CN1057295A

CN1057295A - 人睫状神经元营养因子，编码该因子的dna序列，以及以重组技术生产该因子

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Publication number: CN1057295A
Application number: CN91102344A
Authority: CN
Inventors: 弗兰切斯卡·德拉·瓦莱; 兰弗兰科·卡列加罗; 亚历山德罗·内格罗
Original assignee: Fidia SpA
Current assignee: Fidia SpA
Priority date: 1990-03-14
Filing date: 1991-03-14
Publication date: 1991-12-25
Also published as: AU7291891A; IL97557A0; NO911025D0; PL289413A1; HU910840D0; EP0446931A1; CA2038208A1; NO911025L; AR243237A1; JPH04218374A; KR910016921A; HUT62033A

Abstract

本发明涉及人睫状神经元营养因子，特别是发现了编码该因子的基因、该因子的氨基酸序列以及以 DNA重组技术生产该因子的方法。

Description

本发明涉及人睫状神经元营养因子，特别是发现了编码人睫状神经元营养因子基团的DNA序列片段，该因子的氨基酸序列及借助DNA重组技术生产该因子的方法。因这种可获得足够量具有重要生物学活性，且不含人源污染蛋白的均质蛋白质。

睫状神经节（CG）包含两大类胆碱能神经元，即睫状神经元和脉络膜神经元。CG神经元支配脉络膜、睫状体和虹膜中的眼固有肌肉结构。在鸡胚发育期间，在E8天和E15天之间，当神经元轴突与眼内神经分布区域建立起一种联系时，约有一半的CG神经元死亡。

摘除眼睛可强有力地促进这种神经元的死亡，而移植进一个辅助眼芽体则可明显地阻止这种死亡。根据这一观察结果，已经推断受神经支配区域含有其自身特异性神经元的营养因子。已证明从E8天的各种鸡胚组织得到的提取物对从同一发育阶段的鸡胚之睫状神经节分离的神经元具有营养活性（Adler，1979）。

后来将这种营养活性称为睫状神经元营养因子（CNTF）（Barbin，1982）。

将从E8天的鸡胚睫状神经节分离的神经元接种在适当的底物和适当培养基上并不能存活，除非向培养基中加入特定的添加物，从而制成一个总地适于神经营养因子，特别是适于那些蛋白质性质之因子的生物学试验模型。对于这一点，当比较E8天的各种鸡胚组织的提取物时，有占鸡胚中总CNTF活性的1/3是见于眼睛中，而眼睛本身又有3/4活性存在于脉络膜、虹膜和睫状体（眼睛的固有肌肉结构）的一部分以及色素上皮（CIEP）中。存活性估测结果表明，对CG神经元有营养活性的可溶性蛋白质，（ⅰ）以高浓度存在于它们所支配的眼睛区域内，（ⅱ）在E8-E15之间，即体内决定这些神经元命运的高度发育阶段达到最高特异活性。对E15鸡胚CNTF的纯化包括选择性地再解剖CIEP组织，以及经离子交换层析、蔗糖梯度超速离心及十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）等技术依次处理相关的提取物。

在还原条件下，以离子交换层析、蔗糖梯度超速离心及SDS-PAGE方法显示这种蛋白质的分子量约为21Kd，且净带一个负电荷。该纯化的蛋白质对E8阶段的鸡CG神经元、E10阶段的鸡DRG神经元和E11阶段的交感神经元之营养活性是以10^-11-10^-12M浓度次序发挥的，因此就对其DRG和交感神经元来说，与其他神经营养因子，即从雄性小鼠颌下腺中纯化的神经生长因子（NGF）有着同样的次序。

鸡胚眼提取物，相类于CIEP提取物，对（ⅰ）E10（不是E8）鸡胚DRG神经元和新生小鼠神经元，以及对（ⅱ）E11鸡胚交感神经元和新生大鼠神经节具有营养活性，毫不奇怪，这种结果可认为是由于这些敏感性神经元和交感神经元的神经支配区域部分地相同于CG神经元的神经支配区域。另一方面，DEG和交感神经元对纯化的鸡眼CNTF的营养活性是反应敏感的，尽管事实上CNGF是根据它对CG神经元的营养活性选择的。

与NGF相似，CNTF促进肾上腺嗜铬细胞培养物的生长，尽管这两种因子对酪氨酸羟化酶和苯乙醇胺N-甲基转移酶的作用程度有所不同。CNTF可增强鸡视网膜细胞培养物中的ChAT活性，表明存在着胆碱能神经元反应。CNTF对大鼠胚胎前脑基部或脑桥区域的胆碱能神经元没有营养活性，故不能认为是一种胆碱能神经元营养因子。最近的资料表明，CNTF的作用不只限于对神经元细胞。发现CNTF还可诱导大鼠视觉神经的胶质先祖细胞分化成2型星状胶质细胞。

在CNTF的其他活性中，其中之一是与阻止轴突切除后之运动神经元退化有关（Sendtner，1990）。

概括地说，该新因子相当于至少对三种类型的神经元有活性的蛋白质，其中两类神经元也对NGF敏感。须明确的是这一分子量的鸡眼CNTF在其浓度为10^-11-10^-12M时可提高E8鸡CG神经元、E10鸡DRG神经元和E11鸡交感神经元的1/2最大存活率，此与从小鼠颌下腺纯化的NGF对其神经元靶、DRG和交感神经元有同样次序的特异活性。抗鼠颌下腺之NGF β-亚单位的特异性抗体不能阻断或抑制鸡眼CNTF的任何一种营养活性。

同DRG和交感神经元的营养因子一样，已从多种其他来源，包括从组织浸提物和损伤体液到各种细胞培养物的限制性培养液中制得了CG神经元的营养因子。“限制性培养基”比组织浸提物更有优越性，在于它有利于鉴定“细胞来源”。另一方面，由于从这些细胞中获得的营养活性的浓度低，故这些限制性培养基不大适于制备具有营养活性的纯化蛋白质。确实，从心肌培养物获得的限制性培养基是证实存在CNTF的首批材料（仅次于骨骼肌培养物）。牛心提取物也可能作为一种起始材料，但还不能证明这些材料中CNTF的全部性质。从心和骨骼肌中存在一种CNTF，可推断出CNTF除了对支配眼内固有肌肉的那些神经元（CG）有活性外，对内脏和躯体运动性胆碱能神经元也有活性。但是，还没有就其分子特性或神经元靶的范围对眼、心和骨骼肌的CNTF进行系统比较。

