FR2786501A1 - PROTEINE PARTENAIRE DE LA TOPOISOMERASE IIIa HUMAINE - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne de nouveaux polypeptides capables d'interagir avec la topoisomérase IIIalpha humaine et les séquences d'acides nucléiques codant pour ces polypeptides. Elle concerne en outre une méthode d'identification de composés capables d'interagir avec lesdits polypeptides ainsi qu'une méthode pour identifier des molécules capables de moduler l'interaction de la topoisomérase IIIalpha avec lesdits polypeptides.

Description

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La présente invention concerne de nouveaux polypeptides capables d'interagir avec la topoisomérase IIIa humaine et les séquences d'acides nucléiques codant pour ces polypeptides. Elle concerne en outre une méthode d'identification de composés capables d'interagir avec lesdits polypeptides ainsi qu'une méthode pour identifier des molécules capables de moduler l'interaction de la topoisomérase fila avec lesdits polypeptides.

La réplication du DNA est un mécanisme complexe qui fait intervenir un grand nombre de facteurs. Le DNA se présente à l'état physiologique sous une forme super enroulée et l'accès à l'information qu'il contient requiert une modification importante du taux d'enroulement. La réplication nécessite la suppression des supertours, la séparation des deux brins de la double hélice d'ADN et le maintien de l'ADN sous forme simple brin.

La modification du taux d'enroulement est assurée in vivo par les topoisomérases qui sont des enzymes capables de modifier les superstructures du DNA. On distingue les topoisomérases de type 1 qui ne coupent que l'un de deux brins du DNA et qui suppriment les supertours et les topoisomérases de type II qui agissent en coupant les deux brins du DNA et qui sont capables de supprimer ou bien encore de créer les supertours. Les topoisomérases des eucaryotes sont moins bien connues que leurs homologues procaryotes et à ce jour, leur mécanisme d'action n'est pas encore élucidé.

La séparation des deux brins d'un duplex d'ADN est catalysée par un groupe d'enzymes, appelées DNA hélicases. qui agissent de façon ATP-dépendantes afin de produire l'ADN simple-brin utilisé comme matrice pour les processus de réplication et de transcription de l'ADN. Généralement, les hélicases se fixent à l'ADN simple-brin ou aux jonctions entre de l'ADN simple et double-brin, et se déplacent dans une seule direction le long de l'ADN dans la région double-brin, détruisant les liaisons hydrogènes joignant les deux brins. Toutes les hélicases présentent une activité ATPase (ou NTPase) dépendante de l'ADN qui hydrolyse le phosphate gamma du ribonucleoside ou deoxyribonucleoside 5'-triphosphate et fournit l'énergie nécessaire à la réaction. La première hélicase fut découverte chez E. coli en 1976. Depuis, plus de 60 hélicases ont été isolées chez les procaryotes et les eucaryotes. Le rôle des hélicases humaines reste encore non élucidé dans la plupart des cas, à l'exception de HDHII

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(réparation des lésions induites par les rayons X), HDHIV (assemblage des préribosomes). ERCC2 et ERCC3, impliquées dans la réparation par excision et la viabilité cellulaire. On connaît peu de choses sur la structure de ces hélicases. Une grande partie de l'information disponible sur les structures et les fonctions des hélicases a été obtenue par analyse comparative des séquences en acides aminés. En particulier, des motifs conservés ont permis de regrouper les hélicases en sous-familles. en se basant sur les homologies de séquences.

La Topoisomérase III humaine appartient à la famille des topoisomérases de type IA, et présente donc des homologies de séquence avec les topoisomérases 1 et III de E. coli, la Topoisomérase III de levure ainsi que la réverse gyrase des archéobactéries. La Topoisomérase III humaine est maintenant appelée Topoisomérase IIIa, afin de la différencier de la topoisomérase IIIss humaine, découverte récemment lors du séquençage du locus du gène de l'immunoglobulin # humaine (Kawasaki. K., Minoshima, S., Nakato, E., Shibuya, K., Shintani, A., Schmeits, J.L., Wang, J. and Shimizu, N. 1997, Genome Research 7: 250-261). et pour laquelle aucune activité fonctionnelle n'a été montrée. La topoisomérase IIIa exprimée dans la levure et non purifiée présente une activité de relaxation partielle d'un ADN très surenroulé négativement (Hanai, R., Caron, P. R. and Wang, J.C. 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3653-3657).

La Topoisomérase IIIa est une protéine de 976 acides aminés et de poids moléculaire d'environ 110 kDa. Le gène codant pour la Topoisomérase IIIa humaine est présent en une seule copie sur le chromosome 17p 11.2-12 (Hanai, R., Caron, P.R. and Wang, J.C. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3653-3657). Un homologue murin de la Topoisomérase III a été cloné récemment (Seki, T., Deki, M., Katada. T. and Enomoto, T. 1998. Biochim Biophys Acta 1396: 127-131).

La Topoisomérase IIIa présente une forte homologie de séquence avec la Topoisomérase III de levure, à savoir 44% d'identité de séquence et 61% de similarité. L'homologie qu'elle présente avec les topoisomérases I et III bactériennes est moins forte, à savoir 24% d'identité et 44% de similarité. Cependant, la Topoisomérase IIIa ressemble plus à la Topoisomérase I de E. coli qu'aux autres membres du groupe des topoisomérases de type IA du point de vue de l'organisation de la protéine en domaines. En effet, ces deux polypeptides contiennent un domaine C-terminal sans équivalent chez

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la Topoisomérase III de E. coli ou de levure. Ce domaine C-terminal contient des motifs à 4 cystéines (3 motifs pour la Topoisomérase 1 de E. coli et 1. 5 motif pour la Topoisomérase IIIa humaine), ainsi qu'un domaine C-terminal extrême pour lequel il a été démontré, pour la Topoisomérase 1 de E. coli, un rôle de fixation à l'ADN.

Le rôle de la topoisomérase IIIa humaine dans la cellule n'a pas encore été identifié.

La Topoisomérase IIIa humaine semble être indispensable. au moins au cours de l'embryogenèse, puisque le knock-out de l'homologue murin de la Topoisomérase III[alpha] est létal (Li, W. and Wang, J.C. 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1010-1013). Les ARN messagers de la Topoisomérase IIIa sont présents dans de nombreux tissus (coeur. cerveau, placenta, poumon, foie, muscle squelettique, rein, pancréas) sous la forme de trois transcrits de tailles 7. 2, 6 et 4 kilobases (Fritz, E., Elsea, S.H., Patel, P.I. and Meyn, M.S. 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4538-4542).

D'autre part, il a été supposé que la Topoisomérase IIIa joue un rôle dans le maintien de la stabilité du génome. En effet, le cDNA CAT4.5, codant pour une Topoisomérase IIIa humaine tronquée de 141 acides aminés N-terminaux, est capable de complémenter le phénotype d'hypersensibilité aux rayonnements ionisants des cellules AT (Ataxie-Télangectasie) présentant une mutation dans le gène ATM (Fritz, E., Elsea, S.H., Patel, P.I. and Meyn, M. S. 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. LISA 94 : 4538- 4542).

Chez la levure, deux études indépendantes ont montré l'existence d'une interaction entre l'hélicase SGS1et la Topoisomérase III de levure. D'une part, les mutants sgsl- sont des suppresseurs du phénotype top3- (croissance lente, hyperrecombinaison) chez la levure S. cerevisiae (Gangloff, S., McDonald, J.P., Bendixen, C., Arthur, L. and Rothstein, R. 1994. Mol. Cell. Biol. 14 : 8391- 8398). D'autre part, il a été montré que les 500 premiers acides aminés de SGS11 interagissent avec la Topoisomérase III de levure (Gangloff, S., McDonald, J.P., Bendixen, C., Arthur, L. and Rothstein, R. 1994. Mol. Cell. Biol. 14 : 8391- 8398, Lu, J., Mullen, J.R., Brill. S.J., Kleff, S., Romeo, A. M. and Stemglanz, R. 1996. Nature 383 : Cependant, à ce jour, aucune interaction entre une hélicase et la Topoisomérase III[alpha] humaine n'a été identifiée.

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L'identification de partenaires de la topoisomérase III[alpha] humaine constitue donc un enjeu majeur pour la compréhension du rôle de la topoisomérase IIIa humaine, et de son mécanisme d'action.

