JP2007195555A - 遺伝子発現を誘導するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】DNA結合タンパク質のDNA結合ドメインおよび転写活性化能力を持つタンパク質ドメインを含む、キメラトランスアクティベータータンパク質をコードする組換え核酸分子。哺乳動物細胞内に感染および/またはトランスフェクトし、そして生物学的に活性なキメラトランスアクティベータータンパク質の発現を持続する能力を持つ、組換えウイルスおよび非ウイルスベクター。また、生物学的に活性なキメラトランスアクティベータータンパク質を発現する能力を持つ、宿主細胞系および非ヒトトランスジェニック動物。
【選択図】 図7
Description
虚血性心臓疾患は、心臓内の、有益である可能性がある特定の適応応答を生じる可能性がある。これらの応答の中には:1)遮断された冠状動脈の周りに側副(collateral)循環形成を導く、血管形成性増殖因子およびその受容体発現の増加;2)O2を必要としない代謝経路を活性化させる手段としての、解糖酵素発現の増加;および3)虚血組織を死から保護することが可能である、熱ショックタンパク質の発現がある。
本発明は、哺乳動物低酸素症誘導性因子タンパク質であるDNA結合タンパク質のDNA結合ドメイン、および転写活性化タンパク質の機能的な転写活性化ドメインを含む、キメラトランス活性化因子をコードする組換え核酸分子を提供する。
低酸素症(O2要求が供給を上回る状態)は遺伝子発現の強力な調節要因である。低酸素症に対する生理学的応答には、赤血球生成の亢進(Jelkman,
Physiol. Rev. 72:449−489(1992))、虚血組織における新規血管新生(Whiteら, Circ. Res. 71:1490−1500(1992))および解糖に基づく代謝へのスイッチ(Wolfeら, Eur. J. Biochem. 135:405−412(1983))が含まれる。これらの適応応答は、O2搬送を増加させるか、またはO2を必要としない代替代謝経路を活性化するかどちらかである。これらの過程に関与する遺伝子産物には、例えば:(i)赤血球生成の主要な制御因子であり、そしてしたがって血液O2運搬能力の主要な決定要素であるエリスロポエチンをコードするEPO(Jiangら, J. Biol. Chem. 271(30):17771−78(1996));(ii)血管形成の主要な制御因子であり、そしてしたがって組織灌流の主要な決定要素である、血管内皮増殖因子をコードする、VEGF(Levyら, J. Biol. Chem. 270:13333(1995);Liuら, Circ. Res. 77:638(1995);Forsytheら, Mol. Cell. Biol. 16:4604(1996));(iii)O2の非存在下でATP生成の代謝経路を提供する解糖酵素、アルドラーゼ1、エノラーゼ1、乳酸デヒドロゲナーゼA、ホスホフルクトキナーゼL、およびホスホグリセリン酸キナーゼ1をそれぞれコードする、ALDA、ENO1、LDHA、PFKL、およびPGK1(Firthら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91:6496(1994);Firthら, J. Biol. Chem. 270:21021(1995);Semenzaら, J. Biol. Chem. 269:23757(1994));(iv)それぞれが血管作動性分子である一酸化炭素および一酸化窒素の合成を担う、ヘムオキシゲナーゼ1および誘導性一酸化窒素シンターゼをコードする、HO1およびiNOS(Leeら, J. Biol. Chem. 272:5375;Melilloら, J. Exp. Med. 182:1683(1995))が含まれる。
ここに用いられている、「発現」とは、ポリヌクレオチドがmRNAに転写され、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるプロセスをさす。ポリペプチドがゲノムDNAから誘導される場合、適当な真核生物宿主を選択すると、発現には、mRNAのスプライシングも含まれるであろう。発現に必要な調節エレメントには、RNAポリメラーゼと結合するためのプロモーター配列、およびリボソーム結合用転写開始配列が含まれる。