JPH0866192A - ヒトｓ−Ｍｙｃ様ポリペプチド及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒト胎盤ゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ法等によ
りヒトｓ−ｍｙｃ様遺伝子ｍｙｃＬ２を単離・同定し、
この遺伝子の発現産物であるヒトｓ−Ｍｙｃ様ポリペプ
チドＭｙｃＬ２を同定した。 【効果】 この遺伝子ＤＮＡをリポソーム内に包埋して
神経膠腫細胞内に投与することにより、腫瘍細胞の抑制
又はアポトーシスを引き起こすことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は腫瘍、特に神経膠腫（gl
ioma）や肺癌の治療に有効なヒトｓ−ｍｙｃ様ポリペプ
チド（以下ＭｙｃＬ２ともいう）及びそのアミノ酸配列
をコードするヒトｓ−ｍｙｃ様ポリペプチド遺伝子（以
下ｍｙｃＬ２ともいう）に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】癌遺伝子は正常細胞のゲノムＤＮＡの中
にすでに存在しているという立場から、細胞の癌化の指
令をして、がんの発現成長をもたらす遺伝子を、がん遺
伝子（oncogene）と称している。本明細書においては、
癌遺伝子としてｍｙｃ遺伝子を取り扱うものとする。ヒ
トの白血病、肺癌、胃癌等、種々の腫瘍で遺伝子増幅を
ひき起こす癌遺伝子としてｃ−ｍｙｃが知られており、
これはＮ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃ、Ｖ−ｍｙｃ等とともに
一群の癌遺伝子ファミリーを構成している。

【０００３】癌の発現・成長をもたらすこれらの癌遺伝
子とは別に、癌の成長を抑制したり、又は癌細胞のアポ
トーシス（プログラムされた細胞死）を誘導する作用を
持つ癌抑制遺伝子としてｓ−ｍｙｃ遺伝子が知られてい
る。ｓ−ｍｙｃ遺伝子は１９８９年に、ラットの遺伝子
ライブラリーから初めて単離・同定されたｍｙｃ関連遺
伝子であり、４２９個のアミノ酸からなる核タンパク質
（ｓ−Ｍｙｃ）のアミノ酸配列をコードする、イントロ
ンを含まない遺伝子ＤＮＡである（Sugiyama et al.,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA, 86,9144-9148(1989））。

【０００４】一方、特定のＤＮＡを動物細胞用の発現ベ
クターに組み込み、この発現ベクターを合成カチオン性
脂質からなるリポソームの内部に包埋させ、癌細胞内
に、又はその癌細胞とともに生体内に導入してＤＮＡの
取込みと発現を行うという新しいトランスフェクション
の手法（以下、リポフェクション又はリポソーム媒介ト
ランスフェクション法という）も研究されている（Felg
ner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 84,7413-7417(19
87））。特に、このリポソーム媒介トランスフェクショ
ン法はラットｓ−ｍｙｃ遺伝子に適用すると、脳腫瘍の
一種である神経膠腫に対して特異的な治療効果を発揮す
ることが報告されており、イン・ビボでの遺伝子治療の
試みと相俟って難治性癌疾患の有望な治療法として最近
注目されている。

【０００５】

【本発明が解決しようとする課題】しかしながら、腫瘍
に対し癌抑制作用又はアポトーシス誘導作用を示すヒト
のｓ−Ｍｙｃ様ポリペプチド（以下、このポリペプチド
が有するこれらの作用をヒトｓ−Ｍｙｃ様ポリペプチド
活性といい、このポリペプチドをＭｙｃＬ２という。）
はまだ見出されてはおらず、その単離・同定が望まれて
いた。また、このポリペプチドのアミノ酸配列をコード
するｍｙｃＬ２遺伝子もまだ知られておらず、その単離
・同定と、これを用いた特異性の高い癌治療用製剤及び
癌治療法の開発が切望されていた。

【０００６】本発明はヒトｓ−Ｍｙｃ様ポリペプチドで
あるＭｙｃＬ２を提供することを目的とする。本発明は
また、ＭｙｃＬ２のアミノ酸配列をコードするｍｙｃＬ
２遺伝子を提供することを目的とする。本発明はさら
に、ＭｙｃＬ２のドメインIV及びこれを含むアミノ酸１
１９−１９１の配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ
を含有する組換ベクターを提供することを目的とする。
本発明はさらにまた、ｍｙｃＬ２遺伝子を用いた特異性
の高い癌治療用製剤を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒト胎盤
由来のゲノムＤＮＡからＰＣＲ法によりｍｙｃＬ２のｃ
ＤＮＡを得、遺伝子操作技術を利用してｍｙｃＬ２をク
ローニングすることに成功した。そして、このｍｙｃＬ
２を動物細胞発現ベクターに導入し、リポソーム媒介ト
ランスフェクション法により癌細胞をトランスフェクシ
ョンしてアポトーシスを誘導できることを見出し、本発
明を完成した。