La présente invention résulte de la mise en évidence de nouveaux polypeptides capables d'interagir avec la topoisomérase IIIa (ci-après nommés polypeptides partenaires de la topoisomérase IIIa). Elle résulte également de la découverte que ces polypeptides montrent une forte homologie avec des protéines qui présentent des caractéristiques de structure communes aux RNA hélicases et pour lesquelles aucune fonction n'avait été décrite jusqu'alors. La mise en évidence de cette interaction et de ces homologies. désignent ces protéines comme DNA hélicases partenaires de la topoisomérase IIIa. L'identification de ces partenaires permet d'envisager de nombreuses applications basées sur l'action combinée de ces protéines partenaires et de la topoisomérase III[alpha] ; ces applications concernent notamment :
1) La destruction de la structure nucléosomale : afin de procéder à certains processus tels que la réplication, la transcription, la réparation ou encore la recombinaison, l'ADN doit être accessible aux machineries enzymatiques correspondantes, et pour ce faire, la structure nucléosomale doit être détruite de façon transitoire. Il est ainsi envisageable que l'hélicase sépare localement les brins d'ADN et crée des supertours positifs devant elle et des supertours négatifs derrière elle. La torsion positive est absorbée par la disruption des nucléosomes, tandis que la torsion négative est relâchée sélectivement par la topoisomérase de type IA.

2) Le surenroulement positif de l'ADN : l'interaction entre l'hélicase et la topoisomérase de type IA est susceptible de reconstituer dans un organisme eucaryote, l'activité réverse gyrase des archéobactéries thermophiles. En effet, il a été montré que la réverse gyrase de Sulfolobus acidocaldarius possède en N-terminal un domaine hélicase, contenant les 8 motifs des hélicases à motif DEAD , et en C-terminal un domaine topoisomérase homologue aux topoisomérases de type IA (Confalonieri, F., Edie, C., Nadal, M., Bouthier de la Tour, C., Forterre, P. and Duguet, M. 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4753-4757); cette enzyme relâche l'ADN supertorsadé négativement et introduit des supertours positifs dans l'ADN circulaire de façon ATPdépendante {Forterre, P., Mirambeau, G., Jaxel, C., Nadal, M. and Duguet, M. 1985. EMBO J. 4: 2123-2128 ). Cette activité réverse gyrase eucaryote peut servir à éliminer

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des structures particulières d'ADN, telles que l'ADN cruciforme. l'ADN Z, les mésappariements, les intermédiaires de recombinaison etc. A partir de ces observations et de la mise en évidence que la topoisomérase IIIa est capable d'interagir avec une protéine possédant les propriétés d'une DNA hélicase, on peut envisager la réalisation in vivo ou in vitro d'un complexe topoisomérase III[alpha] ; protéine partenaire constituant un complexe enzymatique ayant les fonctions de type reverse gyrase. Il est à noter, qu'une telle fonction de surenroulement positif de l'ADN n'a encore jamais été décrite chez les eucaryotes.

3) La ségrégation des chromosomes nouvellement répliqués : à la fin de la réplication de l'ADN, des problèmes topologiques apparaissent au niveau du point de convergence de deux fourches de réplication. Un mécanisme qui permet de résoudre ce problème topologique implique l'action concertée d'une hélicase et d'une topoisomérase de type IA, capable de décaténer deux molécules d'ADN simple-brin. Ce modèle (Wang, J.C. 1991. J. Biol. Chem. 266: 6659-6662 ; Rothstein. R. and Gangloff, S. 1995. Genome Research 5: 421-426) propose qu'au point de rencontre des deux fourches de réplication, la réplication est stoppée, laissant des portions d'ADN simplebrin entremêlés. Ceux-ci sont séparés grâce à l'action concertée de l'hélicase et de la topoisomérase. La synthèse d'ADN est alors complétée au niveau des régions simplebrin.

4) La recombinaison et la stabilité du génome : il a été montré que des mutants de levure Top3- ou des mutants Sgsl- présentent tous deux un phénotype d'hyperrecombinaison, tandis que les doubles mutants Top3-''Sgsl- récupèrent un phénotype normal. Ceci montre que la Topoisomérase III de levure et l'hélicase SGS1 agissent probablement de concert pour maintenir un faible taux de recombinaison par exemple par une activité de surenroulement positif de type réverse gyrase, ou par un mécanisme plus direct au niveau des appariements des intermédiaires de recombinaison.

A la différence de l'hélicase SGS 1, connue pour interagir avec la topoisomérase III de levure, la protéine partenaire de la topoisomérase IIIa mise en évidence par la demanderesse n'appartient pas à la famille des hélicases de type RecQ.

Les polypeptides selon l'invention montrent un fort degré d'homologie avec la séquence d'une protéine humaine DDX14 publiée par Chung et al (Chung, J., Lee, S-G.,

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and Song. K. 1995. Korean J. Biochem. 27 : 193-197). La protéine DDX14 présente une homologie de séquence significative avec une ARN hélicase d'origine murine, cependant l'activité hélicase de cette protéine n'a pas encore été démontrée et la fonction de DDX14 n'a pas encore été élucidée.

Les polypeptides selon l'invention montrent également un fort degré d'homologie avec la séquence d'une protéine humaine DBX1publiée par Lahn et al (Lahn. T. and Page. D. C. 1997. Science. 278 : La protéine DBX1 code pour une protéine qui présente des homologies avec des ARN hélicases mais son activité hélicase n'ajamais été démontrée et la fonction de la protéine DBX1n'a pas encore été identifiée.

La protéine DBX code pour une protéine de 662 acides aminés. Le gène correspondant est situé sur le chromosome sexuel X et son homologue situé sur le chromosome Y est identique à 91% au niveau protéique. Les séquences nucléiques et polypeptidiques de DBX1 sont présentées dans la SEQ ID N 3. L'expression du gène DBX semble ubiquitaire. Il a maintenant été mis en évidence que la protéine DBX possède les 8 motifs caractéristiques des hélicases de la famille DEAD . Plus précisément, elle appartient à la sous-famille représentée par l'hélicase PL 10. et dont les membres répertoriés sont les hélicases DEDIet DBP de la levure, l'hélicase An3des amphibiens et les hélicases murines PL 10. mDEAD2 et mDEAD3 (Gee. S. L. and Conboy, J.G. 1994. Gene 140 : 171-177). Les hélicases appartenant à cette sous-famille contiennent en plus du domaine catalytique central contenant les 8 motifs conservés des hélicases, des domaines N et C terminaux particuliers. Le domaine C-tenninal est riche en arginines et sérines, ce qui rappelle les domaines des facteurs d'épissage. Cependant, dans le cas des hélicases de cette sous-famille, ce domaine riche en arginines et sérines est plus court et ne possède pas autant de dipeptides RS que dans le domaine prototype des facteurs d'épissage.

L'invention fournit également un procédé d'identification de molécules capables de bloquer l'interaction entre la Topoisomérase III[alpha] humaine et la protéine partenaire de la topoisomérase III[alpha]. Un tel procédé permet d'identifier des molécules susceptibles notamment de bloquer l'activité de type réverse gyrase de ces deux protéines. De telles molécules sont utiles pour moduler les processus de division, de réplication, de transcription, de traduction, d'épissage. de réparation ou de recombinaison de l'ADN. Ces molécules sont également susceptibles de posséder une activité antitumorale, de

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type cytotoxique, du fait de la perturbation de ces processus fondamentaux au niveau de l'ADN.

Un premier objet de l'invention concerne donc des séquences nucléotidiques codant pour des polypeptides capables d'interagir avec la topoisomérase III[alpha].

Préférentiellement les séquences nucléotidiques selon l'invention codent pour un polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence polypeptidique décrite en SEQ ID N 2 ou ses dérivées.

Au sens de la présente invention, le terme séquence polypeptidique dérivée désigne toute séquence polypeptidique différant de la séquence considérée, obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique, et possédant la capacité d'interagir avec la topoisomérase III[alpha]. Par modification de nature génétique et'ou chimique, on entend toute mutation. substitution. délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'améliorer ses niveaux de production. celui d'augmenter sa résistance à des protéases ou d'améliorer son passage à travers les membranes cellulaires, celui d'augmenter son efficacité thérapeutique ou de réduire ses effets secondaires, celui d'augmenter l'affinité du peptide pour son site d'interaction, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques. Avantageusement, les variants comprennent des délétions ou des mutations portant sur des acides aminés dont la présence n'est pas déterminante à l'activité du dérivé. De tels acides aminés peuvent être identifiés par exemple par des tests d'activité cellulaire comme décrit dans les exemples.

De préférence encore, les séquences nucléotidiques selon l'invention comprennent tout ou partie de la séquence nucléotidique décrite dans la SEQ ID N 2 ou de ses dérivées.

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Au sens de la présente invention, le terme séquence nucléotidique dérivée désigne toute séquence différant de la séquence considérée en raison de la dégérescence du code génétique, obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et'ou chimique, ainsi que toute séquence hybridant avec ces séquences ou des fragments de celles-ci et codant pour un polypeptide capable d'interagir avec la Topoisomérase IIIa.

