CN101050238A - 白喉毒素与gm－csf突变体的融合蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种白喉毒素与GM－CSF突变体的融合蛋白及其编码基因与应用。该白喉毒素与GM－CSF突变体的融合蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有杀伤急性髓系白血病细胞活性的由(a)衍生的蛋白质。该白喉毒素与GM－CSF突变体的融合蛋白不但表达量高，同时还保持了杀伤靶细胞的活性。

Description

白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是成人中发病率最高、儿童中发病率第二高的白血病，美国2006年预期新发病例为11,930例。目前用阿糖胞苷等化疗药物治疗AML的药效显著，完全缓解率可以达到70％。但是大多数患者长期用药产生耐药性，最终会死于复发或治疗综合征(complication of treatment)。复发和难治性AML患者的存活中数是几个星期或几个月，因此急需能够避免多药耐药表型的、具有独特治疗机制的新型药物。目前已知在88％AML患者的白血病细胞表面过量表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte Macrophage ColonyStimulating Factor，GM-CSF)高亲和力受体(GM-CSFReceptor，GM-CSFR)，而骨髓中的正常造血祖细胞，多能造血干细胞表面未发现有GM-CSFR(Hogge DE，WillmanCL，Kreitman RJ，Berger M，Hall PD，Kopecky KJ，McLain C，Tagge EP，EavesCJ，Frankel AE.Malignant progenitors from patients with acute myelogenousleukemia are sensitive to a Diphtheria Toxin-Granulocyte-MacrophageColony-Stimulating Factor fusion protein.Blood，1998，92(2)：589-595)。因此，GM-CSFR可能成为特异性治疗AML的药物靶标。

免疫毒素作为导向治疗药物，利用抗体、细胞因子等导向部分识别并结合特定的靶细胞表面，内吞进入细胞后，毒素效应部分发挥其细胞毒作用，从而特异性杀伤靶细胞。白喉毒素(Diphtheria toxin，DT)是一种高效的生物毒素，全长535aa，分子量为58,330D，结构可分为3个彼此独立的结构域：N端1-193aa是酶活性区(Catalytic Domain，C区，DTA片段)，205-378aa是跨膜转运区(TransmembraneDomain，T区)，386-535aa是细胞膜受体结合区(Receptor Binding Domain，R区)。这3个结构域在一级结构上不交叉，三级结构上也彼此独立。在制备融合蛋白免疫毒素时，保存C和T区，R区用配体分子替换。由于白喉毒素类免疫毒素杀灭细胞的机制与传统治疗药物破坏DNA或细胞分裂的机制不同，是通过C区的ADP核糖基转移酶活性使真核细胞核糖体中的蛋白翻译延伸因子EF2失活，抑制细胞蛋白的翻译表达，并最终诱导靶细胞的凋亡，因此白喉毒素类免疫毒素对复发的、耐化疗药物的肿瘤细胞具有特异杀伤作用。目前唯一经美国FDA批准上市的免疫毒素即采用了截短的白喉毒素和IL2的融合蛋白(DAB₃₈₉-IL2)。因此，以GM-CSFR为靶向的导向药物将有效地特异性杀伤AML细胞，同时对机体的造血功能不造成严重损伤，从而有望为AML患者提供一种新型的、高特异性的治疗药物。目前虽然临床试验表明DT₃₈₈-GMCSF有10％的有效性，但是发现DT-GMCSF形式的免疫毒素有2个重要的缺点：首先，其在大肠杆菌中的表达量非常低，不利于大量生产(Williams MD，RostovtsevA，Narla RK，Uckun FM.Production of recombinant DT_ct GMCSF fusion toxin ina baculovirus expression vector system for biotherapy of GMCSF-receptorpositive hematologic malignancies.Protein expr purif，1998.13：210-221)。虽然有人发现在杆状病毒表达系统中可以得到高表达，但是由于迄今为止尚无杆状病毒表达的蛋白药物得到FDA的批准，可能继续研制的阻力比较大。其次，在临床研究中发现具有肝毒性，可能是肝脏的枯比细胞具有GMCSF受体而造成的损伤，(Frankel AE，Powell BL，Hall PD，Case LD，Kreitman RJ.Phase I trial of anovel diphtheria toxin/granulocyte macrophage colony-stimulating factorfusion protein(DT388GMCSF)for refractory or relapsed acute myeloid leukemia.Clin Cancer Res，2002，8(5)：1004-13；Westcott MM，Abi-Habib RJ，Cohen KA，Willingham MC，Liu S，Bugge TH，Leppla SH，Frankel AE.Diphtheria toxin-murinegranulocyte-macrophage colony-stimulating factor-induced hepatotoxicity ismediated by Kupffer cells.Mol Cancer Ther.2004，3(12)：1681-9)故而仍需对蛋白进行改进，以降低体内的毒性。

发明内容

本发明的一个目的是提供白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白及其编码基因。

本发明所提供的白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白，名称为DT₃₈₆-GMCSF123GVT，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有杀伤急性髓系白血病细胞活性的由(a)衍生的蛋白质。

其中，序列表中的序列2由511个氨基酸残基组成。自序列2的氨基末端第1位-387位氨基酸残基为白喉毒素片段，自序列2的氨基末端第388位氨基酸残基为linker，自序列2的氨基末端第389位-第511位氨基酸残基为GM-CSF突变体。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列2自第502位至第504位氨基酸残基进行取代和/或缺失和/或添加。

上述白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白编码基因(DT₃₈₆-GMCSF 123GVT)也属于本发明的保护范围。

所述白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白的编码基因，其核苷酸序列是编码序列表中序列2的蛋白质的多核苷酸。

所述白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白的编码基因的编码序列可为序列表中序列1的自5′末端第1位至1536位脱氧核糖核苷酸组成的核苷酸序列。

所述白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白的编码基因，具体可为如下1)或2)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白的DNA分子。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

序列表中的序列1由1536个脱氧核糖核苷酸组成。

含有上述白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系和转基因宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种表达上述白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白的方法。

本发明所提供的表达上述白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白的方法，是将上述白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白编码基因插入原核细胞表达载体，获得含有所述白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白的编码基因的重组表达载体，再将所述重组表达载体导入大肠杆菌，筛选得到表达所述白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白的工程细胞，培养所述工程细胞，表达得到上述白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白。

所述原核细胞表达载体可为现有的可在大肠杆菌中表达外源基因的载体，如pET11a、pET3a、pET22a、pET30a、pSE420、pRSET、pDOGA、pBV220。

所述大肠杆菌可为大肠肝菌DH5α、E.coli TB1或E.coli BL21(DE3)等。

当所述表达载体为pET11a，所述白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白编码基因插入pET11a的Nde I和Bam HI位点，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3，pLysS)。

