EP0817845A1 - Systeme d'expression conditionnel - Google Patents

Systeme d'expression conditionnel

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EP0817845A1
EP0817845A1 EP96911000A EP96911000A EP0817845A1 EP 0817845 A1 EP0817845 A1 EP 0817845A1 EP 96911000 A EP96911000 A EP 96911000A EP 96911000 A EP96911000 A EP 96911000A EP 0817845 A1 EP0817845 A1 EP 0817845A1
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EP
European Patent Office
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transactivator
sequence
protein
domain
molecule
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP96911000A
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German (de)
English (en)
Inventor
Laurent Bracco
Fabien Schweighoffer
Bruno Tocque
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Aventis Pharma SA
Original Assignee
Rhone Poulenc Rorer SA
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N2830/003—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor tet inducible

Definitions

  • the present invention relates to a new system for the conditional expression of genes. It also relates to the use of this system in gene or cell therapy, to very selectively target the expression of genes of interest.
  • Gene and cell therapies consist in correcting a deficiency or an anomaly (mutation, aberrant expression, etc.) or in ensuring the expression of a protein of therapeutic interest by introducing genetic information into the affected cell or organ. .
  • This genetic information can be introduced either ex vivo in a cell extracted from the organ, the modified cell then being reintroduced into the body (cell therapy), or directly in vivo in the appropriate tissue (gene therapy).
  • Different techniques exist for performing gene transfer including various transfection techniques involving chemical or biochemical, natural or synthetic vectors such as DNA and DEAE-dextran complexes (Pagano et al., J. Virol.
  • promoters have been described in the literature, such as the promoter of genes coding for pyruvate kinase, villin, GFAP, the promoter of the intestinal fatty acid binding protein, the promoter of ⁇ actin of smooth muscle cells, or the promoter of the genes of apo-AI, apo-AII, human albumin, etc.
  • these promoters have certain drawbacks and in particular they present a certain transcriptional background noise which can be troublesome for the expression of toxic genes and they are limited to certain cells and therefore cannot be used for any application.
  • the present invention now describes a novel conditional gene expression system, which is particularly selective and efficient.
  • One of the advantageous characteristics of the system of the invention lies in its capacity to express a gene not as a function of a cell type, but as a function of the presence of a particular cellular element or of a particular physiological situation.
  • This system makes use of bispecific chimeric molecules comprising a domain capable of selectively binding a defined DNA sequence and a detector domain capable of specifically binding a transactivator or a transactivator complex.
  • a first aspect of the present invention lies more particularly in the creation and expression of chimeric bispecific molecules comprising a domain capable of selectively binding a defined DNA sequence and a domain capable of specifically binding a transactivator or transrepressor or a transactivator complex or transrepressor.
  • Another aspect of the present invention resides in a nucleic acid sequence coding for a chimeric molecule as defined above. before, as well as a whole expression vector comprising said nucleic sequence.
  • Another aspect of the invention consists of a conditional gene expression system comprising (i) a chimeric molecule as defined above and (ii) an expression cassette comprising a regulatory sequence, a minimal promoter (including activity depends on the presence of a transactivator) and said gene.
  • Another aspect of the invention also resides in an expression vector comprising - a nucleic sequence coding for a chimeric molecule as defined above and
  • conditional expression system of the invention is particularly suitable for use in gene or cell therapy, for very selective targeting of the expression of genes of interest.
  • One of the components of the system of the invention therefore consists of particular bispecific chimeric molecules comprising a domain capable of selectively binding a defined DNA sequence and a domain capable of specifically binding a transactivator or a transactivator complex.
  • the bispecificity of the molecules of the invention resides on the one hand in their capacity to link a defined DNA sequence (generally designated regulatory or operator sequence) and on the other hand in their capacity to specifically recruit a transactivating or transrepressant protein domain allowing induce or suppress gene expression.
  • the invention relates in particular to the development of bispecific chimeric molecules allowing the recruitment of any transcriptional factor whose activation or inactivation leads to a situation pathophysiological.
  • the bispecific chimeric molecules according to the invention thus allow the selective recruitment of transcriptional transactivators specific for a pathophysiological state, the binding of these transcriptional factors to promoters by means of a binding of these molecules to defined DNA sequences. located near these promoters (regulatory or operator sequences), and thus the conditional expression of genes (Figure 1).
  • the invention also relates to the development of chimeric bispecific molecules allowing the recruitment not of a molecule carrying a transactivating domain but of a transcriptional transactivating complex, that is to say of a complex formed between a target molecule present in a cell and a molecule carrying a transactivating domain ( Figure 2).
  • the transactivator complex is preferably formed by means of a second bispecific chimeric molecule comprising a transactivator domain and a domain for selective binding to said cell molecule.
  • the binding of this second molecule allows the formation of a transcriptional transactivating binary complex, which complex is then recruited by the detector system of the invention.
  • the binding of this ternary complex near promoters thus allows the regulated expression of genes.
  • This type of construction advantageously makes it possible to extend the conditions of use of the system of the invention to the detection of any intracellular molecule devoid of transactivating domain, whether it is an endogenous molecule or a molecule of infectious origin for example.
  • the system of the invention thus makes it possible, thanks to a very selective detection system ("sensor") to activate the expression of genes of interest only in the presence of target proteins. They can be transcriptional factors appearing during physiological or pathophysiological situations, or any endogenous molecule or of infectious origin for example.
  • the system of the invention indeed contains a very sensitive and very selective detector element making it possible to condition the expression of a gene to the presence, the appearance or the disappearance of any molecule in a cell.
  • the term transactivator designates any transactivating factor for transcription or any protein comprising a transcriptional transactivating domain.
  • the transactivating complex designates the complex formed between a molecule present in a cell and a bispecific molecule of the invention comprising a transactivating domain and a specific binding domain for said molecule.
  • the expression system of the invention can be used to recruit any transactivating protein or carrying a transactivating domain, and in particular any protein of viral, parasitic, mycobacterial or cellular origin having a transcriptional transactivating activity.
  • any transactivating protein or carrying a transactivating domain and in particular any protein of viral, parasitic, mycobacterial or cellular origin having a transcriptional transactivating activity.
  • the transcriptional factors of viral origin there may be mentioned in particular the Tat protein of the HIV virus, the E6 / E7 proteins of the papilloma virus or also the EBNA protein of the Epstein Barr virus.
  • the conditional expression system according to the invention advantageously allows a detection of this physiological situation (the appearance of these specific transactivators of viral infection) and the induction of a selective expression of given gene (s) .
  • the cellular proteins mention may preferably be made of the mutated or wild-type p53 protein.
  • the p53 protein consists of 393 amino acids. In its wild form, it is a tumor suppressor capable of negatively regulating growth and cell division.
  • This activity is linked to the presence of a transcriptional transactivator domain in the structure of the p53 protein, located in the N-terminal region of the protein (residues 1-100 approximately).
  • wild p53 is also capable of inducing apoptosis (Yonish-Rouach et al., Nature, 352, 345-347, 1991). These properties appearing in stressful situations where the integrity of cellular DNA is threatened, p53 has been suggested to be a "guardian of the genome".
  • the system of the invention can also be used to induce selective expression of gene (s) by detection of any target molecule present in a cell.
  • the detected protein is preferably a protein appearing in a cell in abnormal situations (infection, hyperproliferation, etc.).
  • viral proteins such as proteins of structure or function of a virus, and in particular of the HIV virus, hepatitis, herpes, etc.
  • proteins specific to a state of cellular hyperproliferation such as in particular the proteins myc, fos, jun, cyclins, etc.
  • One of the properties of the chimeric molecules of the invention therefore lies in their ability to bind to specific regions of DNA (regions regulators or operator). This bond makes it possible to bring the transactivating domain close to the promoter and therefore to activate the expression of a gene placed under the control of said promoter.
  • the domain capable of selectively binding a defined DNA sequence present in the molecules of the invention is essentially of protein origin. More preferably, this domain derives from a prokaryotic or eukaryotic protein capable of interacting with DNA sequences. Numerous genetic and structural studies have now made it possible to precisely define, within proteins interacting with double-stranded DNA sequences, the domains responsible for these interactions.
  • tetracycline repressor of E.coli is a protein of about 210 amino acids.
  • tetR negatively controls the transcription of genes mediating resistance to this antibiotic within the tet operon.
  • the tetR repressor binds to DNA at the level of a specific sequence (designated operator sequence or Tetop) and represses the transcription of the resistance gene.
  • the tetR repressor no longer binds to the tetop operator allowing a constitutive transcription of the gene (Hillen.W and Wissmann.A. (1989) in Protein-Nucleic Acid Interaction. Topics in Molecular and Structural Biology.eds, Saenger.W. And Heinemann.U. (Macmillan, London), Vol. 10, pp. 143-162).
  • the tetR sequence has been published (it is reproduced in particular in WO94 / 04682).
  • the specific double-strand DNA sequence for binding of tetR to DNA (Tetop) is composed of the following motif: TCTCTATCACTGATAGGGA (SEQ ID No. 1). This pattern can be repeated several times to increase the affinity and efficiency of the system. So the regulatory sequence can include up to 10 patterns and preferably contains 2 patterns (Tetop2) or 7 patterns (Tetop7) (see Figure 3).
  • Cro protein was originally defined as a regulator of the expression of the repressor Cl (Eisen.H. Et al. (1970) PNAS 66, pp855). Cloning of the cro gene made it possible to identify a protein of 66 amino acids (SEQ ID No. 21; Roberts; T et al. (1977) Nature 270, pp274). Cro exercises its physiological role by preferentially attaching itself to the operator OR3 of Lambda.
  • the specific double-strand DNA sequence for binding of Cro to DNA (region designated OR3) is composed of the following bases:
  • the proteins or domains derived from the STAT, p53 or NFkB proteins are preferred to use for the construction of the molecules of the invention.
  • the proteins or domains derived from the STAT, p53 or NFkB proteins are preferred to use for the construction of the molecules of the invention.
  • Concerning the p53 protein, its DNA binding domain is located in the central region of the protein and, more precisely, in the region between amino acids 102 to 292 (Pavletich et al., Genes & Dev. 7 ( 1993) 2556).
  • the domain capable of selectively binding a defined DNA sequence present in the molecules of the invention is preferably derived from a prokaryotic or eukaryotic protein capable of interacting with a region of double-stranded DNA.
  • the domain used for the construction of the molecules of the invention can consist of the whole of the protein or of a fragment thereof comprising the region of interaction with DNA. This domain has been identified for various proteins and in particular TetR (see for example Berens et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 1945). It can also consist of a derivative of this protein or of the fragment having retained the properties of DNA linkage.
  • Such derivatives are in particular proteins having modifications of one or more amino acids, for example to allow their fusion with the other domains of the molecules of the invention, prepared according to conventional techniques of molecular biology.
  • Derivatives of the TetR and Cro proteins for example have been described in the literature, having point mutations and / or deletions (Hecht et al., J. Bact. 175 (1993) p. 1206; Altschmied et al., EMBO J 7 (1988) 4011; Baumeister et al., Proteins 14 (1992) 168; Hansen et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 14030).
  • the binding capacity of these derivatives to a defined DNA sequence can then be tested by incubating the derivative prepared with the regulatory sequence and detecting the complexes formed.
  • the derivatives can also be proteins with improved DNA binding properties (specificity, affinity, etc.).
  • the domain capable of selectively binding a defined DNA sequence present in the molecules of the invention is derived from a prokaryotic protein.
  • This type of construction is particularly advantageous since these proteins, of non-human origin, recognize double stranded DNA sites of at least 14 nucleotides. The probability of finding the same sequence within the human genome is almost zero and therefore the expression system obtained is all the more selective.
  • the domain capable of selectively binding a defined DNA sequence present in the molecules of the invention is derived from the proteins tetR or Cro. It is particularly advantageous to use the complete tetR or Cro proteins (SEQ ID No. 21).
  • the domain capable of specifically binding the transcriptional transactivator or the transcriptional transactivator complex present in the molecules of the invention can be of different types. It may in particular be an oligomerization domain in the case where the transactivator or the targeted transactivator complex also has such a domain. It can also be any synthetic or natural domain known to interact with said transactivator or transactivator complex. It may also be an antibody or a fragment or derivative of an antibody directed against the transactivator or transactivator complex.
  • oligomerization domains which can be used in the context of the invention, mention may be made more particularly of leucine-zippers, SH2 domains or SH3 domains for example.
  • Leucine-zippers are amphipatic ⁇ -helices which contain 4 or 5 leucines every 7 amino acids. This periodicity allows the location of leucines at approximately the same position on the ⁇ helix. Dimerization is underpinned by hydrophobic interactions between the side chains of leucines from two contiguous zipper domains (Vogt et al., Trends In Bioch. Science 14 (1989) 172).
  • the SH2 domains are known to interact with specific peptide sequences phosphorylated in tyrosine.
  • the SH3 domains can be used to form an oligomer with any transactivator or transactivator complex comprising the corresponding proline-rich peptide (Pawson et al., Current Biology 3 (1993) 434). It is also possible to use regions of proteins known to induce oligomerization, such as in particular the C-terminal region of the p53 protein. The use of this region makes it possible to selectively recruit the p53 proteins present in a cell. Preferably, in the context of the invention, a region of p53 between amino acids 320-393 (SEQ ID No. 3), 302-360 or 302-390 is used.
  • a specific binding domain to the preferred transcriptional transactivator of the invention consists of an antibody or an antibody fragment or derivative.
  • the fragments or derivatives of antibodies are for example the Fab or F (ab) ′ 2 fragments, the VH or VL regions of an antibody or also single chain antibodies (ScFv) comprising a VH region linked to a VL region by a arms.
  • This type of domain is particularly advantageous since it can be directed against any molecule.
  • Antibodies molecules of the immunoglobulin superfamily, are made up of different chains (2 heavy (H) and 2 light (L)) themselves made up of different domains (variable domain (V) junction domain (J), etc.).
  • the transactivator binding domain or transactivating complex present in the molecules of the invention advantageously consists of a fragment or derivative of antibodies comprising at least the binding site of the antigen.
  • This fragment can be either the variable domain of a light (V
  • the single chain antibodies used for the construction of the molecules of the invention consist of a peptide corresponding to the binding site of the variable region of the light chain of an antibody linked by a peptide arm to a peptide corresponding to the binding site of the variable region of the heavy chain of an antibody.
  • the construction of nucleic acid sequences encoding such modified antibodies according to the invention has been described for example in patent US Pat. No. 4,946,778 or in applications WO94 / 02610, WO94 / 29446. It is illustrated in the examples.
  • a preferred construct according to the present invention comprises a binding domain to a p53 protein. It is more preferably an antibody derivative directed against a p53 protein. A particular embodiment consists of a single chain antibody directed against p53. AT As a specific example, the ScFv of sequence SEQ ID No. 4 is used, the construction of which is described in the examples.
  • the DNA binding domain and the transactivator binding domain are generally linked together via an arm.
  • This arm generally consists of a peptide conferring sufficient flexibility for the two domains of the molecules of the invention to be able to function independently.
  • This peptide is generally composed of uncharged amino acids, which do not interfere with the activity of the molecules of the invention, such as for example glycine, serine, tryptophan, lysine or proline.
  • the arm generally comprises from 5 to 30 amino acids and, preferably, from 5 to 20 amino acids. Examples of peptide arms which can be used for the construction of the molecules of the invention are for example:
  • Preferred examples of a molecule according to the invention are in particular the following molecules: a) ScFv-tag-Hinge-TET or Cro (FIG. 5A) This type of molecule comprises:
  • sequence SEQ ID No. 7 a tag peptide sequence recognized by a monoclonal antibody allowing the immunological detection of the molecule.
  • This sequence can for example be the VSV epitope of sequence MNRLGK (SEQ ID No. 7) whose coding sequence is ATGAACCGGCTGGGCAAG (SEQ ID No. 7), or the myc epitope of sequence EQKLISEEDLN (SEQ ID No. 8) the coding sequence is GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAAT (SEQ ID No. 8), recognized by the antibody 9E10.
  • This type of molecule simply comprises a binding domain to a transactivator consisting of a single chain antibody and a DNA binding domain consisting of the TET or Cro protein. It has neither arms nor tag sequence. In this construction, the transactivator binding domain is located in the N-terminal part of the molecule and the DNA binding domain in the C-terminal part.
  • TET or Cro-ScFv Figure 5D
  • This type of molecule is similar to type c) above. The difference essentially lies in the arrangement of the domains: the binding domain to the transactivator is now located in the C-terminal part of the molecule and the DNA binding domain in the N-terminal part.