Par modification de nature génétique et/ou chimique, on entend toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. Le terme dérivé comprend également les séquences homologues à la séquence considérée, issues d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes. De telles séquences homologues peuvent être obtenues par des expériences d'hybridation. Les hybridations peuvent être réalisées à partir de banque d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde, la séquence native ou un fragment de celle-ci, dans des conditions variables d'hybridation.

Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN. de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces séquences peuvent être obtenues par exemple par criblage de banques d'ADN (banque d'ADNc. banque d'ADN génomique) au moyen de sondes élaborées sur la base de séquences présentées ci-avant. De telles banques peuvent être préparées à partir de cellules de différentes origines par des techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier. Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. D'une manière générale les acides nucléiques de l'invention peuvent être préparés selon toute technique connue de l'homme du métier.

La présente invention a également pour objet des polypeptides capables d'interagir avec la topoisomérase III[alpha].

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Au sens de la présente invention la dénomination topoisomérase IIIa couvre la topoisomérase III[alpha] humaine en elle même ainsi que les formes homologues correspondant notamment à des formes mutées de cette protéine.

De préférence, les polypeptides selon l'invention comprennent tout ou partie de la séquence polypeptidique décrite dans la SEQ ID N 2 ou de ses dérivées.

La présente invention vise également un polypeptide caractérisé en ce qu'il s'agit d'un fragment de la protéine DBX1, capable d'interagir avec la topoisomérase III[alpha] et comprenant tout ou partie fragment polypeptidique qui s'étend entre les résiddus 318- 662 et représenté dans la séquence polypeptidique SEQ ID N 3 ou ses dérivées.

La présente invention a également pour objet l'utilisation des polypeptides selon l'invention ou de fragments de ces polypeptides, pour un ralentissement, une inhibition. une stimulation ou une modulation de l'activité de la topoisomérase III[alpha].

En effet, il est envisageable de réguler le fonctionnement de la topoisomérase IIIa par le biais des polypeptides selon l'invention ou de leurs fragments et notamment d'inhiber ou de ralentir l'activité de la topoisomérase III[alpha]. Cette modification de l'activité de la topoisomérase III[alpha] est susceptible de conduire à un ralentissement de la croissance cellulaire ou un blocage du cycle cellulaire ou d'induire l'apoptose.

Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de préparation des polypeptides selon l'invention selon lequel on cultive une cellule contenant une séquence nucléotidique codant pour lesdits polypeptides. dans des conditions d'expression de ladite séquence et on récupère le polypeptide produit. Dans ce cas, la partie codant pour ledit polypeptide est généralement placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. Le choix de ces signaux (promoteurs, terminateurs, séquence leader de sécrétion, etc. ) peut varier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. Par ailleurs, les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent faire partie d'un vecteur qui peut être à réplication autonome ou intégratif. Plus particulièrement, des vecteurs à réplication autonome peuvent être préparés en utilisant

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des séquences à réplication autonome chez l'hôte choisi. S'agissant de vecteurs intégratifs, ceux-ci peuvent être préparés, par exemple, en utilisant des séquences homologues à certaines régions du génome de l'hôte. permettant, par recombinaison homologue, l'intégration du vecteur.

La présente invention a également pour objet des cellules hôtes transformées avec un acide nucléique comportant une séquence nucléotidique selon l'invention. Les hôtes cellulaires utilisables pour la production des peptides de l'invention par voie recombinante sont aussi bien des hôtes eucaryotes que procaryotes. Parmi les hôtes eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomvces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules d'insecte Sf9, les cellules COS, CHO, C127, de neuroblastomes humains etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme hôtes procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes E.coli, Bacillus, ou Streptomyces.

Selon un mode préféré, les cellules hôtes sont avantageusement représentées par des souches de levures recombinantes.

Préférentiellement, les cellules hôtes comprennent au moins une séquence ou un fragment de séquence choisis parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N 2 ou SEQ ID N 3, pour la production des polypeptides selon l'invention.

Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être incorporées dans des vecteurs viraux ou non viraux, permettant leur administration in vitro, in vivo ou ex vivo.

Un autre objet de l'invention concerne en outre tout vecteur comprenant une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'invention. Le vecteur de l'invention peut être par exemple un plasmide, un cosmide ou tout ADN non encapsidé par un virus, un phage, un chromosome artificiel, un virus recombinant etc. Il s'agit de préférence d'un plasmide ou d'un virus recombinant.

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A titre de vecteurs viraux conformes à l'invention on peut tout particulièrement citer les vecteurs de type adénovirus, rétrovirus, virus adéno-associés. virus de l'herpès ou virus de la vaccine. La présente demande a également pour objet des virus recombinants défectifs comprenant une séquence nucléique hétérologue codant pour un polypeptide selon l'invention.

Un autre objet de l'invention réside dans des anticorps ou fragment d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un polypeptide tel que défini ci-avant. De tels anticorps peuvent être générés par des méthodes connues de l'homme du métier. En particulier ces anticorps peuvent être préparés par immunisation d'un animal contre un polypeptide dont la séquence est choisie parmi les séquences SEQ ID N 2 ou SEQ ID N 3 ou tout fragment ou dérivé de celles-ci, puis prélèvement du sang et isolement des anticorps. Ces anticorps peuvent également être générés par préparation d'hybridomes selon les techniques connues de l'homme de l'art. Les anticorps ou fragment d'anticorps selon l'invention peuvent notamment être utilisés pour inhiber et ou révéler l'interaction entre la topoisomérase III[alpha] et les polypeptides tels que définis ci-avant.

Un autre objet de la présente invention concerne un procédé d'identification de composés capables de se lier aux polypeptides selon l'invention. La mise en évidence et: ou l'isolement de ces composés ou ligands, peut-être réalisée selon les étapes suivantes : - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec un polypeptide de l'invention dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle-ci posséderait une affinité pour ledit polypeptide. et.

- on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide de l'invention.

Selon un mode particulier, un tel procédé permet d'identifier des molécules capables de bloquer l'activité de type hélicase, et en particulier l'activité DNA hélicase de la protéine DBX ou des polypeptides selon l'invention et de moduler ainsi les processus de division, de réplication, de transcription de l'ADN. Ces molécules sont

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susceptibles de posséder une activité antitumorale, de type cytotoxique, du fait de la perturbation de ces processus fondamentaux au niveau de l'ADN.

A cet égard, un autre objet de l'invention concerne des composés ou ligands capables de se lier aux polypeptides selon l'invention et susceptibles d'être obtenu selon le procédé défini ci-avant.

Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un composé ou d'un ligand identifié et/ou obtenu selon le procédé décrit ci-avant comme médicament. De tels composés sont en effet susceptibles d'être utilisés pour la prévention, l'amélioration ou le traitement de certaines affections impliquant un dysfonctionnement du cycle cellulaire.

L'invention a encore pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un ligand obtenu selon le procédé décrit ci-avant.

Un autre objet de la présente invention concerne un procédé d'identification de composés capables de moduler ou d'inhiber totalement ou partiellement l'interaction entre la topoisomérase IIIa et les polypeptides selon l'invention ou la protéine DBX1.

La mise en évidence et/ou l'isolement de modulateurs ou de ligands capables de moduler ou d'inhiber totalement ou partiellement l'interaction entre la topoisomérase Illa et les polypeptides selon l'invention ou la protéine DBX1, peut-être réalisée selon les étapes suivantes : - on réalise la liaison de la topoisomérase III[alpha] ou d'un fragment de celle-ci à un polypeptide selon l'invention ; - on ajoute un composé à tester pour sa capacité à inhiber la liaison entre la topoisomérase III[alpha] et les polypeptides selon l'invention ; - on détermine si la topoisomérase IIIa ou les polypeptides selon l'invention sont déplacés de la liaison ou empêchés de se lier ;

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- on détecte et ou isole les les composés qui empêchent ou qui gênent la liaison entre la topoisomérase III[alpha] et les polypeptides selon l'invention.

Dans un mode particulier, ce procédé de l'invention est adapté à la mise en évidence et, ou l'isolement d'agonistes et d'antagonistes de l'interaction entre la topoisomérase III[alpha] et les polypeptides de l'invention. Toujours selon un mode particulier, l'invention fournit un procédé d'identification de molécules capables de bloquer l'interaction entre la Topoisomérase III[alpha] humaine et l'hélicase DBX1.