【０００８】本発明のヒトｓ−Ｍｙｃ様ポリペプチド
（ＭｙｃＬ２）のアミノ酸配列（配列番号：２）は図１
に示すように、８個のドメイン（Ｉ〜VIII）を含む３５
８個のアミノ酸からなっている。ドメインＩ〜III は転
写活性化領域、ドメインIVは酸性アミノ酸領域、ドメイ
ンＶは核移行シグナル、ドメインVIは塩基性アミノ酸領
域であり、ドメインVIIはヘリックス−ループ−ヘリッ
クス構造を有し、ドメインVIIIはロイシンジッパーを形
成している。また、ドメインＶ、VI及びVII はＤＮＡ結
合領域であり、ドメインVII 及びVIIIはタンパク質結合
領域である。ドメインＩでは第２０番目のＴｙｒがチロ
シンキナーゼにより、ドメインIVでは第１５８番目のＳ
ｅｒ及び第１６０番目のＳｅｒがカゼインキナーゼによ
り、ドメインVIでは第２７１番目のＴｈｒが、カゼイン
キナーゼにより、それぞれリン酸化される部位（以下、
リン酸化部位という）になっている。ドメインVIIIのロ
イシンジッパーにおいては、実線で囲まれたＭｅｔと３
つのＬｅｕがジッパー構造の構築に重要であり、実線の
外の破線で囲まれたアミノ酸の種類はジッパー構造には
ほとんど影響を与えない。ｍｙｃ関連遺伝子であるＬ−
ｍｙｃではドメインII中のＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔ
ｈｒ−Ｓｅｒなる配列の両側の２つのＳｅｒがリン酸化
部位となっており、ｃ−ｍｙｃではドメインII中のＴｈ
ｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒなる配列の両側の
ＴｈｒとＳｅｒとがリン酸化部位となっている。これに
対し、本発明のｍｙｃＬ２にはドメインIIにかかるリン
酸化部位は存在しない。

【０００９】本発明はＭｙｃＬ２の他に、図１のアミノ
酸配列を中心として含むＭｃｙＬ２の誘導体、及び一つ
又は二つ以上のアミノ酸が置換、削除又は挿入されてい
るがヒトｓ−Ｍｙｃ様ポリペプチド活性を有するＭｙｃ
Ｌ２の誘導体をも包含する。すなわち、本発明のＭｙｃ
Ｌ２及びその誘導体は、それらのポリペプチドのヒトｓ
−Ｍｙｃ様ポリペプチド活性に有害な又は不利な影響を
及ぼさない限り、ポリペプチドの長さ及びアミノ酸組成
において変化することができ、そのような変化したポリ
ペプチドも本発明の範囲に包含される。これらの誘導体
は、例えば、ＭｙｃＬ２の同種間のもしくは数種間の変
異型であってもよく、またはＭｙｃＬ２のポリペプチド
合成において、通常の方法に従い、そのアミノ酸配列中
の一つ又は二つ以上の原料アミノ酸を他のアミノ酸で置
き換えたり、削除することにより得られたもの、もしく
はそのアミノ酸配列中にない新たな原料アミノ酸を追加
することにより得られたものであってもよい。

【００１０】また、本発明はＭｙｃＬ２ポリペプチドの
アミノ酸配列をコードするヒトｓ−ｍｙｃ様遺伝子（ｍ
ｙｃＬ２）に関する。ｍｙｃＬ２は下式で表される塩基
配列（配列番号：３）を有するＤＮＡである。

【化５】

【００１１】本発明は構造遺伝子核酸（ＤＮＡ）である
ｍｙｓＬ２のみならず、その塩基配列（配列番号：３）
中のＴをＵで置き換えた核酸（ＲＮＡ）、これらの核酸
（ＤＮＡ及びＲＮＡ）に対して相補的な塩基配列を有す
る核酸（ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡ）、ｍｙｃＬ２に選択的
にハイブリダイズする上記核酸のフラグメント、及びこ
れらの修飾体をも包含する。

【００１２】本発明のＤＮＡは上記式の塩基配列を含む
限り、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ又はプラスミド等の
ベクターのいずれの形態であってもよい。本発明のＤＮ
Ａは、動物細胞等の宿主中でＭｙｃＬ２ポリペプチドを
発現させるように使用することができる。

【００１３】本発明のｍｙｃＬ２ＤＮＡは例えば以下の
ようにして製造することができる。 （イ）ヒト胎盤ゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ法を用いて、
目的とする上記式の塩基配列のｍｙｃＬ２を含むＤＮＡ
を単離し、これを適当なベクターに挿入する。 （ロ）得られたベクターでコンピテント細胞を形質転換
してｍｙｃＬ２含有ベクターを得、制限酵素を用いてｍ
ｙｃＬ２遺伝子のＤＮＡを切り出す。

【００１４】この切り出されたＤＮＡをベクターのプロ
モーターやエンハンサーの下流に連結してｍｙｃＬ２遺
伝子を含むトランスフェクション用のベクターを作るこ
とができる。

【００１５】このベクターを、例えば動物細胞にトラン
スフェクションし、得られたトランスフェクタントを培
養することによってＭｙｃＬ２ポリペプチドを産生する
ことができる。動物細胞でＭｙｃＬ２ポリペプチドを産
生させる場合のプロモーターとしては、原則として動物
細胞で働くプロモーターであれば何でもよいが、メタロ
チオネイン（ＭＴ）やサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）
プロモーターなどが好ましい。

【００１６】本発明のｍｙｃＬ２遺伝子を腫瘍の治療目
的で製剤として温血動物、特にヒトに適用するにあたっ
ては、ｍｙｃＬ２遺伝子又は転写抑制に関与する責任領
域を動物細胞発現ベクターに導入し、これをリポソーム
で処理、例えばリポソーム内に包埋させるか、又はリポ
ソームとイオン結合させることにより、上記ベクターを
リポソームと共に含むリポソーム−ＤＮＡ複合体を形成
し、この複合体そのものを、又はこの複合体を標的腫瘍
と同一又は同種の細胞にトランスフェクションして得た
細胞を、腫瘍内に投与することができる。