本发明的白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白DT₃₈₆-GMCSF 123GVT，不但表达量提高，同时还保持了杀伤靶细胞的活性。本发明的白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白DT₃₈₆-GMCSF 123GVT，在大肠杆菌中有较高的表达量，为菌株总蛋白的3-5％，相比于DT₃₈₆-GMCSF蛋白在SDS-PAGE上看不到表达条带的情况，有了很大的提高。本发明的白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白DT₃₈₆-GMCSF 123GVT，以GM-CSFR为靶向，具有杀伤人AML细胞系HL60来源的肿瘤单细胞的活性，IC₅₀为1.5×10^-7mol/L(MTS方法)。

本发明的白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白DT₃₈₆-GMCSF 123GVT可作为活性成分，制备治疗急性髓系白血病的药物。

需要的时候，在所述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体等。

本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本领域技术人员可根据实际情况确定给药剂量，如可为1-50μg DT₃₈₆-GMCSF123GVT/kg体重/天，连续给药或隔天给药，疗程为3-7天。

附图说明

图1为DT₃₈₆-GMCSF基因克隆、表达质粒的酶切鉴定结果

图2A为DT₃₈₆-GMCSF表达的SDS-PAGE结果

图2B为Western blot分析DT₃₈₆-GMCSF纯化样品

图3A为DT₃₈₆、DT₃₈₆-GMCSF截短突变体的结构示意图

图3B为DT₃₈₆、DT₃₈₆-GMCSF截短突变体表达产物的SDS-PAGE结果

图3C为DT₃₈₆、DT₃₈₆-GMCSF截短突变体表达产物的Western blot结果

图3D为DF113与DF114表达量的比较

图4A为DF114V、DF114I、DF114G、DF115GL、DF115VL、DF115IL表达产物的SDS-PAGE结果

图4B为DF116GVT和DF117G表达产物的SDS-PAGE结果

图4C为DF123GVT和DF123G表达产物的SDS-PAGE结果

图4D为DF123GVT表达产物的SDS-PAGE结果

图5A为DT₃₈₆-GMCSF 123GVT的Q-Sepharose FF层析图

图5B为Q-Sepharose FF纯化的DT₃₈₆-GMCSF 123GVT的SDS-PAGE结果

图5C为Q-Sepharose FF纯化的DT₃₈₆-GMCSF 123GVT的Western blot分析结果

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白DT₃₈₆-GMCSF 123GVT的表达

一、白喉毒素与GM-CSF的融合蛋白DT₃₈₆-GMCSF的表达

1、DT₃₈₆-GMCSF表达质粒的构建

人工合成由大肠杆菌偏好密码子组成的人GM-CSF基因(将该基因称为GM-CSFm)的ORF，插入pcDNAII(Invitrogen，V40020)的EcoR V位点，得到重组载体pcDNAII-GMCSFm。其中，GM-CSFm的ORF的核苷酸序列是序列表中序列3(序列3由390个核苷酸组成)。

以pcDNAII-GMCSFm为模板，以带有SphI酶切位点的引物GFS与带有BamH I酶切位点的引物GFP14，进行PCR扩增。PCR产物长度约为400bp，平端连接插入pcDNAII质粒EcoR V位点。将经Sph I和Bam HI双酶切和测序鉴定结果表明，插入的片段具有核苷酸序列是序列表中序列3(序列3为GM-CSFm的ORF，由390个核苷酸组成)的自5’端第4位至第387位脱氧核糖核苷酸的重组质粒称为pcDNAII/GMCSFmSB。对pcDNAII/GMCSFmSB进行Sph I、Bam HI双酶切，得到GM-CSFmSB片段，回收保存于-20℃。其中，引物GFS的核苷酸序列是：5’＞GGCATGCGCCT GCTCGT＜3’，引物GFP14的核苷酸序列是：5’＞TGGATCCCTATCACGCTT＜3’。pcDNAII/GMCSFmSB的Sph I和Bam HI双酶切鉴定结果如图1中的泳道3。

以质粒pGEM/DT(张新建，李晶，张宝云，等.白喉毒素/IL-6的高效表达及细胞毒作用的研究.生物化学与生物物理学报，1998，30(2)：169-173.)为模板，用分别带有Nde I和Sph I酶切位点的引物DT1N、DTS进行PCR扩增，DTS中引入1个His密码子。其中，DT1N的核苷酸序列是：5’＞GTC ATA TGG GCG CTG ATG＜3’，DTS的核苷酸序列是：5’＞TGG GCA TGC GTT TTA TG＜3’。PCR产物长度约为1.2kb，平端连接插入pcDNAII质粒EcoR V位点。将经Nde I和Sph I双酶切和测序鉴定结果表明，插入的片段是具有核苷酸序列是序列1的自5′端第403位至第1560位脱氧核糖核苷酸的DT₃₈₆ NS片段的重组质粒称为pcDNAII/DT₃₈₆NS。对pcDNAII/DT₃₈₆ NS进行Nde I和Sph I双酶切，回收DT₃₈₆NS片段。其中，pcDNAII/DT₃₈₆ NS的Nde I和Sph I双酶切鉴定结果如图1的泳道2。

将上述回收的双酶切GM-CSFmSB片段与DT₃₈₆NS片段以1∶1比例混合，定向插入经NdeI和BamHI双酶切的质粒pET11a(Novagen)，转化E.coli DH5α。将经NdeI或BamHI单酶切以及NdeI和BamHI双酶切鉴定正确的重组表达质粒命名为pET11a/DT₃₈₆-GMCSF。pET11a/DT₃₈₆-GMCSF的NdeI单酶切鉴定结果如图1中的泳道5，pET11a/DT₃₈₆-GMCSF的BamHI单酶切鉴定结果如图1中的泳道6，pET11a/DT₃₈₆-GMCSF的NdeI和BamHI双酶切鉴定结果如图1中的泳道8。图1中，泳道1，4，7分别为DNA分子量标准DL2000，DL2000+DL15000，DL2000+DL15000(Takara)。pET11a/DT₃₈₆-GMCSF的测序结果表明，该质粒含有核苷酸序列是序列表中序列4的DT₃₈₆-GMCSF基因。pET11a/DT₃₈₆-GMCSF表达氨基酸序列是序列表中序列5的融合蛋白DT₃₈₆-GMCSF，自序列5的氨基末端第1位-387位氨基酸残基为白喉毒素片段，自序列5的氨基末端第388位氨基酸残基为linker，自序列5的氨基末端第389位-516位氨基酸残基为GM-CSF。

