MXPA01001655A

MXPA01001655A - Gen simple codifica para isoformas de celulas especificas de musculos estriado y de celulas aorticas.

Info

Publication number: MXPA01001655A
Application number: MXPA01001655A
Authority: MX
Inventors: Chung-Ming Hsieh
Original assignee: Harvard College
Priority date: 1998-08-14
Filing date: 1999-05-11
Publication date: 2004-10-14
Also published as: US6350592B1; WO2000009689A9; CA2340428A1; IL141412A0; EP1105473A2; AU3981899A; WO2000009689A3; JP2002522074A; WO2000009689A2

Abstract

Polipeptido de gen 1 de expresion preferencial en la aorta (APEG 1) y polipeptido de expresion preferencial en musuclo estriado (SPEG), secuencias de ADN que codifican y controlan la transcripcion del gen que codifica para el APEG-1/SPEG, metodos para diagnosticar lesion vascular, metodos para conferir la expresion especifica de celulas de musculo liso y metodos para inhibir la proliferacion de celulas de musculo liso vascular mediante el aumento del nivel de APEG-1 en el sitio de la lesion vascular.

Description

GEN SIMPLE QUE CODIFICA PARA ISOFORMAS DE CÉLULAS ESPECÍFICAS DE MÚSCULO ESTRIADO Y DE CÉLULAS AÓRTICAS Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud de los Estados Unidos con número de serie 09/134,250, presentada ti 14 de agosto de 1998.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con el diagnóstico y el tratamiento de lesiones vasculares. La aterosclerosis y sus complicaciones subsecuentes, como por ejemplo: infarto miocárdico, accidente vascular cerebral y enfermedades vasculares periféricas, son las causas principales de mortandad en los países en desarrollo. Las células de músculo liso y endoteliales vasculares son factores importantes en la regulación del tono vascular normal. El daño o disfunción de estas células puede conducir a enfermedades vasculares como la aterosclerosis y la reestenosis. Se cree que la aterosclerosis es una consecuencia de una respuesta de la pared vascular a una lesión (Ross, R., 1993, Nature 362:801-9). Al presentarse una lesión vascular y otros diversos estímulos, los factores de crecimiento y las citocinas de las células vasculares activadas promueven el crecimiento y migración de las células de músculo liso vascular en un estado desdiferenciado, dando por resultado la formación de placas ateroscleróticas . La patogénesis de la aterosclerosis no se ha comprendido completamente, y no se ha desarrollado un régimen terapéutico of<_.<..Livo para prevenir o curar la aterosclerosis iKoss, R., The Pathogenesis of Atherosclerosis, in Heart Disease, libro de texto sobre medicina cardiovascular, E. Braunwald, Editor, 1992, W. B. Saunders Company: Philadelphia, págs. 1106-24 y Ross, R. : The Pathogenesis of Atherosclerosis: a Perspectiva for the 1990s, 1993, Nature 362:801-9). A pesar de la investigación intensiva, los mecanismo moleculares responsables de la regulación de la expresión del gen en células de músculo liso y endoteliales vasculares, son muy desconocidos. En particular, los factores que actúan en trans y los elementos que actúan en cis, que median la expresión del gen específico de célula vascular no han sido identificados, principalmente debido al factor de que sólo unos cuantos genes específicos vasculares han sido identificados. Además, de los genes que han sido caracterizados como específicos de célula endotelial (por ejemplo, factores von Willebrand, receptor VEGF flk-1 y VCAM-1, y la selección E (Hunter, J.J., et al., 1993, Hipertensión 22:608-17) o células específicas de músculo liso (por ejemplo, CHIP28, S 22 y gax (Gorski, D.H., et al., 1993, Mol. Cell. Biol . 13(6) : 3722-33), muchos se han encontrado en otros tipos de células a diversos niveles.

SUMARIO DE TA IMVENc'IÓN La invención I L . basada en el descubrimiento de un gen novedoso, ia expresión del cual da origen a isoformas variantes, una de las cuales es específica de células aórticas y otras se encuentran en las células de músculo estriado. Consecuentemente, la invención presenta un gen específico de célula aórtica y, por lo tanto, proporciona un ADN prácticamente puro (por ejemplo, ADN genómico, ADNc o ADN sintético) que codifica para un polipéptido de gen 1 de expresión preferencial en la aorta (APEG-1) . "ADN prácticamente puro" significa el ADN que está libre de genes que, en el genoma natural del organismo de cual se deriva el ADN de la invención, flanquean al gen APEG-1. El termino incluye así, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector, en un plásmido o virus de replicacion autónoma, o en el ADN genómico de un procariote o eucariote en un sitio distinto a su sitio natural, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADNc o un fragmento genómico producido por PCR o digestión con endonucleasa de restricción) independiente de otras secuencias . También incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica para la secuencia de polipéptido adicional. La hibridación se lleva a cabo utilizando técnicas estándar como las que se describen en Ausubel et :il . , Current Protocole in Molecular Biology, John Wiley & Sons, (1989) . Las condicic.-^d "muy severas" se refieren a las condiciones f*. lavado e hibridación del ? caracterizadas por temperatura elevada. y baja concentración de sal, por ejemplo: condiciones de lavado de 65 °C a una concentración de sal de aproximadamente 0.1 X SSC. Condición "leve" a "moderada" se refiere a condiciones de lavado e hibridación caracterizadas por temperatura baja y alta concentración de sal, por ejemplo: condiciones de lavado de menos de 60 °C a una concentración de sal de por lo menos 1.0 X SSC. Por ejemplo, las condiciones muy severas pueden incluir la hibridación a aproximadamente 42°C y formamida al 50%, aproximadamente; un primer lavado a aproximadamente 65°C, aproximadamente 2X SSC y SDS al 1%, seguido por un segundo lavado a aproximadamente 65°C y a aproximadamente 0.1% x SSC. Las condiciones más leves que son adecuadas para detectar las secuencias de ADN que tienen identidad de secuencia de aproximadamente 50% para un gen APEG-1 son detectadas por ejemplo por: hibridación a aproximadamente 42 °C en ausencia de formamida; un primer lavado a aproximadamente 42 °C, aproximadamente 6X SSC y SDS aproximadamente al 1%, y un segundo lavado a aproximadamente 50°C, aproximadamente 6X SSC y SDS aproximadamente al 1%. Un ADN prácticamente puro que tiene por lo menos u a identidad de secuencia al 50% (de preferencia, por lo menos del 70%, con más prifconcia por lo menos al 80% y con la máxima preferencia por lo menos al 90%) con respecta a la SEQ ID NO .1 , 2 u 11, y que codifica para un polipéptido que tiene actividad biológica de un polipéptido APEG-1 queda también dentro de la invención. El porcentaje de identidad de secuencia de un ADN con otro se determina por medios estándar, por ejemplo, mediante el paquete de software para análisis de secuencia (Sequence Analysis Software Package) desarrollado por el Genetics Computer Group (University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, I) (o por medio de un programa equivalente) , que emplea los parámetros por omisión del mismo. La "actividad biológica de un polipéptido APEG-1" se define como la capacidad para inhibir la proliferación o migración de células de músculo liso en el sitio de la lesión vascular. La invención incluye también un ADN prácticamente puro que contiene un promotor específico de célula vascular, constitutivo o inducible, por ejemplo, un promotor APEG-1 que está de preferencia en un vector en el cual puede ser o ha sido clonado un gen heterólogo, y bajo el control del cual el gen puede expresarse. El promotor es, de preferencia, específico para células arteriales (por ejemplo, células de la aorta) , y con la máxima preferencia, específico para células de músculo liso vascular. El ADN que codifica para APEG-1 puede estar operativamente ligado a una de estas secuencias re ladoras para la expresión del polipéptido APEG-1 en células vasculares. Por "promotor" se entiende una secuencia de ADN mínima que es suficiente para dirigir la transcripción. Los promotores pueden ser constitutivos o inducibles y pueden estar acoplados con otras secuencias reguladoras o "elementos" reguladores que proporcionan expresión de genes dependiente del promotor, que son específicas del tipo de célula, específicas del tejido o inducibles por agentes o señales externas; estos elementos pueden estar ubicados en la región 5' o 3' del gen nativo, o dentro de un intrón. Por "promotor heterólogo" se entiende un promotor distinto al promotor APEG-1 tipo natural. "Operativamente ligado" significa que una secuencia de codificación y unas secuencias reguladoras están conectadas de tal manera que permiten la expresión del gen cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo, las proteínas activadores transcripcionales) colindan con las secuencias reguladoras. La invención describe también un método para dirigir la expresión específica de una proteína por células vasculares, por medio de la introducción, en una célula vascular, de un ADN aislado que contiene una secuencia que codifica para la proteína operativamente ligada al promotor específico de célula vascular. Una célula que contiene el ADN o vector de la invención ta.fliién queda dentro de la invención. La invención también describe un polipéptido APEG-1 prácticamente puro (por ejemplo, APEG-1 de rata (SEQ ID NO: 3) o APEG-1 humano (por ejemplo, APEG-1 humano (SEQ ID NO: 12)) y un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido APEG-1. Por un "polipéptido prácticamente puro" se entiende un polipéptido que está separado de aquellos componentes (proteína y otras moléculas orgánicas que ocurren de manera natural) , que lo acompañan en forma natural. Normalmente, el polipéptido es prácticamente puro cuando constituye por lo menos el 60% en peso de la proteína en la preparación. De preferencia, la proteína en la preparación es polipéptido APEG-1, por lo menos en un 75%, con más preferencia por lo menos en un 90% y con la máxima preferencia, por lo menos en un 99% en peso. Puede obtenerse un polipéptido APEG-1 prácticamente puro por ejemplo, por extracción de una fuente natural (por ejemplo, una célula aórtica) , por expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica para un polipéptido APEG-1, o mediante la síntesis química de la proteína. La pureza puede medirse por cualquier método apropiado, por ejemplo: cromatografía de columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o análisis HPLC. Un proteína está prácticamente libre de componentes asociados de mane."ú natural cuando está separado de esos contamin-n.¿ices que lo acompañan en su estado natural. Así, una proteína que se sintetiza químicamente o que se produce en un sistema celular distinto de la célula de la cual se origina naturalmente, estará prácticamente libre de sus componentes asociados de manera natural. Consecuentemente, los polipéptidos prácticamente puros incluyen polipéptidos recombinantes derivados de un eucariote pero producidos en E. coli o en otro procariote o en otro eucariote distinto del que se derivó originalmente el polipéptido. En otro aspecto, la invención proporciona un método para detectar lesiones en una muestra de tejido vascular mediante la determinación del nivel de la expresión del gen APEG-1 en el tejido; una disminución en el nivel de expresión detectado en la muestra de tejido, comparado con la disminución detectada en tejido vascular control no lesionado, indica la presencia de una lesión vascular . La invención incluye también un método para inhibir la proliferación de células de músculo liso en un animal, poniendo en contacto una arteria del animal con un polipéptido APEG-1 o con un fragmento biológicamente activo del mismo o con un compuesto que estimula al promotor del APEG-1, por ejemplo, que estimula la expresión APEG-1. Todavía en otro aspecto, le invención incluye un método para elaborar un polip^puido APEG-1, por ejemplo, un polipéptido APEG-1 de rata o de humano, que incluye proporcionar una célula que contiene ADN que codifica para un polipéptido APEG-1 y cultivar la célula bajo condiciones que permiten la expresión del ADN que codifica al APEG-1, es decir, la producción del APEG-1 recombinante, por la célula . La invención describe además un ADN prácticamente puro que tiene una secuencia intensificadora derivada del APEG-1 que regula la transcripción específica de células de músculo liso vascular de una secuencia que codifica para el polipéptido al que está operativamente ligado. "Secuencia intensificadora" significa una secuencia de ADN que contiene uno o más elementos de acción en cis que regulan la transcripción, por ejemplo, la transcripción específica de células. Los elementos pueden ser contiguos o estar separados por ADN no involucrado en la regulación de la transcripción, por ejemplo, un elemento intensificador puede estar en una posición inmediatamente adyacente al elemento promotor o varias kilobases en dirección 5' o en dirección 3 ' del sitio de inicio transcripcional . El ADN intensificador se deriva, de preferencia, de la región 5' de un gen APEG-1 de mamífero, como el gen del ratón (SEQ ID 5 NO: 17), y regula la expresión preferencia] en 1-TS células d¿ üiúsculo liso vascular, por ejemplo, en las células de músculo liso aórtico, de u^ ADN que codifica para polipéptido al cual está operativamente ligado. De preferencia, el intensificador incluye una secuencia que se 10 híbrida bajo condiciones muy severas para la SEQ ID NO: 20 o para la SEQ ID NO: 23 o para un complemento de las mismas. Con más preferencia, el intensificador incluye 73 nucleotidos de la SEQ ID NO: 20, que está ubicado dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 17. Con más preferencia, el 15 intensificador incluye a los 38 nucleotidos de la SEQ ID NO: 23, que están ubicados dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 20. ' ? En algunas modalidades, el intensificador incluye V. menos que la secuencia de nucleotido completa de la SEQ ID 20 NO: 17, por ejemplo, puede contener menos de 2.6 kb, 2.1 kb, 1.7 kb, 1.2 kb, 700 nucleotidos, 500 nucleotidos o aún 100 nucleotidos de la SEQ ID NO: 17. En algunas modalidades, el intensificador contiene la SEQ ID NO: 20 y es de menos de 2.7 kb de largo, 25 1.0 kg, 500 pares de bases, 250 pares de bases o 100 pares de bases de largo. El intensificador también puede incluir una pluralidad de copias de la SEQ ID NO: 23 o la SEQ ID NO: 20. El intensificador que incluye la SEQ ID NO: 20 o la SEQ D NO -.23 puede estar inmediatamente contiguo a un AKJ I-ÍC codifica para polipéptido. De rúc'.icra alternativa, el intensificador puede estar ser?..ado por 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75 ó 100 nucleótidos del ADN que codifican para polipéptido. Además, o de manera alternativa, el intensificador puede estar contiguo a, o separado por 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75 ó 100 nucleótidos, de un promotor APEG-l o de un promotor heterologo. De preferencia, la expresión de un polipéptido bajo el control del intensificador APEG (por ejemplo, la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20 Ó SEQ ID NO: 23) es por lo menos 50% mayor (por ejemplo, según se mide en la cantidad de transcripto de ARNm que codifica para polipéptido) , de preferencia por lo menos 100% mayor, con más preferencia por lo menos 200% mayor y todavía con más preferencia por lo menos 400% mayor en células de músculo liso vascular que en células de músculo liso no vascular. Con la máxima preferencia, el intensificador de APEG-l dirige la expresión de polipéptido específica para células de músculo liso vascular y dirige la expresión de polipéptido insignificante en tipos de células de músculo no liso.

