornitina, DFMO.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «transformación» significa un cambio genético en una célula después de que se haya incorporado el ADN exógeno en la célula. Así pues, una «célula transformada» es una célula en la cual (o en cuya progenie) se ha introducido una molécula de ADN por medio de técnicas de ADN recombinante.

La transformación de una célula hospedadora con ADN puede llevarse a cabo mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, cuando la célula hospedadora es eucariota, los métodos de transformación de ADN incluyen, por ejemplo, coprecipitación con fosfato de calcio, procedimientos mecánicos convencionales tales como microinyección, electroporación, inserción de un plásmido encapsulado en liposomas, y vectores víricos. Las células eucariotas también pueden cotransformarse con secuencias de ADN que codifican un ácido nucleico de interés, y una segunda molécula de ADN foráneo que codifica un fenotipo seleccionable, tal como las descritas en la presente memoria. Otro método es utilizar un vector vírico eucariótico, tal como el virus 40 de simio (SV40) o el virus del papiloma bovino, para infectar transitoriamente o transformar las células eucariotas y expresar la proteína.

Después de la trasformación, puede aislarse la forma soluble de CD83 y purificarla siguiendo los métodos convencionales. Por ejemplo, el lisado preparado a partir de un hospedador (p. ej., bacteria) que la expresa puede purificarse por HPLC, cromatografía de exclusión por tamaños, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad u otra técnica de purificación. Las proteínas sustancialmente puras también pueden obtenerse mediante síntesis química con un sintetizador de péptidos (p. ej., Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA; modelo 430A o similar).

Los compuestos para el uso en la presente invención también incluyen derivados de la proteína CD83 de acuerdo con la presente invención, tal y como está mencionado más arriba, en donde se ha añadido, eliminado, sustituido, insertado o invertido uno o varios aminoácidos siempre y cuando estos derivados permanezcan solubles tal y como está definido más arriba y sean capaces de ocasionar una alteración en la fijación de las células dendríticas a los linfocitos T y/o a los linfocitos B y/o la formación de agrupamientos células dendríticas y linfocitos T tal y como está definido más arriba. También incluye variantes de ayuste de los compuestos de CD83 mencionados hasta ahora.

Adiciones concretas preferidas son aquéllas en donde la proteína CD83 soluble tal y como está definida más arriba tiene uno o más restos de aminoácidos procedentes del dominio intracelular cercano en su extremo carboxilo, preferiblemente, la proteína CD83 soluble comprende los restos de aminoácidos 20 a 145 de la SEQ ID n.º 2; y/o tiene secuencias funcionales unidas a su extremo amino, preferiblemente secuencias funcionales de hasta 10 restos de aminoácidos y, lo más preferiblemente, lleva en el extremo amino los aminoácidos adicionales Gly-Ser-Pro-Gly.

Cuando se sustituyen uno o varios aminoácidos de una forma soluble de un miembro de la familia de proteínas de CD83, se prefiere que uno o varios aminoácidos estén sustituidos conservativamente. Por ejemplo, las sustituciones conservativas incluyen sustituciones en las cuales los restos de aminoácidos alifáticos tales como Met. Ile, Val, Leu

o Ala están sustituidos por otro de ellos. Asimismo, los restos de aminoácidos polares pueden estar sustituidos por otro tal como Lys y Arg, Glu y Asp o Gln y Asn.

La proteína CD83 soluble de las realizaciones (1) y (6) de la invención es una proteína CD83 monomérica en la que uno o más de los restos de cisteína se han sustituido por uno o más restos diferentes de aminoácidos pequeños y/o polares. Preferiblemente los restos de aminoácidos pequeños y/o polares se seleccionan de serina, alanina, glicina, valina, treonina, etc., preferiblemente son serina. Además se prefiere que un resto de cisteína, más preferiblemente el quinto resto de cisteína, se haya sustituido. Lo más preferiblemente la proteína CD83 soluble comprende los restos de aminoácidos del 20 al 144 de la SEQ ID n.º 2, donde el resto de cisteína de la posición 129 se ha reemplazado por un resto de serina, o los restos de aminoácidos del 1 al 130 de la SEQ ID n.º 10. Las moléculas monoméricas definidas poseen particular importancia para aplicaciones farmacéuticas.

De acuerdo con la invención, los derivados de una forma soluble de un miembro de la familia de proteínas de CD83 también incluyen derivados en los cuales uno o más de los aminoácidos que contiene, tiene una cadena lateral alterada. Tales polipéptidos derivados incluyen, por ejemplo, los que comprenden aminoácidos en los cuales los grupos amino libres forman hidrocloruros de amina, grupos sulfonilo de p-tolueno, grupos carobenzoxi; los grupos carboxi libres forman sales, ésteres de metilo y ésteres de etilo; los grupos hidroxi libres que forman derivados de Oacilo u O-alquilo así como derivados de aminoácidos que se producen de forma natural, por ejemplo, 4-hidroxiprolina para la prolina, 5-hidroxilisina para la lisina, homoserina para la serina, ornitina para la lisina, etc. También se incluyen derivados de aminoácidos que pueden alterar los enlaces covalentes, por ejemplo, el puente disulfuro que

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se forma entre dos restos de cisteína que produce un polipéptido ciclado.

