MXPA97006928A - Sistema de expresion condicional - Google Patents

Abstract

La presente invención describe un novedoso sistema condicional para la expresión de genes. El sistema de la invención se basa particularmente en la creación y la expresión de moléculas quiméricas biespecíficas que comprenden un dominio capaz de unirse selectivamente a una secuencia definida de ADN y un dominio detector, capaz de unirse específicamente a un transactivador o transrepresor, o un complejo transactivador o transrepresor.

Description

SISTEMA DE EXPRESIÓN CONDICIONAL DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a un novedoso sistema para la expresión condicional de genes. La invención se relaciona igualmente a la utilización de este sistema en terapia génica o celular, para dirigir de manera muy selectiva la expresión de genes de interés. Las terapias génicas y celulares consisten en corregir una deficiencia o una anomalia (mutación, expresión aberrante, etc.) o en asegurar la expresión de una proteina de interés terapéutico por introducción de una información genética en la célula u órgano afectado. Esta información genética puede ser introducida ya sea ex vivo en una célula extraída del órgano, la célula modificada es luego introducida de nuevo en el organismo (terapia celular) , ya sea directamente in vivo en el tejido apropiado (terapia génica) . Existen diferentes técnicas para efectuar la transferencia de genes, entre las cuales están técnicas diversas de transfección que implican vectores químicos o bioquímicos, naturales o sintéticos, tales como los complejos de ADN y de DEAE-dextran (Pagano et al., J.

Virol. 1 891 (1967)), de ADN y de proteínas nucleares (Kaneda et al., Science 243 375(1989), de ADN y de lipidos (Felgner et al., PNAS 84 7413 (1987), el empleo de REF: 25345 liposomas (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 10431 (1980), lipidos catiónicos, etc. Otra técnica se fundamenta en el empleo de virus como vectores para la transferencia de genes. En este respecto, se han probado diferentes virus para determinar su capacidad de infectar ciertas poblaciones celulares. En particular, los retrovirus (RSV, HMS, MMS, etc.) los virus HSV, los virus adeno-asociados y los adenovirus. Una de las principales dificultades para el desarrollo de estas terapias génicas y celulares reside sin embargo en la selectividad del tratamiento. Según las aplicaciones, según el gen a transferir, es importante poder alcanzar ciertos tejidos o ciertas partes solamente del organismo, a fin de concentrar el efecto terapéutico y limitar la diseminación y los efectos secundarios. Esta dirección puede ser realizada utilizando vectores que presentan una especificidad celular dada. Otra aproximación consiste en utilizar señales de expresión especificas de ciertos tipos celulares. En este respecto, se han descrito en la literatura promotores llamados específicos, tales como el promotor de los genes que codifican para la piruvato cinasa, la villina, la GFAP, el promotor de la proteina intestinal de unión de los ácidos grasos, el promotor de la actina a de las células del músculo liso, o el promotor de los genes de la apo-AI, la apo-AII, la albúmina humana, etc. Sin embargo, estos promotores presentan ciertos inconvenientes, y en particular presentan un cierto ruido de fondo transcripcional, que puede ser generado por la expresión de genes tóxicos, y están limitados a ciertas células, y no pueden asi ser utilizados para cualquier aplicación. La presente invención describe ahora un novedoso sistema de expresión condicional de genes, particularmente selectivo y eficaz. Una de las características ventajosas del sistema de la invención reside en su capacidad de expresar un gen no en función de un tipo celular, sino en función de la presencia de un elemento celular particular o de una situación fisiológica particular. Este sistema hace en efecto un llamado a moléculas quiméricas biespecificas que comprenden un dominio capaz de unirse selectivamente a una secuencia definida de ADN, y un dominio detector, capaz de unirse específicamente a un transactivador o un complejo transactivador . Un primer aspecto de la presente invención reside más particularmente en la creación y la expresión de moléculas quiméricas biespecificas que comprenden un dominio capaz de unirse selectivamente a una secuencia definida de ADN, y n dominio capaz de unirse específicamente a un transactivador o transrepresor, o un complejo transactivador o transrepresor. Otro aspecto de la presente invención reside en una secuencia de ácido nucleico que codifica para una molécula quimérica tal como la definida anteriormente, asi como todo vector de expresión que comprenda la secuencia nucleica. Otro aspecto de la invención consiste en un sistema condicional de expresión de genes, que comprende (i) una molécula quimérica tal como la definida anteriormente, y (ii) un cásete de expresión que comprende una secuencia de regulación, un promotor minimo (cuya actividad depende de la presencia de un transactivador) y el gen. Otro aspecto de la invención reside igualmente en un vector de expresión, que comprende: -una secuencia nucleica que codifica para una molécula quimérica tal como la definida anteriormente, y -el cásete de expresión. El sistema de expresión condicional de la invención es particularmente apropiado para una utilización en terapia génica o celular, para dirigir de manera muy selectiva la expresión de genes de interés. Uno de los componentes del sistema de la invención consiste asi en moléculas quiméricas biespecificas particulares, que comprenden un dominio capaz de unirse selectivamente a una secuencia definida de ADN, y un dominio capaz de unirse selectivamente a un transactivador o u complejo transactivador. La biespecificidad de las moléculas de la invención reside por una parte en su capacidad de unirse a una secuencia de ADN definida (por lo general designada secuencia reguladora u operadora) y por otra parte en su capacidad de encontrar específicamente un dominio proteico transactivador o transrepresor que permita inducir o reprimir la expresión de genes. La invención se apoya particularmente en la preparación de moléculas quiméricas biespecificas que permiten el encuentro de cualquier factor transcripcional cuya activación o inactivación conduzca a una situación fisiopatológica. Las moléculas quiméricas biespecificas según la invención permiten asi el encuentro selectivo de transactivadores transcripcionales específicos de un estado fisiopatológico, la fijación de estos factores transcripcionales a promotores por intermedio de una fijación de estas moléculas a secuencias de ADN definidas, localizadas cerca de estos promotores (secuencias reguladoras u operadoras), y asi la expresión condicional de genes (Figura 1) . La invención se apoya igualmente en la preparación de moléculas quiméricas biespecificas que permiten el encuentro no de una molécula que lleve un dominio transactivador, sino de un complejo transactivador transcripcional, es decir, un complejo formado entre una molécula objetivo presente en una célula y una molécula que lleva un dominio transactivador (Figura 2) . En este caso, el complejo transactivador se forma preferiblemente por medio de una segunda molécula quimérica biespecifica que comprende un dominio transactivador y un dominio de unión selectiva a la molécula celular. La fijación de esta segunda molécula permite la formación de un complejo binario transactivador transcripcional, el complejo es entonces encontrado por el sistema detector de la invención. La fijación de este complejo ternario en la proximidad de los promotores permite asi la expresión regulada de genes. Este tipo de construcción permite ventajosamente extender las condiciones de utilización del sistema de la invención en la detección de cualquier molécula intracelular desprovista de dominio transactivador, ya sea que se trate de una molécula endógena o de una molécula de origen infeccioso por ejemplo. El sistema de la invención permite asi, gracias a un sistema de detección muy selectivo ("sensor") activar la expresión de genes de interés únicamente en presencia de proteínas objetivo. Puede tratarse de factores transcripcionales que aparecen durante situaciones fisiológicas o fisiopatológicas, o de cualquier molécula endógena o de origen infeccioso por ejemplo. El sistema de la invención contiene en efecto un elemento detector muy sensible y muy selectivo, que permite condicionar la expresión de un gen en la presencia, la aparición o la desaparición de cualquier molécula en una célula. En el marco de la presente invención, el término transactivador designa cualquier factor transactivador de la transcripción, o cualquier proteina que comprende un dominio transactivador transcripcional. El complejo transactivador designa el complejo formado entre una molécula presente en una célula y una molécula biespecifica de la invención que comprende un dominio transactivador, y un dominio de unión especifica a la molécula. El sistema de expresión de la invención puede ser utilizado para encontrar cualquier proteína transactivadora o que lleve un dominio transactivador, y en particular cualquier proteina de origen viral, parasitario, micobacteriano o celular que posea una actividad de transactivador transcripcional. Entre los factores transcripcionales de origen viral se pueden citar particularmente la proteína Tat del virus VIH, las proteínas E6/E7 del virus del papiloma, o aún la proteína EBNA del virus de Epstein Barr. Estas proteínas poseen un dominio transactivador transcripcional, y están presentes únicamente en las células infectadas por estos virus, es decir, en condiciones fisiopatológicas particulares. El sistema de expresión condicional según la invención permite ventajosamente una detección de esta situación fisiológica (la aparición de estos transactivadores específicos de la infección viral) y la inducción de una expresión selectiva de (un) gen (es) dado(s). Entre las proteínas celulares, se pueden citar de manera preferida la proteína p53 mutada o natural. La proteína p53 está constituida de 393 amino ácidos. Bajo su forma natural, la proteina p53 es un supresor de tumores, capaz de regular de forma negativa el crecimiento y la división celular. Esta actividad está ligada a la presencia de un dominio transactivador transcripcional en la estructura de la proteína p53, localizada en la región N-terminal de la proteína (residuos 1-100 aproximadamente) . En ciertas situaciones, la p53 natural es igualmente capaz de inducir la apoptosa (Yonish-Rouach et al., Nature, 352, 345-347, 1991) . Estas propiedades se manifiestan en situación de tensión en donde la integridad del ADN celular está amenazada, y se ha sugerido que p53 es un "guardián del genoma". La presencia de p53 mutadas en aproximadamente 40 % de los tumores humanos, todos tipos confundidos, refuerza esta hipótesis y recalca el papel probablemente crucial que desempeñan las mutaciones de este gen en el desarrollo tumoral (para revisiones, ver Montenarh, Oncogene, 7, 1673-1680, 1992; Oren, FASEB J., 6, 3169-3176, 1992; Zambetti and Levine, FASEB J., 7, 855-865, 1993). En el marco de la presente invención, es posible encontrar selectivamente el dominio transactivador de la proteína p53, y así inducir la expresión controlada de gen (es) únicamente en las células que contienen esta proteína. Es particularmente interesante según la invención encontrar específicamente las formas mutadas de la proteína p53 que, como se indicó anteriormente, aparecen en situaciones fisiopatológicas de hiperproliferación celular (tipo cáncer) . Esta selectividad de dirección puede ser realizada de preferencia por medio de un dominio de unión específica a las formas mutadas de la proteína p53. Existe sin embargo una especificidad de hecho unida a la acumulación de las formas mutadas que poseen una vida media muy superior a la forma natural. El sistema de la invención puede igualmente ser utilizada para inducir la expresión selectiva de gen (es) para la detección de cualquier molécula objetivo presente en una célula. La proteína detectada es preferiblemente una proteína que aparece en una célula en situaciones anormales (infección, hiperproliferación, etc.). Puede tratarse en particular de proteínas virales tales como proteínas de estructura o de función de un virus, y particularmente del virus VIH, hepatitis, herpes, etc. Puede tratarse igualmente de proteínas específicas de un estado de hiperproliferación celular, tales como particularmente las proteínas myc, fos, jun, las ciclinas, etc. Una de las propiedades de las moléculas quiméricas de la invención reside así en su capacidad de unirse a regiones específicas de ADN (regiones reguladoras u operadoras) . Esta unión permite traer el dominio transactivador a la proximidad del promotor, y con esto activar la expresión de un gen colocado bajo el control del promotor. El dominio capaz de unirse selectivamente a una secuencia definida de ADN presente en las moléculas de la invención es esencialmente de origen proteico. Más preferiblemente, este dominio se deriva de una proteína procariótica o eucariótica capaz de interaccionar con secuencias de ADN. Numerosos estudios genéticos y estructurales han permitido hoy definir precisamente, dentro de las proteínas que interaccionan con secuencias de ADN de' doble hebra, los dominios responsables de estas interacciones. Entre las proteínas procarióticas que interactúan con secuencias de ADN de doble hebra, se pueden citar particularmente los represores bacterianos y, preferiblemente, el represor de tetraciclina de E. coli y el represor Cro del bacteriófago Lambda. El represor de tetraciclina (tetR) de E. coli es una proteina de 210 amino ácidos aproximadamente. En E. coli, tetR controla negativamente la transcripción de genes mediante la resistencia a este antibiótico dentro del operon tet. En ausencia de tetraciclina, el represor tetR se fija al ADN al nivel de una secuencia especifica (designada secuencia operadora o Tetop) , y reprime la transcripción del gen de resistencia. Por el contrario, en presencia de tetraciclina, el represor tetR ya no se fija al operador tetop, permitiendo una transcripción constitutiva del gen (Hillen W. y eissmann, A. (1989) en Protein-Nucleic Acid Interaction. Topics in Molecular and Structural Biology, editores: Saenger, . Y Heinemann, U.