2、DT₃₈₆-GMCSF的表达

将pET11a/DT₃₈₆-GMCSF转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3，plysS)，挑取阳性单菌落接种于5ml含抗生素(100μg/ml氨苄青霉素)的LB培养液中，37℃扩大培养，按照如下方法进行诱导表达：菌种按2-5％的体积比转种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，继续培养至约OD₆₀₀ 0.4~0.6，加入终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导表达，3~6h后，8,000rpm离心5min收集菌体。按照文献(萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T著.金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南，第二版，北京：科学出版社，1992.)中描述的方法制备SDS-PAGE样品：用PBS溶液洗涤并重悬菌体，加入等体积的2×SDS-PAGE样品处理液，煮沸5min。并按照上述文献方法进行12％的SDS-PAGE电泳分析，观察蛋白表达情况。结果如图2A所示，表明未见有明显表达条带，仅Western blot分析表明在57kDa左右位置可见微弱目的蛋白条带。图2A中，泳道1为蛋白质分子量标准，2为转化重组质粒pET11a/DT₃₈₆-GMCSF的大肠杆菌未进行IPTG诱导的表达产物，3为转化重组质粒pET11a/DT₃₈₆-GMCSF的大肠杆菌进行IPTG诱导的表达产物。

3、DT₃₈₆-GMCSF的纯化

将DT₃₈₆-GMCSF表达菌株按照如下方法进行大量诱导表达：挑取转化有表达质粒的E.coli表达菌单个菌落，接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振摇培养过夜，作为一级种子。一级种子以1％的体积比接入100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液(500ml容器)，37℃振摇培养过夜，作为二级种子。二级种子以2～5％的体积比接入2L含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液(5L容器)，37℃培养约3h，至OD600 0.4～0.6，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，继续培养6h。8,000rpm，4℃离心10min，收集菌体。取湿菌体10g，超声破碎细胞，离心收集上清液。将上清液上样至Q-SepharoseFF离子交换柱(40ml，Pharmacia)，A液(20mmol/LTris-HCl，1mmol/L EDTA，pH7.4)淋洗平衡后，用A液与B液(B液为含1.0mol/L NaCl的A液，pH7.4)进行梯度洗脱，收集25％(体积比)B液的洗脱峰，进行Western blot分析，结果如图2B所示，可见57kDa目的蛋白条带。图2B中，泳道1-2为Q-SepharoseFF强阴离子层析柱纯化的DT₃₈₆-GMCSF，泳道3为蛋白质分子量标准，4为白喉毒素-白细胞介素2(DAB₃₈₉-IL2)。将Q-SepharoseFF纯化样品冻干浓缩后用于活性测定。

其中，Western blot分析以白喉毒素A片段(DTA)抗体为一抗，并按照上述文献“萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T著.金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南，第二版，北京：科学出版社，1992.”中描述的方法进行。白喉毒素A片段(DTA)及其抗体按照文献：“欧阳晶，王健伟，王春晓，郭丽，脱厚珍，崔婷，洪涛.白喉毒素A片段的表达纯化与单克隆抗体制备，生物工程学报，2004，20(5)：689-693”中描述的方法制备；白喉毒素-白细胞介素2(DAB₃₈₉-IL2)按照文献：“刘扬，王健伟，屈建国，王春晓，洪涛.白喉毒素-白细胞介素2重组嵌合毒素的克隆表达及特异性细胞毒作用的研究.病毒学报，2001，17(2)：117-121”中描述的方法制备。

二、白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白DT₃₈₆-GMCSF 123GVT的表达

1、DT₃₈₆-GMCSFm各种截短基因和突变体表达质粒的构建及表达

以pET11a/DT₃₈₆-GMCSF为模板，以带有Nde I酶切位点的引物DT1N与下述带有Bam HI酶切位点的引物中的任意一种：GFS44、GFS87、GFS101、GFS109、GFS113、GFS115和GFS114，用Vent酶进行PCR扩增一系列具有不同长度3’末端缺失的DT₃₈₆-GMCSF截短基因片段。DT1N和GFS44是扩增核苷酸序列是序列表中序列4的自5′端第1至第1296位脱氧核糖核苷酸的DF44编码基因的引物，DT1N和GFS87是扩增核苷酸序列是序列表中序列4的自5′端第1至第1425位脱氧核糖核苷酸的DF87编码基因的引物，DT1N和GFS101是扩增核苷酸序列是序列表中序列4的自5′端第1至第1467位脱氧核糖核苷酸的DF101编码基因的引物，DT1N和GFS109是扩增核苷酸序列是序列表中序列4的自5′端第1至第1491位脱氧核糖核苷酸的DF109编码基因的引物，DT1N和GFS113是扩增核苷酸序列是序列表中序列4的自5′端第1至第1503位脱氧核糖核苷酸的DF113编码基因的引物，DT1N和GFS114是扩增核苷酸序列是序列表中序列4的自5′端第1至第1506位脱氧核糖核苷酸的DF114编码基因的引物，DT1N和GFS115是扩增核苷酸序列是序列表中序列4的自5′端第1至第1509位脱氧核糖核苷酸的DF115编码基因的引物。DF44、DF87、DF101、DF109、DF113、DF114和DF115分别终止于GM-CSF的第44、87、101、109、113、114和115位氨基酸(图3A)。DF44的氨基酸序列由序列表中序列5的自氨基末端第1至第432位氨基酸残基组成，DF87的氨基酸序列由序列表中序列5的自氨基末端第1至第475位氨基酸残基组成，DF101的氨基酸序列由序列表中序列5的自氨基末端第1至第489位氨基酸残基组成，DF109的氨基酸序列由序列表中序列5的自氨基末端第1至第497位氨基酸残基组成，DF113的氨基酸序列由序列表中序列5的自氨基末端第1至第501位氨基酸残基组成，DF114的氨基酸序列由序列表中序列5的自氨基末端第1至第502位氨基酸残基组成，DF115的氨基酸序列由序列表中序列5的自氨基末端第1至第503位氨基酸残基组成。

其中，各种GM-CSF截短引物的序列如下：

DT1N：5’＞GTC ATA TGG GCG CTG ATG＜3’

GFS44：5’＞TGG GGA TCC TAG ATT ACT TC＜3’

GFS87：5’＞TGG GGA TCC TAC TGT TTA TAG＜3’

GFS101：5’＞TGG GGA TCC TAT GTC TGG GT＜3’

GFS109：5’＞TGG GGA TCC TAG TTT TCT TT＜3’

GFS113：5’＞GGG TTT GGA TCC TAG AAG TCT TT＜3’

GFS115：5’＞TGG GGA TCC TAA AGC AGG AAG＜3’

GFS114：5’＞GGTGGATCCGGTTACAGGAAGTCTTT＜3’

