CA2353304A1 - Polypeptides capables d'interagir avec la topoisomerase iii alpha humaine - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne de nouveaux polypeptides capables d'interagir avec la topoisomérase III.alpha. humaine et les séquences d'acides nucléique s codant pour ces polypeptides. Elle concerne en outre une méthode d'identification de composés capables d'ineragir avec lesdits polypeptides ainsi qu'une méthode pour identifier des molécules capables de moduler l'interaction de la topoisomérase III.alpha. avec lesdits polypeptides.</SDO AB>

Description

POLYPEPTIDES CAPABLES D'INTERAGIR AVEC LA TOPOISOMERASE I11 ALPHA HUMAINE
La présente invention concerne de nouveaux polypeptides capables d'interagir avec la topoisomérase IIIa humaine et les séquences d'acides nucléiques codant pour ces polypeptides. Elle concerne en outre une méthode d'identification de composés capables d'interagir avec lesdits polypeptides ainsi qu'une méthode pour identifier des molécules capables de moduler l'interaction de la topoisomérase IIIa avec lesdits polypeptides.
La réplication du DNA est un mécanisme complexe qui fait intervenir un grand nombre de facteurs. Le DNA se présente à l'état physiologique sous une forme super enroulée et l'accès à l'information qu'il contient requiert une modification importante du taux d'enroulement. La réplication nécessite la suppression des supertours, la séparation des deux brins de la double hélice d'ADN et le maintien de l'ADN
sous forme simple brin.
La modification du taux d'enroulement est assurée iu viao par les topoisomérases qui sont des enzymes capables de modifier les superstructures du DNA.
On distingue les topoisomérases de type I qui ne coupent que l'un de deux brins du DNA et qui suppriment les supertours et les topoisornérases de type II qui agissent en coupant les deux brins du DNA et qui sont capables de supprimer ou bien encore de créer les supertours. Les topoisomérases des eucaryotes sont moins bien connues que leurs homologues procaryotes et à ce jour, leur mécanisme d'action n'est pas encore élucidé.
La séparation des deux brins d'un duplex d'ADN est catalysée par un groupe d'enzymes, appelées DNA hélicases, qui agissent de façon ATP-dépendantes afin de produire l'ADN simple-brin utilisé comme matrice pour les processus de réplication et de transcription de l'ADN. Généralement, les héücases se fixent à l'ADN simple-brin ou aux jonctions entre de l'ADN simple et double-brin, et se déplacent dans une seule direction le long de l'ADN dans la région double-brin, détruisant les liaisons hydrogènes joignant les deux brins. Toutes les hélicases présentent une activité ATPase (ou NTPase) dépendante de l'ADN qui hydrolyse le phosphate gamma du ribonucleoside ou deoxyribonucleoside S'-triphosphate et fournit l'énergie nécessaire à
la réaction. La première hélicase fut découverte chez E. coli en 1976. Depuis, plus de 60 hélicases ont été isolées chez les procaryotes et les eucaryotes. Le rôle des hélicases humaines reste encore non élucidé dans la plupart des cas, à l'exception de HDHII
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26j

2 (réparation des lésions induites par les rayons X), HDHIV (assemblage des préribosomes), ERCC2 et ERCC3, impliquées dans la réparation par excision et la viabilité cellulaire. On connaît peu de choses sur la structure de ces hélicases. Une grande partie de l'information disponible sur les structures et les fonctions des hélicases a été obtenue par analyse comparative des séquences en acides aminés. En particulier, des motifs conservés ont permis de regrouper les hélicases en sous-familles, en se basant sur les homologies de séquences.
La Topoisomérase III humaine appartient à la famille des topoisomérases de type IA, et présente donc des homologies de séquence avec les topoisomérases I et III de E.
coli, la Topoisomérase III de levure ainsi que la réverse gyrase des archéobactéries. La Topoisomérase III humaine est maintenant appelée Topoisomérase IIIa, afin de la différencier de la topoisomérase III~i humaine, découverte récemment lors du séquençage du locus du gène de l'immunoglobulin ~, humaine (Kawasaki, K., Minoshima, S., Nakato, E., Shibuya, K., Shintani, A., Schmeits, J.L., Wang, J.
and Shimizu, N. 1997, Genome Research 7: 250-261 ), et pour laquelle aucune activité
fonctionnelle n'a été montrée. La topoisomérase IIIa exprimée dans la levure et non purifiée présente une activité de relaxation partielle d'un ADN très surenroulé
négativement (Hanai, R., Caron, P.R. and Wang, J.C. 1993. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA
93: 3653-3657).
La Topoisomérase IIIa est une protéine de 976 acides aminés et de poids moléculaire d'environ 110 kDa. Le gène codant pour la Topoisomérase IIIa humaine est présent en une seule copie sur le chromosome 17p11.2-12 (Hanai, R., Caron, P.R. and Wang, J.C. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3653-3657). Un homologue murin de la Topoisomerase III a été cloné récemment (Seki, T., Deki, M., Katada, T. and Enomoto, T. 1998. Biochim Biophys Acta 1396: 127-131).
La Topoisomérase IIIa présente une forte homologie de séquence avec la Topoisomérase III de levure, à savoir 44% d'identité de séquence et 61% de similarité.
L'homologie qu'elle présente avec les topoisomérases I et III bactériennes est moins forte, à savoir 24% d'identité et 44% de similarité. Cependant, la Topoisomérase IIIa ressemble plus à la Topoisomérase I de E. coli qu'aux autres membres du groupe des topoisomérases de type IA du point de vue de l'organisation de la protéine en domaines.
En effet, ces deux polypeptides contiennent un domaine C-terminal sans équivalent chez

3 la Topoisomérase III de E. coli ou de levure. Ce domaine C-terminal contient des motifs à 4 cystéines (3 motifs pour la Topoisomérase I de E. coli et 1.5 motif pour la Topoisomérase IIIa humaine), ainsi qu'un domaine C-terminal extrême pour lequel il a été démontré, pour la Topoisomérase I de E. coli, un rôle de fixation à l'ADN.
Le rôle de la topoisomérase IIIa humaine dans la cellule n'a pas encore été
identifié.
La Topoisomérase IIIa humaine semble être indispensable, au moins au cours de l'embryogenèse, puisque le knock-out de l'homologue murin de la Topoisomérase IIIa est létal (Li, W. and Wang, J.C. 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1010-1013). Les ARN messagers de la Topoisomérase IIIa sont présents dans de nombreux tissus (coeur, cerveau, placenta, poumon, foie, muscle squelettique, rein, pancréas) sous ia forme de trois transcrits de tailles 7.2, 6 et 4 kilobases (Fritz, E., Elsea, S.H., Patel, P.I. and Meyn, M.S. 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4538-4542).
D'autre part, il a été supposé que la Topoisomérase IIIa joue un rôle dans le maintien de la stabilité du génome. En effet, le cDNA CAT4.5, codant pour une Topoisomérase IIIa humaine tronquée de 141 acides aminés N-terminaux, est capable de complémenter le phénotype d'hypersensibilité aux rayonnements ionisants des cellules AT (Ataxie-Télangectasie) présentant une mutation dans le gène ATM
(Fritz, E., Elsea, S.H., Patel, P.I. and Meyn, M.S. 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA
94: 4538 4542).
Chez la levure, deux études indépendantes ont montré l'existence d'une interaction entre l'hélicase SGS 1 et la Topoisornérase III de levure. D'une part, les mutants sgsl- sont des suppresseurs du phénotype topa- (croissance lente, hyper-recombinaison) chez la levure S. cerevisiae (Gangloff, S., McDonald, J.P., Bendixen, C., Arthur, L. and Rothstein, R. 1994. Mol. Cell. Biol. 14: 8391- 8398).
D'autre part, il a été montré que les 500 premiers acides aminés de SGS 1 interagissent avec la Topoisomérase III de levure (Gangloff, S., McDonald, J.P., Bendixen, C., Arthur, L. and Rothstein, R. 1994. Mol. Cell. Biol. 14: 8391- 8398, Lu, J., Mullen, J.R., Brill, S.J., Kleff, S., Romeo, A.M. and Sternglanz, R. 1996. Nature 383: 678-679).
Cependant, à ce jour, aucune interaction entre une hélicase et la Topoisomérase IIIa humaine n'a été
identifiée.

4 L'identification de partenaires de la topoisomérase IIIa humaine constitue donc un enjeu majeur pour la compréhension du rôle de la topoisomérase IIIa humaine, et de son mécanisme d'action.
La présente invention résulte de la mise en évidence de nouveaux polypeptides capables d'interagir avec la topoisomérase IIIa (ci-après nommés polypeptides partenaires de la topoisomérase IIIa). Elle résulte également de la découverte que ces polypeptides montrent une forte homologie avec des protéines qui présentent des caractéristiques de structure communes aux RNA hélicases et pour lesquelles aucune fonction n'avait été décrite jusqu'alors. La mise en évidence de cette interaction et de ces homologies, désignent ces protéines comme DNA hélicases partenaires de la topoisomérase IIIa. L'identification de ces partenaires permet d'envisager de nombreuses applications basées sur l'action combinée de ces protéines partenaires et de la topoisomérase IIIa ; ces applications concernent notamment 1) La destruction de la structure nucléosomale : afin de procéder à certains processus tels que la réplication, la transcription, la réparation ou encore la recombinaison, l'ADN doit ëtre accessible aux machineries enzymatiques correspondantes, et pour ce faire, la structure nucléosomale doit être détruite de facon transitoire. Il est ainsi envisageable que l'hélicase sépare localement les brins d'ADN et crée des supertours positifs devant elle et des supertours négatifs derrière elle. La torsion positive est absorbée par la disruption des nucIéosomes, tandis que la torsion négative est relâchée sélectivement par la topoisomérase de type IA.
2) Le surenroulement positif de l'ADN : l'interaction entre l'hélicase et la topoisomérase de type IA est susceptible de reconstituer dans un organisme eucaryote, l'activité réverse gyrase des archéobactéries thermophiles. En effet, il a été
montré que la réverse gyrase de Sa~lfolobars acidocaldariars possède en N-terminal un domaine hélicase, contenant les 8 motifs des hélicases à motif « DEAD », et en C-terminal un domaine topoisomérase homologue aux topoisomérases de type IA (Confalonieri, F., Edie, C., Nadal, M., Bouthier de la Tour, C., Forterre, P. and Duguet, M.
1993. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90: 4753-4757); cette enzyme relâche l'ADN supertorsadé
négativement et introduit des supertours positifs dans l'ADN circulaire de façon ATP-dépendante (Forterre, P., Mirambeau, G., Jaxel, C., Nadal, M. and Duguet, M:
1985.
EMBO J. 4: 2123-2128 ). Cette activité réverse gyrase eucaryote peut servir à
éliminer des structures particulières d'ADN, telles que l'ADN cruciforme, l'ADN Z, les mésappariements, les intermédiaires de recombinaison etc. A partir de ces observations et de la mise en évidence que la topoisomérase IIIa est capable d'interagir avec une protéine possédant les propriétés d'une DNA hélicase, on peut envisager la réalisation in

5 vivo ou in vitro d'un complexe topoisomérase IIIa / protéine partenaire constituant un complexe enzymatique ayant les fonctions de type reverse gyrase. Il est à
noter, qu'une telle fonction de surenroulement positif de l'ADN n'a encore jamais été
décrite chez les eucaryotes.
3) La ségrégation des chromosomes nouvellement répliqués : à la fin de la réplication de l'ADN, des problèmes topologiques apparaissent au niveau du point de convergence de deux fourches de réplication. Un mécanisme qui permet de résoudre ce problème topologique implique l'action concertée d'une hélicase et d'une topoisomérase de type IA, capable de décaténer deux molécules d'ADN simple-brin. Ce modèle (Wang, J.C. 1991. J. Biol. Chem. 266: 6659-6662 ; Rothstein, R. and Gangloff, S. 1995. Genome Research S: 421-426) propose qu'au point de rencontre des deux fourches de réplication, la réplication est stoppée, laissant des portions d'ADN simple-brin entremêlés. Ceux-ci sont séparés grâce à l'action concertée de l'hélicase et de la topoisomérase. La synthèse d'ADN est alors complétée au niveau des régions simple-brin.
4) La recombinaison et la stabilité du génome : il a été montré que des mutants de levure Top3- ou des mutants Sgsl- présentent tous deux un phénotype d'hyperecombinaison, tandis que les doubles mutants Top3-/Sgsl- récupèrent un phénotype normal. Ceci montre que la Topoisomérase III de levure et l'hélicase agissent probablement de concert pour maintenir un faible taux de recombinaison par exemple par une activité de surenroulement positif de type réverse gyrase, ou par un mécanisme plus direct au niveau des appariements des intermédiaires de recombinaison.
A la différence de fhélicase SGS1, connue pour interagir avec la topoisomérase III de levure, la protéine partenaire de la topoisomérase IIIa mise en évidence par la demanderesse n'appartient pas à la famille des hélicases de type RecQ.
Les polypeptides selon l'invention montrent un fort degré d'homologie avec la séquence d'une protéine humaine DDX14 publiée par Chung et al (Chung, J., Lee, S-G.,