Una forma soluble de un miembro de la familia de proteínas de CD83 o derivados de la misma puede tener un patrón de glucosilación nativo de una molécula de CD83 o un patrón de glucosilación alterado o puede no estar glucosilada siempre y cuando estas moléculas sean solubles tal y como está definido más arriba y sean capaces de ocasionar una alteración de la fijación de las células dendríticas a las células dendríticas, a los linfocitos T y/o a los linfocitos B y/o la formación de agrupamientos de células dendríticas y linfocitos T tal y como está definido más arriba.

En una realización preferida, la forma soluble de CD83 para el uso en la presente invención comprende los aminoácidos de la posición 20 a la 144, más preferiblemente los aminoácidos de 20 a 145, de la proteína CD83 humana como está descrito en la SEQ ID n.º 2 o los aminoácidos 1 a 130 de la SEQ ID n.º 8.

En otra realización preferida más, la forma soluble de CD83 para el uso en la presente invención comprende los aminoácidos de las posiciones 22 a la 135 de la proteína de ratón HB15 tal y como está descrito en la SEQ ID n.º 4.

La presente invención también se refiere al uso de un ácido nucleico o un vector de expresión que codifica una forma soluble de un miembro de la familia de proteínas de CD83 o un derivado de tal proteína para producir un medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o afección médica ocasionada por la disfunción

o el funcionamiento indeseado de una respuesta inmunitaria celular en la que intervienen las células dendríticas, los linfocitos T y/o los linfocitos B.

Los ácidos nucleicos para utilización en la presente invención tal como los descritos más arriba pueden ser en forma de ADN (ácido desoxirribonucleico) que contiene las bases adenina, timina, guanina y citosina, o de ARN (ácido ribonucleico) que contiene las bases adenina, uracilo, guanina y citosina, o mezclas de los dos.

Cuando la molécula de ácido nucleico para utilización en la invención procede de la proteína CD83 de humano, la porción de la región codificante es preferiblemente del nucleótido 58 al 432 de la secuencia de SEQ ID n.º 1. Alternativamente, la porción de la región codificante es del nucleótido 58 al 435 de la secuencia de SEQ ID n.º 1.

Cuando la molécula de ácido nucleico para utilización en la invención procede de la proteína HB15 de ratón, la porción de la región codificante es preferiblemente desde aproximadamente el nucleótido 76 al 418 de la secuencia de SEQ ID n.º 3.

Un ácido nucleico que codifica una proteína para utilización de acuerdo con la invención puede estar insertado en un vector. La terminología «vector» se refiere a un plásmido, virus u otro vehículo conocido en la técnica que puede manipularse mediante la inserción o incorporación de un polinucleótido. Tales vectores pueden utilizarse para la manipulación genética (a saber, «vectores de clonación») o pueden utilizarse para transcribir o traducir el polinucleótido insertado («vectores de expresión»). Un vector contiene por lo general al menos un origen de replicación para la propagación en una célula y un promotor. Los elementos de control, que incluyen los elementos de control de la expresión que se exponen en la presente memoria, presentes dentro de un vector de expresión, se incluyen para facilitar la transcripción y traducción correctas (p. ej., señal de ayuste para los intrones, mantenimiento del marco de lectura correcto del gen para permitir la traducción en fase del ARNm, y codones de parada, etc.). La terminología «elemento de control» pretende incluir, como mínimo, uno o más componentes cuya presencia puede influir en la expresión, y puede también incluir otros componentes, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de compañero de fusión.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «elemento de control de la expresión» se refiere a una

o varias secuencias de ácido nucleico que regulan la expresión de una secuencia de ácido nucleico a la cual están unidas operativamente. Un elemento de control de la expresión unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico controla la transcripción y, según sea necesario, la traducción de la secuencia de ácido nucleico. Así pues, un elemento de control de la expresión puede incluir, según sea necesario, promotores, potenciadores, terminadores de la transcripción, un codón de inicio (p. ej., ATG) al frente de un gen que codifica una proteína. «Unido operativamente» se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes así descritos se encuentran en una relación que les permite funcionar de la forma en la que fueron diseñados.

Mediante «promotor» se hace referencia a una secuencia mínima suficiente para dirigir la transcripción. Tanto los promotores constitutivos como los inducibles están incluidos en la invención (véase p. ej., Bitter et al., Methods in Enzymology 153: 516-544, 1987). Los promotores inducibles son activados por señales o agentes externos. También están incluidos en la invención los elementos promotores que son suficientes para que la expresión génica dependiente del promotor se pueda controlar específicamente según los tipos celulares, tejidos o condiciones fisiológicas; tales elementos pueden estar localizados en 5', en 3' o en las regiones intrónicas del gen. Los promotores útiles en la invención también incluyen los promotores condicionales. Un «promotor condicional» es un promotor que es activo sólo en determinadas condiciones. Por ejemplo, el promotor puede estar inactivo o reprimido cuando está presente un agente particular, tal como un compuesto químico. Cuando el agente ya no está presente, la transcripción se activa o deja de estar reprimida. Se puede insertar un ácido nucleico de interés según la presente invención en un vector de expresión para la expresión in vivo para terapia génica somática. Con estos vectores, por

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como por ejemplo derivados de polivinilpirrolidona y celulosa.