以pET11a/DT₃₈₆-GMCSF为模板，以带有Nde I酶切位点的引物DT1N和带有Bam HI酶切位点的引物DTB(5’＞TGGGGATCCTACGT TTTATG＜3’)，用Vent酶进行PCR扩增核苷酸序列是序列表中序列4的自5′端第1至第1161位脱氧核糖核苷酸的DT₃₈₆编码基因。

上述PCR反应条件均为94℃45s，54℃60s，72℃90s，共进行30个循环。将PCR产物平端连接插入pCDNAII质粒EcoR V位点。酶切和测序鉴定正确的重组质粒经Nde I、Bam HI双酶切，得到一系列具有不同长度3’末端缺失的DT₃₈₆-GMCSF截短基因片段：DF44、DF87、DF101、DF109、DF113、DF115和DF114编码基因，以及DT₃₈₆编码基因。将上述回收的双酶切DT₃₈₆-GMCSF截短基因以及DT₃₈₆编码基因分别定向插入经同样双酶切的质粒pET11a的Nde I和Bam HI位点，转化E.coli DH5α。酶切鉴定和测序结果正确的如下重组质粒转化表达菌株大肠杆菌BL21(DE3，plysS)：含有DF44编码基因重组质粒pET11a/DF44，含有DF87编码基因重组质粒pET11a/DF87，含有DF101编码基因重组质粒pET11a/DF101，含有DF109编码基因重组质粒pET11a/DF109，含有DF113编码基因重组质粒pET11a/DF113，含有DF114编码基因重组质粒pET11a/DF114，含有DF115编码基因重组质粒pET11a/DF115。

挑取阳性单菌落扩增培养，按照如下方法进行诱导表达：菌种按2-5％的体积比转种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，继续培养至约OD₆₀₀ 0.4-0.6，加入终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导表达，3-6h后，8,000rpm离心5min收集菌体。按照文献(萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T著.金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南，第二版，北京：科学出版社，1992.)中描述的方法制备SDS-PAGE样品：用PBS溶液洗涤并重悬菌体，加入等体积的2×SDS-PAGE样品处理液，煮沸5min。并按照上述文献方法进行12％的SDS-PAGE电泳分析，观察蛋白表达情况。以白喉毒素A片段(DTA)抗体为一抗进行Western blot杂交。其中，Western blot分析方法同上；白喉毒素A片段(DTA)及其抗体按照文献：“欧阳晶，王健伟，王春晓，郭丽，脱厚珍，崔婷，洪涛.白喉毒素A片段的表达纯化与单克隆抗体制备，生物工程学报，2004，20(5)：689-693”中描述的方法制备。

DT₃₈₆、DF44、DF87、DF101、DF109和DF115的SDS-PAGE结果如图3B所示，Westernblot结果如图3C所示，表明转化含有DT₃₈₆编码基因质粒表达得到43kDa的DT₃₈₆，转化含有DF44编码基因质粒表达得到48kDa的DF44，转化含有DF87编码基因质粒表达得到52kDa的DF87，转化含有DF101编码基因质粒表达得到54kDa的DF101，转化含有DF109编码基因质粒表达得到55kDa的DF109，转化含有DF113编码基因质粒表达得到55kDa的DF113，转化含有DF114编码基因质粒表达得到55kDa的DF114，转化含有DF115编码基因质粒表达得到55kDa的DF115。DT₃₈₆、DF44、DF87、DF101、DF109与DT₃₈₆均得到高表达，而DF115的表达量明显低于DF109。这充分说明影响DT₃₈₆-GMCSF表达量的原因可能与mRNA形成某种稳定的二级结构有关，而且这种二级结构在DT₃₈₆与GM-CSF基因之间形成的，GM-CSF自109位氨基酸以后(或aa109～115之间)的基因序列可能参与了这种mRNA稳定结构的形成，从而阻止全长蛋白的表达。

图3B和图3C中，1：DT₃₈₆；2：DF44；3：DF87；4：DF101；5：DF109；6：DF115；7：蛋白分子量标准；8：白喉毒素-白细胞介素2DAB₃₈₆-IL2。其中，白喉毒素-白细胞介素2DAB₃₈₆-IL2按照文献：“刘扬，王健伟，屈建国，王春晓，洪涛.白喉毒素-白细胞介素2重组嵌合毒素的克隆表达及特异性细胞毒作用的研究.病毒学报，2001，17(2)：117-121”中描述的方法制备。

DF113和DF114的SDS-PAGE结果如图3D所示，表明DF113与DF114的表达量有明显的不同，DF113的表达量明显高于DF114的表达量，因此，编码114位氨基酸残基的序列是打破DT₃₈₆与GM-CSF基因之间mRNA稳定结构的关键点。图3D中，泳道1是蛋白分子量标准，2是转化重组质粒pET11a/DF113的大肠杆菌未进行IPTG诱导的表达产物，3是转化重组质粒pET11a/DF113的大肠杆菌进行IPTG诱导的表达产物，4是转化重组质粒pET11a/DF114的大肠杆菌未进行IPTG诱导的表达产物，5是转化重组质粒pET11a/DF114的大肠杆菌进行IPTG诱导的表达产物。

2、DT₃₈₆-GMCSFm各种突变体的表达

为了获得较高表达量的融合蛋白，表达了以下几种DT₃₈₆-GMCSFm的突变体：DF114V、DF114I、DF114G、DF115GL、DF115VL、DF115IL、DF116GVT、DF117G、DF123G和DF123 GVT。

鉴于GM-CSF 114位氨基酸残基的编码序列可能在重组蛋白的表达中产生重要影响，将DF114的羧基末端氨基酸残基，即自序列5的氨基末端第502位氨基酸残基leu(即GM-CSF 114位，记为114(Leu))突变为Gly、Ile和Val的3种突变体，分别标记为DF114G、DF114I及DF114V。

在上述基础上，对3种突变体DF114G、DF114I及DF114V分别进行了1个氨基酸的序列延伸，在它们的羧基末端氨基酸残基后添加一个Leu，记为115(Leu)，分别构建DF115GL、DF115IL和DF115VL突变体。将DF114G进行2个氨基酸残基的序列延伸，在它的羧基末端氨基酸残基后添加VT，即自序列5的氨基末端第502位至第504位氨基酸残基分别突变为Gly Val Thr，该突变记为114(Gly)115(Val)116(Thr)，得到DF116GVT。对突变体DF115GL进行2个氨基酸残基的序列延伸，在它的羧基末端氨基酸残基后添加VI，得到突变体DF117G。分别在DF116GVT与DF117G突变体的羧基末端添加按如下顺序排列的7或6个氨基酸残基IPFDCWE或PFDCWE，得到突变体DF123GVT与DF123G。

