CN1194011C - 眼镜蛇短链神经毒素的制法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的眼镜蛇短链神经毒素，编码此多肽的多核苷酸和经重组技术产生这种多肽的方法。本发明还公开了将眼镜蛇短链神经毒素用于治疗多种疾病如癌症的方法以及含有眼镜蛇短链神经毒素的药物组合物。

Description

眼镜蛇短链神经毒素的制法和用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及新的编码眼镜蛇短链神经毒素的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此眼镜蛇短链神经毒素多核苷酸和多肽的用途和制备。

背景技术

蛇类在地球上出现的时间大约是在距今1.5亿年前的侏罗纪。在大约3200种蛇中，约有1300种是有毒蛇类。通常，毒蛇被分为五个科：具有小后沟牙的Boignae；前沟牙类的Elapidae和Hydrophiidae；蝰类的Viperidae和Crotalidae。虽然大多数毒蛇属于Boignae科，但由于它们的毒牙小并且危害性也小，因此对该科毒蛇的研究就较少。相反，对其它科的蛇毒研究就要广泛得多。

蛇毒是丰富而浓集的多肽类混合物，毒蛇利用它们来进攻或保护自己。它们包括酶类、多肽毒素和小分子量化合物。

蛇毒含大量的水溶性酶类，其中绝大多数是起消化作用的水解酶，分子量范围在13,000~150,000Da。例如，蛋白酶、内切多肽酶、外切多肽酶、磷酸二酯酶和磷脂酶。蛇毒中能检测到的酶类至少超过20种，虽然其中有12种经常出现在所有的蛇毒中，但在不同蛇毒中明显显示出不同的含量。通常，Viperida和Crotalida的酶量占其总干重的80％-95％，而Elapida蛇毒中则为25％~75％(Mebs，1969)。

尽管人们对蛇毒和科学研究已有相当长的历史，但直到20世纪50代末和60代初，神经毒素才从眼镜蛇(Sasaki，1957)和海蛇(Caney&Wright，1960)中分离得到较纯的样品。随后几年，纯品神经毒素相继被分离与鉴定(Yong，1965；Tamiya和Arai，1966；Karlsson等，1966)。1967年，来源于Naja nigricollis的一个神经毒素氨基酸顺序首次被确定(Eaker and Porath，1967)。随后，来自眼镜蛇、银环蛇，mambas，Australian elapid，sea Kraits和海蛇的一些神经毒素氨基酸顺序相继被报导。

由于蛇毒稳定性较好，因此分离纯化时经常采用凝胶过滤和离子交换层析。但在纯化较小分子量神经毒组分或经化学修饰的衍生物时，RP-HPLC仍然是必需的和最有用的手段(Boulain等，1982)。通常，神经毒素纯化经过凝胶过滤和离子交换步骤后仍会含有较少的杂质，这些会严重干扰药理检测。RP-HPLC可被用来确定这些杂质并除去它们。用RP-HPLC纯化α-bungarotoxin就是一个很好的例子(Bailey，1986)。

自从1967年Eaker和Porath首先报道了来源于Naja nigricollis的神经毒素氨基酸序列后，许多神经毒素被分离得到并得以测序。现在已有超过100个神经毒素序列已知(Endo and Tamiya，1991)

神经毒素又可被分为短链神经毒素和长链神经毒素。短链神经毒素含60-62氨基酸残基和4对二硫键。二硫键位置通常位于：Cys3-Cys24；Cys17-Cys45；Cys49-Cys60；Cys61-Cys66。另一方面，长链神经毒素含70-74氨基酸残基和5对二硫键，比短链神经毒素多一对二硫键Cys30-Cys34。此外，长链神经毒素在序列上具有其它特点：(1)4-16位有氨基酸残基缺失；(2)32、34、35、和36位则有氨基酸残基插入；(3)在Cys45和Cys49中插入Ala-46-Ala-47-Thr-48，短链神经毒素则为Gly-48；(4)C-末端多5-9个氨基酸残基。

眼镜蛇蛇毒除神经毒素外，通常还有另一类名为Cardiotoxins或Cytotoxins的基本多肽(60-63氨基酸残基)。该类多肽在序列上与神经毒素高度同源。然而，它们几乎对乙酰胆碱受体没有亲和性，只与细胞膜作用而导致永久性去极化(Chang，1979)。除去完全不同的药理作用模式，两类毒素拥有许多类似的不可变氨基酸残基。例如：Tyr-25，Gly-44，Pro-50，Leu/Ile/Val/Tyr-58，Ser/Thr-63，Asp/Asn/Glu-64和Asn/Asp-67。四对二硫键Cys3-Cys24；Cys17-Cys45；Cys49-Cys60；Cys61-Cys66的位置也是一致的。该事实表明：一些不变残基对神经毒素和细胞毒素(Cytotoxin)在决定它们特殊的三维结构上是至关重要的。相对应的，一些氨基酸残基在神经毒素家族中是保守的，而在Cytotoxins家族中并非如此。这些残基包括lys-27，Trp-29，Asp-31，His/Phe/Trp-33，Arg/lys-37，Gly-38，Glu/Asp-42，Val/Ala-52和lys/Arg-53。它们对神经毒性起到直接或间接的作用，但对细胞毒并无影响。同样有可能一个残基既对神经毒性结构起作用又对神经毒性功能起作用。因此，人们试图明确每一个保守残基的“结构作用”和“功能作用”(Rydenetal，1973；Tamiya，1980)。

神经毒素作用的靶位点是N型乙酰胆碱受体，位于骨骼肌或电器官的突触后细胞膜，其通过传输化学信息到电位反应来介导突触传递作用。神经递质与乙酰胆碱受体结合导致受体离子通道的开放，增加了突触细胞膜对阳离子的通透性，从而使位于神经肌肉接点的终板细胞膜去极化，最终导致肌收缩。

乙酰胆碱结合到受体上后，导致离子通道快速开放，并且在几个毫秒内，离子通道又缓慢关闭。乙酰胆碱受体在对激动剂延长暴露时间后，会转变到另一种状态，即增强了对这些配体的亲和力，该过程持续时间较长，需要几秒到几分钟，这种转变可能和功能性脱敏作用(desensitization)有关。