(Macmillan, Londres), Vol. 10, páginas 143-162). La secuencia de tetR ha sido publicada (se reproduce particularmente en O94/04682) . La secuencia de ADN de doble hebra especifica de unión de tetR al ADN (Tetop) está compuesta del motivo siguiente: TCTCTATCACTGATAGGGA (SEQ ID no. 1) . Este motivo puede ser repetido varias veces, para aumentar la afinidad y la eficacia del sistema. Asi, la secuencia reguladora puede comprender hasta 10 motivos, y de preferencia, contiene 2 motivos (Tetop2) o 7 motivos (Tetop7) (ver la Figura 3) . La proteína Cro ha sido definida en el inicio como un regulador de la expresión del represor Cl (Eisen, H. et al. (1970) PNAS 66, página 855) . El clonado del gen Cro ha permitido la identificación de una proteína de 66 amino ácidos (SEQ ID No. 21; Roberts, T. et al., (1977) Nature 270, página 274) . Cro ejerce su papel fisiológico fijándose de preferencia al operador OR3 de Lambda. La secuencia de ADN de doble hebra específica de unión de Cro al ADN (región designada OR3) está compuesta de las bases siguientes: TATCACCGCAAGGGATA (SEQ ID No. 2) Esta región puede igualmente estar repetida varias veces, para aumentar la afinidad y la eficacia del sistema (ver la Figura 4) . Entre las proteínas eucarióticas que interactúan con secuencias de ADN de doble hebra, se prefiere utilizar para la construcción de las moléculas de la invención las proteínas o dominios derivadas de las proteínas STAT, p53 o NFkB (Inoue et al., PNAS 89 4333 (1992)). En relación a la proteína p53, su dominio de unión al ADN está localizado en la región central de la proteína y, más precisamente, en la región comprendida entre los amino ácidos 102 a 292 (Pavlevich et al., Genes & Dev. 7, 2556 (1993)). Como se indicó anteriormente, el dominio capaz de unirse selectivamente a una secuencia definida de ADN presente en las moléculas de la invención preferiblemente se deriva de una proteína procariótica o eucariótica capaz de interaccionar con una región del ADN de doble hebra. El dominio utilizado para la construcción de las moléculas de la invención puede estar constituido del conjunto de la proteína o de un fragmento de ésta que comprende la región de interacción con el ADN. Este dominio ha sido identificado para diferentes proteínas, y particularmente para TetR (ver por ejemplo Berens et al., J. Biol. Chem. 267 1945 (1992)). Puede estar constituida igualmente de un derivado de esta proteína, o del fragmento que haya conservado las propiedades de unión al ADN. Tales derivados son particularmente proteínas que presentan modificaciones de uno o varios amino ácidos, por ejemplo para permitir su fusión con los otros dominios de las moléculas de la invención, preparadas según las técnicas clásicas de la biología molecular. Los derivados de las proteínas TetR y Cro por ejemplo han sido descritos en la literatura, que poseen mutaciones puntuales y/o supresiones (Hecht et al., J. Bact. 175 página 1206 (1993); Altschmied et al., EMBO J. 7 4011 (1988); Baumeister et al., Proteins 14 168 (1992); Hansen et al., J. Biol. Chem. 262 14030 (1987)). La capacidad de unión de estos derivados a una secuencia definida de ADN puede ser probada a continuación por incubación del derivado preparado con la secuencia reguladora y detección de los complejos formados. Además, los derivados pueden igualmente ser proteínas que tienen propiedades mejoradas de unión al ADN (especificidad, afinidad, etc. ) . Según un modo preferido de aplicación, el dominio capaz de unirse selectivamente a una secuencia definida de ADN presente en las moléculas de la invención se deriva de una proteína procariótica. Este tipo de construcción es particularmente ventajoso, puesto que estas proteínas, de origen no humano, reconocen sitios del ADN de doble hebra de al menos 14 nucleótidos. La probabilidad de encontrar la misma secuencia dentro del genoma humano es casi nula, y asi, el sistema de expresión obtenido es otro tanto más selectivo.