从神经胶质细胞培养物，包括周围（Schwann）和中央（星状细胞）神经胶质细胞获得的限制性培养基对睫状神经元和背部及交感神经末梢神经节的神经元也显示有营养活性，此与NGF的作用不同，该结果有力地支持神经胶质具有作为体内神经营养因子来源之可能作用的假设。

也已证明，成年大鼠坐骨神经提取物与CNS组织的提取物不同，具有很高的CNTF含量，并具有相等于E15鸡眼CIEP的比活性（每毫克蛋白质约20，000个营养单位）。在神经提取物或纯运动神经末梢或纯感觉神经末梢的提取物中也显示有高CNTF活性，这表明没有一个分化标准能判断神经之活性与特异性神经支配区域有相关性，而可证明与包含于其结构中的Schwann细胞之间或连同这些结构间的相互关联。

Manthorpe及合作者（Manthorpe et al.，Ciliary Neuronotro-phic Factors in Nerve Growth Factors，R.A.Rush Ed.，Ibro Hand-book Series：Methods in the Neurosciences，Vol.12，pp.31-56）纯化出了分析水平上的大鼠神经CNTF，表明比从鸡眼纯化的CNTF有稍低负电荷和稍高的分子量（24Kd）。

目前还没有从大鼠坐骨神经、牛心和神经母细胞瘤细胞中分离到CNTF。Williams等人证实在成年大鼠的坐骨神经中有高含量的CNTF，并与鸡的CNTF有相等的比活性（20，000TU/mg蛋白）。

已鉴定出两种形式的CNTF，一种具有约25Kd的分子量，另一种分子量约为28Kd。通过均质纯化一定量的兔和大鼠坐骨神经CNTF，已有可能部分鉴定其氨基酸序列（Lin L-F，H.，J.Bio.Chem.，Vol.265，No.15，pp.8942-8947，1990）。根据这些知识并使用PCR（聚合酶链反应）技术，已分离到编码这两种动物之CNTF的完整基因片段（Stoeckli et al.，Nature，Vol.342，pp.920-923，1989;Lin L-F.H.et al.，Science，Research Articles，Vol.246，pp.1023-1025，1989）。就纯化的蛋白质来说，两种蛋白质的分子量分别为22.7Kd和22.8Kd，且兔蛋白质的等电点为5.78。

比较分析大鼠和兔的CNTF序列，结果表明它们在氨基酸和核苷酸序列上是高度同源的。借助计算机分析已成功地测出某些分子内的更好的保守区域，从而可利用PCR技术和就这些重要区域合成的某些寡核苷酸，鉴定并分离人基因片段中相当于整个序列之80%的有意义部分。该部分基因序列和相应氨基酸序列详见下文所述。

利用DNA重组技术，可以构建表达大量蛋白质的一系列载体，从而使生物学家能够装配DNA序列以制得能生产有用蛋白质的杂合分子。可利用各种反应，如用限制性酶切割，然后用连接酶连接如此得到的片段、组装化学合成的寡核苷酸，以及本领域内各实验室自己设计其他方法学（Maniatis，T.et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1982）。

为了得到高水平表达，被装配的DNA元件必须存在某些必要的信息。例如，复制原点、抗生素选择标志、表达启动子、有用基因的转录激活因子以及本领域内专业人员已知的其他特性等。这些元件恰当地结合即可产生一个质粒，如果有用基因被自然地插入到相关的转录和转译调节序列上，所得到的质粒便称为表达质粒。从而该表达质粒或载体即可在宿主细胞内表达蛋白质，这样的宿主细胞可以是真核或原核生物来源的。经纯化后使可得到所需的蛋白质。

自然地控制许多基因如生长因子表达的元件（启动子）在其表达中并不是强有力的，而只有在合适的天然条件（常常是未知的）下才能被活化。为此目的，可使用有已知活性的启动子如乳头多瘤空泡病毒系列的病毒，或其他已知的启动基因序列。因此用于高水平表达的元件是各种来源（真核生物、细菌、病毒等）之DNA结合形式的杂合体，其中的末端部分可由不同基因部分相结合而成。

一种基因的转录活性取决于调节和编码序列之间的距离。

根据这些事实，使调节序列适当地工作的最好办法之一是将被引入的基因置于与天然基因相同的位置上。对于所使用的系统，要求调节序列包括某些氨基酸的编码序列。与所引入的基因结合后产生一种继后被切除的融合蛋白，以获有更高生物学价值的产物。如果不利用融合蛋白技术，则获得位于调节序列最邻近位点之基因所使用的常规技术将取决于允许其克隆之适当限制性位点的存在。如果在邻近区域没有相匹配的位点，而只有其他位点，则可以通过合成含所需之限制性位点的寡核苷酸或接头来得到这些片段的结合体。

如果在邻近区域没有合适的限制性位点而不能使用接头，则可利用BalI 31和SI缺失DNA的方法。但这样并不能得到精确的缺失，因此必须在各个时间对不同克隆进行序列分析，以检查哪一个是最适用的。

虽然用于分离具有新的生物学活性之蛋白质的方法通常包括从生物体液中纯化而分离蛋白质本身，但所获得的蛋白质量总是不充足而不能用于继后对其结构、功能特别是应用的研究。可利用DNA重组技术得到可见量的蛋白质，借以在表达载体中克隆蛋白质本身。但有的时候，如本发明所述的情况下，对于蛋白质的一级结构毫无所知，不可能进行常规的克隆。就CNTF来说，在本发明以前唯一已知的有价值资料是已分离到兔和大鼠基因，并已测出了它们的相对核苷酸序列（K.A.Stoeckli et al.，Nature，Vol.342，1989，pp.920-923;Leu-Fen H.Lin et al.，Science，Vol.246，1989，pp.1023-1025）。

在此基础上，有可能利用这两个特定基因之一作为探针，以常规方法分离人CNTF，并从cDNA或基因组DNA中筛选人基因文库。

然而，这些系统对于分子生物学家是很有限的，故考虑到必须从现已可利用的新技术出发建立新的战略，如利用聚合酶链反应（PCR）（Saiki et al.，Science，239：487，1988;Scharf，S.J.，Science，233：1076，1986）。借助这一技术有可能将一个基因扩增多达10⁶个。该技术包括利用两条能与待扩增之DNA链的任一条配对的寡核苷酸。相对于基因序列，两条寡核苷酸间的距离即给定了待产生之分子的大小。这两条寡核苷酸按这样的方式构建，从而在它们的序列内包含了允许随后克隆它们的一个限制性位点。该限制性位点可以是天然存在的，也可以是通过简并最少量的核苷酸而构建的。