【００１７】投与は腫瘍内局注、手、足等への筋肉内注
射、ペレット及び皮内注射にて行なわれるが、本発明に
おいては好ましくは腫瘍内局注、筋注である。投与量は
癌・腫瘍の大きさによっても異なるが、本薬理作用が主
に免疫応答性を高めたアポトーシスにあることから、腫
瘍の大きさに較べて、少量で治療効果が期待される。通
常１回局注、筋注する量は、遺伝子含有リポソームの量
として０．１μｇ〜２ｍｇ程度である。投与間隔は週１
回〜３週間に１回程度である。投与量及び投与間隔の適
宜増減はさしつかえない。治療に用いる遺伝子含有リポ
ソームは使用時迄、４℃〜−８０℃で保存すればよい。
また、腫瘍細胞をトランスフェクションした形で、保存
してもよく、この場合−８０℃〜液体窒素下の冷凍状態
で保存することができる。これらにはまた、安定性を増
させる為に種々の添加剤、例えば医薬用賦形剤、緩衝液
等を加えてもよい。

【００１８】

【作用】本発明のｍｙｃＬ２遺伝子をリポソームと共に
含むリポソーム−ＤＮＡ複合体を患部に投与すると、ｍ
ｙｃＬ２の発現により産生されたＭｙｃＬ２ポリペプチ
ドが免疫系の液性因子を誘導して、投与部位のみなら
ず、他の神経膠腫細胞をも特異的に死に至らしめる。例
えば、ｍｙｃＬ２遺伝子を含むプラスミドを包埋させた
リポソーム−ＤＮＡ複合体でヒト由来の神経膠腫細胞Ｕ
２５１をトランスフェクションするとＭｙｃＬ２ポリペ
プチドが発現しており、かつ細胞は、癌による壊死（ne
crosis）でなくアポトーシスを起こしていることが確認
された。また、薬理的に転写活性の消失は、例えば腫瘍
増殖抑制作用をもたらす。すなわち、ドメインIV又はこ
れを含むアミノ酸１１９−１９１の配列をコードする塩
基配列を含むＤＮＡを含有する組換えベクターは腫瘍増
殖抑制剤の活性成分としても有用である。以下実施例に
より本発明のＤＮＡの製造法及びその発現について説明
する。なお制限酵素は、ことわらない限り宝酒造社製を
用いた。

【００１９】

【実施例】

（１）ｍｙｃＬ２を含むＤＮＡの単離 ヒト胎盤ゲノムＤＮＡ（ＣＬ６５５０−１，東洋紡社
製）より、ＰＣＲ法（Saiki,R.K.,PCR Protocols Edite
d by Innis,M.A.,et al.,13-20,ACADEMIC PRESSINC.)
を用いてｍｙｃＬ２を含むＤＮＡを単離した。使用した
プライマーを以下に示す。 HG46 (配列番号：4)：5'-CTTAGATCTATGGACCGCGACTCGTACC-3' (制限酵素 BgIII 部位を含む） HG47 (配列番号：5)：5'-AGCGAATTCAGTAGCTACTGAGGTACTC-3' (制限酵素 EcoRI 部位を含む）

【００２０】得られたＤＮＡ０．１μｇを、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩとＥｃｏＲＩの各々５Ｕの反応液５０μｌ中、
３７℃で２時間反応させた後、フェノール−クロロホル
ム抽出と、エタノール沈澱を行った。１２０００ｒｐｍ
で１０分間遠心分離を行い、沈澱物を回収した。ｐＴＺ
１９Ｒ（ＯＳＰＴＺ−１９Ｒ、東洋紡社製）０．１μｇ
を同様に処理して得た直鎖ベクターと、先に得られたＤ
ＮＡとを連結反応キット（Ligation kit）（６０２１、
宝酒造社製）を用いて１０μｌの反応溶液中で反応させ
た。反応液の一部（２μｌ）で後述の（４）で得られる
コンピテント細胞を形質転換することによって、ｍｙｃ
Ｌ２が挿入されたｐＴＺ１９−２０を得た。得られたＤ
ＮＡに対応するｍＲＮＡの読み取り枠（open reading f
rame) からは、図１に示すアミノ酸配列のポリペプチド
（ＭｙｃＬ２）が合成される。ヒトＬ−Ｍｙｃ（Morto
n,C.C.,et al.,GENOMICS 4,367-375(1989))とＭｙｃＬ
２(Robertson,N.G.,et al.,Nucleic Acids Res. 19, 31
29-3137(1991))のアミノ酸配列を比較すると、高い相同
性（スコア１２８９［７１．４％／３６４ａａ］）が見
られる。

【００２１】（２）ベクターの調製 重金属誘導型ＨＭＴＩＩプロモーター（Karin,M.Haslin
ger,et al.,Cell 36,371-329(1984))をｐＳＶｎｅｏ（K
ume,U.-T.et al.,J.Mol.Biol.202,779-781(1988))に挿
入して発現ベクターｐＳＶｎｅｏＨＭＴ(Nemoto,Y.,et
al.,Gene,91,261-265(1990))を得、その０．４μｇを制
限酵素Ｂａ−ｍＨＩ８Ｕで５０μ１中３７℃で２時間反
応させて直鎖ベクターを得た。この直鎖ベクターの末端
を、さらに平滑化キット（Blunting kit)(６０２５, 宝
酒造社製) を用いて平滑にした。このようにして得たベ
クターをＨＭＴベクターと呼ぶことにする。

