JPWO2012091118A1 - 子宮外妊娠の治療剤 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)ヒト由来の胎盤絨毛を、ヒト以外の哺乳動物の腎臓組織に移植したモデル動物を作製する工程;
(b)前記(a)の工程で作製したモデル動物のうち、一匹(又は一集団)のモデル動物には被験試料を投与して飼育し、他の一匹(又は一集団)のモデル動物には被験試料の担体のみを投与して飼育する工程;
(c)前記被験試料を投与したモデル動物の腎臓組織における細胞性栄養膜細胞及び絨毛外性栄養膜細胞と、前記被験試料を投与しなかったモデル動物の腎臓組織における細胞性栄養膜細胞及び絨毛外性栄養膜細胞とを比較する工程;
(d)被験試料を投与したモデル動物の細胞性栄養膜細胞及び絨毛外性栄養膜細胞の方が減少していた場合に、この被験試料を子宮外妊娠の治療剤として選別する工程。
さらに、本発明は、子宮外妊娠の治療用の脳由来神経栄養因子(BDNF)及び/又は脳由来神経栄養因子受容体(TrkB)の抑制剤を提供する。
さらに、本発明は、有効量の脳由来神経栄養因子(BDNF)及び/又は脳由来神経栄養因子受容体(TrkB) の抑制剤を、子宮外妊娠患者に投与することを含む、子宮外妊娠の治療方法を提供する。
a)Z1及びZ2は共に水素:
1)RはOH、1〜6個の炭素原子のO−n−アルキル、及び、2〜6個の炭素原子のO−アシルよりからなる群から選択され;
2)Xは下記の群より選択される;
H;
CONHC6H5、但し、この場合にはR1及びR2は共にはBrでない;
CH2Y、ここに、Yは、OR7(R7はHまたは2〜5個の炭素原子のアシル);
SOR8、ここに、R8は1〜3個の炭素原子のアルキル、アリール、若しくは、含窒素原子複素環基;
NR9R10、ここに、R9及びR10は、独立して、H、1〜3個の炭素原子のアルキル、Pro、Ser、Gly、Lys、若しくは、2〜5個の炭素原子のアシル、但し、R9及びR10のうちの一方のみがPro、Ser、Gly、Lys若しくはアシルである;
SR16、ここにR16はアリール、1〜3個の炭素原子のアルキル、若しくは、含窒素原子複素環基;
N3;
CO2CH3;
S―Glc;
CONR11R12、ここに、R11およびR12は、独立して、H、1〜6個の炭素原子のアルキル、C6H5若しくは1〜6個の炭素原子のヒドロキシアルキルであるか、若しくは、R11及びR12は一緒になって−CH2CH2OCH2CH2−を形成する;
CH=NNHCONH2;
CONHOH;
CH=NOH;
CH=NNHC(=NH)NH2;
CH2NHCONHR18、ここに、R18は、低級アルキル若しくはアリール;又は、
X及びRは一緒になって、−CH2NHCO2−、CH2OH(CH3)2O―、=O若しくは−CH2N(CH3)CO2−を形成する;
3)R1、R2、R5及びR6は各々独立してHであるか、あるいはそれらのうち2つまではF;Cl;Br;I;NO2;CN;OH;NHCONHR13;CH2OR13;1〜3個の炭素原子のアルキル;CH2OCONHR14若しくはNHCO2R14、ここに、R14は低級アルキル;CH(SC6H5)2若しくはCH(−SCH2CH2S−);
R1はCH2S(O)pR21であって、R2、R5及びR6はH、ここに、pは0若しくは1で、R21はアリール、1〜3個の炭素原子のアルキル、含窒素原子複素環基、
R1はCH=NHR22R23であって、R2、R5及びR6はH、ここに、R22及びR23は各々独立してH、1〜3個の炭素原子のアルキル、C(=NH)NH2、若しくは、含有窒素原子複素環基、あるいは、R22及びR23は一緒になって、−(CH2)4−、−(CH2CH2OCH2CH2)−、若しくは、−CH2CH2N(CH3)CH2CH2−を形成し、但し、R22及びR23は共にはHではあり得ず、かつ双方がアルキルである場合を除いてR22若しくはR23のうち少なくとも一方はH;
(b)Z1及びZ2が一緒になってOを表す場合、XはCO2CH3、RはOHであって、R1、R2、R5及びR6は各々水素を意味する。)
なお、ここで「低級」は炭素数1〜6を意味する。
R3及びR4は、各々、独立して、H、1〜6個の炭素原子のアルキル、1〜3個の炭素原子のヒドロキシアルキル、及び3〜6個の炭素原子のアルケニルよりなる群から選択され、但し、R3及びR4は共にはHではなく;