6 and Song, K. 1995. Korean J. Biochem. 27: 193-197). La protéine DDX14 présente une homologie de séquence significative avec une ARN hélicase d'origine mucine, cependant l'activité hélicase de cette protéine n'a pas encore été démontrée et la fonction de DDX 14 n'a pas encore été élucidée.
Les polypeptides selon l'invention montrent également un fort degré
d'homologie avec la séquence d'une protéine humaine DBX 1 publiée par Latin et al (Latin, T. and Page, D.C. 1997. Science. 278: 675-680). La protéine DBX1 code pour une protéine qui présente des homologies avec des ARN hélicases mais son activité hélicase n'a jamais été démontrée et la fonction de la protéine DBXI n'a pas encore été
identifiée.
La protéine DBX 1 code pour une protéine de 662 acides aminés. Le gène correspondant est situé sur le chromosome sexuel X et son homologue situé sur le chromosome Y est identique à 9I % au niveau protéique. Les séquences nucléiques et polypeptidiques de DBX 1 sont présentées dans les séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID
N°6. L'expression du gène DBXI semble ubiquitaire. Il a maintenant été
mis en évidence que la protéine DBX I possède les 8 motifs caractéristiques des hélicases de la famille « DEAD ». Plus précisément, elle appartient à la sous-famille représentée par l'hélicase PL 10, et dont les membres répertoriés sont les hélicases DED I et DBP 1 de la levure, l'hélicase An3 des amphibiens et les hélicases mucines PL 10, mDEAD2 et mDEAD3 (Gee, S.L. and Conboy, J.G. 1994. Gene 140: 171-177). Les hélicases appartenant à cette sous-famille contiennent en plus du domaine catalytique central contenant les 8 motifs conservés des hélicases, des domaines N et C terminaux particuliers. Le domaine C-terminal est riche en arginines et sérines, ce qui rappelle les domaines des facteurs d'épissage. Cependant, dans le cas des hélicases de cette sous-famille, ce domaine riche en arginines et sérines est plus court et ne possède pas autant de dipeptides RS que dans le domaine prototype des facteurs d'épissage.
L'invention fournit également un procédé d'identification de molécules capables de bloquer l'interaction entre la Topoisomérase IIIa humaine et un polypeptide partenaire de la topoisomérase IIIa. Un tel procédé permet d'identifier des molécules susceptibles notamment de bloquer l'activité de type réverse gyrase de ces deux protéines. De telles molécules sont utiles pour moduler les processus de division, de réplication, de transcription, de traduction, d'épissage, de réparation ou de recombinaison de l'ADN. Ces molécules sont également susceptibles de posséder une

7 activité antitumorale, de type cytotoxique, du fait de la perturbation de ces processus fondamentaux au niveau de l'ADN.
Un premier objet de l'invention concerne donc des séquences nucléotidiques codant pour des polypeptides capables d'interagir avec la topoisomérase IIIa.
Préférentiellement les séquences nucléotidiques selon l'invention codent pour un polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence polypeptidique décrite dans la séquence SEQ ID N°4 ou ses dérivées.
Au sens de la présente invention, le terme séquence polypeptidique dérivée désigne toute séquence polypeptidique différant de la séquence considérée, obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique, et possédant la capacité d'intéragir avec la topoisomérase IIIa. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on entend toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'augmenter sa résistance à des protéases ou d'améliorer son passage à travers les membranes cellulaires, celui d'augmenter son efficacité thérapeutique ou de réduire ses effets secondaires, celui d'augmenter l'affinité du peptide pour son site d'interaction, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques.
Avantageusement, les variants cômprennent des délétions ou des mutations portant sur des acides aminés dont la présence n'est pas déterminante à l'activité du dérivé. De tels acides aminés peuvent être identifiés par exemple par des tests d'activité
cellulaire comme décrit dans les exemptes.
De préférence encore, les séquences nucléotidiques selon l'invention comprennent tout ou partie de la séquence nucléotidique décrite dans la séquence SEQ
ID N°3 et codant pour la séquence SEQ ID N°4 ou les séquences dérivées de cette séquence nucléotidique.

8 PCT/FR99/02952 Au sens de la présente invention, le terme séquence nucléotidique dérivée désigne toute séquence différant de la séquence considérée en raison de la dégérescence du code génétique, obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique, ainsi que toute séquence hybridant avec ces séquences ou des fragments de celles-ci et codant pour un polypeptide capable d'interagir avec Ia Topoisomérase IIIa.
Par modification de nature génétique et/ou chimique, on entend toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus.
Le terme dérivé comprend également les séquences homologues à Ia séquence considérée, issues d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes. De telles séquences homologues peuvent être obtenues par des expériences d'hybridation. Les hybridations peuvent être réalisées à partir de banque d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde, la séquence native ou un fragment de celle-ci, dans des conditions variables d'hybridation.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. II peut s'agir de séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces séquences peuvent être obtenues par exemple par criblage de banques d'ADN (banque d'ADNc, banque d'ADN
génomique) au moyen de sondes élaborées sur la base de séquences présentées ci-avant.
De telles banques peuvent être préparées à partir de cellules de différentes origines par des techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier. Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. D'une manière générale les acides nucléiques de l'invention peuvent être préparés selon toute technique connue de l'homme du métier.
La présente invention .a également pour objet des polypeptides capables d'interagir avec la topoisomérase IIIa.

9 Au sens de la présente invention la dénomination topoisomérase IIIa couvre la topoisomérase IIIa humaine en elle même ainsi que les formes homologues correspondant notamment à des formes mutées de cette protéine.
De préférence, les polypeptides selon l'invention comprennent tout ou partie de la séquence polypeptidique décrite dans la SEQ ID N°4 ou de ses dérivées.
La présente invention vise également un polypeptide caractérisé en ce qu'il s'agit d'un fragment de la protéine DBXI, capable d'interagir avec la topoisomérase IIIa et comprenant tout ou partie fragment polypeptidique qui s'étend entre les résiddus 318 -662 et représenté dans la séquence polypeptidique SEQ ID N°6 ou ses dérivées.
La présente invention a également pour objet l'utilisation des polypeptides selon l'invention ou de fragments de ces polypeptides, pour un ralentissement, une inhibition, une stimulation ou une modulation de !'activité de la topoisomérase IIIa.
En effet, il est envisageable de réguler le fonctionnement de la topoisomérase IIIa par le biais des polypeptides selon l'invention ou de leurs fragments et notamment d'inhiber ou de ralentir l'activité de ia topoisomérase IIIa. Cette modification de l'activité de la topoisomérase IIIa est susceptible de conduire à un ralentissement de la croissance cellulaire ou un blocage du cycle cellulaire ou d'induire l'apoptose.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de préparation des polypeptides selon l'invention selon lequel on cultive une cellule contenant une séquence nucléotidique codant pour lesdits polypeptides, dans des conditions d'expression de ladite séquence et on récupère le polypeptide produit. Dans ce cas, la partie codant pour ledit polypeptide est généralement placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. Le choix de ces signaux (promoteurs, terminateurs, séquence leader de sécrétion, etc.) peut varier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. Par ailleurs, les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent faire partie d'un vecteur qui peut être à réplication autonome ou intégratif. Plus particulièrement, des vecteurs à réplication autonome peuvent ëtre préparés en utilisant WO 00/32768 PCTlFR99/02952 des séquences à réplication autonome chez l'hôte choisi. S'agissant de vecteurs intégratifs, ceux-ci peuvent être préparés, par exemple, en utilisant des séquences homologues à certaines régions du génome de l'hôte, permettant, par recombinaison homologue, l'intégration du vecteur.
5 La présente invention a également pour objet des cellules hôtes transformées avec un acide nucléique comportant une séquence nucléotidique selon l'invention. Les hôtes cellulaires utilisables pour la production des polypeptides de l'invention par voie recombinante sont aussi bien des hôtes eucaryotes que procaryotes. Parmi les hôtes eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou ies

10 champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer Ies levures du genre Saccharomyces, Kluyveromvces, Pichia, Schwanniomyces, ou Nansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules d'insecte Sf~, les cellules COS, CI-i0, Cl2?, de neuroblastomes humains etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspe~gillars ssp. ou Trichoderma ssp. Comme hôtes procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes E.coli, Bacillars, ou Streptomyces.
Selon un mode préféré, ies cellules hôtes sont avantageusement représentées par des souches de levures recombinantes.
Préférentiellement, les cellules hôtes comprennent au moins une séquence ou un fragment de séquence choisis parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID
N°3 ou SEQ ID N° 5, pour la production des polypeptides selon l'invention.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être incorporées dans des vecteurs viraux ou non viraux, permettant leur administration in vitro, in vivo ou ex vivo.
Un autre objet de (invention concerne en outre tout vecteur comprenant une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'invention. Le vecteur de l'invention peut être par exemple un plasmide, un cosmide ou tout ADN non encapsidé
par un virus, un phage, un chromosome artificiel, un virus recombinant etc. I1 s'agit de préférence d'un plasmide ou d'un virus recombinant.

11 A titre de vecteurs viraux conformes à l'invention on peut tout particulièrement citer les vecteurs de type adénovirus, rétrovirus, virus adéno-associés, virus de l'herpès ou virus de la vaccine. La présente demande a également pour objet des virus recombinants défectifs comprenant une séquence nucléique hétérologue codant pour un polypeptide selon l'invention.
Un autre objet de l'invention réside dans des anticorps ou fragments d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un polypeptide tel que défini ci-avant. De tels anticorps peuvent être générés par des méthodes connues de l'homme du métier. En particulier ces anticorps peuvent être préparés par immunisation d'un animal contre un polypeptide dont la séquence est choisie parmi les séquences SEQ ID
N°4 ou SEQ ID N°6 ou tout fragment ou dérivé de celles-ci, puis prélèvement du sang et isolement des anticorps. Ces anticorps peuvent également être générés par préparation d'hybridomes selon les techniques connues de l'homme de l'art. Les anticorps ou fragments d'anticorps selon l'invention peuvent notamment être utilisés pour inhiber et/
ou révéler l'interaction entre la topoisomérase IIIa et les polypeptides tels que définis ci-avant.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé
d'identification de composés capables de se lier aux polypeptides selon l'invention. La mise en évidence et/ou l'isolement de ces composés ou ligands, peut-être réalisée selon les étapes suivantes - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec un polypeptide de l'invention dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle-ci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et, - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide de l'invention.
Selon un mode particulier, un tel procédé permet d'identifier des molécules capables de bloquer l'activité de type hélicase, et en particulier l'activité
DNA hélicase de la protéine DBX 1 ou des polypeptides selon l'invention et de moduler ainsi les processus de division, de réplication, de transcription de l'ADN. Ces molécules sont

12 susceptibles de posséder une activité antitumorale, de type cytotoxique, du fait de la perturbation de ces processus fondamentaux au niveau de l'ADN.
A cet égard, un autre objet de l'invention concerne des composés ou ligands capables de se lier aux polypeptides selon l'invention et susceptibles d'être obtenu selon le procédé défini ci-avant.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un composé ou d'un ligand identifié et/ou obtenu selon le procédé décrit ci-avant comme médicament. De tels composés sont en effet susceptibles d'être utilisés pour la prévention, l'amélioration ou le traitement de certaines affections impliquant un dysfonctionnement du cycle cellulaire.
L'invention a encore pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un ligand obtenu selon le procédé décrit ci-avant.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé d'identification de composés capables de moduler ou d'inhiber totalement ou partiellement l'interaction entre la topoisomérase IIIa et les polypeptides selon l'invention ou la protéine DBXI.
La mise en évidence et/ou l'isolement de modulateurs ou de ligands capables de moduler ou d'inhiber totalement ou partiellement l'interaction entre la topoisomérase IIIa et les polypeptides selon l'invention ou la protéine DBX1, peut-être réalisée selon les étapes suivantes - on réalise la liaison de la topoisomérase IIIa ou d'un fragment de celle-ci à un polypeptide selon l'invention - on ajoute un composé à tester pour sa capacité à inhiber la liaison entre la topoisomérase IIIa et les polypeptides selon l'invention ;
- on détermine si la topoisomérase IIIa ou les polypeptides selon l'invention sont déplacés de la liaison ou empêchés de se lier ;

13 - on détecte et/ou isole les composés qui empêchent ou qui gênent la liaison entre la topoisomérase IIIa et les polypeptides selon l'invention.
Dans un mode particulier, ce procédé de l'invention est adapté à la mise en évidence et/ou l'isolement d'agonistes et d'antagonistes de l'interaction entre la topoisomérase IIIa et les polypeptides de l'invention. Toujours selon un mode particulier, l'invention fournit un procédé d'identification de molécules capables de bloquer l'interaction entre la Topoisomérase IIIa humaine et l'hélicase DBXI.
Un tel procédé permet d'identifier des molécules susceptibles de bloquer l'activité de type réverse gyrase de ces deux protéines et ainsi moduler les processus de division, de réplication, de transcription, de traduction, d'épissage, de réparation ou de recombinaison de l'ADN. Ces molécules sont susceptibles de posséder une activité
antitumorale, de type cytotoxique, du fait de la perturbation de ces processus fondamentaux au niveau de l'ADN.
A cet égard, un autre objet de l'invention concerne des composés ou ligands capables d'interférer au niveau de l'interaction entre la topoisomérase IIIa et les polypeptides selon l'invention ou la protéine DBXI et susceptibles d'être obtenu selon le procédé défini ci-avant.
L'invention concerne également l'utilisation d'un composé ou d'un ligand identifié et/ou obtenu selon le procédé décrit ci-avant comme médicament. De tels composés sont en effet susceptibles d'être utilisés pour la prévention, l'amélioration ou le traitement de certaines affections impliquant un dysfonctionnement du cycle cellulaire.
L'invention a encore pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un ligand obtenu selon le procédé décrit ci-avant.
D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent et qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.