  • This type of molecule is similar to type a), except for the transactivator binding domain which is replaced by the oligomerization domain with the p53 protein of sequence SEQ ID No. 3. This molecule makes it possible to recruit the p53 proteins mutated cells appearing in tumor cells.
  • Oligom-Hinge-TET or Cro Figure 5B
  • This type of molecule is similar to type c), except for the transactivator binding domain which is replaced by the oligomerization domain with the p53 protein of sequence SEQ ID No. 3. i) TET or Cro-Oligom ( Figure 5D) This type of molecule is similar to type d), except for the transactivator binding domain which is replaced by the oligomerization domain with the p53 protein of sequence SEQ ID No. 3. j) TET or Cro -Hinge-Oligom ( Figure 5E)
  • This type of molecule is similar to type e), except for the transactivator binding domain which is replaced by the oligomerization domain with the p53 protein of sequence SEQ ID No. 3.
  • the peptide arm can be easily replaced by the sequence (G4S) 3 (SEQ ID No. 5).
  • nucleic acid sequence coding for a chimeric molecule as defined above. It is advantageously a DNA sequence, in particular cDNA. It can also be an RNA.
  • the sequences of the invention are generally constructed by assembling, within a cioning vector, sequences coding for the different fields according to the conventional techniques of molecular biology.
  • the nucleic acid sequences of the invention can optionally be modified chemically, enzymatically or genetically, with a view to generating stabilized domains, and / or multifunctional domains, and / or of reduced size, and / or with the aim of promoting their location in this or that intracellular compartment.
  • nucleic acid sequences of the invention can include sequences encoding nuclear localization peptides (NLS).
  • NLS nuclear localization peptides
  • nucleic acid sequences according to the invention advantageously form part of an expression vector, which can be of plasmid or viral nature.
  • Another object of the present invention resides in a fusion protein comprising a transcriptional transactivating domain and a binding domain specific to a given molecule, optionally linked by a peptide arm, as well as any nucleic acid sequence coding for such a fusion.
  • the transactivating domain can come from any transcriptional transactivating protein, such as p53, VP16, EBNA, E6 / E7, Tat, etc.
  • Another subject of the invention consists of a conditional gene expression system comprising:
  • An expression cassette comprising a regulatory sequence, a minimal transcriptional promoter and said gene.
  • the expression cassette contains the elements necessary for activation of gene expression by the transactivator or transactivator complex recruited by the bispecific molecule.
  • the regulatory sequence is the DNA binding sequence of the expressed chimeric molecule.
  • the regulatory sequence comprises the sequence SEQ ID No. 1 or a derivative thereof, optionally repeated several times. It is preferably the sequence op2 (comprising 2 repeated Tetop motifs) or Op7 (comprising 7 repeated Tetop motifs such as described for example in Weinmann et al., The Plant Journal 5 (1994) 559).
  • the regulatory sequence comprises the sequence SEQ ID No.
  • sequences SEQ ID No. 1 and 2 can be any sequence obtained by modification of a genetic nature (mutation, deletion, addition, repetition, etc.) and retaining the capacity to specifically bind a protein. Such derivatives have been described in the literature (Baumeister et al cited above, Tovar et al., Mol. Gen. Genêt. 215 (1988) 76, WO94 / 04672).
  • the minimal transcriptional promoter is a promoter whose activity depends on the presence of a transactivator. Therefore, in the absence of the chimeric molecule, the promoter is inactive and the gene is little or not expressed. On the other hand, in the presence of the chimeric molecule, the recruited transactivator or transactivator complex makes it possible to induce the activity of the minimal promoter and thus the expression of the gene of interest.
  • the minimum promoter generally consists of a TATA or INR box. These elements are in fact the minimum elements necessary for the expression of a gene in the presence of a transactivator.
  • the minimal promoter can be prepared from any promoter by genetic modification.
  • a candidate promoter As a preferred example of a candidate promoter, mention may be made of the promoter of the thymidine kinase gene. Interesting results have more precisely been obtained with a minimal promoter derived from the TK promoter composed of nucleotides -37 to +19.
  • the minimal promoter can also be derived from human CMV. In particular, it can consist of the fragment between the nucleotides -53 to +75 or -31 to +75 of the CMV. Any conventional promoter can however be used such as for example the promoter of the genes coding for chloramphenicol acetyl transferase, ⁇ -galactosidase or even luciferase.
  • the expression cassette advantageously consists of the following elements:
  • a regulatory sequence a sequence comprising the sequence SEQ ID No. 1 or 2 or a derivative thereof, optionally repeated several times,
  • TK thymidine kinase
  • the minimal promoter consists of the region -37 to +19 of the promoter of the thymidine kinase gene.
  • the expression cassette is chosen from cassettes of Tetop2.TK-Gene structure; Tetop7.TK-Gene and OR3.TK-Gene.
  • nucleic acid sequence coding for a chimeric molecule and an expression cassette as defined above.
  • the nucleic acid sequence coding for the chimeric molecule and the expression cassette can be inserted in the same orientation or in the opposite orientations.
  • the vector may be of plasmid or viral nature.
  • the viral vectors there may be mentioned more preferably the adenoviruses, the retroviruses, the herpes viruses or even the associated adeno viruses.
  • the viruses according to the present invention are defective, that is to say incapable of replicating autonomously in the target cell.
  • the genome of the defective viruses used in the context of the present invention is therefore devoid of at least the sequences necessary for the replication of said virus in the infected cell. These regions can be either eliminated (in whole or in part), or made non-functional, or substituted by other sequences and in particular by the sequences of the invention.
  • the defective virus nevertheless retains the sequences of its genome which are necessary for the packaging of the viral particles.
  • adenoviruses various serotypes, whose structure and properties vary somewhat, have been characterized.
  • serotypes it is preferred to use, in the context of the present invention, human adenoviruses of type 2 or 5 (Ad 2 or Ad 5) or adenoviruses of animal origin (see application WO94 / 26914).
  • adenoviruses of animal origin which can be used in the context of the present invention, mention may be made of adenoviruses of canine, bovine, murine origin (example: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine , avian or even simian (example: after-sales service).
  • the adenovirus of animal origin is a canine adenovirus, more preferably a CAV2 adenovirus [Manhattan strain or A26 / 61 (ATCC VR-800) for example].
  • adenoviruses of human or canine or mixed origin are used.
  • the genome of the recombinant adenoviruses of the invention comprises at least the ITRs and the packaging region of an adenovirus, and the nucleic acid sequence coding for a chimeric molecule and an expression cassette as defined above. before. More preferably, in the genome of the adenoviruses of the invention, the E1 region at least is non-functional.
  • the viral gene considered can be made non-functional by any technique known to those skilled in the art, and in particular by total suppression, substitution (for example by the sequences of the invention), partial deletion, or addition of one or more bases in the gene (s) considered.
  • the adenovirus according to the invention comprises a deletion in the E1 and E4 regions. According to another preferred embodiment, it comprises a deletion in region E1 at the level of which the region E4 and the sequences of the invention are inserted (Cf FR 94 13355).
  • the defective recombinant adenoviruses according to the invention can be prepared by any technique known to those skilled in the art (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). In particular, they can be prepared by homologous recombination between an adenovirus and a plasmid carrying inter alia the DNA sequences of the invention (sequence coding for the chimeric molecule + expression cassette). Homologous recombination occurs after co-transfection of said adenovirus and plasmid in an appropriate cell line.
  • the cell line used must preferably (i) be transformable by said elements, and (ii), contain the sequences capable of complementing the part of the genome of the defective adenovirus, preferably in integrated form to avoid the risks of recombination.
  • a line mention may be made of the human embryonic kidney line 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) which contains in particular, integrated into its genome, the left part of the genome an Ad5 adenovirus (12%) or lines capable of complementing the E1 and E4 functions as described in particular in applications No. WO 94/26914 and WO95 / 02697. Then, the adenoviruses which have multiplied are recovered and purified according to conventional techniques of molecular biology, as illustrated in the examples.
  • AAV adeno-associated viruses
  • the defective recombinant AAVs according to the invention can be prepared by cotransfection, in a cell line infected with a human helper virus (for example an adenovirus), of a plasmid containing the nucleic sequences of the invention (sequence coding for chimeric molecule + expression cassette) bordered by two inverted repeat regions (ITR) of AAV, and of a plasmid carrying the packaging genes (rep and cap genes) of AAV.
  • a human helper virus for example an adenovirus
  • a plasmid containing the nucleic sequences of the invention sequence coding for chimeric molecule + expression cassette bordered by two inverted repeat regions (ITR) of AAV
  • ITR inverted repeat regions
  • rep and cap genes packaging genes
  • retroviruses are integrative viruses, selectively infecting dividing cells. They therefore constitute vectors of interest for cancer applications.
  • the genome of retroviruses essentially comprises two LTRs, an encapsidation sequence and three coding regions (gag, pol and env).
  • the gag, pol and env genes are generally deleted, in whole or in part, and replaced by a heterologous nucleic acid sequence of interest.
  • These vectors can be produced from different types of retroviruses such as in particular MoMuLV ("murine moloney leukemia virus”; also designated MoMLV), MSV ("murine moloney sarcoma virus”), HaSV ("harvey sarcoma virus”) ; SNV ("spleen necrosis virus”); RSV ("rous sarcoma virus”) or the Friend virus.
  • MoMuLV murine moloney leukemia virus
  • MSV murine moloney sarcoma virus
  • HaSV human moloney sarcoma virus
  • SNV spleen necrosis virus
  • RSV rous sarcoma virus
  • Friend virus Friend virus
  • a plasmid comprising in particular the LTRs, the encapsidation sequence and the sequences of the invention (sequence coding for the chimeric molecule + expression cassette) is generally constructed, then used to transfect a cell line known as packaging, capable of providing in trans retroviral functions deficient in the plasmid.
  • packaging lines are therefore capable of expressing the gag, pol and env genes.
  • Such packaging lines have been described in the prior art, and in particular the line PA317 (US4,861,719); the PsiCRIP line (WO90 / 02806) and the GP + envAm-12 line (WO89 / 07150).
  • the recombinant retroviruses may include modifications at the level of the LTRs to suppress transcriptional activity, as well as extended packaging sequences, comprising a part of the gag gene (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639).
  • the recombinant retroviruses produced are then purified by conventional techniques.
  • FIG. 8 An example of construction of a defective recombinant virus according to the invention (retrovirus) is described in FIG. 8.
  • This figure highlights a second advantage of the constructions according to the invention which resides in the absence of expression of the gene of interest in the packaging lines. These lines being devoid of the transactivator or transactivator complex recruited by the system of the invention, the promoter is inactive and the gene is not expressed in the production cell (FIG. 8A). It is only when the virus has effectively infected a target cell, that is to say a cell in which the transactivator or transactivator complex recruited by the system of the invention is present, that the gene is effectively expressed (FIG. 8B). This is particularly advantageous for the construction of viruses containing genes whose expression would be toxic to cells (Grb3-3, IL-2 genes, diphtheria toxin, etc.).
  • a defective recombinant adenovirus or retrovirus indeed have properties which are particularly advantageous for the transfer of genes into tumor cells.
  • non-viral vectors can also be used in the context of the invention.
  • the conditional expression system according to the invention can in fact be incorporated into a non-viral agent capable of promoting the transfer and expression of nucleic acids in eukaryotic cells.
  • Chemical or biochemical vectors represent an interesting alternative to natural viruses, in particular for reasons of convenience, safety and also by the absence of theoretical limit as regards the size of the DNA to be transfected.
  • These synthetic vectors have two main functions, to compact the nucleic acid to be transfected and to promote its cellular fixation as well as its passage through the plasma membrane and, where appropriate, the two nuclear membranes.
  • the non-viral vectors all have polycationic charges.
  • cationic polymers of polylysine type (LKLK) n, (LKKL) n, polyethylene immine and DEAE dextran or else cationic lipids or lipofectants are the most advantageous. They have the property of condensing DNA and promoting its association with the cell membrane. Among the latter, mention may be made of lipopolyamines (lipofectamine, transfectam, etc.) and various cationic or neutral lipids (DOTMA, DOGS, DOPE, etc.).
  • lipopolyamines lipofectamine, transfectam, etc.
  • DOTMA cationic or neutral lipids
  • the present invention also relates to any pharmaceutical composition comprising a vector as defined above.
  • These compositions can be formulated for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, etc. administration.
  • the composition according to the invention contains pharmaceutically acceptable vehicles for an injectable formulation. They may in particular be saline solutions (monosodium phosphate, disodium, sodium chloride, potassium, calcium or magnesium, etc., or mixtures of such salts), sterile, isotonic, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition as appropriate of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
  • retroviruses they may be advantageous to directly use packaging cells or cells infected ex vivo with a view to their reimplantation in vivo, possibly in the form of neo ⁇ organs (WO 94/24298).
  • the vector doses used for the injection can be adapted according to different parameters, and in particular according to the mode of administration used, the pathology concerned or the duration of the treatment sought.
  • the recombinant viruses according to the invention are formulated and administered in the form of doses of between 10 4 and 10 14 pfu / ml.
  • doses of 10 to 10 10 pfu / ml can also be used.
  • pfu plaque forming unit
  • plaque forming unit corresponds to the infectious power of a suspension of virions, and is determined by infection of an appropriate cell culture, and measures, generally after 48 hours, the number of plaques of infected cells. The techniques for determining the pfu titer of a viral solution are well documented in the literature.
  • the expression system according to the invention and the corresponding vectors are particularly useful for controlling the expression of genes of interest in the context of cell or gene therapies. They can thus be used to control the expression of any coding sequence of interest, and in particular of a sequence coding for a therapeutic product, whether it is a peptide, polypeptide, protein, ribonucleic acid, etc.
  • the gene is a DNA sequence (cDNA, gDNA, synthetic, human, animal, plant DNA, etc.) coding for a protein product such as enzymes, blood derivatives, hormones, lymphokines: interleukins, interferons , TNF, etc (FR 9203120), growth factors, neurotransmitters or their precursors or synthetic enzymes, trophic factors: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; apolipoproteins: ApoAl, ApoAIV, ApoE, etc (FR 93 05125), dystrophin or a minidystrophin (FR 9111947), tumor suppressor genes: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745) , genes coding for factors involved in coagulation: Factors VII, VIII, IX, etc., or all or part of a natural or artificial immunoglobulin (Fab, Fab
  • the gene of interest can also be an antisense sequence, the expression of which in the target cell makes it possible to control the expression of genes or the transcription of cellular mRNA.
  • Such sequences can for example be transcribed, in the target cell, into RNAs complementary to cellular mRNAs and thus block their translation into protein, according to the technique described in patent EP 140308.
  • the present invention is particularly suitable for the expression of sequences coding for toxic factors. It can be in particular poisons for cells (diphtheria toxin, pseudomonas toxin, ricin A, etc.) of product inducing sensitivity to an external agent (suicide genes: Thymidine kinase, cytosine deaminase, etc.) or even killer genes capable of inducing cell death (Grb3-3 (PCT / FR94 / 00542), anti-ras ScFv (W094 / 29446), etc.).
  • the system of the invention indeed makes it possible to produce vectors, in particular viral containing these sequences without toxicity for the production cells, then then to induce the expression of these toxic molecules selectively in target cells having the desired transactivator or transactivator complex .
  • This type of construction is therefore particularly suitable for strategies of antitumor therapies for example, in which the objective is to selectively destroy the affected cells.
  • This system is also particularly interesting for the expression of cytokines, interferons, TNF or TGF for example, whose uncontrolled production can have very marked side effects.
  • Figure 1 Representation of the conditional expression system according to the invention allowing the selective recruitment of a transactivator by means of an oligomerization domain (A) or a ScFv (B).
  • Figure 2 Representation of the conditional expression system according to the invention allowing the selective recruitment of a transactivating complex.
  • Figure 3 Representation of an expression cassette according to the invention comprising a regulatory sequence Tetop7, a minimal promoter (TATA box) and a gene (CAT).
  • Figure 4 Representation of an expression cassette according to the invention comprising an OR3 regulatory sequence, a minimal promoter (box
  • TATA TATA
  • CAT a gene
  • Figure 5 Representation of bispecific chimeric molecules according to the invention.
  • Figure 6 Construction of DNA sequences coding for bispecific chimeric molecules according to the invention.
  • Figure 7 Representation of control chimeric constructions.
  • Figure 8 Structure and functioning of a viral vector (retrovirus) according to the invention.
  • Figure 9 Study of the interaction between the hybrid molecules of the invention and a regulatory sequence.
  • Figure 10 Study of the interaction between the hybrid molecules of the invention and different forms of the p53 protein.
  • Figure 11 Demonstration of the activation of the Tet-Luc cassette in SAOS-2 cells.