乙酰胆碱是脊椎动物和无脊椎动物中一个重要的神经递质，一大批动、植物毒素能干扰它的正常功能。例如，来自烟草植物的叶片的生物碱、烟碱，具有乙酰胆碱类特性，能激活中枢和外周神经系统中的乙酰胆碱受体。

乙酰胆碱受体可进一步分为两类：(1)对烟碱敏感的烟碱乙酰胆碱受体；(2)对蘑菇毒素蕈毒碱敏感的蕈毒碱乙酰胆碱受体。乙酰胆碱受体如同存在于脊椎和无脊椎动物的中枢神经系统中一样，也存在于脊椎动物的骨骼肌和自主神经节。

几乎所有与乙酰胆碱受体作用的蛇毒神经毒素有选择地与烟碱受体作用，只有开始观察到的与蕈毒碱受体结合的mamba蛇毒是有作用的(Adem etal.，1988)。烟碱受体根据它们所处位置及药理特性可以被进一步分类。

蛇神经毒素由于其结合乙酰胆碱受体的高亲和性而对神经药理学家十分重要。通常，这种结合只是缓慢可逆，使得电生理学家有足够的时间来进行详细的生化和定位研究已鉴定的受体，蛇神经毒素是鉴定神经元受体的功能特点和能区分的受体亚型的有价值探针。

神经毒素结合到乙酰胆碱受体上后，阻断了乙酰胆碱的结合，但并没有诱导离子通道的开放，结果阻断了神经传导，对乙酰胆碱受体四种亚基分别进行研究后发现，只有α-亚基能够与α-bungrotoxin结合(Haggerty abd Froehner，1981；Gershonietal.，1983).

乙酰胆碱受体上的两个α-亚基的结合位点似乎并不等价，因为其中一个在靠近结合位点的二硫键被还原后对亲和标记更敏感(Wolosin，1980)。这种不等价可能是因为141位N-天冬酰胺糖基化程度的差异或者是因为乙酰胆碱受体两个α-亚基不对称的四级结构。这种不等价现象在神经毒素和拮抗剂中都有发生(Conti-Tronconi etal.1984)。

神经毒素是分子量相对较小的蛋白质，在蛇毒中相对含量较高，容易分离和纯化，并且存在大量天然的同系物，另外它们还具有强而专一的生理功能等特点，因此一直以来是生物学工作者研究的热点。从1975年Sasaki从海蛇蛇毒中首次分离出相对纯化的神经毒素后，生物学家对神经毒素已进行了广泛而深入的研究。包括采用圆二色谱、激光拉曼光谱、X-射线晶体衍射和NMR等技术，以及现代经常应用的基因工程、定点突变等技术手段，来对神经毒素结构与功能进行详细的研究。

神经毒素也是研究受体的极好工具。α-bungrotoxin为受体的发现以及受体学说的证明提供了关键的证据，至今仍是研究乙酰胆碱受体结构、功能及其关系的良好材料。神经毒素也是研究细胞信号传导等的工具。

神经毒素还具有很高的医用价值，变构神经毒素是目前治疗重症肌无力最有效的药物之一。而研究神经毒素免疫学特性，则对蛇伤的治疗至关重要。中国科学院昆明动物研究所熊郁良等人发现神经毒素有良好的镇痛效应和一定的戒毒功能。

近年来也发现神经毒素cardiotoxin具有抗肿瘤作用，而且Newman，R.A.(1993)等人发现cardiotoxin与crotoxin(属磷酸脂酶A2)合用能增强其抗癌效果。1997年，Costa，L.A.等人将该复合物应用于一期临床试验，在1998年首次报道两名患者(皮肤癌和乳腺癌)用该复合物治疗后肿瘤明显缩小，其中一例肿瘤消失。

由于蛇类的神经毒素神经毒素具有巨大的潜在应用价值，因此，本领域迫切需要研究和开发新的蛇类神经毒素。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的眼镜蛇短链神经毒素以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的眼镜蛇短链神经毒素多肽，它包含：具有SEQ ID NO：2或4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85％相同性：(a)编码上述眼镜蛇短链神经毒素多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列具有SEQ ID NO：1中所示的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了一种眼镜蛇短链神经毒素的制备方法，其特征在于，该方法包含：(a)在适合表达眼镜蛇短链神经毒素的条件下，培养所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出眼镜蛇短链神经毒素。

在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，它含有眼镜蛇短链神经毒素作为活性成分以及药学上可接受的载体和/或稀释剂。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1是RT-PCT产物的2％琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为DNA分子量标记物；泳道2为眼镜蛇短链神经毒素的cDNA产物。

图2显示了质粒pT7ZZa-SNT的构建过程。

图3是大肠杆菌表达产物的15％SDS-PAGE电泳图。泳道1、2和3分别为诱导1.5、2、和2.5小时的样品，泳道4是蛋白质分子量标记物(94、67、43、30、20、14.5kDa)，泳道5为未诱导的对照。箭头所指之处为目的基因的表达条带。

图4是酵母阳性克隆GS115经甲醇诱导后培养基上清液的16.5％SDS-PAGE电泳图。泳道1为阴性对照，泳道2、3、4、5为酵母阳性克隆GS115的培养上清液，泳道6为分子量标记物。

图5是纯化的眼镜蛇短链神经毒素的RP-HPLC图。

具体实施方式

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的眼镜蛇短链神经毒素或多肽”是指眼镜蛇短链神经毒素多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化眼镜蛇短链神经毒素。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。眼镜蛇短链神经毒素多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括眼镜蛇短链神经毒素的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然眼镜蛇短链神经毒素相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ IDNO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码眼镜蛇短链神经毒素的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的DNA序列能用几种方法获得。例如用本领域熟知的杂交技术分离DNA。这些技术包括但不局限于：1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源性核苷酸序列，和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的DNA片段。

编码眼镜蛇短链神经毒素的特异DNA片段序列产生也能用下列方法获得：1)从基因组DNA分离双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以获得所需多肽的双链DNA。

上述方法中，分离基因组DNA最不常用。当需要的多肽产物的整个氨基酸序列已知时，DNA序列的直接化学合成是经常选用的方法。或者，选用的方法是分离cDNA序列。分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录，形成质粒或噬菌体cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术，试剂盒也可从商业途径获得(Qiagene)。而构建cDNA文库也是通常的方法(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。还可得到商业供应的cDNA文库，如Clontech公司的不同cDNA文库。当结合使用聚合酶反应技术时，即使极少的表达产物也能克隆。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