En un modo de realización preferido, el dominio capaz de unirse selectivamente a una secuencia definida de ADN presente en las moléculas de la invención se deriva de las proteínas tetR o Cro. Es muy particularmente ventajoso utilizar las proteínas tetR o Cro (SEQ ID No. 21) completas . El dominio capaz de unirse específicamente al transactivador transcripcional o al complejo transactivador transcripcional presente en las moléculas de la invención puede ser de diferentes tipos. Puede tratarse en particular de un dominio de oligomerización en el caso en donde el transactivador o el complejo transactivador dirigido comprenda igualmente tal dominio. Puede tratarse igualmente de cualquier dominio sintético o natural conocido por interaccionar con el transactivador o complejo transactivador. Puede aún tratarse de un anticuerpo o de un fragmento o derivado de un anticuerpo dirigido contra el transactivador o complejo transactivador. Entre los dominios de oligomerización utilizables en el marco de la invención se pueden citar más particularmente las leucina-cremalleras, los dominios SH2 o los dominios SH3 por ejemplo. Las leucina-cremalleras son hélices a amfipáticas que contienen 4 o 5 leucinas cada 7 amino ácidos. Esta periodicidad permite la localización de las leucinas aproximadamente en la misma posición sobre la hélice a. La dimerización es sub tensada por las interacciones hidrófobas entre las cadenas laterales de las leucinas de dos dominios cremallera contiguos (Vogt et al., Trends in Bioche ical Science 14 172 (1989) ) . Los dominios SH2 son conocidos por interaccionar con secuencias peptídicas específicas fosforiladas en tirosna. Los dominios SH3 pueden ser utilizados para formar un oligómero con cualquier transactivador o complejo transactivador que comprenda el péptido rico en prolina correspondiente (Pa son et al., Current Biology 3 434 (1993)). Se pueden utilizar igualmente regiones de proteínas conocidas por inducir una oligomerización, tales como particularmente la región C-terminal de la proteína p53. La utilización de esta región permite encontrar de manera selectiva las proteínas p53 presentes en una célula. Se utiliza de preferencia en el marco de la invención una región de p53 comprendida entre los amino ácidos 320-393 (SEQ ID No. 3), 302-360 o 302-390) . Entre los dominios sintéticos o naturales conocidos por interaccionar con la molécula que comprende el elemento transactivador dirigido, se pueden citar por ejemplo la región de la proteína MDM2 que interacciona con la proteína p53. Este tipo de construcción permite así encontrar como transactivador la proteína p53 natural o mutada. Un dominio de unión especifico al transactivador transcripcional preferido de la invención está constituido por un anticuerpo o un fragmento o derivado de anticuerpo. Los fragmentos o derivados de anticuerpos son por ejemplo los fragmentos Fab o F(ab)2, las regiones VH o VL de un anticuerpo, o aún anticuerpos de cadena simple (ScFv) que comprenden una región VH unida a una región VL por un brazo. Este tipo de dominio es particularmente ventajoso, puesto que puede ser dirigido contra cualquier molécula. Los anticuerpos, moléculas de la superfamilia de las inmunoglobulinas, están constituidos de diferentes cadenas (2 pesadas (H) y 2 ligeras (L) ) , ellas mismas compuestas de diferentes dominios (dominio variable (V) , dominio de unión (J) , etc.). El dominio de unión al transactivador o complejo transactivador presente en las moléculas de la invención está constituido ventajosamente de un fragmento o derivado de anticuerpo que comprende al menos el sitio de unión del antígeno. Este fragmento puede ser ya sea el dominio variable de una cadena ligera (VL) o pesada (VH) , eventualmente bajo la forma de fragmento Fab o F(ab)2 o, de preferencia, bajo la forma de anticuerpos de cadena simple (ScFv) . Los anticuerpos de cadena simple utilizados para la construcción de las moléculas de la invención están constituidos de un péptido correspondiente al sitio de unión de la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo unido por un brazo peptídico a un péptido correspondiente al sitio de unión de la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo. La construcción de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para tales anticuerpos modificados según la invención ha sido descrita por ejemplo en la patente US4,946,778 o en las solicitudes WO94/02610, W094/29446. La construcción está ilustrada en los ejemplos. Una construcción preferida según la presente invención comprende un dominio de unión a una proteína p53. Se trata más preferiblemente de un derivado de anticuerpo dirigido contra una proteina p53. Un modo de realización particular está constituido por un anticuerpo de cadena simple dirigido contra p53. A título de ejemplo particular, se utiliza el ScFv de secuencia SEQ ID No. 4, cuya construcción está descrita en los ejemplos. El dominio de unión al ADN y el dominio de unión al transactivador están por lo general unidos entre ellos por intermedio de un brazo. Este brazo está por lo general constituido de un péptido que el confiere una flexibilidad suficiente para que los dos dominios de las moléculas de la invención puedan ser funcionales de manera autónoma. Este péptido está compuesto por lo general de amino ácidos no cargados, que no interfieren con la actividad de las moléculas de la invención, tales como por ejemplo la glicina, la serina, el triptofano, la lisina o la prolina. El brazo comprende por lo general de 5 a 30 amino ácidos y, de preferencia, de 5 a 20 amino ácidos. Los ejemplos de brazos peptídicos utilizables para la construcción de las moléculas de la invención son por ejemplo - GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID No. 5) - PKPSTPPGSS (seq id No. 6) cuya secuencia codificante es CCCAAGCCCAGTACCCCCCCAGGTTCTTCA (SEQ ID No. 6) . Los ejemplos preferidos de molécula según la invención son particularmente las moléculas siguientes: a) ScFv-tag-Bisagra-TET o -Cro (Figura 5A) Este tipo de molécula comprende: - un dominio de unión a un transactivador constituido de un anticuerpo de cadena simple. una secuencia peptídica tag reconocida por un anticuerpo monoclonal que permite la detección inmunológica de la molécula. Esta secuencia puede ser por ejemplo el epitope VSV de secuencia MNRLGK (SEQ ID No. 7) cuya secuencia codificante es ATGAACCGGCTGGGCAAG (SEQ ID No. 7), o el epitope myc de secuencia EQKLISEEDLN (SEQ ID No. 8) cuya secuencia codificante es: GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAAT (SEQ ID No. 8), reconocida por el anticuerpo 9E10. - un brazo peptidico de secuencia SEQ ID No. 6 (Bisagra) y - un dominio de unión al ADN, constituido de la proteina TET o Cro. De preferencia, el ScFv se dirige contra una proteina p53. b) ScFv-Bisagra-TET o Cro (Figura 5B) Este tipo de molécula comprende los mismos elementos que la molécula a) , con la excepción de la secuencia tag que está ausente c) ScFv-TET o Cro (Figura 5C) Este tipo de molécula comprende simplemente un dominio de unión a un transactivador, constituido de un anticuerpo de cadena simple, y un dominio de unión al ADN, constituido de la proteína TET o Cro. No comprende ni brazo, ni secuencia tag. En esta construcción, el dominio de unión al transactivador está localizado en la parte N-terminal de la molécula, y el dominio de unión al ADN en la parte C-terminal. d) TET o Cro-ScFv (Figura 5D) Este tipo de molécula es similar al tipo c) mencionado anteriormente. La diferencia reside esencialmente en la disposición de los dominios: el dominio de unión al transactivador está ahora localizado en la parte C-terminal de la molécula, y el dominio de unión al ADN en la parte N-terminal. e) TET o Cro-Bisagra-ScFv (Figura 5E) Este tipo de molécula comprende los mismos elementos que la molécula b) mencionada anteriormente. La diferencia reside esencialmente en la disposición de los dominios: el dominio de unión al transactivador está ahora localizado en la parte C-terminal de la molécula, y el dominio de unión al ADN en la parte N-terminal. f) Oligom-tag-Bisagra-TET o Cro (Figura 5A) Este tipo de molécula es semejante al tipo a), con la excepción del dominio de unión al transactivador, que es reemplazado por el dominio de oligomerización de la proteína p53, de secuencia SEQ ID No. 3. Esta molécula permite encontrar las proteínas p53 mutadas que aparecen en las células tumorales. g) Oligom-Bisagra-TET o Cro (Figura 5B) Este tipo de molécula es semejante al tipo b) , con la excepción del dominio de unión al transactivador, que es reemplazado por el dominio de oligomerización de la proteína p53, de secuencia SEQ ID No. 3. h) Oligom-TET o Cro (Figura 5C) Este tipo de molécula es semejante al tipo c) , con la excepción del dominio de unión al transactivador, que es reemplazado por el dominio de oligomerización de la proteina p53, de secuencia SEQ ID No. 3. i) TET o Cro-Oligom (Figura 5D) Este tipo de molécula es semejante al tipo d) , con la excepción del dominio de unión al transactivador, que es reemplazado por el dominio de oligomerización e la proteína p53, de secuencia SEQ ID No. 3. j) TET o Cro-Bisagra-Oligom (Figura 5E) Este tipo de molécula es semejante al tipo e) , con la excepción del dominio de unión al transactivador, que es reemplazado por el dominio de oligomerización e la proteína p53, de secuencia SEQ ID No. 3. Por otro lado, en cada una de estas moléculas, el brazo peptídico puede ser fácilmente reemplazado por la secuencia (G4S)3(SEQ ID No.5). Otro objeto de la presente invención reside en una secuencia de ácido nucleico que codifica para una molécula quimérica tal como la definida anteriormente. Se trata ventajosamente de una secuencia de ADN, particularmente de ADNc. Puede tratarse igualmente de un ARN. Las secuencias de la invención están construidas por lo general por ensamblado o montaje, dentro de un vector de clonado, de las secuencias que codifican para los diferentes dominios según las técnicas clásicas de la biología molecular. Las secuencias de ácidos nucleicos de la invención pueden eventualmente ser modificadas por vía química, enzimática o genética, con el objeto de generar dominios estabilizados, y/o multifuncionales, y/o de tamaño reducido, y/o con el fin de favorecer su localización en tal o tal compartimento intracelular. Asi las secuencias de ácidos nucleicos de la invención pueden comprender secuencias' que codifican para péptidos de localización nuclear (NLS) . En particular, es posible fusionar las secuencias de la invención con la secuencia que codifica para la NLS del virus SV40, cuya secuencia peptídica es la siguiente: PKKKRKV (SEQ ID No. 9) (Kalderon et al., Cell 39 499 (1984)). Las secuencias nucleicas según la invención forman parte ventajosamente de un vector de expresión, que puede ser de naturaleza plasmídica o viral. Otro objeto de la presente invención reside en una proteína de fusión que comprende un dominio transactivador transcripcional y un dominio de unión específica a una molécula dada, eventualmente unidos por un brazo peptidico, asi como cualquier secuencia de ácido nucleico que codifica par tal fusión. El dominio transactivador puede ser procedente de cualquier proteina transactivadora transcripcional, tal como p53, VP16, EBNA, E6/E7, Tat, etc. Otro objeto de la invención consiste en un sistema condicional de expresión de genes, que comprende: una molécula quimérica tal como la definida anteriormente, y - un cásete de expresión que comprende una secuencia reguladora, un promotor transcripcional mínimo y el gen. El cásete de expresión contiene los elementos necesarios para la activación de la expresión del gen por el transactivador o complejo transactivador encontrado por la molécula biespecifica. Así, la secuencia reguladora es la secuencia de unión al ADN de la molécula quimérica expresada. Cuando el dominio de unión al ADN de la molécula quimérica está representado por todo o parte de TetR, la secuencia reguladora comprende la secuencia SEQ ID No. l o un derivado de ella, eventualmente repetida varias veces. Se trata de preferencia de la secuencia Op2 (que comprende 2 motivos Tetop repetidos) u Op7 (que comprende 7 motivos Tetop repetidos tales como los descritos por ejemplo en einmann et al., The Plant Journal 5 559 (1994)). Del mismo modo, cuando el dominio de unión al ADN de la molécula quimérica está representada por todo o parte de Cro, la secuencia reguladora comprende la secuencia SEQ ID No. 2 o un derivado de ella, eventualmente repetida varias veces. Se trata de preferencia de la secuencia 0R3. Los derivados de las secuencias SEQ ID No. 1 y 2 pueden ser cualquier secuencia obtenida por modificación de naturaleza genética (mutación, supresión, adición, repetición, etc.) y que conservan la capacidad de unirse específicamente a una proteína. Tales derivados han sido descritos en la literatura (Baumeister et al., citado previamente, Tovar et al., Mol. Gen. Genet. 215 76 (1988), WO94/04672) . Con relación al promotor transcripcional minimo, se trata de un promotor cuya actividad depende de la presencia de un transactivador. Por esto, en la ausencia de la molécula quimérica, el promotor es inactivo, y el gen no se expresa, o se expresa poco. En cambio, en presencia de la molécula quimérica, el transactivador o complejo transactivador encontrado permite inducir la actividad del promotor mínimo, y así la expresión del gen de interés. El promotor mínimo está constituido por lo general de una cavidad TATA o INR. Estos elementos son en efecto los elementos mínimos necesarios para la expresión de un gen en presencia de un transactivador. El promotor mínimo puede ser preparado a partir de cualquier promotor, por modificación genética. A título de ejemplo preferido de promotor candidato se puede citar el promotor del gen de la timidina cinasa. Se han obtenido más precisamente resultados interesantes, con un promotor minimo que se deriva del promotor TK, compuesto de los nucleótidos -37 a +19. El promotor minimo puede igualmente derivarse del CMV humano. En particular, puede estar constituido del fragmento comprendido entre los nucleótidos -53 a +75 o -31 a +75 del CMV. Cualquier promotor convencional puede sin embargo ser utilizado, tal como por ejemplo el promotor de los genes que codifican para la cloranfenicol acetil transferasa, la ß-galactosidasa o aún la luciferasa. El cásete de expresión está ventajosamente constituido de los elementos siguientes: - Como secuencia reguladora, una secuencia que comprende la secuencia SEQ ID No. 1 o la 2, o un derivado de ellas, eventualmente repetida varias veces, Como promotor minimo, un promotor derivado del promotor del gen de la timidina cinasa (TK) , - una secuencia codificante de interés. Aún más preferiblemente, el promotor mínimo está constituido de la región -37 a +19 del promotor del gen de la timidina cinasa.