  • Figure 12 Demonstration of the activation of the Tet-Luc cassette in H358 cells.
  • the enzymes were provided by New-England Biolabs (Beverly, MA).
  • the DNA fragments are separated according to their size on 0.8 to 1.5% agarose gels, purified by GeneClean (BIO101, LaJolla CA) and incubated overnight at 14 ° C in Tris buffer. -HCI pH 7.4 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, in the presence of DNA ligase from phage T4.
  • Amplification by PCR (Polymerase Chain Reaction), was also carried out according to Maniatis ei sJ., 1989, with the following specifications:
  • oligonucleotides are synthesized using the chemistry of phosphoramidites protected in ⁇ by a cyanoethyl group, (Sinha __ al., 1984, Giles 1985), with the automatic DNA synthesizer Applied Biosystem model 394, (Applied Biosystem, Foster City CA) , according to the manufacturer's recommendations.
  • the sequencing was carried out on double-stranded templates by the chain termination method using fluorescent primers.
  • Example 1 Construction of expression cassettes comprising a regulatory sequence, a minimal transcriptional promoter and a gene.
  • the plasmid pTETop7 / CAT contains the following elements (Figure 3):
  • a regulatory sequence consisting of an interaction sequence with the tetracycline tetR repressor composed of 7 repeated Tetop motifs (SEQ ID No. 1);
  • This plasmid was constructed by cloning the Smal-Bglll fragment of the plasmid pUHD10-7 (WO 94/29442) into the plasmid pKK232-8 (Pharmacia) previously digested with Smal and BamHI.
  • the plasmid pOR3 / CAT contains the following elements ( Figure 4): - A regulatory sequence consisting of an OR3 sequence for interaction with the Cro repressor (SEQ ID No. 2);
  • This plasmid was constructed in the following manner: The OR3 sequence for interaction with the Cro repressor was synthesized artificially. For this, the following two oligonucleotides were synthesized: Oligo 5533 (SEQ ID n ° 22): 5'-GATCCTATCACCGCAAGGGATAA-3 'Oligo 5534 (SEQ ID n ° 23): 3'-GATAGTGGCGTTCCCTATTTCGA-5'
  • the toxic gene expression cassettes are obtained from the plasmids described above (1.1. And 1.2.) By replacing the CAT sequence with the sequence coding for the toxic product, preferably the Grb3-3 gene (PCT / FR94 / 00542), the thymidine kinase gene, the gene coding for diphtheria toxin or pseudomonas, etc.
  • the CAT sequence preferably the Grb3-3 gene (PCT / FR94 / 00542), the thymidine kinase gene, the gene coding for diphtheria toxin or pseudomonas, etc.
  • Example 2 Construction of a single chain antibody specific for D53 This single chain antibody was constructed according to the following protocol:
  • the cDNAs coding for the VH and VL regions were obtained from the pAb421 hybridoma producing an anti-p53 antibody. For this, the total RNAs of the hybridoma were extracted and subjected to a reverse transcription reaction using random hexamers as primers. The use of this type of primer makes it possible to avoid the use of specific primers of immunoglobulins.
  • the cDNA clones obtained are of sufficient length to clone the V regions. However, since they represent a small fraction of the total cDNA present, a prior amplification reaction must be carried out to produce sufficient DNA for cloning. For this, the cDNAs encoding the VH and VL regions were amplified separately.
  • the primers used are oligonucleotides hybridizing at the opposite ends of the variable regions of each chain (H and L).
  • the amplification product using the primers specific for heavy chains is a fragment of 340 pairs of bases approx.
  • the amplification product using the primers specific to light chains is a fragment of approximately 325 base pairs.
  • the cDNAs encoding the VH and VL regions of the antibody were assembled into a single chain using a nucleotide arm (L).
  • the nucleotide arm was constructed such that one end binds to the 3 'end of the cDNA encoding the VH region and the other to the 5' end of the cDNA encoding the region VL.
  • the sequence of the arm code for the peptide SEQ ID No. 5.
  • the assembled sequence of approximately 700 bp contains, in the form of an Ncol-NotI fragment, the VH-L-VL sequence whose sequence is represented SEQ ID No. 4 (amino acids 9 to 241). This sequence also includes in C-terminal the tag sequence of myc (residues 256 to 266).
  • Example 3 Construction of nucleic acid sequences encoding bispecific chimeric molecules containing a binding domain to a transactivator consisting of a single chain antibody (ScFv).
  • the Ncol-NotI fragment containing the cDNA coding for the anti-p53 ScFv was first of all cloned into a plasmid of the pUC19 type.
  • the sequence coding for the VSV (SEQ ID No. 7) or myc (SEQ ID No. 8) epitope is inserted downstream of the fragment (FIG. 6).
  • TetR The sequence coding for TetR was obtained by amplification from a template plasmid carrying the tetR sequence using the following oligonucleotides:
  • Oligo 5474 (SEQ ID # 10):
  • oligonucleotides also provide the sequence coding for the Hinge peptide arm connecting the two functional domains of the molecules.
  • the amplified fragment therefore contains the sequence coding for the peptide arm and for the tetR DNA binding domain.
  • This fragment was cloned at the Xbal-EcoRI sites of the plasmid obtained above to generate a plasmid containing the sequence coding for the molecule ScFv-myc-Hinge-TetR
  • oligonucleotides also provide the sequence coding for the Hinge peptide arm connecting the two functional domains of the molecules.
  • the amplified fragment therefore contains the sequence coding for the peptide arm and for the DNA binding domain Cro.
  • This fragment was cloned at the Xbal-EcoRI sites of the plasmid obtained above to generate a plasmid containing the sequence coding for the molecule ScFv-myc-Hinge-Cro
  • plasmids were obtained from the plasmids described in 3.1. above by digestion with the enzymes Notl and Xbal. This digestion makes it possible to excise the fragment carrying the region coding for the tag myc.
  • This example describes the construction of plasmids carrying a sequence coding for a bispecific chimeric molecule according to the invention devoid of arms and of tag sequence.
  • plasmids were obtained from the plasmids described in 3.1. above by digestion with the enzymes Notl and BamHI. This digestion makes it possible to excise the fragment carrying the region coding for the myc tag and for the Hinge peptide arm.
  • Example 4 Construction of nucleic acid sequences encoding bispecific chimeric molecules containing a binding domain to a transactivator consisting of an oligomerization domain.
  • the cDNA encoding the oligomerization region of the p53 protein was obtained by PCR amplification on a plasmid carrying the cDNA of human wild p53 using the following oligonucleotides: Oligo 5535 ( SEQ ID # 14):
  • CAGGCCATGGCATGAAGAAACCACTGGATGGAGAA (the underlined part represents an Ncol site)
  • Oligo 5536 (SEQ ID n ° 15): CGTCGGATCCTCTAGATGCGGCCGCGTCTGAGTCAGGCCCTTC (Underlined part: BamHI site; Double-underlined: Xbal site: Bold: Notl site).
  • the plasmids p53 320/393-myc-Hinge-TetR or Cro were obtained by cloning of the amplified fragment above in the form of an Ncol-NotI fragment in the corresponding sites of the plasmids described in Example 3.1 ., replacing the region coding for ScFv.
  • Plasmids p53 320/393-Hinge-TetR or Cro were obtained by cloning the amplified fragment in 4.1. in the form of an Ncol-Xbal fragment in the corresponding sites of the plasmids described in Example 3.1., in substitution for the region coding for ScFv and the tag.
  • Plasmids p53 320/393-TetR or Cro were obtained by cloning the amplified fragment in 4.1. in the form of an Ncol-BamHI fragment in the corresponding sites of the plasmids described in Example 3.1. , replacing the region coding for ScFv, the tag and the Hinge.
  • the plasmids tetR or Cro-p53 320/393 ( Figure 5D) or tetR or Cro-Hinge-p53 320/393 ( Figure 5E) were obtained by cloning of fragments amplified by PCR on a plasmid carrying the cDNA of wild human p53 using oligos 5537/5539 or 5538/5539 digested with Xhol / EcoRI in the plasmids described in 3.1. , previously digested with Xhol / EcoRI.
  • Example 5 Construction of a control plasmid carrying a sequence coding for a chimeric molecule comprising a DNA binding domain (TetR or Cro) and the transactivating domain of the P53 protein (region 1-73).
  • Plasmids p53 1/73 - TetR or Cro with or without tag (myc or VSV) and Hinge were obtained by cloning of fragments amplified by PCR from a plasmid carrying the cDNA of human wild-type p53 using oligos 5661/5662 then digested with Ncol / NotI, Ncol / Xbal, Ncol / BamHI in the plasmids described in 3.1. , previously digested with Ncol / Notl, Ncol / Xbal or Ncol / BamHI.
  • Oligo 5661 SEQ ID n ° 19
  • the plasmids used for the expression of hybrid molecules were obtained by cloning of the fragments containing the cDNA coding for these molecules at the Ncol / EcoRI sites of the eukaryotic expression vector pcDNA3 (Invitrogen).
  • the different constructions thus carried out are as follows:
  • TET03 hybrid protein containing the chain p53 (320/393) -Hinge- TetR described in FIG. 5B according to example 4.4
  • TET04 hybrid protein containing the chain p53 (320/393) -TetR described in FIG. 5C according to example 4.4
  • the different molecules used in this experiment were obtained by in vitro translation into reticulocyte lysate of the molecules described in Example 6 using the TNT Coupled Reticulocyte lysate Systems kit (Promega) according to the experimental protocol described by the supplier for a reaction volume. total of 50 ⁇ l.
  • the specific double-stranded DNA sequence used in this experiment consists of two synthetic oligonucleotides, the sequence of which is as follows:
  • Oligo 5997 (SEQ ID # 24): GATCCGACTTTCACTTTTCTCTATCACTGATAGTGAGTGGTAAACTCA
  • Oligo 5998 (SEQ ID # 25): AGCTTGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCG
  • the DNA binding reaction is carried out in 50 ⁇ l of reaction medium (Tris-HCI pH 7.4 10 mM, MgCI 2 10 mM, KCI 10 mM, ⁇ -mercaptoethanol 6 mM, EDTA 0.1 mM, BSA 0.5 mg / ml) by adding the TetO sequence (10 10 M) prepared according to Example 7.2, 10 ⁇ l of the translation product prepared according to Example 7.1 and 10 ⁇ M of the cold competing oligonucleotide AP2 (Promega) used to remove the non-specific fixation. The specificity of the interaction is verified by shifting the equilibrium by adding 10 ⁇ M tetracycline (Sigma) to the reaction medium.
  • reaction medium Tris-HCI pH 7.4 10 mM, MgCI 2 10 mM, KCI 10 mM, ⁇ -mercaptoethanol 6 mM, EDTA 0.1 mM, BSA 0.5 mg / ml
  • TetO sequence 10 10 M
  • reaction mixtures are incubated for 15 min at 20 ° C. and then added with 10 ⁇ l of 50% glycerol, and the final mixtures are subjected to native electrophoresis on 5% polyacrylamide gel with migration at 200V and 16 ° C. The gel is then dried and autoradiographed.
  • the result of this experiment carried out with the hybrid molecules TET19, TET02 and TET07 is presented in FIG. 9. Under these conditions. The binding of these three molecules to the specific double-stranded DNA sequence TetO is observed by a migration delay of this one, and the specificity of this interaction is demonstrated by the inhibition of this delay by the addition of tetracycline.
  • Example 8 Specific binding of the hybrid molecules of the invention to a molecule having a transcriptional transactivating domain.
  • the hybrid molecules of the invention ScFv 421, TET19 and TET02 according to Example 6 were produced by in vitro translation using the experimental protocol according to Example 7.1 in the presence of 44 ⁇ Ci of ⁇ S-methionine (Amersham ) (1175 Ci / mmol) to generate these radioactive labeled hybrid molecules.
  • the cDNAs of the molecules with or without a transcriptional transactivating domain were cloned into the vector pBlueBaclll (Invitrogen) at the BamHI site. From these vectors, recombinant baculoviruses were produced and purified according to the manufacturer's instructions. The molecules are produced by infection with the recombinant baculovirus of insect cells sf9 according to the manufacturer's experimental protocol. Protein extracts at the final protein concentration of 10 mg / ml are prepared according to the protocol described by K. Ory et al. (K. Ory, EMBO J., 13, 3496-3504, 1994). These molecules are as follows:
  • - p53 (1/320): wild p53 protein limited to its amino acid sequence 1 to 320 and therefore devoid of its oligomerization domain and of the domain recognized by the monoclonal antibody pAb421. 8.2. Binding of the hybrid molecules of the invention to molecules with or without a transcriptional transactivating domain
  • the hybrid molecule presenting the ScFv 421 (TET19) recognizes well the molecule p53 (1/393) in an equivalent manner to the ScFv 421 alone, and the hybrid molecule presenting the domain 320/393 (TET02) the same properties but with a much greater p53 retention capacity (1/393).
  • the absence of signal observed during incubation with the p53 molecule (1/320) shows that these interactions are very specific and mediated by the C-terminal end of the p53 protein (amino acids 320 to 393) as expected.
  • the functional recruitment of a transcriptional transactivating domain by the hybrid molecules of the invention was evaluated in an in vivo transactivation system in SAOS-2 cells (human osteosarcoma) deficient for the two alleles of the p53 protein, in the line. H358 tumor deficiency for the two alleles of the p53 protein (Maxwell & Roth, Oncogene 8, 3421, 1993) and in the HT29 tumor line deficient for one of the two alleles of the p53 protein and having a mutated allele (mutation H273).
  • This system is based on the use of a reporter gene which can be assayed enzymatically and placed under the dependence of a promoter containing the nucleotide patterns of specific recognition by the Tet repressor. (Operator Tet).
  • the reporter gene LUC (luciferase) placed under the control of the operator Tet is contained in the plasmid pUHC13-3 (Gossen M. & Bujard H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5547- 5551, 1992).
  • the molecules having a transcriptional transactivating domain used in this experiment are the wild-type p53 protein (wt) and the mutants G281 and H 175 of this protein.
  • the cDNA coding for these three proteins were inserted at the BamHI site of the vector pcDNA3 (Invitrogen).
  • the hybrid molecules of the invention are expressed in cells in culture by transient transfection using the following protocol:
  • the cells (3.5 ⁇ 10 5 ) are seeded in 6-well plates containing 2 ml of culture medium, and cultured overnight in a CO 2 (5%) incubator at 37 ° C.
  • the different constructions are then transfected using lipofectAMINE (Gibco BRL) as transfection agent in the following manner: 1.5 ⁇ g of total plasmid are incubated (including 0.25 ⁇ g of the reporter plasmid) with 5 ⁇ l of lipofectAMINE for 30 min with 2 ml of culture medium without serum (transfection mixture). Meanwhile, the cells are rinsed twice with PBS and then incubated for 4 h at 37 ° C. with the transfection mixture, after which the latter is aspirated and replaced with 2 ml of culture medium added with 10% fetal calf serum. heat inactivated and cells returned to grow for 48 h at 37 ° C.
  • the activation of the transcription linked to the functional recruitment of the transcriptional transactivator is detected and quantified by measuring the luciferase activity encoded by the LUC gene using the Luciferase Assay System kit (Promega) according to the manufacturer's experimental protocol. 9.5. Functional recruitment of a transcriptional transactivator domain by the molecules of the invention
  • the TET02 molecule as well as the TET07 positive control were expressed in HT29 cells which have an endogenous mutant p53 protein (H273), the negative control of this experiment consisting in transfecting the empty pcDNA3 vector.
  • H273 endogenous mutant p53 protein
  • NAME RHONE POULENC RORER S.A.

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Abstract

La présente invention concerne un nouveau système conditionnel pour l'expression de gènes. Le système de l'invention est basé notamment sur la création et l'expression de molécules chimériques bispécifiques comprenant un domaine capable de lier sélectivement une séquence définie d'ADN et un domaine détecteur capable de lier spécifiquement un transactivateur ou transrépresseur ou un complexe transactivateur ou transrépresseur.

Description

SYSTEME D'EXPRESSION CONDITIONNEL
La présente invention concerne un nouveau système pour l'expression conditionnelle de gènes. Elle concerne également l'utilisation de ce système en thérapie génique ou cellulaire, pour cibler de manière très sélective l'expression de gènes d'intérêt.