14 LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : Cette figure reprend le début et ia fin de la séquence SEQ ID
N° 1 pour présenter l'introduction des sites BamHI et SaII en S' et 3' de la séquence codante de la topoisomérase IIIa et la position des sites XhoI et HindIII.
MATERIEL ET METHODES
1 ) Techniques générales de biologie moléculaire Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN
plasmidique en gradient de chlorure de césium, félectrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extractions de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987.
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur.
Le remplissage des extrémités S' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S 1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 5 ( 1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Polymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les 10 spécifications du fabricant.
La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
2) Les souches de levures utilisées sont

15 La souche yCMl7 du genre S. cerevisiae (MA Ta, t~ra3-52, his3-200, ade2-101, Ivs2-801, trpl-901, leu2-3,112, canr, gal4-542, ga180-538. URA3::GAL1/10-IacZ
URA3) a été utilisée comme outil de criblage de la banque de fusion de cellules Hela par le système deux hybrides.
La souche L40 du genre S.cerevisiae (MATa, his3D200, trpl-901, leac2-3,112, ade2, LYS2:: (IexAop)4-HIS3, URA3: (lexAop)8-LacZ, GAL4) a été utilisée pour vérifier les interactions protéine-protéine quand l'un des partenaires protéiques est fusionné à la protéine LexA. Cette dernière est capable de reconnaïtre l'élément de réponse LexA
contrôlant l'expression des gènes rapporteurs LacZ et His3.
Elles ont été cultivées sur les milieux de culture suivants Milieu YPD complet : Extrait de levures (lOg/1) (Difco), Bactopeptone (20g/1) (Difco), Glucose (20g/1) (Merck). Ce milieu a été rendu solide par addition de 20g/1 d'agar (Difco).

16 Milieu YNB minimum : Yeast Nitrogen Base (sans acides aminés) (6,7g/1) (Difco), Glucose (20g/1) (Merck). Ce milieu peut être rendu solide par addition de 20g/1 d'agar (Difco). Ce milieu est complémenté avec les acides aminés ou les bases azotées (SOmg/ml) nécessaires pour assurer la croissance des levures auxotrophes. De ampicilline (100 p,g/ml) est ajoutée au milieu afn d'éviter les contaminations bactériennes.
3) Les souches de bactéries utilisées sont La souche TG1 d'Escherichia coli de génotype supE, hsd~5, thi, 0(lac-proAB), F'[tra D36 pro A+B+ lacIq lacZOMlS] a été utilisée pour la construction des plasmides pLex-TopoIIIa et pGBT-TopoIIIa.
La souche HB101 d'Escherichia coli de génotype supE44, aral4, galK2, lacYl, 0(gpt-proA)62, rpsL20(Strr), xyl-5, recA 13, 0(mcrC-mn), HsdS (c m-) a été
employée comme moyen d'amplification et d'isolement de plasmides provenant de la banque d'ADNc de cellules Hela.
La souche TG1 a été cultivée sur Milieu LB : NaCI (Sg/1) (Difco), Bactotryptone (lOg/1) (Difco), Extrait de levure {Sg/1) (Difco). Ce milieu peut être rendu solide par addition de 20g/1 d'agar (Difco). L'ampicilline a été utilisée à 100 p.g/ml pour la sélection des bactéries ayant reçu les plasmides portant comme marqueur le gène de résistance à cet antibiotique.
La souche HB 101 a été cultivée sur Milieu M9: Na2HP04 (7g/1) (Sigma), KH2P04 (3g/1) (Sigma), NH4C1 (lg/1) (Sigma), NaCI (O,Sg/1) (Sigma), Glucose (20g/1) (Sigma), MgS04 (Imm) (Sigma), Thiamine (0,001%). Ce milieu est rendu solide par addition de I Sg/I d'agar (Difco).
De la leucine (SOmg/1) (Sigma) et de la proline (SOmg/1) (Sigma) sont ajoutées au milieu M9 pour permettre la croissance de la souche HB 101. Lors de la sélection de plasmides provenant de la banque deux hybrides d'ADNc de cellules Hela, la leucine n'a pas été ajoutée au milieu car les plasmides portent un marqueur de sélection Leu2.

WO 00/32?68 PCT/FR99/02952

17 3) Les plasmides utilisés sont Vecteur pGBT9 (+2) : ce plasmide dérive du plasmide pGBT9 (Clontech). Il présente un décalage du cadre de lecture de +2, en amont du site EcoRl, dans la zone correspondant au multisites de clonage. La différence de séquence entre pGBT9 (+2) et pGBT9, en amont du site EcoRI (souligné), est représentée en gras ci-dessous SEQ ID N°7 pGBT9 (+2) TCG CCG GAA TTG AAT TCC CGG GGA TCC GT
SEQ ID N°8 pGBT9 TCG CCG GAA TTC CCG GGG ATC CGT
Le vecteur pGBT9 (+2) est un plasmide navette de 5,4 kb qui possède une origine réplication bactérienne et de levure lui permettant de se répliquer à
haut nombre de copies chez ces deux micro-organismes. Ce plasmide contient un site multiple de clonage situé en aval de la séquence codant pour le domaine de liaison à l'ADN
de GAL4 et en amont d'un terminateur pour former une protéine de fusion. II
contient également le gène TRP 1 de S. cerevisiae qui permet de complémenter les levures de génotype trpl afin de les sélectionner sur un milieu minimum ne contenant pas de tryptophane. Ce vecteur porte le gène de résistance à l'ampicilline qui permet de sélectionner les bactéries sur un milieu contenant de l'ampicilline.
pGBT-HaRasVall2 : plasmide dérivé de pGBT9 et comprenant la séquence codant pour la protéine HaRas mutée en position Va112 connue pour interagir avec la protéine Raf de mammifère. Ce plasmide a été utilisé pour tester la spécificité
d'interaction de la protéine selon l'invention avec la topoisomérase IIIa, humaine.
PGBT-Fe65 : plasmide dérivé de pGBT9 et comprenant une partie de la séquence codant pour la protéine Fe65 connue pour interagir avec la région cytoplamique de l'APP (Précurseur du Peptide Amyloïde). Ce plasmide a été
utilisé
comme contrôle pour vérifier la spécificité d'interaction de la protéine selon l'invention avec la topoisomérase IIIa humaine.

18 Le vecteur pGAD GH : fourni par Clontech et qui permet l'expression chez la levure de protéines de fusion entre le domaine transactivateur de GAL4 et une protéine codée par l'ADNc provenant d'une banque de cellules Hela, inséré au niveau des sites EcoRI et XhoI.
Le vecteur pLex9 (pBTMII6) (Bartel et al D.A Hartley Ed, Oxford University press page 1 S3) de Skb homologue au pGBTlO qui contient un site multiple de clonage situé en aval de la séquence codant pour le répresseur bactérien LexA et en amont d'un terminateur pour former une protéine de fusion.
4 ) les oligonucléotides de synthèse employés sont SEQ ID N°9 oligonucléotide 124 CGAGGTCTGAGGATGATCTT
SEQ ID N°10 oligonucléotide 12S
CTGAGAAAGTGGCGTTCTCT
Ce couple d'oligonucléotides a servi à amplifier par PCR, à partir d'une banque d'ADNc de cellules Hela, un fragment correspondant à la séquence codant pour la topoisomérase IIIa humaine.
SEQ ID N°11 oligonucléotide Top3Xhol AAGTTACTCGAGATGGCCCTCCGAGG
SEQ ID N°12 : oligonucléotide Top3Hind3 ACGAGCAAGCTTCTCTACCCTACCCTG
Le couple d'oligonucléotidesTop3Xho1 et Top3Hind3 a permis d'introduire respectivement les sites XhoI et HindIII lors d'une deuxième étape de PCR sur le fragment correspondant à la topoisoméraseIIIa préalablement amplifiée grâce aux oligonucléotides 124 et 125.
2~ SEQ ID N° 13 : oligonucléotide PCS 1

19 AATTGCGAATTCTCGAGCCCGGGGATCCGTCGACTGCA
SEQ ID N° 14 : oligonucléotide PCS2 GTCGCAGGATCCCCGGGCTCGAGAATTCGC
Le couple d'oligonucIéotides PCS 1 et PCS2 a permis d'introduire dans le plasmide pLex9 un site XhoI en phase avec la séquence codante de la topoisoméraseIIIa humaine. L'insert comportant le gène codant pour la topoisomérase IIIa a donc été
recloné dans ce vecteur entre les sites XhoI en S' et Sal I en 3'.
SEQ ID N°15 oligonucléotide GAL4TA
CCACTACAATGGATGATG
Cet oligonucléotide a été utilisé pour séquencer les inserts contenus dans les plasmides de la banque deux hybrides d'ADNc de cellule Hela.
Les oligonucléotides sont synthétisés sur l'appareil Applied System ABI 394-08. Ils sont décrochés de la matrice de synthèse par de l'ammoniac et précipités deux fois par 10 volumes de n-butanol puis repris dans de l'eau. La quantification est effectuée par mesure de la densité optique (lunité DO correspond à 30 pg/ml).
S) Transformation des bactéries TG1 La totalité du volume de ligation (10 pl) est utilisée pour transformer les bactéries TG1 rendues compétentes par la méthode de Chung et col, ( PNAS,1988 86, 2172-2175).
Les bactéries TG1 sont mises en culture dans un milieu LB liquide pendant quelques heures dans une étuve à agitation à 37°C, jusqu'à obtenir une DO de 0,6 à 600 nm. Le milieu est ensuite centrifugé à 6000 rpm pendant 10 mn. Les bactéries sont rendues compétentes en reprenant le culot bactérien avec un volume de TSB
(milieu LB
+ 100 g/I de PEG 4000, 5% de DMSO, 10 mM de MgCl2, 10 mM de MgS04) correspondant à 1/10 du volume du milieu de la culture initiale. Après incubation à 4°C
pendant 30 à 60 minutes, 200 ul de bactéries sont mises au contact des produits de WO 00/32768 PCf/FR99/02952 ligation pendant 15 minutes sur la glace. Après addition de 200p1 de LB, les bactéries sont incubées 30 mn à 37°C puis étalées sur un milieu LB + ampicilline.
6) Préparation de plasmides de la banque deux hybrides d'ADNc de cellules Hela(Clontech~).
5 La banque deux hybrides d'ADNc de cellules Hela est vendue sous forme de bactéries. Ces dernières contiennent un plasmide pGAD GH renfermant un insert correspondant à un ADNc de cellules Hela. Les ADNc de cette banque sont constitués grâce à une amorce oligodT. Ces cDNA sont clonés de façon orientée dans le vecteur pGAD GH au niveau des sites EcoRI et XhoI. 2.1 ) 10 L'ADN plasmidique de la banque d'ADNc de cerveau a été extrait suivant le protocole Clontech~. Afin de conserver la représentativité de la banque qui est constituée de 1,2.106 plasmides indépendants, le lot d'ADN plasmidique a été
préparé à
partir d'un nombre de colonies bactériennes isolées correspondant à un peu plus de deux fois la représentativité de la banque soit 4.106 colonies.
15 Après vérification du titre de la banque, 2 pl de bactéries de la banque deux hybrides d'ADNc de cellules Hela, mis préalablement dans 8 ml de LB, sont étalés sur un milieu solide (16 boites / 770 cm2 en milieu LB+ampicilline). Les colonies apparues sont reprises pour chacune des boites avec 30m1 de LB+ampicilline liquide. Les suspensions obtenues sont incubées à 37°C pendant 3 heures. L'ADN est ensuite extrait

20 de ces souches par la technique d'extraction d'ADN plasmidique en grande quantité. La concentration en ADN est déterminée à 260 nm.
7) Transformation de la levure Les levures préalablement cultivées dans 100m1 de milieu liquide sont récoltées par centrifugation (3000 rpm, 3 minutes). Le culot est lavé deux fois par centrifugation avec Iml d'eau stérile. Les levures sont ensuite reprises par 1 ml de la solution I de transformation (LiAc 0. I M, Tris-HCl pH 7,5 l OmM, EDTA 1 mM) puis centrifugées (3000 rpm, 3 minutes). Le culot est repris dans 1 ml de la solution I de transformation.
50 Itl de cette suspension de levures sont mis en présence de SOpg d'ADN de sperme de saumon et de 1 à S p.g d'ADN plasmidique et de 300p1 d'une solution II de transformation (LiAc O.IM, Tris-HCl pH 7,5 IOmM, EDTA 1mM dans du PEG4000