1)Z1及びZ2は共に水素であって、
R1、R2、R5及びR6は、各々独立して、H、又は、それらのうち2つまではF;Cl;Br;I;NO2;CN;OH;NHCONHR13、ここに、R13はC6H5若しくは1〜3個の炭素原子のアルキル、但し、R1,R2,R5及びR6のうちの1つのみがNHCONHR13である;CH2OR13;1〜3個の炭素原子のアルキル;CH2OCONHC2H5;若しくは、NHCO2CH3;
2)Z1及びZ2が一緒になってOを表す場合、R1、R2、R5及びR6は各々水素を意味する。)
(a)ヒト由来の胎盤絨毛を、ヒト以外の哺乳動物の腎臓組織に移植したモデル動物を作製する工程;
(b)前記(a)の工程で作製したモデル動物のうち、一匹(又は一集団)のモデル動物には被験試料を投与して飼育し、他の一匹(又は一集団)のモデル動物には被験試料の担体のみ投与して飼育する工程;
(c)前記被験試料を投与したモデル動物の腎臓組織における細胞性栄養膜細胞及び絨毛外性栄養膜細胞と、前記被験試料を投与しなかったモデル動物の腎臓組織における細胞性栄養膜細胞及び絨毛外性栄養膜細胞とを比較する工程;
(d)被験試料を投与したモデル動物の細胞性栄養膜細胞及び絨毛外性栄養膜細胞の方が減少していた場合に、この被験試料を子宮外妊娠の治療剤として選別する工程。
ヒト絨毛様組織
秋田大学医学部付属病院(秋田、日本)にて、妊娠の最初の3ヶ月(6〜11週)のヒト胎盤絨毛は、心理社会的な理由により子宮内容掻爬術を施行された妊娠女性から得た。また、子宮外妊娠の組織サンプルは、妊娠8週の患者から腹腔鏡下での手術によって得た。妊娠週数は、最終月経の日付及び超音波による胎児頭殿長の測定から決定した。in vitro 及び in vivoの実験に用いた全ての組織サンプルは、18から30歳(平均23±4.5歳)の日本人女性から、当院の地域医療倫理委員会と共にインフォームドコンセントで患者から同意を得た後に採取した。
妊娠の最初の3ヶ月間の胎盤からのヒト絨毛断片の準備と培養は、非特許文献13に記載の通りに行った。簡潔に述べると、妊娠6〜8週の胎盤絨毛を、脱落膜組織および卵膜を除去するために無菌的に解剖し、実体顕微鏡(ライカマイクロシステムズ、東京、日本)下で、少量の胎盤絨毛(湿重量8mg)とした。それぞれの絨毛片を、200μlの希釈していないマトリゲルグロースファクターリデュースト(BDバイサイエンシズファーミンゲン)を用いて事前に被膜したミリセルCMカルチャーディッシュインサート(12mm径)(ミリポア、ベッドフォード、マサチューセッツ)上に乗せ、24穴培養プレート中に置いた。絨毛片を150μlの培地(血清を含まず、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、及び0.25μg/mlアスコルビン酸を添加した、pH7.4のDMEM/F12)(インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア)で覆い、底部チャンバーを500μlの同じ培地で満たした。絨毛片を異なった量のTrkBの可溶性細胞外領域(R&Dシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ)、神経栄養因子(pan)特異的Trk受容体阻害薬K252a(カルビオケム、ラホーヤ、カリフォルニア)(非特許文献14)、若しくは不活化原形質膜非透過K252b(カルビオケム)(非特許文献15)を加えて又は加えないで、37℃、3%酸素/5%二酸化炭素/92%窒素中で96時間培養した。培地は48時間ごとに取り替え、グルコース濃度測定のために回収した。