如上所述得到的本发明的基因，或者各种DNA片段等的核苷酸序列的测定可用常规方法如双脱氧链终止法(Sanger et al.PNAS，1977，74：5463-5467)。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列，测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或眼镜蛇短链神经毒素编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的眼镜蛇短链神经毒素多肽(Science，1984；224：1431)。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码眼镜蛇短链神经毒素的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，眼镜蛇短链神经毒素多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含眼镜蛇短链神经毒素编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体P_L启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可包被于细胞内、细胞外或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的多肽，及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞可以用来作为抗原以生产抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体。多克隆抗体可以通过将此多肽直接注射动物的方法得到。制备单克隆抗体的技术包括杂交瘤技术，三瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术，EBV-杂交瘤技术等。

可以将本发明的眼镜蛇短链神经毒素与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。本发明的眼镜蛇短链神经毒素很容易制成水剂或冻干制剂，其中后者更易于长期保存。

本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒，容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。

药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。眼镜蛇短链神经毒素以有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的眼镜蛇短链神经毒素的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。一般，本发明眼镜蛇短链神经毒素用于镇痛时，其使用剂量为1-1000ug/kg/天，较佳地为10-200ug/kg/天；用于抗肿瘤时，其使用剂量为50-1500ug/kg/天，较佳地为100-500ug/kg/天。

本发明的人眼镜蛇短链神经毒素核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是本发明眼镜蛇短链神经毒素长度仅62个氨基酸。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的眼镜蛇短链神经毒素。本发明的多核苷酸是从眼镜蛇(Naja Najaatra)的cDNA文库中分离出的。它包含的开放阅读框序列长度252个碱基(含终止密码子)，编码21个氨基酸的信号肽和由62个氨基酸构成的成熟的眼镜蛇短链神经毒素。本发明的眼镜蛇短链神经毒素的分子量是约23千道尔顿。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：眼镜蛇短链神经毒素cDNA的克隆

一材料与方法

1材料

眼镜蛇(Naja Naja atra，福建)和购于上海市铜川路蛇市场；总RNA提取试剂盒、PCR试剂盒、T₄ DNA连接酶、pGEM-T质粒、核酸Marker均购自：Promega公司；cDNA反转录试剂盒购自：Gibco公司；X-gal、IPTG购自华美公司；宿主菌E.coli JM109为常用菌株。

2方法

2.1总RNA的提取

眼镜蛇活杀取头，迅速取出毒腺(去除毒腺周围结缔组织)；剪碎，加液氮研磨成粉末，加入变性溶液后，离心，取上清；其余步骤均按试剂盒说明书操作，抽提总RNA，以2％琼脂糖电泳来判断总RNA的质量。RNA样品用BECKMAN DU-7000进行定量后，置于-20℃，备用。

2.2RT-PCR反应

2.2.1逆转录反应(cDNA合成)

首先去除样品中残留DNA，反应体系如下：

总RNA               10μg             1μl

10×PCR缓冲液                         2μl

25mM MgCl₂                           2μl

DNase I                               1μl

ddH₂O                                9μl

混合后，置于37℃水浴，15分钟，除去样品中的残留DNA。

然后，置于70℃水浴，15分钟，使DNase I失活，置于冰浴1分钟以上。然后，再加入：

Oligo(dT)          1μl

dNTP               1μl

DTT                2μl

置于42℃，5分钟，加入1μl M-MLV反转录酶，置于42℃，50分钟。

而后转到70℃水浴，15分钟，转入冰浴，加入1μl RNase H，置于37℃水浴，20分钟。备用。

2.2.2PCR反应

参考GenBank中已发表的蛇毒神经毒素基因序列，经微机分析后设计以下三对引物：

引物1：5′AAGATGGAAACTCTGTTGCTGACC   3′

引物2：5′AAGTCAAAGACAGTAGTGGAGAAGG  3′

各引物分别在ABI DNA自动合成仪上合成，用合成引物分别进行以下PCR反应。

PCR反应体系如下：

cDNA模板	2μl
		10×PCR缓冲液	5μl
25mM MgCl2	3μl
		dNTP	1μl
引物	(1+1)μl
		ddH2O	36μl

PCR反应按下列参数进行35个反应循环：94℃变性70秒；50℃复性60秒；72℃延伸60秒，最后一个循环延长10分钟。

2.3cDNA的克隆及其DNA序列分析

将上述PCR产物用酚∶氯仿抽提纯化后，用T₄ DNA连接酶将它们分别直接克隆到pGEM-T载体上。连接反应体系如下：

PCR产物           2μl

T₄连接酶         1μl

缓冲液            1μl

ddH₂O            6μl

16℃，反应进行4小时。

将以上连接反应产物转化入感受态E.coli细胞(JM109)，将连接产物与200μl感受态细胞混合，冰浴30分钟，然后42℃水浴中放置90秒，最后，将混合溶液铺到含Amp、X-gal和IPTG的LB培养基上，37℃培养，筛选阳性克隆。

挑选阳性克隆，接种LB斜面，37℃培养。抽提阳性克隆质粒，进行双酶切鉴定，

反应体系如下：

质粒DNA              5.00μl

10×缓冲液           2.00μl

Sac I                0.25μl

Apa I                0.25μl

ddH₂O               12.5μl

37℃，反应1小时。2％琼脂糖电泳检测。

将阳性克隆质粒分别用DNA自动测序仪进行DNA测序。

二、结果

在抽提眼镜蛇毒腺总RNA后，经2％琼脂糖电泳检查后可看到28S和18S两条rRNA条带，说明总RNA无明显降解。

参考已报道的神经毒素基因序列，设计RT-PCR引物时主要考虑将引物1分别设计在信号肽位点前，引物2分别设计在基因3′端非编码区的互补序列。

用相应的引物分别进行RT-PCR反应后，PCR扩增产物用2％琼脂糖电泳初步鉴定，可明显看到相应条带(见图1)，其中在383bp处有一短链神经毒素cDNA。

将以上cDNA克隆入pGEM-T载体上后，对阳性克隆质粒进行DNA测序，结果如下：

1.眼镜蛇短链神经毒素的cDNA序列

TTAG ATGGAA ACTCTGTTGC TGACCTTGCT GGTGGTGACA ATCGTGTGCC TGGACTTAGG

ATACACCCTG GAATGTCACA ACCAACAATC ATCGCAAACT CCAACCACTA CAGGTTGTTC

AGGTGGGGAG ACCAATTGCT ATAAAAAGCG TTGGCGTGAT CACCGTGGAT ATAGAACCGA

GAGGGGATGT GGTTGCCCTA TAGTGAAGAA CGGCATTGAA AGTAACTGTT GCACAACAGA

CAGATGCAAC AAT TAGCTCT CCGAGTGGCT AAATTCCTTG AGTTTTGCTC TCATCCATCA

TGGACCATCC TTGAAAATTT ATGCTTGTGG CCTTTAGCAC CAGATGGTCC ATCATTCCTT

CTCCACTACT GTCTTTGACT T(SEQ ID NO：3)