具体方法如下：以pET11a/DT₃₈₆-GMCSF为模板，以带有Nde I酶切位点的引物DT1N与下述带有Bam HI酶切位点的引物中的任意一种：GF114V、GF114I、GF114G、GF115GL、GF115VL、GF115IL、GF116GVT和GF117G，用Vent酶进行PCR扩增。DT1N和GF114V是扩增DF114V编码基因的引物，DT1N和GF114I是扩增DF114I编码基因的引物，DT1N和GF114G是扩增DF114G编码基因的引物，DT1N和GF115GL是扩增DF115GL编码基因的引物，DT1N和GF115VL是扩增DF115VL编码基因的引物，DT1N和GF115IL是扩增DF115IL编码基因的引物，DT1N和GF116GVT是扩增DF116GVT编码基因的引物，DT1N和GF117G是扩增DF117G编码基因的引物。上述PCR反应条件均为94℃45s，54℃60s，72℃90s，共进行30个循环。将PCR产物平端连接插入pCDNAII质粒EcoR V位点。酶切和测序鉴定正确的重组质粒经Nde I、Bam HI双酶切，得到一系列DT₃₈₆-GMCSF突变体基因片段：DF114V、DF114I、DF114G、DF115GL、DF115VL、DF115IL、DF116GVT和DF117G编码基因。将上述回收的双酶切DT₃₈₆-GMCSF突变体基因片段分别定向插入经同样双酶切的质粒pET11a的Nde I和Bam HI位点，经酶切和测序鉴定得到如下重组表达质粒：含有DF114G编码基因重组质粒pET11a/DF114G，含有DF114I编码基因重组质粒pET11a/DF114I，含有DF114V编码基因重组质粒pET11a/DF114V，含有DF115GL编码基因重组质粒pET11a/DF115GL，含有DF115IL编码基因重组质粒pET11a/DF115IL，含有DF115VL编码基因重组质粒pET11a/DF115VL，含有DF116GVT编码基因重组质粒pET11a/DF116GVT，含有DF117G编码基因重组质粒pET11a/DF117G。

以带有下述突变体编码基因的重组质粒pET11a/DF116GVT、pET11a/DF117G分别为模板，以带有Nde I酶切位点的引物DT1N与下述带有Bam HI酶切位点的引物中的任意一种：GF123G和GF123GVT，用Vent酶进行PCR扩增。DT1N和GF123G是扩增DF123G编码基因的引物，DT1N和GF123GVT是扩增DF123GVT编码基因的引物。同上方法进行PCR。将PCR产物平端连接插入pcDNAII质粒EcoR V位点。酶切和测序鉴定正确的重组质粒经Nde I、Bam HI双酶切，得到DT₃₈₆-GMCSF突变体基因片段：DF123G和DF123GVT编码基因。将上述回收的双酶切DT₃₈₆-GMCSF突变体基因片段分别定向插入经同样双酶切的质粒pET11a的Nde I和Bam HI位点，转化E.coli DH5α。经酶切和测序鉴定得到含有DF123G编码基因的重组表达质粒pET11a/DF123G，和含有DF123GVT编码基因的重组表达质粒pET11a/DF123GVT。

其中，DT₃₈₆-GMCSFm各种突变体引物的序列如下：

GF114V：5’＞CCTGGTGGATCCTATACGAAGTCTTT＜3’

GF114I：5’＞CCCCTGGTGGATCCTAAATGAAGTCTTT＜3’

GF114G：5’＞GGTGGTGGATCCTAACCGAAGTCTTT＜3’

GF115GL：5’＞GGTGGATCCTACAGACCGAAGTCTTT＜3’

GF115VL：5’＞GGTGGATCCTACAGTACGAAGTCTTT＜3’

GF115IL：5’＞GGTGGATCCTACAGAATGAAGTCTTT＜3’

GF116GVT：5’＞GCGGGATC CTATGTTACACCGAAGTCTTT＜3’

GF117G：5’＞GGGGTGGATC CTAAATTACCAGACCGAAGTCTTT＜3’

GF123G：5’＞GGGTGGATCCTATTCCCAACAGTCAAATGGAATTACC＜3’

GF123GVT：5’＞GGGTGGATC CTATTCCCAACAGTCAAATGG AATTGTTAC＜3’

将如下重组质粒转化表达菌株大肠杆菌BL21(DE3，p1ysS)：含有DF114G编码基因重组质粒pET11a/DF114G，含有DF114I编码基因重组质粒pET11a/DF114I，含有DF114V编码基因重组质粒pET11a/DF114V，含有DF115GL编码基因重组质粒pET11a/DF115GL，含有DF115IL编码基因重组质粒pET11a/DF115IL，含有DF115VL编码基因重组质粒pET11a/DF115VL，含有DF116GVT编码基因重组质粒pET11a/DF116GVT，含有DF117G编码基因重组质粒pET11a/DF117G，含有DF123G编码基因重组质粒pET11a/DF123G，含有DF123GVT编码基因重组质粒pET11a/DF123GVT。分别挑取阳性单菌落扩增培养，按照如下方法进行诱导表达：菌种按2-5％的体积比转种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，继续培养至约OD₆₀₀ 0.4-0.6，加入终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导表达，3-6h后，8,000rpm离心5min收集菌体。同时诱导表达转化pET11a、上述pET11a/DF114、pET11a/DF115的大肠杆菌BL21(DE3，plysS)作为对照，或用未诱导表达的转化pET11a/DF116GVT、pET11a/DF117G，pET11a/DF123GVT、pET11a/DF123G的大肠杆菌BL21(DE3，plysS)作为对照。按照文献(萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T著.金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南，第二版，北京：科学出版社，1992.)中描述的方法制备SDS-PAGE样品：用PBS溶液洗涤并重悬菌体，加入等体积的2×SDS-PAGE样品处理液，煮沸5min。并进行12％的SDS-PAGE电泳分析，观察蛋白表达情况。结果如图4A-4D所示。其中，12％的SDS-PAGE方法同上。各突变体的表达量通过凝胶扫描方法和相应软件(Pharmacia公司，分析软件ImageMaster TotalLab)进行定量，结果见表1。

     表1  免疫毒素DT₃₈₆-GMCSF突变体蛋白的表达量

融合蛋白	占菌体总蛋白百分比(％)	以100kDa菌体蛋白为内对照，占菌体总蛋白的相对百分比(％)
			DT386-GMCSF	ND*	ND
DF113DF114DF114GDF114IDF114VDF115DF115GDF115IDF115VDF116GVTDF117GDF123GDF123GVT	9.22.313.75.56.5ND8.83.81.84.42.01.54.1	9.22.016.05.88.3ND8.24.91.86.13.32.25.3

^*ND：未检测.