Además, la secuencia del intensif icador puede regular la expresión específica de la etapa de desarrollo, por ejemplo, la expresión preferencial en células de embrión, de una secuencia que codifica para polipéptido. El ADN de la invención (seruencia ligado a una secuencia de ADN que codifica para "..i polipéptido que no es APEG-1 (es decir, un polipéptido heterólogo) , y funcionar para regular la transcripción específica de célula de músculo liso vascular de la secuencia que codifica para e polipéptido. Entre los ejemplos de estos polipéptidos se incluye: el activador de plasminógeno de tejido (tPA) , el inhibidor del ciclo celular p21, la óxido nítrico sintasa, el ? interferón y el polipéptido natriurético atrial . La invención incluye también un vector que contiene al ADN intensificador de la invención (ligado operativamente a una secuencia de ADN que codifica para el polipéptido) y a una célula de músculo liso vascular que contienen al vector. Dentro de la invención, también está un método para dirigir la expresión específica de célula lisa vascular del polipéptido mediante la introducción del vector en una célula de músculo liso vascular y el mantenimiento de la célula bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido, por ejemplo, por la introducción del vector en un paciente humano para terapia génica.

El vector de la invención puede utilizarse para terapia génica. Por ejemplo, el vector puede introducirse en una célula de músculo liso vascular para dirigir la expresión específica de células de músculo liso vascular de un polipéptido . Si vector de la invención también uede utili^ai ;--; para dirigir la expresión especí £?.·a de la etapa d-.= desarrollo, por ejemplo, la e presan preferencial de un polipéptido por células de embrión, que incluye introducir el vector de la invención, en una célula de músculo liso vascular. La invención también representa un método para inhibir la proliferación de células de músculo liso vascular mediante la administración de un polipéptido APEG-1 a las células. La invención también representa un producto génico variante específico de célula de músculo estriado que surge del mismo ADN genómico que codifica para el APEG-1, y proporciona, por lo tanto, un ADN prácticamente puro (por ejemplo, ADN genómico, ADNc o ADN sintético) que codifica para un polipéptido génico expresado de preferencia en músculo estriado (SPEG) . El ADN puede codificar para un polipéptido SPEG de mamífero de origen natural, como por ejemplo, un polipéptido SPEG humano (SEQ ID NO: 14) o un polipéptido SPEG de ratón (SEQ ID NO: 16) Por ejemplo, la invención incluye variantes de degeneración del ADNc humano (SEQ ID NO:13) o de ADNc de ratón (SEQ ID N0:15). La invención incluye también un ADN prácticamente puro que comprende una cadena que se híbrida en condiciones muy severas con un ADN que tiene la aecuenria de SEQ ID NO: 13 ó 15, o comnleraeni-os Un ADN prácticamente puro qup Liene por lo menos 50% de identidad de secuencia (de preferencia por lo menos el 70%, con más preferencia por lo menos el 80% y con la máxima preferencia por lo menos el 90%) con respecto a la SEQ ID NO: 13 ó 15 y que codifica para un polipéptido que tiene una actividad biológica de un polipéptido SPEG también queda dentro de la invención. La invención incluye también un ADN prácticamente puro que contiene un promotor específico de célula de músculo estriado inducible o constitutiva, por ejemplo, un promotor SPEG que está de preferencia, en un vector en el cual un gen heterologo puede ser o ha sido clonado, y bajo el control de tal promotor, el gen puede expresarse. El promotor es, de preferencia, específico para células de músculo estriado (por ejemplo, células de esqueleto o de músculo cardiaco) . El ADN que codifica para SPEG puede estar ligado operativamente a estas secuencias reguladoras para la expresión del polipéptido SPEG en células de músculo estriado.

La invención proporciona también un método para dirigir la expresión específica de células de músculo estriado de una proteína mediante la introducción, en una célula, de un ADN aislado que contiene una secuencia que 5 codifica para la prot ína ligada operativamente al promotor- específico J-¿ célula estriada. Una célula qui ¾.<.-.. iene el ADN vector de la invención también envida dentro de la invención . La invención describe también a un polipéptido ^ 10 SPEG prácticamente puro que tiene una secuencia represora transcripcional de acción en cis derivada de APEG-1. Un "represor transcripcional de acción en cis", como se utiliza aquí, es un ácido nucleico que funciona para disminuir la transcripción de una secuencia de ácido 15 nucleico ligado operativamente. Por ejemplo, la transcripción de una secuencia ligada operativamente disminuye cuando un represor de acción en trans, por ' N ejemplo, una proteína intracelular endógena que se une a la secuencia represora de acción en cis, se une al represor de 20 acción en cis. La inhibición de la unión del represor de acción en trans, por ejemplo, por la administración de un compuesto exógeno que se una al represor transcripcional de acción en cis, conduce a la desrepresión y a un aumento concomitante en la expresión del ácido nucleico ligado 25 operativamente.

La secuencia represora transcripcional de acción en cis puede estar unida a otros elementos de acción en cis, por ejemplo, copias adicionales de la secuencia represora transcripcional de acción en cis. Los elementos pueden estar contiguas o separados por el AD no involucrado d. la regulación de la transcripcló.., por ejempT , un elemento represor puede estar en una posición inmediatamente adyacente al elemento promotor o a varias kilobases en sentido 51 o en sentido 3 ' del sitio de inicio transcripcional. En algunas modalidades, la secuencia represora transcripcional de acción en cis se híbrida hacia una secuencia entre la que se incluyen nucleótidos -3337 a -2663 de la región 5' del gen APEG-1 de ratón (SEQ ID NO:24). En otras modalidades, la secuencia represora transcripcional de acción en cis comprende la SEQ ID NO:24. La secuencia represora transcripcional de acción en cis puede ser, por ejemplo, de menos de 4.0 kb, 3.0 kb, 1.5 kb, 1.0 kb o aún de 670 nucleótidos de largo. En algunas modalidades, el ácido nucleico que continúa la secuencia represora transcripcional de acción en cis no incluye a la secuencia de SEQ ID NO:23. La invención incluye también a un vector que comprende a la secuencia represora transcripcional de acción en cis.

En un aspecto adicional, la invención incluye un método para evaluar un compuesto respecto a su capacidad de unirse a una secuencia represora transcripcional de acción en cis de célula de músculo liso vascular. El método incluye poner en contacto el compuesto con una secuencia represora tr ii.- -j.ipcional de acción en cis de ·£] uia de músculo liso vascular y determinar la cantil-va. de unión del compuesto a la secuencia represora transcripcional de acción en cis de la célula de músculo liso vascular. La secuencia represora transcripcional de acción en cis puede ser, por ejemplo, una secuencia que se híbrida bajo condiciones muy severas con la SEQ ID NO: 24 y puede ser la SEQ ID NO: 24. En un aspecto adicional, la invención incluye un método para evaluar a un compuesto con respecto a su capacidad de unirse a una secuencia represora transcripcional de acción en cis. En este método, el compuesto se pone en contacto con una célula de músculo liso que contiene un ácido nucleico que comprende una secuencia represora transcripcional de acción en cis de célula de músculo liso vascular que está ligada operativamente a una secuencia que codifica para una molécula indicadora que está en contacto. Se mide la cantidad de la molécula indicadora expresada por la célula, y una alteración en el nivel de la molécula indicadora expresada en la presencia del compuesto en comparación con el nivel en ausencia del compuesto, indica que el compuesto se une a una secuencia represora transcripcional de acción en cis de célula de músculo liso vascular. En otro aspecto, la invención incluye un método para evaluar un ^apuesto respecto a su capacidad ríe huirse para aum ;icar la expresión de APEG-1. En es*"t: método, una célula de músculo liso vascular se pone en contacto con un compuesto prueba, y se mide la cantidad de polipéptido o transcripto de APEG-1 en la célula de músculo liso vascular. Un aumento en la cantidad de transcripto de APEG-1 o producto de gen indica que el compuesto aumenta la expresión del APEG-1. En un aspecto adicional, la invención incluye un método para inhibir la proliferación de células de músculo liso vascular mediante el contacto de un compuesto que se une a una secuencia represora transcripcional de acción en cis de célula de músculo liso vascular. El compuesto se proporciona en una cantidad efectiva para inhibir la proliferación de la célula de músculo liso vascular. En algunas modalidades, la secuencia represora transcripcional de acción en cis incluye una secuencia que se híbrida a condiciones muy severas para la SEQ ID NO:24. Por ejemplo, la secuencia represora transcripcional de acción en cis, comprende la SEQ ID NO: 24.

Otras particularidades y ventajas de la invención serán evidente a partir de la siguiente descripción de las modalidades preferidas de la misma y a partir de las reivindicaciones .

DESCRIPCIÓN DETALLADA í- describirán primero los dibujos. La Figura 1 es un diagrama de flujo del procedimiento de despliegue del ARNm diferencial para identificar la secuencia de APEG. La Figura 2A es una fotografía de un despliegue de ARNm diferencial que muestra el APEG-1 expresado de manera preferencial en la aorta de rata. La expresión diferencial fue probada entre 6 tejidos de rata. Se indican bandas únicas en la aorta que fueron eluidas y que se volvieron a amplificar para análisis subsecuente (·) . La Figura 2B es una fotografía de un despliegue de ARNm diferencial que muestra el APEG-2 expresado de manera preferencial en la aorta de rata. La expresión diferencial fue probada entre 6 tejidos rata. Se indican bandas únicas en la aorta, que fueron eluidas y que se volvieron a amplificar para análisis subsecuente (·) . La Figura 2C es una fotografía de un despliegue de ARNm diferencial que muestra el APEG-3 expresado de manera preferencial en la aorta de rata. La expresión diferencial fue probada entre 6 tejidos de rata. Se indican bandas únicas en la aorta, que fueron eluidas y que se volvieron a amplificar para análisis subsecuente (·) . La Figura 2D es una fotografía de un despliegue de ARNm diferencial oue muestra el APEG-4 expresado de manera preferencia! en la aorta de rata. La expr.;s. u diferencial iue probada entre 6 tejidos de -"uca. Se indican bandas únicas en la aorta, que fueron eluidas y que se volvieron a amplificar para análisis subsecuente (·) . La Figura 2E es una fotografía de un análisis de transferencia Northern que muestra la expresión del tejido de APEG-1. Se utilizaron diez microgramos del ARN total de cada tejido en el análisis Northern. La carga del ARN de cada tejido se normalizó comparando las señales de hibridación de ARNr 18s (mostrado en la Figura 2F) . La Figura 2F es una fotografía de un análisis de transferencia Northern que muestra el ARNr I8s. La Figura 2G es una fotografía de un análisis de transferencia Northern que muestra la expresión del tejido de APEG-2. Se utilizaron diez microgramos de los ARN totales de cada tejido en el análisis Northern, y la carga de ARN de cada tejido se normalizó comparando las señales de hibridación de ARNr 18s. La Figura 2H es una fotografía de un análisis de transferencia Northern que muestra la expresión del tejido de APEG-3. Se utilizaron diez microgramos del ARNs total de cada tejido en el análisis Northern, y la carga de ARN de cada tejido se normalizó comparando las señales de hibridación de ARNr 18s. 5 La Figura 21 e^ una fotografía de un análisis de transferencia Nort eir: que muestra la expresión del te ida de APEG-4. L utilizaron diez microgramos del LOS ARN totales de cada tejido en el análisis Northern, y la carga de ARN de cada tejido se normalizó comparando las señales { ) 10 de hibridación de ARNr 18s. La Figura 3A es una fotografía de un análisis de transferencia Northern que utiliza ADNc de longitud total de APG-1 (ADNc total de APEG-1) como una sonda. Se analizaron las muestras de ARN provenientes de órganos de 15 rata. Las bandas respectivas están etiquetadas en la Figura 3D. La Figura 3B es una fotografía de una análisis de ^ transferencia Northern que utiliza un fragmento de ADNc 3 ' clonado originalmente por despliegue de ARNm diferencial 20 (frag. D.D. 3' APEG-1) como una sonda. Se analizaron las muestras de ARN de 12 órganos de rata. La Figura 3C es una fotografía de una transferencia Northern que muestra las bandas de ARNm 18s (18s ARNr) en donde la carga de ARN fue normalizada. 25 La Figura 3D es una gráfica de barras que muestra la distribución de tejido de la expresión del gen APEG-1. La Figura 4 es un diagrama de flujo que muestra la estrategia de clonación para el APEG-1. Una biblioteca de ADNc aórtico de rata, establecida en el vector pcJATA de expresión de levadura (13) se clasificó para aislar el ADNc del APEG-1 de longi ud completa. Se llevó a cabo un análisis para confirmar la presencia de FEG-1 en esta biblioteca de ADNc. Los fragmentos de ADNc digeridos por la enzima de restricción (Eco I y Xhol) (14) se separaron en un gel de agarosa (15) y las porciones que contenían ADNc de APEG-1, según de determinó por análisis Southern y marcadores de tamaño, se extrajeron para eluir el contenido de ADNc (17) . Los ADNc eluidos (18) se ligaron con vectores pSP72 linearizados (19) y los ADN ligados se utilizaron para transformar células DHa5 de E. coli competentes (20) para establecer una sub-biblioteca de ADNc aórtica de tamaño seleccionado (21) . Esta sub-biblioteca de ADNc se tamizó por el fragmento 3' de ADNc de APEG-1 para obtener su ADNc de longitud total. La Figura 5 es un diagrama de la secuencia de nucleótido de ADNc de APEG-1 de rata (SEQ ID NO:l). El marco de lectura abierto más largo está ubicado desde el nucleótido 169 hasta el 511 (LETRAS MAYÚSCULAS NEGRITAS) y el ATG que flanquea los nucleótidos que coinciden con la secuencia de consenso Kozak están indicadas (LETRAS MAYUSCULAS) . Un marco de lectura muy corto abierto en la región 5' está presente desde el nucleótido 102 hasta el 116 (en letras itálicas) . Hay una señal de poliadenilación (subrayada) de 21 nucleótidos en la región 5' de la cola poli -A. El sitio de empalme de cebador del cebador arbitrario 5' utilizado la PCR de despliegue diferencia.1, inicial también "-.i indica (LETRAS MAYÚSCULAS ITÁLICAS1* . La Figura 6 es un diagrama de la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) deducida a partir del marco de lectura abierto de ADNc de APEG-1 más largo (SEQ ID NO: 2) . Los sitios de fosforilación posibles dé proteína quinasa C y de caseína quinasa-2 están indicados (letras negrillas) . También se muestra un sitio de unión de integrina (letras itálicas negrillas). »***» representa un codón de finalización. La Figura 7A es una fotografía de productos de transcripción in vitro del gen APEG-1. El ADNc de APEG-1 de 1.3 kb y un molde de ADN control positivo se transcribieron por ARN polimerasa T7 1 µ? de los productos de ARN de 20 µ? se resolvieron en un gel de agarosa desnaturalizante al 1.2%. La Figura 7B es una fotografía de productos de traducción in vitro del gen APEG-1. El ARNm de APEG-1 transcrito in vitro se tradujo por extracto de germen de trigo en la presencia de [35S] -metionina y se separó en un gel de tricina-SDS-poliacrilamida al 10%. En la reacción simulada, el molde de ARNm estuvo ausente. La Figura 8 es una alineación de secuencia de aminoácidos de APEG-1 (SEQ ID NO:8), de la quinasa de cadena ligera de miosina de pnllo (fhkMLCK) ; SEQ ID NO:5) y de conejo (RabMLCK; SEQ 0 NO: 7) y de teloquina de pollo (ChkTelo; SEQ ID :<±) y de conejo (RabTelo; SEQ ID ??·.. . También se muestra una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 9) para indicar los residuos de aminoácido que son idénticos entre estas proteínas. El residuo de serina conservado que es fosforilado por quinasa de proteína dependiente de cAMP está marcado por un asterisco (*) . La Figura 9A es un diagrama del ADNc de APEG-1. El ADNc de APEG-1 se dividió en cuatro fragmentos por digestión de enzima de restricción EcoR I, BamHI , Hind III y Xhol . Los tres fragmentos grandes (405, 299 y 432 pares de bases) se utilizaron para explorar el ARN de seis tejidos de rata para mostrar sus distintos patrones de hibridación. La Figura 9B es una fotografía de un análisis Northern que utiliza el fragmento de 405 pares de bases de ADNc de APEG-1 como una sonda. La Figura 9C es una fotografía de un análisis Northern que utiliza el fragmento de 299 pares de bases de ADNc de APEG-1 como una sonda.