定义为定点诱变的这种方法，使得分子生物学家能在预定的位置上构建限制性位点。构建与其他基因片段相配合的位点不仅有利于克隆，而且可以特异地连接不同的基因片段。基于已知的兔和大鼠基因序列已构建了一系列寡核苷酸。

可将这一技术描述为以定点诱变进行克隆的技术。正是因为有了DNA重组技术，才有可能在实践中通过直接表达途径来表达完整的异源多肽，或表达与类似物多肽的部分氨基酸序列相融合的异源多肽。通常，如此得到的产物不具有生物学活性（见英国专利申请公开号2007676A;Wenzel，American Scientist 68，664，1980）。

CNTF是目前正在研究的许多生长因子之一，研究工作包括鉴定它们的生物学活性之特异性，以及设计一种借助DNA重组技术或其他纯化和提取技术而得到生长因子的方法。这些包括CNTF在内的生长因子在治疗上可用于维持神经功能之目的，并可用于防止和恢复在急、慢性病理状态下，包括影响周围、中枢和植物神经系统神经退化或免疫神经退化性质的各种病理状态下所造成的神经功能丧失。

因此，本发明涉及对分离的编码人CNTF之人基因的序列分析，相应之人CNTF氨基酸序列的鉴定，以及用重组技术生产商业上有价值的、生物学活性量的且不含人源污染蛋白的蛋白质。

本发明还涉及只含有CNTF，或由人CNTF与神经节苷酯（包括天然存在的神经节苷酯、神经节苷酯衍生物，以及半合成的神经节苷酯类似物）、多糖（包括天然的或化学修饰的多糖），和/或其他生长因子合并而成的药物组合物。

本发明进一步涉及人CNTF及上面提到的药物组合物的医疗应用。

图1显示编码人CNTF之基因的部分序列。

图2说明用三个适当的密码子将图1中的序列转录成相应的氨基酸序列。

图3显示由图1的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

图4显示将图3所示的氨基酸序列与大鼠和兔CNTF序列相比较。

图5显示将图3所示的假设的氨基酸序列之“水疗法”曲线与大鼠和兔CNTF的相应曲线相比较。

图6显示来自EMBL-3中人基因组文库之人CNTF基因的核苷酸序列。

图7显示来自gt11中人视网膜文库之人CNTF基因的核苷酸序列。

图8显示由图7所示核苷酸序列编码的人CNTF的氨基酸序列。

图9显示用于人CNTF之原核宿主表达的质粒pSVCNTFh的构建。

图10显示用于人CNTF之真核宿主表达之质粒pJLACNTF的构建。

图11图解显示对用人CNTF基因转染的CHO细胞所作生物学活性估测的结果。

在研究人CNTF基因的序列时，本发明人首先成功地对该基因的一部分作了序列测定，然后利用这一知识又成功地分析了完整基因的序列，进而鉴定了人CNTF的氨基酸序列。

本文使用并描述的方法包括适用于下面提到之特定步骤的各种通用方法。

A.一般性方法

某些反应和方法是本领域内技术人员熟知且已描述过的，如参见Molecular Cloning，Sambrook J.et al.，1989和Maniatis，T.et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Laboratory，N.Y.，1982。

按照制造商提供的说明书用限制性酶切割DNA链的连接物。通常是在20μl溶液中用1单位酶切割1μg质粒;保温温度和时间取决于所用的酶，但通常是37℃1小时。保温后，均在琼脂糖凝胶上纯化质粒和基因片段，所用的凝胶是将LMP琼脂糖（美国BRL公司）溶于40mM Tris-HCl、20mM柠檬酸钠、1mM EDTA中制得的，然后用GENECLEAN^TM药盒（BIO101Inc，La Jolla，CA-USA）从琼脂糖中分离之。

用T4连接酶进行连接反应，在20μl反应混合物中加入酶的浓度为每0.5μg DNA加1单位，于13℃下反应12小时。通过转染HB101细胞并在含有50μl/ml氨苄青霉素之LB培养基（Luria Bertani）的琼脂糖平板上选择已转化的细胞，进一步证实有正确插入的质粒序列。在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养携带质粒的HB101细胞，并用Quiagen（DIAGEN GmbH，Diis-seldorf-Germany）提供的药盒进行大量和小量纯化。根据Quiagen的使用说明书从细菌细胞中制取克隆载体。

按下述方法从足月人胎盘中制备用于PCR反应的DNA：用剪刀仔细剪碎一块0.4cm³的绒毛膜绒毛，悬浮于700μl 50mMTris/HCl（pH7.8）、100mM EDTA、100mM NaCl、1%SDS中。然后在该悬液中加入35μl蛋白酶（K，100μg/ml），并于55℃下保温过夜。再加入20μl浓度为13μg/ml的RNAase A溶液并继续保温2小时。然后用苯酶及氯仿各提取两次。加入1倍体积的异丙醇沉淀DNA于一微型玻璃试管中。即刻用70%和100%乙醇通过几次，然后干燥之。在轻轻搅拌下，将DNA溶解于缓冲液（10mM Tris/HCl（pH7.4），1mM EDTA）中。几小时后，将溶解的DNA用于基因扩增。一般情况下，0.1μg DNA即足够用于PCR反应。

按照下文所述方法从足月人胎盘中制备用于Southern印迹分析的DNA。用剪刀仔细剪碎一块0.4cm³的绒毛膜绒毛，悬浮于700μl由50mM Tris/HCl（pH 7.8）、100mM EDTA、10mM NaCl、1%SDS组成的缓冲液中，然后向其中加入35μl蛋白酶（K 100μg/ml），于55℃下保温过夜。再向其中加入20μl浓度为13μg/ml的RNase A溶液，继续保温2小时。然后用苯酚和氯仿各提取两次。再加入1倍体积的异丙醇在一个微细玻璃管中沉淀DNA。即刻用70%和100%乙醇通过几次，然后干燥沉淀的DNA。