Un tel procédé permet d'identifier des molécules susceptibles de bloquer l'activité de type réverse gyrase de ces deux protéines et ainsi moduler les processus de division, de réplication, de transcription, de traduction. d'épissage, de réparation ou de recombinaison de l'ADN. Ces molécules sont susceptibles de posséder une activité antitumorale, de type cytotoxique, du fait de la perturbation de ces processus fondamentaux au niveau de l'ADN.

A cet égard, un autre objet de l'invention concerne des composés ou ligands capables d'interférer au niveau de l'interaction entre la topoisomérase III[alpha] et les polypeptides selon l'invention ou la protéine DBX1et susceptibles d'être obtenu selon le procédé défini ci-avant.

L'invention concerne également l'utilisation d'un composé ou d'un ligand identifié et/ou obtenu selon le procédé décrit ci-avant comme médicament. De tels composés sont en effet susceptibles d'être utilisés pour la prévention, l'amélioration ou le traitement de certaines affections impliquant un dysfonctionnement du cycle cellulaire.

L'invention a encore pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un ligand obtenu selon le procédé décrit ci-avant.

D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent et qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.

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LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : Cette figure reprend le début et la fin de la séquence SEQ ID N 1 pour présenter l'introduction des sites BamHI et Sa!! en 5' et 3' de la séquence codante de la topoisomérase IIIa et la position des sites Xhol et HindIII.

MATERIEL ET METHODES
1 ) Techniques générales de biologie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extractions de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli. etc... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds). "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons. New York. 1987].

Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol,'chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur.

Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase 1 d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les

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recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S 1.

La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham.

L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Polymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant.

La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463- 5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.

2) Les souches de levures utilisées sont :

La souche yCM17 du genre S. cerevisiae (I.ATa, ura3-52. lTiss-?0, adc2-101, lys2-801. trpl-901, leir?-3,11?, cali l', gal4-542, gaI80-53S. CR.-t3:: G.-1 L l,10-lacZ- URA3)a été utilisée comme outil de criblage de la banque de fusion de cellules Hela par le système deux hybrides.

La souche L40 du genre S.cerevisiae (:LI~-ITa, his3D20, trpl-901, lecs?-3,112, ade2, L YS2:: (le.rAop)4-HIS.3, URA 3:(le..-op)8-LacZ, GAL4) a été utilisée pour vérifier les interactions protéine-protéine quand l'un des partenaires protéiques est fusionné à la protéine LexA. Cette dernière est capable de reconnaître l'élément de réponse LexA contrôlant l'expression des gènes rapporteurs LacZ et His3.

Elles ont été cultivées sur les milieux de culture suivants :
Milieu YPD complet : Extrait de levures (10g/l) (Difco), Bactopeptone (20g/l) (Difco), Glucose (20g/l) (Merck). Ce milieu a été rendu solide par addition de 20g/l d'agar (Difco).

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Milieu YNB minimum : Yeast Nitrogen Base (sans acides aminés) (6,7g/l) (Difco), Glucose (20g 1) (Merck). Ce milieu peut être rendu solide par addition de 20g 1 d'agar (Difco). Ce milieu est complémenté avec les acides aminés ou les bases azotées (50mg,'ml) nécessaires pour assurer la croissance des levures auxotrophes. De ampicilline (100 g ml) est ajoutée au milieu afin d'éviter les contaminations bactériennes.

3) Les souches de bactéries utilisées sont :
La souche TG1 d'Escherichia coli de génotype supE, hsdA5, thi, A(lac-proAB).

F'[tra D36 pro A+B+ lacIq lacZ#M15] a été utilisée pour la construction des plasmides pLex-TopoIIIa et pGBT-TopoIIIa.

La souche HB101 d'Escherichia coli de génotype supE44, aral4, galK2, lacYL A(gpt-proA)62, rpsL20(Strr), xyl-5, recA13, #(mcrC-mrr), HsdS-(r-m-) a été employée comme moyen d'amplification et d'isolement de plasmides provenant de la banque d'ADNc de cellules Hela.

La souche TG1a été cultivée sur Milieu LB : NaCl (5g/l) (Difco), Bactotryptone (10g/l) (Difco), Extrait de levure (5g/l) (Difco). Ce milieu peut être rendu solide par addition de 20g/l d'agar (Difco). L'ampicilline a été utilisée à 100 g/ml pour la sélection des bactéries ayant reçu les plasmides portant comme marqueur le gène de résistance à cet antibiotique.

La souche HB101 a été cultivée sur Milieu M9: Na2HP04 (7g'1) (Sigma), KH2P04 (3g/l) (Sigma), NH4C1 (lg/I) (Sigma), NaCI (0,5g/l) (Sigma), Glucose (20g/l) (Sigma), MgS04 (lmm) (Sigma), Thiamine (0,001%). Ce milieu est rendu solide par addition de 15g/l d'agar (Difco).

De la leucine (50mg/l) (Sigma) et de la proline (50mg/l) (Sigma) sont ajoutées au milieu M9 pour permettre la croissance de la souche HB101. Lors de la sélection de plasmides provenant de la banque deux hybrides d'ADNc de cellules Hela, la leucine n'a pas été ajoutée au milieu car les plasmides portent un marqueur de sélection Leu2.

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3) Les plasmides utilisés sont :
Vecteur pGBT9 (+2) : ce plasmide dérive du plasmide pGBT9 (Clontech). Il présente un décalage du cadre de lecture de +2, en amont du site EcoR 1. dans la zone correspondant au multisites de clonage. La différence de séquence entre pGBT9 (+2) et pGBT9. en amont du site EcoRI (souligné), est représentée en gras ci-dessous : pGBT9 (+2): TCG CCG GAA TTG AAT TCC CGG GGA TCC GT pGBT9 : TCG CCG GAA TTC CCG GGG ATC CGT
Le vecteur pGBT9 (+2) est un plasmide navette de 5,4 kb qui possède une origine réplication bactérienne et de levure lui permettant de se répliquer à haut nombre de copies chez ces deux micro-organismes. Ce plasmide contient un site multiple de clonage situé en aval de la séquence codant pour le domaine de liaison à l'ADN de GAL4 et en amont d'un terminateur pour former une protéine de fusion. Il contient également le gène TRP 1 de S. cerevisiae qui permet de complémenter les le\ ures de génotype trp1 afin de les sélectionner sur un milieu minimum ne contenant pas de tryptophane. Ce vecteur porte le gène de résistance à l'ampicilline qui permet de sélectionner les bactéries sur un milieu contenant de l'ampicilline. pGBT-HaRasVall2 : plasmide dérivé de pGBT9 et comprenant la séquence codant pour la protéine HaRas mutée en position Val12connue pour interagir avec la protéine Raf de mammifère. Ce plasmide a été utilisé pour tester la spécificité d'interaction de la protéine selon l'invention avec la topoisomérase IIIa humaine.

PGBT-Fe65 : plasmide dérivé de pGBT9 et comprenant une partie de la séquence codant pour la protéine Fe65 connue pour interagir avec la région cytoplamique de l'APP (Précurseur du Peptide Amyloïde). Ce plasmide a été utilisé comme contrôle pour vérifier la spécificité d'interaction de la protéine selon l'invention avec la topoisomérase IIIa humaine.

Le vecteur pGAD GH : fourni par Clontech et qui permet l'expression chez la levure de protéines de fusion entre le domaine transactivateur de GAL4 et une protéine codée par l'ADNc provenant d'une banque de cellules Hela, inséré au niveau des sites EcoRI et Xhol.

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Le vecteur pLex9 (pBTM 16) (Bartel et al D. A Hartley Ed, Oxford University press page 153) de 5kb homologue au pGBTIO qui contient un site multiple de clonage situé en aval de la séquence codant pour le répresseur bactérien LexA et en amont d'un terminateur pour former une protéine de fusion.

4 ) les oligonucléotides de synthèse employés sont : oligonucléotide 124 : CGAGGTCTGAGGATGATCTT oligonucléotide 125 : CTGAGAAAGTGGCGTTCTCT
Ce couple d'oligonucléotides a servi à amplifier par PCR. à partir d'une banque d'ADNc de cellules Hela, un fragment correspondant à la séquence codant pour la topoisomérase fila humaine. oligonucléotide Top3Xhol :AAGTTACTCGAGATGGCCCTCCGAGG oligonucléotide Top3Hind3 : ACGAGCAAGCTTCTCTACCCTACCCTG
Le couple d'oligonucléotidesTop3Xhol et Top3Hind3 a permis d'introduire respecti\ement les sites Xhol et HindIII lors d'une deuxième étape de PCR sur le fragment correspondant à la topoisoméraseIIIa préalablement amplifiée grâce aux oligonucléotides 124 et 125. oligonucléotide PCS 1
AATTGCGAATTCTCGAGCCCGGGGATCCGTCGACTGCA oligonucléotide PCS2 :
GTCGCAGGATCCCCGGGCTCGAGAATTCGC
Le couple d'oligonucléotides PCS1 et PCS2 a permis d'introduire dans le plasmide pLex9 un site Xhol en phase avec la séquence codante de la topoisomérasellla humaine. L'insert comportant le gène codant pour la topoisomérase IIIa a donc été recloné dans ce vecteur entre les sites Xhol en 5' et Sal I en 3'. oligonucléotide GAL4TA :

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CCACTACAATGGATGATG
Cet oligonucléotide a été utilisé pour séquencer les inserts contenus dans les plasmides de la banque deux hybrides d'ADNc de cellule Hela.