Ventajosamente, el cásete de expresión se selecciona entre los casetes de estructura Tetop2.TK-Géne; Tetop7.TK-Géne y 0R3. K-Géne. Otro aspecto de la invención reside en un vector de expresión que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una molécula quimérica, y un cásete de expresión tales como los definidos anteriormente. En los vectores de la invención, la secuencia de ácidos nucleicos que codifican para la molécula quimérica y el cásete de expresión pueden ser insertados en la misma orientación, o en orientaciones opuestas. Por otro lado, el vector puede ser de naturaleza plasmídica o viral. Entre los vectores virales, se pueden citar más preferiblemente los adenovirus, los retrovirus, los virus del herpes o aún los virus adeno asociados. Los virus según la presente invención son defectivos, es decir, incapaces de replicarse de manera autónoma en la célula objetivo. Por lo general, el genoma de los virus defectivos utilizados en el marco de la presente invención está pues desprovisto al menos de las secuencias necesarias para la replicación del virus en la célula infectada. Estas regiones pueden ser ya sea eliminadas (todas o en parte) , ya sea vueltas no funcionales, ya sea substituidas por otras secuencias, y particularmente por las secuencias de la invención. De preferencia, el virus defectivo conserva sin embargo las secuencias de su genoma que son necesarias para la encapsidación de las partículas virales. Se trata más particularmente de adenovirus, de diferentes serotipos, cuya estructura y las propiedades varían un poco, que han sido caracterizados. Entre estos serotipos, se prefiere utilizar en el marco de la presente invención los adenovirus humanos de tipo 2 o 5 (Ad 2 o Ad5) , o los adenovirus de origen animal (ver la solicitud W094/26914) . Entre los adenovirus de origen animal utilizables en el marco de la presente invención se pueden citar los adenovirus de origen canino, bovino, murino (ejemplo: Mavl, Beard et al., Virology 75 81 (1990)), ovino, porcino, aviar o aún simiesco (ejemplo: SAV) . De preferencia, el adenovirus de origen animal es un adenovirus canino, más preferiblemente un adenovirus CAV2 [cepa Manhattan o A26/61 (ATCC VR-800) por ejemplo] . De preferencia, se utilizan en el marco de la invención adenovirus de origen humano o canino o mixto. De preferencia, el genoma de los adenovirus recombinantes de la invención comprende al menos los ITR y la región de encapsidación de un adenovirus, y la secuencia de ácidos nucleicos que codifican para una molécula quimérica y un cásete de expresión tales como los definidos anteriormente. Más preferiblemente, en el genoma de los virus de la invención, la región El al menos es no funcional. El gen viral considerado puede ser vuelto no funcional por cualquier técnica conocida por el experto en la técnica, y particularmente por supresión total, substitución (por ejemplo por las secuencias de la invención) , supresión parcial, o adición de una o varias bases en el o los genes considerados. Tales modificaciones pueden ser obtenidas in vitro (sobre ADN aislado) o in situ, por ejemplo, por medio de técnicas de ingeniería genética, o aún por tratamiento por medio de agentes mutagénicos. Otras regiones pueden igualmente ser modificadas, y particularmente la región E3 (WO 95/02697), E2 (WO 94/28938), E4 (WO 94/28152, WO 94/12649, WO 95/02697) y L5 (WO 95/02697) . Según un modo preferido de aplicación, el adenovirus según la invención comprende una supresión de las regiones El y E4. Según otro modo de realización preferido, comprende una supresión en la región El al nivel de la cual se insertan la región E4 y las secuencias de la invención (Comparar FR 94 13355) . Los adenovirus recombinantes defectivos según la invención pueden ser preparados por cualquier técnica conocida por el experto en la técnica (Levrero et al., Gene 101 195 (1991), EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 2917 (1984)), En particular, pueden ser preparados por recombinación homologa entre un adenovirus y un plásmido que llevan entre otras las secuencias de ADN de la invención (secuencia que codifica para la molécula quimérica + el cásete de expresión) . La recombinación homologa se produce después de la co-transfección de los adenovirus y plásmido en una línea celular apropiada. La linea celular utilizada de preferencia debe (i) ser transformable por los elementos, y (ii) llevar las secuencias capaces de complementar la parte del genoma del adenovirus defectivo, de preferencia bajo la forma integrada, para evitar los riesgos de recombinación. A título de ejemplo de línea, se puede mencionar la linea de reina embrionaria humana 293 (Graham et al., J. Gen. Virol., 36 59 (1977)) que contiene particularmente, integrada en su genoma, la parte izquierda del genoma de un adenovirus Ad5 (12 %), o lineas capaces de complementar las funciones El y E4 tales como las descritas particularmente en las solicitudes Nos. WO 94/26914 y WO 95/02697. En seguida, se recuperan los adenovirus que se multiplican, y se purifican según las técnicas clásicas de biología molecular, como se ilustra en los ejemplos. Con relación a los virus adeno-asociados (AAV) , se trata de virus con ADN de tamaño relativamente reducido, que se integran en el genoma de las células que infectan, de manera estable y sitio-específica. Son capaces de infectar un gran espectro de células, sin inducir un efecto sobre el crecimiento, la morfología o la diferenciación celular. Por otro lado, no parecen estar implicados en las patologías del hombre. El genoma de los AAV ha sido clonado, se les ha determinado la secuencia, y caracterizado. Comprende aproximadamente 4700 bases, y contiene en cada extremo una región repetida invertida (ITR) de 145 bases aproximadamente, que sirven de origen de replicación para el virus. El resto del genoma está dividido en 2 regiones esenciales, que llevan las funciones de encapsidación: la parte izquierda del genoma, que contiene el gen rep implicado en la replicación viral y la expresión de los genes virales; la parte derecha del genoma, que contiene el gen cap que codifica para las proteínas de la cápside del virus. La utilización de vectores derivados de los AAV para la transferencia de genes in vitro e in vivo ha sido descrita en la literatura (ver particularmente WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528). Estas patentes describen diferentes construcciones derivadas de los AAV, en las cuales los genes rep y/o cap son suprimidos y reemplazados por un gen de interés, y su utilización para transferir in vitro (sobre células en cultivo) o in vivo (directamente en un organismo) el gen de interés. Los AAV recombinantes defectivos según la invención pueden ser preparados por co-transfección, en una linea celular infectada por un virus auxiliar humano (por ejemplo un adenovirus) , de un plásmido que contiene las secuencias nucleicas de la invención (secuencia que codifica para la molécula quimérica + cásete de expresión) bordeada de dos regiones repetidas invertidas (ITR) del AAV, y de un plásmido que lleva los genes de encapsidación (genes rep o cat) del AAV. Los AAV recombinantes producidos son purificados luego por técnicas clásicas. Con relación a los virus del herpes y los retrovirus, la construcción de vectores recombinantes ha sido ampliamente descrita en la literatura: ver particularmente Breakfield et al., En Biologist 3 203 (1991); EP 45342, EP 178220, Berntein et al., Genet. Eng. 7 235 (1985); McCormick, BioTechnology 3 689 (1985), etc.). En particular, los retrovirus son virus integrativos, que infectan selectivamente las células en división. Constituyen así vectores de interés para aplicaciones en cáncer. El genoma de los retrovirus comprende esencialmente dos LTR, una secuencia de encapsidación y tres regiones codificantes (gag, pol y env) . En los vectores recombinantes derivados de os retrovirus, los genes gag, pol y env son por lo general suprimidos, todos o en parte, y reemplazados por una secuencia de ácido nucleico heterólogo de interés. Estos vectores pueden ser realizados a partir de diferentes tipos de retrovirus tales como particularmente el MoMuLV "Virus de la Leucemia de Moloney Murino"; designado MoMLV) , el MSV ("Virus del Sarcoma de Moloney Murino") , el HaSV ("Virus del Sarcoma de Harvey") ; el SNV (Virus de la Necrosis del bazo") ; el RSV ("Virus del Sarcoma de Rous") o aún el virus de Friend. Para construir los retrovirus recombinantes según la invención, un plásmido que comprende particularmente los LTR, la secuencia de encapsidación, y las secuencias de la invención (secuencia que codifica para la molécula quimérica + el cásete de expresión) es construido por lo general, y después utilizado para transfectar una línea celular llamada de encapsidación, capaz de aportar en trans las funciones retrovirales deficientes en el plásmido. Por lo general, las líneas de encapsidación son pues capaces de expresar los genes gag, pol y env. Tales lineas de encapsidación han sido descritas en la técnica anterior, y particularmente la linea PA317 (US 4,861,719); la línea PsiCRIP (WO 90/02806) y la línea GP + envAm-12 (WO 89/07150) . Por otro lado, los retrovirus recombinantes pueden llevar modificaciones a nivel de los LTR para suprimir la actividad transcripcional, así como secuencias de encapsidación extendidas, que llevan una parte del gen gag (Bender et al., J. Virol. 61 1639 (1987). Los retrovirus recombinantes producidos se purifican luego por técnicas clásicas. Un ejemplo de construcción de un virus recombinante defectivo según la invención (retrovirus) está descrito en la Figura 8. Esta figura subraya una segunda ventaja de las construcciones según la invención, que reside en la ausencia de expresión del gen de interés en las lineas de encapsidación. Estas líneas están desprovistas del transactivador o complejo transactivador encontrado por ele sistema de la invención, el promotor está inactivo, y el gen no se expresa en la célula de producción (Figura 8A) . No es que cuando el virus ha infectado efectivamente una célula objetivo, es decir una célula en la cual está presente el transactivador o complejo transactivador encontrado por el sistema de la invención, que el gen es efectivamente expresado (Figura 8B) . Esto es particularmente ventajoso para la construcción de virus que contienen genes cuya expresión sería tóxica para las células (genes Grb3-3, IL-2, Toxina diftérica, etc.). Para la aplicación de la presente invención, es particularmente muy ventajoso utilizar un adenovirus o un retrovirus recombinante defectivo. Estos vectores poseen en efecto propiedades paticularmente interesantes para la transferencia de genes a las células tumorales. Pueden igualmente ser utilizados diferentes tipos de vectores no virales en el marco de la invención. El sistema de expresión condicional según la invención puede en efecto ser incorporado en un agente no viral, capaz de promover la transferencia y la expresión de ácidos nucleicos en las células eucarióticas. Los vectores químicos o bioquímicos representan una alternativa interesante a los virus naturales, en particular por razones de comodidad, de seguridad e igualmente por la ausencia de límite teórico en lo que concierne al tamaño del ADN a transfectar. Estos vectores sintéticos tienen dos funciones principales, compactar el ácido nucleico a transfectar y promover su fijación celular, asi como su paso a través de la membrana plasmática y, siendo el caso, las dos membranas nucleares. Para paliar a la naturaleza polianiónica de los ácidos nucleicos, los vectores no virales poseen todos cargas policatiónicas. Entre los vectores sintéticos desarrollados, los polímeros catiónicos de tipo polilisina, (LKLK)n, (LKKL)n, polietilen imina y DEAE dextran o aún los lípidos catiónicos o lipofectantes son los más ventajosos. Poseen la propiedad de condensar el ADN, y de promover su asociación con la membrana celular. Entre estos últimos, se pueden citar las lipopoliaminas (lipofectamina, transfectam, etc.) y diferentes lípidos catiónicos o neutros (DOTMA, DOGS, DOPE, etc.). Más recientemente, se ha desarrollado el concepto de la transfección dirigida, mediada por un receptor, que aprovecha el principio de condensar el ADN gracias al polímero catiónico mientras dirige la fijación del complejo a la membrana gracias a un acoplamiento químico entre el polímero catiónico y el ligando de un receptor de membrana, presente en la superficie de tipo celular que se desea incorporar. La dirección del receptor a la transferrina, a la insulina o del receptor de las asialoglicoproteínas de los hepatocitos también ha sido descrita. La presente invención tiene igualmente por objeto cualquier composición farmacéutica que comprende un vector tal como el definido anteriormente. Estas composiciones pueden ser formuladas con objeto de una administración por vía tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraocular, etc. De preferencia, la composición según la invención contiene vehículos farmacéuticamente aceptables para una formulación inyectable. Puede tratarse en particular de soluciones salinas (fosfato monosódico, disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio, etc, o de mezclas de tales sales) , estériles, isotónicas, o de composiciones secas, particularmente liofilizadas, las cuales, por adición según el caso de agua esterilizada o de suero fisiológico, permiten la constitución de soluciones inyectables. Tratándose de retrovirus, puede ser ventajoso utilizar directamente las células de encapsidación o células infectadas ex vivo con objeto de su reimplantación in vivo, eventualmente bajo la forma de neo-órganos (WO 94/24298) . Las dosis de vector utilizadas para la inyección pueden ser adaptadas en función de diferentes parámetros, y particularmente en función del modo de administración utilizado, de la patología concernida o aún de la duración del tratamiento buscado. De una manera general, los virus recombinantes según la invención se formulan y administran bajo la forma de dosis comprendidas entre 104 y 1014 ufp/ml. Para los AAV y los adenovirus, pueden ser utilizadas igualmente dosis de 106 a 1010 ufp/ml. El término ufp ("unidad formadora de placa") corresponde al poder infeccioso de una suspensión de viriones, y se determina por infección de un cultivo celular apropiado, y medición, por lo general después de 48 horas, del número de placas de células infectadas. Las técnicas de determinación del 'título de ufp de una suspensión viral están bien documentadas en la literatura. El sistema de expresión según la invención y los vectores correspondientes son particularmente útiles para controlar la expresión de genes de interés en el marco de las terapias celular o génica. Pueden así ser utilizados para controlar la expresión de cualquier secuencia codificante de interés, y particularmente de una secuencia que codifica para un producto terapéutico, ya sea que se trate de un péptido, polipéptido, proteina, ácido ribonucleico, etc. Más particularmente, el gen es una secuencia de ADN (ADNc, ADNg, ADN sintético, humano, animal, vegetal, etc.) que codifica para un producto proteico tal como enzimas, los derivados sanguíneos, las hormonas, las linfoquinas: interleucinas, interferones, TNF, etc (FR 9203120), los factores de crecimiento, los neurotransmisores o sus precursores, o enzimas de síntesis, los factores tróficos: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc.; las apolipoproteinas : ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc. (FR 93 05125), la distrofina o una minidistrofina (FR 9111947), los genes supresores de tumores: p53, Rb, RaplA, DCC, J-rev, etc. (FR 93 04745), los genes que codifican para factores implicados en la coagulación: Factores VII, VIII, IX, etc., o aún toda o parte de una inmunoglobulina natural o artificial (Fab, ScFv, etc.), un ARN ligando (WO 91/19813), etc. El gen de interés puede igualmente ser una secuencia de antisentido, cuya expresión en la célula objetivo permite controlar la expresión de genes o la transcripción de ARNm celulares. Tales secuencias pueden por ejemplo ser transcritas, en la célula objetivo, en ARN' s complementarios de ARNm' s celulares, y bloquear así su traducción el proteína, según la técnica descrita en la patente EP 140 308. La presente invención está particularmente adaptada a la expresión de secuencias que codifican para factores tóxicos. Puede tratarse en particular de venenos para las células (toxina diftérica, toxina de pseudomonas, ricina A, etc.), de un producto que induzca una sensibilidad a un agente externo (genes suicidas: Timidina cinasa, citosina desaminasa, etc.) o aún de genes asesinos, capaces de inducir la muerte celular (Grb3-3 (PCT/FR94/00542) , ScFv anti-ras (W094/29446) , etc.). El sistema de la invención permite en efecto producir vectores particularmente virales que contienen secuencias sin toxicidad para las células de producción, y después inducir la expresión de estas moléculas tóxicas selectivamente en las células objetivo que presentan el transactivador o complejo transactivador deseado. Este tipo de construcción está pues particularmente adaptado a estrategias de terapia antitumorales por ejemplo, en las cuales el objetivo es destruir selectivamente las células afectadas. Este sistema es igualmente particularmente interesante para la expresión de citocinas, interferones, TNF o TGF por ejemplo, cuya producción no controlada puede tener efectos secundarios muy marcados . La presente solicitud será descrita más en detalle con la ayuda de los ejemplos que siguen, que deben ser considerados como ilustrativos y no limitantes. Texto de las Figuras Figura 1 : Representación del sistema de expresión condicional según la invención que permite el encuentro selectivo de u transactivador por medio de un dominio de oligomerización (A) o de un ScFv (B) . Figura 2 : Representación del sistema de expresión condicional según la invención que permite el encuentro selectivo de un complejo transactivador. Figura 3: Representación de un cásete de expresión según la invención que lleva una secuencia reguladora Tetop7, un promotor minimo (cavidad TATA) y un gen (CAT) .