Para la aplicación convencional en la piel o también en la membrana mucosa, cabe nombrar las emulsiones normales, geles, ungüentos, cremas o sistemas de emulsión anfipática y/o de fases mixtas (mezcla de fases aceite/agua o agua/aceite) así como liposomas y transferosomas. A modo de adyuvantes y/o vehículos, son adecuados el alginato de sodio como un formador de gel para la producción de una base adecuada o derivados de celulosa, tal como por ejemplo goma guar o goma de xanteno, formadores de gel inorgánico, tales como por ejemplo hidróxidos de aluminio o bentonitas (también denominado formador de gel tixotrópico), derivados de ácido poliacrílico, tales como por ejemplo Carbopol®, polivinilpirrolidona, celulosa microcristalina o carboximetilcelulosa. Además, son adecuados los compuestos de masa molecular baja y alta anfipáticos así como los fosfolípidos. Los geles pueden estar presentes bien como hidrogeles a base de agua o como organogeles hidrófobos, por ejemplo, a base de mezclas de hidrocarburos parafínicos y vaselina de baja y alta masa molecular.

Se pueden emplear tensioactivos aniónicos, catiónicos o neutros como emulsionantes, por ejemplo, jabones alcalinizados, detergentes metílicos, detergentes amínicos, compuestos sulfonatados, detergentes catiónicos, alcoholes grasos altos, ésteres parciales de ácidos grasos de sorbitano y de polioxietilensorbitano, por ejemplo, tipos de Lanette, cera de la lana, lanolina u otros productos sintéticos para producir emulsiones de aceite/agua y/o agua/aceite.

Se pueden formular organogeles hidrófilos, por ejemplo, a base de polietilenglicoles de alta masa molecular. Estas formas de tipo gel son lavables. La vaselina, las ceras naturales o sintéticas, los ácidos grasos, alcoholes grasos, ésteres de ácidos grasos, por ejemplo, como mono-, di-o triglicéridos, aceite de parafina o aceites vegetales, aceites de ricino o aceite de coco endurecidos, grasa de cerdo, grasas sintéticas, por ejemplo a base de ácido acrílico, caprínico, láurico y estárico, tal como por ejemplo Softisan® o mezclas de triglicéridos tal como Miglyol® se emplean como lípidos en forma de grasa y/o aceite y/o componentes de tipo cera para producir ungüentos, cremas o emulsiones.

Para ajustar el valor del pH se utilizan los ácidos y las bases osmóticamente eficaces, tales como por ejemplo ácido clorhídrico, ácido cítrico, solución de hidróxido de sodio, solución de hidróxido de potasio, carbonato de monosodio, otros sistemas tamponantes, tales como por ejemplo citrato, fosfato, tampón Tris o trietanolamina. Para incrementar la estabilidad se pueden añadir conservantes tal como, por ejemplo, benzoato de metilo o de propilo (parabenos) o el ácido sórbico.

Las pastas, polvos o soluciones se deben mencionar como otras formas de aplicación tópica. Las pastas a menudo contienen agentes auxiliares lipófilos e hidrófilos con cantidades muy altas de materia grasa como base para dar consistencia. Los polvos o los polvos aplicables por vía tópica pueden contener, por ejemplo, variedades de almidón tales como almidón de trigo o arroz, dióxido de silicona o sílice apagallamas, que también sirven como diluyentes, para incrementar la fluidez así como la lubricidad y también para impedir que se formen aglomerados.

Las gotas nasales o pulverizadores nasales sirven como formas de aplicación nasal. En este sentido, pueden utilizarse los nebulizadores o cremas o ungüentos nasales.

Además, los pulverizadores nasales o las formulaciones de polvo seco así como los aerosoles de dosificación controlada también son adecuados para la administración sistémica de los compuestos de la presente invención.

Estos aerosoles con dosis controlada y/o por presión y formulaciones de polvo seco pueden inhalarse y/o insuflarse. Las formas de administración de este tipo desde luego que también tienen importancia para la aplicación directa y regional en el pulmón o los bronquios y la laringe. En consecuencia, las composiciones de polvo seco se pueden formular, por ejemplo, como microesferas blandas con los compuestos de la invención, como una mezcla de microesferas con los compuestos de la invención con los vehículos adecuados, tales como por ejemplo lactosa y/o glucosa. Para la inhalación o insuflación, los aplicadores habituales que son adecuados son los adecuados para el tratamiento de la nariz, boca y/o faringe. Los compuestos de la presente invención también pueden aplicarse por medio de un dispositivo nebulizador ultrasónico. Como gas propelente para las formulaciones de pulverizador en aerosol y/o aerosoles de dosificación controlada, son adecuados el tetrafluoroetano o HFC 134a y/o el heptafluoropropano o HFC 227, en donde se pueden preferir los hidrocarburos sin fluorar u otros propelentes que son gaseosos a la presión normal y la temperatura ambiente, tal como por ejemplo propano, butano o dimetiléter. En vez de aerosoles de dosificación controlada, también pueden utilizarse los sistemas manuales con bomba libres de propelentes.

Los aerosoles con gas propelente también pueden contener convenientemente adyuvantes tensioactivos, tales como por ejemplo miristato de isopropilo, éster de ácido graso con polioxietilensorbitano, trioleato de sorbitano, lecitinas o lecitina de soja.