例えば、細菌発現ベクターには、lacプロモーターのようなプロモーターならびに転写開始用シャイン−ダルカルノ配列および開始コドンAUGが含まれる(Sambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual、第二版、ColdSpringHarbor,NY,1989;またはAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology,Greene Assoc.,Wiley Interscience,NY,NY、1992)。同様に、真核生物発現ベクターには、異種または同種のRNAポリメラーゼII用プロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンAUG、およびリボソーム分離用終止コドンが含まれる。そのようなベクターは、市販されているか、またはこの技術分野で周知の方法、例えば一般にベクターを構築するための上記の方法、に記載された配列で組み立てることができる。発現ベクターは、本発明のハイブリッド/キメラトランスアクティベーター(融合)ポリペプチドを発現する細胞を作成するために有用である。
実施例1:ハイブリッド/キメラ構築物
HIF−1αからのDNA結合ドメインおよびダイマー化(dimerization)ドメインならびに単純ヘルペスウイルスVP16からのトランス活性化ドメイン(図1)からなるハイブリッド転写因子(pcDNA3/HIP.VP−16.Afl2)を構築し、低酸素に対する生理学的適応に通常含まれる遺伝子の強く本質的な活性化を提供する。以下に記載した方法に従って、我々は、インビトロでのVEGF遺伝子発現およびウサギ後脚虚血モデルでの新生血管形成への、このHIF−1α/VP16転写因子の影響について分析した。
全長(aal−826)のHIF−1α遺伝子を、配列番号1および2に示したプライマーを用いてHela細胞cDNAライブラリー(Clontech)からPCR(Advanage cDNA PCR Kit,Clontech,Palo Alto,CA)によって単離し、発現ベクターpcDNA3(Invitrogen,Carlsbad,CA)のKpnIおよびXbaI部位の間に挿入した。このプラスミドでは、遺伝子発現は、シトメガロウイルス(CMV)即時型早期エンハンサー/プロモーターによって調節される。HIF−1α/VP−16ハイブリッドを、aa390(Afl2部位)でHIF−1αを切除し、次いでHSV VP−16下流のトランス活性化ドメインを連結することによって構築した。Afl2およびXbaI末端を持つVP16フラグメント(aa413−490)を、Ventポリメラーゼ(New England Biolabs,Beverly,MA)および配列番号3および4に示したプライマーを用いて、PCRにより増幅し、このフラグメントをpcDNA3/HIF−1α構築物の適当な部位にクローン化した。関連する構築物(pcDNA3/HIF/VP−16/R1)は、EcoRIでの部分消化によりaa530でHIF−1αを切除することによって、作成された。PCRによって生成した全配列の完全性を、Applied Biosystems 377 DNA Sequencerを用いたDNAシークエンシングによって確認した。全クローニングマニュピュレーションを、標準法(Sambrook,Jら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual、第二版、Cold Spring Harbor,NY、1989)に従って行った。制限酵素およびDNA修飾酵素は、New England BiolabsまたはLife Technologies,Inc.(Gaithersburg,MD)のいずれかから得られ、製造者らの明細書に従って用いられた。プラスミドDNAsをQiagen(Chatsworth,CA)から得たキットで精製した。ヒトVEGF165(phVEFG165)を発現するプラスミド構築物については、以前に記載されている(Tsurumiら、Circulation,96,II−382−II−388、1977)。ルシフェラーゼレポータープラスミド(EPO−lucおよびVEGF−luc)は、Dr.H.Franklin Bunn(Brigham and Women’s Hospital,Harvard Medical School)から提供して頂いた。