经BLAST在GenBank中查询序列同源性后，未见报道，登记号为：AF161797(因保密关系，在本申请之前未公开)。编码序列示于SEQ ID NO：1。

经分析后，得出以下结论：

该cDNA序列是短链神经毒素，ATG→TAG为编码区。

其中，ATG→ACC：信号肽区域；CTG→TAG：蛋白功能区。

根据其cDNA序列，推导出相应的蛋白序列如下(含信号肽的全序列示于SEQ IDNO：4)：

信号肽：METLLLTLLVVTIVCLDLGYT

功能区：LECHNQQSSQ TPTTTGCSGG ETNCYKKRWR DHRGYRTERG CGCPIVKNGIESNCCTTDRC NN(SEQ ID NO：2)

来源于眼镜蛇毒腺的短链神经毒素(62个氨基酸残基)功能区与Chu.R.C和Yang.C.C报道的中华眼镜蛇短链神经毒素cDNA有很高的同源性，只有很少几个氨基酸差别(45位和52位)。62个氨基酸残基的短链神经毒素与另两个基因的同源性不高。

LECHNQQSSQTPTTTGCSGGETNCYKKRWRDHRGYRTERGCGCP IVKNGIE SNCCTTDRCNN

实施例2

眼镜蛇短链神经毒素在大肠杆菌中的表达生产

随着基因工程的迅速发展，目的基因的表达已经可以选择多种表达系统。为获得足够量的蛋白，人们根据不同研究目标，既可以选择原核表达系统，也可以选择真核表达系统，在该实施例中，选择的原核表达系统是大肠杆菌(E.coli)表达系统。

一材料与方法

1.材料

表达载体pT7ZZa和宿主菌E.coli BL21(DE3)为常用质粒。

BamH I、Sac I、Sma I和Klenow等工具酶购自Promega公司；IPTG购自华美公司；

pSK质粒购自Stratagene公司；各引物分别在ABI DNA自动合成仪上合成。

LB培养基配方如下：

细菌胰蛋白胨             10g

细菌-酵母提取物          5g

NaCl                     10g

将以上溶质溶于950ml去离子水中，用5mol/L NaOH调节pH至7.0，再用去离子水定容到总体积为1L，15磅高压蒸气灭菌20分钟。

全细胞裂解液(Cracking buffer)配方如下：

Tris-HCl(pH6.8)          50mM

SDS                      1％

EDTA                     2mM

糖                       400mM

溴酚蓝                   0.1％

2方法

2.1大肠杆菌表达载体pT7ZZa-SNT的构建

经微机分析基因序列后，设计引物如下，引入酶切位点：BamH I和Sac I。

5′AT G ^↓ GATCCATGCTGGAATGTCACAAC  3′(BamH I)

5′CC GAGCT ^↓ CGCTAATTGTTGCATCTG   3′(Sac I)

将克隆在质粒pGEM-T中的眼镜蛇短链神经毒素基因，利用以上引物进行PCR反应。

PCR扩增反应条件为：按下列参数循环35次，94℃变性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸50秒，最后一个循环72℃反应10分钟。

经PCR扩增反应后，去除该短链神经毒素基因的信号肽序列，得到两端带BamHI和Sac I酶切位点的短链神经毒素功能区基因，然后将PCR产物用Klenow酶补平。将其与pSK(Sma I预先酶切)连接，DNA测序确认无序列错误。

用BamH I和Sac I对pSK重组质粒进行酶切，回收目的基因。用BamH I和SacI对表达载体pT7ZZa进行双酶切，然后用T4 DNA连接酶进行连接反应，将短链神经毒素功能区基因克隆到表达载体pT7ZZa质粒上，构建T7启动子控制下的含有短链神经毒素功能区基因的表达质粒pT7ZZa-SNT(见图2)。

2短链神经毒素基因融合蛋白在大肠杆菌中(E.coli BL21(DE3))的融合表达

将重组pT7ZZa-SNT质粒转化到感受态E.coli BL21(DE3)，37℃平板培养过夜。挑取单菌落转接于新鲜LB培养基，37℃摇床培养8小时左右，以2％接种量转接新鲜LB培养基，37℃摇床培养至OD 600 0.4-0.6加终浓度1mmol/l的IPTG诱导表达，继续培养3小时。

取不同时间段的培养细胞进行全细胞裂解反应，然后进行SDS-PAGE电泳分析(图3)。具体操作按分子克隆手册(SambrooK，J.et al.，Molecular Cloning，ALaboratory Manual 2nd，1989，Cold Spring Harbor Press，NeW York)进行。

含质粒PT7ZZa-SNT大肠杆菌E.coli BL21(DE3)于2000年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉)，保藏号为CCTCC No.：M200001，名称为Escherichia coli BL(DE3)Cai Qin SNT。

3.结果

短链神经毒素基因在引入酶切位点BamH I和Sac I后，构建成功重组质粒pT7ZZa-SNT并转化到E.coli BL21(DE3)后，在T7启动子控制下，通过IPTG的诱导，短链神经毒素得到表达。经SDS-PAGE分析，得到一条分子量约为7kDa的表达条带。表达量约为25％左右。

实施例3

眼镜蛇短链神经毒素在酵母中的表达生产

在该实施例中，选用的真核表达系统是毕赤氏酵母(Pichia pastoris)表达系统。

材料

表达载体pHIL-S1购自Novagen公司。宿主菌GS115(his4)为一常用酵母菌。

培养基为MD(Minimal Dextrose)培养基和YEPD(Yeast Extract PeptoneDextrose)培养基。

设计如下所示的，引入酶切位点：BamH I和Sac I。

5’AC G ^↓ AATTC CTGGAATGTCACAACC  3’(EcoR I)