在缓慢搅拌下，将DNA溶解于缓冲液（10mM Tris/HClpH 7.4、1mM EDTA）中。用限制性酶37℃消化过夜。然后在加于TAG（Tris乙酸EDTA）中的0.8%琼脂糖凝胶上分离各片段。将该凝胶在0.1M HCl和1.5M NaCl中洗两次，在1M NaOH和1.5M NaCl中洗两次，再在2M Tris（pH 7.4）和0.6M NaCl中洗两次，然后过夜转移到硝酸纤维素膜（Hyboud N Amersham）上。将该硝酸纤维素滤膜在紫外线下暴露3分钟，然后在50%甲酰胺、5×Denhardt′s、5×SSC、1mg/ml鲑鱼精子DNA中预杂交，并在42℃下保温2小时。在50%甲酰胺、5×Denhardt′s、5×SSC、0.250μg/ml鲑鱼精子DNA和10%葡聚糖硫酸钠中进行杂交反应过夜。将滤膜在65℃之0.1%SDS、2×SSC中洗2小时，然后作放射自显影。

按照制造商提供的使用说明书，使用380B型DNA合成仪（Applied Biosystems，USA）固相合成所有寡核苷酸。将这些寡核苷酸在氨气环境下55℃处理12小时，然后以真空速度处理。将其重新悬浮于2.5M乙酸铵中，然后用3倍体积的冷乙醇（-20℃）沉淀。再次用80%冷乙醇洗并重新悬浮在水中。用分光光度计估测寡核苷酸的浓度。

在Perkin Elmer Cetus DNA热循环器中进行扩增反应。用于扩增反应的试剂均为相关的DNA^TM扩增器（PerkinElmer-Cetus）所使用的试剂。

B.人CNTF基因的部分序列分析

为了将人CNTF片段克隆到一个质粒上，利用了可从GENEBANK得到的保藏登记号为M29828的兔CNTF核苷酸序列。从该序列合成两条寡核苷酸。第一条位于碱基123和147之间，其序列为：

5' CAGGGCCTGAACAAGAACATCAAC 3'

使第8个碱基突变形成一个ApaⅠ位点，以利于继后的克隆：

Apa Ⅰ

5' CAGGGCCCGAACAAGAACATCAAC 3'

该寡核苷酸被称为ApaⅠ。

第二条寡核苷酸包括位于碱基581至600间的片段，并与该序列互补以便于PCR反应，其序列为：

5' CTACATTTCCTTGACGTTAG 3'

在5′端加上一个SalⅠ限制性位点以利于继后的克隆。因此，合成了下示序列：

SalⅠ

5' TAGTGCACTACATTTCCTTGACGTTAG 3'

使用330B型DNA合成仪（Applied Biosystems，USA），按照制造商提供的说明书固相合成这两条寡核苷酸。将其在NH₃环境下55℃处理12小时，然后以真空速度处理。将其重新悬浮于2.5M乙酸铵中，并用3倍体积的冷乙醇（-20℃）沉淀。用80%冷乙醇再次洗涤并重新悬浮于水中。用分光光度计估测两寡核苷酸的浓度。

在Perkin Elmer Cetus DNA热循环器中进行扩增反应，所用试剂均为相关DNA^TM扩增仪试剂盒（Perkin Elmer-Cetus）的试剂。概括地说，使用各200μM寡核苷酸的混合物，各0.5μM的核苷酸dATP、dTTP、dCTP、dGTP和0.1μg人DNA及含0.5单位TAQ聚合酶制成总体积为100μl的缓冲反应混合物，然后用液体石蜡密封以防止蒸发。对于人DNA，扩增反应循环35次;对于纯化的噬菌体DNA，则循环25次。这两种情况下，各次循环均按下述条件进行：94℃1分钟，45℃2分钟，72℃3分钟。如果被扩增的序列较长，则可适当地改动上述反应条件。

在低熔点琼脂糖凝胶（Nu Sieve）[用GENECLEAN^TM药盒（BIO 101 Inc，La Jolla，CA-USA）溶解琼脂糖]上纯化已扩增的482bp片段。用限制性酶ApaⅠ和SalⅠ切割该DNA，并按上述方法再次纯化之。在pGEM-7Zf（+）载体（Promego）的ApaⅠ和XhoⅠ位点处克隆如此纯化的片段。

用pUC/M13引物（其限制性酶切图显示在该质粒的2941-2957和158-174之间）对已扩增的片段进行序列分析。

按两个方向进行序列分析，所测得的序列示于图1中，图中A代表脱氧腺苷酸残基，G代表脱氧鸟苷酸残基，C是脱氧胞苷酸残基，T是脱氧胸苷酸，图的左侧和右侧末端分别代表5′末端和3′末端。

用三个不同的可能密码子将图1所示的核苷酸序列转译成相应的氨基酸。这一可能的转译结果示于图2中。

从图2可以看出，第二种方法（第二行）转译得到一个没有终止密码子的连续基因。将如此限定的连续蛋白质序列示于图3中。

按照Needleman-Wunsch的方法将列于图3中的氨基酸序列与大鼠和兔CNTF序列对应排列（见图4）。所得肽序列的高度同源性毫无疑问地表明已分离的DNA片段与人CNTF相符合。

另外，将本发明人克隆之片段的“水疗法”曲线与兔和大鼠的比较（见图5），可以证明本发明克隆之片段链上氨基酸残基的改变基本上没有影响多肽的总体轮廓。以上两个证据实质上证明了本发明克隆的片段是与人睫状神经营养因子相符的。

C.对人CNTF基因的全序列分析

根据上文描述的人CNTF基因的部分序列，有可能收回到完整的基因片段。为此目的，对两个可由商业途径得到的、先前分离之CNTF组分的人基因文库进行分析。所使用的基因文库可通过商业途径得到。第一个文库是EMBL-3中白细胞的人基因文库，另一个是λ噬菌体gt11中人视网膜信息（cDNA）库。

C.1.分析人CNTF的EMBL-3文库

分析含有人睫状神经营养因子（CNTF）重组体之噬菌体的战略包括用由CNTF基因制备的放射活性探针检测核苷酸同源性。如Sambrook J.等人（1989）即描述过用于分析该文库的方法学。

具体地说，在四个20×20cm的平板上铺敷800，000个重组体并影印到硝酸纤维素滤膜上。将该滤膜在5×SSC、5×Danhardt′s和50%甲酰胺中42℃预杂交2小时。然后在加有10%葡聚糖硫酸钠的上述预杂交所用溶液内杂交过夜。用Boehringer“随机引物”药盒由上文所述pGEM7质粒之ApaⅠ-SalⅠ片段制备³²P标记的探针。将滤膜在0.2×SSC和0.1%SDS中50℃洗四次，各30分钟，然后再于室温下用2×SSC洗。

将四片影印的滤膜对带有加强屏的Kodak XR-5胶片曝光，进行放射自显影。对于CNTF克隆，杂交后得到20个放射自显影点。借助PCR技术并利用上文描述的寡核苷酸ApaⅠ和SalⅠ，检查这些克隆中是否有CNTF。这一分析结果显示出存在7个阳性克隆。