HeLa細胞を、10%のウシ胎児血清(FBS;JRH Biosciences,Lenexa,KS)を添加したDulbeccoのイーグル修飾培地−高グルコース(DME;Irvine Scientific,Santa Ana,CA)内で増殖させた。ルシフェラーゼレポーター実験用に、HelA細胞(3x105細胞/60mM皿)を、リン酸カルシウムProFectionキット(Promega,Madison,WI)を製造者らの使用説明書に従って用いて、トランスフェクトした。二重の皿を、それぞれ5μgのプラスミド[HIF−1α構築物およびEPO−luc(Blanchard,K.L.ら、Mol.Cell Biol.,12,5373−85、1992)またはVEGF−luc(Levy,A.P.ら、J.Biol.Chem.,270,13333−40、1995)レポーターのいずれか、ならびにpCMVβ(Clonetech)]でトランスフェクトした。トランスフェクション後24時間で、1セットの皿を100μMデスフェリオキサミン(desferrioxamine)で誘導した。細胞を誘導後18時間で集菌し、ルシフェラーゼ活性をアッセイした(Promega)。また、個々のサンプル内のβ−ガラクトシダーゼ活性を、Galacto−Lightキット(Tropix,Bedford,MA)を用いて定量し、これらの値を用いて、トランスフェクション効率の対照として、ルシフェラーゼ活性を標準化した。
HIF−1α/VP16ハイブリッド構築物を、レポータープラスミドと共に293またはHeLa細胞のいずれかへコトランスフェクションすることによって、遺伝子発現を活性化する能力について、試験した(それぞれ図3および4)。これらの実験に用いられたレポータープラスミドは、エリスロポイエチンエンハンサー/プロモーター(Blanchard,K.L.ら、Mol.Cell Biol.,12,5373−85、1992)またはVEGFプロモーター(Levy,A.P.ら、J.Biol.Chem.,270,13333−40、1995)のいずれかの転写調節下で、ルシフェラーゼ遺伝子を含んでいた(図3−5では、pcDNA3/HIF/VP16.Afl2およびpcDNA3/HIF/VP16.R1を、それぞれ”HIF−4/VP−16.AflII”および”HI−4/VP−16.R1”と示している)。
図6(左)は、EPO3’エンハンサー−プロモーター−ルシフェラーゼレポーター構築物を用いて生成したルシフェラーゼ活性を示している。図6(右)は、VEGFプロモーター−ルシフェラーゼレポーター構築物を用いて生成したルシフェラーゼ活性を示している。
HIF−1α/VP16ハイブリッドが内因性VEGF遺伝子の発現を活性化する能力を持つか否かを決定するために、これら構築物をHeLa細胞内にトランスフェクトし、VEGFをELISAでアッセイした。トランスフェクション前、HeLa細胞を、6cm皿に5x105細胞/皿の密度で塗布した。細胞を10μgのHIP−1α/VP16ハイブリッドプラスミドDNAでトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、二重プレート内の細胞は、対照(誘導せず)か、または100μg/mlのデスフェリオキサミンを含む新規の培地を加えることによって誘導するかのいずれかであった。誘導40時間後、培養液を収集し、ELISA(QuantikineTM、R&D Systems,Minneapolis,MN)を製造者らの指示書に従って用いることによって、VEGFについてアッセイした。
A.血清VEGFレベル
HIF−1α/VP16ハイブリッド遺伝子(pHIF−1α/VP16)またはヒトVEGF165(phVEGF165)のいずれかをコードするむき出しのプラスミドDNAを、大腿動脈をてき出して後脚虚血を誘導した、ウサギの中央内転筋および半膜様筋肉内に注射することによって、投与した。血清VEGFレベルを、ヒトVEGFに対して調製したELISAアッセイによってアッセイした。従って、HIF−1α/VP16−処理グループに適用したようなこのアッセイは、ウサギの内因性タンパク質がこれらの動物内で生成される程、定量的ではない。しかしながら、VEGF発現の反応速度論および持続性を、グループ内で比較することはできる。処理前、血清VEGFレベルはほとんど検出できず、それぞれのグループで類似していた。しかしながら、投与3日後、VEGFレベルは、phVEGF165−トランスフェクト動物では10.5(±3.9)pg/mlに、HIF−1α/VP−16処理グループでは26.3(±4.6)pg/mlに、増加した。処理5日後、pHIF−1α/VP−16処理動物内のVEGFレベルは未だ高く、徐々に減少していた(14.9±3.0pg/ml)。対照的に、5日後、phVEGF165処理動物では、血清VEGFを検出できなかった。対照(pCMVβ−処理)グループでは、処理前、または処理3日後および5日後のいずれでも、VEGFは検出されなかった。VEGFタンパク質レベルは5日迄に減少したが、両方のトランスジーン発現は、RT−PCRで分析したところ、投与14日後迄、持続した。