La Figura 9D es una fotografía de un análisis Northern que utiliza el fragmento de 432 pares de bases de ADNc de APEG-1 como una sonda. La Figura 10 es una fotografía de un análisis fouthern genómico del gen APEG-1. El ADN genómico proveniente de las células J¾ músculo liso aórtico de rata cultivadas se recole taron y digirieron con EcoRI , HindTT... o BamHI . El ADNc de longitud total de APEG-1 se utilizó como sonda en el análisis Southern. El tamaño de cada banda (indicado a la derecha) se determinó de acuerdo con marcadores de tamaño (indicados a la izquierda) . La Figura 11A es una fotografía de tinción de bromuro de etidio de las 3 clonas de homologas humanos de APEG-1 de rata. La clona 1 (1.1, 1.2), la clona 2 (2.1, 2.2) y la clona 3 (3.1) fueron de 1.45, 2.0 y 2.7 kb de tamaño, respectivamente. La Figura 11B es una fotografía de un análisis Southern que muestra la hibridación de estos homólogos de humano con una sonda de ADNc de APEG-1 de rata. La Figura 12 es una fotografía de un análisis Northern de la expresión de APEG-1 in vi tro. Los ARN de células de músculo liso aórtico de rata (RASMC) y de células endoteliales microvasculares (RMEC) se purificaron y se separaron en un gel de agarosa desnaturalizante al 1.2%. El ARN de aorta de rata normal se utilizó como control positivo. El ADNc de APEG-1 se utilizó como sonda en análisis Northern para examinar su expresión en estos dos tipos de célula. La Figura 13A es una fotografía de un análisis 5 Northern que muestra la expresión de APEG-1 en arteria carótida de rata, durante .:n lesión de globo. Se purificaron los ARN de .arterias carótidas de rata 2, 5 y 8 días después de la lesión de globo. Estas ratas con lesión se utilizaron en cada punto del tiempo y dos ratas sin [ } 10 lesión se utilizaron como control. El ADNc de APEG-1 se utilizó en el análisis Northern y las intensidades de banda se normalizaron por señal de ARNr 18s. La Figura 13B es una gráfica de barras que muestra la expresión de APEG-1 en arteria carótida de rata 15 durante la lesión de globo. Cada columna representa la media de expresión de APEG-1 en las bandas del análisis Northern mostradas en la Figura 13A, expresadas como un por ¦' N ciento del control ± un error estándar. La Figura 14A es una fotografía de un gel de 20 tricina-SDS-PAGE al 10% de tinción con azul de Coomassie que muestra la proteína de fusión FLAG-APEG- 1 purificada. M : marcador de tamaño de la proteína. Ext: extractos de célula bacteriana inducida. FT: extracto de célula que fluyó a través de la columna de afinidad de péptido FLAG. 25 La Figura 14B es una fotografía de un análisis Western de la proteína de fusión purificada. Un anticuerpo monoclonal anti-péptido FLAG , M2 (IBI) , se utilizó para identificar la pureza de la proteína de fusión. Un: extractos de célula bacteriana no inducida. In: extractos de cólula bacteriana inducida. PT: extracto de célula que fluyó a través de la columna A-i jiinidad de péptido FLAG. La Figura 15 una gráfica de barras que compara la expresión de APEG-1 en ratas diabéticas y ratas control. La expresión APEG-1 se determinó en ratas diabéticas (prueba T no apareada: Ti0=3.284, valor p=0.0033) . La Figura 16 es un diagrama que muestra la secuencia de ADNc de APEG-1 de humano (SEQ ID NO: 11) . La Figura 17 es un diagrama que muestra la secuencia de aminoácidos de APEG-1 de humano (SEQ ID NO:12) . " * " representa un codón de finalización. La Figura 18A es una fotografía que muestra los resultados de un experimento de hibridación in si tu. Se seccionó la luz de la aorta de una rata y se llevó a cabo la hibridación utilizando una sonda de ADN de cadena homosentido de APEG-1 de rata, como control. La Figura 18B es una fotografía que muestra la expresión de ARNm de APEG-1 en la luz de una aorta de rata. Se llevó a cabo la hibridación in situ, utilizando una sonda de ADN de cadena antisentido de rata para medir la expresión de APEG-1 de rata en tejido aórtico. Las Figuras 19A-C son diagramas que muestran el patrón de uso del exón en las transcripciones de APEG-1 y de SPEG. La Figura 19A es un diagrama que muestra el arreglo intrón/exón del locus APEG/SPEG. La Figura 19B es un diagrama que muestra el uso 5 de] exón APEG-1. La Figura 19C es un diagrama que muestra el uso del exón SPEG. La Figura 20 ^.s un diagrama que muestra la secuencia de ADNc de SPEG de humano (SEQ ID NO: 13) . La Figura 21 es un diagrama que muestra la ( 10 secuencia de aminoácidos de SPEG de humano (SEQ ID NO: 14) . La Figura 22 es un diagrama que muestra la secuencia de ADNc de SPEG de ratón (SEQ ID NO: 15) . La Figura 23 es un diagrama que muestra la secuencia de aminoácidos de SPEG de ratón (SEQ ID NO: 16) . 15 La Figura 24A es un diagrama que muestra la construcción de PGL-3. La Figura 24B es una gráfica de barras que ¦ muestra los resultados de los exámenes indicadores de v. / transfección que utilizan la secuencia 5' de APEG-1 de 3.3 20 kb. Líneas celulares utilizadas: RASMC : células de músculo liso aórtico de rata; BAEC: células endoteliales aórticas de bovino; HeLa : línea celular de carcinoma epidermoide humano; U-2 OS: células de osteosarcoma humano; HepG2 : células de hepatoma humano, NIH 3T3 : fibroblastos de ratón. 25 La Figura 25 es un diagrama que muestra la secuencia de un fragmento de 2.7 kb que contiene actividad promotora específica de célula de músculo liso vascular 5' de APEG-1 (SEQ ID NO: 17) . La Figura 26 es un diagrama que muestra una comparación de. las secuencias de aminoácido de APEG-1 de longitud completa de humano, ratór. ^ ..acá. La Figura 27 es an diagrama que muestra una comparación de las secuencias de aminoácido de SPEG parcial en humano y en ratón. "*" representa un codón de finalización. La Figura 28 es un diagrama que muestra la secuencia de un ADN de nucleótido 73 (SEQ ID NO:20) que contiene actividad promotora específica de célula de músculo liso vascular de APEG-1. La Figura 29 es una gráfica de barras que muestra los resultados de los exámenes indicadores de transfección que utilizan un fragmento de 73 pares de bases de la secuencia 5' de APEG-1. Líneas celulares utilizadas: RASMC: células de músculo liso aórtico de rata; U-2 OS: células de osteosarcoma humano; HeLa: una línea celular de carcinoma epidermoide humano y BAEC : células endoteliales aórticas de bovino. La Figura 30 es una gráfica de barras que muestra los resultados los exámenes indicadores de transfección que utilizan plásmidos indicadores construidos a partir de la región promotora de APEG-1. La Figura 31 es un diagrama que muestra la secuencia de nucleótido desde -3337 hasta +76 de la región 5' del gen APEG-1 de ratón. Triángulos abiertos en -3337 y -266'·» denotan una secuencia represora trarscripcional de '..ión en cis, y triángulos abiertos +38 y +76 indican una secuencia de intensificac-1 Cu transcripcional de acción en cis. La Figura 32 es una gráfica de barras que muestra actividad luciferasa relativa en RASMC para las construcciones p ( -33376/+76) , p (-33376/+76) Rev y p(-2663/ + 76) . La actividad se muestra como un porcentaje de actividad luciferasa producida por p(-2663/+76) .

Purificación de los ARN totales El ARN total se recolectó de órganos de ratas macho Sprangue-Dawley . Los órganos extirpados se lavaron en solución salina amortiguadora de fosfato y se sometieron a congelación rápida en nitrógeno líquido. La adventicia de la aorta se retiró y el contenido del intestino delgado se retiró antes de la congelación. Los órganos congelados se homogeneizaron y los ARN se recolectaron por extracción en ácido guanidinio-tiocianato- fenol -cloroformo (Chomczynski , P. et al., 1987, Anal. Biochem. 162 (1) : 156-9) . El ARN de embrión de ratón se recolectó de embriones completos. Los ARN de cultivo celular se purificaron por ultracentrifugación en guanidinio/CsCl .

Despliegue de ARNm diferencial 5 Cincuenta mic .ogramos del ARN total se trataron con DNasa T {Líuenringer Mannheim) para retirar ^l ADN genómi e contaminante en la presencia H-Ü inhibidor de RNasa, RNasin (Promega) . Después de la extracción fenol/cloroformo y de la precipitación en etanol, la ( ) 10 concentración de ARN se ajustó a 0.1 g/ml en dH20 tratado con DEPC. La primera cadena de ADN se sintetizó utilizando transcriptasa inversa, MLV (GIBCO, BRL) , con el cebador de anclaje de poli-A 3' Ti2VG (51 -TTTTTTTTTTTTVG-3 ' ) (SEQ ID NO:10) . Subsecuentemente la reacción se calentó a 95°C 15 para inactivar la transcriptasa inversa y los productos de ADNc se almacenaron a -20°C. Se utilizaron dos microlitros del ADNc en reacciones PCR de 20 µ? (2 µ? de ADNc, 0.2 µ? ( \ de cebador arbitrario 5 ' , 1 µ? de cebador Ti2VG 31 , 1.5 mM Mg2+, 2.5 µ? de dNTP, 12.5 µ?? 35S-dATP, 1 unidad de ADN 20 polimerasa Taq; 94°C durante 15 segundos, el ciclo térmico fue de 40°C durante 30 segundos y de 72 °C durante 30 segundos; el ciclo térmico se repitió por 40 ciclos) después de la transcripción inversa. Se añadió amortiguador de carga de muestra (formaldeído al 98%, azul 25 de bromofenol al 0.05% y xilencianol al 0.05%) y las muestras se calentaron a 95°C antes de cargarlas en un gel de secuenciación al 6%. La exposición durante toda la noche de los geles de secuenciación secos a películas X-OMAT (Kodak) normalmente fue suficiente para desplegar los patrones de ARNm diferenciales.