【００２２】ｐＧａｌ４−ＭＬｂおよびｐＧａ１４−Ｍ
Ｌｈの作製用に、ｐＧａ１４の０．２μｇを制限酵素Ｘ
−ｂａＩとＢａｍＨＩ各々５Ｕの反応液５０μ１中３７
℃で２時間反応させ、同様の操作で直鎖ベクターを得
た。これをｂベクターと呼ぶことにする。ｐＧａｌ４−
ＳＭ作製用に、ｐＧａｌ４の０．４μｇを制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ８Ｕの５０μ１中３７℃で２時間反応させて得ら
れた直鎖ベクターの末端を、上記の平滑キットを用いて
平滑にした。得られたベクターをＳＭベクターと呼ぶこ
とにする。さらにこのベクターの０．２μｇを制限酵素
ＸｂａＩ５Ｕの５０μ１中３７℃で２時間反応させ、ｐ
Ｇａｌ−ＭＬｓ作製用のｓベクターを得た。ｐＧａｌ４
０．４μｇを制限酵素ＸｂａＩ８Ｕの５０μ１中３７
℃で２時間反応させて得られた直鎖ベクターの末端を、
平滑化キットを用いて平滑にした。このベクターの０．
２μｇをさらに制限酵素ＢａｍＨＩ５Ｕの５０μ１中３
７℃で２時間反応させて、ｐＧａｌ４−ＭＬｈｂ作製用
のｈｂベクターを得た。

【００２３】（３）用いた細胞株の由来 ヒト神経膠細胞株Ｕ２５１(Acta Pathol.Microbiol.Sca
nd.74,465-485,1968:Human Tumor Cells in vitro,in N
ew-York,Plenum Publishing Corp.,175-206(1975))はD
r.M.Rosenblum(UCSF)(Bodell,W.T.et al.,Cancer Res.4
5,3460-3464(1985);Yoshida,J.,et al.,Cancer 50,410-
418(1982)) より供与されたものを用いた。培養液とし
て、ＤＭＥＭ(Duldecco's modified essential mediu
m),10 ％ＦＣＳ（胎児ウシ血清）および６００μｇ／ｍ
ｌグルタミンを使用した。

【００２４】（４）コンピテント細胞の調製 ２％Bacto Tryptone (Difco 社製) 、０．５％Bacto Ye
ast extract(Difco 社製) 、０．５％ＭｇＳＯ₄ の組成
を有するψ-broth５ｍｌにE ．coli HB 101 株（ATCC33
694)を接種し、３７℃で振とう培養して６００ｎｍにお
ける吸光度が約０．３になった時点で全量を１００ｍｌ
のψ-brothに移した。３７℃で６００ｎｍにおける吸光
度が０．３−０．５に達するまで振とう培養を行った。
培養液を１０分間氷冷した後、４℃で６０００ｒｐｍ、
５分間での遠心分離により集菌した。Ｔｆｂ１液（30ｍ
Ｍ KOCOCH₃ ,100ｍＭ RbCl,10ｍＭ CaCl₂ , 50ｍＭ
ＭｎＣｌ₂ ，15％ ｇｌｙｃｅｏｌ，ｐＨ５．８）10ｍ
ｌに菌を懸濁させ、０℃に５分間静置後再び遠心分離し
て集菌した。Ｔｆｂ２液（10ｍＭ MOPS, 75ｍＭCaC
l₂ , 10ｍＭ RbCl,15% glycerol,pH 6.5)２ｍｌに菌を
懸濁させ、懸濁液を氷中に１５分間放置後、２００μｌ
ずつ分注し、ドライアイス−エタノール浴で瞬間凍結し
た後−８０℃で保存した。

【００２５】（５）ｍｙｃＬ２発現ベクターの調製 （１）で得られた pTZl9-20 の５μｇからｍｙｃＬ２遺
伝子を切り出すため、制限酵素ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩ各
々２０Ｕで、１００μ１中３７℃で２時間消化後、フェ
ノール−クロロホルム処理とエタノール沈殿を行なっ
た。回収された沈殿物を、平滑化キットを用いて５０μ
ｌの溶液中で反応させ、ＤＮＡの末端を平滑にした。反
応主成物を０．８％アガロースゲル上で電気泳動に付し
てｍｙｃＬ２遺伝子を含むフラグメントを回収した。こ
のフラグメント０．１μｇとＨＭＴベクター０．１μｇ
とを連結反応キットを用いて１０μｌで反応させ、その
一部２μｌを用いて、（４）で得られたコンピテント細
胞を形質転換して、メタロチオネイン プロモータ（Ｍ
Ｔプロモータ）発現ベクターpSVneoHMT-ML2 を得た。

【００２６】ｐＴＺｌ９−２０の５μｇを制限酵素Ｘｂ
ａＩとＢａｍＨＩで消化し、上記と同様の方法でｍｙｃ
Ｌ２遺伝子を含むフラグメントを回収した。このフラグ
メントとｂベクターとを上記と同様の方法によって連結
して、β−ガラクトシダーゼプロモーター（Gal プロモ
ーター）発現ベクターｐＧａｌ４−ＭＬｂを得た。ｐＴ
Ｚｌ９−２０の５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ２０Ｕの１
００μｌで，３７℃、２時間消化し、同様の方法で末端
を平滑にした。さらにＸｂａＩで消化後、同様の方法で
ｍｙｃＬ２遺伝子を含むフラグメントを回収した。この
フラグメントとｓベクターとを同様の方法で連結して、
ｐＧａｌ４−ＭＬｓを得た。