然后利用PCR技术再次检查这些克隆是否存在完整的CNTF。合成两条寡核苷酸，第一条是依据兔CNTF的第一股核苷酸链合成的，其具有下示序列：

5' AAC CATG GCTTTCATGGAGCTTCA 3'

Nco Ⅰ

该寡核苷酸中5′端的某些核苷酸产生了突变以便简化克隆步骤;即在某中加入了一个Nco Ⅰ位点。

第二条寡核苷酸位于人CNTF序列的第一个天然HindⅢ位点处，以便于进行继后的克隆，得到下示序列：

5' GATA AGCT TGAAGGTTCTCTTG 3'

HindⅢ

扩增结果显示在1%琼脂糖上存在一条1，500bp的带。用T4DNA激酶处理该纯化的带，然后再用Agarose/Geneclean^TM纯化之。

随后拼接HindⅢ位点并克隆到质粒pGEM7的SmaⅠ和HindⅢ位点之间，得到质粒pGEM7CNTFh。采用Sanger（1983）的方法测定该克隆的核苷酸序列，结果显示存在与人、大鼠和兔CNTF相似的序列。对携带该序列的噬菌体克隆进行均质纯化，显示出一个14Kb的插入段。分析该噬菌体内的CNTF编码序列，结果示于图6中。

图6中图解显示的基因序列包括上文和图1中描述的基因部分。

C.2.分析人视网膜噬菌体中的CNTF基因文库

从gt10中的基因库内分离编码特异性蛋白质之克隆的常规方法（Sambrook J.et al.，1989）需要使用同源于待分离之序列的放射活性探针。如果没有同源性基因探针，则可利用所研究之蛋白质的抗体。所构建的及从中分离克隆的文库是一个表达文库，例如gt11。由于出现了新技术，而可以利用PCR反应实现用放射活性基因探针筛选文库的战略。

在本发明的实际情况下，由于已分离了CNTF的基因组序列并且该序列对本发明人来说是已知的，因此可构建两条寡核苷酸以回收该基因，而不在该基因本身的5′和3′片段上增加核苷酸。称为NcoⅠ的第一条寡核苷酸位于基因的5′端，并具有下示序列：

AGC CATG GCTTTCACAGAGCAT

NcoⅠ

该序列含有有助于随后克隆的一个天然NcoⅠ限制性位点。称为EcoRⅠ的第二条寡核苷酸具有下示序列：

5' AGG AATT CTACATTTTCTTGTTGTT 3'

EcoRⅠ

该寡核苷酸含有非天然的限制性位点EcoRⅠ。

利用这两条寡核苷酸，从相当于3×10⁶个不同克隆的人视网膜文库取1μl进行PCR扩增反应（对该克隆文库作系列稀释而确定克隆数;循环30次，所用技术同前所述）。扩增产物首先用T4 DNA激酶处理，然后用Agarose/BIO 101纯化。

然后切割EcoRⅠ片段，用Agarose/BIO 101再次纯化，并克隆到质粒pGEM7的SmaⅠ和EcoRⅠ位点之间，得到质粒pGEM7 CNTFh。

该克隆的序列示于图7中。就该基因组克隆而言，它显示在起始密码子之后有一个切接的114bp片段。

比较示于图6和7中的序列，表明图7所示序列与图6所示序列的96-210和311-794之间完全一致。基于图6和7中所示的关于核苷酸序列的资料，将人CNTF蛋白质的连续氨基酸序列示于图8中，其中Met代表蛋氨酸残基、Gln代表谷氨酰胺残基，Asp为天冬氨酸残基、Pro为脯氨酸残基、Tyr为酪氨酸残基、Val为缬氨酸残基、Lys为赖氨酸残基、Glu为谷氨酸残基、Ala为丙氨酸残基、Asn为天冬酰胺残基、Leu为亮氨酸残基、Phe为苯丙氨酸残基、Ser为丝氨酸残基、Thr为苏氨酸残基、Ile为异亮氨酸残基、Trp为色氨酸残基、Arg为精氨酸残基、Cys为胱氨酸残基。该蛋白质的分子量为22.8Kd，计算的等电点为6.02。

D.人CNTF的原核表达载体

利用PCR技术修饰克隆在质粒pGEM7CNTFh之SmaⅠ位点和EcoRⅠ位点间的人CNTF cDNA，以便更好地转录蛋白质。合成一个其中某些核苷酸改变了的新的寡核苷酸NcoⅠ（2），以使编码氨基酸的密码子改为大肠杆菌优选的密码子。改变其他的核苷酸，以使之带有与表达载体的Shine-Dalgarno区域相关信息的稳定性。

该寡核苷酸的序列如下：

AGC CATG GCTTTTACTGAACATTCA

NcoⅠ

按前述方法，将用上面所说的寡核苷酸NcoⅠ（2）和EcoRⅠ进行PCR反应得到的扩增产物克隆到质粒pJLA602的NcoⅠ和EcoRⅠ位点之间（图9）。从而使人CNTF处于噬菌体PL和pR之启动子和CI⁸⁵⁷阻遏物的控制下。

将该表达质粒转染到各种大肠杆菌细胞系（包括71/18和CAG628）中，以实现该蛋白质的表达。

E.细菌生长和增殖

将含有质粒pJLA602CNTF的大肠杆菌7.0/18菌落接种于含有30μg/ml氨苄青霉素的5ml LB培养基中。使细胞在30℃下生长过夜。然后在含有20μg/ml氨苄青霉素的M9中将1等份样品以1/100的比例稀释。发酵培养细胞直到在550nm处的吸光率为0.40D。然后将发酵器快速加热到42℃。使细胞继续生长3小时，然后离心，重新悬浮于Tris/HCl（pH8.0）、10mM EDTA中并准备用于继后的提取步骤。

F.人CNTF的真核表达载体

将编码人CNTF的序列插入pSVT7真核表达质粒（Sambrook J.et al.，1989）中。为此目的使用了得自基因组克隆EMBL-3的DNA。合成两条新的寡核苷酸，第一条在该基因的5′端，第二条在该基因的3′端。这些寡核苷酸的序列如下：

5' TTG AATT CATGGCTTTCACAGAGCAT 3'

EcoRⅠ

5' TGG TCGA CTACATTTTCTTGTTGTT 3'