Reampli ilación de ADNc eluidos Las bandas de interés en el gel seco se extrajeron, se empaparon en 200 µ? de dH20 durante 10 minutos a temperatura ambiente y se eluyeron por calentamiento a 95°C durante 15 minutos. Después de una breve centrifugación, los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos y los ADN eluidos se precipitaron en etanol a -20°C en la presencia de 20 9 de glicógeno y 300 mM de acetato de sodio. Los ADN precipitados se recolectaron por centrifugación y se lavaron con etanol al 70%. Los granulos de ADN secos se resuspendieron en 10 µ? de dH20 y se reamplificaron en forma no radioactiva por PCR con la misma condición y cebadores PCR iniciales, excepto porque el volumen de la reacción se aumentó a 100 µ? con 25 µ? de dNTP. Los ADN reamplificados se resolvieron en gel de agarosa al 1% para determinar sus tamaños y cantidades.

Electroforesis en ael y transferencia Northern del ARN Diez microgramos del ARN total se desnaturalizaron por calor y se cargaron en un gel de agarosa de desnaturización (agarosa al 1.2%, formaldehído al 1.1%, 0.5 ng/ml de bromuro de etidio en amortiguador MOPS) . La electroforesis se llevó a cabo a 10 V/cm durante 5 tres a cuatro horas. Se tcnó una fotografía del patrón d manchas de bromuro e etidio para los ARN, bajo iluminL.-u.0n con luz tp.. Se transfirieron entonces los AR a una membrana Nitropure (Micron Separation Inc.) mediante el procedimiento de transferencia estándar (Ausubel , F.M., et 10 al., ed. Current Protocole in Molecular Biology, ed. K. Janssen., 1994, Vol . 1., Current Protocols : 4.9.1- 14 ) .

Electroforesis en gel y transferencia Southern del ADN Los ADN se cargaron y se separaron en un gel de 15 agarosa al 1%, seguido por transferencia Southern estándar (Ausubel, F.M., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, ed. K. Janssen., 1994, Vol. 1., Current Protocols : 2.9.1-15) . Los ADN en el gel se desnaturalizaron \ ,7 en el amortiguador de desnaturalización (1.5 M de NaCl , 1 M 20 de TrisCl, pH 7.4) antes de transferirlos a una membrana Nitropure en solución 20 x SSC durante toda la noche.

Hibridación v cebado aleatorio Se generaron sondas de ADN radioactivas por 25 cebado aleatorio (Boehringer Mannheim) con 25 a 50 ng del fragmento de ADN. La hibridación para las transferencias de ADN o ARN se llevó a cabo en solución QuikHyb (Stratagene) con 1 x 106 cpm/ml de sondas radioactivas y 0.2 mg/ml de ADN de esperma de arenque (Boehringer Mannheim) a 68 °C du cante una a dos horas. Las trasferencias se le aron y se expusieron a película:; / . rayos X para .¡.egistros permanentes.

Cuantificación de las señales de hibridación Para cuantificar las señales de hibridación, se expusieron las transferencias de ADN y ARN a pantallas fosforescentes y después se exploraron mediante un explorador Phospholmager (Molecular Dynamics) operado por el programa ImageQuant (Molecular Dynamics) que corre en un sistema de computación Windows PC-DOS/MS (Compaq) . Las intensidades de las señales se cuantificaron por el mismo programa ImageQuant siguiendo las instrucciones del fabricante .

Análisis de secuencia y secuenciación de ADN Se utilizó el método de secuenciación de ADN por terminación de cadena de dideoxinucleótido para la secuencia de los ADN. Se incluyó siempre un microlitro de DMSO para reducir las estructuras secundarias de molde de ADN que pudieran interferir con la actividad enzimática Sequenase (USB) . Las secuencias se resolvieron en gel de secuenciación al 8% (National Diagnostics) . Las secuencias de ADN se almacenaron en una unidad principal de computadora local (mbcrr.harvard.edu) y se analizaron por un paquete de software pa->-a análisis de secuencia (Genetics Computer Group) .

Purificación y expresión de proteína de fusión El ADNc de APEG-1 se clonó en el vector pFLAG-2, después se transformó en células BL21 de E. coli. Las células BL21 transformadas se dejaron crecen a gran escala hasta una densidad óptica (OD595) de 1.75. El granulo celular se resuspendió en amortiguador de extracción (20 mM TrisCl, pH 7.4, p.2 mM EDTA, 1 M de NaCl , 1 mM de PMSF, 1 mM de DDT) y se sónico en hielo, después de lo cual el extracto se congeló y se descongeló tres veces en nitrógeno líquido y en un baño de agua a 42 °C. El extracto celular soluble se recolectó por centrifugación (12,000 x g, 4°C, 20 minutos) y se utilizó en la purificación de la proteína de fusión por cromatografía de afinidad con una columna de afinidad mAb de anti-péptido FLAG M2. La columna, cargada dos veces con el extracto celular soluble, se lavó secuencialmente con 50 mi de cada una de las siguientes soluciones: amortiguador TE/NaCl/NP-40 (20 mM TrisCl pH 7.4, 0.2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.5% NP-40) , amortiguador TE/NaCl (20 mM TrisCl pH 7.4, 0.2 mM EDTA, 150 mM NaCl) y amortiguador TE (20 mM TrisCl pH 7.4, 0.2 mM EDTA). La proteína de fusión FLAG-APEG-1 se eluyó con 10 mi de amortiguador de glicina (0.1 M de glicina, pH 3.0) y los eluidos se recolectaron lentamente en fracciones de 0.8 mi en tubos de microcentrif ycición que contenían soluciones d^ 50 µ? de TrisCl M, pH 8.0 y de 150 µ? de NaCl 5 v. La pureza de las proteínas de fusión purificadas se examinó por electroforesis de proteína y tinción de azul de Coomassie, así como por transferencia Western con mAb anti-FLAG.

Transferencia Western y electroforesis en ael de proteína : Un sistema de gel de tricina-SDS-poliacrilamida al 10% se utilizó para separar la proteína de fusión pFLAG-APEG-1 de expresión bacteriana (Schágger, H. et al., 1987, Anal. Biochem. 166:368-79). Este sistema se utilizó porque un gel de tricina-SDS-poliacrilamida al 10% tiene resolución superior para proteínas de menos de aproximadamente 14 kDa en comparación con un gel de glicina-SDS-poliacrilamida estándar. Después de la electroforesis, el gel de proteína se armó en un aparato de transferencia semiseca (Hoefer) y las muestras de proteína se transfirieron sobre una membrana PVDF (Millipore) en amortiguador de transferencia (25 mM de base Tris, 200 mM de glicina, metanol al 20%) a 125 mA durante una hora.

Traducción y transcripción in vi tro el ADNc de APEG-1 de rata se clonó en el vector pSP72 y se linealizó de manera que el ARN pudiera transcribirse desde su ru!:wtor T7 de la región 5 ' con la ARN polimerasa T7 La transcripción se llevó a cabo un sistema de transcripción T7 a gran escala (Novagen) en la presencia de 7.moGpppGTP para producir ARNm con remate. El ARNm transcrito in vi tro se tradujo en un sistema de traducción in vitro de extracto de germen de trigo (Promega) con la [35S] -metionina para producir proteínas radiomarcadas .

Localización celular El plásmido de expresión c-/nyc-rAPEG-l/pCR3 se construyó añadiendo, dentro del marco, una secuencia de ADN que codifica para una etiqueta de péptido c-Myc (EQKLISEED) al marco de lectura abierto del APEG-1 de rata, en el extremo 5', mediante técnicas PCR conocidas en la técnica (cualquier otro péptido detectable puede utilizarse como etiqueta para localizar el APEG-1) . Este fragmento de ADN híbrido se clonó entonces en el vector pCR3 de expresión eucariótica (Invitrogen, San Diego, CA) . Las células COS-7 se transfectaron en forma transiente con el plásmido de expresión c-myc-rAPEG- 1 por un método de DEAE-dextrano estándar (por ejemplo, el método descrito en Tan et al., 1994, Kidney Intern. 46:690). Las células U-2 OS se transíectaron en rorma transiente por el método de fosfato de calcio conocido en la técnica. Veinticuatro horas después de la transíecció^ , lad células fueron transferidas a un portaobjetos d^ dos cámara. Las células se fijaran con paraformaldehído al 4% en PBS después de crecimiento adicional de veinticuatro horas. La inmunotransferencia se efectuó con un anticuerpo monoclonal anti-c-Myc (9E10, Oncogene, Cambridge, MA) seguido por un anticuerpo secundario IgG antirratón de cabra, conjugado con rodamina (Sigma, S . Louis, MO) . El contrateñido de ADN nuclear se efectuó con Hoechst 33258 a una concentración de 1 µ/ml .

Cultivo celular Las células primarias de músculo liso aórtico de rata se mantuvieron en medio DMEM suministrado con suero de feto de ternera, L-glutamina 4 mM, HEPES 10 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 ng/ml de estreptomicina. Las células primarias endoteliales microvasculares de rata se mantuvieron en medio DMEM suministrado con suero de feto de ternera al 20%, L-glutamina 4 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 ng/ml de estreptomicina. BAEC se aislaron y cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (JRH Biosciences, Lenexa, S) suplementado con suero de feto de ternera al 10% (HyClone, Logan, UT) , 600 ^ig de glutamina/ml , 100 unidades de penicilina/ml y 100 µ de estreptomicina/ml . Las células de hepatom* huma-io HepG2 (ATCC HB- 8065) , las células de osteor.a .'^.u humano U-2 OS (ATCC HTB-96) , las células de ca^'.'inoma epidermoide humano (ATCC CRL-7923) , las células de hepatoma humano HepG2 (ATCC HB-8065) y los fibroblastos de ratón NIH 3T3 (ATCC CRL-1658) están disponibles de la American Type Culture Collection.

Purificación del ADN de plásmido Las preparaciones de miniescala (<20 µg) y de escala media (<200 µg) se purificaron por cromatografía de afinidad del ADN (Qiagen) . La purificación a gran escala de ADN plásmido se llevó a cabo de conformidad con los métodos de ultracentrifugación alcalina y lisis/CsCl (Ausubel, F.M., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, ed. . Janssen., 1994, Vol . 1, Current Protocols: 1.7.1-11) .

Purificación de ADN recombinante gtll Las placas simples positivas se escogieron y se empaparon en el medio de suspensión (NaCl 0.1 M, MgS04 10 mM, TrisCl 50 mM, pH 7.5 y gelatina al 0.01%) con una gota de CHC13. Las células competentes Y1090 de cepa E. coli recientemente preparadas se mezclaron e incubaron brevemente con el fago resuspendido. Las células infectadas se dejaron crecer toda la noche en un medio LB con MgS0 10 mM y maltosa al 0.2%. A la mañana siguiente se agregó una gota de clorofcrr. ; al medio, para lisar las células bacteriales p^i 15 minutos. Los residuos bacteriales se recolectaron por centrifugación y al sobrenadante limpio se añadieron 100 U Dnasa I y 100 ng de Rnasa A para digerir el ARN y ADN genómico de E. coli. Las soluciones de EDTA, TrisCl (pH 8.0), NC1 y proteinasa K se añadieron subsecuentemente a concentraciones finales de 50 mM, 100 mM, 200 mM y 100 ng/ml, respectivamente. La mezcla se incubó a 42 °C por 30 minutos. El ADN fago se extrajo entonces por fenol/cloroformo una vez y se precipitó añadiendo 0.6 x volumen de isopropanol en la presencia de NaOAc 300 mM. El ADN fago precipitado se recuperó por centrifugación y se lavó con etanol al 70%, se secó con aire y se disolvió después en 250 µ? de amortiguador TE (TrisCl 10 mM, pH 8.0, EDTA 1 mM) .

Clonación de genes APEG-1 Para clonar genes que se expresan, preferencialmente en la aorta, se preparó ARN de órgano total (1) proveniente de aorta de rata con la adventicia retirada y proveniente del cerebro, músculo esquelético, esófago, corazón e intestino. Mediante el uso de la técnica de despliegue de ARNm diferencial, una técnica que amplifica sistemáticamente los ARNm por medio de RT-PCR (2) con conjuntos distintos de cebadoras arbitrarios 5' y cebadores de anclaje oligo-dT 3' (4), los patrones de ARNm de los distintos órganos, compararon (7) . Los productos de PCR se resolvieron en un gel de secuenciación de poliacrilamida desnaturalizante (6) para desplegar patrones de ARNm que distinguen un órgano de otro. Las bandas que se separaron por electroforesis de gel representan la terminación 3' de los ADNc (3). Por lo tanto, una banda que está presente en un órgano pero no en los otros, sugiere que el gen sólo se expresa en ese órgano en particular (Figura 1) . Los ARNm específicos que estuvieron presentes solamente en la aorta fueron identificados y se clonaron. Los ARN de órgano se clasificaron con treinta y tres cebadores arbitrarios 51 en combinación con un cebador de anclaje oligo-dT 3' T12VG. Esta clasificación inicial cubrió el 21 por ciento de las 160 combinaciones de cebador necesarias para clasificar a todos los ARNm posibles para ser desplegados por esta técnica. Este estimado se basa en la presunción de que una combinación de cebador despliega aproximadamente 100 distintos ARNm de entre aproximadamente 15,000 distintas especies de ARNm que están presentes en cada célula. A partir de la clasificación inicial, se identificaron diecisiete bandas que estuvieron presentes 5 sol m t en la aorta. Estas bandas pe corearon del gel v¿) y los fragmentos de ADNc t>e eluyeron (9) y reamplificaron por PCR (10) ^ n los mismos cebadores que se utilizaron en sus RT-PCR originales. Estos ADNc reamplificados se etiquetaron con 32P (5) , después se 10 utilizaron en análisis de transferencia Northern (11) para confirmar su especificidad aórtica. Se descubrió que cuatro fragmentos de ADNc son específicos de aorta (Figuras 2A - 21) . Después de la clonación de estos cuatro fragmentos de ADNc por métodos de clonación TA (12) , las 15 clonas se designaron como APEG-1, APEG-2, APEG-3 y APEG-4. Sus secuencias de ADN se determinaron por el método de terminación de cadena de dideoxinucleótido y se compararon ¦ ? para conocer las secuencias de ADN enlistadas en la base de datos GENBANK®. El APEG-2 mostró secuencias idénticas a la 20 del gen S 22 de la rata. (Shanahan, C.M., et al., 1993, Circ . Res. 73 (1) : 193-204) , un gen específico de célula de músculo liso. Se descubrió que el APEG-4 tiene una secuencia casi idéntica a los genes TIMP-3 de pollo y de ratón (Inhibidor de tejido de metaloproteinasa-3 ) (Sun, Y., 25 et al., 19944, Cáncer Res. 54:1139-44; Leco, K.J., et al., 1994, J. Biol. Chem. 269 (12 ) : 9352 -60 ) . Los APEG-1 y APEG-3 no coincidieron con ninguno de los genes conocidos. El examen adicional de la distribución del tejido de expresión mostró que APEG-3 también estaba expresado en el pulmón, un resultado ?? observado en el análisis de transferencia «.·>-. hern inicial. En contraste, APEG- mostró la expresión más alta en la aorta entre docp órganos de rata (Figuras 3A - 3D) , confirmando así la especificidad de la expresión del tej ido .