Les oligonucléotides sont synthétisés sur l'appareil Applied System ABI 394- 08. Ils sont décrochés de la matrice de synthèse par de l'ammoniac et précipités deux fois par 10 volumes de n-butanol puis repris dans de l'eau. La quantification est effectuée par mesure de la densité optique (lunité DO correspond à 30 ug/ml).

5) Transformation des bactéries TG1
La totalité du volume de ligation (10 l) est utilisée pour transformer les bactéries TG1 rendues compétentes par la méthode de Chung et col, ( PNAS,1988 86, 2172-2175).

Les bactéries TG1 sont mises en culture dans un milieu LB liquide pendant quelques heures dans une étuve à agitation à 37 C, jusqu'à obtenir une DO de 0,6 à 600 nm. Le milieu est ensuite centrifugé à 6000 rpm pendant 10 mn. Les bactéries sont rendues compétentes en reprenant le culot bactérien avec un volume de TSB (milieu LB + 100 g/1 de PEG 4000,5% de DMSO, 10 mM de MgCl2, 10 mM de MgS04) correspondant à 1/10 du volume du milieu de la culture initiale. Après incubation à 4 C pendant 30 à 60 minutes, 200 (il de bactéries sont mises au contact des produits de ligation pendant 15 minutes sur la glace. Après addition de 200ul de LB, les bactéries sont incubées 30 mn à 37 C puis étalées sur un milieu LB + ampicilline.

6) Préparation de plasmides de la banque deux hybrides d'ADNc de cellules Hela (Clontech#).

La banque deux hybrides d'ADNc de cellules Hela est vendue sous forme de bactéries. Ces dernières contiennent un plasmide pGAD GH renfermant un insert correspondant à un ADNc de cellules Hela. Les ADNc de cette banque sont constitués grâce à une amorce oligodT. Ces cDNA sont clonés de façon orientée dans le vecteur pGAD GH au niveau des sites EcoRI et XhoI. 2.1)

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L'ADN plasmidique de la banque d'ADNc de cerveau a été extrait suivant le protocole Clontech . Afin de conserver la représentativité de la banque qui est constituée de 1,2.10 plasmides indépendants, le lot d'ADN plasmidique a été préparé à partir d'un nombre de colonies bactériennes isolées correspondant à un peu plus de deux fois la représentativité de la banque soit 4.106 colonies.

Après vérification du titre de la banque, 2 III de bactéries de la banque deux hybrides d'ADNc de cellules Hela, mis préalablement dans 8 ml de LB, sont étalés sur un milieu solide (16 boites/ 770 cm2 en milieu LB+ampicilline). Les colonies apparues sont reprises pour chacune des boites avec 30ml de LB+ampicilline liquide. Les suspensions obtenues sont incubées à 37 C pendant 3 heures. L'ADN est ensuite extrait de ces souches par la technique d'extraction d'ADN plasmidique en grande quantité. La concentration en ADN est déterminée à 260 nm.

7) Transformation de la levure
Les levures préalablement cultivées dans 100ml de milieu liquide sont récoltées par centrifugation (3000 rpm, 3 minutes). Le culot est lavé deux fois par centrifugation avec 1ml d'eau stérile. Les levures sont ensuite reprises par 1 ml de la solution 1 de transformation (LiAc 0.1 M, Tris-HCl pH 7,5 10mM, EDTA ImM) puis centrifugées (3000 rpm, 3 minutes). Le culot est repris dans 1 ml de la solution 1 de transformation. 50 (il de cette suspension de levures sont mis en présence de 50 g d'ADN de sperme de saumon et de 1 à 5 g d'ADN plasmidique et de 300 l d'une solution II de transformation (LiAc 0.1 M, Tris-HCl pH 7,5 lOmM, EDTA 1mM dans du PEG4000 40%). Ce mélange est incubé à 28 C pendant 30 minutes. Après application d'un choc thermique (40 C , 15 minutes), les cellules sont récoltées par centrifugation (15000 rpm pendant 1 mn). Ce culot est repris dans 200 III d'eau puis étalé sur un milieu minimum gélosé ne contenant pas les acides aminés correspondant aux marqueurs de résistance portés par les plasmides transformants les levures. Les levures sont incubées 72 heures à 28 C.

8) Transformation de la levure par la banque deux hybrides d'ADNc de cellules Hela.

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La levure utilisée a été préalablement transformée par le plasmide pLexTopoIIIa. Elle est cultivée en milieu minimum YNB+His+Lys+Ad+Leu (250 ml), à 28 C, sous agitation jusqu'à une densité de 107 cellules/ml. Les cellules sont récoltées par centrifugation (3000 rpm, 10 minutes) puis reprises dans 250 ml d'eau.

Après une nouvelle centrifugation, le culot cellulaire est repris dans 100 ml d'eau et de nouveau centrifugé. Le culot est alors repris dans 10ml de la solution I de transformation et incubé pendant 1 heure à 28 C sous agitation. Après centrifugation, les cellules sont de nouveau reprises dans 2,5 ml de la solution 1 de transformation, de 100 ul de la banque d'ADNc de cellules Hela et de 20 ml de la solution II de transformation, puis incubées pendant 1 heure à 28 C sous agitation. Un choc thermique est effectué sur ce mélange de transformation à 42 C pendant 20 minutes.

Les cellules sont ensuite centrifugées et le culot cellulaire récolté est lavé avec 10 ml d'eau stérile. Cette opération est répétée deux fois puis le culot est repris avec 2,5 ml de PBS. A ce stade, le PEG toxique pour les cellules est éliminé. 2,4 ml de cette suspension sont utilisés pour ensemencer 250 ml de milieu minimum contenant les acides aminés His, Lys, Ad et cultivés durant une nuit dans un shaker à 28 C. Les 100 l de cette suspension restants servent à déterminer l'efficacité de la transformation par dilution sur milieu minimum solide enprésence de His, Lys et Ad. La culture de nuit est ensuite centrifugée (3000 rpm pendant 5 mn) et lavée deux fois à l'eau stérile. Le culot est ensuite repris dans 2,5 ml d'eau. Un aliquot de 2.4 ml de ce mélange est amené à 10ml dans de l'eau stérile, cette solution est utilisée pour ensemencer 10 boites de 435 cm2 contenant 200 ml de milieu YNB+Lys+Ad et mis à incuber pendant 3 jours. Les 100 l restants sont utilisés pour déterminer le taux d'amplification du nombre de colonies au cours d'une nuit de culture.

9 ) Extraction d'acides nucléiques de levures.

La valeur d'une anse moyenne d'un clone de levure est mise dans 200 l d'une solution TELT (Triton X100 2%, SDS 1%, NaCl lOOmM, Tris pH8 10mM, EDTA ImM), en présence de 3g de billes de verre de 450 m de diamètre et de 2001 de phénol/chloroforme. Ce mélange est agité pendant 15minutes, puis centrifugé pendant 2 minutes à 14000 rpm. Le surnageant est collecté sans prélever la galette protéique et l'ADN contenu dans cette phase est précipité avec 2,5 volumes d'éthanol absolu. Après centrifugation pendant 2 minutes à 14000 rpm, le culot d'ADN est séché et repris dans

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20 l de TE-RNAse. 3 III de cette solution d'ADN préalablement dialysée contre de l'eau, qui correspond à un mélange d'acides nucléiques, sert directement à transformer des bactéries HB101. Seul l'ADN plasmidique est capable de se répliquer dans les bactéries et peut être analysé par la technique de préparation d'ADN plasmidique de bactéries en petite quantité.

10) Test d'activité de la ss-galactosidase.