5’CC G ^↓ GATCC CTAATTGTTGCATCTG  3’(BamH I)

将克隆在质粒pGEM-T中的眼镜蛇短链神经毒素基因，利用以上引物进行PCR反应。

PCR扩增反应条件为：按下列参数循环35次，94℃变性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸50秒，最后一个循环72℃反应10分钟。

经PCR扩增反应后，去除该短链神经毒素基因的信号肽序列，得到两端带EcoRI和BamH I酶切位点的短链神经毒素功能区基因，然后将PCR产物用Klenow酶补平。将其与pSK(Sma I预先酶切)连接，DNA测序确认无序列错误。

用EcoR I和BamH I对pSK重组质粒进行酶切，回收目的基因。用EcoR I和BamHI对表达载体pHIL-S1进行双酶切，然后用T4 DNA连接酶进行连接反应，将短链神经毒素功能区基因克隆到表达载体pHIL-S1质粒上，构建pAOX1启动子控制下的含有短链神经毒素功能区基因的表达质粒pHIL-S1-SNT。

将质粒pHIL-S1-SNT转化感受态E.coli(TG1)中，大量制备重组质粒。然后用SacI酶切pHIL-S1-SNT，使其线性化。再用电转移法转化毕赤氏酵母(Pichiapastoris)GS115，在MD平板上筛选His+表型。对于初筛的阳性克隆，将其点于MD平板上，再次筛选，挑选出阳性克隆。

对于阳性克隆，通过抽提克隆染色体DNA并用PCR加以鉴定，证实眼镜蛇短链神经毒素编码序列确已整合入染色体。

将阳性酵母单菌接种于25毫升BMGY培养基中，28-30℃摇床培养至OD600为2-6，使细胞处于对数期，室温离心收集细胞，转接于BMMY培养基中使之OD600为1，继续培养。每隔24小时添加终浓度为0.5％的甲醇(100％)，诱导表达3-5。将培养液离心后，取上清液浓缩后取样进行SDS-PAGE检测(图4)，图中泳道2-5(阳性克隆)在约7千道尔顿处有一条带，即为表达的眼镜蛇短链神经毒素。

实施例4

大肠杆菌表达产物的分离纯化

在分离纯化天然神经毒素时，经常采用凝胶过滤和离子交换层析的方法。但是神经毒素纯化经过凝胶过滤和离子交换步骤后仍会含有少量的杂质，这些杂质有可能会严重干扰药理检测。RP-HPLC仍然是必需的和最有用的手段。虽然神经毒素分子较小，只有62个氨基酸残基，却含有4对二硫键。因此，蛋白分子的正确折叠与二硫键的正确配对与否对功能的影响就十分关键。

一材料与方法

1、材料

BIOFLO 3000发酵罐(5L)，New Brunswick Scientific公司；IgG Sepharose 6Fast Flow，Sephadex G25，SP-Sepharose FF，蛋白分子量Marker均购自Pharmacia公司；HPLC仪器，Waters公司(486型)；半制备反相C₁₈柱，PROSPHERE 300(300×7.8mm，Φ5μm)，Alltech公司。Urea，β-mercaptoethanol，glutathione(oxidized)均购自Sigma公司，其余化学试剂皆为国产分析纯。

2×YT培养基配方如下：

细菌胰蛋白胨         16g

细菌-酵母提取物      10g

NaCl                 5g

用去离子水将溶质完全溶解，5N NaOH调节pH至7.0，最后定容于1L，15磅蒸气灭菌20分钟。

SDS-PAGE(Tris-Tricine)缓冲体系及母液配方：

缓冲液                Tris(M)        Tricine(M)   pH             SDS(％)
	Anode      缓冲液     0.2            /            8.9             /Cathode    缓冲液     0.1            0.1          8.25            0.1Gel        缓冲液     3.0            /            8.45            0.3
丙烯酰胺-双丙烯酰胺混合物  丙烯酰胺(w/v，％)    双丙烯酰胺(w/v，％)
	49.5％T，3％C                     48                    1.5

2方法

2.1发酵

将含pT7ZZ-NT质粒的E.coli BL21(DE3)接种于LB培养基，37℃摇床培养8小时左右，然后按2％接种量转接于5L发酵罐，发酵采用2×YT培养基(配制5L)，发酵条件如下：

37℃，300-700rpm；通气：5.3～8.0L/min(波动)；Feed 1，消泡泵(泡敌-水混合液)；Feed 2，碳源泵(50％甘油)。

OD₆₀₀达6.0左右时，加终浓度为1mmol/l的IPTG诱导表达(Feed 2暂停约15分钟)，继续培养3小时(OD₆₀₀达8.0左右)。离心，收集菌体。用超声波破碎仪破菌后，离心分别收集上清和沉淀。SDS-PAGE证明融合蛋白主要存在于上清。

2.2融合蛋白的亲和纯化

取2.1中上清液，冻干缩小体积。溶于TST(Tris-saline Tween 20：50mM Tris缓冲液，pH7.6；150mM NaCl；0.05％Tween 20)缓冲液中，上样于IgG Sepharose6 Fast Flow亲和柱，用0.5M NH₄Ac，pH5.0的缓冲液洗脱样品，收集，SDS-PAGE鉴定。

将样品冷冻干燥后，备用。

2.3融合蛋白的裂解

将上述经亲和层析后得到的融合蛋白(电泳纯)，首先用5％巯基乙醇在pH8.0室温下处理24小时，再加入色胺(按每分子甲硫氨酸加5分子的色胺)，然后采用溴化氰裂解。反应体系如下：

融合蛋白               1mg/mlCNBr(70％甲酸，V/V)    50mg/ml1×SDS缓冲液

反应物混合后，在反应容器中充满氮气，密封反应容器口，避光，室温，预先摸索最佳反应时间。

融合蛋白定量按以下公式计算：

测定融合蛋白在260nm和280nm下的吸光度，按C(_mg/ml)＝1.45A₂₈₀-0.74A₂₆₀定量。

预实验：

1.各取50ug脱盐后的融合蛋白，分装于7个1.5ml小离心管中，真空冷冻抽干，备用。

2.在通风橱中新鲜配制裂解液(70％甲酸/50mg/ml CNBr)