Análisis de secuencia y clonación de ADNc de APEG-1 de rata El fragmento de ADNc 3' del APEG-1, derivado del despliegue de ARNm diferencial, se utilizó para tamizar una biblioteca de ADNc aórtica de rata (Figura 4) . Se determinó que el ADNc del APEG-1 clonado era de 1,808 pares de bases, consistentes con el tamaño del mensaje observado en el análisis de transferencia Northern. Las secuencias de ambas cadenas de ADNc se determinaron por la secuenciación de terminación de cadena de dideoxinucleótido con estrategias de avance de oligonucleótido y subclonación de fragmento. La secuencia de ADNc completa no tuvo contraparte homologa en la base de datos GENBANK®. El ADNc de APEG-1 de rata puede utilizarse entonces para tamizar una biblioteca genómica para obtener las secuencias promotoras específicas de célula vascular que regulan la expresión específica de célula de expresión del APEG-1. Para analizar la proteína codificada en ADNc de APEG-1, la secuencia que se buscó para posible codones de iniciación ?""? para la traducción del extremo r>' de la F.iO-iicia . El marco de lectura abi*=.r más largo en el ADNc de APEG-1 de rata (SEQ ID O: i) se extiende desde 169 hasta 511 nucleótidos (SEQ ID NO: 2) en dirección 5' del extremo 5' del ADNc. Se encontró otra secuencia ATG en el nucleótido 102 a 104 (Figura 5) , pero la traducción posible de este codón ATG precedente se terminó después de cuatro residuos de aminoácido, haciendo con esto improbable que sea el codón de iniciación utilizado in vivo. El marco de lectura abierto más largo tiene una secuencia de consenso Kozak (Kozqk, M. , 1987, J. Mol. Biol . 196:947-50) y codifica una proteína de 113 aminoácidos (SEQ ID NO:3) con un peso molecular pronosticado de 12,667 daltons y un pl estimado de 9.125 (Figura 6). Este producto de traducción pronosticado se confirmó por transcripción in vitro y traducción in vitro del ADNc de APEG-1, que rindieron un mayor producto de traducción de 12.7 kDa según se predijo por la secuencia de aminoácido deducida del marco de lectura abierto más largo (Figuras 7A-7B) . La comparación de la secuencia de aminoácido deducida de APEG-1 con la base de datos de proteína SwissProt nuevamente no mostró secuencia de proteína idéntica. Sin embargo, se identificó una región que es homologa a las proteínas de la familia de cadena quinasa ligera de miosina, que incluye teloquina y quinasas de cadena ligera de miosina (Figura 8) . Las quinasas de cadena ligera de miosina (MLCK) , pre:;ei;Lj:s en todas las células eucarió LCJ , son miembros de las quinasas de proteína dependj ".ites de Ca2+-calmodulina y fosforilan la subunidad de cadena libera de 20 kDa de miosina, una proteína que es importante en la regulación de la contracción de células de músculo liso, el movimiento de la vesícula secretora, la locomoción celular y los cambios en la morfología celular (Gallagher, P.J., et al., 1991, J. Biol. Chem. 266 (35) :23945-52) . la estructura de las MLCK es altamente conservada y se compone de varios dominios modulares. El término carboxil MLCK es el dominio de unión por calmodulina y tiene una función reguladora mediada por dos residuos de serina específicos que se fosforilan mediante proteína quinasa dependiente de cAMP. La fosforilación en estos dos sitios regula en sentido descendente la actividad de la quinasa MLCK disminuyendo la afinidad de MLCK para Ca2+-calmodulina . Uno de los dos residuos de serina fosforilada en el C terminal del MLCK se conserva en APEG-1 (Serl2) , que sugiere un sitio regulador de APEG-1. La teloquina, originalmente purificada como una proteína acídica de la molleja de pavo, como un proteína que tiene la misma secuencia de péptido de dominio terminal de carboxilo de los MLCK. Su transcripción de ARNm inicia a partir de un promotor que está ubicado en uno de los intrones MLCK. La regulación de transcripción t loqui a es indepínJ l nte de la regulación de MLCK a .'_. r que tener una secuencia idéntica al dominio ter.ninal carboxilo MLCK. Se ha propuesto que la teloquina sea una proteína de unión a la calmodulina (Holden, H.M., et al., 1992, J. Mol. Biol . 227:840-51), y se expresa en casi todas las células de músculo liso, excepto en la célula de músculo liso aórtica. No se expresa en ninguna de las células que no son de músculo (Gallagher, P.J., et al., supra) . Cuando la secuencia de polipéptido APEG-1 se comparó con aquello de los MLCK, hubo un 33% de identidad en el nivel de aminoácido. Sin embargo, varias líneas de evidencia indican que el APEG-1 no es un homólogo de rata de un MLCK. Primero, la comparación de secuencia del péptido de APEG-1 con el MLCK de músculo liso de rata tiene solamente un 24% de identidad, significativamente menor a la identidad entre APEG-1 y MLCK de conejo o de pollo. Segundo, la proteína APEG-1 se pronostica como una proteína básica, mientras que la proteína teloquina es acídica. Tercero, la teloquina de conejo no se expresa en la aorta, en contraste con el patrón de expresión específico de APEG-1. Cuando la proteína APEG-1 se analizó para identificar los motivos de secuencia, se identificó que diversos residuos eran capaces de ser fosforilados por proteína quinasa C y caseína quinasa-2. Una secuencia de péptido arg-gly-asp (RGD) se en la posición 90-92. Este motivo está presen*:e en muchas proteínas involucradas en la adhesión celular, así como en la señalización, e interactúa con su receptor de superficie celular, una integrina (Hynes, R.O. , 1992, Cell 69:11-25, Ruoslahti, E., et al., 1987, Science 238:491-6). Esta observación sugiere que la proteína APEG-1 juega un papel en la señalización celular. El motivo de dos residuos de cisteína, cuatro residuos en dirección 51 y seis residuos en dirección 31 de la secuencia RGD de unión con integrina, también se conservan en las desintegrinas , una familia de inhibidores de agregación de plaquetas encontrados en serpientes venenosas (Blobel, CP., et al., 1992, Curr. Opin. Cell. Biol . 4:760-5) . Se descubrió que también los 6 residuos del residuo de cisteína en dirección 3' de la secuencia RGD están presentes en la proteína de APEG-1.

Clonación de APEG-1 de ratón El ADNc de ratón que codifica para un marco de lectura abierto de APEG-1 se amplificó primero a partir de ARN aórtico de ratón por reacción de cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) con cebadores conservados entre las secuencias de rata y de humano. Utilizando cebadores anidados diseñados de acuerdo con el marco de lectura abierto de mAPEG-1, el extremo ?' del ADNc de ratón se obtuvo por RACE 31. Amba^ .' denas del ADNc deAPEG-1 completo de ratón se por lo menos una vez por el método de secuenciación de terminación de cadena dideoxi .

Análisis Northern y Análisis Genómico Southern de APEG-1 El ADNc de longitud completa del APEG-1 se empleo como la sonda para hibridar una transferencia Northern de ARN 12 -órgano. Además del mensaje de 1.3 kb que apareció en la aorta, se observaron otros dos mensajes mucho más largos (10-20 kb) en el músculo esquelético, el esófago y el corazón. Estos dos mensajes largos no se identificaron inicialmente por la sonda 3' del APEG-1, por lo tanto, es probable que la secuencia 51 del ADNc del APEG-1, se hibride en estas nuevas señales. Para probar esta posibilidad adicional, se utilizaron tres sondas diferentes provenientes de las porciones 5', media y 3' de la secuencia de ADNc del APEG-1, para el análisis Northern (figura 9A) . Los resultados indicaron que estos mensajes 10-20 kb se reconocieron por la porción 5' pero no por la porción 3' del ADNc APEG-1 (figuras 9B-9D) . Para determina la relación del transcripto aórtico 1.3 kb y de los transcriptos más grandes, se utilizaron una serie de sondas de expansión del gen APEG-1 en los análisis de hibridación de transferencia Northern del ARN aislado a partir de .AC-La, corazón y músculo esquelético de rata. Esto^ análisis revelaron que el gen APEG-1 define una familia de proteínas específicas del músculo celular que codifica para proteínas específicas de células de músculo liso y proteínas específicas de células de músculo estriado. Los transcriptos APEG-1 se detectaron solamente en el ARN aórtico. Los transcriptos grandes corresponden a isoformas de variantes que se han nombrado como SPEG. Los SPEG se detectan en ARN de músculo estriado (tejido esquelético y cardiaco) pero no se observan en el ARN aórtico. Los patrones de uso de exon en APEG-1 y SPEG se muestran en las figuras 19A-C. El gen APEG-1 se expande a 4.5 kb y está compuesto de cinco exones y cuatro intrones. Las sondas específicas de SPEG detectan los transcriptos de tamaño 10 y 12 kb que están compuestos de por lo menos siete exones. Tres de estos exones son compartidos con el gen APEG-1, mientras que por lo menos cuatro son únicos. El primer exon de APEG-1 se separa del exon SPEG más cercano en dirección 5' en 7 kb. Los patrones de expresión de tejido diferencial de APEG-1 y SPEG surgen de la utilización de diferentes promotores, zonas de unión alternativas o una combinación de dos de estos mecanismos. Las secuencias parciales de aminoácidos y nuc'Leótidos del SPEG humano se muestran el as figuras 20 y 21, respectivamente. Las parciales de nucleótidos y aminoácidos de EG de ratón se muestran en las figuras 22 y 23, respec ivamente. Una comparación de las secuencias parciales de aminoácidos de SPEG de humano y ratón se muestra en la figura 27.

Localización cromosomal del gen APEG-1 El gen APEG-1 se mapea con el cromosoma humano 2q33-34, que es una región que contiene varios genes implicados en enfermedades cardiovasculares.