Une feuille de nitrocellulose est préalablement déposée sur la boite de Pétri contenant les clones de levures individualisés. Cette feuille est ensuite plongée dans de l'azote liquide pendant 30 secondes afin de faire éclater les levures et de libérer ainsi l'activité Bgalactosidase. Après décongélation, la feuille de nitrocellulose est déposée, colonies vers le haut, dans une autre boite de Pétri contenant un papier Whatman 3M préalablement imbibé de 1,5ml de solution PBS (Na2HP04 60mM, NaH2PO4 40mM, KC1 10mM, MgS04 ImM, pH7) et de 10 à 30 l de X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl- ss-D-galactoside) à 50mg/ml de N,N-diméthylformamide. La boite est ensuite incubée à 37 C.

Exemple 1 : Construction d'un vecteur permettant l'expression d'une protéine de fusion entre la topoisomérase III[alpha] humaine et une protéine se liant à l'ADN.

Le criblage d'une banque d'ADNc utilisant le système double hybride nécessite au préalable que la topoisomérase III[alpha] humaine soit fusionnée à une protéine capable de se fixer sur les promoteurs contrôlant l'expression des gènes rapporteurs comme la protéine LexA du répresseur bactérien ou le domaine de liaison à l'ADN (DB) de GAL4. L'expression des protéines de fusion est réalisée grâce au vecteur pLex9 dans le cas d'une fusion avec la protéine LexA ou grâce au vecteur pGBT9 (+2) pour une fusion avec le DB de GAL4 (cf. Matériel et Méthodes). La séquence codant pour la topoisomérase III[alpha] humaine présentée en SEQ ID N 1, a été introduite dans ces deux types de vecteur dans le même cadre de lecture que la séquence correspondant à la protéine LexA ou au DB de Gal4.

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Le fragment d'ADN correspondant à la séquence codant pour la topoisomérase IIIa humaine a été amplifié par PCR à partir d'une banque d'ADNc de cellules Hela (Clontech) grâce aux oligonucléotides 124 et 125. Une deuxième étape d'amplification par PCR a été réalisée sur le fragment d'ADN afin d'introduire aux deux extrémités les sites Xhol et HindIII grâce au couple d'oligonucléotides Top3Xhol et Top3Hind3. Le nouveau fragment d'ADN obtenu, digéré par Xhol et HindIII, a été introduit aux sites correspondant dans le vecteur pBlueBacHis2A (Invitrogen) qui donne la possibilité d'utiliser de nouveaux sites de restriction BamHI et Sali (représentés en gras avec les sites Xhol et HindIII sur la figure 1) pour réaliser les constructions finales.

Le plasmide pLex-TopoIIIa a été construit par insertion du fragment XhoI-Sall, du plasmide précédant, correspondant à la topoisoméraseIIIa humaine, dans le plasmide pLex9 préalablement modifié par insertion des oligonucléotides PCS1 et PCS2 aux sites EcoRI-PstIl. Ce plasmide a été utilisé pour cribler une banque deux hybrides d'ADNc de cellules Hela dans le but d'identifier des protéines interagissant avec la topoisomérase IIIa humaine.

Le plasmide pGBT-TopoIIIa a été construit par insertion, aux sites BamHI et Sali du plasmide pGBT9 (+2), d'un fragment obtenu par digestion partielle avec BamHI et totale avec Sali et correspondant à la topoisomérase IIIa humaine. Ce plasmide a été utilisé pour valider par la technique du deux hybrides la spécificité d'interaction des protéines sélectionnées lors du criblage avec la topoisomérase IIIa humaine.

Les constructions ont été vérifiées par séquençage de l'ADN. Cette vérification a permis de montrer que les fragments de la topoisomérase III[alpha] humaine ne présentaient pas de mutations générées au cours de la réaction de PCR et qu'ils étaient fusionnés dans la même phase ouverte de lecture que celle du fragment correspondant à la protéine LexA ou au DB de GAL4.

Exemple 2 : criblage par la technique du deux hybrides d'une banque d'ADNe de cellules HeLa.

Le criblage d'une banque de fusion permet d'identifier des clones produisant des protéines fusionnées au domaine transactivateur de GAL4, pouvant interagir avec la

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topoisomérase III[alpha]. Cette interaction permet de reconstituer un transactivateur qui va alors être capable d'induire l'expression des gènes rapporteurs His3 et LacZ dans la souche L40 utilisée.

Pour effectuer ce criblage, une banque de fusion réalisée à partir d'ADNc provenant de cellules Hela a été choisie.

Transformation de la levure par la banque deux hybrides d'ADNc de cellule Hela et sélection des clones positifs.

Lors du criblage il est nécessaire de préserver la probabilité que chaque plasmide indépendant de la banque de fusion soit présent dans au moins une levure en même temps que le plasmide pLex-TopoIIIa. Pour préserver cette probabilité, il est important d'avoir une bonne efficacité de transformation de la levure, à cette fin , il a été choisi un protocole de transformation de la levure donnant une efficacité de 10 cellules transformées par g d'ADN. De plus, comme la cotransformation de la levure par deux plasmides différents réduit cette efficacité, une levure L40 préalablement transformée par le plasmide pLex-TopoIIIa a été utilisée. Cette souche contenant pLex-TopoIIIa, de phénotype His-, Lys-, Leu-, a été transformée par 100 g d'ADN plasmidique de la banque deux hybrides. Cette quantité d'ADN a permis d'obtenir après estimation (voir Matériel et Méthodes) 6 10 cellules transformées, ce qui correspond au nombre de plasmides indépendants que constitue la banque. On peut ainsi estimer que moins de la totalité des plasmides de la banque a servi à transformer les levures. La sélection des cellules transformées, capables de reconstituer un transactivateur GAL4 fonctionnel, a été faite sur un milieu YNB+Lys+Ad.

A l'issue de cette sélection environ 500 clones de phénotype His+ ont été obtenus. Sur ces transformants un test d'activité (3-galactosidase a été effectué afin de déterminer le nombre de clones exprimant l'autre gène rapporteur, LacZ. Sur 500 clones obtenus, soixante-trois présentaient le double phénotype His+ et pGal+ montrant ainsi qu'ils expriment des protéines pouvant interagir avec la topoisomérase IIIa humaine.

Exemple 3 : isolement des plamides à partir des clones de levure sélectionnés

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Afin d'identifier les protéines qui interagissent avec la topoisomérase III[alpha] humaine, les plasmides provenant de la banque deux hybrides des levures sélectionnées lors du criblage double hybride ont été extraits. L'ADN des souches de levures de phénotype His+ et pGal+ est utilisé pour transformer la souche E. coli HB 101.

Les ADN plasmidiques des colonies bactériennes obtenues après transformation par des extraits d'ADN de levures ont été analysés par digestion avec des enzymes de restriction et par séparation des fragments d'ADN sur gel d'agarose. Il a été obtenu deux profils de restriction différents sur 15clones de levure analysés. Un de ces profil était fortement représenté. Ces résultats montrent qu'au moins 2 plasmides différents ont été isolés lors de ce criblage, le fragment d'ADN provenant de la banque d'ADNc contenu dans le plasmide le plus représenté a été retenu pour la suite de l'étude.

Exemple 4 : de la séquence de l'insert contenu dans le plasmide sélectionné.

Le séquençage a été réalisé sur le plasmide le plus représenté. Le séquençage est effectué à partir de l'oligonucléotide GAL4TA complémentaire de la région à proximité du site d'insertion de la banque de cDNA de cellules Hela , à 52 paires de bases du site EcoRI.

La comparaison de la séquence obtenue avec les séquences contenues dans les banques de données GenBank et EMBL (European Molecular Biology Lab) a montré que la séquence de l'ADNc présent dans le plasmide sélectionné présente 98. 2 % au niveau nucléique avec le gène humain codant pour la protéine Dead Box X isoform (DBX1) appelée aussi helicase like protéine 2 (DDX14) ayant le numéro d'accession AF000982 et U50553 respectivement. La comparaison de séquence de l'ADNc présent dans le plasmide sélectionné montre également 98. 1 % d'identité avec la protéine DDX14.

La séquence nucléotidique et polypeptidique de DBX1 est présentée dans la séquence SEQ ID N 3. La séquence du gène cloné par deux hybrides commence au nucléotide 952 par rapport au codon d'initiation supposé, soit au 318 ème acide aminé

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et contient une séquence homologue à la séquence codant pour la partie C-terminale de la protéine DBX1 incluant le codon stop.

Ce résultat montre que le domaine d'interaction des protéines ou polypeptides partenaires de la topoisomérase IIIa humaine est contenu dans la seconde moitié Cterminale desdits partenaires.

Des différences ont été notées par rapport à la séquence DBX1 publiée, notamment le codon AGT (en position 1768 par rapport au codon d'initiation, soit en position 2624 sur la séquence SEQ ID N 3) codant pour la sérine 590, est absent dans le fragment cloné.