Además, cuando la composición farmacéutica comprende un ácido nucleico para el uso en la invención para la administración a determinadas especies de animales, el ácido nucleico para uso en la invención procede preferiblemente de esa especie. Por ejemplo, cuando la composición farmacéutica se debe administrar a humanos, el ácido nucleico de la sustancia farmacéutica preferiblemente comprende la forma soluble de la proteína CD83

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humana o un derivado de la misma.

Los ácidos nucleicos para el uso en la invención pueden administrarse junto con agentes que incrementan la permeabilidad de la membrana celular y/o la captación celular de los ácidos nucleicos. Ejemplos de estos agentes son las poliaminas como se describe, por ejemplo, en Antony T. et al. (1999) Biochemistry 38: 10775-10784; poliaminas ramificadas como se describe, por ejemplo, en Escriou, V. et al. (1998) Biochem. Biophys. Acta 1368(2): 276-288; poliaminolípidos como los que se describen, por ejemplo, en Guy-Caffey, J. K. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(52): 31391-31396; DOTMA como se describe en Feigner, P. L. et al. (1987) PNAS USA 84 (21): 7413-7417 y porfirinas catiónicas como se describe, por ejemplo, en Benimetskaya, L. et al. (1988) NAR 26(23): 5310-5317.

La CD83 soluble anteriormente definida es adecuada para preparar anticuerpos (policlonales o monoclonales) contra CD83. Los anticuerpos se pueden preparar según métodos estándar conocidos en la técnica. Estos anticuerpos son útiles específicamente en métodos de ensayo para determinar enfermedades correlacionadas con un presencia aumentada de la proteína CD83 soluble en el suero del paciente, preferiblemente el método para determinar en un paciente tumores, enfermedades autoinmunes, infecciones virales, etc., incluyendo leucemia de linfocitos B.

Empleando un ensayo Elisa se detectó CD83 soluble a una concentración de aproximadamente 0,25 ng/ml (+/-0,25 ng/ml) en individuos sanos. Sorprendentemente, en pacientes con tumores se detectaron concentraciones de hasta 15 ng/ml. Así, este ensayo podría tener valor tanto para diagnóstico como para pronóstico en pacientes con tumores. Y también para pacientes que padezcan trastornos autoinmunes, alergias e infecciones virales, bacterianas y/o parasitarias.

A continuación se describen más detalladamente diferentes aspectos de la invención por medio de ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Expresión recombinante en Escherichia coli del dominio extracelular de la CD83 humana.

Utilizando de plantilla un clon de ADNc humano de longitud completa se amplificó por PCR el dominio extracelular de CD83 (condiciones de la PCR: 1 ciclo de 1 min a 94 ºC; 30 ciclos, en donde cada uno consiste en 1 min a 94 ºC

El fragmento de ADNc amplificado se clonó entre los sitios SmaI y EcoRI del vector de expresión pGEX2T (Amersham Pharmacia Biotech, Friburgo, Alemania), lo que dio lugar al plásmido pGEX2ThCD83ext y este plásmido se introdujo por transformación en la cepa de E. coli TOP10F' [F{lacIIQTn10 (TetR} mcrA Δ(mrr-hsd RMS-mcrBC) Φ 80 lacZ, ΔM15 ΔlacX74 recA1 deoR araD139 Δ(ara-leu) 7697 galU galK rpsL(StrR) endA1 nupG] (Invitrogen, Groningen, Países Bajos). La secuencia nucleotídica correcta de pGEX2ThCD83ext se verificó por secuenciación. La CD83 extracelular se expresó como una proteína de fusión que contiene la glutatión S-transferasa como compañero de fusión en el extremo amino. Se insertó un sitio de reconocimiento para la escisión por la trombina entre la GST y el dominio extracelular de CD83 (véase la figura 1).

Ejemplo 2: Purificación de la CD83ext humana recombinante

Cultivo:

Un cultivo bacteriano de una noche de la bacteria mencionada anteriormente se diluyó 1:10 en el medio LB nuevo (complementado con ampicilina a 100 µg/ml) y se hizo crecer a una densidad óptica de 1,0. Se añadió el IPTG (concentración final de 1 mM) y se continuó con el cultivo durante una hora más. Las células se sedimentaron, se resuspendieron en 10 ml de tampón nativo (NaCl a 140 nM, KCl a 2,7 mM, Na2HPO4 a 10 mM, KH2PO4 a 1,8 mM, MnCl2 a 2,6 mM, MgCl2 a 26 mM, leupeptina a 1 μg/ml, aprotinina a 1 μg/ml, ADNasa I a 1 μg/ml, pH 7,6) por cultivo de 500 ml y se le añadió lisozima a 50 μg/ml. Después de una incubación de 15 min en hielo, se centrifugó el lisado a 20.000 x g.

Etapa de captura:

Se añadieron 40 ml del sobrenadante a una columna de 5 ml de GSTrap en un sistema ÄKTA Explorer 10 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) que se equilibró previamente con 4 volúmenes de columna del tampón de fijación: PBS (solución salina tamponada con fosfato), pH 7,6. A continuación se lavó la columna con 12 volúmenes de columna del mismo tampón de fijación y posteriormente se eluyó con 5 volúmenes de columna del tampón de elución: Tris-HCl a 50 mM, pH 8,0 con glutatión reducido a 5 mM a una velocidad de flujo de 5 ml/min. Entonces se trató la columna con 5 volúmenes de columna de NaCl a 2 M/PBS, pH 7,6 y 5 volúmenes de columna del tampón de fijación (figura 2A).