21 40%). Ce mélange est incubé à 28°C pendant 30 minutes. Après application d'un choc thermique (40°C , 15 minutes), les cellules sont récoltées par centrifugation (15000 rpm pendant 1 mn). Ce culot est repris dans 200 p.l d'eau puis étalé sur un milieu minimum gélosé ne contenant pas les acides aminés correspondant aux marqueurs de résistance portés par les plasmides transformants les levures. Les levures sont incubées 72 heures à
28°C.
8) Transformation de la levure par la banque deux hybrides d'ADNc de cellules Hela.
La levure utilisée a été préalablement transformée par le plasmide pLexTopoIIIa. Elle est cultivée en milieu minimum YNB+His+Lys+Ad+Leu (250 ml), à 28 °C, sous agitation jusqu'à une densité de 107 cellules/ml. Les cellules sont récoltées par centrifugation (3000 rpm, 10 minutes) puis reprises dans 250 ml d'eau.
Après une nouvelle centrifugation, le culot cellulaire est repris dans 100 ml d'eau et de nouveau centrifugé. Le culot est alors repris dans lOml de la solution I de transformation et incubé pendant 1 heure à 28 °C sous agitation. Après centrifugation, les cellules sont de nouveau reprises dans 2,5 ml de la solution I de transformation, de 100 pl de la banque d'ADNc de cellules Hela et de 20 ml de la solution II de transformation, puis incubées pendant 1 heure à 28 °C sous agitation.
Un choc thermique est effectué sur ce mélange de transformation à 42 °C pendant 20 minutes.
Les cellules sont ensuite centrifugées et le culot cellulaire récolté est lavé
avec 10 ml d'eau stérile. Cette opération est répétée deux fois puis le culot est repris avec 2,5 ml de PBS. A ce stade, le PEG toxique pour les cellules est éliminé. 2,4 ml de cette suspension sont utilisés pour ensemencer 250 ml de milieu minimum contenant les acides aminés His, Lys, Ad et cultivés durant une nuit dans un shaker à 28 °C. Les 100 pl de cette suspension restants servent à déterminer l'efficacité de la transformation par dilution sur milieu minimum solide enprésence de His, Lys et Ad. La culture de nuit est ensuite centrifugée (3000 rpm pendant 5 mn) et lavée deux fois à l'eau stérile. Le culot est ensuite repris dans 2,5 mI d'eau. Un aliquot de 2,4 ml de ce mélange est amené
à lOml dans de l'eau stérile, cette solution est utilisée pour ensemencer 10 boites de 435 cm2 contenant 200 ml de milieu YNB+Lys+Ad et mis à incuber pendant 3 jours. Les 100 ul restants sont utilisés pour déterminer le taux d'ampliftcation du nombre de colonies au cours d'une nuit de culture.

22 9 ) Extraction d'acides nucléiques de levures La valeur d'une anse moyenne d'un clone de levure est mise dans 200p1 d'une solution TELT (Triton X100 2%, SDS 1%, NaCI 100mM, Tris pH8 IOmM, EDTA
I mM), en présence de 3g de billes de verre de 450 pm de diamètre et de 200p1 de phénol/chloroforme. Ce mélange est agité pendant 15 minutes, puis centrifugé
pendant 2 minutes à 14000 rpm. Le surnageant est collecté sans prélever la galette protéique et l'ADN contenu dans cette phase est précipité avec 2,5 volumes d'éthanoI
absolu. Après centrifugation pendant 2 minutes à 14000 rpm, le culot d'ADN est séché et repris dans 20 ul de TE-RNAse. 3 pl de cette solution d'ADN préalablement dialysée contre de l'eau, qui correspond à un mélange d'acides nucléiques, sert directement à
transformer des bactéries HB I01. Seul l'ADN plasmidique est capable de se répliquer dans les bactéries et peut être analysé par la technique de préparation d'ADN
plasmidique de bactéries en petite quantité.
I O) Test d'activité de la ~i-galactosidase.
Une feuille de nitrocellulose est préalablement déposée sur la boite de Pétri contenant les clones de levures individualisés. Cette feuille est ensuite plongée dans de l'azote liquide pendant 30 secondes afin de faire éclater les levures et de libérer ainsi l'activité l3galactosidase. Après décongélation, la feuille de nitrocellulose est déposée, colonies vers le haut, dans une autre boite de Pétri contenant un papier Whatman 3M
préalablement imbibé de I,SmI de solution PBS (Na2HP04 60mM, NaH2P04 40mM, KCl l OmM, MgS04 1 mM, pH7) et de 10 à 30p1 de X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-(3-D-galactoside) à SOmg/ml de N,N-diméthyIformamide. La boite est ensuite incubée à
37°C.
Exemple 1 : Construction d'un vecteur permettant l'expression d'une protéine de fusion entre la topoisomérase IIIa humaine et une protéine se liant à
l'ADN.
Le criblage d'une banque d'ADNc utilisant le système double hybride nécessite au préalable que la topoisomérase IIIa humaine soit fusionnée à une protéine capable de se fixer sur les promoteurs contrôlant l'expression des gènes rapporteurs comme la

23 protéine LexA du répresseur bactérien ou le domaine de liaison à l'ADN (DB) de GAL4. L'expression des protéines de fusion est réalisée grâce au vecteur pLex9 dans le cas d'une fusion avec la protéine LexA ou grâce au vecteur pGBT9 (+2) pour une fusion avec le DB de GAL4 (cf. Matériel et Méthodes). La séquence codant pour la topoisomérase IIIa humaine présentée en SEQ ID N° 1, a été introduite dans ces deux types de vecteur dans le même cadre de lecture que la séquence correspondant à
la protéine LexA ou au DB de Gal4.
Le fragment d'ADN correspondant à la séquence codant pour la topoisomérase IIIa humaine a été amplifié par PCR à partir d'une banque d'ADNc de cellules Hela (Clontech) grâce aux oligonucléotides 124 et 125. Une deuxième étape d'amplification par PCR a été réalisée sur le fragment d'ADN afin d'introduire aux deux extrémités les sites XhoI et HindIII grâce au couple d'oligonucléotides Top3Xho1 et Top3Hind3. Le nouveau fragment d'ADN obtenu, digéré par XhoI et HindIII, a été introduit aux sites correspondant dans le vecteur pBlueBacHis2A (Invitrogen) qui donne la possibilité
d'utiliser de nouveaux sites de restriction BamHI et SaII (représentés en gras avec les sites XhoI et HindIII sur la figure I ) pour réaliser les constructions finales.
Le plasmide pLex-TopoIIIa a été construit par insertion du fragment XhoI-SaII, du plasmide précédant, correspondant à la topoisoméraseIIIa humaine, dans le plasmide pLex9 préalablement modifié par insertion des oligonucléotides PCS 1 et PCS2 aux sites EcoRI-PstIl. Ce plasmide a été utilisé pour cribler une banque deux hybrides d'ADNc de cellules Hela dans le but d'identifier des protéines interagissant avec la topoisomérase IIIa humaine.
Le plasmide pGBT-TopoIIIa a été construit par insertion, aux sites BamHI et SaII du plasmide pGBT9 (+2), d'un fragment obtenu par digestion partielle avec BamHI
et totale avec SaII et correspondant à la topoisomérase IIIa humaine. Ce plasmide a été
utilisé pour valider par la technique du deux hybrides la spécificité
d'interaction des protéines sélectionnées lors du criblage avec la topoisomérase IIIa humaine.
Les constructions ont été vérifiées par séquençage de l'ADN. Cette vérification a permis de montrer que les fragments de la topoisomérase IIIa humaine ne présentaient pas de mutations générées au cours de la réaction de PCR et qu'ils étaient fusionnés

24 dans la même phase ouverte de lecture que celle du fragment correspondant à la protéine LexA ou au DB de GAL4.
Exemple 2 : criblage par la technique du deux hybrides d'une banque d'ADNc de cellules HeLa.
Le criblage d'une banque de fusion pernzet d'identifier des clones produisant des protéines fusionnées au domaine transactivateur de GAL4, pouvant interagir avec la topoisomérase IIIa. Cette interaction permet de reconstituer un transactivateur qui va alors être capable d'induire l'expression des gènes rapporteurs His3 et LacZ
dans la souche L40 utilisée.
Pour effectuer ce criblage, une banque de fusion réalisée à partir d'ADNc provenant de cellules Hela a été choisie.
Transformation de la levure par la banque deux hybrides d'ADNc de cellule Hela et sélection des clones positifs.
Lors du criblage il est nécessaire de préserver la probabilité que chaque plasmide indépendant de la banque de fusion soit présent dans au moins une levure en même temps que le plasmide pLex-TopoIIIa. Pour préserver cette probabilité, il est important d'avoir une bonne efficacité de transformation de la levure, à cette fin , il a été choisi un protocole de transformation de la levure donnant une efficacité de 105 cellules transformées par p.g d'ADN. De plus, comme la cotransformation de la levure par deux plasmides différents réduit cette efficacité, une levure L40 préalablement transformée par le plasmide pLex-TopoIIIa a été utilisée. Cette souche contenant pLex-TopoIIIa, de phénotype His-, Lys-, Leu-, a été transformée par 100 pg d'ADN plasmidique de la banque deux hybrides. Cette quantité d'ADN a permis d'obtenir après estimation (voir Matériel et Méthodes) 6 I06cellules transformées, ce qui correspond au nombre de plasmides indépendants que constitue la banque. On peut ainsi estimer que moins de la totalité des plasmides de la banque a servi à transformer les levures. La sélection des cellules transformées, capables de reconstituer un transactivateur GAL4 fonctionnel, a été faite sur un milieu YNB+Lys+Ad.

A l'issue de cette sélection environ 500 clones de phénotype His+ ont été
obtenus. Sur ces transformants un test d'activité (3-galactosidase a été
effectué afin de déterminer le nombre de clones exprimant l'autre gène rapporteur, LacZ. Sur 500 clones obtenus, soixante-trois présentaient le double phénotype His+ et [3GaI+
montrant ainsi 5 qu'ils expriment des protéines pouvant interagir avec la topoisomérase IIIa humaine.
Exemple 3 . isolement des plamides à partir des clones de levure sélectionnés Afin d'identifier les protéines qui interagissent avec la topoisomérase IIIa 10 humaine, les plasmides provenant de la banque deux hybrides des levures sélectionnées lors du criblage double hybride ont été extraits. L'ADN des souches de levures de phénotype His+ et ~3Ga1+ est utilisé pour transformer la souche E. coli HB101.
Les ADN plasmidiques des colonies bactériennes obtenues après transformation par des extraits d'ADN de levures ont été analysés par digestion avec des enzymes de 15 restriction et par séparation des fragments d'ADN sur gel d'agarose. II a été obtenu deux profils de restriction différents sur 15 clones de levure analysés. Un de ces profil était fortement représenté. Ces résultats montrent qu'au moins 2 plasmides différents ont été
isolés lors de ce criblage, le fragment d'ADN provenant de la banque d'ADNc contenu dans le plasmide le plus représenté a été retenu pour la suite de l'étude.
Exemple 4 : détermination de la séquence de l'insert contenu dans le plasmide sélectionné.
Le séquençage a été réalisé sur le plasmide le plus représenté. Le séquençage est effectué à partir de I'oligonucléotide GAL4TA complémentaire de la région à
proximité
du site d'insertion de la banque de cDNA de cellules Hela , à 52 paires de bases du site EcoRI.
La comparaison de la séquence obtenue avec les séquences contenues dans les banques de données GenBank et EMBL (European Molecular Biology Lab) a montré

que la séquence de I'ADNc présent dans le plasmide sélectionné présente 98.2 %
au niveau nucléique avec le gène humain codant pour la protéine Dead Box X
isoform (DBX1) appelée aussi helicase like protéine 2 (DDX14) ayant le numéro d'accession AF000982 et U50553 respectivement. La comparaison de séquence de fADNc présent dans le plasmide sélectionné montre également 98.1 % d'identité avec la protéine DDX 14.
La séquence nucléotidique et polypeptidique de DBX1 est présentée dans la séquence SEQ ID N°5. La séquence du gène cloné par deux hybrides commence au nucléotide 952 par rapport au codon d'initiation supposé, soit au 318 ème acide aminé
et contient une séquence homologue à la séquence codant pour la partie C-terminale de la protéine DBX1 incluant le codon stop.
Ce résultat montre que le domaine d'interaction des protéines ou polypeptides partenaires de la topoisomérase IIia humaine est contenu dans la seconde moitié C-terminale desdits partenaires.
Des différences ont été notées par rapport à la séquence DBX 1 publiée, notamment le codon AGT (en position 1768 par rapport au codon d'initiation, soit en position 2624 sur la séquence SEQ ID N°5) codant pour la sérine 590, est absent dans le fragment cloné.
De même, il a été noté la présence d'un résidu C à la place d'un T en position 2068 de l'ATG.
La séquence du fragment cloné est représentée en SEQ ID N°3.
Exemple 5 : analyse de la spécificité d'interaction entre la topoisomérase IIIa et les polypeptides de l'invention.
La spécificité d'interaction entre la topoisomérase IIIa humaine et le polypeptide selon l'invention a été confirmée dans un test d'interaction deux hybrides en utilisant le plasmide pGBT-TopoIIIa à la place du plasmide pLex-TopoIIIa. Le plasmide pGBT-TopoIIIa comprend le gène codant pour la topoisomérase IIIa humaine fusionné
au domaine le liaison à l'ADN de GAL4.