【００２７】ｐＴＺｌ９−２０の５μｇを制限酵素Ｈｉ
ｎｄIII ２０Ｕの１００μｌで３７℃、２時間消化し、
同様の方法で末端を平滑にした。このベクター４μｇと
ＢａｍＨＩリンカー（4610P,宝酒造社製）１μｇとを同
様の方法で連結し、フェノール−クロロホルム処理、エ
タノール沈澱を行った。このベクター約４μｇをＸｂａ
Ｉの１０ＵとＢａｍＨＩの２０Ｕで消化し、同様の方法
でｍｙｃＬ２遺伝子を含むフラグメントを回収した。こ
のフラグメントとｂベクターとを同様の方法で連結して
ｐＧａｌ４−ＭＬｈを得た。

【００２８】pTZl9-20の５μｇを制限酵素ＸｂａＩ２０
Ｕの１００μｌで３７℃、２時間消化し、同様の方法で
末端を平滑にした。さらにＢａｍＨＩで消化後、同様の
方法でmycL２遺伝子を含むフラグメントを回収した。こ
のフラグメントとｈｂベクターとを同様の方法で連結し
て、pGal4-MLhbを得た。ＤｒａＩで切り出したラットs-
myc フラグメント（Sugiyama,A.,et al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 86,9144-9148(1989)) ０．１μｇとＳＭベク
ター０．１μｇとを同様の方法で連結し、pGal4-SMを得
た。

【００２９】（６）ガン細胞へのプラスミドの挿入 ガン細胞へのin vitroでのプラスミドの挿入は、リポソ
ーム媒介トランスフェクション法(Felgner,P.L.,et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413-7417(1987)) に従
った。すなわち、lipid(liposome;100μｇ) と、ＣｓＣ
ｌ密度勾配遠心によって得られた発現ベクター（プラス
ミド）（１−２５μｇ）とを、１５０ｍＭＮａＣｌ，２
０ｍＭ HEPES,pH 7.4(HBS)buffer１．５ｍｌに懸濁させ
て加えた。１００ｍφシャーレ上で密集成長（confluen
t growth) に達した細胞を５ｍｌのＨＢＳで洗い３ｍｌ
の脂質−ＤＮＡ混合液を加えた。この細胞を３７℃、５
時間インキュベートした後、１０ｍｌの培養液を加え
た。３７℃、１６時間インキュベート後、新しい１０ｍ
ｌの培養液に置き換え、２〜３日後に細胞を集めた。安
定なトランスフェクタント（transfectant) を得るため
には、例えばネオマイシン（neomycin) 耐性を選択マー
カーとして利用する場合は４００μｇ／ｍｌとなる選択
培地で培養する。

【００３０】（７）インビトロ（in vitro) 実験 （ｉ）ｍＲＮＡと生死判別試験用細胞の調製 シャーレ１枚当り１×１０⁶ 個のＵ２５１トランスフェ
クタントを５％ＣＯ₂ガスの存在下３７℃で６時間培養
後、新しい培養液１０ｍｌに交換し、さらに２４時間
後、２５０μＭとなるようにＺｎＳＯ₄ を加えた（コン
トロール群には加えない）。ｍＲＮＡ調製用シャーレは
５時間後に処理した。生死判別試験用シャーレは７２時
間後に処理し、トリパンブルー染色で判定した。

【００３１】（ｉｉ）ノーザン ブロット分析 （６）に示した方法によりヒト神経膠腫Ｕ２５１細胞か
ら発現ベクターpSVneoHMT-ML2 を用いてトランスフェク
タントＵ２５１ＭＬ２を調製した。ｍｙｃＬ２（１．１
ｋｂ）の発現レベルをノーザンブロット法で分析したと
ころ、２５０μＭ ＺｎＳＯ₄ 存在下に様々な程度の発
現を示すクローンが得られた。