3.分别在样品中各加入50ul裂解液，在反应管中充氮气，封口，室稳，置于25℃水浴中。

4.分别在反应0、2、4、8、12、24、48小时各取样品，置于-80度冰箱冻存，终止反应。

5.全部反应结束后，将各样品冷冻抽干。

6.分别溶解于50ul双蒸水，各取5ul走12.5％的SDS-PAGE(Tris-Tricine)电泳鉴定裂解效果。见下表：

反应时间(小时)	0	2	4	8	12	24	48
								裂解率(％)	0	8.18％	17.94％	33.7％	50.74％	68.39％	72.45％

*裂解率：100％-(LKB激光扫描仪扫描SDS-PAGE中融合蛋白在总蛋白中的百分率含量)，

根据以上实验结果，选择24小时作为融合蛋白裂解反应时间。

以下按照上述实验程序进行大量裂解融合蛋白。将反应混合物冻干，备用。

将裂解反应物溶解于6M盐酸胍，0.1M Tris，pH8.5，0.1M DTT的溶液中，备用。

2.5眼镜蛇短链神经毒素阳离子柱的纯化

将上述反应混合物，用4倍体积的2.5M尿素(pH2.5)稀释后，上样于阳离子交换树脂SP-Sepharose FF，用2M尿素/10mmol HCl洗涤杂蛋白，然后再用2M尿素/10mmol HCl/100mmol NaCl洗脱样品，280nm监测，SDS-PAGE检测样品。冻干，备用。

2.6脱盐

将上述样品用分子筛(Sephadex G25)脱盐。冻干，备用。

2.7眼镜蛇短链神经毒素C₁₈反相HPLC的制备

上样于半制备柱(C₁₈μ-Bondapak，Waters)，用线性梯度洗脱40分钟(A相：水/乙氰/三氟乙酸＝95％/5％/0.1％；B相：水/乙氰/三氟乙酸＝20％/85％/0.1％)，280nm监测，收集洗脱蜂。冻干，备用。

2.8蛋白再复性

将2.7的样品以1mg蛋白/m1的浓度溶解于0.1M Tris-HCl(pH8.7)，同时，该溶液中含2％的β-巯基乙醇和8M的脲，室温放置1小时，然后在4℃下，对0.1MTris-HCl(pH8.0)缓冲液进行透析，后者缓冲液中含10mM氧化型谷胱甘肽，其间换三次以上的缓冲液，48小时后将样品冻干，备用。

结果

融合蛋白经过高效率的亲和柱纯化后达到电泳纯；接着，融合蛋白在进行溴化氰裂解反应后，分子量约为7000Da的目的蛋白被切离下来。

目的蛋白在经过阳离子交换树脂吸附、分子筛脱盐以及最后C₁₈反相HPLC纯化后，得到纯品(见图5，纯度大于95％)。

实施例5

酵母表达产物的分离纯化

酵母培养上清液，于4℃，在磁力搅拌器缓慢搅拌下，加入硫酸铵至30％饱和度，离心弃去沉淀。在上清液中再加入硫酸铵至60％饱和度，离心取沉淀。然后按实施例4类似的方式，先用阳离子交换树脂纯化目的蛋白，再用反相C₁₈柱用梯度HPLC纯化，最后进行复性。

结果表明，Pichia Pastoris表达产物经阳离子交换树脂和反相C₁₈ HPLC纯化后，得到了纯品(纯度＞95％)。使用Pichia Pastoris表达外源基因的优势在于，在表达质粒pHIL-S1上PHO1分泌信号肽的作用下，目的蛋白被分泌到培养基中，从而给纯化工作带来很大方便。蛋白纯化程序的简化显然增加了对蛋白质本身的保护。

实施例6

眼镜蛇短链神经毒素的免疫学测定

初次免疫采用购自Sigma公司的α-Bungarotoxin(Bungarus multicinctus)(一种蛇神经毒素)，以0.5毫克蛋白/千克的剂量免疫兔子，用弗氏完全佐剂等比例体积混匀乳化后，背部、多点注射。4周后，用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，以相同剂量进行加强免疫。对免疫后的兔子进行耳缘静脉采血，制备抗血清。经测定，抗血清的抗体效价达10⁹。

用如上制备的抗血清进行蛋白免疫印迹实验，结果表明(1)大肠杆菌表达的眼镜蛇短链神经毒素融合蛋白，(2)纯化后的眼镜蛇短链神经毒素能与多抗结合，这表明大肠杆菌表达产物有明显的神经毒素抗原决定蔟。

类似地，对眼镜蛇短链神经毒素的酵母表达产物进行蛋白免疫印迹测试，结果也表明，酵母表达产物具有明显的神经毒素抗原决定蔟。

实施例7

眼镜蛇短链神经毒素的理化特性

(1)等电点

对实施例2和3中所制得的眼镜蛇短链神经毒素纯样品，用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的等电点。结果表明，眼镜蛇短链神经毒素的pI值为9.47。

(2)分子量

分子量测定委托中国科学院上海有机化学研究所和生物化学研究所测试，大肠杆菌表达的眼镜蛇短链神经毒素分子量为6949±0.73；Pichia表达的眼镜蛇短链神经毒素分子量为7380。测定结果与理论值相符。

(3)N-末端测定

N-末端用Edman法测定，仪器为Bechman Proton LF3200测序仪。N-末端程序结果与cDNA推导的蛋白质序列N-末端一致，即眼镜蛇短链神经毒素前15个残基：LECHNQQSSQTPTTT。

(4)圆二色谱测定

将实施例2和3中所制得的眼镜蛇短链神经毒素纯样品，分别溶于磷酸钠缓冲液(pH7.0)中，在日本JASCO的J-500C型圆二色仪上测试，光径为0.1厘米，室温，扫描波长为250-190纳米，连续扫描5次。结果表明，最大值在195纳米处，最小值在210纳米(单位：度·厘米²·摩尔^-1)。

实施例8

眼镜蛇短链神经毒素的毒理性质

按寇氏法，按0.75的比率递减，将实施例2和3中所制得的眼镜蛇短链神经毒素纯样品，用生理盐水分别稀释至以下5组给药浓度：1200、900、675、506.25、和379.6微克/千克(大肠杆菌表达产物)；或2750、1925、1347.5、943.25、660.28和462.19微克/千克(酵母表达产物)。