Etapas de purificación intermedias:

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Las fracciones que contienen la GST-CD83ext se dializaron frente a 1-metil-piperazina (Sigma) a 50 mM, Bis-Tris (Sigma) a 50 mM, Tris (Sigma) a 25 mM, pH 9,5 (tampón A) y se cargaron en una columna de intercambio aniónico15Q PE 4.6/100 (Amersham Pharmacia Biotech) en un sistema ÄKTA Explorer 10 (Amersham Pharmacia Biotech). Las proteínas se separaron mediante 3 gradientes salinos lineales diferentes: 16 volúmenes de columna a una concentración esperada del tampón B al 10% (tampón A/NaCl a 1 M); 20 volúmenes de columna a una concentración esperada del tampón B al 50% y 10 volúmenes de columna a una concentración esperada del tampón B al 100% (véase la figura 2B).

Las fracciones con la GST-CD83ext se dializaron frente a PBS, pH 7,6. A continuación, la proteína de fusión GSThCD83ext se incubó con trombina (20 U/ml) en una matriz de glutatión-Sepharose a 22 ºC durante 16 h. Para separar la proteína hCD83ext de GST, esta solución se cargó en columnas de glutatión-Sepharose 4B empaquetadas previamente en las mismas condiciones de tampón que en la etapa de captura. Las fracciones con la proteína CD83ext humana recombinante se recogieron directamente en las condiciones del tampón de fijación. Los resultados se muestran en la figura 2C.

Etapa de acabado final:

Finalmente se realizó una separación de filtración en gel preparativa en la que dicha fracción eluida se depositó en una columna Superdex 200 (26/16) de calidad prep (Amersham Pharmacia Biotech) en un sistema ÄKTA Explorer 10 (Amersham Pharmacia Biotech) con tampón de elución de PBS, pH 7,6, a una velocidad de flujo de 3 ml/min.

Las fracciones correctas se analizaron por tinción con plata, tinción de coomassie y análisis de inmunotransferencia con anti-CD83 (Coulter-Immunotech, Marsella, Francia) (véase la figura 2D).

Liofilización de la CD83 soluble recombinante:

El dominio soluble de la CD83 recombinante que había sido purificado por HPLC se dializó frente a una dilución de

1:20 de DPBS (BioWhittaker Europe). A continuación, esta solución de proteína se congeló en nitrógeno líquido y se liofilizó durante 4 h en un dispositivo de liofilización α 1-2 LD (Christ). La proteína se volvió disolver con ddH2O filtrada por 0,22 µm en un volumen de concentración final de DPBS a 1x.

El análisis por SDS-PAGE reveló que se observaba que la proteína recombinante liofilizada no se degradaba tras este procedimiento, y que de hecho era comparable a la proteína sin liofilizar (figura 2E).

Ejemplo 3: Inhibición de la maduración de las células dendríticas, del agrupamiento de células in vitro y de los experimentos (con humano) por MRL

Cultivo:

A menos que se mencione otra cosa, todas las células se cultivaron en un medio estándar (medio con plasma humano al 1%) que consistía en RPMI 1640 (BioWhittaker, Verviers, Bélgica) complementado con glutamina (200 µg/ml) (BioWhittaker, Veviers, Bélgica), penicilina/estreptomicina (20 µg/ml), Hepes a 10 mM, pH 7,5 (Sigma-Aldrich) y plasma humano inactivado por calor (56 ºC; 30 min) al 1% de un único donante obtenido del Departamento de Transfusiones Médicas, Eriangen, Alemania.

Generación de células dendríticas:

Se aislaron células mononucleadas de la sangre periférica a partir de capas de leucocitos por sedimentación en Ficoll-hypague (Amersham Pharmacia Biotech, Friburgo, Alemania) y se dispusieron en placas de cultivo de 100 mm revestidas con IgG (10 μg/ml de la γ-globulina de la fracción de Cohn; Sigma-Aldrich) y se incubaron a 37 ºC en CO2 al 5%. Tras incubaciones de 1 y 7 h, se recogieron las fracciones celulares no adherentes, y las células adherentes se cultivaron adicionalmente en medio con plasma humano al 1% complementado con las citocinas GM-CSF (800 U/ml) e IL-4 (500 U/ml). El medio nuevo con GM-CSF a una concentración final de 400 U/ml e IL-4 (500 U/ml) se añadió el día 3 del periodo de incubación. Las células no adherentes se recogieron al día 4 o 5, se contaron y se transfirieron a placas nuevas a una densidad de 0,3-0,5 x 105 células/ml. Para la maduración final de las células dendríticas, el medio con plasma humano al 1% se complementó con TNF-α, (1,25 ng/ml), GM-CSF (40 U/ml), IL-4 (200 U/ml), prostaglandina E2 (0,5 μg/ml) (Lechmann, M. et al. (2001) J. Exp. Med. 194: 1813-1821).