Identificación de las secuencias APEG-1 asociadas que confieren expresión crénica de célula de músculo liso vascular Para determinar si un promotor específico de célula de músculo liso existe en 5' respecto al primer exon APEG-1, se utilizó una secuencia de flanqueo 5' APEG-1 de 3.3 kb en un análisis de transfección de gen indicador utilizando el plásmido indicador de luciferasa pGL3-C. Como se muestra en las Figuras 24A-B, se detectó un alto nivel de actividad de promotor dirigido por la secuencia de flanqueo 5' de APEG-1, en las células de músculo liso aórticas humanas y las células de músculo liso aórticas de rata. En contraste, como se observa en las figuras 24A-B, se detectó mínima actividad en cinco tipos de células de mÚbijuio no liso, entre las que se HJluyen las líneas celulares humanas HeLa, HepG2 y j-2 OS. La secuencia responsable de dirigir un alto nivel de actividad promotora se ha localizado adicionalmente dentro del fragmento 3.3 kb hasta la secuencia 2.7 kb mostrada en la figura 25. Las secuencias APEG-1 capaces de conferir expresión génica específica de célula de músculo liso vascular han sido localizadas todavía dentro de la secuencia de 2.7 kb hasta una secuencia de 73 nucleótidos (SEQ ID NO: 20) que se muestra en la figura 28. La secuencia corresponde a los nucleótidos 2666 a 2738 de la secuencia mostrada en la figura 25 (SEQ ID NO: 17) y a los nucleótidos +4 a +76 del transcripto APEG-1, en donde +1 es el primer nucleótido transcripto de acuerdo a lo que se determina por los ensayos de protección de ARNasa y de amplificación PCR 5* RACE. La secuencia de 73 nucleótidos incluye dos motivos de unión AP-2 y un motivo de unión de caja E (E-box) . Para demostrar su habilidad para conferir transcripción específica VSMC, se clonó una secuencia de 73 pares de bases en las dos orientaciones dentro del sitio Smal del promotor pGL3 para generar pGL3-Elbox y pGL3-ElEbox.Rev, respectivamente. Las construcciones pGL3-Elbox y pGL? -EH Ebox. Rev se muestran esquemátir-amento en la F'.'i'jiún izquierda de la figura 29. La .secuencia derivada de APEG-1 se muestra como un óval relleno, para denotar la región que contiene la caja E-box y con una cabeza de flecha para indicar la orientación relativa de la secuencia de 73 pares de bases en los dos plásmidos. Los dos plásmidos contienen, además, un promotor (P) derivado de SV40. También se muestra en el diagrama esquemático a las construcciones control pGL3 -Promotor, que contienen al promotor derivado de SV40 (P) pero carecen de un elemento intensificador y pGL3 -control , que contiene al promotor SV40 (P) y una región intensificadora SV40 (En) . La región intensificadora SV40 puede dirigir la transcripción en una variedad de tipos de células. Las construcciones se transíectaron cada una en células de músculo liso aórtico de rata (RASMC) , U-2 OS, HeLa y BAEC. La habilidad de activar la transcripción del promotor SV40 se determinó midiendo la actividad de luciferasa. La actividad de luciferasa para cada construcción en los tipos de células respectivos se muestra en la porción derecha de la figura 29. Para los datos mostrados, la actividad de luciferasa se midió en cada tipo de célula como un porcentaje de la actividad de luciferasa del pGL3 -control . Cada barra representa la media ± SEM. En todos los tipos celulares examinadas . la cor^ i ^ ión pGL3 -promotor demostró ac ivi ^ de luciferasa muy pobre. En contraste, el pl?s;uido pGL3 -control , que contenía al intensificador SV40, fue activo en todas las líneas celulares. Tanto pGL3-El Ebox como pGL3-El Ebox.Rev expresaron niveles de actividad de luciferasa comparables con pGL3 -control , solamente en RASMC. Los promotores dirigieron sólo un poco de la luciferasa, o absolutamente nada, en las líneas celulares U2-OS, HeLa o BAEC. Estos resultados demuestran que la secuencia de 73 pares de bases de APEG-l activa la transcripción RASMC-específica de forma que no depende de la orientación de la secuencia de 73 pares de bases con respecto al promotor SV40. La secuencia de 73 pares de base se caracterizó, además, por ensayo de desplazamiento de movilidad en gel para actividad de unión durante la incubación con extractos nucleares. Se hicieron estudios utilizando dos oligonucleótidos de doble cadena, de 18 pares de bases, derivados de la secuencia de exon 1 de APEG-l de ratón. Un oligonucleótido de 18-mer, llamado oligonucleótido E, tuvo la secuencia 5 ' -GGGCCTCAGCTGGGTCAG- ' (SEQ ID NO:21). Esta secuencia corresponde al motivo de la caja E (E box) en el fragmento de 73 pares de bases, así como 6 nucleótidos en dirección 5' y en dirección 3' de la caja E. El segundo oligonucleótido, llamado oligonucleótido Emut, tuvo la 5 secuencia 5 ' -GGGr TCAGCACGGTCAG-3 ' (SEQ ID NO:22). El oligonu leótido Emut fue de secuencia j.déntica al oligonucleótido E, excepto que el uucleótido TG de la secuencia de la caja E cambió por AC en la posición correspondiente de la secuencia Emut. ' 10 Cada oligonucleótido se marcó en su extremo con [?-32?]??? y se incubó con o sin extracto nuclear RASMC. La omisión del extracto nuclear RASMC originó que cada oligonucleótido marcado migrara hacia las posiciones esperadas para el oligonucleótido libre. 15 La incubación del oligonucleótido E con el extracto RASMC retardó la movilidad del oligonucleótido con relación a su migración como un nucleótido libre. No se observó movilidad alterada si el oligonucleótido E marcado se incubó con extracto nuclear RASMC en presencia de un 20 exceso molar de 100 veces del oligonucleótido E no marcado. En contraste, se observó todavía movilidad alterada después de la incubación del oligonucleótido E marcado con el extracto nuclear RASMC en presencia de un exceso molar de 100 veces el oligonucleótido Emut no marcado o con un 25 oligonucleótido no marcado que tiene una secuencia no relacionada al oligonucleo ido E. No se observó movilidad alterada durante la incubación del oligonucleotido Emut marcado y el extracto nuclear RASMC. Estos resultados muestran que el motivo que 5 contiene a la caja F> (E box) se une a uno o más componentes de los e- -idctos nucleares RASMC en una forn..?. específica pr>ta la secuencia. La unión de la región de 73 nucleótidos por un componente de los extractos nucleares RASMC también se ' " 10 determinó en un ensayo de huella de DNasa I. Una secuencia de ADN genómico de APEG-1 que corresponde a los nucleótidos de -132 a +76 pares de bases se radiomarcaron en los extremos 5' ó 3' con el fragmento Klenow y [a-32P]dNTP. Las sondas marcadas en el extremo se incubaron con albúmina de 15 suero de bovino (BSA) o con extracto de nuclear RASMC, y se sometieron a diversas cantidades de digestión con DNasal . La incubación con el extracto nuclear RASMC dio por ' resultado regiones protegidas que corresponden a los motivos de unión AP2 y Spl en la secuencia genómica APEG-1. 20 No se observó protección de estas regiones durante la incubación con BSA. Las regiones AP2 y SP1 se protegieron similarmente cuando los estudios con ADNasa I se efectuaron en un fragmento que tenía los nucleótidos -490 a +76 de la 25 secuencia genómica de APEG-1. En conjunto, los estudios de huella de ADNasa I revelan que los extractos nucleares VSMC tienen uno o más componentes que se unen a la región promotora APEG-1. Una serie de construcciones con deleción 3 ' con base en const ruccio-tes que contienen nucleótidos -479 a +715 de ]. -Legión 5' de APEG-1 o los nucleótidoc. · Í22 a +76 de ia región 5' (p(-479/+76) y p(-122/+76), respectivamente) , se construyeron para localizar adicional ente el elemento en cis positivo y para confirmar la presencia de la secuencia de exon I de 76 pares de base con importancia para actividad promotora. Las construcciones se transfectaron en RASMC y se determina la cantidad de actividad luciferasa con relación a la luciferasa generada por una construcción p ( -2653/+76) . Los resultados se muestran en la figura 30. Cuatro construcciones de deleción 5 ' (p-1073/+76) , p(-479/+76), p(-355/+76) y p(-122/+76) se elaboraron a partir de ( -2663/+76) . Los resultados demuestran que la mayoría de la actividad promotora APEG-1 está contenida dentro de p(-122/+76) . Dos construcciones de deleción 31 p(-479/+38) y p(-122/+38), que se elaboraron a partir de p(-479/+76) y p(-122/+76), mostraron actividad promotora mínima. Las construcciones ( -479/ +76) Emut y ( - 122/+76) Emut contienen una mutación de 2 pares de bases que cambia el motivo de la caja E en el exon 1 de CAGCTG a CAGCAC. El diagrama de la izquierda de la figura 30 muestra las longitudes relativas de las construcciones y las posiciones de las cajas CArG (cajas blancas) y la caja E (óvalo negro) . La mutación de la caja E está indicada por los óvalos achairad-JS . Los experimentos de transfección se repitie o.! por lo menos tres veces ^ ^a cada construcción y la actividad promotora SP expresó como un porcentaje de la actividad p ( -2663/+76) . En comparación con p(-479/+76), la secuencia que incluye -479 a +38 de la región 5" de APEG-1 ó -122 a -38 de la región 5', tuvieron actividad promotora mucho menor (16% y 4%, respectivamente) . Estos resultados demuestran que la secuencia entre los pares de bases +38 y +76 (SEQ ID NO: 23) en el exon 1 es esencial para la actividad promotora APEG-1. La secuencia SEQ ID NO se muestra en la figura 31 como la secuencia definida por triángulos abiertos en los nucleótidos +38 y +76. La secuencia entre los pares de bases +38 y +76 incluye un motivo de caja E (CAGCTG) en los pares de bases +39 a +44 (figura 31) . Para determinar si esta secuencia se requiere para la actividad, se preparó una construcción en donde la secuencia sea CAGCTG se alteró a CAGCAC en las construcciones p(-479/+76) y p(-122/+76). Como se demuestra por experimentos de transfección con p ( -479/+76) Emut y ( -122/+76) Emu , la mutación del motivo del exon 1 de la caja E produjo una reducción muy marcada en la actividad promotora APEG-1 (figura 30) . Estos datos muestran que este motivo de la caja E ubicado en la región 5 '-no traducida (5'-UTR) es esencial para la actividad promotora APEG-1 de alto nivel en RASMC. Auiiqj-o. no se encuentran típicamente.. está documentado que los elementos reguladorios de la transcripción se ubican hacia el 51 -UTR de algunos otros genes. Por ejemplo, el 51 -UTR del gen ICP22 del virus de herpes simplex tipo 1 y el gen ß3 de integrina humana, se ha reportado que contienen elementos de acción cis que median la expresión de alto nivel de estos genes (Greco et al., J. Gen. Virol . 75:1693-1702, 1994; Wilhide et al., Blood 90:3951-61, 1997). Además, el gen humano de A ?-globina también tiene elementos regulatorios en el 5 '-UTR. Uno de estos elementos se une al factor de transcripción eritroide GATA-1 y puede regular la transcripción del gen de A ?-globina humano durante el desarrollo (Amrolia et al., J. Biol. Chem. 270:12892-12898, 1995). Vale la pena notar que una de las cajas CArG y una de las cajas semejantes a Carg se ubicaron en los pares de bases -1531 a -1522 y -443 a -434 de la región de flanqueo 5' de APEG-1, respectivamente. La caja Carg es crucial para la expresión de varios genes SMC-específieos ( im et al.. Mol. Cell. Biol. 15:2266-2278, 1997; Herring et al., Am. J. Physiol . 272 :C1394-1404 , 1997; Shimizu et al., J. biol. Chem. 270:7631-43; Madsen et al . , J. Biol . Chem. 272:6332-6340, 1937), aunque no se conoce ninguna proteína de unión a la caja Carg que sea SMC-espec£fica . En el caso del promotor APEG-l, la deleción de las cajas Carg y la ce e; parecida a Carg no alteró su e.;:t- vidad (figura ..¦0) , lo que indica que las d ". cajas son innecesarias. Este factor distingue a APEG-l de otros genes SMC-específieos y sugiere la existencia de mecanismos independientes de Carg en la expresión del gen SMC-específico. Efectivamente, el promotor sin Carg del CRP2/SmLIM de ratón ha mostrado dirigir un alto nivel de la expresión génica del indicador VSMC-específico en ratones transgénicos (Yet et al., J. Biol. Chem. 273:10530-37, 1998) . Las secuencias capaces de dirigir la expresión específica de músculo estriado de los exones SPEG se determina al realizar ensayos de transfección celular como los antes descritos, utilizando la secuencia 5' para el primer exon SPEG.

Identificación de una secuencia represora transcripcional en la región 5' del gen APEG-l La expresión de APEG-l se sub-regula en VSMC desdiferenciado, tanto in vivo como in vitro. Por lo tanto, era inesperado que 2.7 kb (SEQ ID NO: 17) de la región de flanqueo 5' de APEG-1 dirigiera altos niveles de actividad promotora en RASMC cultivado y, por lo tanto desdiferenciado. Una explicación de esta anomalía es la presencia de elementos reg^atorios negativos de ADN fuera de la secuencia d; ilanqueo 5* de APEG-1 de 2.7 kb. ^ ra probar esta posibilidad, lo° plásmidos p(-3336/+76) y p ( -3336/+76) Rev se construyeron clonando una secuencia de flanqueo 5' adicional de APEG-1 de 685 pares de bases en el p (-2663/+76) , en las dos orientaciones. La secuencia de nucleótidos -3336 a +76 (SEQ ID NO: 24) se muestra en la figura 31 en triángulos abiertos en estas posiciones de nucleótido. Como se muestra en la figura 32, la actividad promotora de p(-336/+76) y p ( -3336/+76) Rev fue sólo el 20% de la actividad de la construcción del promotor APEG-1 de 2.7-kb, p ( -2663/+76) . Una secuencia ADN adicional de 4-kb (hacia el extremo 51 ) no disminuyó adicionalmente la actividad promotora. Estos resultados revelaron que un receptor de transcripción independiente de la orientación está ubicado entre los pares de bases -3336 y -2663 (SEQ ID NO: 24) .

Expresión de APEG-1 y SPEG en el desarrollo de ratones El ADNc del APEG-1 de longitud completa se utilizó para ARN de sonda aislado de embriones de ratón en diferentes etapas del desarrollo embrionario. El ARN se aisló del embrión íntegro para estos experimentos. La sonda APEG-1 se híbrido con un ARN de 1.3 kb proveniente de los embriones, iniciando 9. días post -coito (p.c.) y continuando 20 día-3 ..".o. Se observó fuerte hibridación C>.<Ü el ARN de lo" embriones de 11.5 a 20 días p.c. Los niveles de transcripción APEG-1 también se examinaron en forma post -natal en el ARN aislado del tejido cardiaco de rata. La hibridación de la sonda APEG-1 fue detectable en ARN a partir de ratas de dos días de nacidas, pero una leve hibridación se detectó en el ARN de ratas de 14 a 28 días de edad. Los experimentos de hibridación in situ del tejido cardiaco post-natal utilizando la sonda APEG-1 también revelaron un nivel disminuido de ARN de APEG-1. Es interesante observar que a medida que los niveles de ARN de APEG-1 disminuyen, los niveles de ARN de SPEG en el músculo estriado aumentan. Al considerarse esto con los datos de expresión específica de tejidos, estos resultados sugieren que los niveles de transcripción APEG-1 son altos durante el desarrollo embriónico, particularmente en el día 11.5 p.c. y en forma posterior. Los niveles de transcripción APEG-1 post-natales, por ejemplo el músculo cardiaco, disminuyeron. A medida que los niveles globales de APEG-1 disminuyeron, los niveles de transcripción SPEG en las células de músculo estriado aumentaron. El análisis de transferencia Southern sugiere que APEG-1 tiene una sola copia en el genoma de rata, pero sólo 5 hay una banda de 17.1 kb en el ADN genómico de rata digerido con EcoR 7. ,' iyura 10) . Este resultado indic;*, además, que es poco probable que los grandes mensa"í a sean productos de otros genes, a menos que estos otros genes estén estrechamente ligados con el APEG-1 sin que ; ? 10 intervenga ningún otro sitio EcoR I. A partir de la secuencia de ADNc de APEG-1 se ubicaron dos sitios BamH I y un sitio Hind III (figura 9A) . Esto se correlacionó con los datos de análisis Southern porque se identificaron tres bandas (18.7, 2.4 y 1.4 kb) en el ADN genómico digerido con 15 BamH I y dos bandas (12.0 y 6.4 kb) en el ADN genómico digerido con HindIII.