Les thérapies génique et cellulaire consistent à corriger une déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante, etc) ou à assurer l'expression d'une protéine d'intérêt thérapeutique par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information génétique peut être introduite soit ex vivo dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme (thérapie cellulaire), soit directement in vivo dans le tissu approprié (thérapie génique). Différentes techniques existent pour effectuer le transfert de gènes, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des vecteurs chimiques ou biochimiques, naturels ou synthétiques tels que des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), lipides cationiques, etc. Une autre technique repose sur l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-associés et les adénovirus. L'une des difficultés majeures pour le développement de ces thérapies génique et cellulaire réside cependant dans la sélectivité du traitement. Selon les applications, selon le gène à transférer, il est important de pouvoir cibler certains tissus ou certaines parties seulement de l'organisme afin de concentrer l'effet thérapeutique et de limiter la dissémination et les effets secondaires. Ce ciblage peut être réalisé en utilisant des vecteurs présentant une spécificité cellulaire donnée. Une autre approche consiste à utiliser des signaux d'expression spécifiques de certain types cellulaires. A cet égard, des promoteurs dits spécifiques ont été décrits dans la littérature, tels que le promoteur des gènes codant pour la pyruvate kinase, la villine, la GFAP, le promoteur de la protéine intestinale de liaison des acides gras, le promoteur de l'actine α des cellules du muscle lisse, ou le promoteur des gènes de l'apo-AI, l'apo-AII, l'albumine humaine, etc. Cependant, ces promoteurs présentent certains inconvénients et en particulier ils présentent un certain bruit de fond transcriptionnel qui peut être gênant pour l'expression de gènes toxiques et ils sont limités à certaines cellules et ne peuvent donc être utilisés pour toute application.
La présente invention décrit maintenant un nouveau système d'expression conditionnel de gènes, particulièrement sélectif et efficace. Une des caractéristiques avantageuses du système de l'invention réside dans sa capacité à exprimer un gène non pas en fonction d'un type cellulaire, mais en fonction de la présence d'un élément cellulaire particulier ou d'une situation physiologique particulière. Ce système fait en effet appel à des molécules chimériques bispécifiques comprenant un domaine capable de lier sélectivement une séquence définie d'ADN et un domaine détecteur capable de lier spécifiquement un transactivateur ou un complexe transactivateur.
Un premier aspect de la présente invention réside plus particulièrement dans la création et l'expression de molécules chimériques bispécifiques comprenant un domaine capable de lier sélectivement une séquence définie d'ADN et un domaine capable de lier spécifiquement un transactivateur ou transrépresseur ou un complexe transactivateur ou transrépresseur.
Un autre aspect de la présente invention réside dans une séquence d'acide nucléique codant pour une molécule chimérique telle que définie ci- avant, ainsi que tout un vecteur d'expression comprenant ladite séquence nucléique.
Un autre aspect de l'invention consiste en un système conditionnel d'expression de gènes comprenant (i) une molécule chimérique telle que définie ci-avant et (ii) une cassette d'expression comportant une séquence de régulation, un promoteur minimal (dont l'activité dépend de la présence d'un transactivateur) et ledit gène.
Un autre aspect de l'invention réside également dans un vecteur d'expression comprenant - une séquence nucléique codant pour une molécule chimérique telle que définie ci-avant et
- ladite cassette d'expression.
Le système d'expression conditionnel de l'invention est particulièrement approprié pour une utilisation en thérapie génique ou cellulaire, pour cibler de manière très sélective l'expression de gènes d'intérêt.
L'une des composantes du système de l'invention consiste donc en des molécules chimériques bispécifiques particulières comprenant un domaine capable de lier sélectivement une séquence définie d'ADN et un domaine capable de lier spécifiquement un transactivateur ou un complexe transactivateur. La bispécificité des molécules de l'invention réside d'une part dans leur capacité à lier une séquence d'ADN définie (généralement désignée séquence régulatrice ou opérateur) et d'autre part dans leur capacité à recruter spécifiquement un domaine protéique transactivateur ou transrépresseur permettant d'induire ou de réprimer l'expression de gènes.
L'invention porte particulièrement sur la mise au point de molécules chimériques bispécifiques permettant le recrutement de tout facteur transcriptionnel dont l'activation ou l'inactivation conduit à une situation physiopathologique. Les molécules chimériques bispécifiques selon l'invention permettent ainsi le recrutement sélectif de transactivateurs transcriptionnels spécifiques d'un état physiopathologique, la fixation de ces facteur transcriptionnels à des promoteurs par l'intermédiaire d'une fixation de ces molécules à des séquences d'ADN définies localisées près de ces promoteurs (séquences régulatrices ou opérateur), et ainsi l'expression conditionnelle de gènes (Figure 1).
L'invention porte également sur la mise au point de molécules chimériques bispécifiques permettant le recrutement non pas d'une molécule portant un domaine transactivateur mais d'un complexe transactivateur transcriptionnel, c'est à dire d'un complexe formé entre une molécule cible présente dans une cellule et une molécule portant un domaine transactivateur (Figure 2). Dans ce cas, le complexe transactivateur est préférentiellement formé au moyen d'une deuxième molécule chimérique bispécifique comprenant un domaine transactivateur et un domaine de liaison sélectif à ladite molécule cellulaire. La fixation de cette deuxième molécule permet la formation d'un complexe binaire transactivateur transcriptionnel, lequel complexe étant alors recruté par le système détecteur de l'invention. La fixation de ce complexe ternaire à proximité de promoteurs permet ainsi l'expression régulée de gènes. Ce type de construction permet avantageusement d'élargir les conditions d'utilisation du système de l'invention à la détection de toute molécule intracellulaire dépourvue de domaine transactivateur, qu'il s'agisse d'une molécule endogène ou d'une molécule d'origine infectieuse par exemple.
Le système de l'invention permet ainsi, grâce à un système de détection très sélectif ("sensor") d'activer l'expression de gènes d'intérêt uniquement en présence de protéines cibles. Il peut s'agir de facteurs transcriptionnels apparaissant lors de situations physiologiques ou physiopathologiques, ou de toute molécule endogène ou d'origine infectieuse par exemple. Le système de l'invention contient en effet un élément détecteur très sensible et très sélectif permettant de conditionner l'expression d'un gène à la présence, l'apparition ou la disparition de toute molécule dans une cellule. Dans le cadre de la présente invention, le terme transactivateur désigne tout facteur transactivateur de la transcription ou toute protéine comportant un domaine transactivateur transcriptionnel. Le complexe transactivateur désigne le complexe formé entre une molécule présente dans une cellule et une molécule bispécifique de l'invention comprenant un domaine transactivateur et un domaine de liaison spécifique à ladite molécule. Le système d'expression de l'invention peut être utilisé pour recruter toute protéine transactivatrice ou portant un domaine transactivateur, et en particulier toute protéine d'origine virale, parasitaire, mycobactérienne ou cellulaire possédant une activité transactivateur transcriptionnel. Parmi les facteurs transcriptionnels d'origine virale on peut citer notamment la protéine Tat du virus VIH, les protéines E6/E7 du virus du papillome ou encore la protéine EBNA du virus d'Epstein Barr. Ces protéines possèdent un domaine transactivateur transcriptionnel et sont présentes uniquement dans les cellules infectées par ces virus, c'est-à-dire dans des conditions physiopathologiques particulières. Le système d'expression conditionnel selon l'invention permet avantageusement une détection de cette situation physiologique (l'apparition de ces transactivateurs spécifiques de l'infection virale) et l'induction d'une expression sélective de gène(s) donné(s). Parmi les protéines cellulaires, on peut citer préférentiellement la protéine p53 mutée ou sauvage. La protéine p53 est constituée de 393 acides aminés. Sous sa forme sauvage, elle est un suppresseur de tumeur capable de réguler négativement la croissance et la division cellulaire. Cette activité est liée à la présence d'un domaine transactivateur transcriptionnel dans la structure de la protéine p53, localisé dans la région N-terminale de la protéine (résidus 1-100 environ). Dans certaines situations, p53 sauvage est également capable d'induire l'apoptose (Yonish-Rouach et al., Nature, 352, 345-347, 1991). Ces propriétés se manifestant en situation de stress où l'intégrité de l'ADN cellulaire est menacée, p53 a été suggérée être un "gardien du génome". La présence de p53 mutées dans environ 40 % des tumeurs humaines, tous types confondus, renforce cette hypothèse et souligne le rôle probablement crucial que jouent les mutations de ce gène dans le développement tumoral (pour revues, voir Montenarh, Oncogene, 7, 1673-1680, 1992 ; Oren, FASEB J., 6, 3169-3176, 1992 ; Zambetti and Levine, FASEB J., 7, 855-865, 1993). Dans le cadre de la présente invention, il est possible de recruter sélectivement le domaine transactivateur de la protéine p53 et ainsi d'induire l'expression contrôlée de gène(s) uniquement dans les cellules contenant cette protéine. Il est particulièrement intéressant selon l'invention de recruter spécifiquement les formes mutées de la protéine p53 qui, comme indiqué ci-avant, apparaissent dans des situations physiopathologiques d'hyperprolifération cellulaire (type cancer). Ce ciblage peut être réalisé préférentiellement au moyen d'un domaine de liaison spécifique aux formes mutées de la protéine p53. Il existe toutefois une spécificité de fait liée à l'accumulation des formes mutées qui possèdent une demi-vie très supérieure â la forme sauvage. Le système de l'invention peut également être utilisé pour induire l'expression sélective de gène(s) par détection de toute molécule cible présente dans une cellule. La protéine détectée est préférentiellement une protéine apparaissant dans une cellule dans des situations anormales (infection, hyperprolifération, etc). Il peut s'agir en particulier de protéines virales telles que des protéines de structure ou de fonction d'un virus, et notamment du virus VIH, hépatite, herpès, etc. Il peut s'agir également de protéines spécifiques d'un état d'hyperprolifération cellulaire telles que notamment les protéines myc, fos, jun, les cyclines, etc.
L'une des propriétés des molécules chimériques de l'invention réside donc dans leur capacité à se lier à des régions spécifiques d'ADN (régions régulatrices ou opérateur). Cette liaison permet d'apporter le domaine transactivateur à proximité du promoteur et de ce fait d'activer l'expression d'un gène placé sous contrôle dudit promoteur.
Le domaine capable de lier sélectivement une séquence définie d'ADN présent dans les molécules de l'invention est essentiellement d'origine protéique. Plus préférentiellement, ce domaine dérive d'une protéine procaryote ou eucaryote capable d'interagir avec des séquences d'ADN. De nombreuses études génétiques et structurales ont aujourd'hui permis de définir précisément, au sein de protéines interagissant avec des séquences d'ADN double brin, les domaines responsables de ces interactions.
Parmi les protéines procaryotes interagissant avec des séquences d'ADN double brin, on peut citer notamment des represseurs bactériens et, préférentiellement, le répresseur tetracycline d'E. Coli et le répresseur Cro du bactériophage Lambda. Le répresseur tetracycline (tetR) de E.coli est une protéine de 210 acides aminés environ. Chez E.coli, tetR contrôle négativement la transcription de gènes médiant la résistance à cet antibiotique au sein de l'opéron tet. En absence de tetracycline, le répresseur tetR se fixe à l'ADN au niveau d'une séquence spécifique (désignée séquence opérateur ou Tetop) et réprime la transcription du gène de résistance. Au contraire, en présence de tetracycline, le répresseur tetR ne se fixe plus à l'opérateur tetop permettant une transcription constitutive du gène (Hillen.W and Wissmann.A. (1989) in Protein-Nucleic Acid Interaction. Topics in Molecular and Structural Biology.eds, Saenger.W. and Heinemann.U. (Macmillan, London), Vol.10. pp. 143-162). La séquence de tetR a été publiée (elle est reproduite notamment dans WO94/04682). La séquence d'ADN double brin spécifique de liaison de tetR à l'ADN (Tetop) est composée du motif suivant : TCTCTATCACTGATAGGGA (SEQ ID n° 1). Ce motif peut être répété plusieurs fois pour augmenter l'affinité et l'efficacité du système. Ainsi, La séquence régulatrice peut comprendre jusqu'à 10 motifs et, de préférence, contient 2 motifs (Tetop2) ou 7 motifs (Tetop7) (voir Figure 3).
La protéine Cro a été définie à l'origine comme un régulateur de l'expression du répresseur Cl (Eisen.H. et coll. (1970) PNAS 66, pp855). Le clonage du gène cro a permis l'identification d'une protéine de 66 acides aminés (SEQ ID n° 21 ; Roberts;T et coll. (1977) Nature 270, pp274). Cro exerce son rôle physiologique en se fixant préférentiellement à l'opérateur OR3 de Lambda.
La séquence d'ADN double brin spécifique de liaison de Cro à l'ADN (région désignée OR3) est composée des bases suivantes :
TATCACCGCAAGGGATA (SEQ ID n° 2) Cette région peut également être répétée plusieurs fois pour augmenter l'affinité et l'efficacité du système (voir Figure 4).
Parmi les protéines eucaryotes interagissant avec des séquences d'ADN double brin, on préfère utiliser pour la construction des molécules de l'invention les protéines ou domaines dérivés des protéines STAT, p53 ou NFkB (Inoue et al., PNAS 89 (1992) 4333). Concernant la protéine p53, son domaine de liaison à l'ADN est localisé dans la région centrale de la protéine et, plus précisément, dans la région comprise entre les acides aminés 102 à 292 (Pavletich et al., Gènes & Dev. 7 (1993) 2556).
Comme indiqué ci-avant, le domaine capable de lier sélectivement une séquence définie d'ADN présent dans les molécules de l'invention est préférentiellement dérivé d'une protéine procaryote ou eucaryote capable d'interagir avec une région d'ADN double-brin. Le domaine utilisé pour la construction des molécules de l'invention peut être constitué de l'ensemble de la protéine ou d'un fragment de celle-ci comportant la région d'interaction avec l'ADN. Ce domaine a été identifié pour différentes protéines et notamment TetR (voir par exemple Berens et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 1945). Il peut également être constitué d'un dérivé de cette protéine ou du fragment ayant conservé les propriétés de laison à l'ADN. De tels dérivés sont notamment des protéines présentant des modifications d'un ou plusieurs acides aminés, par exemple pour permettre leur fusion avec les autres domaines des molécules de l'invention, préparées selon les techniques classiques de la biologie moléculaire. Des dérivés des protéines TetR et Cro par exemple ont été décrits dans la littérature, possédant des mutations ponctuelles et/ou des délétions (Hecht et al., J. Bact. 175 (1993) p. 1206; Altschmied et al., EMBO J 7 (1988) 4011 ; Baumeister et al., Proteins 14 (1992) 168; Hansen et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 14030). La capacité de liaison de ces dérivés à une séquence définie d'ADN peut ensuite être testée par incubation du dérivé préparé avec la séquence régulatrice et détection des complexes formés. En outre, les dérivés peuvent également être -des protéines ayant des propriétés améliorées de liaison à l'ADN (spécificité, affinité, etc).
Selon un mode préféré de mise en oeuvre, le domaine capable de lier sélectivement une séquence définie d'ADN présent dans les molécules de l'invention est dérivé d'une protéine procaryote. Ce type de construction est particulièrement avantageux puisque ces protéines, d'origine non-humaine, reconnaissent des sites d'ADN double brin d'au moins 14 nucléotides. La probabilité de trouver la même séquence au sein du génome humain est quasi nulle et donc le système d'expression obtenu est d'autant plus sélectif.
Dans un mode de réalisation préféré, le domaine capable de lier sélectivement une séquence définie d'ADN présent dans les molécules de l'invention est dérivé des protéines tetR ou Cro. Il est tout particulièrement avantageux d'utiliser les protéines tetR ou Cro (SEQ ID n° 21) complètes.
Le domaine capable de lier spécifiquement le transactivateur transcriptionnel ou le complexe transactivateur transcriptionnel présent dans les molécules de l'invention peut être de différents types. Il peut s'agir en particulier d'un domaine d'oligomérisation dans le cas où le transactivateur ou le complexe transactivateur ciblé comporte également un tel domaine. Il peut également s'agir de tout domaine synthétique ou naturel connu pour interagir avec ledit transactivateur ou complexe transactivateur. Il peut encore s'agir d'un anticorps ou d'un fragment ou dérivé d'un anticorps dirigé contre le transactivateur ou complexe transactivateur.