De même, il a été noté la présence d'un résidu C à la place d'un T en position 2068 de l'ATG.

La séquence du fragment cloné est représentée en SEQ ID N 2.

Exemple 5 : de la spécificité d'interaction entre la topoisomérase III[alpha] et les polypeptides de l'invention.

La spécificité d'interaction entre la topoisomérase IIIa humaine et le polypeptide selon l'invention a été confirmée dans un test d'interaction deux hybrides en utilisant le plasmide pGBT-TopoIIIa à la place du plasmide pLex-TopoIIIa. Le plasmide pGBTTopoIIIa comprend le gène codant pour la topoisomérase IIIa humaine fusionné au domaine le liaison à l'ADN de GAL4.

La souche yCM17 a été transformée par le plasmide isolé lors du criblage de la banque deux hybrides et par le plasmide pGBT-TopoIIIa. Des contrôles de spécificité d'interaction ont également été effectués en transformant cette souche par les plasmides de contrôle pGBT-HaRasVall2 ou pGBT-Fe65, à la place du plasmide pGBTTopoIIIa. Un test d'activité (3-Gal sur les cellules transformées par les différents plasmides a été effectué pour mettre en évidence les interactions protéine-protéine.

Les résultats du test ont montrés que seules les levures transformées par le plasmide isolé lors du criblage de la banque deux hybrides et par le plasmide pGBTTopoIIIa présentaient une activité p-Gal+ montrant ainsi une interaction entre la

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topoisomérase III[alpha] humaine et la région C-terminale des polypeptides selon l'invention. Ces résultats montrent également que cette interaction est indépendante de la protéine de fusion utilisée.

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LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM: RHONE-POULENC RORER (B) RUE : Avenue Raymond Aron (C) VILLE : (E) PAYS : (F) CODE POSTAL: 92165 (H) TELECOPIE : 01.55.71.72.91(ii) TITRE DE L' INVENTION : Partenaires de la topoisomerase III humaine (iii) NOMBRE DE SEQUENCES : (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT : disk (B) ORDINATEUR : PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION : PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS : NON(ix) CARACTERISTIQUE : (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:16..2940 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 1 : GGATCCGAGC TCGAG ATG GCC CTC CGA GGC GTG CGG AAA GTC CTC TGT GTG 51
Met Ala Leu Arg Gly Val Arg Lys Val Leu Cys Val
1 5 10

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GCC GAA AAA AAC GAC GCG GCC AAG GGG ATC GCC GAC CTG CTG TCA AAC 99 Ala Glu Lys Asn Asp Ala Ala Lys Gly Ile Ala Asp Leu Leu Ser Asn
15 20 25 GGT CGC ATG AGG CGG AGA GAA GGA CTT TCA AAA TTC AAC AAG ATC TAT 147 Gly Arg Met Arg Arg Arg Glu Gly Leu Ser Lys Phe Asn Lys Ile Tyr
30 35 40 GAA TTT GAT TAT CAT CTG TAT GGC CAG AAT GTT ACC ATG GTA ATG ACT 195 Glu Phe Asp Tyr His Leu Tyr Gly Gln Asn Val Thr Met Val Met Thr
45 50 55 60 TCA GTT TCT GGA CAT TTA CTG GCT CAT GAT TTC CAG ATG CAG TTT CGA 243 Ser Val Ser Gly His Leu Leu Ala His Asp Phe Gin Met Gin Phe Arg
65 70 75 AAA TGG CAG AGC TGC AAC CCT CTT GTC CTC TTT GAA GCA GAA ATT GAA 291 Lys Trp Gin Ser Cys Asn Pro Leu Val Leu Phe Glu Ala Glu Ile Glu
80 85 90 AAG TAC TGC CCA GAG AAT TTT GTA GAC ATC AAG AAA ACT TTG GAA CGA 339 Lys Tyr Cys Pro Glu Asn Phe Val Asp Ile Lys Lys Thr Leu Glu Arg
95 100 105 GAG ACT CGC CAG TGC CAG GCT CTG GTG ATC TGG ACT GAC TGT GAT AGA 387 Glu Thr Arg Gin Cys Gin Ala Leu Val Ile Trp Thr Asp Cys Asp Arg
110 115 120 GAA GGC GAA AAC ATC GGG TTT GAG ATT ATC CAC GTG TGT AAG GCT GTA 435 Glu Gly Glu Asn Ile Gly Phe Glu Ile Ile His Val Cys Lys Ala Val 125 130 135 140 AAG CCC AAT CTG CAG GTG TTG CGA GCC CGA TTC TCT GAG ATC ACA CCC 483 Lys Pro Asn Leu Gin Val Leu Arg Ala Arg Phe Ser Glu Ile Thr Pro
145 150 155 CAT GCC GTC AGG ACA GCT TGT GAA AAC CTG ACC GAG CCT GAT CAG AGG 531 His Ala Val Arg Thr Ala Cys Glu Asn Leu Thr Glu Pro Asp Gin Arg
160 165 170 GTG AGC GAT GCT GTG GAT GTG AGG CAG GAG CTG GAC CTG AGG ATT GGA 579 Val Ser Asp Ala Val Asp Val Arg Gln Glu Leu Asp Leu Arg Ile Gly

<Desc/Clms Page number 30>

175 180 185 GCT GCC TTT ACT AGG TTC CAG ACC CTG CGG CTT CAG AGG ATT TTT CCT 627 Ala Ala Phe Thr Arg Phe Gln Thr Leu Arg Leu Gln Arg Ile Phe Pro
190 195 200 GAG GTG CTG GCA GAG CAG CTC ATC AGT TAC GGC AGC TGC CAG TTC CCC 675 Glu Val Leu Ala Glu Gln Leu Ile Ser Tyr Gly Ser Cys Gln Phe Pro 205 210 215 220 ACA CTG GGC TTT GTG GTG GAG CGG TTC AAA GCC ATT CAG GCT TTT GTA 723 Thr Leu Gly Phe Val Val Glu Arg Phe Lys Ala Ile Gln Ala Phe Val
225 230 235 CCA GAA ATC TTC CAC AGA ATT AAA GTA ACT CAT GAC CAC AAA GAT GGT 771 Pro Glu Ile Phe His Arg Ile Lys Val Thr His Asp His Lys Asp Gly
240 245 250 ATC GTA GAA TTC AAC TGG AAA AGG CAT CGA CTC TTT AAC CAC ACG GCT 819 Ile Val Glu Phe Asn Trp Lys Arg His Arg Leu Phe Asn His Thr Ala
255 260 265 TGC CTA GTT CTC TAT CAG TTG TGT GTG GAG GAT CCC ATG GCA ACT GTG 867 Cys Leu Val Leu Tyr Gln Leu Cys Val Glu Asp Pro Met Ala Thr Val
270 275 280 GTA GAG GTC AGA TCT AAG CCC AAG AGC AAG TGG CGG CCT CAA GCC TTG 915 Val Glu Val Arg Ser Lys Pro Lys Ser Lys Trp Arg Pro Gln Ala Leu 285 290 295 300 GAC ACT GTG GAG CTT GAG AAG CTG GCT TCT CGA AAG TTG AGA ATA AAT 963 Asp Thr Val Glu Leu Glu Lys Leu Ala Ser Arg Lys Leu Arg Ile Asn
305 310 315 GCT AAA GAA ACC ATG AGG ATT GCT GAG AAG CTC TAC ACT CAA GGG TAC 1011 Ala Lys Glu Thr Met Arg Ile Ala Glu Lys Leu Tyr Thr Gln Gly Tyr
320 325 330 ATC AGC TAT CCC CGA ACA GAA ACA AAC ATT TTT CCC AGA GAC TTA AAC 1059 Ile Ser Tyr Pro Arg Thr Glu Thr Asn Ile Phe Pro Arg Asp Leu Asn
335 340 345