phVEGF165−pHIF−1α/VP16での処理前(10日)および処理後30日(40日)ならびに対照グループの赤血球数、ヘマトクリット値およびヘモグロビン値を、下の表1に示している。処理前または処理後のいずれでも、3グループ間で赤血球数およびヘモグロビンに差はなかった。ヘマトクリットはpHIF−1α/VP16−処理動物内で増加する様に思われたが、同様の増加が対照グループ内にも認められ、この結果が、HIF−1α/VP16ハイブリッド転写因子の発現によるものでなかったことを示唆している。
虚血誘導10日後(プラスミド注射直前)、ウシ血圧比(虚血/正常脚)は、3グループ間で類似していた(phVEGF165 =0.45±0.01、pHIF−1α/VP16=0.44±0.02、対照=0.45±0.03;P=NS)。40日迄(トランスフェクション後30日)、血圧比は、3グループ間で改良した。しかしながら、pHIF−1α/VP16処理動物の血圧比(0.93±0.02)は、phVEGF165を受けた動物の血圧比(0.82±0.03)または対照グループのそれ(0.69±0.02)より有意に高かった(P<0.01)。40日の血圧比は、phVEGF165−処理グループで対照より高かった(P<0.01)。
虚血脚内の静止血流および最大血流(パパベリン−刺激)は、10日では、3グループ間で類似していた。しかしながら、40日では、静止血流およびパパベリン刺激最大血流は、pHIF−1α/VP16−トランスフェクトグループ(それぞれ41.6±3.1ml/分および111.2±5.7ml/分)およびphVEGF165トランスフェクトグループ(それぞれ42.2±3.9ml/分および88.7±7.4ml/分)では、対照グループのそれ(それぞれ28.7±1.5ml/分および65.3±3.8ml/分)より有意に高かった。静止血流は、pHIF−1α/VP16およびphVEGF165−処理ウサギ間では類似していた(40日)が、最大血流は、phVEGF165処理グループよりpHIF−1α/Vp16でトランスフェクトした動物の方が、有意に高かった(p<0.05)。非虚血脚内の静止血流および最大血流は、10日ならびに40日共、3グル−プ間で類似していた。
大腿中央の血管造影視覚型の側副血管の定量分析は、血管密度を測定することによって成し遂げられた。処理前(10日)の基準線では、phVEGF165、pHIF−1α/VP16および対照グループ間の血管造影スコアに有意の差はなかった(それぞれ0.38±0.03、0.42±0.01、0.41±0.02、P=NS)。40日まで、pHIF−1α/VP16−処理ウサギ(0.61±0.01)およびphVEGF165−処理ウサギ(0.58±0.03)の血管造影スコアは、対照グループのそれ(0.51±0.05)より有意に高かった。40日では、pHIF−1α/VP16−処理およびphVEGF165処理グループ間の血管造影スコアに、統計上有意な差はなかった。pHIF−1α/VP16およびphVEGF165を受けた動物内で認められる血管造影スコアの増加を説明する主な知見は、いわゆる中央帯の側副血管の強化であった。
インビトロおよびインビボでHIF−1α/VP16ハイブリッド因子によってVEGF遺伝子発現が活性化されることから、VP16活性化ドメインが試験した細胞型(ヒト頸部上皮、ラットグリオーム、ウサギ骨格筋)内のHIF−1標的遺伝子の発現に必要とされるアクセサリー因子と相互作用するであろうと、考えられる。従って、遺伝子治療によるHIF−1α/VP16ハイブリッドの投与は、血管障害に関連する虚血への有効な治療法であることが分かる。この適用では、HIF−1α/VP16は、VEGFを含む様々な遺伝子をアップレギュレートすることができる。治療による恩恵は、血管形成の刺激の結果としてのみならず、血管拡張および嫌気代謝のアップレギュレーションのような、低い酸素圧へのさらなるHIF−1仲介局所適応を通してでも、達成することができる。成長因子および/または血管形成を強化するそれらをコードする遺伝子の投与は、慣用の血管再生技術が適さない場合の組織虚血の治療として、有用であることができる。
筋肉内遺伝子のトランスファー