La hCD83ext soluble inhibe la maduración de las células dendríticas inmaduras:

Para analizar la influencia de hCD83ext sobre el fenotipo de las células dendríticas, el día 8 se realizó el análisis por FACS (véase la figura 3). Las células dendríticas se pueden hacer madurar completamente con el uso de un cóctel de maduración específico compuesto por IL-1β, TNF-α y PGE2 (figura 3a). Es interesante que cuando este cóctel de maduración se administró el día 5 a las células dendríticas inmaduras junto con la hCD83ext (4 μg/ml) y se dejó hasta el análisis por FACS final el día 8, estas células revelaron una reducción manifiesta de la expresión de CD80 (del 96 al 66%) y de CD83 (del 96 al 30%) en la superficie celular (figura 3c), cuando se compararon con las células dendríticas maduradas con normalidad (figura 3a). Así pues, la hCD83ext induce una reducción de la maduración de las células dendríticas (véase también el incremento de células positivas CD14). En cambio, las células dendríticas

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subcutánea en ambos muslos 50 μl de una suspensión que contiene adyuvante de Freundsch completo (AFC) y glucoproteína de mielina de oligodendrocitos (MOG35-55) el día 0. El mismo día se les inyectó por vía intraperitoneal 100 μl de la toxina pertúsica (2 μg/ml). El día 2 se les administró una segunda dosis de la toxina pertúsica. Aparecieron signos clínicos de parálisis entre los días 10 y 14.

Inhibición de la EAE en un modelo in vivo:

Para analizar la capacidad de hCD83ext para prevenir y suprimir la parálisis asociada a la EAE, se administraron 100 μl de hCD83 (1 μg/1 μl) mediante inyección los días –1, 1 y 3 (véase la figura 6A). Como control, un grupo de ratones recibió una inyección con 100 μl de SAB (1 μg/1 μl). Un tercer grupo de ratones se dejó sin tratar. En los tres grupos de ratones se indujo la EAE el día 0. Sorprendentemente, la hCD83ext casi inhibió completamente la parálisis asociada a la EAE.

Efecto duradero de la inhibición de la EAE:

Se demostró que incluso cuando se induce la EAE una segunda vez, los ratones tratados con la CD83 todavía están protegidos (tres dosis de CD83 soluble protegen a los ratones de la EAE).

La EAE se indujo como está descrito más arriba: se inyectaron (i.p.) 100 μg de hCD83 (o SAB como control) los días –1, 1 y 3. La EAE se indujo el día 0 mediante inyección subcutánea (s.c.) del péptido MOG emulsionado en AFC enriquecido con M. tuberculosis. Además, se les administraron (i.p.) 200 ng de la toxina pertúsica (Pt) los días 0 y 2. La hCD83 inhibió casi completamente la parálisis, mientras que los ratones tratados con SAB y sin tratar desarrollaron fuertes síntomas de la enfermedad (véase la figura 6B; 1.EAE, panel izquierdo). El día 28 se indujo la EAE una segunda vez por inmunización de los ratones con el péptido MOG tal y como está descrito más arriba. Sorprendentemente, sólo estaban completamente protegidos los ratones que habían sido tratados tres veces con la CD83 soluble, mientras que los ratones tratados con la SAB y los ratones sin tratar estaban paralizados (véase la figura 6B; 2.EAE, panel derecho).

Inhibición de la EAE en una aplicación terapéutica:

La EAE se indujo el día 0 tal y como está descrito más arriba mediante inyección subcutánea (s.c.) del péptido MOG emulsionado en AFC enriquecido con M. tuberculosis. Además, se administraron (i.p.) 200 ng de la toxina pertúsica (Pt) los días 0 y el 2. La hCD83ext (100 μg/dosis) se administró 14 veces, en días alternos, desde el día 3 en adelante. Incluso en esta situación terapéutica, la CD83 soluble fue capaz de influir fuertemente en los síntomas de la EAE. La SAB (100 μg/dosis) se utilizó como control negativo (véase la figura 6C).

Ejemplo 6: Producción de anticuerpos monoclonales contra la CD83 humana

Aproximadamente 50 μg de la proteína de fusión GST-hCD83ext se inyectaron por vía intraperitoneal (i.p.) y por vía subcutánea (s.c.) en las ratas LOU/C. Tras un intervalo de 2 meses, se administró i. p. y s.c. un refuerzo final con el antígeno 3 días antes de la fusión. La fusión de la línea celular de mieloma P3X63-Ag8.653 con células inmunitarias del bazo de rata se realizó de acuerdo con el procedimiento estándar. Se analizaron los sobrenadantes de los hibridomas en un inmunoensayo de fase sólida con la proteína GST-hCD83ext adsorbida a las placas de microtitulación de poliestireno. Tras la incubación con sobrenadantes de cultivo durante 1 hora, los anticuerpos monoclonales fijados se detectaron con anticuerpos IgG+IgM antirrata de cabra marcados con peroxidasa (Dianova, Hamburgo, Alemania) y o-fenilendiamina como cromógeno en la reacción de la peroxidasa. Una proteína de fusión irrelevante con GST sirvió de control negativo. El isotipo de la inmunoglobulina de los anticuerpos monoclonales se determinó con anticuerpos monoclonales antirrata biotinilados específicos de la subclase de inmunoglobulina (IgG) (ATCC, Rockville, MD). Los CD83-1G11 (IgG1 de rata) y CD83-4B5 (IgG2a de rata) se utilizaron para el análisis de inmunotransferencia y el análisis por FACS.

Ejemplo 7: Determinación de la CD83 soluble en los pacientes

Con un análisis por ELISA se detectó la CD83 soluble a una concentración de aproximadamente 0,25 ng/ml (± 0,25 ng/ml) en los individuos sanos. Sorprendentemente, en los pacientes con tumores, se detectó una concentración de hasta 15 ng/ml. Así pues, este ensayo podría tener valor diagnóstico y pronóstico para los pacientes con tumores.