La souche yCM 17 a été transformée par le plasmide isolé lors du criblage de la banque deux hybrides et par le plasmide pGBT-TopoIIIa. Des contrôles de spécificité
d'interaction ont également été effectués en transformant cette souche par les plasmides de contrôle pGBT-HaRasVa112 ou pGBT-Fe65, à la place du plasmide pGBT-TopoIIIa. Un test d'activité (3-Gal sur les cellules transformées par les différents plasmides a été effectué pour mettre en évidence les interactions protéine-protéine.
Les résultats du test ont montrés que seules les levures transformées par le plasmide isolé lors du criblage de la banque deux hybrides et par le plasmide pGBT-TopoIIIa présentaient une activité (3-Gal+ montrant ainsi une interaction entre la topoisomérase IIIa humaine et la région C-terminale des polypeptides selon l'invention.
Ces résultats montrent également que cette interaction est indépendante de la protéine de fusion utilisée.

LISTE DE SEQUENCES
<110> Rhône-Poulenc Rorer <120> Polypeptides capables d'interagir avec la topoisomérase III alpha humaine <130> polypep. partenaires topo III alpha <140>
<141>
<150> FR9815081 <151> 1998-11-30 <160> 15 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2973 <212> ADN
<213> Homo sapiens <220>
<221> CDS
<22Z> (16)..(2940) <220>
<223> Topoisomerase III alpha <400> 1 ggatccgagc tcgag atg gcc ctc cga ggc gtg cgg aaa gtc ctc tgt gtg 51 Met Ala Leu Arg Gly Val Arg Lys Val Leu Cys Val gcc gaa aaa aac gac gcg gcc aag ggg atc gcc gac ctg ctg tca aac 99 Ala Glu Lys Asn Asp Ala Ala Lys Gly Ile Ala Asp Leu Leu Ser Asn ggt cgc atg agg cgg aga gaa gga ctt tca aaa ttc aac aag atc tat 147 Gly Arg Met Arg Arg Arg Glu Gly Leu Ser Lys Phe Asn Lys Ile Tyr gaa ttt gat tat cat ctg tat ggc cag aat gtt acc atg gta atg act 195 Glu Phe Asp Tyr His Leu Tyr Gly Gln Asn Val Thr Met Val Met Thr tca gtt tct gga cat tta ctg gct cat gat ttc cag atg cag ttt cga 243 Ser Val Ser Gly His Leu Leu Ala His Asp Phe Gln Met Gln Phe Arg aaa tgg cag agc tgc aac cct ctt gtc ctc ttt gaa gca gaa att gaa 291 Lys Trp Gln Ser Cys Asn Pro Leu Val Leu Phe Glu Ala Glu Ile Glu aag tac tgc cca gag aat ttt gta gac atc aag aaa act ttg gaa cga 339 Lys Tyr Cys Pro Glu Asn Phe Val Asp Ile Lys Lys Thr Leu Glu Arg gag act cgc cag tgc cag gct ctg gtg atc tgg act gac tgt gat aga 387 Glu Thr Arg Gln Cys Gln Ala Leu Val Ile Trp Thr Asp Cys Asp Arg gaa ggc gaa aac atc ggg ttt gag att atc cac gtg tgt aag gct gta 435 Glu Gly Glu Asn Ile Gly Phe Glu Ile Ile. His Val Cys Lys Ala Val aagccc aatctgcag gtgttgcgagcc cgattctctgag atcacaccc 483 LysPro AsnLeuGln ValLeuArgAla Ar Ph g e SerGlu IleThrPro catgcc gtcaggaca gcttgtgaaaac ctgaccgagcct gatcagagg 531 HisAla ValArgThr AlaCysGluAsn LeuThrGluPro AspGlnArg gtgagc gatgctgtg gatgtgaggcag gagctggacctg aggattgga 579 ValSer AspAlaVal AspValArgGln GluLeuAspLeu ArgIleGly gctgcc tttactagg ttccagaccctg cggcttcagagg atttttcct 627 AlaAla PheThrArg PheGlnThrLeu ArgLeuGlnArg IlePhePro gag gtg ctg gca gag cag ctc atc agt tac ggc agc tgc cag ttc ccc 675 Glu Val Leu Ala Glu Gln Leu Ile Ser Tyr Gly Ser Cys Gln Phe Pro aca ctg ggc ttt gtg gtg gag cgg ttc aaa gcc att cag gct ttt gta 723 Thr Leu Gly Phe Val Val Glu Arg Phe Lys Ala Ile Gln Ala Phe Val cca gaa atc ttc cac aga att aaa gta act cat gac cac aaa gat ggt 771 Pro Glu Ile Phe His Arg Ile Lys Val Thr His Asp His Lys Asp Gly atc gta gaa ttc aac tgg aaa agg cat cga ctc ttt aac cac acg gct 819 Ile Val Glu Phe Asn Trp Lys Arg His Arg Leu Phe Asn His Thr Ala tgc cta gtt ctc tat cag ttg tgt gtg gag gat ccc atg gca act gtg 867 Cys Leu Val Leu Tyr Gln Leu Cys Val Glu Asp Pro Met Ala Thr Val 270 275 2g0 gta gag gtc aga tct aag ccc aag agc aag tgg cgg cct caa gcc ttg 915 Val Glu Val Arg Ser Lys Pro Lys Ser Lys Trp Arg Pro Gln Ala Leu gac act gtg gag ctt gag aag ctg gct tct cga aag ttg aga ata aat 963 Asp Thr Val Glu Leu Glu Lys Leu Ala Ser Arg Lys Leu Arg Ile Asn gct aaa gaa acc atg agg att gct gag aag ctc tac act caa ggg tac 1011 Ala Lys Glu Thr Met Arg Ile Ala Glu Lys Leu Tyr Thr Gln Gly Tyr atc agc tat ccc cga aca gaa aca aac att ttt ccc aga gac tta aac 1059 Ile Ser Tyr Pro Arg Thr Glu Thr Asn Ile Phe Pro Arg Asp Leu Asn ctg acg gtg ttg gtg gaa cag cag acc ccc gat cca cgc tgg ggg gcc 1107 Leu Thr Val Leu Val Glu Gln Gln Thr Pro Asp Pro Arg Trp Gly Ala ttt gcc cag agc att cta gag cgg ggt ggt ccc acc cca cgc aat ggg 1155 Phe Ala Gln Ser Ile Leu Glu Arg Gly Gly Pro Thr Pro Arg Asn Gly aac aag tct gac caa gct cac cct ccc att cac ccc acc aaa tac acc 1203 Asn Lys Ser Asp Gln Ala His Pro Pro Ile His Pro Thr Lys Tyr Thr aac aac tta cag gga gat gaa cag cga ctg tac gag ttt att gtt cgc 1251 Asn Asn Leu Gln Gly Asp Glu Gln Arg Leu Tyr Glu Phe Ile Val Arg cat ttc ctg gct tgc tgc tcc cag gat gct cag ggg cag gag acc aca 1299 His Phe Leu Ala Cys Cys Ser Gln Asp Ala Gln Gly Gln Glu Thr Thr gtg gag atc gac atc gct cag gaa cgc ttt gtg gcc cat ggc ctc atg 1347 Val Glu Ile Asp Ile Ala Gln Glu Arg Phe Val Ala His Gly Leu Met attctg gcccgaaactat ctggatgtg tatccatat gatcactgg agt 1395 IleLeu AlaArgAsnTyr LeuAspVal TyrProTyr AspHisTrp Ser gacaag atcctccctgtc tatgagcaa ggatcccac tttcagccc agc 1443 AspLys IleLeuProVal TyrGluGln GlySerHis PheGlnPro Ser accgtg gagatggtggac ggggagacc agcccaccc aagctgctc acc 1491 ThrVal GluMetValAsp GlyGluThr SerProPro LysLeuLeu Thr gaggcc gacctcattgcc ctcatggag aagcatggc attggtacg gat 1539 GluAla AspLeuIleAla LeuMetGlu LysHisGly IleGlyThr Asp gccact catgcggagcac atcgagacc atcaaagcc cggatgtac gtg 1587 AlaThr HisAlaGluHis IleGluThr IleLysAla ArgMetTyr Val ggc ctc acc cca gac aag cgg ttc ctc cct ggg cac ctg ggc atg gga 1635 Gly Leu Thr Pro Asp Lys Arg Phe Lev Pro Gly His Leu Gly Met Gly ctt gtg gaa ggt tat gat tcc atg ggc tat gaa atg tct aag cct gac 1683 Leu Val Glu Gly Tyr Asp Ser Met Gly Tyr Glu Met Ser Lys Pro Asp ctc cgg gct gaa ctg gaa gct gat ctg aag ctg atc tgt gat ggc aaa 1731 Leu Arg Ala Glu Leu Glu Ala Asp Leu Lys Leu Ile Cys Asp Gly Lys aag gac aaa ttt gtg gtt cta agg cag caa gtg cag aaa tac aag cag 1779 Lys Asp Lys Phe Val Val Leu Arg Gln Gln Val Gln Lys Tyr Lys Gln gtt ttc att gaa gcg gtg gct aaa gca aag aaa ttg gac gag gcc ttg 1827 Val Phe Ile Glu Ala Val Ala Lys Ala Lys Lys Leu Asp Glu Ala Leu gcc cag tac ttt ggg aat ggg aca gag ttg gcc cag caa gaa gat atc 1875 Ala Gln Tyr Phe Gly Asn Gly Thr Glu Leu Ala Gln Gln Glu Asp Ile tac cca gcc atg cca gag ccc atc agg aag tgc cca cag tgc aac aag 1923 Tyr Pro Ala Met Pro Glu Pro Ile Arg Lys Cys Pro Gln Cys Asn Lys gacatggtc cttaagacc aagaagaatggc gggttctac ctcagctgc 1971 AspMetVal LeuLysThr LysLysAsnGly GlyPheTyr LeuSerCys atgggtttc ccagagtgt cgctcagctgtg tggcttcct gactcggtg 2019 MetGlyPhe ProGluCys ArgSerAlaVal TrpLeuPro AspSerVal ctggaggcc agcagggac agcagtgtgtgt ccagtttgt cagccacac 2067 LeuGluAla SerArgAsp SerSerValCys ProValCys GlnProHis cct gtg tac agg tta aag tta aag ttt aag cgc ggt agc ctt ccc ccg 2115 Pro Val Tyr Arg Leu Lys Leu Lys Phe Lys Arg Gly Ser Leu Pro Pro acc atg cct ctg gag ttt gtt tgc tgc atc ggc gga tgc gac gac acc 2163 Thr Met Pro Leu Glu Phe Val Cys Cys Ile Gly Gly Cys Asp Asp Thr ctg agg gag atc ctg gac ctg aga ttt tca ggg ggc ccc ccc agg gct 2211 Leu Arg Glu Ile Leu Asp Leu Arg Phe Ser Gly Gly Pro Pro Arg Ala agc cag ccc tct ggc cgc ctg cag gct aac cag tcc ctg aac agg atg 2259 Ser Gln Pro Ser Gly Arg Leu Gln Ala Asn Gln Ser Leu Asn Arg Met gac aac agc cag cac ccc cag cct gct gac agc aga cag act ggg tcc 2307 Asp Asn Ser Gln His Pro Gln Pro Ala Asp Ser Arg Gln Thr Gly Ser ~tca aag gct ctg gcc cag acc ctc cca cca ccc acg gct gct ggt gaa 2355 Ser Lys Ala Leu Ala Gln Thr Leu Pro Pro Pro Thr Ala Ala Gly Glu agc aat tct gtg acc tgc aac tgt ggc cag gag gct gtg ctg ctc act 2403 Ser Asn Ser Val Thr Cys Asn Cys Gly Gln Glu Ala Val Leu Leu Thr gtc cgt aag gag ggc ccc aac cgg ggc cgg cag ttc ttt aag tgc aac 2451 Val Arg Lys Glu Gly Pro Asn Arg Gly Arg Gln Phe Phe Lys Cys Asn gga ggt agc tgc aac ttc ttc ctg tgg gca gac agc ccc aat ccg gga 2499 Gly Gly Ser Cys Asn Phe Phe Leu Trp Ala Asp Ser Pro Asn Pro Gly gca gga ggg cct cct gcc ttg gca tat aga ccc ctg ggc gcc tcc ctg 2547 Ala Gly Gly Pro Pro Ala Leu Ala Tyr Arg Pro Leu Gly Ala Ser Leu gga tgc cca cca ggc cca ggg atc cac cta ggt ggg ttt ggc aac cct 2595 Gly Cys Pro Pro Gly Pro Gly Ile His Leu Gly Gly Phe Gly Asn Pro ggt gat ggc agt ggt agt ggc aca tcc tgc ctt tgc agc cag ccc tcc 2643 Gly Asp Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Cys Leu Cys Ser Gln Pro Ser gtc aca cgg act gtg cag aag gat gga ccc aac aag ggg cgc°cag ttc 2691 Val Thr Arg Thr Val Gln Lys Asp Gly Pro Asn Lys Gly Arg Gln Phe cac aca tgt gcc aag ccg aga gag cag cag tgt ggc ttt ttc cag tgg 2739 His Thr Cys Ala Lys Pro Arg Glu Gln Gln Cys Gly Phe Phe Gln Trp gtc gat gag aac acc gct cca ggg act tct gga gcc ccg tcc tgg aca 2787 Val Asp Glu Asn Thr Ala Pro Gly Thr Ser Gly Ala Pro Ser Trp Thr gga gac aga gga aga acc ctg gag tcg gaa gcc aga agc aaa agg ccc 2835 Gly Asp Arg Gly Arg Thr Leu Glu Ser Glu Ala Arg Ser Lys Arg Pro cgg gcc agt tcc tca gac atg ggg tcc aca gca aag aaa ccc cgg aaa 2883 Arg Ala Ser Ser Ser Asp Met Gly Ser Thr Ala Lys Lys Pro Arg Lys tgc agc ctt tgc cac cag cct gga cac acc cgt ccc ttt tgt cct cag 2931 Cys Ser Leu Cys His Gln Pro Gly His Thr Arg Pro Phe Cys Pro Gln aac aga tga gctcagggta gggtagagaa gcttggagtc gac 2973 Asn Arg <210> 2 <211> 974 <212> PRT
<213> Homo sapiens <223> Topoisomerase III alpha <400> 2 Met Ala Leu Arg Gly Val Arg Lys Val Leu Cys Val Ala Glu Lys Asn Asp Ala Ala Lys Gly Ile Ala Asp Leu Leu Ser Asn Gly Arg Met Arg Arg Arg Glu Gly Leu Ser Lys Phe Asn Lys Ile Tyr Glu Phe Asp Tyr His Leu Tyr Gly Gln Asn Val Thr Met Val Met Thr Ser Val Ser Gly His Leu Leu Ala His Asp Phe Gln Met Gln Phe Arg Lys Trp Gln Ser Cys Asn Pro Leu Val Leu Phe Glu Ala Glu Ile Glu Lys Tyr Cys Pro Glu Asn Phe Val Asp Ile Lys Lys Thr Leu Glu Arg Glu Thr Arg Gln Cys Gln Ala Leu Val Ile Trp Thr Asp Cys Asp Arg Glu Gly Glu Asn Ile Gly Phe Glu Ile Ile His Val Cys Lys Ala Val Lys Pro Asn Leu Gln Val Leu Arg Ala Arg Phe Ser Glu Ile Thr Pro His Ala Val Arg Thr Ala Cys Glu Asn Leu Thr Glu Pro Asp Gln Arg Val Ser Asp Ala Val Asp Val Arg Gln Glu Leu Asp Leu Arg Ile Gly Ala Ala Phe Thr Arg Phe Gln Thr Leu Arg Leu Gln Arg Ile Phe Pro Glu Val Leu Ala Glu Gln Leu Ile Ser Tyr Gly Ser Cys Gln Phe Pro Thr Leu Gly Phe Val Val Glu Arg Phe Lys Ala Ile Gln Ala Phe Val Pro Glu Ile Phe His Arg Ile Lys Val Thr His Asp His Lys Asp Gly Ile Val Glu Phe Asn Trp Lys Arg His Arg Leu Phe Asn His Thr Ala Cys Leu Val Leu Tyr Gln Leu Cys Val Glu Asp Pro Met Ala Thr Val Val Glu Val Arg Ser Lys Pro Lys Ser Lys Trp Arg Pro Gln Ala Leu Asp Thr Val Glu Leu Glu Lys Leu Ala Ser Arg Lys Leu Arg Ile Asn Ala Lys Glu Thr Met Arg Ile Ala Glu Lys Leu Tyr Thr Gln Gly Tyr Ile Ser Tyr Pro Arg Thr Glu Thr Asn Ile Phe Pro Arg Asp Leu Asn Leu Thr Val Leu Val Glu Gln Gln Thr Pro Asp Pro Arg Trp Gly Ala Phe Ala Gln Ser Ile Leu Glu Arg Gly Gly Pro Thr Pro Arg Asn Gly Asn Lys Ser Asp Gln Ala His Pro Pro Ile His Pro Thr Lys Tyr Thr Asn Asn Leu Gln Gly Asp GIu Gln Arg Leu Tyr GIu Phe Ile Val Arg His Phe Leu Ala Cys Cys Ser Gln Asp Ala Gln Gly Gln Glu Thr Thr Val Glu Ile Asp Ile Ala Gln Glu Arg Phe Val Ala His Gly Leu Met Ile Leu Ala Arg Asn Tyr Leu Asp Val Tyr Pro Tyr Asp His Trp Ser Asp Lys Ile Leu Pro Val Tyr Glu Gln Gly Ser His Phe Gln Pro Ser Thr Val Glu Met Val Asp Gly Glu Thr Ser Pro Pro Lys Leu Leu Thr Glu Ala Asp Leu Ile Ala Leu Met Glu Lys His Gly Ile Gly Thr Asp Ala Thr His Ala Glu His Ile Glu Thr Ile Lys Ala Arg Met Tyr Val Gly Leu Thr Pro Asp Lys Arg Phe Leu Pro Gly His Leu Gly Met Gly Leu Val Glu Gly Tyr Asp Ser Met Gly Tyr Glu Met Ser Lys Pro Asp Leu Arg Ala Glu Leu Glu Ala Asp Leu Lys Leu Ile Cys Asp Gly Lys Lys Asp Lys Phe Val Val Leu Arg Gln Gln Val Gln Lys Tyr Lys Gln Val Phe Ile Glu Ala Val Ala Lys Ala Lys Lys Leu Asp Glu Ala Leu Ala Gln Tyr Phe Gly Asn Gly Thr Glu Leu Ala Gln Gln Glu Asp Ile Tyr Pro Ala Met Pro Glu Pro Ile Arg Lys Cys Pro Gln Cys Asn Lys Asp Met Val Leu Lys Thr Lys Lys Asn Gly Gly Phe Tyr Leu Ser Cys Met Gly Phe Pro Glu Cys Arg Ser Ala Val Trp Leu Pro Asp Ser Val Leu Glu Ala Ser Arg Asp Ser Ser Val Cys Pro Val Cys Gln Pro His Pro Val Tyr Arg Lev Lys Leu Lys Phe Lys Arg Gly Ser Leu Pro Pro Thr Met Pro Leu Glu Phe Val Cys Cys Ile Gly Gly Cys Asp Asp Thr Leu Arg Glu Ile Leu Asp Leu Arg Phe Ser Gly Gly Pro Pro Arg Ala Ser Gln Pro Ser Gly Arg Leu Gln Ala Asn Gln Ser Leu Asn Arg Met Asp Asn Ser Gln His Pro Gln Pro Ala Asp Ser Arg Gln Thr Gly Ser Ser Lys Ala Leu Ala Gln Thr Leu Pro Pro Pro Thr Ala Ala Gly Glu Ser Asn Ser Val Thr Cys Asn Cys Gly Gln Glu Ala Val Leu Leu Thr Val Arg Lys Glu Gly Pro Asn Arg Gly Arg Gln Phe Phe Lys Cys Asn Gly Gly Ser Cys Asn Phe Phe Leu Trp Ala Asp Ser Pro Asn Pro Gly Ala Gly Gly Pro Pro Ala Leu Ala Tyr Arg Pro Leu Gly Ala Ser Leu Gly Cys Pro Pro Gly Pro Gly Ile His Leu Gly Gly Phe Gly Asn Pro Gly Asp Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Cys Leu Cys Ser Gln Pro Ser Val Thr Arg Thr Val Gln Lys Asp Gly Pro Asn Lys Gly Arg Gln Phe His Thr Cys Ala Lys Pro Arg Glu Gln Gln Cys Gly Phe Phe Gln Trp Val Asp Glu Asn Thr Ala Pro Gly Thr Ser Gly Ala Pro Ser Trp Thr Gly Asp Arg Gly Arg Thr Leu Glu Ser Glu Ala Arg Ser Lys Arg Pro Arg Ala Ser Ser Ser Asp Met Gly Ser Thr Ala Lys Lys Pro Arg Lys Cys Ser Leu Cys His Gln Pro Gly His Thr Arg Pro Phe Cys Pro Gln Asn Arg <210> 3 <211> 1233 <212> ADN
<213> Homo sapiens <220>
<221> CDS