SalⅠ

这两条寡核苷酸还含有两个非天然存在的限制性位点EcoRⅠ和SalⅠ，而有利于继后的克隆。

因此，经PCR反应得到的扩增产物含有编码第一个外显子、第一个内含子及第二个外显子的序列。用琼脂糖，再用Geneclean纯化出约1900bp的片段，然后用EcoRⅠ-SalⅠ切割，并通过连接酶反应将其克隆到质粒pSVT7的EcoRⅠ和SalⅠ位点之间。所得表达载体示于图10中。

G.用脂质体暂时转染到中国仑鼠卵（CHO）细胞中

用5%胎牛血清培养CHO细胞。在转染的前一天用胰蛋白酶处理，并重新铺板，以使之到第二天时有80%会合。用50μlH₂O将质粒DNA pSVhCNTF稀释至浓度为10μg DNA，向其中加入50μl Lipofeetin^TM（GIBCO），然后将该混合物装在聚苯乙烯试管中。放置15分钟后，将该混合物加到已用OPTI-MEN培养基（GIBCO）洗过的细胞中。如此将细胞保温8小时，然后加入含胎牛血清的正常培养基以维持其继续生长。按Stoeckli等人（1989）所述方法估测生物学活性。

将鸡睫状神经节与培养基或用携带或不携带人CNTF之表达质粒转染的CHO溶胞产物一起保温。只有用携带人CNTF基因序列之质粒pSVhCNTF转染的溶解之CHO细胞才能维持睫状神经节存活（图11）。

H.估测人基因组中人CNTF基因的独特性

为了确定本发明分离并描述的CNTF基因是否为人基因组中仅有的CNTF基因，对用不同的限制性酶消化的10μg人胎盘DNA进行Southern印迹分析。用作标记的探针与第一次克隆人CNTF时所用探针相同，且如上文所述，该探针是利用Boehringer的随机引物药盒以³²P标记的。用2×10⁶cpm进行杂交，洗一次后进行放射自显影。曝光两天后，用HindⅢ、NcoⅠ、EcoRⅠ、XhoⅡ、PstⅠ切割DNA，均可见一条单一的带，此表明只存在一个单一的基因。

如上文所讨论的，本发明还涉及CNTF的医疗应用，及其通过含有该因子之单独或合并有其他活性物质之药物组合物的给药方法。利用CNTF可有效地保持神经功能，或阻止神经功能的丧失，并可用于治疗由于急性或慢性病理状态引起的神经功能损害，包括急性病征如脑血管性的、感染的、炎症性的、压迫性的或代谢性的病理缺陷，以及慢性或神经退化性病理状态。CNTF也可用于治疗因神经系统老化或影响免疫系统的疾病引起的神经病理状态。

药物制剂可含有活性物质，如合并有一种或多种生长因子CNTF和天然神经节苷脂（或神经节苷脂衍生物或其半合成类似物）或其盐，或这些及其他生长因子与多糖（天然的、化学修饰的或转化成终产物如生物材料）之间结合的产物。这样的药物制品可经口服、局部、直肠、非胃肠道、吸入或脑内等途径给药。因此它们可以是固体或半固体形式的，如丸剂、片剂、乳膏、明胶胶囊、胶囊、栓剂、软明胶胶囊、凝胶、薄膜、小管等剂型。对于非胃肠道或脑内给药的剂型，可以制成适于肌肉内或皮下注射给药、静脉内或脑内输注给药的剂型，故可制成活性化合物的溶液或活性化合物的冻干粉末，以便与一种或多种医药上可接受的赋形剂或稀释剂混合，制成适于上述给药途径、并具有与生理体液相容之渗透性的制剂。对于局部给药，可考虑制成适于局部使用的乳膏或软膏或喷雾剂;对于吸入给药，可考虑制成喷雾液体和喷雾剂。

本发明的制剂可用于人或动物。对于溶液、喷雾剂、软膏和乳膏，制剂中最好含有0.01%至10%的活性成分;对于固体制剂，可含有1%至100%，更好为5%至50%的活性成分。给药剂量依据个体需要、预期的效果及选择的给药途径而定，但对人体经皮下、肌肉内或脑内注射给药时，每天的剂量一般为每公斤体重0.05mg至0.5mg活性物质。

本发明还包括所有由神经节苷酯或透明质酸衍生物或这些衍生物与生长因子CNTF形成之复合物在治疗上述适应症上的应用。

可利用已知制备这类用于病人之医药上可接受之组合物的方法，制备含以DNA重组得到的人CNTF分子，不含还另外含有神经节苷脂、磷脂、透明质酸，且以有效量之CNTF分子与一种医药上可接受的载体混合而成的药物组合物。有关适用的载体物质及含其他蛋白质的配方可参见“Remington′s Pharmaceutical Sciences”（Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，USA，1985）。这些载体包括可注射的“储存配制品”。

基于上述，该药物配方可包括但不仅限于CNTF生长因子或其冻干粉末与一种或多种医药上可接受的载体或稀释剂组合成的溶液，其中存在有适当pH和与生理体液有等渗压的缓冲溶液。对于冻干制剂，载体赋形剂可以是甘露醇或甘氨酸，以及所需体积的适当缓冲溶液，以配制成具有所期望之pH适当等渗缓冲溶液。可用相同溶液在所期望体积的等渗溶液中制备经DNA重组得到的CNTF分子的药物组合物，其可含有但不仅限于适当浓度的磷酸或柠檬酸缓冲盐水，以得到有所需pH，如中性pH的等渗药物制剂。

药物制剂还可包括用于经直肠给药的栓剂，该栓剂中可含有亲水赋形剂，如水溶性、半乳化赋形剂，如糖凝胶等。在这些制剂中，由DNA重组衍生的CNTF生长因子的量可占赋形剂量的0.01%至1%（W）。栓剂中还可含有但不仅限于适当量的乙酰水杨酸盐。