Parmi les domaines d'oligomérisation utilisables dans le cadre de l'invention on peut citer plus particulièrement les leucine-zipper, les domaines SH2 ou les domaines SH3 par exemple. Les leucine-zipper sont des hélices α amphipatiques qui contiennent 4 ou 5 leucines tous les 7 acides aminés. Cette périodicité permet la localisation des leucines à peu près à la même position sur l'hélice α. La dimérisation est sous tendue par des interactions hydrophobes entre les chaines latérales des leucines de deux domaines zipper contigus (Vogt et al., Trends In Bioch. Science 14 (1989) 172). Les domaines SH2 sont connus pour interagir avec des séquences peptidiques spécifiques phosphorylées en tyrosine. Les domaines SH3 peuvent être utilisés pour former un oligomère avec tout transactivateur ou complexe transactivateur comportant le peptide riche en proline correspondant (Pawson et al., Current Biology 3 (1993) 434). On peut également utiliser des régions de protéines connues pour induire une oligomérisation, telles que notamment la région C-terminale de la protéine p53. L'utilisation de cette région permet de recruter de manière sélective les protéines p53 présentes dans une cellule. On utilise préférentiellement dans le cadre de l'invention une région de p53 comprise entre les acides aminés 320-393 (SEQ ID n° 3), 302-360 ou 302-390.
Parmi les domaines synthétiques ou naturels connus pour interagir avec la molécule comportant l'élément transactivateur ciblé, on peut citer par exemple la région de la protéine MDM2 interagissant avec la protéine p53. Ce type de construction permet ainsi de recruter comme transactivateur la protéine p53 sauvage ou mutée. Un domaine de liaison spécifique au transactivateur transcriptionnel préféré de l'invention est constitué par un anticorps ou un fragment ou dérivé d'anticorps. Les fragments ou dérivés d'anticorps sont par exemple les fragments Fab ou F(ab)'2, les régions VH ou VL d'un anticorps ou encore des anticorps simple chaine (ScFv) comprenant une région VH liée à une région VL par un bras. Ce type de domaine est particulièrement avantageux puisqu'il peut être dirigé contre toute molécule.
Les anticorps, molécules de la superfamille des immunoglobulines, sont constitués de différentes chaines (2 lourdes (H) et 2 légères (L)) elles mêmes composées de différents domaines (domaine variable (V) domaine de jonction (J), etc). Le domaine de liaison au transactivateur ou complexe transactivateur présent dans les molécules de l'invention est avantageusement constitué d'un fragment ou dérivé d'anticorps comprenant au moins le site de liaison de l'antigène. Ce fragment peut être soit le domaine variable d'un chaine légère (V|_) ou lourde (VH), éventuellement sous forme de fragment Fab ou F(ab')2 ou, préférentiellement, sous forme d'anticorps simple chaine (ScFv). Les anticorps simple chaine utilisés pour la construction des molécules de l'invention sont constitués d'un peptide correspondant au site de liaison de la région variable de la chaine légère d'un anticorps relié par un bras peptidique à un peptide correspondant au site de liaison de la région variable de la chaine lourde d'un anticorps. La construction de séquences d'acides nucléiques codant pour de tels anticorps modifiés selon l'invention a été décrite par exemple dans le brevet US4.946.778 ou dans les demandes WO94/02610, W094/29446. Elle est illustrée dans les exemples.
Une construction préférée selon la présente invention comprend un domaine de liaison à une protéine p53. Il s'agit plus préférentiellement d'un dérivé d'anticorps dirigé contre une protéine p53. Un mode de réalisation particulier est constitué par un anticorps simple chaine dirigé contre p53. A titre d'exemple particulier, on utilise le ScFv de séquence SEQ ID n° 4 dont la construction est décrite dans les exemples.
Le domaine de liaison à l'ADN et le domaine de liaison au transactivateur sont généralement reliés entre eux par l'intermédiaire d'un bras. Ce bras est généralement constitué d'un peptide conférant une flexibilité suffisante pour que les deux domaines des molécules de l'invention puissent être fonctionnels de manière autonome. Ce peptide est généralement composé d'acides aminés non chargés, n'interférant pas avec l'activité des molécules de l'invention, tels que par exemple la glycine, la serine, le tryptophane, la lysine ou la proline. Le bras comprend généralement de 5 à 30 acides aminés et, de préférence, de 5 à 20 acides aminés. Des exemples de bras peptidiques utilisables pour la construction des molécules de l'invention sont par exemple :
- GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID n° 5) - PKPSTPPGSS (SEQ ID n° 6) dont la séquence codante est
CCCAAGCCCAGTACCCCCCCAGGTTCTTCA (SEQ ID n° 6).
Des exemples préférés de molécule selon l'invention sont notamment les molécules suivantes : a) ScFv-tag-Hinge-TET ou Cro (Figure 5A) Ce type de molécule comporte :
- un domaine de liaison à un transactivateur constitué d'un anticorps simple chaine,
- une séquence peptidique tag reconnue par un anticorps monoclonal permettant la détection immunologique de la molécule. Cette séquence peut être par exemple l'épitope VSV de séquence MNRLGK (SEQ ID n° 7) dont la séquence codante est ATGAACCGGCTGGGCAAG (SEQ ID n° 7), ou l'épitope myc de séquence EQKLISEEDLN (SEQ ID n° 8) dont la séquence codante est GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAAT (SEQ ID n° 8), reconnu par l'anticorps 9E10. - un bras peptidique de séquence SEQ ID n° 6 (Hinge) et
- un domaine de liaison à l'ADN constitué de la protéine TET ou Cro. Préférentiellement, le ScFv est dirigé contre une protéine p53. b) ScFv-Hinge-TET ou Cro (Figure 5B) Ce type de molécule comporte les mêmes éléments que la molécule a) à l'exception de la séquence tag qui est absente. c) ScFv-TET ou Cro (Figure 5C)
Ce type de molécule comporte simplement un domaine de liaison à un transactivateur constitué d'un anticorps simple chaine et un domaine de liaison à l'ADN constitué de la protéine TET ou Cro. Il ne comporte ni bras, ni séquence tag. Dans cette construction, le domaine de liaison au transactivateur est localisé dans la partie N-terminale de la molécule et le domaine de liaison à l'ADN dans la partie C-terminale. d) TET ou Cro-ScFv (Figure 5D) Ce type de molécule est similaire au type c) ci-dessus. La différence réside essentiellement dans l'agencement des domaines : le domaine de liaison au transactivateur est maintenant localisé dans la partie C-terminale de la molécule et le domaine de liaison à l'ADN dans la partie N-terminale. e) TET ou Cro-Hinge-ScFv (Figure 5E) Ce type de molécule comporte les mêmes éléments que la molécule b) ci-dessus. La différence réside essentiellement dans l'agencement des domaines : le domaine de liaison au transactivateur est maintenant localisé dans la partie C-terminale de la molécule et le domaine de liaison à l'ADN dans la partie N-terminale. f) Oligom-tag-Hinge-TET ou Cro (Figure 5A)
Ce type de molécule est semblable au type a), à l'exception du domaine de liaison au transactivateur qui est remplacé par le domaine d'oligomérisation à la protéine p53 de séquence SEQ ID n° 3. Cette molécule permet de recruter les protéines p53 mutées apparaissant dans les cellules tumorales. g) Oligom-Hinge-TET ou Cro (Figure 5B)
Ce type de molécule est semblable au type b), à l'exception du domaine de liaison au transactivateur qui est remplacé par le domaine d'oligomérisation à la protéine p53 de séquence SEQ ID n° 3. h) Oligom-TET ou Cro (Figure 5C)
Ce type de molécule est semblable au type c), à l'exception du domaine de liaison au transactivateur qui est remplacé par le domaine d'oligomérisation à la protéine p53 de séquence SEQ ID n° 3. i) TET ou Cro-Oligom (Figure 5D) Ce type de molécule est semblable au type d), à l'exception du domaine de liaison au transactivateur qui est remplacé par le domaine d'oligomérisation à la protéine p53 de séquence SEQ ID n° 3. j) TET ou Cro-Hinge-Oligom (Figure 5E)
Ce type de molécule est semblable au type e), à l'exception du domaine de liaison au transactivateur qui est remplacé par le domaine d'oligomérisation à la protéine p53 de séquence SEQ ID n° 3.
Par ailleurs, dans chacune de ces molécules, le bras peptidique peut être aisément remplacé par la séquence (G4S)3 (SEQ ID n° 5).
Un autre objet de la présente invention réside dans une séquence d'acide nucléique codant pour une molécule chimérique telle que définie ci- avant. Il s'agit avantageusement d'une séquence d'ADN, notamment d'ADNc. Il peut également s'agir d'un ARN. Les séquences de l'invention sont généralement construites par assemblage, au sein d'un vecteur de cionage, des séquences codant pour les différents domaines selon les techniques classiques de la biologie moléculaire. Les séquences d'acides nucléiques de l'invention peuvent éventuellement être modifiées par voie chimique, enzymatique ou génétique, en vue de générer des domaines stabilisés, et/ou multifonctionnels, et/ou de taille réduite, et/ou dans le but de favoriser leur localisation dans tel ou tel compartiment intracellulaire. Ainsi, les séquences d'acides nucléiques de l'invention peuvent comprendre des séquences codant pour des peptides de localisation nucléaire (NLS). En particulier, il est possible de fusionner les séquences de l'invention avec la séquence codant pour le NLS du virus SV40, dont la séquence peptidique est la suivante : PKKKRKV (SEQ ID n° 9) (Kalderon et al, Cell 39 (1984) 499).
Les séquences nucléiques selon l'invention font avantageusement partie d'un vecteur d'expression, qui peut être de nature plasmidique ou virale.
Un autre objet de la présente invention réside dans une protéine de fusion comprenant un domaine transactivateur transcriptionnel et un domaine de liaison spécifique à une molécule donnée, éventuellement reliés par un bras peptidique, ainsi que toute séquence d'acide nucléique codant pour une telle fusion. Le domaine transactivateur peut être issu de toute protéine transactivateur transcriptionnel, tel que p53, VP16, EBNA, E6/E7, Tat, etc.
Un autre objet de l'invention consiste en un système conditionnel d'expression de gènes comprenant :
- une molécule chimérique telle que définie ci-avant et
- une cassette d'expression comportant une séquence régulatrice, un promoteur transcriptionnel minimal et ledit gène.
La cassette d'expression contient les éléments nécessaires à l'activation de l'expression du gène par le transactivateur ou complexe transactivateur recruté par la molécule bispécifique. Ainsi, la séquence régulatrice est la séquence de liaison à l'ADN de la molécule chimérique exprimée. Lorsque le domaine de liaison à l'ADN de la molécule chimérique est représenté par tout ou partie de TetR, la séquence régulatrice comprend la séquence SEQ ID n° 1 ou un dérivé de celle-ci, éventuellement répétée plusieurs fois. Il s'agit préférentiellement de la séquence op2 (comprenant 2 motifs Tetop répétés) ou Op7 (comportant 7 motifs Tetop répétés telle que décrite par exemple dans Weinmann et al., The Plant Journal 5 (1994) 559). De même, lorsque le domaine de liaison à l'ADN de la molécule chimérique est représenté par tout ou partie de Cro, la séquence régulatrice comprend la séquence SEQ ID n° 2 ou un dérivé de celle-ci, éventuellement répétée plusieurs fois. Il s'agit préférentiellement de la séquence OR3. Les dérivés des séquences SEQ ID n° 1 et 2 peuvent être toute séquence obtenue par modification de nature génétique (mutation, délétion, addition, répétition, etc) et conservant la capacité de lier spécifiquement une protéine. De tels dérivés ont été décrits dans la littérature (Baumeister et al précitée, Tovar et al., Mol. Gen. Genêt. 215 (1988) 76, WO94/04672).
Concernant le promoteur transcriptionnel minimal, il s'agit d'un promoteur dont l'activité dépend de la présence d'un transactivateur. De ce fait, en l'absence de la molécule chimérique, le promoteur est inactif et le gène n'est pas ou peu exprimé. En revanche, en présence de la molécule chimérique, le transactivateur ou complexe transactivateur recruté permet d'induire l'activité du promoteur minimal et ainsi l'expression du gène d'intérêt. Le promoteur minimal est constitué généralement d'une boite TATA ou INR. Ces éléments sont en effet les éléments minimum nécessaires à l'expression d'un gène en présence d'un transactivateur. Le promoteur minimal peut être préparé à partir de tout promoteur par modification génétique. A titre d'exemple préféré de promoteur candidat on peut citer le promoteur du gène de la thymidine kinase. Des résultats intéressants ont plus précisément été obtenus avec un promoteur minimal dérivant du promoteur TK composé des nucléotides -37 à +19. Le promoteur minimal peut également dériver du CMV humain. En particulier, il peut être constitué du fragment compris entre les nucléotides -53 à +75 ou -31 à +75 du CMV. Tout promoteur conventionnel peut toutefois être utilisé tel que par exemple le promoteur des gènes codant pour la chloramphénicol acétyle transférase, la β-galactosidase ou encore la luciférase. La cassette d'expression est avantageusement constituée des éléments suivants :
- Comme séquence régulatrice, une séquence comprenant la séquence SEQ ID n° 1 ou 2 ou un dérivé de celles-ci, éventuellement répétée plusieurs fois,
- Comme promoteur minimal, un promoteur dérivé du promoteur du gène de la thymidine kinase (TK),
- une séquence codante d'intérêt.
Encore plus préférentiellement, le promoteur minimal est constitué de la région -37 à +19 du promoteur du gène de la thymidine kinase.
Avantageusement, la cassette d'expression est choisie parmi les cassettes de structure Tetop2.TK-Gène; Tetop7.TK-Gène et OR3.TK-Gène.
Un autre aspect de l'invention réside dans un vecteur d'expression comprenant une séquence d'acides nucléique codant pour une molécule chimérique et une cassette d'expression telles que définies ci-avant. Dans les vecteurs de l'invention, la séquence d'acides nucléiques codant pour la molécule chimérique et la cassette d'expression peuvent être insérées dans la même orientation ou dans les orientations opposées. Par ailleurs, le vecteur peut être de nature plasmidique ou virale.
Parmi les vecteurs viraux, on peut citer plus préférentiellement les adénovirus, les rétrovirus, les virus de l'herpès ou encore les virus adéno associés. Les virus selon la présente invention sont défectifs, c'est-à-dire incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs utilisés dans je cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par les séquences de l'invention. Préférentiellement, le virus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales.
S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande W094/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple : Mav1 , Beard et al., Virology 75 (1990) 81 ), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Préférentiellement, le génome des adénovirus recombinants de l'invention comprend au moins les ITR et la région d'encapsidation d'un adénovirus, et la séquence d'acides nucléiques codant pour une molécule chimérique et une cassette d'expression telles que définies ci-avant. Plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, la région E1 au moins est non fonctionnelle. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution (par exemple par les séquences de l'invention), délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (WO 95/02697), E2 (WO 94/28938), E4 (WO 94/28152, WO 94/12649, WO 95/02697) et L5 (WO 95/02697). Selon un mode préféré de mise en oeuvre, l'adénovirus selon l'invention comprend une délétion dans les régions E1 et E4. Selon un autre mode de réalisation préféré, il comprend une délétion dans région E1 au niveau de laquelle sont insérées la région E4 et les séquences de l'invention (Cf FR 94 13355).
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gène 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre les séquences d'ADN de l'invention (séquence codant pour la molécule chimérique + cassette d'expression). La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %) ou des lignées capables de complémenter les fonctions E1 et E4 telles que décrites notamment dans les demandes n° WO 94/26914 et WO95/02697. Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été clone, séquence et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation : la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus.
L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US5.139,941 , EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co- transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant les séquences nucléiques de l'invention (séquence codant pour la molécule chimérique + cassette d'expression) bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature : voir notamment Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, Bemstein et al. Genêt. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc.
En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant sélectivement les cellules en division. Ils constituent donc des vecteurs d'intérêt pour des applications cancer. Le génome des rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.
Pour construire des rétrovirus recombinants selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et les séquences de l'invention (séquence codant pour la molécule chimérique + cassette d'expression) est généralement construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4.861.719); la lignée PsiCRIP (WO90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (WO89/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Un exemple de construction d'un virus recombinant défectif selon l'invention (rétrovirus) est décrit sur la figure 8. Cette figure souligne un deuxième avantage des constructions selon l'invention qui réside dans l'absence d'expression du gène d'intérêt dans les lignées d'encapsidation. Ces lignées étant dépourvues du transactivateur ou complexe transactivateur recruté par le système de l'invention, le promoteur est inactif et le gène n'est pas exprimé dans la cellule de production (figure 8A). Ce n'est que lorsque le virus a effectivement infecté une cellule cible, c'est-à-dire une cellule dans laquelle est présent le transactivateur ou complexe transactivateur recruté par le système de l'invention, que le gène est effectivement exprimé (Figure 8B). Ceci est particulièrement avantageux pour la construction de virus contenant des gènes dont l'expression serait toxique pour les cellules (gènes Grb3-3, IL-2, Toxine diphtérique, etc).