<222> (1)..(1035) <400> 3 cat ttg tta gta gcc act cca gga cgt cta gtg gat atg atg gaa aga 48 His Leu Leu Val Ala Thr Pro Gly Arg Leu Val Asp Met Met Glu Arg gga aag att gga tta gac ttt tgc aaa tac ttg gtg tta gat gaa gct 96 Gly Lys Ile Gly Leu Asp Phe Cys Lys Tyr Leu Val Leu Asp Glu Ala gat cgg atg ttg gat atg ggg ttt gag cct cag att cgt aga ata gtc 144 Asp Arg Met Leu Asp Met Gly Phe Glu Pro Gln Ile Arg Arg Ile Val gaa caa gat act atg cct cca aag ggt gtc cgc cac act atg atg ttt 192 Glu Gln Asp Thr Met Pro Pro Lys Gly Val Arg His Thr Met Met Phe agt gct act ttt cct aag gaa ata cag atg ctg gct cgt gat ttc tta 240 Ser Ala Thr Phe Pro Lys Glu Ile Gln Met Leu Ala Arg Asp Phe Leu gat gaa tat atc ttc ttg gct gta gga aga gtt ggc tct acc tct gaa 288 Asp Glu Tyr Ile Phe Leu Ala Val Gly Arg Val Gly Ser Thr Ser Glu aac atc aca cag aaa gta gtt tgg gtg gaa gaa tca gac aaa cgg tca 336 Asn Ile Thr Gln Lys Val Val Trp Val Glu Glu Ser Asp Lys Arg Ser ttt ctg ctt gac ctc cta aat gca aca ggc aag gat tca ctg acc tta 384 Phe Leu Leu Asp Leu Leu Asn Ala Thr Gly Lys Asp Ser Leu Thr Leu gtg ttt gtg gag acc aaa aag ggt gca gat tct ctg gag gat ttc tta 432 Val Phe Val Glu Thr Lys Lys Gly Ala Asp Ser Leu Glu Asp Phe Leu tac cat gaa gga tac gca tgt acc agc atc cat gga gac cgt tct cag 480 Tyr His Glu Gly Tyr Ala Cys Thr Ser Ile His Gly Asp Arg Ser Gln agg gat aga gaa gag gcc ctt cac cag ttc cgc tca gga aaa agc cca 528 Arg Asp Arg Glu Glu Ala Leu His Gln Phe Arg Ser Gly Lys Ser Pro att tta gtg gct aca gca gta gca gca aga gga ctg gac att tca aat 576 IleLeu ValAlaThr AlaValAla AlaArg GlyLeuAsp IleSerAsn gtgaaa catgttatc aatttt gac ttgcca agtgatatt gaagaatat 624 ValLys HisValIle AsnPheAsp LeuPro SerAspIle GluGluTyr gtacat cgtattggt cgtacggga cgtgta ggaaacctt ggcctggca 672 ValHis ArgIleGly ArgThrGly ArgVal GlyAsnLeu GlyLeuAla acc tca ttc ttt aac gag agg aac ata aat att act aag gat ttg ttg 720 Thr Ser Phe Phe Asn Glu Arg Asn Ile Asn Ile Thr Lys Asp Leu Leu gat ctt ctt gtt gaa gct aaa caa gaa gtg ccg tct tgg tta gaa aac 768 Asp Leu Leu Val Glu Ala Lys Gln Glu Val Pro Ser Trp Leu Glu Asn atg gct tat gaa cac cac tac aag ggt agc agt cgt gga cgt tct aag 816 Met Ala Tyr Glu His His Tyr Lys Gly Ser Ser Arg Gly Arg Ser Lys agc aga ttt agt gga ggg ttt ggt gcc aga gac tac cga caa agt agc 864 Ser Arg Phe Ser Gly Gly Phe Gly Ala Arg Asp Tyr Arg Gln Ser Ser ggt gcc agc agt tcc agc ttc agc agc agc cgc gca agc agc agc cgc 912 Gly Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Ser Arg Ala Ser Ser Ser Arg agt ggc gga ggt ggc cac ggt agc agc aga gga ttt ggt gga ggt ggc 960 Ser Gly Gly Gly Gly His Gly Ser Ser Arg Gly Phe Gly Gly Gly Gly tat gga ggc ttt tac aac agt gat gga tat gga gga aat tat aac tcc 1008 Tyr Gly Gly Phe Tyr Asn Ser Asp Gly Tyr Gly Gly Asn Tyr Asn Ser cag ggg gtt gac tgg tgg ggt aac tga gcctgctttg cagtaggtca 1055 Gln Gly Val Asp Trp Trp Gly Asn ccctgccaaa caagctaata tggaaaccac atgtaactta gccagactat accttgtgta 1115 gcttcaagaa ctcgcagtac attaccagct gtgattctcc actgaaattt tttttttaag 1175 ggagctcaag gtcacaagaa gaaatgaaag gaacaatcag cagccctgtt cagaagga 1233 <210> 4 <211> 344 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 4 His Leu Leu Val Ala Thr Pro Gly Arg Leu Val Asp Met Met Glu Arg Gly Lys Ile Gly Leu Asp Phe Cys Lys Tyr Leu Val Leu Asp Glu Ala Asp Arg Met Leu Asp Met Gly Phe Glu Pro Gln Ile Arg Arg Ile Val Glu Gln Asp Thr Met Pro Pro Lys Gly Val Arg His Thr Met Met Phe 50 55 60 .
Ser Ala Thr Phe Pro Lys Glu Ile Gln Met Leu Ala Arg Asp Phe Leu Asp Glu Tyr Ile Phe Leu Ala Val Gly Arg Val Gly Ser Thr Ser Glu Asn ile Thr GIn Lys Val Val Trp Val Glu Glu Ser Asp Lys Arg Ser Phe Leu Leu Asp Leu Leu Asn Ala Thr Gly Lys Asp Ser Leu Thr Leu Val Phe Val Glu Thr Lys Lys Gly Ala Asp Ser Leu Glu Asp Phe Leu Tyr His Glu Gly Tyr Ala Cys Thr Ser Ile His Gly Asp Arg Ser Gln Arg Asp Arg Glu Glu Ala Leu His Gln Phe Arg Ser Gly Lys Ser Pro Ile Leu Val Ala Thr Ala Val Ala Ala Arg Gly Leu Asp Ile Ser Asn Val Lys His Val Ile Asn Phe Asp Leu Pro Ser Asp Ile Glu Glu Tyr Val His Arg Ile Gly Arg Thr Gly Arg Va1 Gly Asn Leu Gly Leu Ala WO 00/32768 PCT/FR99l02952 Thr Ser Phe Phe Asn Glu Arg Asn Ile Asn Ile Thr Lys Asp Leu Leu Asp Leu Leu Val Glu Ala Lys Gln Glu Val Pro Ser Trp Leu Glu Asn Met Ala Tyr Glu His His Tyr Lys Gly Ser Ser Arg Gly Arg Ser Lys Ser Arg Phe Ser Gly Gly Phe Gly Ala Arg Asp Tyr Arg Gln Ser Ser Gly Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Ser Arg Ala Ser Ser Ser Arg Ser Gly Gly Gly Gly His Gly Ser Ser Arg Gly Phe Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Phe Tyr Asn Ser Asp Gly Tyr Gly Gly Asn Tyr Asn Ser Gln Gly Val Asp Trp Trp Gly Asn <210> 5 <211> 5321 <212> ADN
<213> Homo sapiens <220>
<221> CDS
<222> (856)..(2844) <400> 5 tttCCCCttd CtCCCJCtCCC CtCttttCCC tCCCtCtCCt CCCCttCCCt CtgttCtCtC 60 ctcctcttcc cctcccctcc cccgtccggg gcactctata ttcaagccac cgtttcctgc 120 ttcacaaaat ggccaccgca cgcgacacct acggtcacgt ggcctgccgc cctctcagtt 180 tcgggaatct gcctagctcc cactaagggg aggctacccg cggaagagcg agggcagatt 240 agaccggaga aatcccacca catctccaag cccgggaact gagagaggaa gaagagtgaa 300 WO 00/32768 PC1'/FR99/02952 ggccagtgtt aggaaaaaaa aaaacaaaaa caaaaaaaac gaaaaacgaa agctgagtgc 360 atagagttgg aaaggggagc gaatgcgtaa ggttggaaag gggggcgaag aggcctaggt 420 taacattttc aggcgtctta gccggtggaa agcgggagac gcaagttctc gcgagatctc 480 gagaactccg aggctgagac tagggtttta gcggagagca cgggaagtgt agctcgagag 540 aactgggaca gcatttcgca ccctaagctc caaggcagga ctgctagggg cgacaggact 600 aagtaggaaa tcccttgagc ttagacctga gggagcgcgc agtagccggg cagaagtcgc 660 cgcgacaggg aattgcggtg tgagagggag ggcacacgtt gtacgtgctg acgtagccgg 720 ctttccagcg ggtatattag atccgtggcc gcgcggtgcg ctccagagcc gcagttctcc 780 cgtgagaggg ccttcgcggt ggaacaaaca ctcgcttagc agcggaagac tccgagttct 840 cggtactctt caggg atg agt cat gtg gca gtg gaa aat gcg ctc ggg ctg 891 Met Ser His Val Ala Val Glu Asn Ala Leu Gly Leu gac cag cag ttt gct ggc cta gac ctg aac tct tca gat aat cag agt 939 Asp Gln Gln Phe Ala Gly Leu Asp Leu Asn Ser Ser Asp Asn Gln Ser gga gga agt aca gcc agc aaa ggg cgc tat att cct cct cat tta agg 987 Gly Gly Ser Thr Ala Ser Lys Gly Arg Tyr Ile Pro Pro His Leu Arg aac cga gaa gct act aga ggt ttc tac gat aaa gac agt tca ggg tgg 1035 Asn Arg Glu Ala Thr Arg Gly Phe Tyr Asp Lys Asp Ser Ser Gly Trp agt tct agc aaa gat aag gat gcg tat agc agt ttt gga tct cgt agt 1083 Ser Ser Ser Lys Asp Lys Asp Ala Tyr Ser Ser Phe Gly Ser Arg Ser gat tca aga ggg aag tct agc ttc ttc agt gat cgt gga agt gga tca 1131 Asp Ser Arg Gly Lys Ser Ser Phe Phe 5er Asp Arg Gly Ser Gly Ser agg gga agg ttt gat gat cgt gga cgg agt gat tac gat ggc att ggc 1179 Arg Gly Arg Phe Asp Asp Arg Gly Arg Ser Asp Tyr Asp Gly Ile Gly agc cgt ggt gac aga agt ggc ttt ggc aaa ttt gaa cgt ggt gga aac 1227 Ser Arg Gly Asp Arg Ser Gly Phe Gly Lys Phe Glu Arg Gly Gly Asn agtcgctggtgt gacaaatca gatgaagatgat tggtcaaaa ccactc 1275 SerArgTrpCys AspLysSer AspGluAspAsp TrpSerLys ProLeu ccaccaagtgaa cgcttggaa caggaactcttt tctggaggc aacact 1323 ProProSerGlu ArgLeuGlu GlnGluLeuPhe SerGlyGly AsnThr gggattaatttt gagaaatac gatgacattcca gttgaggca acaggc 1371 GlyIleAsnPhe GluLysTyr AspAspIlePro ValGluAla ThrGly aacaactgtcct ccacatatt gaaagtttcagt gatgttgag atggga 1419 AsnAsnCysPro ProHisIle GluSerPheSer AspValGlu MetGly gaaattatcatg ggaaacatt gagcttactcgt tatactcgc ccaact 1467 GluIleIleMet GlyAsnIle GluLeuThrArg TyrThrArg ProThr cca gtg caa aag cat gct att cct att atc aaa gag aaa aga gac ttg 1515 Pro Val Gln Lys His Ala Ile Pro Ile Ile Lys Glu Lys Arg Asp Leu atg gct tgt gcc caa aca ggg tct gga aaa act gca gca ttt ctg ttg 1563 Met Ala Cys Ala Gln Thr Gly Ser Gly Lys Thr Ala Ala Phe Leu Leu ccc atc ttg agt cag att tat tca gat ggt cca ggc gag gct ttg agg 1611 Pro Ile Leu Ser Gln Ile Tyr Ser Asp Gly Pro Gly Glu Ala Leu Arg gcc atg aag gaa aat gga agg tat ggg cgc cgc aaa caa tac cca atc 1659 Ala Met Lys Glu Asn Gly Arg Tyr Gly Arg Arg Lys Gln Tyr Pro Ile tcc ttg gta tta gca cca acg aga gag ttg gca gta cag atc tac gaa 1707 Ser Leu Val Leu Ala Pro Thr Arg Glu Leu Ala Val Gln Ile Tyr Glu gaa gcc aga aaa ttt tca tac cga tct aga gtt cgt cct tgc gtg gtt 1755 Glu Ala Arg Lys Phe Ser Tyr Arg Ser Arg Vai Arg Pro Cys Val Val tat ggt ggt gcc gat att ggt cag cag att cga gac ttg gaa cgt gga 1803 Tyr Gly Gly Ala Asp Ile Gly Gln Gln Ile Arg Asp Leu Glu Arg Gly tgc cat ttg tta gta gcc act cca gga cgt cta gtg gat atg atg gaa 1851 Cys His Leu Leu Val Ala Thr Pro Gly Arg Leu Val Asp Met Met Glu aga gga aag att gga tta gac ttt tgc aaa tac ttg gtg tta gat gaa 1899 Arg Gly Lys Ile Gly Leu Asp Phe Cys Lys Tyr Leu Val Leu Asp Glu gct gat cgg atg ttg gat atg ggg ttt gag cct cag att cgt aga ata 1947 Ala Asp Arg Met Leu Asp Met Gly Phe Glu Pro Gln Ile Arg Arg Ile gtc gaa caa gat act atg cct cca aag ggt gtc cgc cac act atg atg 1995 Val Glu Gln Asp Thr Met Pro Pro Lys Gly Val Arg His Thr Met Met ttt agt gct act ttt cct aag gaa ata cag atg ctg gct cgt gat ttc 2043 Phe Ser Ala Thr Phe Pro Lys Glu Ile Gln Met Leu Ala Arg Asp Phe tta gat gaa tat atc ttc ttg gct gta gga aga gtt ggc tct acc tct 2091 Leu Asp Glu Tyr Ile Phe Leu Ala Val Gly Arg Val Gly Ser Thr Ser gaa aac atc aca cag aaa gta gtt tgg gtg gaa gaa tca gac aaa cgg 2139 Glu Asn Ile Thr Gln Lys Val Val Trp Val Glu Glu Ser Asp Lys Arg tca ttt ctg ctt gac ctc cta aat gca aca ggc aag gat tca ctg acc 2187 Ser Phe Leu Leu Asp Leu Leu Asn Ala Thr Gly Lys Asp Ser Leu Thr tta gtg ttt gtg gag acc aaa aag ggt gca gat tct ctg gag gat ttc 2235 Leu Val Phe Val Glu Thr Lys Lys Gly Ala Asp Ser Leu Glu Asp Phe tta tac cat gaa gga tac gca tgt acc agc atc cat gga gac cgt tct 2283 Leu Tyr His Glu Gly Tyr Ala Cys Thr Ser Ile His Gly Asp Arg Ser cag agg gat aga gaa gag gcc ctt cac cag ttc cgc tca gga aaa agc 2331 Gln Arg Asp Arg Glu Glu Ala Leu His Gln Phe Arg Ser Gly Lys Ser cca att tta gtg gct aca gca gta gca gca aga gga ctg gac att tca 2379 Pro Ile Leu Val Ala Thr Ala Val Ala Ala Arg Gly Leu Asp Ile Ser aat gtg aaa cat gtt atc aat ttt gac ttg cca agt gat att gaa gaa 2427 Asn Val Lys His Val Ile Asn Phe Asp Leu Pro Ser Asp Ile Glu Glu tat gta cat cgt att ggt cgt acg gga cgt gta gga aac ctt ggc ctg 2475 Tyr Val His Arg Ile Gly Arg Thr Gly Arg Val Gly Asn Leu Gly Leu gca acc tca ttc ttt aac gag agg aac ata aat att act aag gat ttg 2523 Ala Thr Ser Phe Phe Asn Glu Arg Asn Ile Asn Ile Thr Lys Asp Leu ttg gat ctt ctt gtt gaa gct aaa caa gaa gtg ccg tct tgg tta gaa 2571 Leu Asp Leu Leu Val Glu Ala Lys Gln Glu Val Pro Ser Trp Leu Glu aac atg gct tat gaa cac cac tac aag ggt agc agt cgt gga cgt tct 2619 Asn Met Ala Tyr Glu His His Tyr Lys Gly Ser Ser Arg Gly Arg Ser aag agt agc aga ttt agt gga ggg ttt ggt gcc aga gac tac cga caa 2667 Lys Ser Ser Arg Phe Ser Gly Gly Phe Gly Ala Arg Asp Tyr Arg Gln agt agc ggt gcc agc agt tcc agc ttc agc agc agc cgc gca agc agc 2715 Ser Ser Gly Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Ser Arg Ala Ser Ser agc cgc agt ggc gga ggt ggc cac ggt agc agc aga gga ttt ggt gga 2763 Ser Arg Ser Gly Gly Gly Gly His Gly Ser Ser Arg Gly Phe Gly Gly ggt ggc tat gga ggc ttt tac aac agt gat gga tat gga gga aat tat 2811 Gly Gly Tyr Gly Gly Phe Tyr Asn Ser Asp Gly Tyr Gly Gly Asn Tyr aac tcc cag ggg gtt gac tgg tgg ggt aac tga gcctgctttg cagtaggtca 2864 Asn Ser Gln Gly Val Asp Trp Trp Gly Asn ccctgccaaa caagctaata tggaaaccac atgtaactta gccagactat accttgtgta 2924 gtttcaagaa ctcgcagtac attaccagct gtgattctcc actgaaattt tttttttaag 2984 ggagctcaag gtcacaagaa gaaatgaaag gaacaatcag cagccctgtt cagaaggtgg 3044 tttgaagact tcattgctgt agtttggatt aactcccctc ccgcctaccc ccatcccaaa 3104 ctgcatttat aattttgtga ctgaggatca tttgtttgtt aatgtactgt gcctttaact 3164 atagacaact ttttattttg atgtcctgtt ggctcagtaa tgctcaagat atcaattgtt 3224 ttgacaaaat aaatttactg aacttgggct aaaatcaaac cttggcacac aggtgtgata 3284 caacttaaca ggaatcatcg attcatccat aaataatata aggaaaaact tatgcggtag 3344 cctgcattag ggctttttga tacttgcaga ttgggggaaa acaacaaatg tcttgaagca 3404 tattaatgga attagtttct aatgtggcaa actgtattaa gttaaagttc tgatttgctc 3464 actctatcct ggataggtat ttagaacctg atagtcttta agccattcca gtcatgatga 3524 ggtgatgtat gaatacatgc atacattcaa agcactgttt tcaaagttaa tgcaagtaaa 3584 tacagcaatt cctctttcaa cgtttaggca gatcattaat tatgagctag ccaaatgtgg 3644 gcatactatt acagggaaag tttaaaggtc tgataacttg aaaataggtt tttaggagaa 3704 ttcatctact tagacttttt aagtgcctgc cataaatgaa attgaaatgg tagaatggct 3764 gaccacagca atgaccagcc ctcattaggg ccctggatga tttttggtct aataacgcat 3824 gctagtgttg atgttttttg gtcagagggt atgaacagga agaattaaat gcagcaggct 3884 ttattttaaa tgccgattca cattactctg ttcaagctgc gttgagatgt taaactggct 3944 tactatagac ttcgtaaaaa tggctccaga aaagtaacaa actgaaatct ttgagatcac 4004 acaggttgga aatatgtaca taactgcaca aggtgtcaat tctgctctac agtgcagttt 4064 tagtcagttt tagttgcata ggtttccatt gtatttatag tctgtttatg ctaaatctgg 4124 ccaaagatga acattgtcca ccactaaaat gcctctgcca ctttgaattc tgtgctaatt 4184 ttgtggccag aatgcggtga tcaaaacgct ccatcttttt acagtggcat aggaagacgg 4244 caaaaatttc ctaaagtgca atagattttc aagtgtattg tgccttgttc taaaactttt 4304 attaagtagg tgcacttgac agtattgagg tcatttgtta tggtgctatt tcaattagtc 4364 taggtttagg cccttgtaca ttttgcccat aactttttac aaagtacttc ttttattgca 4424 cattcagaga attttatata tatgtcttgt gtgcgtgtcc ttaaacttcc aatcttactt 4484 tgtctcttgg agattgttga acgcagcttg tctaggaagg ggatgggact agattctaaa 4544 atttatttgg gaccatggga atgatagttg ggaagaaaac tatttgcaca cgacagattt 4604 ctagatactt tttgctgcta gctttatgta atatttattg aacattttga caaatattta 4664 tttttgtaag cctaaaagtg attctttgaa agtttaaaga aacttgacca aaagacagta 4724 caaaaacact ggcacttgaa tgttgaatgt caccgtatgc gtgaaattat atatttcggg 4784 gtagtgtgag cttttaatgt ttaagtcata ttaaactctt aagtcaaatt aagcagaccc 4844 ggcgttggca gtgtagccat aactttctga tgttagtaaa aacaaaattg gcgacttgaa 4904 attaaattat gccaaggttt tgatacactt gtcttaagat attaatgaaa cacttcaaaa 4964 cactgatgtg aagtgtccag attctcagat gtttgttgtg tggattttgt ttagttgtgt 5024 gttttttttt ttttcagtga atgtctggca cattgcaatc ctcaaacatg tggttatctt 5084 tgttgtattg gcataatcag tgacttgtac attcagcaat agcatttgag caagttttat 5144 cagcaagcaa tattttcagt taataaggtt tcaaaaatca tgtaaggatt taaacttgct 5204 gaatgtaaag attgaacctc aagtcactgt agctttagta attgcttatt gtattagttt 5264 agatgctagc actgcatgtg ctgtgcatat tctgatttta ttaaaataaa aaaaaaa 5321 <210> 6 <211> 662 <212> PRT