下面给出某些按本发明方法制备之药物组合物的例子，旨在进一步说明而不是限定本发明。

A）可注射之溶液的例子

1号制剂 - 一个2ml小瓶内含有：

活性物质 1μg（3，200BU）

氯化钠 16mg

柠檬酸盐缓冲液，pH＝7 2ml

（在注射用水中）

2号制剂 - 一个2ml小瓶内含有：

活性物质 10μg（32，000BU）

氯化钠 16mg

柠檬酸盐缓冲液，pH＝7 2ml

（在加注射用水中）

3号制剂 - 一个2ml小瓶内含有：

活性物质 1μg（32，000BU）

氯化钠 16mg

神经节苷脂（钠盐） 100mg

柠檬酸盐缓冲液，pH＝7 2ml

（在注射用水中）

4号制剂 - 一个2ml小瓶内含有：

活性物质 10μg（32，000BU）

氯化钠 16mg

神经节苷脂（钠盐） 50mg

柠檬酸盐缓冲液pH＝7 2ml

（在注射用水中配制）

5号制剂 - 一个2ml小瓶内含有：

活性物质 1μg（3，200BU）

氯化钠 16mg

单唾液酰四己糖基神经节苷脂（GM₁）钠盐 100mg

柠檬酸盐缓冲液pH＝7 2ml

（在注射用水中配制）

6号制剂 - 一个2ml小瓶内含有：

活性物质 10μg（32，000BU）

氯化钠 16mg

单唾液酰四己糖基神经节苷脂

（GM₁）钠盐 100mg

柠檬酸盐缓冲液pH＝7 2ml

（在注射用水中配制）

7号制剂

a）一个2ml安瓶内含有：

冻干的活性物质 4μg（12，800BU）

甘氨酸 30mg

b）一个2ml安瓶的溶剂含有：

氯化钠 16mg

柠檬酸盐缓冲液 2ml

（在注射用水中配制）

8号制剂

a）一个2ml小瓶内含有：

冻干的活性物质 4μg（12，800BU）

甘露醇 40mg

b）一个2ml安瓶的溶剂含有：

氯化钠 16mg

柠檬酸盐缓冲液 2ml

（在注射用水中配制）

9号制剂

a）一个3ml小瓶内含有：

冻干的活性物质 10μg（32，000BU）

甘氨酸 45mg

b）一个3ml安瓶的溶剂含有：

氯化钠 24mg

柠檬酸盐缓冲液 3ml

（在注射用水中配制）

10号制剂

a）一个3ml小瓶内含有：

冻干的活性物质 10μg（32，000BU）

神经节苷脂（钠盐） 100mg

甘氨酸 45mg

b）一个3ml安瓶的溶剂含有：

氯化钠 24mg

柠檬酸盐缓冲液 3ml

（在注射用水中配制）

11号制剂

a）一个3ml小瓶内含有：

冻干的活性物质 10μg（32，000BU）

神经节苷脂（钠盐） 50mg

甘氨酸 45mg

b）一个3ml安瓶的溶剂含有：

氯化钠 24mg

柠檬酸盐缓冲液 3ml

（在注射用水中配制）

12号制剂

a）一个3ml小瓶内含有：

冻干的活性物质 1μg（3，200BU）

单唾液酰四己糖基神经

苷脂（GM₁）钠盐 100mg

甘氨酸 45mg

b）一个3ml安瓶的溶剂含有：

氯化钠 24mg

柠檬酸盐缓冲液 3ml

（在注射用水中配制）

13号制剂

a）一个3ml小瓶内含有：

冻干的活性物质 10μg（32，000BU）

单唾液酰四己糖基神经

节苷脂（GM₁）钠盐 100mg

甘氨酸 45mg

b）一个3ml安瓶的溶剂含有：

氯化钠 24mg

柠檬酸盐缓冲液 3ml

（在注射用水中配制）

14号制剂

a）一个3ml小瓶内含有：

冻干的活性物质 10μg（32，000BU）

3-Sn-磷脂酰-L-丝氨酸 50mg

卵磷脂 15mg

甘露醇 100mg

b）一个4ml安瓶的溶剂含有：

甘露醇 60mg

注射用水加至 4ml

15号制剂

a）一个3ml小瓶内含有：

冻干的活性物质 10μg（32，000BU）

甘露醇 60mg

b）一个3ml安瓶的溶剂含有：

氯化钠 24mg

柠檬酸缓冲液在 3ml

注射用水中

B）.皮下注射制剂的例子

16号制剂

a）一个2ml小瓶内含有：

冻干的活性物质 5μg（16，000BU）

甘露醇 30mg

b）一个2ml安瓶的溶剂含有：

氯化钠 16mg

柠檬酸缓冲液 2ml

（在注射用水中配制）

C）直肠途径给药之栓剂的例子

17号制剂

活性物质 10μg（32，000BU）

可可缓冲液 2.5mg

18号制剂

活性物质 10μg（32，000BU）

Carbowax 1540 1.75g

Carbowax 6000 0.75g

19号制剂

活性物质 10μg（32，000BU）

吐温60 2.125g

羊毛脂 0.25g

20号制剂

活性物质 10μg（32，000BU）

甘油 1.5g

水 0.25g

明胶 0.25g

很明显，基于上面所作的描述，可对这些方法做多方面的改动。这样的改动不能被视为超出了本发明的精神和目的，对于那些在本领域内专家看来是显而见的改动均应包括于本发明下述权利要求之范围内。