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus ou un rétrovirus recombinant défectif. Ces vecteurs possèdent en effet des propriétés particulièrement intéressantes pour le transfert de gènes dans les cellules tumorales.
Différents types de vecteurs non-viraux peuvent également être utilisés dans le cadre de l'invention. Le système d'expression conditionnel selon l'invention peut en effet être incorporé dans un agent non viral capable de promouvoir le transfert et l'expression d'acides nucléiques dans des cellules eucaryotes. Les vecteurs chimiques ou biochimiques représentent une alternative intéressante aux virus naturels en particulier pour des raisons de commodité, de sécurité et également par l'absence de limite théorique en ce qui concerne la taille de l'ADN à transfecter. Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales, compacter l'acide nucléique à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et, le cas échéant, les deux membranes nucléaires. Pour pallier à la nature polyanionique des acides nucléiques, les vecteurs non viraux possèdent tous des charges polycationiques.
Parmi les vecteurs synthétiques développés, les polymères cationiques de type polylysine, (LKLK)n, (LKKL)n, polyéthylène immine et DEAE dextran ou encore les lipides cationiques ou lipofectants sont les plus avantageux. Ils possèdent la propriété de condenser l'ADN et de promouvoir son association avec la membrane cellulaire. Parmi ces derniers, on peut citer les lipopolyamines (lipofectamine, transfectam, etc) et différents lipides cationiques ou neutres (DOTMA, DOGS, DOPE, etc). Plus récemment, il a été développé le concept de la transfection ciblée, médiée par un récepteur, qui met à profit le principe de condenser l'ADN grâce au polymère cationique tout en dirigeant la fixation du complexe à la membrane grâce à un couplage chimique entre le polymère cationique et le ligand d'un récepteur membranaire, présent à la surface du type cellulaire que l'on veut greffer. Le ciblage du récepteur à la transferrine, à l'insuline ou du récepteur des asialoglycoprotéines des hépatocytes a ainsi été décrit.
La présente invention a également pour objet toute composition pharmaceutique comprenant un vecteur tel que défini ci-avant. Ces compositions peuvent être formulées en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous- cutanée, intraoculaire, etc. Préférentiellement, la composition selon l'invention contient des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. S'agissant des rétrovirus, ils peut être avantageux d'utiliser directement les cellules d'encapsidation ou des cellules infectées ex vivo en vue de leur réimplantation in vivo, éventuellement sous forme de néo¬ organes (WO 94/24298).
Les doses de vecteur utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les virus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml. Pour les AAV et les adénovirus, des doses de 10 à 1010 pfu/ml peuvent également être utilisées. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une suspension de virions, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
Le système d'expression selon l'invention et les vecteurs correspondants sont particulièrement utiles pour contrôler l'expression de gènes d'intérêt dans le cadre de thérapies cellulaire ou génique. Ils peuvent ainsi être utilisés pour contrôler l'expression de toute séquence codante d'intérêt, et notamment d'une séquence codant pour un produit thérapeutique, qu'il s'agisse d'un peptide, polypeptide, protéine, acide ribonucléiques, etc. Plus particulièrement, le gène est une séquence d'ADN (ADNc, ADNg, ADN synthétique, humain.animal, végétal, etc) codant pour un produit protéique tel que des enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; les apolipoprotéines : ApoAl, ApoAIV, ApoE, etc (FR 93 05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 9111947), les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII, IX, etc, ou encore tout ou partie d'une immunoglobuline naturelle ou artificielle (Fab, ScFv, etc), un ARN ligand (W091/19813) etc. Le gène d'intérêt peut également être une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140308.
La présente invention est particulièrement adaptée à l'expression de séquences codant pour des facteurs toxiques. Il peut s'agir en particulier de poisons pour les cellules (toxine diphtérique, toxine pseudomonas, ricine A, etc) de produit induisant une sensibilité à un agent externe (gènes suicides :Thymidine kinase, cytosine désaminase, etc) ou encore de gènes tueurs capables d'induire la mort cellulaire (Grb3-3 (PCT/FR94/00542), ScFv anti-ras (W094/29446), etc). Le système de l'invention permet en effet de produire des vecteurs notamment viraux contenant ces séquences sans toxicité pour les cellules de production, puis ensuite d'induire l'expression de ces molécules toxiques sélectivement dans des cellules cibles présentant le transactivateur ou complexe transactivateur désiré. Ce type de construction est donc particulièrement adapté à des stratégies de thérapies antitumorales par exemple, dans lesquelles l'objectif est de détruire sélectivement les cellules affectées. Ce système est également particulièrement intéressant pour l'expression de cytokines, interférons, TNF ou TGF par exemple, dont une production incontrôlée peut avoir des effets secondaires très marqués.
La présente demande sera décrite plus en détail à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des Figures
Figure 1 : Représentation du système d'expression conditionnel selon l'invention permettant le recrutement sélectif d'un transactivateur au moyen d'un domaine d'oligomérisation (A) ou d'un ScFv (B).
Figure 2: Représentation du système d'expression conditionnel selon l'invention permettant le recrutement sélectif d'un complexe transactivateur.
Figure 3: Représentation d'une cassette d'expression selon l'invention comportant une séquence régulatrice Tetop7, un promoteur minimal (boite TATA) et un gène (CAT).
Figure 4: Représentation d'une cassette d'expression selon l'invention comportant une séquence régulatrice OR3, un promoteur minimal (boite
TATA) et un gène (CAT).
Figure 5: Représentation de molécules chimériques bispécifiques selon l'invention.
Figure 6: Construction de séquences d'ADN codant pour des molécules chimériques bispécifiques selon l'invention.
Figure 7: Représentation de constructions chimériques contrôle.
Figure 8: Structure et fonctionnement d'un vecteur viral (rétrovirus) selon l'invention.
Figure 9: Etude de l'interaction entre les molécules hybrides de l'invention et une séquence régulatrice.
Figure 10: Etude de l'interaction entre les molécules hybrides de l'invention et différentes formes de la protéine p53. Figure 11 : Mise en évidence de l'activation de la cassette Tet-Luc dans les cellules SAOS-2.
Figure 12: Mise en évidence de l'activation de la cassette Tet-Luc dans les cellules H358.
Techniques générales de Biologie Moléculaire
Les méthodes classiques de biologie moléculaires telles que la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium-bromure d'éthidium, les digestions par les enzymes de restriction, l'électrophorèse sur gel, la transformation dans E.coli. la précipitation des acides nucléiques etc, sont décrites dans la littérature (Maniatis ÊÎ al., 1989).
Les enzymes-ont été fournies par New-England Biolabs (Beverly, MA). Pour les ligatures les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille sur des gels d'agarose de 0,8 à 1 ,5 %, purifiés par GeneClean (BIO101 , LaJolla CA) et incubés de nuit à 14°C dans un tampon Tris-HCI pH 7.4 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, en présence d'ADN ligase du phage T4.
L'amplification par PCR, (Polymerase Chain Reaction), a également été réalisée selon Maniatis ei sJ., 1989, avec les spécifications suivantes :
- Concentration en MgCl2 portée à 8mM.
- Température de dénaturation 95°C, température d'hybridation 55°C, température d'allongement 72°C. Ce cycle a été répété 25 fois dans un
PE9600 Thermalcycler (Perkin Elmer, Norwalk CO).
Les oligonucléotides sont synthétisés en utilisant la chimie des phosphoramidites protégés en β par un groupement cyanoéthyl, (Sinha __ al., 1984, Giles 1985), avec le synthétiseur automatique d'ADN Applied Biosystem modèle 394, (Applied Biosystem, Foster City CA), selon les recommandations du fabricant.
Le séquencage a été effectué sur des matrices double-brin par la méthode de terminaison de chaînes en utilisant des amorces fluorescentes. Nous avons utilisé le kit se séquencage Taq Dye Primer Kit de chez Applied Biosystem (Applied Biosystem, Foster City CA) selon les spécifications du fabricant.
Exemples
Exemple 1 : Construction de cassettes d'expression comportant une séquence de régulation, un promoteur transcriptionnel minimal et un gène.
1.1. Construction du plasmide pTETop7/CAT
Le plasmide pTETop7/CAT contient les éléments suivants (Figure 3) :
- Une séquence de régulation constituée d'une séquence d'interaction avec le répresseur tetracycline tetR composée de 7 motifs Tetop (SEQ ID n° 1) répétés ;
- un promoteur minimal dérivé du promoteur du gène de la thymidine kinase (région -37 à + 19 portant la boite TATA) ;
- la séquence codant pour la chloramphénicol acétyl transférase (CAT) sous contrôle dudit promoteur minimal. Ce plasmide a été construit par clonage du fragment Smal-Bglll du plasmide pUHD10-7 (WO 94/29442) dans le plasmide pKK232-8 (Pharmacia) préalablement digéré par Smal et BamHI.
1.2. Construction du plasmide pOR3/CAT
Le plasmide pOR3/CAT contient les éléments suivants (Figure 4) : - Une séquence de régulation constituée d'une séquence OR3 d'interaction avec le répresseur Cro (SEQ ID n° 2) ;
- un promoteur minimal dérivé du promoteur du gène de la thymidine kinase (région -37 à + 19 portant la boite TATA);
- la séquence codant pour la chloramphénicol acétyl transférase (CAT) sous contrôle dudit promoteur minimal.
Ce plasmide a été construit de la manière suivante : La séquence OR3 d'interaction avec le répresseur Cro a été synthétisée artificiellement. Pour cela, les deux oligonucléotides suivants ont été synthétisés : Oligo 5533 (SEQ ID n° 22) : 5'-GATCCTATCACCGCAAGGGATAA-3' Oligo 5534 (SEQ ID n° 23) : 3'-GATAGTGGCGTTCCCTATTTCGA-5'
Ces deux oligonucléotides ont ensuite été hybrides pour reconstituer la séquence double brin OR3 bordée de séquences permettant son clonage orienté comme suit :
GATCCTATCACCGCAAGGGATAA
GATAGTGGCGTTCCCTATTTCGA
1.3. Construction de cassettes d'expression de gènes toxiques
Les cassettes d'expression de gènes toxiques sont obtenues à partie des plasmides décrits ci-dessus (1.1. et 1.2.) par remplacement de la séquence CAT par la séquence codant pour le produit toxique, de préférence le gène Grb3-3 (PCT/FR94/00542), le gène de la thymidine kinase, le gène codant pour la toxine diphtérique ou pseudomonas, etc.
Exemple 2 : Construction d'un anticorps simple chaine spécifique de D53 Cet anticorps simple chaine a été construit selon le protocole suivant :
- Les cDNA codant pour les régions VH et VL ont été obtenus à partir de l'hybridome pAb421 produisant un anticorps anti-p53. Pour cela, les ARN totaux de l'hybridome ont été extraits et soumis à une réaction de transcription inverse en utilisant des hexamères random comme amorces. L'utilisation de ce type d'amorce permet d'éviter l'emploi d'amorces spécifiques des immunoglobulines. Les clones d'ADNc obtenus ont une longueur suffisante pour cloner les régions V. Toutefois, dans la mesure où ils représentent une faible fraction des cDNA totaux présents, une réaction préalable d'amplification doit être réalisée pour produire suffisamment de DNA pour le clonage. Pour cela, les ADNc codant pour les régions VH et VL ont été amplifiés séparément. Les amorces utilisées sont des oligonucléotides hybridant au niveau des extrémités opposées des régions variables de chaque chaine (H et L). Le produit d'amplification utilisant les amorces spécifiques des chaines lourdes est un fragment de 340 paires de bases environ. Le produit d'amplification utilisant les amorces spécifiques des chaines légères est un fragment de 325 paires de bases environ.
- Après purification, les ADNc codant pour les régions VH et VL de l'anticorps ont été assemblés en une chaine unique au moyen d'un bras nucléotidique (L). Le bras nucléotidique a été construit de telle sorte que l'une des extrémités se lie à l'extrémité 3' de l'ADNc codant pour la région VH et l'autre à l'extrémité 5' de l'ADNc codant pour la région VL. La séquence du bras code pour le peptide SEQ ID n° 5. La séquence assemblée de 700 pb environ contient, sous forme d'un fragment Ncol-Notl, l'enchainement VH-L- VL dont la séquence est représentée SEQ ID n° 4 (acides aminés 9 à 241). Cette séquence inclut également en C-terminal la séquence tag de myc (résidus 256 à 266).
Exemple 3 : Construction de séquences d'acides nucléiques codant pour des molécules chimériques bispécifiques contant un domaine de liaison à un transactivateur constitué d'un anticorps simple chaine (ScFv).
3.1. Construction d'un plasmide comportant une séquence ScFv-myc- Hinge-TetR ou Cro (Figures 5A et 6)
Le fragment Ncol-Notl contenant l'ADNc codant pour le ScFv anti-p53 a tout d'abord été clone dans un plasmide de type pUC19. La séquence codant pour l'épitope VSV (SEQ ID n° 7) ou myc (SEQ ID n° 8) est insérée en aval du fragment (Figure 6).
Les séquences codant pour les protéines TetR et Cro ont ensuite été obtenues comme suit :
- La séquence codant pour TetR a été obtenue par amplification à partir d'un plasmide matrice portant la séquence tetR au moyen des oligonucléotides suivants :
Oligo 5474 (SEQ ID n° 10) :
GGCTCTAGACCCAAGCCCAGTACCCCCCCAGGTTCTTCAACGCG TGGATCCATGTCCAGATTAGATAAAAGTAAAG Oligo 5475 (SEQ ID n° 11) :
CGTACGGAATTCGGGCCCTTACTCGAGGGACCCACTTTCACATTT AAGTTG
Ces oligonucléotides apportent également la séquence codant pour le bras peptidique Hinge reliant les deux domaines fonctionnels de la molécules.
Le fragment amplifié contient donc la séquence codant pour le bras peptidique et pour le domaine de liaison à l'ADN tetR. Ce fragment a été clone aux sites Xbal-EcoRI du plasmide obtenu ci-dessus pour générer un plasmide contant la séquence codant pour la molécule ScFv-myc-Hinge-TetR
(Figure 6).
- La séquence codant pour Cro a été obtenue par amplification sur une matrice d'ADN du bactériophage Lambda au moyen des oligonucléotides suivants : Oligo 5531 (SEQ ID n° 12) :
GGCTCTAGACCCAAGCCCAGTACCCCCCCAGGTTCTTCAACGCG TGGATCCATGGAACAACGCATAACCCTGAAAG
Oligo 5532 (SEQ ID n° 13) :
CGTACGGAATTCGGGCCCTTACTCGAGTGCTGTTG I I I I I I I GTT ACTCGG
Ces oligonucléotides apportent également la séquence codant pour le bras peptidique Hinge reliant les deux domaines fonctionnels de la molécules.
Le fragment amplifié contient donc la séquence codant pour le bras peptidique et pour le domaine de liaison à l'ADN Cro. Ce fragment a été clone aux sites Xbal-EcoRI du plasmide obtenu ci-dessus pour générer un plasmide contant la séquence codant pour la molécule ScFv-myc-Hinge-Cro
(Figure 6).
3.2. Construction d'un plasmide comportant une séquence ScFv- Hinge-TetR ou Cro (Figure 5B) Cet exemple décrit la construction de plasmides portant une séquence codant pour une molécule chimérique bispécifique selon l'invention dépourvue de séquence tag.
Ces plasmides ont été obtenus à partir des plasmides décrits en 3.1. ci-avant par digestion par les enzymes Notl et Xbal. Cette digestion permet d'exciser le fragment portant la région codant pour le tag myc.
3.3. Construction d'un plasmide comportant une séquence ScFv-TetR ou Cro (Figure 5C)
Cet exemple décrit la construction de plasmides portant une séquence codant pour une molécule chimérique bispécifique selon l'invention dépourvue de bras et de séquence tag.
Ces plasmides ont été obtenus à partir des plasmides décrits en 3.1. ci-avant par digestion par les enzymes Notl et BamHI. Cette digestion permet d'exciser le fragment portant la région codant pour le tag myc et pour le bras peptidique Hinge.
Exemple 4 : Construction de séquences d'acides nucléiques codant pour des molécules chimériques bispécifiques contant un domaine de liaison à un transactivateur constitué d'un domaine d'oligomérisation.
4.1. Clonage de la région d'oligomérisation de la protéine p53 (fragment 320-393).
L'ADNc codant pour la région d'oligomérisation de la protéine p53 (SEQ ID n° 3) a été obtenu par amplification par PCR sur un plasmide portant le cDNA de la p53 sauvage humaine à l'aide des oligonucléotides suivants : Oligo 5535 (SEQ ID n° 14) :
CAGGCCATGGCATGAAGAAACCACTGGATGGAGAA (la partie soulignée représente un site Ncol) Oligo 5536 (SEQ ID n° 15) : CGTCGGATCCTCTAGATGCGGCCGCGTCTGAGTCAGGCCCTTC (Partie soulignée : site BamHI; Double-souligné : site Xbal: Gras : site Notl).