Ejemplo 8: hCD83ext es una proteína homodimérica mantenida por puentes disulfuro

La proteína CD83ext humana recombinante purificada por HPLC (la clonación y la expresión están descritas en el ejemplo 1, y la purificación está descrita en el ejemplo 2) se analizó con el sistema SDS-PAGE de Laemmli. Para identificar las posibles formas oligoméricas de CD83 se ha omitido el 2-mercaptoetanol (ME) del tampón de muestra (SDS al 2%, 2-mercaptoetanol (ME) al 5%, glicerol al 10%, EDTA a 0,2 mM, azul de bromofenol al 0,005%, Tris a 62,5 mM, pH 6,8). En ausencia de este reductor, los puentes disulfuro intra-y intercatenarios de CD83 permanecen intactos. Las muestras de proteínas reducidas y sin reducir se incubaron durante 5 min a 95 ºC y se compararon entre sí por SDS-PAGE (véase la figura 7). Durante la electroforesis, la movilidad de las proteínas oligoméricas en SDS es menor que la de sus componentes polipeptídicos totalmente desnaturalizados en SDS. Sin ME, aparece una

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banda superior del tamaño estimado de un dímero de CD83 (aproximadamente 25 kDa), mientras que la banda de CD83 monomérica (aproximadamente 14 kDa) es tenue. El análisis de inmunotransferencia con el anticuerpo CD831G11 anti-CD83 (Lechmann et al., Protein Expression and Purification 24: 445-452 (2 de marzo de 2002)) confirmó la especificidad de las bandas de proteína. Por lo tanto, la hCD83ext es una proteína homodimérica mantenida por puentes disulfuro.

La actividad inhibidora del aislado de la proteína homodimérica mantenida por puentes disulfuro se determinó en los experimentos por MLR descritos en los ejemplos 3 y 4. Se encontró que la actividad inhibidora del homodímero aislado era idéntica a la descrita en los ejemplos 3 y 4.

Ejemplo 9: Generación de una forma mutante de la CD83 soluble

Clonación del mutante de Cys a Ser en la posición 129 de hCD83ext en Escherichia coli

El dominio extracelular mutante de la CD83 humana (aminoácidos 20 a 145) se amplificó por PCR con el conjunto

siguiente de cebadores:

sentido-pGEX2ThCD83: CD83extra_mutantCtoS:

5' -3' y antisentido5'-3'

(MWG-Biotech AG; SEQ ID n.º 11 y 12, respectivamente). El cebador antisentido inserta una transversión de nucleótido de g a c que conduce a un cambio de aminoácido de cisteína a serina en la posición 129 de los aminoácidos (véase la figura 8). Las condiciones de la PCR fueron: etapa de desnaturalización inicial de 5 minutos a 94 ºC, 31 ciclos: desnaturalización de 1 min a 94 ºC, hibridación de 1 min a 61 ºC, elongación de 2 min a 72 ºC; y una etapa final de elongación de 10 min a 72 ºC. El fragmento de ADNc amplificado se subclonó en los sitios SmaI y EcoRI del vector de expresión pGEX2T (Amersham, Pharmacia Biotech), lo que da lugar al plásmido pGEX2ThCD83ext_mut129_CtoS y se introdujo por transformación en la cepa de E. coli TOPO10 (Invitrogen). Se verificó por secuenciación que la secuencia de nucleótidos era la correcta.

Expresión recombinante de la proteína mutante hCD83ext_mut129_CtoS en Escherichia coli

La expresión y purificación del mutante de hCD83ext se realizó tal y como está descrito más arriba para la proteína hCD83ext recombinante:

Un cultivo bacteriano de una noche se diluyó 1:10 en medio LB nuevo (complementado con 100 µg/ml de ampicilina). A una densidad óptica de 0,9 se le añadió IPTG a 1 mM y se continuó con el cultivo durante 1 h más. A continuación se sedimentaron las células y se resuspendieron en 10 ml de tampón nativo (NaCl a 140 mM, KCl a 2,7 mM, Na2HPO4 a 10 mM, KH2PO4 a 1,8 mM, MnCl a 2,6 mM, MgCl2 a 26 mM, 1 µg/ml de leupeptina, 1 µg/ml de aprotinina, 1 µg/ml de ADNasa I, pH 7,6) por 500 ml de cultivo. También se añadieron 50 µg/ml de lisozima. Tras la incubación de 15 min en hielo, se centrifugó el lisado a 20.000 g. Purificación de la proteína: etapa de captura: se depositaron 40 ml del sobrenadante en una columna de 5 ml GSTrap en un sistema ÄKTA Explorer 10 (Amersham Pharmacia Biotech). Tampón de fijación: PBS (NaCl a 140 mM, KCl a 2,7 mM, Na2HPO4 a 10 mM, KH2PO4 a 1,8 mM, pH 7,6). Tampón de elución: Tris-HCl a 50 mM, pH 8,0 con glutatión reducido a 5 mM. Velocidad del flujo: 5 ml. Procedimiento cromatográfico: 4 VC (volúmenes de columna) de tampón de fijación , 40 ml de sobrenadante, 12 VC de tampón de fijación, 5 VC de tampón de elución, 5 VC de NaCl a 2 N/PBS, pH 7,6, 5 VC de tampón de fijación. Luego, la proteína de fusión GST-hCD83ext se incubó 16 h con trombina (20 U/ml) a 22 ºC. Para separar la proteína hCD83ext de la GST, se cargó de nuevo la elución en una columna de 5 ml GSTrap con las condiciones del tampón de la etapa de captura. El eluido con la proteína CD83ext humana recombinante se recogió en las condiciones del tampón de fijación.