Claims

1、含有编码人睫状神经元营养因子之DNA序列的DNA分离物。

2、根据权利要求1的DNA分离物，其中所说的DNA包含下列核苷酸序列：

10 20 30 40 50

GGGTTTAGTT CTTTGAGAGT CACATCTCTT ATTTGGACCA GTATAGACAG

60 70 80 90 100

AAGTAAACCC ACCTGACTTG TTTCCTGGGA CAGTTGAGTT AAGGGATGGC

110 120 130 140 150

TTTCACAGAG CATTCACCGC TGACCCTTCA CCGTCGGGAC CTCTGTAGCC

160 170 180 190 200

GCTCTATCTG GCTAGCAAGG AAGATTCGTT CAGACCTGAC TGCTCTTACG

210 220 230 240 250

GAATCCTATG TAAGTTGCCT ATTTTGCTGT TATCTGAAAA CCCTTCATXX

260 270 280 290 300

XXXXXXXXXX XXCATGGGTA TGACAGAAGA TGTGGTGTTT TCCTGTATCC

310 320 330 340 350

TCGGCGAGGT GAAGCATCAG GGCCTGAACA AGAACATCAA CCTGGACTCT

360 370 380 390 400

GCGGATGGGA TGCCAGTGGC AAGCACTGAT CAGTGGAGTG AGCTGACCGA

410 420 430 440 450

GGCAGAGCCA CTCCAAGAGA ACCTTCAAGC TTATCGTACC TTCCATGTTT

460 470 480 490 500

TGTTGGCCAG GCTCTTAGAA GACCAGCAGG TGCATTTTAC CCCAACCGAA

510 520 530 540 550

GGTGACTTCC ATCAAGGTAT ACATACCCTT CTTCTCCAAG TCGCTGCCTT

560 570 580 590 600

TGCATACCAG ATAGAGGAGT TAATGATACT CCTGGAATAC AAGATCCCCG

610 620 630 640 650

CCAATGAGGC TGATGGGATG CCTATTAATG TTGGAGATGG TGGTCTCTTT

660 670 680 690 700

GAGAAGAAGC TGTGGGGCCT AAAGGTGCTG CAGGAGCTTT CACAGTGGAC

710 720 730 740 750

AGTAAGGTCC ATCCATGACC TTCGTTTCAT TTCTTCTCAT CAGACTGGGA

760 770 780 790 800

TCCCAGCACG TGGGAGCCAT TATATTGCTA ACAACAAGAA AATGTAGCAG

810 820 830 840 850

TTAGTCCCTT CTCTCTTCCT TGCTTTCTCT TCTAATGGAA TATGGGTAG

或由于其遗传密码子的简并性而得到的变异体。

3、根据权利要求1的DNA分离物，其中所说的DNA包含下列核苷酸序列：

10 20 30 40 50

ATGGCTTTCA CAGAGCATTC ACCGCTGACC CTTCACCGTC GGGACCTCTG

60 70 80 90 100

TAGCCGCTCT ATCTGGCTAG CAAGGAAGAT TCGTTCAGAC CTGACTGCTC

110 120 130 140 150

TTACGGAATC CTATGTGAAG CATCAGGGCC TGAACAAGAA CATCAACCTG

160 170 180 190 200

GACTCTGCGG ATGGGATGCC AGTGGCAAGC ACTGATCAGT GGAGTGAGCT

210 220 230 240 250

GACCGAGGCA GAGCGACTCC AAGAGAACCT TCAAGCTTAT CGTACCTTCC

260 270 280 290 300

ATGTTTTGTT GGCCAGGCTC TTAGAAGACC AGCAGGTGCA TTTTACCCCA

310 320 330 340 350

ACCGAAGGTG ACTTCCATCA AGCTATACAT ACCCTTCTTC TCCAAGTCGC

360 370 380 390 400

TGCCTTTGCA TACCAGATAG AGGAGTTAAT GATACTCCTG GAATACAAGA

410 420 430 440 450

TCCCCGCCAA TGAGGCTGAT GGGATGCCTA TTAATGTTGG AGATGGTGGT

460 470 480 490 500

CTCTTTGAGA AGAAGCTGTG GGGCCTAAAG GTGCTGCAGG AGCTTTCACA

510 520 530 540 550

GTGGACAGTA AGGTCCATCC ATGACCTTCC TTTCATTTCT TCTCATCAGA

560 570 580 590 600

CTGGGATCCC AGCACGTGGG AGCCATTATA TTGCTAACAA CAAGAAAATG

或由于其遗传密码子的简并性而得到的变异体。

4、根据权利要求1的DNA分离物，其中所说的DNA分离物有下列氨基酸序列：

5、包含编码人睫状神经元营养因子之DNA序列的重组表达载体，其中所说的载体能在被转化的微生物或细胞培养物中表达人睫状神经元营养因子。

6、根据权利要求5的重组表达载体，其中所说的DNA序列具有权利要求2中限定的核苷酸序列。

7、根据权利要求5的重组表达载体，其中所说的DNA序列具有权利要求3中限定的核苷酸序列。

8、根据权利要求5的重组表达载体，其中所说的睫状神经元营养因子具有下列氨基酸序列：

9、用权利要求5的载体转化的并能够表达人睫状神经元营养因子的微生物。

10、用权利要求6的载体转化的并能够表达人睫状神经元营养因子的微生物。

11、用权利要求7的载体转化的并能够表达人睫状神经元营养因子的微生物。

12、用权利要求8的载体转化的并能够表达人睫状神经元营养因子的微生物。

13、根据权利要求9-12中任一项的大肠杆菌微生物。

14、用权利要求5的载体转化的并能够表达人睫状神经元营养因子的细胞培养物。

15、用权利要求6的载体转化的并能够表达人睫状神经元营养因子的细胞培养物。

16、用权利要求7的载体转化的并能够表达人睫状神经元营养因子的细胞培养物。

17、用权利要求8的载体转化的并能够表达人睫状神经元营养因子的细胞培养物。

18、根据权利要求14-17中任一项的细胞培养物，其中所说的细胞系是非人哺乳动物细胞系。

19、根据权利要求18的细胞培养物，其中所说的细胞系是中国仑鼠卵细胞系。

20、不含人源污染蛋白质的基本上纯的人睫状神经元营养因子。

21、根据权利要求20的基本上纯的人睫状神经元营养因子，其具有下列氨基酸序列：

22、一种医药组合物，其含有神经治疗有效量之根据权利要求20的人睫状神经元营养因子和医药上可接受的载体或稀释剂。

23、一种医药组合物，其含有神经治疗有效量之根据权利要求21的人睫状神经元营养因子和医药上可接受的载体或稀释剂。

24、根据权利要求22或23的医药组合物，其进一步包含天然神经节苷脂，或其衍生物，或半合成类似物，或这种神经节苷脂的盐。

25、根据权利要求22或23的医药组合物，其进一步包含天然多糖，或这种多糖的衍生物或半合成类似物。

26、根据权利要求25的医药组合物，其中所说的多糖是透明质酸。

27、通过维持、防止丧失或恢复神经功能以治疗神经病变的方法，其包括给病人使用有效量的根据权利要求20的人睫状神经元营养因子。

28、通过维持、防止丧失或恢复神经功能以治疗神经病变的方法，其包括给病人使用有效量的根据权利要求21的人睫状神经元营养因子。

29、通过维持、防止丧失或恢复神经功能以治疗神经病变的方法，其包括给病人使用有效量的根据权利要求24的医药组合物。

30、通过维持、防止丧失或恢复神经功能以治疗神经病变的方法，其包括给病人使用有效量的根据权利要求25的医药组合物。

31、治疗因神经系统老化或影响免疫系统之疾病引起之神经病理状态的方法，其包括给病人使用有效量的根据权利要求20的人睫状神经元营养因子。

32、治疗因神经系统老化或影响免疫系统之疾病引起之神经病理状态的方法，其包括给病人使用有效量的根据权利要求21的人睫状神经元营养因子。

33、治疗因神经系统老化或影响免疫系统之疾病引起之神经病理状态的方法，其包括给病人使用有效量的根据权利要求24的医药组合物。

34、治疗因神经系统老化或影响免疫系统之疾病引起之神经病理状态的方法，其包括给病人使用有效量的根据权利要求25的医药组合物。