ヒト子宮外妊娠における内因性TrkBシグナルの役割を調べるために、in vivoモデルとして妊娠7〜8週のヒト胎盤絨毛を異種移植したSCIDマウス(C.B-17/Icr-scid/scidJcl)(日本クレア、東京、日本)を用いた。動物の飼育及び使用は、秋田大学医学部の動物研究委員会によって是認された。移植片の準備では、胎盤絨毛の小片を上記の通りに摘出し、氷冷したPBS中に移植まで保存した。8〜11週齢のSCIDマウスをトリブロモエタノール(14〜20 mg/kg)(シグマ、セントルイス、ミズーリ)を用いて麻酔した後、腹部を切開して左右の腎臓をそれぞれ体外に牽引した。その後、それぞれの腎臓被膜に0.5mmの切り口を作り、胎盤絨毛(湿重量5mg)の小片を、ブラントチップピンセットを用いてその被膜の下に移植した。動物へのTrk抑制剤投与は、細胞性栄養膜細胞が侵入した領域にマウス由来血管組織網が構築されることが知られている(非特許文献18)、移植1週間後から開始した。動物体重は、Trk抑制剤投与の日において19〜22gの間であった。生理的食塩水に溶解したK252a(500 μg/kg)の腹腔内投与(ip)を毎日行った。ネガティブコントロールとしてはK252b(500μg/kg)での処理、または担体のみの処理を用いた。これらの実験でのK252aおよびK252bの量は、これまでの研究の成果をもとに選択した(非特許文献12、非特許文献19)。何匹かの動物には、子宮外妊娠の治療で用いられる治療用量に相当するメトトレキサート(ip;1 mg/kg)(シグマ)を毎日処理した(非特許文献3)。以下のアッセイには薬剤投与後7日目のマウスを用いた。hCG-βレベル及びカスパーゼ-3/7活性を測定するために、移植された絨毛を有する腎臓を摘出し、破砕した。腎臓における栄養膜細胞を同定するために、栄養膜細胞のマーカーであるサイトケラチン(非特許文献20)を免疫組織化学的手法で検出した。HE染色に加えて、摘出したサンプルにおけるin vivoの細胞増殖及びアポトーシスをそれぞれ、PCNA並びにKi-67の免疫染色及びTUNELアッセイによって評価した。
絨毛断片組織培養におけるEVT陽性の割合を比較するために、カイ二乗検定を行った。その他の差異を評価するために、一元配置分散分析の後に制約付最小有意差検定を行った。データは平均±標準誤差である。
ヒト胎盤絨毛におけるニューロトロフィン(神経成長因子、NGF、及びニューロトロフィン-3、NT-3)及びTrk受容体(TrkA及びTrkC)の発現を検討するための、通常のRT-PCRにおけるNGF、NT-3、TrkA、TrkC、及びβ-アクチン用のプライマーは、(非特許文献11)に記載されている。PCR反応は、94℃で30秒間の変性、57℃(TrkA)、60℃(TrkC及びβ-アクチン)、62℃(NGF及びNT-3)で30秒間のアニーリング、そして72℃で30秒間の伸長反応を35回繰り返した。ネガティブコントロールにはmRNAを加えなかった。
胎盤絨毛及び異種移植されたヒト絨毛を有するマウス腎臓におけるTrkB、断片化TrkB及びHLA-G転写産物レベルの定量的リアルタイムRT-PCRを、スマートサイクラー(SmartCycler、タカラバイオ株式会社、東京、日本)とTrkB並びにβ-アクチン用のプライマー及びハイブリダイゼーションプローブを用いて(非特許文献32)に記載の通りに行った。TrkB用のプライマーには不完全なアイソフォームの増幅を避けるために、受容体の触媒キナーゼドメインに相当する部分を用い(非特許文献33)、断片化Trkbは既報のprimerを用いて特異的に増幅した(非特許文献37)。HLA-G(アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア)の発現の定量には、バリデート済みTaqman遺伝子発現アッセイ(Validated Taqman gene expression assay)を用いた。データはβ-アクチンの転写産物レベルに基づいて標準化した。
ELISA用に胎盤絨毛を、137 mM NaCl、20 mM Tris-HCl、1% ノニデットP40、10%グリセロール、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル(ロシュ・アプライド・サイエンス、インディアナポリス、インディアナ)を含む緩衝液中で破砕し、その後8000xgで5分間、4℃において遠心分離した。胎盤絨毛における脳由来神経栄養因子(BDNF)及びニューロトロフィン-4/5(NT-4/5)の定量は、ELISAによって(非特許文献32、非特許文献10)に記載の通りに行った。結果をタンパク質の濃度に基づいて標準化し、そして組織1mgあたりpgのBDNF又はNT-4/5として表示した。
正常及び子宮外妊娠期間中のヒト胎盤絨毛におけるBDNF、NT-4/5,及びTrkBの発現