图4A表明转化重组质粒pET11a/DF114的大肠杆菌表达得到55kDa的DF114，转化重组质粒pET11a/DF114G的大肠杆菌表达得到55kDa的DF114G，转化重组质粒pET11a/DF114I的大肠杆菌表达得到55kDa的DF114I，转化重组质粒pET11a/DF114V的大肠杆菌表达得到55kDa的DF114V，转化重组质粒pET11a/DF115的大肠杆菌表达得到55kDa的DF115，转化重组质粒pET11a/DF115GL的大肠杆菌表达得到55kDa的DF115GL，转化重组质粒pET11a/DF115IL的大肠杆菌表达得到55kDa的DF115IL，转化重组质粒pET11a/DF115VL的大肠杆菌表达得到55kDa的DF115VL。与DF114相比，DF114G的表达量明显提高，而DF114I及DF114V表达量高低不同(表1)。这进一步说明在mRNA的稳定结构形成过程中，GM-CSF 114位(Leu)的编码序列的确起重要作用。在上述基础上延伸一个氨基酸L，分别构建DF115GL、DF115IL和DF115VL突变体。诱导表达结果表明，延伸后的突变体均比延伸前表达量有所降低，但比DF115原序列的表达量都有明显提高(表1)。这说明115(Leu)的编码序列在mRNA复杂结构结构的形成中起一定的作用，但可能不如114(Leu)的作用显著。图4A中，泳道1为转化重组质粒pET11a/DF114的大肠杆菌表达产物，2为转化重组质粒pET11a/DF114G的大肠杆菌表达产物，3为转化重组质粒pET11a/DF114I的大肠杆菌表达产物，4为转化重组质粒pET11a/DF114V的大肠杆菌表达产物，5为转化重组质粒pET11a的大肠杆菌表达产物，6为蛋白分子量标准，7为转化重组质粒pET11a/DF115的大肠杆菌表达产物，8为转化重组质粒pET11a/DF115GL的大肠杆菌表达产物，9为转化重组质粒pET11a/DF115IL的大肠杆菌表达产物，10为转化重组质粒pET11a/DF115VL的大肠杆菌表达产物。

图4B表明转化重组质粒pET11a/DF116GVT的大肠杆菌表达得到55kDa的DF116GVT，转化重组质粒pET11a/DF117G的大肠杆菌表达得到55kDa的DF117G。其中，DF116GVT表达量比DF115明显提高(表1)。而DF116GVT的自序列5的氨基末端第502位至504位氨基酸残基序列GVT与原序列LLV相比，氨基酸的亲疏水性、氨基酸分子大小和结构特征比较近似，可能对活性的影响不是很大，因此可采用此突变继续进行下一步延伸。同时，将DF115GL进一步按原序列延伸到117位，得到突变体DF117G，发现有较高的表达，但小于DF116GVT(表1)。这说明115、116位氨基酸的编码序列对mRNA结构起一定的作用，但不如114位氨基酸编码的作用重要。图4B中，泳道1为蛋白分子量标准，2为转化重组质粒pET11a/DF116GVT的大肠杆菌进行IPTG诱导的表达产物，3为转化重组质粒pET11a/DF116GVT的大肠杆菌未进行IPTG诱导的表达产物，4为转化重组质粒pET11a/DF117G的大肠杆菌进行IPTG诱导的表达产物，5为转化重组质粒pET11a/DF117G的大肠杆菌未进行IPTG诱导的表达产物。

图4C表明转化重组质粒pET11a/DF123GVT的大肠杆菌表达得到56kDa的DF123GVT，转化重组质粒pET11a/DF123G的大肠杆菌表达得到56kDa的DF123G；诱导表达结果表明，相比于全长的DT₃₈₆-GMCSF，DF123GVT与DF123G二者的表达量均有所提高，可看到表达带。其中，DF123GVT仍然有较高表达(表1，占菌体总蛋白的5％)，而DF123G的表达变弱(表1，约占菌体总蛋白的2％)。这进一步表明GM-CSF的115、116位氨基酸的序列起一定作用，可能主要是与后面的序列形成稳定结构，从而促进前面序列所形成的mRNA二级结构的稳定性。DF123GVT有明显的表达带，但比DF116GVT弱。这表明GM-CSF117-123aa之间的基因序列参与mRNA二级结构的形成，影响了表达量的提高。图4C中，泳道1为蛋白分子量标准，2为转化重组质粒pET11a/DF123GVT的大肠杆菌未进行IPTG诱导的表达产物，3为转化重组质粒pET11a/DF123GVT的大肠杆菌进行IPTG诱导的表达产物，4为转化重组质粒pET11a/DF123G的大肠杆菌未进行IPTG诱导的表达产物，5为转化重组质粒pET11a/DF123G的大肠杆菌进行IPTG诱导的表达产物。图4D也显示了转化重组质粒pET11a/DF123GVT的大肠杆菌表达得到56kDa的DF123GVT。图4D中，泳道1为蛋白分子量标准，2为转化重组质粒pET11a/DF123GVT的大肠杆菌未进行IPTG诱导的表达产物，3为转化重组质粒pET11a/DF123GVT的大肠杆菌进行IPTG诱导的表达产物。

其中，DF123GVT即为融合蛋白DT₃₈₆-GMCSF 123GVT，它是由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质，它的编码基因是由序列表中序列1的核苷酸序列组成的DNA分子。

4、DT₃₈₆-GMCSF 123GVT的纯化

将DT₃₈₆-GMCSF 123GVT表达菌株按照如下方法进行大量诱导表达：挑取转化有表达质粒的E.coli表达菌单个菌落，接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振摇培养过夜，作为一级种子。一级种子以1％的体积比接入100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液(500ml容器)，37℃振摇培养过夜，作为二级种子。二级种子以2～5％的体积比接入2L含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养液(5L容器)，37℃培养约3h，至OD600 0.4～0.6，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，继续培养6h。8,000rpm，4℃离心10min，收集菌体。取湿菌体10g，破碎细胞离心收集上清，包涵体(IB)沉淀洗涤后称重约为0.5g。包涵体采用8mol/L尿素常规方法变性、复性。将包涵体复性液上样至Q-Sepharose FF离子交换柱(40ml)，A液(20mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH7.4)淋洗平衡后，用A液与B液(B液为含1.0mol/L NaCl的A液，pH7.4)进行梯度洗脱，收集25％(体积比)B液的洗脱峰。DT₃₈₆-GMCSF 123GVT的Q-Sepharose FF层析图如图5A所示，横坐标为洗脱液体积，纵坐标为A280光吸收，箭头表明所收集的洗脱液浓度为0.25mol/L NaCl的蛋白洗脱峰。将收集的洗脱峰进行12％的SDS-PAGE和Western blot分析。其中，12％的SDS-PAGE和Western blot分析方法同上。SDS-PAGE结果如图5B所示，Western blot分析结果如图5C所示，表明收集的洗脱峰中含有大小为56kDa的DT₃₈₆-GMCSF 123GVT。图5B和图5C中，泳道1为蛋白质分子量标准，2为Q-Sepharose FF强阴离子层析柱纯化的产物。将Q-SepharoseFF纯化产物冻干浓缩后用于活性测定。