Figura 4: Representación de un cásete de expresión según la invención que lleva una secuencia reguladora 0R3, un promotor mínimo (cavidad TATA) y un gen (CAT) . Figura 5: Representación de moléculas quiméricas biespecíficas según la invención. Figura 6: Construcción de secuencias de ADN que codifican para moléculas quiméricas biespecíficas según la invención.

Figura 7 : Representación de construcciones quiméricas de control . Figura 8: Estructura y funcionamiento de un vector viral (retrovirus) según la invención. Figura 9: Estudio de la interacción entre las moléculas híbridas de la invención y una secuencia reguladora. Figura 10: Estudio de la interacción entre las moléculas híbridas de la invención y diferentes formas de la proteína p53. Figura 11: Evidencia de la activación del cásete Tet-luc en las células SAOS-2. Figura 12: Evidencia de la activación del cásete Tet-luc en las células H358. Técnicas generales de Biología Molecular Los métodos clásicos de biología molecular, tales como la centrifugación de ADN plasmídico en gradiente de cloruro de cesio-bromuro de etidium, las digestiones por las enzimas de restricción, la electroforesis sobre gel, la transformación en E. coli, la precipitación de los ácidos nucleicos, etc., están descritos en la literatura (Maniatis et al., 1989) . Las enzimas fueron proporcionadas por Ne -England Biolabs (Beverly, MA) . Para las ligaduras, los fragmentos de ADN se separaron según su tamaño sobre geles de agarosa de 0.8 a 1.5 %, purificados por GeneClean (BIO101, LaJolla CA) e incubados de noche a 14° C en una solución amortiguadora Tris-HCl pH 7.4 y 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, en presencia de ADN ligasa del fago T4. La amplificación por PCR, (Reacción en Cadena de Polimerasa), se realizó igualmente según Maniatis et al., 1989, con las especificaciones siguientes: - Concentración en MgCl2 llevada a 8 mM, - Temperatura de desnaturalización 95° C, temperatura de hibridación 55° C, temperatura de alargamiento 72° C. Este ciclo se repitió 25 veces en un Ciclador Térmico PE9600 (Perkin Elmer, Norwalk CO) . Los oligonucleótidos se sintetizaron utilizando la química de las fosforamiditas protegidas en ß por un grupo cianoetilo, (Sinha et al., 1984, Giles 1985), con el sintetizador automático de ADN Applied Biosystem modelo 394, (Aplied Biosystem, Foster City CA) , según las recomendaciones del fabricante. La determinación de la secuencia se efectuó sobre matrices de doble hebra por el método de terminación de cadenas, utilizando cebos fluorescentes. Nosotros utilizamos el estuche de determinación de secuencias Taq Dye Primer Kit de Applied Biosystem (Applied Biosystem, Foster City CA) según las especificaciones del fabricante.

Ejemplos Ejemplo 1: Construcción de casetes de expresión que llevan una secuencia de regulación, un promotor transcripcional mínimo y un gen 1.1 Construcción del plásmido pTETop7/CAT El plásmido pTETop7/CAT contiene los elementos siguientes (Figura 3) : - Una secuencia de regulación, constituida de una secuencia de interacción con el represor tetraciclina tetR compuesto de 7 motivos Tetop (SEQ ID No. 1) repetidos; - un promotor mínimo, derivado del promotor del gen de la timidina cinasa (región -37 a +19 que lleva la cavidad TATA) ; - la secuencia que codifica para la cloranfenicol acetil transferasa (CAT) bajo el control del promotor mínimo .