' ^ Clonación del ADNc APEG-1 humano La sonda de ADNc de APEG-1 se utilizó para 20 clasificar una biblioteca de ADNc de expansión 5' aórtica ?gtll humana (Clontech) , cuatro clonas positivas se purificaron y el ADNc de inserto se dimensionó mediante la digestión con EcoRI del ADN fáguico y se secuenció. La secuencia del ADNc de APEG-1 humano y la secuencia de 25 aminoácidos predicha del cuadro de lectura abierto que codifica para el APEG-1 humano se muestran en la figura 16 y figura 17, respectivamente. El ADNc de APEG-1 humano se utilizó entonces para clasificar una biblioteca genómica para obtener la secuencia promotora específica le célula bascular que regula la expresión de APEG-1 específica de célula de expresión.

La comparación de las secuencias de péptido de APEG-1 humano, de ratón y de rata La figura 26 muestra las secuencias de péptido APEG-1 de humano, ratón y rata alineadas, junto con una secuencia de consenso (SEQ ID NO: 12, 18, 13 y 19) . Una comparación de los cuadros de lectura abiertos de humana y rata, reveló 90% de identidad en el nivel de ADNc y 97% de identidad en el nivel de aminoácidos. La comparación de los cuadros de lectura abiertos de APEG-1 de ratón y rata reveló 95% de identidad en el nivel de ADNc y 98% de identidad en el nivel del aminoácido. Por lo tanto, APEG-1 se conserva en gran medida a través de las especies.

Depósito El plásmido que contiene el ADN que codifica para APEG-1 de rata (ADNc de APEG-1 de rata en el vector pSP72) se han depositado con la American Type culture Collection (ATCC) de acuerdo a los términos del tratado de Budapest sobre Reconocimiento Internacional de Depósito de Microorganismos para Fines de Procedimientos de Patente del 3 de marzo de 1995, y lleva el número de acceso ATCC 97071. 5 Un plásmido que contiene ADN que codifica para el APEG-1 humano (ADNc de APEG-?. Líbano en el vector pUC18) se depositó en el Type culture Collection (ATCC) ae acuerdo a los términos del Tratado de Budapest del 1 de junio de 1995, y lleva el número de acceso ATCC 97180. Un ) 10 depósito de la clona de plásmido que contiene las secuencias de flanqueo 5 'de 2.7 kb del gen APEG-1 de ratón se depositó en la ATCC el 5 de febrero de 1997. La cesionaria de las solicitantes, President and Fellows of Harvard College, reconoce su deber de renovar el depósito 15 si éste fuera incapaz de proporcionar una muestra cuando sea solicitada, debido a las condiciones del depósito antes de que expire el término de la patente otorgada sobre el ' N mismo, y es su responsabilidad notificar a la ATCC sobre V. cualquier emisión de dicha patente, y sobre el tiempo en 20 que el depósito estará disponible al público. Con anterioridad a esa fecha, el depósito se hará disponible al Comisionado de Patentes y marcas de acuerdo a los términos del Código de Reglamentos Federales §1.14 y 35 del Código de los Estados Unidos §112. 25 La ausencia de expresión de APEG-1 en células de cultivo primarias Como ya se analizó, en la APEG-1 se identificó inicialmente en tejido aórtico al que se le retirado la adven icia, un tejido compuesto de céJ ulas de músculo liso y células endoteliales . Par.-, identificar cuál de estos dos tipos de células expr,jda al gen APEG-1, se recolectaron e! total del ARN de las células endoteliales microvasculares y las células de músculo liso aórticas de rata, cultivadas, las dos en el segundo subcultivo, y estos ARN se utilizaron en el análisis Northern. El mensaje APEG-1 no se detectó en estos tipos de células (figura 12) . Es muy probable que la expresión in vivo de APEG-1 se haya perdido durante el cultivo de las células in vitro. Estos datos sugieren que la expresión de APEG-1 está estrictamente regulada por el crecimiento, de manera que su expresión está sub-regulada cuando las células se cultivan in vitro, como se ha observado en relación a la expresión del gen gasl (Sal, G.D., et al., 1992, Cell 70:595-607) . Alternativamente, como las células de músculo liso cultivadas se cree exhiben un fenotipo des-diferenciado (Pauly, . R.R., et al., 1992, Circulation 86 (suppl III) : 111-68-73) , APEG-1 puede haberse expresado únicamente en células de músculo liso o endoteliales totalmente diferenciadas. Consistente con un papel en la conservación de un fenotipo diferenciado, que se caracteriza por la ausencia de división celular, el APEG-1 micro- inyectado inhibió la absorción de BrdU en células de músculo liso arterial de rata. La expresión APEG-1 in vivo resultó ser específica para las células de músculo liso vascular, como se muestra en las figuras 18A y 18B.

Expresión de APEG-1 en modelo animal de lesión de globo Como la expresión del gen APEG-1 in vitro es diferente que la expresión in vivo, la expresión APEG-1 in vivo fue la estudiada. Un modelo de lesión de globo de la arteria carótida de rata, que se ha utilizado ampliamente para estudiar las células de músculo liso bascular en aterogénesis y remodelación vascular (Clo es, A.W., et el., 1983, Lab. Invest. 49 (2) :208-15, Clowes, A.W. et al., 1985, Circ. Res. 56:139-45), se utilizó para estudiar la modulación de expresión de APEG-1. En este modelo animal, la arteria carótida izquierda de la rata se lesionó mediante un catéter de globo 2F, las células endoteliales arteriales intímales se retiraron completamente y la capa de la célula de músculo liso medial se distendió. Después de la lesión en la carótida, se inició la formación de neo-íntima. Esto implicó que las células de músculo liso se proliferaran y migraran desde la media. Con este modelo, las células de músculo liso mediales y neointimales alcanzaron sus índices más altos respectivos de proliferación dos días y cuatro días después de la lesión de globo, y posteriormente declinaron con rapidez. El número total de células de músculo liso llega a un máximo y se conserva const-.ante después de dos semanas (Clowes, A.W. et al., 1 35, supra) . Los ARN totales de 1- s uicerias carót"iu s de rata 2, 5 y 8 días después de la lesión con el globo se recolectaron y utilizaron en el análisis Northern en una sonda de ADNc de APEG-1. Los resultados mostraron que APEG-1 se sub-reguló hasta 15%-20% de las arterias carótidas no lesionadas después de 2 y 5 días, la expresión recuperó hasta 40% del control después de 8 días (figuras 13A y 13B) . Estos datos sugieren que la expresión APEG-1 está implicada en la regulación de la proliferación celular de músculo liso y/o la migración, y la expresión había suprimido la ocurrencia de uno o los dos eventos.

Producción y purificación de APEG-1 recombinante APEG-1 recombinante se expresión como una proteína de fusión y se purificó por el sistema de expresión pFLAG (IBI) y subsecuentemente se inyectó en conejos para producir antisuero. El ADNc del APEG-1 de rata se clonó en el vector de expresión pFLAG-2 y se utilizó para transformar las células BL21 de E. coli. Las células transformadas se cultivaron e indujeron por IPTG (isopropil- ?-D- io-galactopirósido) para expresar la proteína de fusión codificada por vector. La proteína de fusión pFLAG-APEG-1 se purificó después mediante cromatografía de afinidad con anticuerpos monoclonales anti-FLAG, a partir del extracto celular soluble y la uic a se monitoreo por tinción con. c_r_ l de coomassi e (figura 14A) y por análisis Western igura 14B) .

Localización celular APEG-1 Para determinar la localización celular de APEG- 1, se generó un plásmido, c-myc-rAPEG-l/pCR3 , que expresaría una proteína de fusión APEG-1 con una marca c-Myc N-terminal. Las células COS-7 después se transfectaron transitoriamente con el plásmido c-myc-rAPEG-l/pCR3 y se inmunotiñieron con un anticuerpo anti-c-Myc monoclonal , 9E10. La proteína marcada con c-Myc se expresó predominantemente en los núcleos de las células COS-7 transfectadas . El mismo resultado se obtuvo cuando se utilizaron células U-2 OS como las células hospederas.

Método de diagnóstico La invención incluye un método para detectar lesión de una muestra de tejido vascular. Un nivel disminuido de APEG-1 predeciría un alto grado de proliferación de célula de músculo liso indicativo de lesión al tejido vascular, por ejemplo restenosis. El método de diagnóstico de la invención se lleva a cabo mediante la determinación del nivel de expresión génica de APEG-1 en un tejido, por ejemplo, una biopsia vascular obtenida en la aterectomí¾ . El nivel de la expresión génica puede m ái^¿ utilizando métodos conocidos e. la técnica, ry_.r ejemplo hibridación in situ, el análisis de transferencia Northern o el análisis de transferencia Western utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos de APEG-1. Una disminución en el nivel de expresión de APEG-1 por célula en la muestra de prueba del tejido en comparación con el nivel por célula en el tejido vascular control no lesionado, indicó la presencia de lesión vascular en la muestra de prueba. Por ejemplo, el tejido obtenido en la aterectomía puede someterse a prueba para la expresión de APEG-1, por ejemplo, el nivel de proteína o transcripto de APEG-1. Un nivel menor de APEG-1 (en comparación con el tejido normal) se correlaciona con un alto grado de proliferación de las células de músculo liso lo que indica una alta probabilidad de restenosis. Este procedimiento de diagnóstico es útil para identificar pacientes que necesitan una intervención terapéutica para reducir o prevenir la restenosis.

Métodos para detectar los tipos específicos de células de músculo Como los ARNm de APEG-1 y SPEG están enriquecidos en células de músculo liso bascular y células de músculo estriado, respectivamente, lar- secuencias de ácido nucleico APEG-1 y SPEG iquen utilizarse como sondas p^.'.á identificar ¿stos tipos de células. Por e-i!~;uplo, la secuencia de ácido nucleico específica de APEG-1, por ejemplo, una sonda que corresponde a un exon específico de APEG-1, se híbrida utilizando métodos bien conocidos en este campo, con secuencias de ARN en los estudios de hibridación de transferencia Northern o utilizando ensayos de hibridación in si tu. La reactividad hacia una sonda específica de APEG-1 es indicativa de un tejido celular de músculo liso vascular. En forma similar, la secuencia de ácido nucleico específica de SPEG, por ejemplo, una sonda que corresponde a un exon SPEG-específico, se utiliza para identificar las células de músculo estriado. Las secuencias de ADN APEG-1 y SPEG también pueden utilizarse para elaborar polipéptidos recombinantes APEG-1 y SPEG o fragmentos de los mismos. Los anticuerpos monoclonales o policlonales se cultivan entonces con respecto a los polipéptidos recombinantes utilizando los métodos ya conocidos. Los anticuerpos anti-SPEG se utilizan, por ejemplo, en experimentos western o de inmunofluorescencia, para identificar las células de músculo liso vascular, en el caso de APEG-1, o las células de músculo estriado en el caso de SPEG.