其中，Western blot分析以白喉毒素A片段(DTA)抗体为一抗，并按照文献“萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T著.金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南，第二版，北京：科学出版社，1992.”中描述的方法进行。白喉毒素A片段(DTA)及其抗体按照文献：“欧阳晶，王健伟，王春晓，郭丽，脱厚珍，崔婷，洪涛.白喉毒素A片段的表达纯化与单克隆抗体制备，生物工程学报，2004，20(5)：689-693”中描述的方法制备。

实施例2、DT₃₈₆-GMCSF 123GVT的活性测定

为了观察免疫毒素杀伤体内肿瘤细胞的效果，将HL60细胞接种小鼠以后长成瘤块后，制备了肿瘤单细胞，以进行细胞毒活性测定。取6-8周龄的NOD/SCID小鼠(购自中国医学科学院实验动物所)，尾静脉注射HL60细胞(5×10⁶个/只)，约4周后形成人白血病模型，部分小鼠生成肿瘤。取荷瘤NOD/SCID小鼠剥离瘤体，置10％FCS的RPMI 1640培养液中充分剪碎，过400目筛网。将细胞悬液离心至4,000rpm骤停，弃上清，RPMI 1640培养液洗3次。将细胞沉淀悬于10％FCS的RPMI 1640培养液中。取部分肿瘤单细胞悬液或HL60细胞，与抗入CD13、CD33、CD34、CD38的鼠源抗体(美国BD公司)进行孵育，对细胞进行CD13、CD33、CD34、CD38的流式细胞术检测。将细胞瓶内留存的悬液摇匀，竖直静置，待细胞沉至瓶底，吸去上层液体，加入新的培养基，置37℃，5％(体积比)CO₂培养，用于细胞毒作用测定。

肿瘤单细胞在测定活性之前通过免疫流式细胞术进行了鉴定。免疫流式细胞术结果表明，肿瘤单细胞悬液中的细胞确实为HL60细胞(表2)。表2中，“-”表示结果为阴性。

       表2、荷瘤NOD/SCID小鼠来源肿瘤细胞鉴定

阳性细胞比例(％)	CD13	CD33	CD34	CD38
					HL60	99.79	64.58	-	62.72
肿瘤单细胞	75.87	60.35	-	76.63

细胞毒作用的测定采用MTS法，按照Promega公司MTS检测试剂盒说明书操作。收集处于对数生长期的肿瘤单细胞，用10％FCS的RPMI 1640培养液调整为5×10⁵个/ml，以0.1ml/孔接入96孔细胞培养板中，培养24h，加入0.1ml的DT₃₈₆-GMCSF123GVT或0.1ml的DT₃₈₆-GMCSF或0.1ml的pH为7.4、0.1mol/L的PBS(0.1ml)作用72h。其中，加入0.1ml pH为7.4、0.1mol/L的PBS作为对照。同时采用在0.1ml10％FCS的RPMI 1640培养液中添加0.1ml pH为7.4、0.1mol/L的PBS作为空白。其中每种样品、空白和对照各3-8孔。每孔再加入20μl的MTS溶液，37℃，5％(体积比)CO₂温育4h，用酶标仪测定495nm波长的吸光值，计算细胞存活率(SurvivalRate，SR)：SR＝(A_样品-A_空白)/(A_对照-A_空白)×100％。绘制不同浓度融合蛋白纯化组分作用后细胞的存活率曲线，细胞存活率被抑制至50％时的融合蛋白浓度为IC₅₀。

用所获肿瘤细胞对DT₃₈₆-GMCSF 123GVT的细胞毒作用测定结果如表3所示，表明DT₃₈₆-GMCSF与C端缺失5个氨基酸残基的DT₃₈₆-GMCSF 123GVT的IC₅₀在同一个数量级(1.5-2×10^-7mol/L)。表明DT₃₈₆-GMCSF 123GVT基本保留了全长免疫毒素的所有活性。

表3、DT₃₈₆-GMCSF与DT₃₈₆-GMCSF 123GVT的细胞毒性比较

	DT386-GMCSF	DT386-GMCSF123GVT
			IC50/(mol/L)	1.5×10-7	2×10-7

                                     序列表

<160>5

<210>1

<211>1536

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

atgggcgctg atgatgttgt tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg     60

taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa    120

tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagggt tttatagtac cgacaataaa    180

tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc    240

gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc    300

gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga    360

acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc    420

ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc gaaagcgtta    480

agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat    540

gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtgtcaggc gatcagtagg tagctcattg    600