4.2. Les plasmides p53 320/393-myc-Hinge-TetR ou Cro (Figure 5A) ont été obtenus par clonage du fragment amplifié ci-dessus sous forme d'un fragment Ncol-Notl dans les sites correspondants des plasmides décrits dans l'exemple 3.1., en substitution de la région codant pour le ScFv.
4.3. Les plasmides p53 320/393-Hinge-TetR ou Cro (Figure 5B) ont été obtenus par clonage du fragment amplifié en 4.1. sous forme d'un fragment Ncol-Xbal dans les sites correspondants des plasmides décrits dans l'exemple 3.1., en substitution de la région codant pour le ScFv et le tag.
4.4. Les plasmides p53 320/393-TetR ou Cro (Figure 5C) ont été obtenus par clonage du fragment amplifié en 4.1. sous forme d'un fragment Ncol-BamHI dans les sites correspondants des plasmides décrits dans l'exemple 3.1. , en substitution de la région codant pour le ScFv, le tag et le Hinge.
4.5. Les plasmides tetR ou Cro- p53 320/393 (Figure 5D) ou tetR ou Cro-Hinge-p53 320/393 (Figure 5E) ont été obtenus par clonage de fragments amplifiés par PCR sur un plasmide portant le cDNA de la p53 humaine sauvage à l'aide des oligos 5537/5539 ou 5538/5539 digérés par Xhol/EcoRI dans les plasmides décrits en 3.1. , préalablement digérés par Xhol/EcoRI.
Oligo 5537 (SEQ ID n° 16) :
CAGGCTCGAGAAGAAACCACTGGATGGAGAA Oligo 5538 (SEQ ID n° 17) :
CAGGCTCGAGCCCAAGCCCAGTACCCCCCCAGGTTCTTCAAAGA AACCACTGGATGGAGAA
Oligo 5539 (SEQ ID n° 18) :
GGTCGAATTCGGGCCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTTC Exemple 5 : Construction d'un plasmide contrôle portant un séquence codant pour une molécule chimérique comportant un domaine de liaison à l'ADN (TetR ou Cro) et le domaine transactivateur de la protéine P53 (région 1-73).
Les plasmides p53 1/73 - TetR ou Cro avec ou sans tag (myc ou VSV) et Hinge (Figures 7 A, B et C) ont été obtenus par clonage de fragments amplifiés par PCR à partir d'un plasmide portant le cDNA de la p53 sauvage humaine à l'aide des oligos 5661/5662 puis digérés par Ncol/Notl, Ncol/Xbal, Ncol/BamHI dans les plasmides décrits en 3.1. , préalablement digérés par Ncol/Notl, Ncol/Xbal ou Ncol/BamHI. Oligo 5661 (SEQ ID n° 19) :
CAGGCCATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCC
Oligo 5662 (SEQ ID n° 20) :
CGTCGGATCCTCTAGATGCGGCCGCCACGGGGGGAGCAGCCTC TGG
Exemple 6 : Construction de plasmides d'expression de différentes molécules hybrides de l'invention
Les plasmides utilisés pour l'expression de molécules hybrides ont été obtenus par clonages des fragments contenant les cDNA codant pour ces molécules aux sites Ncol/EcoRI du vecteur d'expression eukaryote pcDNA3 (Invitrogen). Les différentes constructions ainsi effectuées sont les suivantes:
- ScFv 421 : SEQ IDn°4
- TET19: protéine hybride contenant l'enchainement ScFv421-VSV-Hinge- TetR décrite en figure 6 suivant l'exemple 3.1
- TET02: protéine hybride contenant l'enchainement p53 (320/393)- VSV- Hinge-TetR décrite en figure 5A suivant l'exemple 4.3
- TET03: protéine hybride contenant l'enchainement p53(320/393)-Hinge- TetR décrite en figure 5B suivant l'exemple 4.4 - TET04: protéine hybride contenant l'enchainement p53(320/393)-TetR décrite en figure 5C suivant l'exemple 4.4
- TET07: protéine hybride contenant l'enchainement p53(1/73)-VSV-Hinge- TetR décrite en figure 7A suivant l'exemple 5
Exemple 7 : Reconnaissance de séquences d'ADN double brin spécifiques par les molécules hybrides de l'invention
7.1. Production des molécules hybrides
Les différentes molécules utilisées dans cette expérience ont été obtenues par traduction in vitro en lysat de réticulocytes des molécules décrites dans l'exemple 6 en utilisant le kit TNT Coupled Reticulocyte lysate Systems (Promega) suivant le protocole expérimental décrit par le fournisseur pour un volume réactionnel total de 50 μl.
7.2 Construction de la séquence d'ADN double brin spécifique
La séquence d'ADN double brin spécifique utilisée dans cette expérience est constituée de deux oligonucléotides de synthèse dont la séquence est la suivante:
Oligo 5997 (SEQ ID n°24): GATCCGACTTTCACTTTTCTCTATCACTGATAGTGAGTGGTAAACTCA
Oligo 5998 (SEQ ID n°25): AGCTTGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCG
Ces deux oligonucléotides de synthèse ont été marqués au phosphore 33 par incubation de 30min à 37°C de 10 pmole de chaque oligonucléotide dans 10 μl du milieu réctionnel suivant:
Tris-HCI pH7,6 50mM MgCI2 10mM dithiothréitol 5mM Spermidine 100μM
EDTA 100μM
ATP-γ-∞P (Amersham) 50μCi (1000-3000 Ci/mmole)
T4 kinase (Boehringer) 10U
Puis les deux oligonucléotides ainsi marqués ont été hybrides en présence de de 400mM NaCI pour reconstituer la séquence double brin TetO suivante (SEQ ID n°26):
GATCCGACTTTCACTTTTCTCTATCACTGATAGTGAGTGGTAAACTCA CTAGGCTCAAAGTGAAAAGAGATAGTGACTATCACTCACCATTTGAGT
7.3 Reconnaissance de la séquence double brin TetO par les différentes molécules hybrides de l'invention
La réaction de liaison à l'ADN est effectuée dans 50 μl de milieu réactionnel (Tris-HCI pH7,4 10mM, MgCI2 10mM, KCI 10mM, β-mercaptoéthanol 6mM, EDTA 0,1 mM, BSA 0,5mg/ml) par addition de la séquence TetO (1010M) préparée selon l'exemple 7.2, de 10 μl du produit de traduction préparé selon l'exemple 7.1 et de lO^M de l'oligonucléotide compétiteur froid AP2 (Promega) utilisé pour éliminer la fixation non spécifique. La spécificité de l'interaction est vérifiée par déplacement de l'équilibre par addition de tetracycline 10 μM (Sigma) dans le milieu réactionnel. Les mélanges réactionnels sont incubés 15min à 20°C puis additionné de 10 μl de glycérol à 50 %, et les mélange finaux sont soumis à une électrophorèse native sur gel de polyacrylamide à 5 % avec migration à 200V et 16°C. Le gel est ensuite séché et autoradiographié. Le résultat de cette expérience effectuée avec les molécules hybrides TET19, TET02 et TET07 est présenté sur la figure 9. Dans ces conditions.la liaison de ces trois molécules à la séquence d'ADN spécifique double brin TetO est observée par un retard de migration de celle-ci, et la spécificité de cette interaction est mise en évidence par l'inhibition de ce retard par addition de tetracycline.
Ce résultat confirme donc que les molécules hybrides de l'invention sont capables de se lier de façon spécifique à la séquence nucléotidique TetO
Exemple 8 ; Liaison spécifique des molécules hybrides de l'invention à une molécule présentant un domaine transactivateur transcriptionnel.
8.1. Production des molécules hybrides de l'invention et de molécules présentant ou non un domaine transactivateur transcriptionnel.
Pour cette expérience, les molécules hybrides de l'invention ScFv 421 , TET19 et TET02 selon l'exemple 6 ont été produites par traduction in vitro en utilisant le protocole expérimental selon l'exemple 7.1 en présence de 44μCi de ^S-methionine (Amersham) (1175 Ci/mmole) pour générer ces molécules hybrides radioactivement marquées.
Les cDNA des molécules présentant ou non un domaine transactivateur transcriptionnel ont été clones dans le vecteur pBlueBaclll (Invitrogen) au site BamHI. A partir de ces vecteurs, des baculovirus recombinants ont été produits et purifiés suivant les instructions du fabricant. Les molécules sont produites par infection avec le baculovirus recombinant de cellules d'insecte sf9 suivant le protocole expérimental du fabricant. Des extraits protéiques à la concentration protéique finale de 10mg/ml sont préparés suivant le protocole décrit par K. Ory et al. (K. Ory, EMBO J., 13, 3496-3504, 1994). Ces molécules sont les suivantes:
- p53 (1/393): protéine p53 sauvage
- p53 (1/320): protéine p53 sauvage limitée à sa séquence en acide aminé 1 à 320 et donc dépourvue de son domaine d'oligomérisation et du domaine reconnu par l'anticorps monoclonal pAb421. 8.2. Liaison des molécules hybrides de l'invention aux molécules présentant ou non un domaine transactivateur transcriptionnel
5 μl de chacun des produits de traduction in vitro préparés selon l'exemple 8.1 ont été incubés avec 5μl de l'extrait baculovirus préparé selon l'exemple 8.1 et 2μg de l'anticorps monoclonal D01 (Oncogene Sciences) qui reconnaît l'extrémité N-terminale de la protéine p53 pendant 16 heures à 4°C dans 100μl de tampon RIPA modifié ((K. Ory, EMBO J., 13, 3496-3504, 1994). L'immunoprécipitation est réalisé comme décrit par K. Ory et al. (K. Ory, EMBO J., 13, 3496-3504, 1994). Les complexes retenus par l'anticorps sont élues par incubation de 10min à 80°C en présence de 30μl de tampon de migration (Laemmli U.K., Nature, 227, 680-685, 1970) et soumis à électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 10% en milieu dénaturant à 200V suivant le protocole précédemment décrit (Laemmli U.K., Nature, 227, 680- 685, 1970). Le gel est ensuite séché et révélé à l'aide d'un instantimager (Packard instruments) qui permet de quantifier les quantités de molécules hybrides liées à la molécule présentant ou non un domaine transactivateur transcriptionnel. Les résultats de cette expérience sont représentés sur la figure 10.
Dans ces conditions, il apparaît nettement que la molécule hybride présentant le ScFv 421 (TET19) reconnaît bien la molécule p53 (1/393) de façon équivalente au ScFv 421 seul, et la molécule hybride présentant le domaine 320/393 (TET02) présente les mêmes propriétés mais avec un pouvoir de rétention de la p53(1/393) beaucoup plus important. De plus, l'absence de signal observé lors de l'incubation avec la molécule p53(1/320) montre que ces interactions sont bien spécifiques et médiées par l'extrémité C-terminale de la protéine p53 (acides aminés 320 à 393) comme attendu.
Ces résultats confirment donc que les molécules hybrides de l'invention sont bien capables de recruter un domaine transactivateur transcriptionnel porté par une molécule dont elles sont des partenaires spécifiques. Exemple 9 : Recrutement fonctionnel d'un domaine transactivateur transcriptionnel par les molécules hvhririps rte l'invention
Le recrutement fonctionnel d'un domaine transactivateur transcriptionnel par les molécules hybrides de l'invention a été évalué dans un système de transactivation in vivo dans les cellules SAOS-2 (ostéosarcome humain) déficientes pour les deux allèles de la protéine p53, dans la lignée tumorale H358 déficiente pour les deux allèles de la protéine p53 (Maxwell & Roth, Oncogene 8, 3421 , 1993) et dans la lignée tumorale HT29 déficiente pour un des deux allèles de la protéine p53 et présentant un allèle muté (mutation H273). Ce sytème repose sur l'utilisation d'un gène rapporteur dosable enzymatiquement et placé sous la dépendance d'un promoteur contenant les motifs nucléotidiques de reconnaissance spécifique par le répresseur Tet. (Opérateur Tet).
Dans ce test, le gène rapporteur LUC (luciférase) placé sous contrôle de l'opérateur Tet est contenu dans le plasmide pUHC13-3 (Gossen M. & Bujard H.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5547-5551 , 1992).
9.1 Lignées cellulaires utilisées et conditions de culture
Les lignées cellulaires utilisées dans ces expériences ainsi que leur génotype lié à la protéine p53 et les milieu de culture utilisés pour leur croissance sont reportés dans le Tableau ci-dessous :
Tableau: lignées cellulaires
Lignée p53 Milieu de culture n°ATCC milieu DMEM (Gibco BRL) additionné de
SAOS-2 -/- HTB 85 10% de sérum de veau foetal (Gibco BRL) milieu RPMI1640 (Gibco BRL) additionné de
H358 -/- 10% de sérum de veau foetal (Gibco BRL) milieu DMEM (Gibco BRL) additionné de
HT29 -/H273 10% de sérum de veau foetal (Gibco BRL) 9.2. Plasmides d'expression des molécules présentant un domaine transactivateur transcriptionnel
Les molécules présentant un domaine transactivateur transcriptionnel utilisées dans cette expérience sont la protéine p53 sauvage (wt) et les mutant G281 et H 175 de cette protéine. Les cDNA codant pour ces trois protéines ont été insérés au site BamHI du vecteur pcDNA3 (Invitrogen).
9.3. Expression intracellulaire des molécules hybrides de l'invention
Les molécules hybrides de l'invention sont exprimées dans les cellules en culture par transfection transitoire en utilisant le protocole suivant :
Les cellules (3,5 105) sont ensemencées dans des plaques 6 puits contenant 2 ml de milieu de culture, et cultivées sur la nuit dans un incubateur à C02 (5 %) à 37°C. Les différentes constructions sont alors transfectées en utilisant la lipofectAMINE (Gibco BRL) comme agent de transfection de la façon suivante: 1 ,5 μg de plasmide total sont incubés ( dont 0,25 μg du plasmide reporter) avec 5 μl de lipofectAMINE pendant 30 min avec 2 ml de milieu de culture sans sérum (mélange de transfection). Pendant ce temps, les cellules sont rincées deux fois au PBS puis incubées 4 h à 37°C avec le mélange de transfection, après quoi celui-ci est aspiré et remplacé par 2 ml de milieu culture additioné de 10 % de sérum de veau foetal inactivé à la chaleur et les cellules remises à pousser pendant 48 h à 37°C.
9.4. Détection de l'activation de la transcription
L'activation de la transcription liée au recrutement fonctionnel du transactivateur transcriptionnel est détectée et quantifiée par la mesure de l'activité luciférase codée par le gène LUC en utilisant le kit Luciferase Assay System (Promega) selon le protocole expérimentale du fabricant. 9.5. Recrutement fonctionnel d'un domaine transactivateur transcriptionnel par les molécules de l'invention
Cette expérience a été effectuée en utilisant les molécules TET02, TET03 et TET07 selon l'exemple 6. Dans cette expérience la molécule TET07 sert de contrôle positif puisqu'elle possède son propre domaine transactivateur transcriptionnel.
Les résultats obtenus dans les cellules SAOS-2 et présentés dans la figure 11 montrent que la molécule TET07 est bien capable à elle seule d'activer la transcription du gène LUC placé sous le contrôle de l'opérateur Tet contrairement à la construction TET02. Ceci est en accord avec le fait que cette lignée cellulaire ne contient pas de protéine p53 endogène qui ne peut donc être recrutée par la molécule TET02. Par contre, l'introduction de la protéine p53 sauvage ou de son mutant G281 qui ne produisent pas de signal à elles seules, est capable de générer une activité transcriptionnelle en présence de la molécule TET02. Un tel résultat n'est pas observable avec le mutant H 175 décrit dans la littérature comme présentant un domaine transactivateur transcriptionnel non fonctionnel.
Ce résultat obtenu dans la lignée cellulaire SAOS-2 avec la molécule TET02 a pu être reproduit dans une lignée tumorale ne contenant pas non plus de p53 endogène (cellules H358) et a pu être étendu aux molécules TET03 et TET04 (figure 12).
Dans le but de confirmer ces deux résultats dans un contexte cellulaire différent, la molécule TET02 ainsi que le contrôle positif TET07 ont été exprimées dans les cellules HT29 qui présentent une protéine p53 endogène mutante (H273), le contrôle négatif de cette expérience consistant à transfecter le vecteur pcDNA3 vide. Le résultat de cette expérience, présenté dans le Tableau ci-dessous, montre que la molécule TET02 est bien capable de recruter le domaine transactivateur transcriptionnel de la protéine p53 endogène.