Métodos de terapia Durante la lesión vascular o cualquier o ro estímulo, las itosinas y los factores de crecirtr <LUCO de otras células basculares activadas promueven el crecimiento y la migración de las células de músculo liso vascular desdiferenciadas, dando por resultado placas de ateroesclerosis y restenosis . La administración del polipéptido APEG-1 a las células de músculo liso vascular in vitro (por microinyección) originó una disminución en la síntesis de ADN, indicativa de una disminución en la proliferación celular. La lesión vascular, por ejemplo, aquélla ocasionada durante la cirugía o angioplastia de globo, puede tratarse administrando polipeptidos APEG-1 o ADN que codifica para polipéptidos APEG-1, ligado operativamente a las secuencias de control de expresión adecuadas. Otras condiciones vasculares, por ejemplo la atereoesclerosis, arterioesclerosis de transplante y diabetes, que se caracterizan por una disminución en la expresión de APEG-1 (figura 15) podrán tratarse de manera similar. El polipéptido APEG-1, el ADN que codifica para un polipéptido APEG-1 o las composiciones que estimulan al promotor APEG-1 podrán administrarse para aumentar el nivel del polipéptido APEG-1 en el tejido vascular lesionado y así inhibir el crecimiento de las células de músculo liso. Los polipéptidos APEG-1 podrán administrase al paciente en forma in ravenosa en un portador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo solución salin?. fisiológica. L s métodos estándar de administr ción intracelular de polipéptidos podrán utilizarse, por ejemplo empaquetado en liposomas. Estos métodos son bien conocidos para los expertos en este campo. Se experimenta que una dosis intravenosa de aproximadamente 1 a 100 /xmoles del polipéptido de la invención se administraría por kilogramo de peso corporal por día. La composición de la invención es útil para la administración parenteral, por ejemplo intravenosa, subcutánea, intramuscular e intraperitoneal . Los compuestos que aumenta la expresión de APEG-1, por ejemplo inhiben la unión de un receptor que actúa en sentido trans, a un receptor que actúa en sentido cis, (por ejemplo SEQ ID NO: 24) se administran como ya se describió. ADN (por ejemplo, ADN que codifica para APEG-1, ADN que incluye promotores específicos de célula vascular (por ejemplo, secuencias que se hibridan con condiciones altamente restringidas a la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, o SEQ ID NO: 23) , ADN que codifica para SPEG y promotores específicos de célula de músculo estriado) y los vectores de la invención podrán introducirse en las células blanco del paciente mediante vectores estándares y/o sistemas de administración de genes. Los sistemas de administración de genes adecuados pueden incluir liposomas, sistemas de ¦5 administración mediados por receptores, ADN desnudo y vectores virales, por e an^l virus de herpes, retrovirus y adenovirus, entre otros. Por ejemplo, el ADN para xa codificación del polipéptido APEG-1 o SPEG bajo el control de un promotor constitutivo fuerte, podrá administrase en 10 forma local a un vaso sanguíneo durante la angioplastía de globo utilizando un sistema de administración de adenovirus . Un promotor específico de célula vascular o secuencia intensificadora del gen APEG-1 gene (por ejemplo, 15 SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, O SEQ ID NO: 23) podrá utilizarse para dirigir la expresión de APEG-1 o de genes distintos APEG-1. Por lo tanto, la enfermedad vascular > podrá tratarse administrando una secuencia intensificadora específica de célula vascular de la invención, 20 operativamente ligada a una secuencia que codifica para un polipéptido heterólogo, por ejemplo un promotor APEG-1 ligado al ADN que codifica para un gen inhibidor del crecimiento, por ejemplo un promotor Rb, p21 o pl8. El ADN puede codificar un polipéptido APEG-1 de 25 mamífero que se presenta en la naturaleza, por ejemplo el polipéptido APEG-1 de rata (SEQ ID N0:3) o el polipéptido APEG-1 humano (SEQ ID N0:12) . Por ejemplo, la invención incluye degenerar las variantes de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 11. La invención también incluye un ADN esencialmente puro que comprende una cadena que se híbrida en condiciones altamente restringidas, con i_ ADN que tiene la secuencia de SEQ ID N0:1, 2 u il, o los complementos de las mismas. Similarmente, puede utilizarse un promotor específico de célula de músculo estriado para dirigir la expresión de SPEG o de genes distintos a SPEG. Por lo tanto, las enfermedades de músculo estriado pueden tratarse administrando un promotor específico de célula de músculo estriado de la invención ligado operativamente a una secuencia que codifica para un polipéptido heterólogo, por ejemplo, un promotor SPEG ligado a un ADN que codifica para el gen terapéutico, por ejemplo, distrofina, para tratar distrofia muscular de Duchenne o Becker o un gen inhibidor de crecimiento como por ejemplo Rb, p21 ó pl8, para reducir la proliferación indeseable de células de músculo estriado. El ADN de la invención puede administrarse en un portador farmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica también puede incluir un sistema de administración de genes como ya se describió. Los portadores farmacéuticamente aceptables son vehículos biológicamente compatibles que son adecuados para administrase a un animal, por ejemplo la solución salina fisiológica. Una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad del ácido nucleico de la invención que es capaz de producir un resultada médicamente deseable en un animal tratado. Como ya es sabido c.-r. -i área médica, la dosis que se administra a cualan^er paciente específico depende de muchos factores, entre los que se incluyen talla, área superficial corporal, edad, compuesto particular que se administrará, sexo, edad y vía de administración, estado de salud general y otros fármacos que se estén administrando en forma concurrente . Las dosis para los compuestos de la invención variarían, pero una dosis preferida para administración intravenosa está entre 105 y 1022 copias de molécula de ácido nucleico, aproximadamente. La determinación de la dosis óptima queda dentro de las habilidades de un farmacólogo con pericia ordinaria. Los fármacos que estimulan al promotor APEG-1 también pueden administrarse como ya se describió para aumentar el nivel de expresión de APEG-1 en el tejido vascular. Estos fármacos pueden identificarse poniendo en contacto el promotor APEG-1 ligado a un gen indicador, con un compuesto candidato y midiendo el nivel de expresión del gen indicador en la presencia y ausencia del compuesto. Un nivel aumentado en la expresión en la presencia del compuesto comparado con éste, en su ausencia, indica que el compuesto estimula al promotor APEG-1. La invención incluye también células transfectadas con el ADN de la invención. Los métodos estándares para transfectar células con ácido nucleico aislado son bien conocidos para l s expertos en el área de la biología molecular. .¿e preferencia, las células son células de músculo liso vasculares y expresan un polipéptido APEG-1 de la invención, codificado por el ácido nucleico de la invención. Las células de la invención pueden administrarse a un animal en forma local o sistémica utilizando métodos intravenoso, subcutáneo, intramuscular e intraperitoneal para la administración. Alternativamente, las células procarióticas o eucarióticas en cultivo pueden transfectarse con el ADN de la invención ligado operativamente a las secuencias de control de expresión adecuadas para la expresión de alto nivel en la célula. Estas células son útiles para producir grandes cantidades del polipéptido APEG-1, que pueden purificarse y utilizarse, por ejemplo, como una terapia para elevar el nivel de anticuerpos anti-APEG-1.

Métodos de evaluación de compuestos para la unión a la secuencia del represor transcripcional VSMC La invención incluye métodos para evaluar un compuesto en su habilidad para unirse a una secuencia represora transcripcional que actúa en cis, en la célula de músculo liso vascular. Esta secuencia que actúa en cis pueden incluir una secuencia que híbrida bajo condiciones muy sev¾raa con la secuencia ID N0:?4, por ejemplo una secuencia que contiene la propia 3EQ lü NO:24. El compuesto pue^t ponerse en contacto con una secuencia represora transcripcional que actúa en cis para la célula de músculo liso vascular, utilizando los métodos conocidos en la técnica y la cantidad de unión determinada utilizando los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el ensayo de movilidad en gel alterado puede utilizarse para valorar la unión de un compuesto de prueba a la secuencia represora transcripcional que actúa en cis. Alternativamente, los ensayos que detectan la sensibilidad alterada a los agentes, por ejemplo DNasa o dimetil sulfato (DMS) en la presencia del compuesto de prueba, también podrán utilizarse. Alternativamente, puede evaluarse un compuesto respecto a su habilidad para unirse a una secuencia de represor transcripcional que actúa en cis, proporcionando una célula de músculo liso vascular que contiene un ácido nucleico que comprende una secuencia represora transcripcional que actúa en cis de la célula de músculo liso vascular, que está ligada operativamente a una secuencia que codifica para una molécula indicadora. La molécula indicadora puede ser, por ejemplo, luciferasa o ß-galactosidasa . El compuesto de prueba se añade entonces a la y la cantidad de la molécula indicadora expresada ¿¦ •JI la célula se mide. Una alterncló en el nivel de la molécula indicadora expresada e.u la presencia del compuesto comparado con el nivel en ausencia del compuesto, indica que el compuesto se une a una secuencia represora transcripcional que actúa en cis, de la célula de músculo liso vascular. Por ejemplo, un aumento en el nivel de la transcripción del ADN que codifica para la molécula indicadora o un aumento en la cantidad de la molécula expresada, indica que el compuesto de prueba inhibe la unión del factor represor que actúa en trans en un VSMC respecto a la secuencia que actúa en cis y, por lo tanto, funciona terapéuticamente para aumentar la expresión de APEG-1 y disminuir la proliferación de VSMC. Otras modalidades quedan dentro del alcance de la invención .

Claims

REIVINDICACIONES ; 1. Un ADN esencialmente puro que comprende una secuencia intensificadora específica de célula de músculo liso vascular (VSMC) ligada operativamente a una secuencia que codifica para un polipéntido, en donde la secuencia intensificadora incluye u.i¿_. secuencia que se híbrida bajo condiciones altampr.Le severas con la SEQ ID NO: 20, * el complemento de la misma, y en donde el ADN no contiene la secuencia de nucleótido completa de SEQ ID NO: 17. 2. El ADN de la reivindicación 1, en donde la secuencia de ADN contiene menos de 2.6 kb de la SEQ ID NO: 17. 3. El ADN de la reivindicación 1, en donde la secuencia de ADN contiene menos de 2.1 kb de la SEQ ID NO:17. 4. El ADN de la reivindicación 1, en donde la secuencia de ADN contiene menos de 1.7 kb de la SEQ ID NO: 17. 5. El ADN de la reivindicación 1, en donde la secuencia intensificadora es menos de 100 nucleótidos de longitud. 6. El ADN de la reivindicación 1, en donde la secuencia intensificadora es menos de 50 nucleótidos de longitud. 7. El ADN de la reivindicación 1, en donde la secuencia intensificadora comprende a la SEQ ID NO: 20. 8. El ADN de la reivindicación 1, en donde la secuencia intensificadora comprende una pluralidad de copias de SEQ ID NO: 20. 9. El ADN de la reivindicación 1, en donde la secuencia intensificadora híbrida bajo condiciones altamente severas COTÍ ia SEQ ID NO: 23 o el complemento r\<¿ la misma. 10. El ADN de la reivindicación 1, en donde la secuencia intensificadora comprende a la SEQ ID NO:23. 11. El ADN de la reivindicación 1, en donde la secuencia intensificadora comprende una pluralidad de copias de SEQ ID NO: 23. 12. El ADN de la reivindicación 1, en donde la secuencia codificadora de polipéptido no codifica para APEG-1. 13. El ADN de la reivindicación 1, en donde el intensificador está ligado operativamente al promotor heterólogo . 14. El ADN de la reivindicación 1, en donde el polipéptido se selecciona de un grupo que consiste de activador de plasminógeno de tejido, inhibidor de ciclo celular p21, óxido nítrico sintasa, ?-interferón y polipéptido natriurético atrial. 15. Un vector que comprende al ADN de la reivindicación 1. 16. Un método para dirigir la expresión específica de célula de músculo liso vascular de un polipéptido, que comprende introducir a una célula de músculo liso vascular el vector de la reivindicación 15. 17. Un ADN puro que comprende una secuencia de represor ¦..ranscripcional que actúan en cis, que reduce la transcripción específica de célula de músculo liso vascular de una secuencia ligada operativamente. 18. El ADN de la reivindicación 17, en donde la secuencia de represor transcripcional que actúan en cis se híbrida bajo condiciones altamente severas con la SEQ ID NO: 24. 19. El ADN de la reivindicación 17, en donde la secuencia de represor transcripcional que actúan en cis comprende a la SEQ ID NO: 24. 20. El ADN de la reivindicación 17, en donde el ADN es menor de 4 kb de longitud. 21. El ADN de la reivindicación 17, en donde el ADN no incluye a la SEQ ID NO: 23. 22. Un vector que comprende al ADN de la reivindicación 18. 23. Un ADN esencialmente puro, que comprende una secuencia que codifica para un polipéptido del gen-l expresado preferencialmente por músculo estriado (SPEG-1) . 24. El ADN de la reivindicación 23, en donde el polipéptido es un SPEG-1 humano. 25. El ADN de la reivindicación 24, en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. 26. Un ADN esencia.V.ri£:->L¿ puro que comprende una secuencia de nucleótido que tiene por lo menos 50% de identidad con SEQ ID NO: 13. 27. El ADN según la reivindicación 26, en donde el polipéptido es un SPEG de ratón. 28. El ADN según la reivindicación 27, en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. 29. Un ADN esencialmente puro que comprende una cadena que se híbrida bajo condiciones altamente severas con una cadena de ADN que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 13 o el complemento de la misma. 30. Un ADN esencialmente puro que tiene por lo menos 50% de identidad con SEQ ID NO: 15 y que codifica para un polipéptido que tiene la actividad biológica de un polipéptido SPEG-1. 31. Un polipéptido SPEG-1 humano, esencialmente puro . 32 El polipéptido de la reivindicación 31, en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. 33. Un método para evaluar un compuesto en su habilidad de unirse a una secuencia represora transcripcional que actúa en cis de la célula de músculo ] iso vascular, que comprende: poner en contacto el con.f.uüsto con una secuencia de represor transcripcional que actúa en cis, de la célula de músculo liso vascular; y determinar la cantidad de unión del compuesto a la secuencia de represor transcripcional que actúan en cis, de la célula de músculo liso vascular. 34. El método según la reivindicación 33, en donde la secuencia de represor transcripcional, que actúa en cis, de la célula de músculo liso vascular, comprende una secuencia que se híbrida bajo condiciones altamente severas con la SEQ ID NO: 24. 35. El método según la reivindicación 33, en donde la secuencia represora transcripcional que actúa en cis, de la célula de músculo liso vascular, comprende la SEQ ID NO: 24. 36. Un método para evaluar un compuesto en su habilidad de unirse a una secuencia de represor transcripcional que actúa en cis, que comprende: proporcionar una célula de músculo liso vascular que contiene un ácido nucleico que comprende a una secuencia de represor transcripcional que actúa en cis, de la célula de músculo liso vascular, ligada operativamente a una secuencia que codifica para una molécula indicadora; poner en contacto la célula con el compuesto; y medir la cantidad de la molécula, indicadora expresada por la célula, en donde na alteración en el nivel de la molécula indicadora expresada en la presencia del compuesto, en comparación con el nivel en la ausencia del compuesto, indica que el compuesto se une a una secuencia represora tanscripcional que actúan en cis, de la célula de músculo liso vascular. 37. El método según la reivindicación 36, en donde la secuencia represora transcripcional, que actúa en cis, de la célula de músculo liso vascular, comprende una secuencia que se híbrida bajo condiciones altamente severas con la SEQ ID NO: 24. 38. El método según la reivindicación 36, en donde la secuencia de represor transcripcional que actúa en cis, de la célula de músculo liso vascular, comprende la SEQ ID NO: 24. 39. Un método para evaluar un compuesto en su habilidad para unirse a fin de aumentar la expresión de APEG- 1 , que comprende : proporcionar una célula de músculo liso vascular; poner en contacto la célula de músculo liso vascular con el compuesto; y medir la cantidad de polipéptido o transcripto de APEG-1 en la célula de músculo liso vascular, en donde un aumento en la cantidad del gen o del transcripto APEG-1, como product"o, indica que el compuesto aumentó la expresión 40. Un método para inhibir la proliferación de célula de músculo liso vascular, que comprende poner en contacto una célula de músculo liso vascular con un compuesto que se une a una secuencia de represor transcripcional que actúa en cis, de la célula de músculo liso vascular, en una cantidad eficaz para inhibir la proliferación de la célula de músculo liso vascular. 41. El método según la reivindicación 40, en donde la secuencia del represor transcripcional que actúa en cis, de la célula de músculo liso vascular, comprende una secuencia que se híbrida bajo condiciones altamente severas con la SEQ ID NO:24. 42. El método según la reivindicación 30, en donde la secuencia de represor transcripcional que actúa en cis, de la célula de músculo liso vascular, comprende la SEQ ID NO: 24.