29のウサギを用いて、後脚虚血への筋肉内遺伝子治療の効果について研究した。全プロトコールは、St.Elizabeth’s Institutional Animal Care and Use Commiteeによって承認されている。雄のニュージーランド白ウサギ(4.0−4.3kg)(Pine Acre Rabbitry,Norton,MA)に、キシラジン(2mg/kg)を前投与した後、ケタミン(50mg/kg)およびアセプロマジン(0.8mg/kg)の混合物で麻酔をかけた。手術方法は、前記の通りである(Takeshita,S.ら、Am.J.Physiol.,93,662−670、1994a)。簡単に言えば、大腿動脈を、外腸骨動脈からの分岐のその中央に近い源から伏在静脈と膝窩動脈に分かれる末梢部まで、完全に剔出した。手術後、全動物を、綿密にモニターした。無痛剤(0.25mg/kgの酒石酸レボファノール、Hoffmann−La Roche Inc.,Nutley,NJ)を、1日間、皮下投与した。また、予防的に抗生物質(エンロフロキサシン、Bayer Corporation,Shawnee Mission,KA)を、手術後、合計5日間、皮下投与した。
それぞれのグループから最初に6匹のウサギについて、プラスミドトランスフェクション処理の直前ならびに処理後3および5日に、血液サンプルを、23ゲージの針を用いて、ウサギの耳の中心動脈から採血した。血液サンプルを、4℃で30分間保存し、次いで、3,000rpmで15分間、遠心分離した。ELISA(R&D Systems)によるVEGFアッセイを行うまでは、血清を−80℃に凍結した。血清VEGFの検出の最低限界は9.0pg/mlであった。アッセイは、それぞれのサンプルについて、二重に行った。観察者内での変化率は、8%以下であった。
血液サンプルを、ウサギの耳の中心動脈から、23ゲージの針を用いて、処理直前(10日)および屠殺日(40日)に、採血した。赤血球、ヘマトクリットおよびヘモグロビンを、市販の自動検出器(Sysmex alpha,Sysmex Corporation,Long Groove,IL)で測定した。
ウシ血圧比を、ドップラーフローメーター[Model1050;Parks
Medical Electoronics.Aloha,(OR)]を用いて、処理直前(10日)ならびに治療開始後1ヶ月(40日)に、両方の後脚で測定した。個々の場合、麻酔下で、ウサギの後脚の毛を剃りきれいにした。トップラープローブを用いて、後脛骨動脈のパルスを同定し、後脚の心収縮期血圧を、標準的技術を用いて測定した(Takeshita,S.ら、Am.J.Physiol.,93,662−670、1994a)。ウシの血圧比は、虚血脚の心収縮期血圧と正常な脚のそれの比率として、それぞれのウサギ毎に定義した。
前記の方法(Bauters.C.ら、Am.J.Physiol.,267,H1263−H1271、1994)に従って、0.018/ドップラーガイドワイヤー(Cardiometrics,Inc.,Mountain View,CA)を用いて、選択的腸骨内血液造影前10日および40日に、インビボで血流量を測定した。虚血脚の代わりとなる腸骨内動脈の隣接セグメントへの共通の腸骨動脈の源に、ワイヤーチップを位置付けた。スペクトルピーク速度の時間平均(APV)(time average of the spectral peak velocity) を静止状態で記録し、最大APVを2mgのパパベリン(Sigma,St.Louis,MO)のボーラス注射の後記録した。
選択的腸骨内血管造影は、前記の方法(Takeshita,S.ら、Am.J.Physiol.,93,662−670、1994a)に従って、成し遂げられた。カテーテルのチップを、第7腰椎と第一仙椎との間の空間レベルで、腸骨内動脈内に配置した。全5mlの非イオン性対照培地(Isovue−370;Squibb Diagnostics,New Branswick,NJ)を、腸骨内動脈に配置した3F摂取カテーテル(Tracker−18;Target Therapeutics,Fremont,CA)を通して、流速1ml/sで、自動血管造影インジェクターで注入した。次いで、虚血腔脚の一連の像を、105mmスポットフィルム上に、1秒当たり1フィルムの割合で少なくとも10秒間、記録した。血管造影完了後、カテーテルを除去し、傷を閉じた。