Este plásmido se construyó por clonado del fragmento Smal-BglII del plásmido pUHD10-7 (WO 94/29442) en el plásmido pKK232-8 (Pharmacia) previamente digerido con Smal y BamHI . 1.2 Construcción del plásmido pOR3/CAT El plásmido pOR3/CAT contiene los elementos siguientes (Figura 4) : - Una secuencia de regulación, constituida de una secuencia 0R3 de interacción con el represor Cro (SEQ ID No . 2) ; - un promotor mínimo, derivado del promotor del gen de la timidina cinasa (región -37 a +19 que lleva la cavidad TATA) ; - la secuencia que codifica para la cloranfenicol acetil transferasa (CAT) bajo el control del promotor mínimo . Este plásmido se construyó de la manera siguiente: La secuencia OR3 de interacción con el represor Cro se sintetizó artificialmente. Para ésto, se sintetizaron los dos oligonucleótidos siguientes: Oligo 5533 (SEQ ID No. 22): 5' -GATCCTATCACCGCAAGGGATAA-3' Oligo 5534 (SEQ ID No. 23): 3' -GATAGTGGCGTTCCCTATTTCGA-5' Estos dos oligonucleótidos se hibridaron en seguida, para reconstituir la secuencia de doble hebra de OR3 bordeada de secuencias que permiten su clonado orientado como sigue: GATCCTATCACCGCAAGGGATAA GATAGTGGCGTTCCCTATTTCGA 1.3 Construcción de casetes de expresión de genes tóxicos Los casetes de expresión de genes tóxicos se obtuvieron a partir de los plásmidos descritos anteriormente (1.1. y 1.2.) por reemplazo de la secuencia CAT por la secuencia que codifica para el producto tóxico, de preferencia el gen Grb3-3 (PCT/FR94/00542) , el gen de la timidina cinasa, el gen que codifica para la toxina diftérica o de pseudomonas, etc. Ejemplo 2: Construcción de un anticuerpo de cadena simple específico de p53 Este anticuerpo de cadena simple se construyó según el protocolo siguiente: - Los cADN que codifican para las regiones VH y VL se obtuvieron a partir del hibrido a pAb421 que produce el anticuerpo anti-p53. Para esto, los ARN totales del hibridoma se extrajeron y se sometieron a una reacción de transcripción inversa, utilizando hexámeros aleatorios como cebos. La utilización de este tipo de cebo permite evitar el empleo de cebos específicos de las inmunoglobulinas. Los clones de ADNc obtenidos tienen una longitud suficiente 4 para clonar las regiones V. Sin embargo, en la medida en donde representan una fracción reducida de los cADN totales presentes, una reacción previa de amplificación debe ser realizada para producir una cantidad suficiente de ADN para la clonación. Para esto, los ADNc que codifican para las regiones VH y VL se amplificaron separadamente. Los cebos utilizados son oligonucleótidos que se hibridan a nivel de los extremos opuestos de las regiones variables de cada cadena (H y L) . El producto de amplificación que usa los cebos específicos de las cadenas pesadas es un fragmento de 340 pares de bases aproximadamente. El producto de amplificación que utiliza los cebos específicos de las cadenas ligeras es un fragmento de 325 pares de bases aproximadamente . - Después de la purificación, los ADNc que codifican para las regiones VH y VL de los anticuerpos se ensamblaron en una cadena única, por medio de un brazo nucleotídico (L) . El brazo nucleotídico se construyó de tal suerte que uno de los extremos se unió al extremo 3' del ADNc que codifica para la región VH y el otro al extremo 5' del ADNc que codifica para la región VL. La secuencia del brazo que codifica para el péptido SEQ ID No. 5. La secuencia ensamblada de 700 pb aproximadamente contiene, bajo la forma de un fragmento Ncol-Notl, el eslabonamiento VH-L-VL cuya secuencia está representada en SEQ ID No. 4 (amino ácidos 9 a 241) . Esta secuencia incluye igualmente en la C-terminal la secuencia tag de myc (residuos 256 a 266) . Ejemplo 3: Construcción de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para moléculas quiméricas biespecíficas que contienen un dominio de unión a un transactivador constituido de un anticuerpo de cadena simple (ScFv) 3.1 Construcción de un plásmido que comprende una secuencia ScFv-myc-Bisagra-TetR o Cro (Figuras 5A y 6) El fragmento Ncol-Motl que contiene el ADNc que codifica para la ScFv anti-p53 se clonó en primer lugar en un plásmido de tipo pUC19. La secuencia que codifica para el epitope VSV (SEQ ID No. 7) o myc (SEQ ID No. 8) se inserta más abajo del fragmento (Figura 6) . Las secuencias que codifican para las proteínas TetR y Cro se obtuvieron en seguida como sigue: - La secuencia que codifica para TetR se obtuvo por amplificación a partir de un plásmido matriz, que lleva la secuencia tetR por medio de los oligonucleótidos siguientes: Oligo 5474 (SEQ ID No. 10) : GGCTCTAGACCCAAGCCCAGTACCCCCCCCAGGTTCTTCAACGCGTGGATCCAT GTCCAGATTAGATAAAAGTAAAG Oligo 5475 (SEQ ID No. 11): CGTACGGAATTCGGGCCCTTACTCGAGGGACCCACTTTCACATTTAAGTTG Estos oligonucleótidos aportan igualmente la secuencia que codifica para el brazo peptídico Bisagra, que une los dos dominios funcionales de la molécula. El fragmento amplificado contiene pues la secuencia que codifica para el brazo peptídico y para el dominio de unión al ADN de tetR. Este fragmento se clonó a los sitios Xbal-EcoRI del plásmido obtenido anteriormente, para generar un plásmido que contiene la secuencia que codifica para la molécula ScFv-myc-Bisagra-TetR (Figura 6) . - La secuencia que codifica para Cro se obtuvo por amplificación sobre una matriz de ADN del bacteriófago Lambda, por medio de los oligonucleótidos siguientes: Oligo 5531 (SEQ ID No. 12): GGCTCTAGACCCAAGCCCAGTACCCCCCCAGGTTCTTCAACGCGTGGATCCATG GAACAACGCATAACCCTGAAAG Oligo 5532 (SEQ ID No. 13) : CGTACGGAATTCGGGCCCTTACTCGAGTGCTGTTGTTTTTTTGTTACTCGG Estos oligonucleótidos aportan igualmente la secuencia que codifica para el brazo peptídico Bisagra que une los dos dominios funcionales de la molécula. El fragmento amplificado contiene pues la secuencia que codifica para el brazo peptídico y para el dominio de unión al ADN de Cro. Este fragmento se clonó a los sitios Xbal-EcoRI del plásmido obtenido anteriormente, para generar un plásmido que contiene la secuencia que codifica para la molécula ScFv-myc-Bisagra-Cro (Figura 6) . 3.2 Construcción de un plásmido que comprende una secuencia ScFv-Bisagra-Tetr o Cro (Figura 5B) . Este ejemplo describe la construcción de plásmidos que llevan una secuencia que codifica para una molécula quimérica biespecífica según la invención desprovista de la secuencia tag. Estos plásmidos se obtuvieron a partir de los plásmidos descritos en 3.1. de arriba por digestión por las enzimas Notl y Xbal. Esta digestión permite cortar el fragmento que lleva la región que codifica para el tag myc. 3.3 Construcción de un plásmido que lleva una secuencia ScFv-TetR o Cro (Figura 5C) . Este ejemplo describe la construcción de plásmidos que llevan una secuencia que codifica para una molécula quimérica biespecífica según la invención, desprovista de brazo y de la secuencia tag. Estos plásmidos se obtuvieron a partir de los plásmidos descritos en 3.1. de arriba por digestión por las enzimas Notl y BamHI . Esta digestión permite cortar el fragmento que lleva la región que codifica para el tag myc y para el brazo peptídico Bisagra. Ejemplo 4: Construcción de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para moléculas quiméricas biespecificas que contienen un dominio de unión a un transactivador constituido de un dominio de oligomerización 4.1. Clonación de la región de oligomerización de la proteína p53 (fragmento 320-393) El ADNc que codifica para la región de oligomerización de la proteina p53 (SEQ ID No. 3) se obtuvo por amplificación por PCR sobre un plásmido que lleva el cADN de la p53 natural humana con la ayuda de los oligonucleótidos siguientes: Oligo 5535 (SEQ ID No. 14) : CAGGCCATGGCATGAAGAAACCACTGGATGGAGAA (la parte subrayada representa un sitio Ncol) Oligo 5536 (SEQ ID No. 15) : CGTCGGATCCTCTAGATGCGGCCGCGTCTGAGTCAGGCCCTTC (Parte subrayada: sitio BamHI; Doble subrayado: sitio Xbal: Letra gruesa: sitio Notl). 4.2. Los plásmidos p53 320/393-myc-Bisagra-TetR o Cro (Figura 5A) se obtuvieron por clonación del fragmento amplificado anteriormente bajo la forma de un fragmento Ncol-Notl en los sitios correspondientes de los plásmidos descritos en el ejemplo 3.1., en substitución de la región que codifica para el ScFv. 4.3. Los plásmidos p53 320/393-Bisagra-TetR o Cro (Figura 5B) se obtuvieron por clonación del fragmento amplificado en 4.1. bajo la forma de un fragmento Ncol-Xbal en los sitios correspondientes de los plásmidos descritos en el ejemplo 3.1., en substitución de la región que codifica para la ScFv y el tag. 4.4. Los plásmidos p53 320/393-TetR o Cro (Figura 5C) se obtuvieron por clonación del fragmento amplificado en 4.1., bajo la forma de un fragmento NcoI-BamHI en los sitios correspondientes de los plásmidos descritos en el ejemplo 3.1., en substitución de la región que codifica para la ScFv, el tag y la Bisagra. 4.5. Los plásmidos tetR o Cro- p53 320/393 (Figura 5D) o tetR o Cro-Bisagra-p53 320/393 (Figura 5E) se obtuvieron por clonación de fragmentos amplificados por PCR sobre un plásmido que lleva la cADN de la p53 humana natural, con la ayuda de los oligos 5537/5539 o 5538/5539 digeridos con Xhol/EcoRI en los plásmidos descritos en 3.1. previamente digeridos con Xhol/EcoRI. Oligo 5537 (SEQ ID No. 16) : CAGGCTCGAGAAGAAACCACTGGATGGAGAA Oligo 5538 (SEQ ID No. 17) : CAGGCTCGAGCCCAAGCCCAGTACCCCCCCAGGTTCTTCAAAGAAACCACTGGATGGAG AA Oligo 5539 (SEQ ID No. 18) : GGTCGAATTCGGGCCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTTC Ejemplo 5: Construcción de un plásmido de control que lleva una secuencia que codifica para una molécula quimérica que lleva un dominio de unión al ADN (TetR o Cro) y el dominio transactivador de la proteína p53 (región 1-73) Los plásmidos p53 1/73 - TetR o Cro con o sin tag (myc o VSV) y Bisagra (Figuras 7A, B y C) se obtuvieron por clonación de fragmentos amplificados por PCR a partir de un plásmido que lleva el cADN de la p53 natural humana, con ayuda de los oligos 5661/5662 y después digeridos con Ncol/Notl, Ncol/Xbal, NcoI/BanHI en los plásmidos descritos en 3.1., previamente digeridos con NcoI/NotL, Ncol/Xbal o NcoI/BamHI. Oligo 5661 (SEQ ID No. 19) : CAGGCCATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCC Oligo 562 (SEQ ID No. 20): CGTCGGATCCTCTAGATGCGGCCGCCACGGGGGGAGCAGCCTCTGG Ejemplo 6: Construcción de plásmidos de expresión de diferentes moléculas híbridas de la invención Los plásmidos utilizados para la expresión de moléculas híbridas se obtuvieron por clonaciones de los fragmentos que contenían los cADN que codifican para estas moléculas a los sitios NcoI/EcoRI del vector de expresión eucariótico pcDNA3 (Invitrogen) .Las diferentes construcciones así efectuadas son las siguientes: - ScFv 421: SEQ ID No. 4 - TET19: proteína híbrida que contiene el eslabonamiento ScFv421-VSV-Bisagra-TetR descrito en la Figura 6 siguiendo el ejemplo 3.1. - TET02: proteina híbrida que contiene el eslabonamiento p53 (320/393) -VSV-Bisagra TetR descrito en la Figura 5A siguiendo el ejemplo 4.3 - TET03: proteína híbrida que contiene el eslabonamiento p53 (320/393) -Bisagra-TetR descrito en la Figura 5B siguiendo el ejemplo 4.4 - TET04: proteína híbrida que contiene el eslabonamiento p53 (320/393) -TetR descrito en la Figura 5C siguiendo el ejemplo 4.4 - TET07: proteína híbrida que contiene el eslabonamiento p53 (1/73) -VSV-Bisagra-TetR descrito en la Figura 7A siguiendo el ejemplo 5 Ejemplo 7: Reconocimiento de las secuencias de ADN de doble hebra específicas por las moléculas híbridas de la invención 7.1 Producción de moléculas híbridas Las diferentes moléculas utilizadas en esta experiencia se obtuvieron por traducción in vitro en un lisado de reticulocitos de las moléculas descritas en el ejemplo 6, utilizando el estuche TNT Coupled Reticulocyte lysate Systems (promega) , siguiendo el protocolo experimental descrito por el proveedor para un volumen de reacción total de 50 µl. 7.2 Construcción de la secuencia de ADN de doble hebra específica La secuencia de ADN de doble hebra específica utilizada en esta experiencia está constituida de dos oligonucleótidos de síntesis, cuya secuencia es la siguiente: Oligo 5997 (SEQ ID No. 24) : GATCCGACTTTCACTTTTCTCTATCACTGATAGTGAGTGGTAAACTCA Oligo 5998 (SEQ ID No. 25) : AGCTTGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCG Estos dos oligonucleótidos de síntesis se marcaron con fósforo 33 por incubación de 30 minutos a 37° C de 10 pmoles de cada oligonucleótido en 10 µl de medio de reacción siguiente: Tris-HCl pH 7.6 50 mM MgCl2 10 M ditiotreitol 5 mM Espermidina 100 µM EDTA 100 µM ATP-?-33P (Amersham) 50 µCi (1000-3000 Ci/mmol) T4 cinasa (Boehringer) 10 U Después los dos oligonucleótidos así marcados se hibridaron en presencia de NaCl 400 mM para reconstituir la secuencia de doble hebra TetO siguiente (SEQ ID No. 26) : GATCCGACTTTCACTTTTCTCTATCACTGATAGTGAGTGGTAAACTCA CTAGGCTCAAAGTGAAAAGAGATAGTGACTATCACTCACCATTTGAGT 7.3 Reconocimiento de la secuencia de doble hebra de TetO por las diferentes moléculas híbridas de la invención. La reacción de unión al ADN se efectuó en 50 µl de medio de reacción (Tris-HCl pH 7.4, 10 mM, MgCl2 10 mM, KCl 10 mM, ß-mercaptoetanol 6 mM, EDTA 0.1 mM, BSA 0.5 mg/ml) por adición de la secuencia TetO (10~10 M) preparada según el ejemplo 7.2, de 10 µl de producto de traducción preparado según el ejemplo 7.1 y de 10"8 M del oligonucleótido competidor frío AP2 (Promega) , utilizado para eliminar la fijación no específica. La especificidad de la interacción se verificó por desplazamiento del equilibrio por adición de tetraciclina 10 µM (Sigma) en el medio de reacción. Las mezclas se reacción se incubaron 15 minutos a 20° C, y después se adicionaron de 10 µl de glicerol al 50 %, y las mezclas finales se sometieron a una electroforesis nativa sobre gel de poliacrilamida al 5 % con migración a 200V y 16° C. El gel se secó luego y se sometió a autorradiografía. El resultado de este experimento efectuado con las moléculas híbridas TET19, TET20 y TET07 se presenta en la Figura 9. En estas condiciones, la unión de estas tres moléculas a la secuencia de ADN específica de doble hebra TetO se observa por un retardo de migración de la misma, y la especificidad de esta interacción se puso en evidencia por la inhibición de este retardo por adición de tetraciclina. Este resultado confirma así que las moléculas híbridas de la invención son capaces de unirse de manera específica a la secuencia nucleotídica TetO.