取昆明小鼠随机分组，每组10只，每只动物分别在腹腔注射相应剂量，注射体积为0.5ml/20g小鼠。注射后观察7天，死亡动物进行尸检和病理观察。

结果表明，大肠杆菌表达的眼镜蛇短链神经毒素的半致死剂量LD₅₀＝735.7±1.0715ug/千克；酵母表达的眼镜蛇短链神经毒素的半致死剂量LD₅₀＝1298.7±1.122ug/千克。

实施例9

眼镜蛇短链神经毒素的药理性质

1、镇痛作用

根据E.coli和Pichia表达产物各自LD₅₀的结果，分别设计以下5组浓度(单位：ug/kg)。

E.coli表达产物(ug/kg)	9.5	18.7	37	75	150
						Pichia表达产物(ug/kg)	40.5	81	162.5	325	650
生理盐水(阴性对照)	0.2ml	0.2ml	0.2ml	0.2ml	0.2ml

将雄性昆明种小鼠随机分组，每组10只，按上述浓度将样品及生理盐水对照分别给每组小鼠腹腔注射，30分钟后，分别给各组小鼠腹腔注射0.7％冰乙酸0.2ml，5分钟后观察小鼠在10分钟内的扭体次数，记录扭体次数。

实验结果

小鼠腹腔注射0.7％冰乙酸后，可以观察到小鼠腹部收缩、扭体等疼痛现象。

具体数据参见下表，镇痛有效率按以下公式计算：

             表1，短链神经毒素对小鼠镇痛效应的测定(扭体法)

组别	剂量(ug/kg)	给药途径	小鼠数目(只)	扭体次数(X+SD)	有效率(％)
						E.coli表达产物	9.518.737.575159	ip×1ip×1ip×1ip×1ip×1	1010101010	16.75±4.5*7.50±6.0*4.75±4.1*0.000.00	33.2670.1081.00100.00100.00
E.coli表达产物	40.581162.5325650	ip×1ip×1ip×1ip×1ip×1	1010101010	7.30±1.2*3.75±2.5*0.000.000.00	71.1085.10100.00100.00100.00
						生理盐水(对照)		ip×1	10	25.10±5.2

^*P＜0.01，与对照组比较

鉴于大多数药物的治疗指数大于3时，在动物试验中是比较安全的。因此，我们采用各样品的三分之一LD₅₀值作为最大剂量，同时也作为用药的起始剂量。实验中发现，在起始剂量(高剂量)时，动物活动减少，对醋酸注射引起的疼觉有很明显的抑制作用，各样品的镇痛效应都应达到100％。因此，分别以50％的比例缩小用药剂量，结果，各给药组在低剂量时的扭体次数也比对照组减少，有明显的剂量关系，具体为：大肠杆菌表达产物在其剂量为LD₅₀值的二十分之一时，仍有良好的镇痛效应；同样，酵母表达产物在其剂量为LD₅₀值的十六分之一时，也有明显的镇痛效应。

2、抗肿瘤作用

(1)对小鼠肉瘤S₁₈₀(实体型)的抑瘤作用

取生长良好的小鼠肉瘤S₁₈₀腹水，用生理盐水1∶4稀释后，每只小鼠腋下接种0.2ml，随机分组，设生理盐水组(阴性对照)和环磷酰胺阳性对照组(100mg/kg，ip×2)，三个样品各分成二个给药剂量组，次日起连续腹腔给药7天，第10天脱颈处死动物，解剖取瘤块，比较各剂量组瘤重之大小。

根据以下公式计算肿瘤抑制率：

结果见下表：

        表2，短链神经毒素各样品对小鼠肉瘤S₁₈₀(实体型)的抑制作用

组别             剂量       给药    动物体重(g)    瘤重(g)        抑制率

                 ug/kg      方案       始终        (x±DS)        (％)

N.S(阴性对照)    25ml/kg    po×7   18.9  25.4     2.96±0.79

短链神经毒素     75         ip×7   19.0  25.1     2.36±0.86     20.3

(E.coli)         150        ip×7   19.1  24.8     2.0±0.92^*    32.4

短链神经毒素     400        ip×7   19.0  25.1     2.16±0.87^*   27.0

(Pichia)         800        ip×7   19.1  21.1     1.50±0.32^*   49.3

融合蛋白         500        ip×7   19.0  23.3     2.65±1.08     10.4

(E.coli)         1000       ip×7   19.2  26.8     2.40±0.77     18.9

环磷酰胺         100mg/kg   ip×2   19.1  22.4     0.51±0.26^**  82.7

(阳性对照)

^*P＜0.05  ^**P＜0.01(与对照组比较)。

以上实验结果表明，大肠杆菌表达的和酵母表达的短链神经毒素各高剂量组对小鼠肉瘤S₁₈₀(实体型)有明显的抑瘤作用。而大肠杆菌表达的融合蛋白则无抑瘤作用。

(2)对小鼠肝癌HAC(实体型)的抑瘤作用

取生长良好的小鼠肝癌HAC腹水，用生理盐水1∶4稀释后，每只小鼠腋下接种0.2ml，随机分组，设生理盐水组和环磷酰胺阳性对照组(100mg/kg ip×2)，Pichia表达的短链神经毒素和E.coli表达的短链神经毒素各二个给药组次日起给予不同的药物，连续腹腔给药7天，第10天脱颈处死动物，解剖取瘤块，比较各剂量组瘤重之大小。

结果判定根据以下公式：

结果见下表：

          表3，短链神经毒素各样品对小鼠肝癌HAC(实体型)的抑制作用

组别                    剂量     给药  动物体重(g)  瘤重(g)       抑制率

                        ug/kg    方案      始终     (x±DS)       (％)

N.S(阴性对照)           25ml/kg  ip×7  19.2  24.6  2.90±0.94

短链神经毒素(E.coli)    75       ip×7  19.0  25.4  2.62±0.73    9.65

                        150      ip×7  19.1  24.1  1.92±0.51^*  33.8

短链神经毒素(Pichia)    400      ip×7  19.1  24.3  2.14±0.39    26.2

                        800      ip×7  19.1  21.6  1.52±0.33^*  47.7

环磷酰胺(阳性对照)      100mg/k  ip×2  19.2  22.5  0.16±0.04^** 94.5

                        g        (1.5.)