La hCD83ext_mut129_CtoS purificada se comparó con la hCD83ext purificada por SDS-PAGE (véase la figura 9). En condiciones reductoras y no reductoras, la forma mutante de CD83 mostró una banda monomérica estable a 14 kDa. Esta banda es similar a la proteína de tipo silvestre de hCD83ext en condiciones reductoras. En condiciones no reductoras no se pudo detectar ningún dímero de CD83 con la proteína mutante de CD83. Por lo tanto, se necesita la 5.ª cisteína carboxiterminal del dominio extracelular de CD83 para la creación de homodímeros. El análisis de inmunotransferencia confirmó la especificidad de las bandas (no se muestran los datos).

La actividad inhibidora de hCD83ext_mut129_CtoS que se ensayó como en los experimentos por MLR descritos en los ejemplos 3 y 4 fue similar a la del compuesto analizado en los ejemplos 3 y 4.

Ejemplo 10: La CD83 soluble inhibe la proliferación de los esplenocitos.

Inhibición de la proliferación de los esplenocitos:

Después de 30 o, alternativamente, 60 días de la inmunización de los ratones con MOG, se retiraron los bazos para los ensayos de reestimulación. Las células se cultivaron en medio HL-1 sin suero complementado con penicilina (100 U/ml, Sigma), estreptomicina (100 µg/ml, Sigma), L-glutamina (2 mM, Sigma) y 2-mercaptoetanol (50 µM,

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Sigma). Las células específicas contra MOG se analizaron por incubación de 4 x 105 esplenocitos con diferentes concentraciones del péptido MOG en 200 µl de HL1/pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Adicionalmente, como control, se estimularon 4 x 105 esplenocitos con la IL-2 (500 U/ml, Proleukin). Como control negativo se utilizaron cultivos sin estimular. Trascurridas 72 horas, los cultivos se recibieron un pulso de [3H]-timidina (0,4 Ci/mmol, Amersham TRA-20). Doce horas después se midió la incorporación de la timidina con un contador de microplacas (Wallac).

Los esplenocitos procedentes de los ratones tratados con hCD83ext redujeron claramente la proliferación (véase la figura 10A). Adicionalmente, como control, se estimularon 4 x 105 esplenocitos con la IL-2 (500 U/ml). De igual forma, las células tratadas con hCD83ext todavía son capaces de proliferar en respuesta a la IL-2 (véase la figura 10A, inserto a la derecha). Estos datos demuestran con claridad que la proliferación de los esplenocitos está reducida en los ratones tratados con CD83, aunque se pueden volver a estimular con la IL-2. Por lo tanto, no están muertos.

La reestimulación de los esplenocitos procedentes de ratones tratados con hCD83ext, con SAB o sin tratar, en donde la EAE se indujo dos veces (véase la figura 10B). Los ratones tratados con hCD83ext mostraron una ligera reducción de la capacidad de proliferación. Sin embargo, mientras que los ratones tratados con SAB y los ratones sin tratar siguen proliferando fuertemente en respuesta a la IL-2, las células tratadas con la hCD83ext proliferan menos en respuesta a la IL-2 (véase la figura 10B, inserto a la derecha).

Estos datos demuestran con claridad que la proliferación de los esplenocitos está reducida en los ratones tratados con la CD83.

Ejemplo 11: la CD83 soluble inhibe la producción de las citocinas en los esplenocitos

A los esplenocitos recogidos que se estimularon con diferentes concentraciones del péptido MOG (tal y como está descrito en el ejemplo 10), se les examinó su producción de citocinas ex vivo. Los sobrenadantes del cultivo se tomaron tras 96 horas y se analizaron con los kits de ELISA de sándwich disponibles comercialmente para INF-γ, IL2, IL-4 e IL-10 (BD Biosciences). Las células tratadas con hCD83ext (tras la primera inducción de la EAE) tenían fuertemente inhibida la producción del IFN-γ (véase la figura 11A). También estaba reducida con claridad la producción de IL-10. La producción de la IL-2 y de la IL-4 no se había visto considerablemente alterada. Estos datos demuestran con claridad que la CD83 soluble conduce a una reducción de la producción de citocinas en los animales tratados.

La producción de las citocinas desde los esplenocitos se determinó también en los esplenocitos procedentes de animales en donde la EAE se indujo dos veces (véase la figura 11B). La producción del IFN-γ está fuertemente inhibida. Lo mismo ocurre con la producción de la IL-10. La producción de la IL-2 no se ve muy alterada. Hay cierta producción de IL-4 en las células tratadas con SAB y sin tratar, aunque los valores son muy bajos y están cercanos al límite de detección. De nuevo, estos datos demuestran claramente que la CD83 soluble conduce a una reducción de la producción de citocinas en los animales en los que se ha inducido la EAE una segunda vez.

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