Ejemplo 8: Unión específica de las moléculas híbridas de la invención a una molécula que presenta un dominio transactivador transcripcional 8.1 Producción de las moléculas híbridas de la invención, y de moléculas que presentan o no un dominio transactivador transcripcional Para este experimento, las moléculas híbridas de la invención ScFv 421, TET19 y TET02 según el ejemplo 6 se produjeron por traducción in vitro, utilizando el protocolo experimental según el ejemplo 7.1, en presencia de 44 µCi de 35S-metionina (Amersham) (1175 Ci/mmoles) para generar estas moléculas híbridas marcadas radioactivamente. Los cADN de las moléculas que presentaban o no un dominio transactivador transcripcional se clonaron en el vector pBlueBacIII (Invitrogen) al sitio Ba HI . A partir de estos vectores, se produjeron y purificaron baculovirus recombinantes, siguiendo las instrucciones del fabricante. Las moléculas se produjeron por infección con el baculovirus recombinante de células de insecto sf9, siguiendo el protocolo experimental del fabricante. Se prepararon extractos proteicos de la concentración proteica final de 10 mg/ml, siguiendo el protocolo descrito por K. Ory et al. (K. Ory, EMBO J. 13, 3496-3504, 1994). Estas moléculas son las siguientes: - p53 (1/393) : proteína p53 natural - p53 (1/320) : proteína p53 natural limitada a su secuencia en amino ácidos 1 a 320, y asi desprovista de su dominio de oligomerización y del dominio reconocido por el anticuerpo monoclonal pAb-421. 8.2 Unión de las moléculas híbridas de la invención a las moléculas que presentaban o no un dominio transactivador transcripcional 5 µl de cada uno de los productos de traducción in vitro, preparados según el ejemplo 8.1 se incubaron con 5 µl del extracto de baculovirus preparado según el ejemplo 8.1 y 2 µl del anticuerpo monoclonal DOl (Oncogene Sciences) , que reconoce el extremo N-terminal de la proteína p53 durante 16 horas a 4° C en 100 µl de solución amortiguadora RIPA modificada (K. Ory, EMBO J. 13, 3496-3504, 1994) . La inmunoprecipitación se realizó como se des'cribe por K. Ory et al., (K. Ory, EMBO J. 13, 3496-3504, 1994) . Los complejos retenidos por el anticuerpo se eligieron por incubación de 10 minutos a 80° C en presencia de 30 µl de solución amortiguadora de migración (Laemmli U. K., Nature, 227, 680-685, 1970) y sometidos a electroforesis sobre gel de poliacrilamida al 10 % en medio desnaturalizante a 200 V, siguiendo el protocolo descrito anteriormente (Laemmli U. K., Nature, 227, 680-685, 1970). El gel se seco en seguida, y se reveló con la ayuda de un Instantimager (Packard Instruments) que permite cuantificar las cantidades de moléculas híbridas unidas a la molécula que presenta o no un dominio transactivador transcripcional. Los resultados de este experimento están representados en la Figura 10. En estas condiciones, aparece claramente que la molécula híbrida que presenta el ScFv 421 (TET19) reconoce bien la molécula p53 (1/393) de forma equivalente al ScFv 421 solo, y la molécula híbrida que presenta el dominio 320/393 (TET02) presenta las mismas propiedades, pero con un poder de retención de la p53 (1/393) mucho más importante. Además, la ausencia de señal observada durante la incubación con la molécula p53 (1/320) muestra que estas interacciones son muy específicas y mediadas por el extremo C-terminal de la proteína p53 (amino ácidos 320 a 393) , como se esperaba. Estos resultados confirman pues que las moléculas híbridas de la invención son muy capaces de encontrar un dominio transactivador transcripcional llevado por una molécula de la cual ellas son asociados específicos.

Ejempxj 9: Encuentro funcional de un dominio transactivador transcripcional por las moléculas híbridas de la invención El encuentro funcional de un dominio transactivador transcripcional por las moléculas híbridas de la invención se evaluó en un sistema de transactivación in vivo en las células SAOS-2 (osteosarcoma humano) deficientes para los dos alelos de la proteína p53, en la línea tumoral H358 deficiente para los dos alelos de la proteína p53 (Maxwell & Roth, Oncogene 8, 3421, 1993) y en la línea tumoral HT29, deficiente para uno de los dos alelos de la proteína p53, y que presenta un alelo mutado (mutación H273) . Este sistema reposa sobre la utilización de un gen transportador dosificable enzimáticamente, y colocado bajo la dependencia de un promotor que contiene los motivos nucleotídicos de reconocimiento específico por el represor Tet. (Operador Tet) . En esta prueba, el gen transportador LUC (luciferasa) colocado bajo el control del operador Tet, está contenido en el plásmido pUHC13-3 (Gosen M. & Bujard H., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 5547-5551, 1992) . 9.1 Líneas celulares utilizadas y condiciones de cultivo Las líneas celulares utilizadas en este experimento, así como su genotipo unido a la proteína p53, y los medios de cultivo utilizados para su crecimiento se reportan en la tabla de abajo: Tabla: líneas celulares Línea P53 Medio de Cultivo No. ATCC SAOS-2 -/- medio DMEM (Gibco BRL) adicionado HTB 85 de 10 % de suero de becerro fetal (Gibco BRL) H358 -/- medio RPMI (Gibco BRL) adicionado de 10 % de suero de becerro fetal (Gibco BRL) HT29 -/H273 medio DMEM (Gibco BRL) adicionado de 10 % de suero de becerro fetal (Gibco BRL) 9.2 Plásmidos de expresión de las moléculas que presentan un dominio transactivador transcripcional Las moléculas que presentan un dominio transactivador transcripcional utilizadas en esta experiencia son la proteina p53 natural (wt) y los mutantes G281 y H175 de esta proteína. Los cADN que codifican para estas tres proteínas se insertaron al sitio BamHI del vector pcDNA3 (invitrogen) . 9.3 Expresión intracelular de las moléculas híbridas de la invención.

Las moléculas híbridas de la invención se expresaron en las células en cultivo por transfección transitoria, utilizando el protocolo siguiente: las células (3.5 x 105) se sembraron en placas de 6 pozos, que contenían 2 mi de medio de cultivo, y se cultivaron durante la noche en un incubador con C02 (5 %) a 37° C. Las diferentes construcciones se transfectaron luego, utilizando la lipofectAMINE (Gibco BRL) como agente de transfección, de la manera siguiente: 1.5 µg de plásmido total se incubaron (del cual 0.25 µg son del plásmido transportador) con 5 µl de lipofectAMINE durante 30 minutos, con 2 mi de medio de cultivo sin suero (mezcla de transfección) . Durante este tiempo, las células se enjuagaron dos veces con PBS, y después se incubaron 4 horas a 37° C con la mezcla de transfección, después de lo cual ésta se aspiró, y se reemplazó por 2 mi de medio de cultivo adicionado de 10 % de suero de becerro fetal inactivado con calor, y las células se incubaron para que se activaran durante 48 horas a 37° C. 9.4 Detección de la activación de la transcripción La activación de la transcripción unida al encuentro funcional del transactivador transcripcional se detectó y se cuantificó por la medición de la actividad de la luciferasa codificada por el gen LUC, utilizando el estuche Luciferase Assay System (Promega) según el protocolo experimental del fabricante. 9.5 Encuentro funcional de un dominio transactivador transcripcional por las moléculas de la invención. Este experimento se efectuó utilizando las moléculas TET02, TET03 y TET07 según el ejemplo 6. En este experimento, la molécula TET07 sirve de control positivo, puesto que posee su propio dominio transactivador transcripcional. Los resultados obtenidos en las células SAOS-2, y presentados en la Figura 11, muestran que la molécula TET07 es muy capaz ella sola de activar la transcripción del gen LUC colocado bajo el control del- operador Tet, contrariamente a la construcción TET02. Esto está de acuerdo con el hecho de que esta línea celular no contiene la proteína p53 endógena, que no puede así ser encontrada por la molécula TET02. Por el contrario, la introducción de la proteína p53 natural, o de su mutante G281, que no producen señal ellas solas, es capaz de generar una actividad transcripcional en presencia de la molécula TET02. Tal resultado no es observable con el mutante H175 descrito en la literatura como el que presenta un dominio transactivador transcripcional no funcional.

Este resultado obtenido en la línea celular SAOS-2 con la molécula TET02 ha podido ser reproducido en una línea tumoral que no contiene tampoco p53 endógena (células H358), y ha podido ser extendido a las moléculas TET03 y TET04 (Figura 12) . Con el fin de confirmar estos dos resultados en un contexto celular diferente, la molécula TET02, así como el control positivo TET07 se expresaron en las células HT29 que presentan una proteína p53 endógena mutante (H273) , el control negativo de esto experimento consiste en transfectar el vector pcDNA3 vacío. Los resultados de este experimento, presentados en la Tabla de abajo, muestran que la molécula TET02 es muy capaz de encontrar el dominio transactivador transcripcional de la proteína p53 endógena. Tabla: Activación transcripcional de las moléculas híbridas de la invención en las células HT29 pcDNA3 TET07 TET02 1 59 10 El conjunto de estos experimentos muestra así que las moléculas híbridas de la invención son muy capaces de unirse a la vez a secuencias de ADN de doble hebra específicas y a proteínas que presentan u dominio transactivador transcripcional, y que estas moléculas son capaces de inducir de manera condicional la expresión de genes de interés.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE (A) NOMBRE: RHONE POULENC RORER S. A. (B) DIRECCIÓN: 20, AVENUE RAYMOND ARON (C) CIUDAD: ANTONY (E) PAÍS: FRANCIA (F) CÓDIGO POSTAL: 92165 (G) TELEFONO: (1) 40.91.70.36 (H) FAX: (1) 40.91.72.91 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: SISTEMA DE EXPRESIÓN CONDICIONAL (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 26 (iv) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) ELEMENTOS DE PROGRAMACIÓN: PatentIn Reléase # 1.0, Versión # 1.30 (OEB) (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1: TCTCTATCAC TGATAGGGA 19 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: TATCACCGCA AGGGATA 17 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 74 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO ( xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 3 : Lvs Lvs Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln lie Arg Gly Arg i" * 5 'O 15 Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asa Glu Ala Leu Glu Leu Lys 20 25 30 Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser 35 40 45 His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu 50 55 ó0 Met Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp 65 "0 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 768 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: TTACTCGCGG CCCAGCCGGC CATGGCCCAG GTGCAGCTGC AGCAGTCTGG GGCAGAGCTT 60 GTAAGGTCAG GGGCCTCAGT CAAGTTGTCC TGCACAGCTT CTGGCTTCAA CATTAAAGAC 120 TACTATA7 C ACTGGGTGAA GCAGAGGCCT GAACAGGGCC TGGAGTGGAT TGGATGGATT 130 GATCCTAAGA ATGGTGATAC TGAATATGCC CCGAAGTTCC AGGGCAAGGC CACTATGACT Z40 GCAGACACAT CCTCCAATAC AGCCTACCTG CAGCTCAGCA GCCTGGCATC TGAGGACACT 300 GCCGTGTATT ATTGTAATTT TTACGGGGAT GCTTTGGACT ATTGGGGCCA AGGGACCACG 360 GTCACCGTCT CCTCAGGTGG AGGCGGTTCA GGCGGAGGTG GCTCTGGCGG TGGCGGATCG 420 GATGTTTTGA TGACCCAAAC TCCACTCACT TTGTCGGTTA CCATTGGACA ACCAGCCTCC 430 ATCTCTT CA AGTCAAGTCA GAGCCTCTTG GATAGTGATG GAAAAACATA TTTGAATTGG 540 TTGTTACAGA GGCCAGGCCA GTCTCCAAAG CGCCTAATCT ATCTGGTGTC TAAACTGGAC iC TCTGGAGT C CTGACAGGTT CACTGGCAGT GGATCAGGGA CAGATTTCAC ACTTAAAATC 660 AACAGAGTGG AGGCTGAGGA TTTGGGAGTT TATTATTGCT GGCAAGGTAC ACATTCTCCG 7Z0 CTTACGTTCG GTGCTGGCAC CAAGCTGGAA ATTAAACGGG CGGCCGCA - 763 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 15 pares de bases (B) TIPO: amino ácido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Glv Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 ? o 1 5 \ 2 ) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 6 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 30 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) COLOCACIÓN: 1...30 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: CCC AAG CCC AGT ACC CCC CCA GGT TCT TCA 30 Pro Lys pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) COLOCACIÓN: 1...18 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: ATG AAC CGG CTG GGC AAG 18 Met Asn Arg Leu Gly Lys 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) ASPECTOS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) POSICIÓN: 1...33 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8: GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT 33 Glu Gln Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu Asn 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 7 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9: Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 66 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: GGCTCTAGAC CCAAGCCCAG TACCCCCCCA GGTTCTTCAA CGCGTGGATC CATGTCCAGA 60 TTAGATAAAA GTAAAG 66 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 51 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11: CGTACGGAAT TCGGGCCCTT ACTCGAGGGA CCCACTTTCA CATTTAAGTT G 51 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 66 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12: GGCTCTAGAC CCAAGCCCAG TACCCCCCCA GGTTCTTCAA CGCGTGGATC CATGGAACAA 60 CGCATAACCC TGAAAG 66 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13: - (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 51 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13: CGTACGGAAT TCGGGCCCTT ACTCGAGTGC TGTTGTTTTT TTGTTACTCG G (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 35 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14: CAGGCCATGG CATGAAGAAA CCACTGGATG GAGAA 35 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 43 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15: CGTCGGATCC TCTAGATGCG GCCGCGTCTG AGTCAGGCCC TTC 43 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 31 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16 CAGGCTCGAG AAGAAACCAC TGGATGGAGA A 31 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 61 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17 CAGGCTCGAG CCCAAGCCCA GTACCCCCCC AGGTTCTTCA AAGAAACCAC TGGATGGAGA tt) A «« (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 37 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18: GGTCGAATTC GGGCCCTCAG TCTGAGTCAG GCCCTTC 37 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 29 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19: CAGGCCATGG AGGAGCCGCA GTCAGATCC 29 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18: GGTCGAATTC GGGCCCTCAG TCTGAGTCAG GCCCTTC 37 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 46 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20: CGTCGGATCC TCTAGATGCG GCCGCCACGG GGGGAGCAGC CTCTGG 46 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 66 pares de bases (B) TIPO: amino ácido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21: Met Glu Gln Arg He Thr Leu Lys Asp Tyr Ala Mßt Arg Phß Gly Gln 1 5 10 15 Thr Lys Thr Ala Lys Asp Leu Gly Val Tyr Gln Ser Ala He Asn Lys 20 25 30 Ala He His Ala Gly Arg Lys He Phe Leu Thr He Asn Ala Asp Gly 35 40 45 Ser Val Tyr Ala Glu Glu Val Lys Pro Phe Pro Ser Asn Lys Lys Thr 50 55 60 Thr Ala 65 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22: GATCCTATCA CCGCAAGGGA TAA 23 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23: GATAGTGGCG TTCCCTATTT CGA 23 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 48 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24: GATCCGACTT TCACTTTTCT CTATCACTGA TAGTGAGTGG TAAACTCA 48 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 648 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25: AGCTTGAGTT TACCACTCCC TATCAGTGAT AGAGAAAAGT GAAAGTCG 48 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 96 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26: GATCCGACTT TCACTTTTCT CTATCACTGA TAGTGAGTGG TAAACTCACT AGGCTCAAAG -60 TGAAAAGAGA TAGTGACTAT CACTCACCAT TTGAGT 96 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (57)