正常妊娠の最初の3ヶ月間での胎盤絨毛におけるBDNF、NT-4/5、及びTrkBの経時的な発現をELISA及びリアルタイムRT-PCRによって検査した。絨毛では、検査した全ての妊娠時期においてBDNFタンパク質レベルがNT-4/5レベルよりも1.3〜5.0倍高いことがELISA解析によって示された(図1A)。BDNFタンパク質レベルが初期段階では安定していたが、妊娠11週で低下した一方、NT-4/5タンパク質レベルは妊娠7週後に低下し、検査した全ての妊娠段階を通じて低いレベルを維持した(図1A)。絨毛におけるTrkB転写産物レベルは、妊娠6週で高く、7週で低下し、その後妊娠が進行するにつれて徐々に増加することが定量的リアルタイムRT-PCR解析によって示された(図1A)。
ヒト胎盤絨毛の特異的細胞型におけるTrkBリガンドと受容体両方の発現は、TrkBシグナルが栄養膜細胞発育においてオートクリン/パラクリンの役割を担っていることを示唆した。内因性TrkBリガンドが、細胞性栄養膜細胞に対する分化因子として作用しているかどうかを決定するために、TrkB細胞外ドメイン及びK252aを添加培養した絨毛片からのEVT増生を評価した。対照群においては、EVT増生は培養48時間で増加し、外稙片の大きさの収縮を伴って培養96時間で最大に達した(図2A)。細胞増殖マーカー(Ki-67)の発現が遊走した細胞では認められなかったことから(図7)、EVT増生はEVT細胞の分裂を含まなかった。TrkB細胞外ドメイン又は、K252aでの処理は、EVTの特異的マーカーであるHLA-G(非特許文献21)の転写産物レベルの低下を伴って(図2C)、EVT増生を用量依存的に同等の効果で抑制したが(図2A及びB)、不活化K252bではその効果は認められなかった。
正常及び子宮外妊娠のヒト絨毛におけるTrkBリガンドと受容体の発現、及びTrk阻害剤によってヒト栄養膜細胞発育がin vitroで阻害された結果を受け、子宮外妊娠の薬物療法としてのTrkBシグナル抑制の効果の可能性を検討した。子宮外妊娠のin vivoモデルとして、SCIDマウスにヒト胎盤絨毛を異種移植した。これまでの研究(非特許文献18)と一致して、マウス腎臓組織へのヒト栄養膜細胞浸潤は異種移植後1週間で見られ、その浸潤は、細胞数の増加を伴って、3週間後には腎臓のより深い領域に拡大した(図5A)。さらに、組織ホモジネートにおけるhCG-βレベルの増加(図5B)は、移植した絨毛が子宮外の部位で発育したことを示唆した。腎臓に浸潤した栄養膜細胞はHLA-Gによって染色され(図5C)、このことはそれらがEVTへ分化していることを示している。これらの結果から、本方法により子宮外妊娠のモデルが確立され、子宮外妊娠おける栄養膜細胞発育の抑制に対するTrk阻害薬の使用が試験できるようになった。
Claims (11)
- 脳由来神経栄養因子(BDNF)及び/又は脳由来神経栄養因子受容体(TrkB)の抑制剤を有効成分として含有する子宮外妊娠の治療剤。
- チロシンキナーゼ抑制剤、遊離のTrkB若しくはBDNFとの結合性を有するその断片又は子宮外妊娠の治療効果を有するそれらの修飾体又はTrkB若しくは前記断片又は前記修飾体を細胞内で生産する組換えベクター、BDNF遺伝子若しくはTrkB遺伝子に対する干渉RNA又は該干渉RNAを細胞内で生産する組換えベクター、BDNF又はTrkBに対する抗体、及びBDNF遺伝子若しくはTrkB遺伝子に対するアンチセンス核酸又は該アンチセンス核酸を細胞内で生産する組換えベクターから成る群より選ばれる少なくとも1種を有効成分として含有する請求項1記載の治療剤。
- チロシンキナーゼ抑制剤、及び遊離のTrkB又はBDNFとの結合性を有するTrkB断片から成る群より選ばれる少なくとも1種を有効成分として含有する請求項2記載の治療剤。
- チロシンキナーゼ抑制剤が、下記一般式(1)で表される化合物である請求項3記載の治療剤。
a)Z1及びZ2は共に水素:
1)RはOH、1〜6個の炭素原子のO−n−アルキル、及び、2〜6個の炭素原子のO−アシルよりからなる群から選択され;
2)Xは下記の群より選択される;
H;
CONHC6H5、但し、この場合にはR1及びR2は共にはBrでない;
CH2Y、ここに、Yは、OR7(R7はHまたは2〜5個の炭素原子のアシル);