【００３２】ノーザン ブロットは以下のように行っ
た。mycL２のＯＲＦフラグメント約１μｇをＮｉｃｋ翻
訳キット（宝酒造社製）とα−[ ³²P ］−ｄＣＴＰ(Ame
rsham社製）３．７ＭＢｑを用いて１５℃、２時間反応
させた後反応を止め、さらに酵素を７０℃、１０分間処
理した後に、Sephadex G100 ゲル濾過により放射線ラベ
ルされたＤＮＡを分離した。全ＲＮＡ（total RNA)はＡ
ＧＰＣ法（Chomczynski,P.,and Sacchi,N.,Anal.Bioche
m.162,156-159(1987))により調製した。すなわち、１×
１０⁷ 個の細胞当り１０ｍｌの溶液Ｄ（４Ｍグアニジン
チオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム，０．
５％ナトリウム ラウロイル サルコシネート，０．１
Ｍメルカプトエタノール）を加え、Polytronでホモジェ
ナイズした。１ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム，ｐＨ４．０
を加えて混和した。１０ｍｌの水飽和フェノールを加え
混和した。２ｍｌのクロロホルム−イソアミルアルコー
ル（４９：１）を加え混和した。混合液を遠心管に移し
１０秒間激しく振とうし、１５分間氷冷し、次いで４℃
で１０，０００ｘｇ２０分間遠心分離した。上清を回収
し等量のイソプロパノールを加えよく混和した後、−２
０℃に１時間放置し、４℃で１０，０００ｘｇ２０分間
遠心分離した。沈澱に３ｍｌの溶液Ｄを加え、ピペッテ
ィングで完全に沈殿を溶解し、等量のイソプロパノール
を加えて混和した後、−２０℃に１時間放置し、４℃で
１０，０００ｘｇ１０分間遠心分離した。上清を捨て、
沈澱を７０％エタノールで洗浄して０．１５−０．３ｍ
ｇの全ＲＮＡを得た。次に以下のようにしてpoly(A)RNA
を調製した。全ＲＮＡに１ｍｌの１０ｍＭ Tris/HCl,pH
７．５，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ＳＤＳを加え、さ
らに１ｍｌのOligotex-dT30<super>（第一化学薬品社
製）を加え、混合液を６５℃、５分間加熱し、氷中で３
分急冷した。これに０．２ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌを加
え、３７℃で１０分間インキューベートした。１５，０
００ｒｐｍ，３分間の遠心分離後、上清を注意深く除去
した。得られたペレットを２．５ｍｌの１０ｍＭTris/H
Cl,ｐＨ７．５，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５Ｍ ＮａＣ
ｌ，０．１％ＳＤＳ溶液に懸濁し、１５，０００ｒｐ
ｍ，３分間の遠心分離後、上清を注意深く除去した。ペ
レットを１ｍｌの減菌蒸留水に懸濁した。懸濁液を６５
℃で５分間加熱し、氷中で３分間急冷した。この液を１
５，０００ｒｐｍ，３分間遠心分離後、上清中に１．５
−５μｇのｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ＝ｍＲＮＡを得た。得
られたｍＲＮＡを１．５％ホルムアルデヒド アガロー
スゲルを用いた電気泳動に付した。Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ(A
mersham 社製) を膜として用い、分子クローニング法
（Cold Spring Harbor Laboratory Press,7.46-47)に従
ってトランスファーを行った。先に調製した放射線標識
ＤＮＡ７４０ｋＢｑとＲＮＡとをトランスファーした膜
を用いて分子クローニング法（Cold Spring Harbor Lab
oratory Press,7.52）に従ってハイブリダイゼーション
とオートラジオグラフィーを行った。

【００３３】（ｉｉｉ）生死判別試験の測定 （ｉｉ）で得られた種々のクローンを用いてＭｙｃＬ２
の発現と腫瘍細胞の生死の関係を調べた。Ｚｎイオンを
加えてもＭｙｃＬ２を発現しないクローンでは、腫瘍細
胞中の死細胞の増加が殆ど見られないのに対し、Ｍｙｃ
Ｌ２を高発現するクローンでは、明らかな死細胞の増加
が認められた。

【００３４】（ｉｖ）ＭｙｃＬ２の転写因子としての機
能 ＭｙｃＬ２の機能の分子的機序を探るためにＭｙｃＬ２
に共通する転写因子としての機能をキメラタンパク発現
によって検討した。図２に示すように構築したエフェク
タープラスミド５μｇとレポータープラスミド５μｇと
をリポソーム媒介トランスフェクション法によりヒト神
経膠腫細胞Ｕ２５１に導入し、４８時間後細胞を集めて
ライゼートを調製しクロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ（ＣＡＴ）検定を行った。pGal4 を用い
た時のＣＡＴ活性を基準としこれに対する比で表した。
ＭｙｃＬ２はそのドメイン４を含むと全く転写活性化が
消失した（図３）。この結果より、転写活性の消失は以
下に示すドメインIV又はこれを含むアミノ酸１１９−１
９１の範囲（配列番号：１）に責任領域を求めることが
できる。

【００３５】ドメインIV（配列番号：６）

【化６】Ser Asp Ser Glu Gly Glu Glu Ile Asp Val アミノ酸１１９−１９１（配列番号：１）

【化７】 Lys Glu Phe Ala Thr Pro Asp Tyr Thr Pro Glu Leu Glu Ala Gly Asn Leu Ala Pro Ile Phe Pro Cys Leu Leu Gly Glu Pro Lys Ile Gln Ala Cys Ser Arg Ser Glu Ser Pro Ser Asp Ser Glu Gly Glu Glu Ile Asp Val Thr Val Lys Lys Arg Gln Ser Leu Ser Thr Arg Lys Pro Val Ile Ile Ala Val Arg Ala Asp Leu Leu Asp これら、ドメインIV及びこれを含むアミノ酸１１９−１
９１の配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡを腫瘍増
殖抑制剤として用いるために、このＤＮＡを含有する組
換えベクターをリポソームに包埋させて保存した。