^*P＜0.05  ^**P＜0.01(与对照组比较)。

以上实验结果表明，大肠杆菌表达和酵母表达的短链神经毒素的高剂量组对小鼠肝癌HAC(实体型)有明显的抑瘤作用。

(3)对小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用

取生长良好的小鼠Lewis肺癌瘤块，用生理盐水1∶5匀浆，每只小鼠腋下接种0.2ml，随机分组，设生理盐水组和环磷酰胺阳性对照组(100mg/kg ip×2)，pichia表达的短链神经毒素和E.coli表达的短链神经毒素各二个给药组次日起给予不同的药物，连续灌药7天，第10天脱颈处死动物，解剖取瘤块，比较各剂量组瘤重大小。

结果判定根据以下公式：

           表4，短链神经毒素各样品对小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用

组别             剂量      给药   动物体重(g)    瘤重(g)       抑制率

                 ug/kg     方案      始终        (x±DS)       (％)

N.S(阴性对照)    25ml/kg   po×7  18.0  18.6     1.88±0.24

短链神经毒素     75        ip×7  18.0  18.0     1.62±0.27    14.8

(E.coli)         150       ip×7  18.1  19.8     1.38±0.36    27.6

短链神经毒素     400       ip×7  18.2  18.4     1.66±0.35    11.7

(Pichia)         800       ip×7  18.2  18.2     1.34±0.39    28.7

环磷酰胺         100mg/kg  ip×2  18.1  18.2     0.40±0.15^** 78.7

(阳性对照)                 (1.5.)

从上表可见，大肠杆菌表达和酵母表达的短链神经毒素的高剂量组对小鼠Lewis肺癌均无明显的抑瘤作用。

讨论

由以上实验结果得出，短链神经毒素各样品对小鼠由醋酸引起的疼痛有明显的抑制作用，对小鼠S₁₈₀肉瘤、肝癌HAC的抑制作用，Pichia表达的短链神经毒素有效剂量为800ug/kg，抑制率分别为：49.3％和47.7％；E.coil表达的短链神经毒素有效剂量为150ug/kg，抑制每分别为：32.4％和33.8％。而两者对小鼠Lewis肺癌均无明显的抑制作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                          序列表

(1)一般信息：

  (ii)发明名称：眼镜蛇短链神经毒素及其制法和用途

  (iii)序列数目：4

(2)SEQ ID NO：1的信息：

  (i)序列特征：

     (A)长度：252bp

     (B)类型：核酸

     (C)链性：双链

     (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：cDNA

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

ATGGAAACTC TGTTGCTGAC CTTGCTGGTG GTGACAATCG TGTGCCTGGA  50

CTTAGGATAC ACCCTGGAAT GTCACAACCA ACAATCATCG CAAACTCCAA  100

CCACTACAGG TTGTTCAGGT GGGGAGACCA ATTGCTATAA AAAGCGTTGG  150

CGTGATCACC GTGGATATAG AACCGAGAGG GGATGTGGTT GCCCTTCAGT  200

GAAGAACGGC ATTGAAATTA ACTGTTGCAC AACAGACAGA TGCAACAATT  250

AG                                                      252

(2)SEQ ID NO：2的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：62个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：多肽

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

LECHNQQSSQ TPTTTGCSGG ETNCYKKRWR DHRGYRTERG CGCPSVKNGI  50

EINCCTTDRC NN                                           62

(2)SEQ ID NO：3的信息：

  (i)序列特征：

   (A)长度：381bp

   (B)类型：核酸

   (C)链性：双链

   (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

TTAGATGGAA ACTCTGTTGC TGACCTTGCT GGTGGTGACA ATCGTGTGCC TGGACTTAGG  60

ATACACCCTG GAATGTCACA ACCAACAATC ATCGCAAACT CCAACCACTA CAGGTTGTTC  120

AGGTGGGGAG ACCAATTGCT ATAAAAAGCG TTGGCGTGAT CACCGTGGAT ATAGAACCGA  180

GAGGGGATGT GGTTGCCCTA TAGTGAAGAA CGGCATTGAA AGTAACTGTT GCACAACAGA  240

CAGATGCAAC AATTAGCTCT CCGAGTGGCT AAATTCCTTG AGTTTTGCTC TCATCCATCA  300

TGGACCATCC TTGAAAATTT ATGCTTGTGG CCTTTAGCAC CAGATGGTCC ATCATTCCTT  360

CTCCACTACT GTCTTTGACT T                                            381

(2)SEQ ID NO：4的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：83个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：多肽

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

METLLLTLLV VTIVCLDLGY TLECHNQQSS QTPTTTGCSG GETNCYKKRW  50

RDHRGYRTER GCGCPSVKNG IEINCCTTDR CNN                    83

Claims (5)

1.一种眼镜蛇短链神经毒素的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达眼镜蛇短链神经毒素的条件下，培养毕赤氏酵母，所述的毕赤氏酵母的染色体中整合有眼镜蛇短链神经毒素的编码序列，所述编码序列编码氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的眼镜蛇短链神经毒素并且在pAOX1启动子的控制下，从而直接表达眼镜蛇短链神经毒素，并使眼镜蛇短链神经毒素被分泌到培养基中；

(b)离心去除沉淀，从而获得含眼镜蛇短链神经毒素的上清液；

(c)沉淀出上清液中的眼镜蛇短链神经毒素，离心获得眼镜蛇短链神经毒素沉淀；

(d)对所述沉淀依次用阳离子交换树脂和HPLC纯化，从而获得纯化的眼镜蛇短链神经毒素；

(e)对纯化的眼镜蛇短链神经毒素进行复性，从而获得复性的眼镜蛇短链神经毒素。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)是取毕赤氏酵母培养上清液加入硫酸铵至30％饱和度，离心弃去沉淀，获得上清液；

步骤(c)是在上清液中再加入硫酸铵至60％饱和度，离心取沉淀，从而获得眼镜蛇短链神经毒素沉淀。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的HPLC是反相C18柱梯度HPLC。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的毕赤氏酵母是毕赤氏酵母GS115。

5.眼镜蛇短链神经毒素的用途，其中所述的眼镜蛇短链神经毒素具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，其特征在于，所述的眼镜蛇短链神经毒素被用于制备治疗肝癌或肉瘤的药物。

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