tcatgcataa atcttgattg ggatgtcata agggataaaa ctaagacaaa gatagagtct    660

ttgaaagagc atggccctat caaaaataaa atgagcgaaa gtcccaataa aacagtatct    720

gaggaaaaag ctaaacaata cctagaagaa tttcatcaaa cggcattaga gcatcctgaa    780

ttgtcagaac ttaaaaccgt tactgggacc aatcctgtat tcgctggggc taactatgcg    840

gcgtgggcag taaacgttgc gcaagttatc gatagcgaaa cagctgataa tttggaaaag    900

acaactgctg ctctttcgat acttcctggt atcggtagcg taatgggcat tgcagacggt    960

gccgttcacc acaatacaga agagatagtg gcacaatcaa tagctttatc gtctttaatg   1020

gttgctcaag ctattccatt ggtaggagag ctagttgata ttggtttcgc tgcatataat   1080

tttgtagaga gtattatcaa tttatttcaa gtagttcata attcgtataa tcgtcccgcg   1140

tattctccgg gtcataaaac gcatgcgcct gctcgttctc cgtcaccttc tacacagcct    1200

tgggaacatg ttaatgctat ccaagaggct cgccgtctgc ttaacctatc tcgtgatacc    1260

gcggctgaga tgaatgaaac cgttgaagta atctccgaga tgttcgacct gcaagaacct    1320

acatgtcttc agacccgcct ggaactttat aagcaaggtc ttcgtggctc tctgacaaag    1380

ctgaaaggtc ctcttaccat gatggcttca cactataaac agcattgtcc tccgacccct    1440

gagacatctt gcgctaccca gacaatcacc ttcgaatcct ttaaagaaaa cctgaaagac    1500

ttcggtgtaa caattccatt tgactgttgg gaatag                              1536

<210>2

<211>511

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu

1               5                   10                  15

Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile

            20                  25                  30

Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp

        35                  40                  45

Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala

    50                  55                  60

Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly

65                  70                  75                  80

Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys

                85                  90                  95

Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr

            100                 105                 110

Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe

        115                 120                 125

Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly

    130                 135                 140

Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu

145                 150                 155                 160

Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln

                165                 170                 175

Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val

            180                 185                 190

Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp

        195                 200                 205

Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His

    210                 215                 220

Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser

225                 230                 235                 240

Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu

                245                 250                 255

Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro

            260                 265                 270

Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln

        275                 280                 285

Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala

    290                 295                 300

Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly

305                 310                 315                 320

Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu

                325                 330                 335

Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val

            340                 345                 350

Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu

        355                 360                 365

Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly

    370                 375                 380

His Lys Thr His Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro

385                 390                 395                 400

Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu

                405                 410                 415

Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser

            420                 425                 430

Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu

        435                 440                 445

Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro

    450                 455                 460

Pro Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro

465                 470                 475                 480

Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Thr Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu

                485                 490                 495

Asn Leu Lys Asp Phe Gly Val Thr Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu

            500                 505                 510

<210>3

<211>390

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

atggcgcctg ctcgttctcc gtcaccttct acacagcctt gggaacatgt taatgctatc     60

caagaggctc gccgtctgct taacctatct cgtgataccg cggctgagat gaatgaaacc    120

gttgaagtaa tctccgagat gttcgacctg caagaaccta catgtcttca gacccgcctg    180

gaactttata agcaaggtct tcgtggctct ctgacaaagc tgaaaggtcc tcttaccatg    240

atggcttcac actataaaca gcattgtcct ccgacccctg agacatcttg cgctacccag    300

acaatcacct tcgaatcctt taaagaaaac ctgaaagact tcctgcttgt tatcccgttt    360

gactgctggg aacctgttca agaagcgtga                                     390

<210>4

<211>1551

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

atgggcgctg atgatgttgt tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg     60

taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa    120

tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagggt tttatagtac cgacaataaa    180

tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc    240

gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc    300

gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga    360

acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc    420

ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc gaaagcgtta    480

agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat    540

gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtgtcaggc gatcagtagg tagctcattg    600

tcatgcataa atcttgattg ggatgtcata agggataaaa ctaagacaaa gatagagtct    660

ttgaaagagc atggccctat caaaaataaa atgagcgaaa gtcccaataa aacagtatct    720

gaggaaaaag ctaaacaata cctagaagaa tttcatcaaa cggcattaga gcatcctgaa    780

ttgtcagaac ttaaaaccgt tactgggacc aatcctgtat tcgctggggc taactatgcg    840

gcgtgggcag taaacgttgc gcaagttatc gatagcgaaa cagctgataa tttggaaaag    900

acaactgctg ctctttcgat acttcctggt atcggtagcg taatgggcat tgcagacggt    960

gccgttcacc acaatacaga agagatagtg gcacaatcaa tagctttatc gtctttaatg   1020

gttgctcaag ctattccatt ggtaggagag ctagttgata ttggtttcgc tgcatataat   1080

tttgtagaga gtattatcaa tttatttcaa gtagttcata attcgtataa tcgtcccgcg   1140

tattctccgg gtcataaaac gcatgcgcct gctcgttctc cgtcaccttc tacacagcct   1200

tgggaacatg ttaatgctat ccaagaggct cgccgtctgc ttaacctatc tcgtgatacc   1260

gcggctgaga tgaatgaaac cgttgaagta atctccgaga tgttcgacct gcaagaacct   1320

acatgtcttc agacccgcct ggaactttat aagcaaggtc ttcgtggctc tctgacaaag   1380

ctgaaaggtc ctcttaccat gatggcttca cactataaac agcattgtcc tccgacccct  1440

gagacatctt gcgctaccca gacaatcacc ttcgaatcct ttaaagaaaa cctgaaagac  1500

ttcctgcttg ttatcccgtt tgactgctgg gaacctgttc aagaagcgtg a           1551

<210>5

<211>516

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu

1               5                   10                  15

Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile

            20                  25                  30

Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp

        35                  40                  45

Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala

    50                  55                  60

Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly

65                  70                  75                  80

Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys

                85                  90                  95

Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr

            100                 105                 110

Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe

        115                 120                 125

Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly

    130                 135                 140

Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu

145                 150                 155                 160

Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln

                165                 170                 175

Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val

            180                 185                 190

Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp

        195                 200                 205

Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His

    210                 215                 220

Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser

225                 230                 235                 240

Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu

                245                 250                 255

Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro

            260                 265                 270

Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln

        275                 280                 285

Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala

    290                 295                 300

Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly

305                 310                 315                 320

Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu

                325                 330                 335

Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val

            340                 345                 350

Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu

        355                 360                 365

Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly

    370                 375                 380

His Lys Thr His Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro

385                 390                 395                 400

Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu

                405                 410                 415

Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser

            420                 425                 430

Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu

        435                 440                 445

Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro

    450                 455                 460

Pro Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro

465                 470                 475                 480

Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Thr Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu

                485                 490                 495

Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro

            500                 505                 510

Val Gln Glu Ala

        515

Claims (9)

1、一种白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有杀伤急性髓系白血病细胞活性的由(a)衍生的蛋白质。

2、权利要求1所述的白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白的编码基因。

3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白编码基因，为如下1)或2)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白的DNA分子。

4、含有权利要求2或3所述的白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白编码基因的重组表达载体、转基因细胞系和转基因宿主菌。

5、一种治疗急性髓系白血病的药物，它的活性成分是权利要求1所述的白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白。

6、一种表达权利要求1所述的白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白的方法，是将所述白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白的编码基因插入原核细胞表达载体，获得含有所述白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白的编码基因的重组表达载体，再将所述重组表达载体导入大肠杆菌，筛选得到表达所述白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白的工程细胞，培养所述工程细胞，表达得到所述白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述表达载体为pET11a、pET3a、pET22a、pET30a、pSE420、pRSET、pDOGA或pBV220。

8、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠肝菌DH5α、E.coli TB1或E.coli BL21(DE3)。

9、根据权利要求6、7或8所述的方法，其特征在于：所述表达载体为pET11a，所述白喉毒素与GM-CSF突变体的融合蛋白编码基因插入pET11a的Nde I和Bam HI位点，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3，pLysS)。

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