【００３６】さらにキメラタンパクではなく、ＭｙｃＬ
２全体が転写に対してどのような作用を持っているかを
調べた。このＣＡＴ検定では、ＣＡＣＧＴＧの塩基配列
を認識する転写因子の転写活性化レベルを見ることが出
来る。図４に示すように、構築したエフェクタープラス
ミド１０μｇとレポータープラスミド５μｇとをリポソ
ーム媒介トランスフェクション法を用いてヒト神経膠腫
細胞Ｕ２５１に導入した。４８時間インキュベーション
後に細胞を集め、ライゼートを取りＣＡＴ検定を行っ
た。ｃ−ｍｙｃおよびｍｙｃＬ２の各遺伝子を組み込ん
だ場合のＣＡＴ活性を、遺伝子を組み込まなかった時の
ＣＡＴ活性（基礎転写レベル）で割った値をそれぞれの
遺伝子による転写活性化（あるいは抑制）能とした。Ｍ
ｙｃＬ２の発現は基礎転写レベルを下げる方向に働いて
おり、転写抑制因子としての機能を持つと考えられる
（図５）。同様にしてベクターなし、ｃ−ｍｙｃベ
クター５μｇ、ｃ−ｍｙｃベクター５μｇ＋ｍｙｃＬ
２ベクター２．５μｇ、ｃ−ｍｙｃベクター５μｇ＋
ｍｙｃＬ２ベクター５μｇ、のＣＡＴ検定を行った（図
６）。これによりＭｙｃＬ２はｃ−ＭｙｃのＣＡＣＧＴ
Ｇ配列における転写活性化を用量依存的に抑制している
ことがわかる。

【００３７】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＭｙｃＬ２ポリペプチドの１次構造とドメイン
Ｉ〜VIII。

【図２】エフェクタープラスミドとしてpGal4-MLb, -ML
h, -MLhb, -MLSおよび -SMの発現ベクターとＧａｌとの
融合の構造と、レポータープラスミドとしてＣＡＴ発現
遺伝子の５’側の制御遺伝子部分構造。

【図３】エフェクタープラスミドとレポータープラスミ
ドを用いて行ったＣＡＴ検定の結果。

【図４】エフェクタープラスミドとレポータープラスミ
ドの部分構造を示す。図２と比べ、レポーター部分の５
Ｇａｌ４結合部位が４ｘ−ＣＡＣＧＴＧで置き換わって
いる。

【図５】図４に示すエフェクタープラスミドとレポータ
ープラスミドを用いて行ったＣＡＴ検定の結果。

【図６】ＣＡＴ検定に及ぼすｃ−Ｍｙｃポリペプチドと
ＭｙｃＬ２ポリペプチドの影響を調べるため、同時に発
現するよう、Ｕ２５１細胞にトランスフェクトした結
果。

【００３８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：７３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル配列：Ｎｏ フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：ヒト（Homo sapiens) 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：１..７３ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 Lys Glu Phe Ala Thr Pro Asp Tyr Thr Pro Glu Leu Glu Ala Gly Asn 1 5 10 15 Leu Ala Pro Ile Phe Pro Cys Leu Leu Gly Glu Pro Lys Ile Gln Ala 20 25 30 Cys Ser Arg Ser Glu Ser Pro Ser Asp Ser Glu Gly Glu Glu Ile Asp 35 40 45 Val Thr Val Lys Lys Arg Gln Ser Leu Ser Thr Arg Lys Pro Val Ile 50 55 60 Ile Ala Val Arg Ala Asp Leu Leu Asp 65 70

【００３９】配列番号：２ 配列の長さ：３５８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル配列：Ｎｏ 起源 生物名：ヒト（Homo sapiens) 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：１..３５８ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 Met Asp Arg Asp Ser Tyr His His Tyr Phe Tyr Asp Tyr Asp Gly Gly 1 5 10 15 Glu Asp Phe Tyr Arg Ser Thr Thr Pro Ser Glu Asp Ile Trp Lys Lys 20 25 30 Phe Glu Leu Val Pro Pro Pro Trp Asp Leu Gly Pro Ala Ala Gly Asn 35 40 45 Pro Ala Leu Ser Phe Gly Leu Leu Glu Pro Trp Pro Val Gly Cys Ala 50 55 60 Gly Asp Glu Thr Glu Ser Gln Asp Tyr Trp Lys Ala Trp Asp Ala Asn 65 70 75 80 Tyr Ala Ser Leu Ile Arg Arg Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser Thr 85 90 95 Gln Glu Pro Leu Glu Arg Ala Val Ser Asp Leu Leu Ala Pro Gly Ala 100 105 110 Pro Arg Gly Tyr Ser Pro Lys Glu Phe Ala Thr Pro Asp Tyr Thr Pro 115 120 125 Glu Leu Glu Ala Gly Asn Leu Ala Pro Ile Phe Pro Cys Leu Leu Gly 130 135 140 Glu Pro Lys Ile Gln Ala Cys Ser Arg Ser Glu Ser Pro Ser Asp Ser 145 150 155 160 Glu Gly Glu Glu Ile Asp Val Thr Val Lys Lys Arg Gln Ser Leu Ser 165 170 175 Thr Arg Lys Pro Val Ile Ile Ala Val Arg Ala Asp Leu Leu Asp Pro 180 185 190 Arg Met Asn Leu Phe His Ile Ser Ile His Gln Gln Gln His Asn Tyr 195 200 205 Ala Ala Pro Phe Pro Pro Glu Ser Cys Phe Gln Glu Gly Ala Pro Lys 210 215 220 Arg Met Pro Pro Lys Glu Ala Leu Glu Arg Glu Ala Pro Gly Gly Lys 225 230 235 240 Asp Asp Lys Glu Asp Glu Glu Ile Val Ser Leu Pro Pro Val Glu Ser 245 250 255 Glu Ala Ala Gln Ser Cys Gln Pro Lys Pro Ile His Tyr Asp Thr Glu 260 265 270 Asn Trp Thr Lys Lys Lys Tyr His Ser Tyr Leu Glu Arg Lys Arg Arg 275 280 285 Asn Asp Gln Arg Ser Arg Phe Leu Ala Leu Arg Asp Glu Val Pro Ala 290 295 300 Leu Ala Ser Cys Ser Arg Val Ser Lys Val Met Ile Leu Val Lys Ala 305 310 315 320 Thr Glu Tyr Leu His Glu Leu Ala Glu Ala Glu Glu Arg Met Ala Thr 325 330 335 Glu Lys Arg Gln Leu Glu Cys Gln Arg Arg Gln Leu Gln Lys Arg Ile 340 345 350 Glu Tyr Leu Ser Ser Tyr 355