Tableau : Activation transcriptionnelle des molécules hvbrides de l'invention dans les cellules HT29
pcDNA3 TET07 TET02
1 59 10
L'ensemble de ces expériences montre donc que les molécules hybrides de l'invention sont bien capables de lier à la fois des séquences d'ADN double brin spécifiques et des protéines présentant un domaine transactivateur transcriptionnel, et que ces molécules sont capables d'induire de manière conditionnelle l'expression de gènes d'intérêt.
LISTE DE SEQUENCES
(1 ) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, AVENUE RAYMOND ARON
(C) VILLE: ANTONY (E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(G) TELEPHONE: (1) 40.91.70.36 (H) TELECOPIE: (1) 40.91.72.91 (ii) TITRE DE L' INVENTION: SYSTEME D'EXPRESSION CONDITIONNEL
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 26
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D" EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 19 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
TCTCTATCAC TGATAGGGA 19
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: TATCACCGCA AGGGATA 17
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 74 acides amin,s
(B) TYPE: acide amin,
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin,aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gin Ile Arg Gly Arg 1 5 10 15
Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys 20 25 30
Asp Ala Gin Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser 35 40 45
His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gin Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu 50 55 60 Met Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp 65 70
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 768 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: TTACTCGCGG CCCAGCCGGC CATGGCCCAG GTGCAGCTGC AGCAGTCTGG GGCAGAGCTT 60 GTAAGGTCAG GGGCCTCAGT CAAGTTGTCC TGCACAGCTT CTGGCTTCAA CATTAAAGAC 120
TACTATATGC ACTGGGTGAA GCAGAGGCCT GAACAGGGCC TGGAGTGGAT TGGATGGATT 180
GATCCTAAGA ATGGTGATAC TGAATATGCC CCGAAGTTCC AGGGCAAGGC CACTATGACT 240
GCAGACACAT CCTCCAATAC AGCCTACCTG CAGCTCAGCA GCCTGGCATC TGAGGACACT 300 GCCGTGTATT ATTGTAATTT TTACGGGGAT GCTTTGGACT ATTGGGGCCA AGGGACCACG 360
GTCACCGTCT CCTCAGGTGG AGGCGGTTCA GGCGGAGGTG GCTCTGGCGG TGGCGGATCG 420
GATGTTTTGA TGACCCAAAC TCCACTCACT TTGTCGGTTA CCATTGGACA ACCAGCCTCC 480
ATCTCTTGCA AGTCAAGTCA GAGCCTCTTG GATAGTGATG GAAAAACATA TTTGAATTGG 540
TTGTTACAGA GGCCAGGCCA GTCTCCAAAG CGCCTAATCT ATCTGGTGTC TAAACTGGAC 600 TCTGGAGTCC CTGACAGGTT CACTGGCAGT GGATCAGGGA CAGATTTCAC ACTTAAAATC 660
AACAGAGTGG AGGCTGAGGA TTTGGGAGTT TATTATTGCT GGCAAGGTAC ACATTCTCCG 720
CTTACGTTCG GTGCTGGCAC CAAGCTGGAA ATTAAACGGG CGGCCGCA 768
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 15 acides amin,s
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..30
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
CCC AAG CCC AGT ACC CCC CCA GGT TCT TCA 30
Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser 1 5 10
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..18
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
ATG AAC CGG CTG GGC AAG 18 Met Asn Arg Leu Gly Lys
1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 1..33
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT 33
Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn 1 5 10
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 7 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 66 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: GGCTCTAGAC CCAAGCCCAG TACCCCCCCA GGTTCTTCAA CGCGTGGATC CATGTCCAGA 60 TTAGATAAAA GTAAAG 66
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 51 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11 : CGTACGGAAT TCGGGCCCTT ACTCGAGGGA CCCACTTTCA CATTTAAGTT G 51
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 66 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: GGCTCTAGAC CCAAGCCCAG TACCCCCCCA GGTTCTTCAA CGCGTGGATC CATGGAACAA 60 CGCATAACCC TGAAAG 66
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 51 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: CGTACGGAAT TCGGGCCCTT ACTCGAGTGC TGTTGTTTTT TTGTTACTCG G
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 35 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14: CAGGCCATGG CATGAAGAAA CCACTGGATG GAGAA 35
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 43 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15: CGTCGGATCC TCTAGATGCG GCCGCGTCTG AGTCAGGCCC TTC 43
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 31 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: CAGGCTCGAG AAGAAACCAC TGGATGGAGA A 31
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 61 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17: CAGGCTCGAG CCCAAGCCCA GTACCCCCCC AGGTTCTTCA AAGAAACCAC TGGATGGAGA 60 A 61
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18: GGTCGAATTC GGGCCCTCAG TCTGAGTCAG GCCCTTC 37 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19:
CAGGCCATGG AGGAGCCGCA GTCAGATCC 29
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:
GGTCGAATTC GGGCCCTCAG TCTGAGTCAG GCCCTTC 37
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 20:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 46 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20: CGTCGGATCC TCTAGATGCG GCCGCCACGG GGGGAGCAGC CTCTGG 46
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 21:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 66 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21:
Met Glu Gin Arg Ile Thr Leu Lys Asp Tyr Ala Met Arg Phe Gly Gin 1 5 10 15 Thr Lys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Val Tyr Gin Ser Ala Ile Asn Lys
20 25 30
Ala Ile His Ala Gly Arg Lys Ile Phe Leu Thr Ile Asn Ala Asp Gly 35 40 45
Ser Val Tyr Ala Glu Glu Val Lys Pro Phe Pro Ser Asn Lys Lys Thr 50 55 60
Thr Ala 65
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 22:
GATCCTATCA CCGCAAGGGA TAA 23
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 23:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23: GATAGTGGCG TTCCCTATTT CGA 23
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 24: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 48 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 24:
GATCCGACTT TCACTTTTCT CTATCACTGA TAGTGAGTGG TAAACTCA 48
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 25:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 48 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
( i) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 25: AGCTTGAGTT TACCACTCCC TATCAGTGAT AGAGAAAAGT GAAAGTCG 48
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 26:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 96 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON (iv) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 26:
GATCCGACTT TCACTTTTCT CTATCACTGA TAGTGAGTGG TAAACTCACT AGGCTCAAAG 60 TGAAAAGAGA TAGTGACTAT CACTCACCAT TTGAGT 96

Claims

REVENDICATIONS
1. Molécule chimérique bispécifique comprenant un domaine capable de lier sélectivement une séquence définie d'ADN et un domaine détecteur capable de lier spécifiquement un transactivateur ou transrépresseur ou un complexe transactivateur ou transrépresseur caractéristique d'un état physiologique ou physiopathologique.
2. Molécule selon la revendication 1 caractérisée en ce que le domaine capable de lier sélectivement une séquence définie d'ADN dérive d'une protéine capable d'interagir avec l'ADN.
3. Molécule selon la revendication 2 caractérisée en ce que le domaine capable de lier sélectivement une séquence définie d'ADN dérive d'une protéine eucaryote.
4. Molécule selon la revendication 3 caractérisée en ce que le domaine capable de lier sélectivement une séquence définie d'ADN dérive des protéines p53, STAT ou NFkB.
5. Molécule selon la revendication 2 caractérisée en ce que le domaine capable de lier sélectivement une séquence définie d'ADN dérive d'une protéine procaryote.
6. Molécule selon la revendication 5 caractérisée en ce que la protéine procaryote est un répresseur bactérien.
7. Molécule selon la revendication 6 caractérisée en ce que le domaine capable de lier sélectivement une séquence définie d'ADN dérive la protéine tetR.
8. Molécule selon la revendication 6 caractérisée en ce que le domaine capable de lier sélectivement une séquence définie d'ADN dérive la protéine
Cro.
9. Molécule selon l'une des revendications 2 à 8 caractérisée en ce que le domaine capable de lier sélectivement une séquence définie d'ADN comprend le domaine d'interaction avec l'ADN de ladite protéine.
10. Molécule selon l'une des revendications 2 à 8 caractérisée en ce que le domaine capable de lier sélectivement une séquence définie d'ADN est constitué de la protéine complète.
11. Molécule selon la revendication 10 caractérisée en ce que le domaine capable de lier sélectivement une séquence définie d'ADN est constitué de la protéine tetR.
12. Molécule selon la revendication 10 caractérisée en ce que le domaine capable de lier sélectivement une séquence définie d'ADN est constitué de la protéine Cro.
13. Molécule selon la revendication 1 caractérisée en ce que le domaine capable de lier spécifiquement le transactivateur ou transrépresseur ou le complexe transactivateur ou transrépresseur est un domaine d'oligomérisation.
14. Molécule selon la revendication 13 caractérisée en ce que le domaine d'oligomérisation est un leucine-zipper, un domaine SH3 ou SH2.
15. Molécule selon la revendication 13 caractérisée en ce que le domaine d'oligomérisation capable de lier spécifiquement le transactivateur est constitué de la partie C-terminale de la protéine p53.
16. Molécule selon la revendication 15 caractérisée en ce que le domaine d'oligomérisation est constitué de la partie C-terminale de la protéine p53 allant du résidu 320 à 393 (SEQ ID n° 3), 302-360 ou 302-390.
17. Molécule selon la revendication 1 caractérisée en ce que le domaine capable de lier spécifiquement le transactivateur ou transrépresseur ou le complexe transactivateur ou transrépresseur est un domaine synthétique ou naturel connu pour interagir avec ledit transactivateur ou transrépresseur ou complexe transactivateur ou transrépresseur.
18. Molécule selon la revendication 1 caractérisée en ce que le domaine capable de lier spécifiquement le transactivateur ou transrépresseur ou le complexe transactivateur ou transrépresseur est un anticorps ou un fragment ou dérivé d'anticorps dirigé contre le transactivateur ou transrépresseur ou complexe transactivateur ou transrépresseur.
19. Molécule selon la revendication 18 caractérisée en ce que le domaine capable de lier spécifiquement le transactivateur ou le complexe transactivateur est constitué par un fragment Fab ou F(ab)'2 d'anticorps ou une région VH ou VL d'un anticorps.
20. Molécule selon la revendication 18 caractérisée en ce que le domaine capable de lier spécifiquement le transactivateur ou le complexe transactivateur est constitué par un anticorps simple chaine (ScFv) comprenant une région VH liée à une région VL par un bras.
21. Molécule selon la revendication 1 caractérisée en ce que le domaine de liaison à l'ADN et le domaine de liaison au transactivateur sont reliés entre eux par l'intermédiaire d'un bras.
22. Molécule selon la revendication 21 caractérisée en ce que le bras est constitué d'un peptide comprenant de 5 à 30 acides aminés et, de préférence, de 5 à 20 acides aminés.
23. Molécule selon la revendication 22 caractérisée en ce que le bras est choisi parmi les peptides de séquence SEQ ID n° 5 ou SEQ ID n° 6.
24. Molécule selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le domaine de liaison à l'ADN est situé en position N-terminale et le domaine de liaison au transactivateur est situé en position C-terminale.
25. Molécule selon l'une des revendications 1 à 23 caractérisée en ce que le domaine de liaison à l'ADN est situé en position C-terminale et le domaine de liaison au transactivateur est situé en position N-terminale.
26. Molécule chimérique bispécifique de structure ScFv-VSV/myc-Hinge-TET ou Cro (Figure 5A).
27. Molécule chimérique bispécifique de structure ScFv-Hinge-TET ou Cro (Figure 5B).
28. Molécule chimérique bispécifique de structure ScFv-TET ou Cro (Figure 5C).
29. Molécule chimérique bispécifique de structure TET ou Cro-ScFv (Figure 5D).
30. Molécule chimérique bispécifique de structure TET ou Cro-Hinge-ScFv (Figure 5E).
31. Molécule chimérique bispécifique de structure Oligom-VSV/myc-Hinge- TET ou Cro (Figure 5A), Oligom-Hinge-TET ou Cro (Figure 5B) ou Oligom- TET ou Cro (Figure 5C).
32. Séquence d'acide nucléique codant pour une molécule chimérique selon l'une des revendications 1 à 31.
33. Séquence d'acide nucléique selon la revendication 32 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une séquence d'ADN.
34. Séquence d'acide nucléique selon la revendication 32 ou 33 caractérisée en ce qu'elle fait partie d'un vecteur.
35. Système conditionnel d'expression de gènes comprenant :
- une molécule chimérique telle que définie dans les revendications 1 à 31, et,
- une cassette d'expression comportant une séquence régulatrice, un promoteur transcriptionnel minimal et ledit gène.
36. Système conditionnel selon la revendication 35 caractérisé en ce que le domaine de liaison à l'ADN de la molécule chimérique est représenté par tout ou partie de TetR et la séquence régulatrice comprend la séquence SEQ ID n° 1 ou un dérivé de celle-ci, éventuellement répétée plusieurs fois.
37. Système conditionnel selon la revendication 35 caractérisé en ce que le domaine de liaison à l'ADN de la molécule chimérique est représenté par tout ou partie de Cro et la séquence régulatrice comprend la séquence SEQ ID n° 2 ou un dérivé de celle-ci, éventuellement répétée plusieurs fois.
38. Système conditionnel selon l'une des revendications 35 à 37 caractérisé en ce que le promoteur minimal comprend une boite TATA ou INR.
39. Système conditionnel selon la revendication 38 caractérisé en ce que le promoteur minimal dérive du promoteur du gène de la thymidine kinase.
40. Système conditionnel selon la revendication 39 caractérisé en ce que le promoteur minimal est composé des nucléotides -37 à +19 du promoteur du gène de la thymidine kinase.
41. Vecteur comprenant :
- une séquence d'acide nucléique codant pour une molécule chimérique selon l'une des revendications 1 à 31 , et
- une cassette d'expression comportant une séquence de régulatrice, un promoteur transcriptionnel minimal et une séquence codante d'intérêt.
42. Vecteur selon la revendication 41 caractérisé en ce que le promoteur transcriptionnel minimal est défini selon les revendications 38 à 40.
43. Vecteur selon la revendication 41 caractérisé en ce que le domaine de liaison à l'ADN de la molécule chimérique est représenté par tout ou partie de TetR et la séquence régulatrice comprend la séquence SEQ ID n° 1 ou un dérivé de celle-ci, éventuellement répétée plusieurs fois.
44. Vecteur selon la revendication 41 caractérisé en ce que le domaine de liaison à l'ADN de la molécule chimérique est représenté par tout ou partie de Cro et la séquence régulatrice comprend la séquence SEQ ID n° 2 ou un dérivé de celle-ci, éventuellement répétée plusieurs fois.
45. Vecteur selon l'une des revendications 41 à 44 caractérisé en ce que la séquence codante d'intérêt est une séquence d'ADN codant pour un produit thérapeutique.
46. Vecteur selon la revendication 45 caractérisé en ce que le produit thérapeutique est un peptide ou polypeptide toxique.
47. Vecteur selon ' la revendication 46 caractérisé en ce que le produit thérapeutique toxique est choisi parmi la toxine diphtérique, la toxine pseudomonas, la ricine A, la thymidine kinase, la cytosine désaminase, la protéine Grb3-3, ou le ScFv Y28.
48. Vecteur selon l'une des revendications 41 à 47 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur plasmidique.
49. Vecteur selon l'une des revendications 41 à 47 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral.
50. Vecteur selon la revendication 49 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un adénovirus recombinant défectif.
51. Vecteur selon la revendication 49 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un rétrovirus recombinant défectif.
52. Composition pharmaceutique comprenant au moins un vecteur selon l'une des revendications 41 à 51.
53. Acide nucléique comprenant la séquence SEQ ID n° 4.
54. Molécule selon la revendication 1 caractérisée en ce que le transactivateur caractéristique d'un état physiologique ou physiopathologique est une protéine d'origine virale, parasitaire, mycobactérienne ou cellulaire possédant une activité transactivateur transcriptionnel.
55. Molécule selon la revendication 54 caractérisée en ce que le transactivateur est une protéine virale choisie parmi la protéine Tat du virus VIH, les protéines E6/E7 du virus du papillome et la protéine EBNA du virus d'Epstein Barr.
56. Molécule selon la revendication 54 caractérisée en ce que le transactivateur est une protéine cellulaire, de préférence la protéine p53 mutée ou sauvage.
57. Molécule selon la revendication 1 caractérisée en ce que le transactivateur ou complexe transactivateur caractéristique d'un état physiologique ou physiopathologique est une protéine apparaissant dans une cellule infectée ou hyperproliférative
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