SOR8、ここに、R8は1〜3個の炭素原子のアルキル、アリール、若しくは、含窒素原子複素環基;
NR9R10、ここに、R9及びR10は、独立して、H、1〜3個の炭素原子のアルキル、Pro、Ser、Gly、Lys、若しくは、2〜5個の炭素原子のアシル、但し、R9及びR10のうちの一方のみがPro、Ser、Gly、Lys若しくはアシルである;
SR16、ここにR16はアリール、1〜3個の炭素原子のアルキル、若しくは、含窒素原子複素環基;
N3;
CO2CH3;
S―Glc;
CONR11R12、ここに、R11およびR12は、独立して、H、1〜6個の炭素原子のアルキル、C6H5若しくは1〜6個の炭素原子のヒドロキシアルキルであるか、若しくは、R11及びR12は一緒になって−CH2CH2OCH2CH2−を形成する;
CH=NNHCONH2;
CONHOH;
CH=NOH;
CH=NNHC(=NH)NH2;
CH2NHCONHR18、ここに、R18は、低級アルキル若しくはアリール;又は、
X及びRは一緒になって、−CH2NHCO2−、CH2OH(CH3)2O―、=O若しくは−CH2N(CH3)CO2−を形成する;
3)R1、R2、R5及びR6は各々独立してHであるか、あるいはそれらのうち2つまではF;Cl;Br;I;NO2;CN;OH;NHCONHR13;CH2OR13;1〜3個の炭素原子のアルキル;CH2OCONHR14若しくはNHCO2R14、ここに、R14は低級アルキル;CH(SC6H5)2若しくはCH(−SCH2CH2S−);
R1はCH2S(O)pR21であって、R2、R5及びR6はH、ここに、pは0若しくは1で、R21はアリール、1〜3個の炭素原子のアルキル、含窒素原子複素環基、
R1はCH=NHR22R23であって、R2、R5及びR6はH、ここに、R22及びR23は各々独立してH、1〜3個の炭素原子のアルキル、C(=NH)NH2、若しくは、含有窒素原子複素環基、あるいは、R22及びR23は一緒になって、−(CH2)4−、−(CH2CH2OCH2CH2)−、若しくは、−CH2CH2N(CH3)CH2CH2−を形成し、但し、R22及びR23は共にはHではあり得ず、かつ双方がアルキルである場合を除いてR22若しくはR23のうち少なくとも一方はH;
(b)Z1及びZ2が一緒になってOを表す場合、XはCO2CH3、RはOHであって、R1、R2、R5及びR6は各々水素を意味する。) - チロシンキナーゼ抑制剤が、K252aである請求項4記載の治療剤。
- 遊離のTrkB又はBDNFとの結合性を有するその断片が、BDNFと結合するTrkBの細胞外ドメインを含むTrkB断片である請求項3記載の治療剤。
- 子宮外妊娠が未破裂子宮外妊娠である請求項1〜6のいずれか1項に記載の治療剤。
- 被験試料の存在下におけるTrkBのキナーゼ活性と、被験試料の非存在下におけるTrkBのキナーゼ活性とを測定し、TrkBのキナーゼ活性を減少させる被験試料を選別することを特徴とする、子宮外妊娠の治療剤のスクリーニング方法。
- 次の(a)〜(d)の工程を含むことを特徴とする、子宮外妊娠の治療剤のスクリーニング方法:
(a)ヒト由来の胎盤絨毛を、ヒト以外の哺乳動物の腎臓組織に移植したモデル動物を作製する工程;
(b)前記(a)の工程で作製したモデル動物のうち、一匹(又は一集団)のモデル動物には被験試料を投与して飼育し、他の一匹(又は一集団)のモデル動物には被験試料の担体のみを投与して飼育する工程;
(c)前記被験試料を投与したモデル動物の腎臓組織における細胞性栄養膜細胞及び絨毛外性栄養膜細胞と、前記被験試料を投与しなかったモデル動物の腎臓組織における細胞性栄養膜細胞及び絨毛外性栄養膜細胞とを比較する工程;
(d)被験試料を投与したモデル動物の細胞性栄養膜細胞及び絨毛外性栄養膜細胞の方が減少していた場合に、この被験試料を子宮外妊娠の治療剤として選別する工程。 - 子宮外妊娠の治療用の脳由来神経栄養因子(BDNF)及び/又は脳由来神経栄養因子受容体(TrkB) の抑制剤。
- 有効量の脳由来神経栄養因子(BDNF)及び/又は脳由来神経栄養因子受容体(TrkB) の抑制剤を、子宮外妊娠患者に投与することを含む、子宮外妊娠の治療方法。
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