1. REIVINDICACIONES 1. Molécula quimérica biespecífica caracterizada porque comprende un dominio capaz de unirse selectivamente a una secuencia definida de ADN, y un dominio detector, capaz de unirse específicamente a un transactivador o transrepresor, o un complejo transactivador o transrepresor característico de un estado fisiológico o fisiopatológico.
2. 2. Molécula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio capaz de unirse selectivamente a una secuencia definida de ADN se deriva de una proteína capaz de interaccionar con el ADN.
3. 3. Molécula de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el dominio capaz de unirse selectivamente a una secuencia definida de ADN se deriva de una proteína eucariótica.
4. 4. Molécula de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el dominio capaz de unirse selectivamente a una secuencia definida de ADN se deriva de las proteínas p53, STAT o NFkB.
5. 5. Molécula de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el dominio capaz • de unirse selectivamente a una secuencia definida de ADN se deriva de una proteína procariótica.
6. 6. Molécula de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la proteína procariótica es un represor bacteriano.
7. 7. Molécula de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el dominio capaz de unirse selectivamente a una secuencia definida de ADN se deriva de la proteina tetR.
8. 8. Molécula de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el dominio capaz de unirse selectivamente a una secuencia definida de ADN se deriva de la proteína Cro.
9. 9. Molécula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, caracterizada porque el dominio capaz de unirse selectivamente a una secuencia definida de ADN comprende el dominio de interacción con el ADN de la proteína.
10. 10. Molécula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, caracterizada porque el dominio capaz de unirse selectivamente a una secuencia definida de ADN está constituido de la proteína completa.
11. 11. Molécula de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el dominio capaz de unirse selectivamente a una secuencia definida de ADN está constituido de la proteína tetR.
12. 12. Molécula de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el dominio capaz de unirse selectivamente a una secuencia definida de ADN está constituido de la proteína Cro.
13. 13. Molécula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio capaz de unirse específicamente al transactivador o transrepresor, o al complejo transactivador o transrepresor es un dominio de oligomerización.
14. 14. Molécula de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el dominio de oligomerización es un leucina-cremallera, un dominio SH3 o SH2.
15. 15. Molécula de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el dominio de oligomerización capaz de unirse específicamente al transactivador está constituido de la parte C-terminal de la proteína p53.
16. 16. Molécula de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el dominio de oligomerización está constituido de la parte C-terminal de la proteína p53 que tiene los residuos 320 a 393 (SEQ ID No. 3), 302-360 o 302-390.
17. 17. Molécula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio capaz de unirse específicamente al transactivador o transrepresor, o al complejo transactivador o transrepresor es un dominio sintético o natural conocido por interaccionar con el transactivador o transrepresor, o complejo transactivador o transrepresor.
18. 18. Molécula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio capaz de unirse específicamente al transactivador o transrepresor, o al complejo transactivador o transrepresor es un anticuerpo o un fragmento o derivado de anticuerpo dirigido contra el transactivador o transrepresor, o el complejo transactivador o transrepresor.
19. 19. Molécula de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el dominio capaz de unirse específicamente al transactivador o al complejo transactivador está constituido por un fragmento Fab o F(ab)2 de un anticuerpo, o una región VH o VL de un anticuerpo.
20. 20. Molécula de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el dominio capaz de unirse específicamente al transactivador o al complejo transactivador está constituido por un anticuerpo de cadena simple (ScFv) que comprende una región VH unida a una región VL por un brazo.
21. 21. Molécula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio de unión al ADN y el dominio de unión al transactivador están unidos entre ellos por intermedio de un brazo.
22. 22. Molécula de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el brazo está constituido de un péptido que comprende de 5 a 30 amino ácidos y, de preferencia, de 5 a 20 amino ácidos.
23. 23. Molécula de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el brazo se selecciona de entre los péptidos de la secuencia SEQ ID No. 5 o SEQ ID No. 6.
24. 24. Molécula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el dominio de unión al ADN está situado en posición N-terminal, y el dominio de unión al transactivador está situado en posición C-terminal.
25. 25. Molécula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizada porque el dominio de unión al ADN está situado en posición C-terminal, y el dominio de unión al transactivador está situado en posición N-terminal.
26. 26. Molécula quimérica biespecífica, caracterizada porque es de la estructura ScFv-VSV/myc-Bisagra-TET o Cro (Figura 5A) .
27. 27. Molécula quimérica biespecífica, caracterizada porque es de la estructura ScFv-Bisagra-TET o Cro (Figura 5B) .
28. 28. Molécula quimérica biespecífica, caracterizada porque es de la estructura ScFv-TET o Cro (Figura 5C) .
29. 29. Molécula quimérica biespecífica, caracterizada porque es de la estructura TET- o Cro-ScFv (Figura 5D) .
30. 30. Molécula quimérica biespecífica, caracterizada porque es de la estructura TET- o Cro-Bisagra-ScFv (Figura 5E) .
31. 31. Molécula quimérica biespecífica, caracterizada porque es de la estructura Oligom-VSV/myc-Bisagra-TET o Cro (Figura 5A) , Oligom-Bisagra-TET o Cro (Figura 5B) u Oligom-TET o Cro (Figura 5C) .
32. 32. Secuencia de ácido nucleico caracterizada porque codifica para una molécula quimérica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31.
33. 33. Secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque se trata de una secuencia de ADN.
34. 34. Secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 32 o la 33, caracterizada porque forma parte de un vector.
35. 35. Sistema condicional de expresión de genes, caracterizado porque comprende: - una molécula quimérica tal como la definida en las reivindicaciones 1 a 31, y - un cásete de expresión que comprende una secuencia reguladora, un promotor transcripcional mínimo y el gen.
36. 36. Sistema condicional de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el dominio de unión al ADN de la molécula quimérica está representado por todo o parte de TetR, y la secuencia reguladora comprende la secuencia SEQ ID No. 1 o un derivado de ésta, eventualmente repetida varias veces.
37. 37. Sistema condicional de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el dominio de unión al ADN de la molécula quimérica está representado por todo o parte de Cro, y la secuencia reguladora comprende la secuencia SEQ ID No. 2 o un derivado de ésta, eventualmente repetida varias veces.
38. 38. Sistema condicional de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, caracterizado porque el promotor minimo comprende una cavidad TATA o INR.
39. 39. Sistema condicional de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el promotor mínimo se deriva del promotor del gen de la timidina cinasa.
40. 40. Sistema condicional de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el promotor mínimo está compuesto de los nucleótidos -37 a +19 del promotor del gen de la timidina cinasa.
41. 41. Vector caracterizado porque comprende: - una secuencia de ácido nucleico que codifica para una molécula quimérica de conformidad con cualquier de las reivindicaciones 1 a 31, y - un cásete de expresión que comprende una secuencia reguladora, un promotor transcripcional mínimo y una secuencia que codifica de interés.
42. 42. Vector de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el promotor transcripcional mínimo está definido de conformidad con las reivindicaciones 38 a 40.
43. 43. Vector de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el dominio de unión al ADN de la molécula quimérica está representado por todo o parte de TetR, y la secuencia reguladora comprende la secuencia SEQ ID No. 1 o un derivado de ésta, eventualmente repetida varias veces.
44. 44. Vector de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el dominio de unión al ADN de la molécula quimérica está representado por todo o parte de Cro, y la secuencia reguladora comprende la secuencia SEQ ID No. 2 o un derivado de ésta, eventualmente repetida varias veces.
45. 45. Vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 44, caracterizada porque la secuencia que codifica de interés es una secuencia de ADN que codifica para un producto terapéutico.
46. 46. Vector de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el producto terapéutico es un péptido o polipéptido tóxico.
47. 47. Vector de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el producto terapéutico tóxico se selecciona de entre la toxina diftérica, la toxina de pseudomonas, la ricina A, la timidina cinasa, la citosina desaminasa, la proteína Grb3-3, o la ScFv Y28.
48. 48. Vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 47, caracterizado porque se trata de un vector plasmídico.
49. 49. Vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 47, caracterizado porque se trata de un vector viral.
50. 50. Vector de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque se trata de un adenovirus recombinante defectivo.
51. 51. Vector de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque se trata de un retrovirus recombinante defectivo.
52. 52. Composición farmacéutica caracterizada porque comprende al menos un vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 51.
53. 53. Acido nucleico caracterizado porque comprende la secuencia SEQ ID No. 4.
54. 54. Molécula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el transactivador característico de un estado fisiológico o fisiopatológico es una proteína de origen viral, parasitario, micobacteriano o celular que posee una actividad transactivadora transcripcional.
55. 55. Molécula de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque el transactivador es una proteína viral seleccionada de entre la proteína Tat del virus VIH, las proteínas E6/E7 del virus del papiloma y la proteína EBNA del virus de Epstein Barr.
56. 56. Molécula de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque el transactivador es una proteína celular, de preferencia la proteína p53, mutada o natural.
57. 57. Molécula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el transactivador o complejo transactivador característico de u estado fisiológico o fisiopatológico es una proteína que aparece en una célula infectada o hiperproliferativa.