【００４０】配列番号：３ 配列の長さ：１０７７ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源 生物名：ヒト（Homo sapiens) 組織の種類：ヒト胎盤 配列の特徴 配列を決定した方法：Ｅ 配列

【００４１】配列番号：４ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列 CTTAGATCTA TGGACCGCGA CTCGTACC 28

【００４２】配列番号：５ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列 AGCGAATTCA GTAGCTACTG AGGTACTC 28

【００４３】配列番号：６ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル配列：Ｎｏ フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：ヒト（Homo sapiens) 組織の種類：ヒト胎盤 配列の特徴 配列を決定した方法：Ｅ 配列 Ser Asp Ser Glu Gly Glu Glu Ile Asp Val

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成７年８月２５日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１

【補正方法】変更

【補正内容】

【化１】 、該アミノ酸配列を中心として含むヒトｓ−Ｍｙｃ様ポ
リペプチドの誘導体、及び一つ又は二つ以上のアミノ酸
が置換、削除又は挿入されているがヒトｓ−Ｍｙｃ様ポ
リペプチド活性を有するヒトｓ−Ｍｙｃ様ポリペプチド
の誘導体。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３７】

【配列表】

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＭｙｃＬ２ポリペプチドの１次構造とドメイン
Ｉ〜ＶＩＩＩ。

【図２】エフェクタープラスミドとしてｐＧａｌ４−Ｍ
Ｌｂ，−ＭＬｈ，−ＭＬｈｂ，−ＭＬＳおよび−ＳＭの
発現ベクターとＧａｌとの融合の構造と、レポータープ
ラスミドとしてＣＡＴ発現遺伝子の５’側の制御遺伝子
部分構造。

【図３】エフェクタープラスミドとレポータープラスミ
ドを用いて行ったＣＡＴ検定の結果。

【図４】エフェクタープラスミドとレポータープラスミ
ドの部分構造を示す。図２と比べ、レポーター部分の５
Ｇａｌ４結合部位が４ｘ−ＣＡＣＧＴＧで置き換わって
いる。

【図５】図４に示すエフェクタープラスミドとレポータ
ープラスミドを用いて行ったＣＡＴ検定の結果。

【図６】ＣＡＴ検定に及ぼすｃ−Ｍｙｃポリペプチドと
ＭｙｃＬ２ポリペプチドの影響を調べるため、同時に発
現するよう、Ｕ２５１細胞にトランスフェクトした結
果。

【手続補正４】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下のアミノ酸配列で表されるヒトｓ−
   Ｍｙｃ様ポリペプチド： 【化１】 、該アミノ酸配列を中心として含むヒトｓ−Ｍｙｃ様ポ
   リペプチドの誘導体、及び一つ又は二つ以上のアミノ酸
   が置換、削除又は挿入されているがヒトｓ−Ｍｙｃ様ポ
   リペプチド活性を有するヒトｓ−Ｍｙｃ様ポリペプチド
   の誘導体。
2. 【請求項２】 請求項１記載のヒトｓ−Ｍｙｃ様ポリペ
   プチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核
   酸。
3. 【請求項３】 以下の塩基配列で表される請求項２記載
   の核酸、但し以下の塩基配列中、ＴはＵで置き換えるこ
   とができる。 【化２】
4. 【請求項４】 請求項２又は３記載の核酸であるＤＮＡ
   を含有する組換えベクター。
5. 【請求項５】 請求項４記載の組換えベクターをリポソ
   ームと共に含むリポソーム−ＤＮＡ複合体。
6. 【請求項６】 請求項３又は４記載の遺伝子によって形
   質転換されたヒト神経膠腫細胞。
7. 【請求項７】 請求項５記載のリポソーム−ＤＮＡ複合
   体を活性成分として含有する腫瘍治療用薬剤。
8. 【請求項８】 以下のアミノ酸配列をコードする塩基配
   列を含むＤＮＡを含有する組換えベクター。 【化３】Ser Asp Ser Glu Gly Glu Glu Ile Asp Val
9. 【請求項９】 以下のアミノ酸配列をコードする塩基配
   列を含むＤＮＡを含有する請求項８記載の組換えベクタ
   ー。 【化４】 Lys Glu Phe Ala Thr Pro Asp Tyr Thr Pro Glu Leu Glu Ala Gly Asn Leu Ala Pro Ile Phe Pro Cys Leu Leu Gly Glu Pro Lys Ile Gln Ala Cys Ser Arg Ser Glu Ser Pro Ser Asp Ser Glu Gly Glu Glu Ile Asp Val Thr Val Lys Lys Arg Gln Ser Leu Ser Thr Arg Lys Pro Val Ile Ile Ala Val Arg Ala Asp Leu Leu Asp
10. 【請求項１０】 請求項８又は９記載の組換えベクター
    をリポソーム中に含むリポソーム−ＤＮＡ複合体。
11. 【請求項１１】 請求項１０記載のリポソーム−ＤＮＡ
    複合体を活性成分として含有する腫瘍治療用薬剤。