<213> Homosapiens <900> 6 Met Ser ValAla ValGluAsn AlaLeuGlyLeu AspGlnGlnPhe His 5 10 15 Ala Gly AspLeu AsnSerSer AspAsnGlnSer GlyGlySerThr Leu Ala Ser GlyArg TyrIlePro ProHisLeuArg AsnArgGluAla Lys 40 45 Thr Arg PheTyr AspLysAsp SerSerGlyTrp SerSerSerLys Gly 55 60 Asp Lys AlaTyr SerSerPhe GlySerArgSer AspSerArgGly Asp Lys Ser Phe PheSerAsp ArgGlySer GlySerArgGly ArgPhe Ser Asp Asp Gly ArgSerAsp TyrAspGly IleGlySerArg GlyAsp Arg Arg Ser Phe GlyLysPhe GluArgGly GlyAsnSerArg TrpCys Gly Asp Lys Asp GluAspAsp TrpSerLys ProLeuProPro SerGlu Ser Arg Leu Glu Gln Glu Leu Phe Ser Gly Gly Asn Thr Gly Ile Asn Phe Glu Lys Tyr Asp Asp Ile Pro Val Glu Ala Thr Gly Asn Asn Cys Pro Pro His Ile Glu Ser Phe Ser Asp Val Glu Met Gly Glu Ile Ile Met Gly Asn Ile Glu Leu Thr Arg Tyr Thr Arg Pro Thr Pro VaI Gln Lys His Ala Ile Pro Ile Ile Lys Glu Lys Arg Asp Leu Met Ala Cys Ala Gln Thr Gly Ser Gly Lys Thr Ala Ala Phe Leu Leu Pro Ile Leu Ser Gln Ile Tyr Ser Asp Gly Pro Gly Glu Ala Leu Arg Ala Met Lys Glu Asn Gly Arg Tyr Gly Arg Arg Lys Gln Tyr Pro Ile Ser Leu Val Leu Ala Pro Thr Arg Glu Leu Ala Val Gln Ile Tyr Glu Glu Ala Arg Lys Phe Ser Tyr Arg Ser Arg Val Arg Pro Cys Val Val Tyr Gly Gly Ala Asp Ile Gly Gln Gln Ile Arg Asp Leu Glu Arg Gly Cys His Leu Leu Val Ala Thr Pro Gly Arg Leu Val Asp Met Met Glu Arg Gly Lys Ile Gly Leu PheCys Lys Leu ValLeuAsp AlaAspArg Asp Tyr Glu Met Leu Asp GlyPhe Glu Gln IleArgArg ValGluGln Met Pro Ile Asp Thr Met ProLys Gly Arg HisThrMet PheSerAla Pro Val Met Thr PhePro Lys Glu Ile Met Leu Ala Arg Phe Leu Asp Glu 385Gln Asp Tyr IlePhe Leu Ala Val Arg Val Gly Ser Ser Glu Asn Ile Gly Thr Thr Gln Val Arg Lys Trp Ser Val Val Phe Glu Leu Glu Leu Ser Asp Lys Asp LeuLeuAsn LysAsp Ser Thr Ala Leu Leu Thr Val Gly Phe Val Glu ThrLysLysGly Asp SerLeu Glu PheLeuTyr His Ala Asp Glu Gly TyrAIaCysThr Ile HisGly Asp SerGlnArg Asp Ser Arg Arg Glu GluAlaLeuHis Phe ArgSer Gly SerProIle Leu Gln Lys Val Ala ThrAlaValAla Arg GlyLeu Asp SerAsnVai Lys Ala Ile His Val IleAsnPheAsp Pro SerAsp Ile GluTyrVal His Leu Glu Arg Ile GlyArgThrGly Val GlyAsn Leu LeuAlaThr Ser Arg Gly Phe Phe AsnGlu Asn Asn IleThr Lys LeuLeuAsp Leu Arg Ile Asp Leu Val GluAla Gln Val ProSer Trp AsnMet Ala Lys Glu Leu Glu Tyr Glu His Lys Ser LysSer Ser His Tyr Gly Ser Arg Arg Gly Arg Ser WO 00/32?68 PCT/FR99/02952 Phe Ser Gly Gly Phe Gly Ala Arg Asp Tyr Arg Gln Ser Ser Gly Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Ser Arg Ala Ser Ser Ser Arg Ser Gly Gly Gly Gly His Gly Ser Ser Arg Gly Phe Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Phe Tyr Asn Ser Asp Gly Tyr Gly Gly Asn Tyr Asn Ser Gln Gly Val Asp Trp Trp Gly Asn <210> 7 <211> 29 <272> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la sëquence artificielle:
oligonucléotide pGBT9(+2) <400> 7 tcgccggaat tgaattcccg gggatccgt <210> 8 <211> 24 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide pGBT9 <400> 8 tcgccggaat tcccggggat ccgt <210> 9 <211> 20 <212> ADN