血管密度を、虚血後脚から採取した光学顕微鏡切片を用いて、毛細血管レベルで評価した。組織検体は、動物屠殺時に、虚血脚の内転筋および半膜様筋からの横切片として得られた。筋肉サンプルを、OCT化合物(Miles,Elkhart,IN)内に包埋し、液体窒素でスナップ凍結し、5μm厚の切片に切断した。前記の方法(Ziada,A.M.ら、Cardiovasc.Res.,18,724−732、1984)に従って、組織切片をインドキシル−テトラゾリウム法でアルカリホスファターゼで染色して毛細血管内皮細胞を検出し、次いで、エオシンで対抗染色した。2つの筋肉からの全体で20の異なる領域を無作為に選択し、毛細血管および筋細繊維の数を20x対物レンズ下でカウントした。次に、毛細血管密度(毛細血管/mm2)および毛細血管−対−筋細繊維の比率を測定した。
むき出しのDNAの代わりとして、以下に記載する方法に従って、HIF−1αに基づく遺伝子構築物を持つアデノウイルスベクターを構築した。
5μgのAd2CMVBgal−6 DNAをPshA1およびSnaB1で、37℃で24時間消化し、反応物の1/10を0.8%アガロース/TBEゲル上に走行させ、消化の完全性をチェックした。残りの反応物をトランスフェクションに用いた。
以下に示すように、Promegaの”Profection−Calcium Phosphate Transfection Kit”からの標準プロトコールを用いて、トランスフェクションを行った。
第1日: 60mm皿上に293細胞を1x106/皿で塗布し、37℃/5%CO2で24時間インキュベートする。
第2日:
1.トランスフェクション4時間前、細胞からの培地を除き、それを4.5mlの新しい増殖培地に置き換える。
2.DNAおよびCaCl2混合物
3.300μlの2xHBSでDNA−CaCl2を沈殿させ、RTで0.5−2時間インキュベートする。次いで、沈殿させたDNAを細胞に加え、16−17時間インキュベートする。
第3日: 培地を交換する。
第5日: 60mm皿から100mmの皿に細胞をスプリットする。
第7日: 細胞を100mmの皿から150mmの皿にスプリットする。
第9日: それぞれのトランスフェクションから5プラークをピックアップする。
第11日: EV+RIから12のさらなるプラークを、EV+Af111から10のさらなるプラークをピックアップする。250μlの増殖培地中でプラークを凍結解凍を3回繰り返し、−20℃に保存した。
1.感染
第1日: 細胞を24穴プレートに1.4x105細胞/穴で塗布する。
第2日: 200μlのそれぞれのプラーク、37℃/5%CO2で2時間、細胞を感染させ(約40−50%の集密度)、次いで、800μlの増殖培地を加える。細胞をインキュベーター内に置き、CPEが起こるまで、増殖させる。
第4日: CPEが進んだとき、それぞれのプレートの一つの穴を集菌する。
第5日: EV+Af111の10の穴から、およびEV+RIの13の穴からCPE細胞を洗浄除去する。
第8日: 残ったCPE細胞を洗浄除去する。
250μlのCPE
250μlの2xプロテイナーゼK溶解バッファー
40μlの10mg/mlプロテイナーゼK
細胞を37℃で3時間インキュベートし、フェノール/クロロホルムで2回抽出した。サンプルを、20℃ O/N、エタノールで沈殿させ、ペレットを25μlのddH2O内に再懸濁した(溶解バッファー:40mM EDTA、40mM Tris−HCl、pH8、2%SDS)。
25μlのDNAを制限酵素BcII、50℃ O/Nで消化し、次いで、0.8%アガロース/TBEゲル上で分離した。全プラークは、真の組換え体であった。バックグラウンドはなかった。HIF−1α/VP16アデノウイルスベクターと共に含まれるアデノウイルス配列の概要を図7に示す。このベクターは、Ad2CMVBgal−6骨格とほぼ同一であったが、B−gal遺伝子は、HIF−1α/VP16ハイブリッド構築物で置き換えられていた。
実験1に記載の技術と類似の技術を用いて、我々は、HIF−1αからのDNA結合ドメインおよびダイマー化ドメインならびにNF−κBからのトランス活性化ドメインを含むキメラトランスアクティベータータンパク質をコードする核酸配列を構築した。特に、NFκBのp65サブユニットの活性化ドメインをコードするDNAフラグメント(Schmitz,M.L.およびBaeuerle,P.A.、1991、EMBO J.,10.3805−3817;Schmitz,M.L.ら、1994、J.Biol.Chem.,269,25613−25630;Schmitz,M.L.ら、1995、J.Biol.Chem.,270,15576−15584)を、HeLa細胞cDNAライブラリー(Clontech)からのDNA配列のPCR増幅(advantage cDNA PCRキット、Clotech)によって、作成した。次いで、DNAフラグメントを、pcDNA3/HIF−1α発現ベクターのAfl2とXbaI部位の間に挿入した。この構築物(pHIF−α/NF−κB)は、それ故、HIF−1αのaa1−390およびHF−κB p65サブユニットのaa407−551からなる。PCRによって生成した配列の完全性を、DNAシークエンシングによって確認した。