WO 00/32768 PC'T/FR99/02952 <213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide 124 <400> 9 cgaggtctga ggatgatctt <210> 10 <211> 20 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
oligonucléotide 125 <400> 10 ctgagaaagt ggcgttctct <210> 11 <211> 26 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
Oligonucléotide Top3XhoI
<400> 11 aagttactcg agatggccct ccgagg 26 <210> 12 <211> 27 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
Oligonucléotide Top3Hind3 <400> 12 acgagcaagc ttctctaccc taccctg <210> 13 <211> 38 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:Oligonucléotide PCS1 <400> 13 aattgcgaat tctcgagccc ggggatccgt cgactgca 38 <210> 14 <211> 30 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
Oligonucléotide PCS2 <400> 14 gtcgcaggat ccccgggctc gagaattcgc 30 <210> 15 <211> 18 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
Oligonucléotide GALT4 <400> 15 ccactacaat ggatgatg 18

Claims (16)

REVENDICATIONS

1. Séquence nucléotidique codant pour un polypeptide capable d'interagir avec la topoisomérase III.alpha..

2. Séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence polypeptidique SEQ
ID N° 4 ou de ses dérivées.

3. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID
N°3 ou de ses dérivées.

4. Polypeptide caractérisé en ce qu'il est capable d'interagir avec la topoisomérase III.alpha..

5. Polypeptide selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence polypeptidique SEQ ID N°4 ou d'une séquence dérivée de celle-ci.

6. Polypeptide selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il est constitué
de la séquence polypeptidique correspondant aux résidus 318-662 de la séquence SEQ
ID
N°5 ou d'une séquence dérivée de celle-ci.

7. Utilisation d'un polypeptide ou d'un fragment de polypeptide selon les revendications 4 à 6, pour un ralentissement, une inhibition, une stimulation ou une modulation de l'activité de la topoisomérase III.alpha..

8. Anticorps ou fragment d'anticorps dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 4 à 6.

9. Procédé de mise en évidence ou d'identification de composés capables de se lier avec un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes:
a - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 4 à 6 dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle-ci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et, b - on détecte et/ou isole les molécules liées avec ledit polypeptide.

10. Procédé de mise en évidence ou d'identification de composés capables de moduler ou d'inhiber l'interaction entre la topoisomérase III -.alpha. et un polypeptide tel que défini selon les revendications 4 à 6, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes:
a - on réalise la liaison de la topoisomérase IIIa ou d'un fragment de celle-ci avec ledit polypeptide ;
b - on ajoute un composé à tester pour sa capacité à inhiber la liaison entre la topoisomérase IIIa et ledit polypeptide ;
c - on détermine le déplacement ou l'inhibition de la liaison de la topoisomérase IIIa avec ledit polypeptide ;
d - on détecte et/ou isole les composés qui empêchent ou qui gênent la liaison entre la topoisomérase IIIa et ledit polypeptide.

11. Ligand d'un polypeptide tel que défini selon les revendications 4 à 6, susceptible d'être obtenu selon le procédé de la revendication 9.

12. Ligand capable de moduler ou d'inhiber l'interaction entre la topoisomérase III.alpha. et un polypeptide tel que défini selon les revendications 4 à 6, susceptible d'être obtenu selon le procédé de la revendication 10.

13. Utilisation d'un ligand selon la revendication 11 ou 12 pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention, à l'amélioration ou au traitement des maladies impliquant un dysfonctionnement du cycle cellulaire.

14. Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins ligand selon l'une des revendications 11 ou 12 ou un anticorps selon la revendication 8.

15. Composition selon la revendication 14 destinée à moduler ralentir ou inhiber l'activité de topoisomérase III.alpha..

16. Composition selon l'une des revendications 14 ou 15 destinée à la prévention, à l'amélioration ou au traitement des maladies impliquant un dysfonctionnement du cycle cellulaire.