Claims (23)
- (a)低酸素症誘導性因子タンパク質のDNA結合ドメイン;および
(b)転写活性化が可能なタンパク質ドメイン
を含む、生物学的に活性があるキメラトランス活性化タンパク質をコードする核酸分子。 - 低酸素症誘導性因子タンパク質がHIF−1αである、請求項1の核酸分子。
- HIF−1αのDNA結合ドメインが最初のアミノ酸からAfl2部位までのアミノ酸残基を含む、請求項2の核酸分子。
- 転写活性化が可能なタンパク質ドメインが:HSV VP16;NFκB;熱ショック因子;p53;fos;v−jun;因子EF−C;HIV tat;HPV E2;Ad E1A;Sp1;AP1;CTF/NF1;E2F1;HAP1;HAP2;MCM1;PHO2;GAL4;GCN4;およびGAL11からなる群より選択されるタンパク質由来である、請求項1の核酸分子。
- 低酸素症誘導性因子タンパク質がヒト低酸素症誘導性因子HIF−1αである、請求項4の核酸分子。
- 低酸素症誘導性因子タンパク質がHIF−1αであり、そして転写活性化が可能なタンパク質ドメインがHSV VP16由来の転写活性化ドメインである、請求項1の核酸分子。
- HIF−1αのDNA結合ドメインが最初のアミノ酸からAfl2部位までのアミノ酸残基を含む、請求項6の核酸分子。
- 低酸素症誘導性因子タンパク質がHIF−1αであり、そして転写活性化が可能なタンパク質ドメインがNFκB由来の転写活性化ドメインである、請求項1の核酸分子。
- HIF−1αのDNA結合ドメインが最初のアミノ酸からAfl2部位までのアミノ酸残基を含む、請求項8の核酸分子。
- 低酸素症誘導性因子タンパク質がヒト低酸素症誘導性因子である、請求項1の核酸分子。
- 低酸素症誘導性因子タンパク質がヒトHIF−1αである、請求項1の核酸分子。
- 発現調節配列に、機能可能であるように連結されている、請求項1−11のいずれか1つの核酸分子を含む、発現ベクター。
- 発現調節配列が誘導性プロモーターを含む、請求項12の発現ベクター。
- 発現ベクターがpcDNA3/HIF/VP16/Afl2である、請求項12の発現ベクター。
- ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項12の発現ベクター。
- 請求項12−15のいずれか1つの発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
- 請求項1−11のいずれか1つの核酸分子にコードされる、生物学的に活性があるキメラトランス活性化タンパク質。
- 請求項12−15のいずれか1つの発現ベクターおよび薬学的に許容しうるキャリアーを含む、薬剤組成物。
- 請求項12−15のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む、低酸素症誘導性遺伝子の標的細胞における発現を増加させるための薬剤。
- 請求項12−15のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む、酸素正常条件下で細胞における生物学的に活性があるHIF−1αの持続発現を提供するための薬剤。
- 請求項12−15のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む、低酸素症関連障害を有する哺乳類患者における虚血性組織損傷を減少させるための薬剤。
- 請求項1−11のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、酸素正常条件下で細胞における生物学的に活性があるHIF−1αの持続発現を提供するための薬剤であって、前記核酸分子が前記細胞におけるその発現を指示する発現調節配列に、機能可能であるように連結されている、前記薬剤。
- 請求項1−11のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、低酸素症関連障害を有する哺乳類患者における虚血性組織損傷を減少させるための薬剤。
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