<Desc/Clms Page number 31>

CTG ACG GTG TTG GTG GAA CAG CAG ACC CCC GAT CCA CGC TGG GGG GCC 1107 Leu Thr Val Leu Val Glu Gln Gln Thr Pro Asp Pro Arg Trp Gly Ala
350 355 360 TTT GCC CAG AGC ATT CTA GAG CGG GGT GGT CCC ACC CCA CGC AAT GGG 1155 Phe Ala Gln Ser Ile Leu Glu Arg Gly Gly Pro Thr Pro Arg Asn Gly 365 370 375 380 AAC AAG TCT GAC CAA GCT CAC CCT CCC ATT CAC CCC ACC AAA TAC ACC 1203 Asn Lys Ser Asp Gln Ala His Pro Pro Ile His Pro Thr Lys Tyr Thr
385 390 395 AAC AAC TTA CAG GGA GAT GAA CAG CGA CTG TAC GAG TTT ATT GTT CGC 1251 Asn Asn Leu Gln Gly Asp Glu Gln Arg Leu Tyr Glu Phe Ile Val Arg
400 405 410 CAT TTC CTG GCT TGC TGC TCC CAG GAT GCT CAG GGG CAG GAG ACC ACA 1299 His Phe Leu Ala Cys Cys Ser Gln Asp Ala Gln Gly Gln Glu Thr Thr
415 420 425 GTG GAG ATC GAC ATC GCT CAG GAA CGC TTT GTG GCC CAT GGC CTC ATG 1347 Val Glu Ile Asp Ile Ala Gln Glu Arg Phe Val Ala His Gly Leu Met
430 435 440 ATT CTG GCC CGA AAC TAT CTG GAT GTG TAT CCA TAT GAT CAC TGG AGT 1395 Ile Leu Ala Arg Asn Tyr Leu Asp Val Tyr Pro Tyr Asp His Trp Ser 445 450 455 460 GAC AAG ATC CTC CCT GTC TAT GAG CAA GGA TCC CAC TTT CAG CCC AGC 1443 Asp Lys Ile Leu Pro Val Tyr Glu Gln Gly Ser His Phe Gln Pro Ser
465 470 475 ACC GTG GAG ATG GTG GAC GGG GAG ACC AGC CCA CCC AAG CTG CTC ACC 1491 Thr Val Glu Met Val Asp Gly Glu Thr Ser Pro Pro Lys Leu Leu Thr
480 485 490 GAG GCC GAC CTC ATT GCC CTC ATG GAG AAG CAT GGC ATT GGT ACG GAT 1539 Glu Ala Asp Leu Ile Ala Leu Met Glu Lys His Gly Ile Gly Thr Asp
495 500 505 GCC ACT CAT GCG GAG CAC ATC GAG ACC ATC AAA GCC CGG ATG TAC GTG 1587 Ala Thr His Ala Glu His Ile Glu Thr Ile Lys Ala Arg Met Tyr Val

<Desc/Clms Page number 32>

510 515 520 GGC CTC ACC CCA GAC AAG CGG TTC CTC CCT GGG CAC CTG GGC ATG GGA 1635 Gly Leu Thr Pro Asp Lys Arg Phe Leu Pro Gly His Leu Gly Met Gly 525 530 535 540 CTT GTG GAA GGT TAT GAT TCC ATG GGC TAT GAA ATG TCT AAG CCT GAC 1683 Leu Val Glu Gly Tyr Asp Ser Met Gly Tyr Glu Met Ser Lys Pro Asp
545 550 555 CTC CGG GCT GAA CTG GAA GCT GAT CTG AAG CTG ATC TGT GAT GGC AAA 1731 Leu Arg Ala Glu Leu Glu Ala Asp Leu Lys Leu Ile Cys Asp Gly Lys
560 565 570 AAG GAC AAA TTT GTG GTT CTA AGG CAG CAA GTG CAG AAA TAC AAG CAG 1779 Lys Asp Lys Phe Val Val Leu Arg Gln Gln Val Gln Lys Tyr Lys Gln
575 580 585 GTT TTC ATT GAA GCG GTG GCT AAA GCA AAG AAA TTG GAC GAG GCC TTG 1827 Val Phe Ile Glu Ala Val Ala Lys Ala Lys Lys Leu Asp Glu Ala Leu
590 595 600 GCC CAG TAC TTT GGG AAT GGG ACA GAG TTG GCC CAG CAA GAA GAT ATC 1875 Ala Gln Tyr Phe Gly Asn Gly Thr Glu Leu Ala Gln Gln Glu Asp Ile 605 610 615 620 TAC CCA GCC ATG CCA GAG CCC ATC AGG AAG TGC CCA CAG TGC AAC AAG 1923 Tyr Pro Ala Met Pro Glu Pro Ile Arg Lys Cys Pro Gln Cys Asn Lys
625 630 635 GAC ATG GTC CTT AAG ACC AAG AAG AAT GGC GGG TTC TAC CTC AGC TGC 1971 Asp Met Val Leu Lys Thr Lys Lys Asn Gly Gly Phe Tyr Leu Ser Cys
640 645 650 ATG GGT TTC CCA GAG TGT CGC TCA GCT GTG TGG CTT CCT GAC TCG GTG 2019 Met Gly Phe Pro Glu Cys Arg Ser Ala Val Trp Leu Pro Asp Ser Val
655 660 665 CTG GAG GCC AGC AGG GAC AGC AGT GTG TGT CCA GTT TGT CAG CCA CAC 2067 Leu Glu Ala Ser Arg Asp Ser Ser Val Cys Pro Val Cys Gln Pro His
670 675 680

<Desc/Clms Page number 33>

CCT GTG TAC AGG TTA AAG TTA AAG TTT AAG CGC GGT AGC CTT CCC CCG 2115 Pro Val Tyr Arg Leu Lys Leu Lys Phe Lys Arg Gly Ser Leu Pro Pro 685 690 695 700 ACC ATG CCT CTG GAG TTT GTT TGC TGC ATC GGC GGA TGC GAC GAC ACC 2163 Thr Met Pro Leu Glu Phe Val Cys Cys Ile Gly Gly Cys Asp Asp Thr
705 710 715 CTG AGG GAG ATC CTG GAC CTG AGA TTT TCA GGG GGC CCC CCC AGG GCT 2211 Leu Arg Glu Ile Leu Asp Leu Arg Phe Ser Gly Gly Pro Pro Arg Ala
720 725 730 AGC CAG CCC TCT GGC CGC CTG CAG GCT AAC CAG TCC CTG AAC AGG ATG 2259 Ser Gln Pro Ser Gly Arg Leu Gln Ala Asn Gln Ser Leu Asn Arg Met
735 740 745 GAC AAC AGC CAG CAC CCC CAG CCT GCT GAC AGC AGA CAG ACT GGG TCC 2307 Asp Asn Ser Gln His Pro Gln Pro Ala Asp Ser Arg Gln Thr Gly Ser
750 755 760 TCA AAG GCT CTG GCC CAG ACC CTC CCA CCA CCC ACG GCT GCT GGT GAA 2355 Ser Lys Ala Leu Ala Gln Thr Leu Pro Pro Pro Thr Ala Ala Gly Glu 765 770 775 780 AGC AAT TCT GTG ACC TGC AAC TGT GGC CAG GAG GCT GTG CTG CTC ACT 2403 Ser Asn Ser Val Thr Cys Asn Cys Gly Gln Glu Ala Val Leu Leu Thr
785 790 795 GTC CGT AAG GAG GGC CCC AAC CGG GGC CGG CAG TTC TTT AAG TGC AAC 2451 Val Arg Lys Glu Gly Pro Asn Arg Gly Arg Gln Phe Phe Lys Cys Asn
800 805 810 GGA GGT AGC TGC AAC TTC TTC CTG TGG GCA GAC AGC CCC AAT CCG GGA 2499 Gly Gly Ser Cys Asn Phe Phe Leu Trp Ala Asp Ser Pro Asn Pro Gly
815 820 825 GCA GGA GGG CCT CCT GCC TTG GCA TAT AGA CCC CTG GGC GCC TCC CTG 2547 Ala Gly Gly Pro Pro Ala Leu Ala Tyr Arg Pro Leu Gly Ala Ser Leu
830 835 840 GGA TGC CCA CCA GGC CCA GGG ATC CAC CTA GGT GGG TTT GGC AAC CCT 2595 Gly Cys Pro Pro Gly Pro Gly Ile His Leu Gly Gly Phe Gly Asn Pro

<Desc/Clms Page number 34>

845 850 855 860 GGT GAT GGC AGT GGT AGT GGC ACA TCC TGC CTT TGC AGC CAG CCC TCC 2643 Gly Asp Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Cys Leu Cys Ser Gln Pro Ser
865 870 875 GTC ACA CGG ACT GTG CAG AAG GAT GGA CCC AAC AAG GGG CGC CAG TTC 2691 Val Thr Arg Thr Val Gln Lys Asp Gly Pro Asn Lys Gly Arg Gln Phe
880 885 890 CAC ACA TGT GCC AAG CCG AGA GAG CAG CAG TGT GGC TTT TTC CAG TGG 2739 His Thr Cys Ala Lys Pro Arg Glu Gln Gln Cys Gly Phe Phe Gln Trp
895 900 905 GTC GAT GAG AAC ACC GCT CCA GGG ACT TCT GGA GCC CCG TCC TGG ACA 2787 Val Asp Glu Asn Thr Ala Pro Gly Thr Ser Gly Ala Pro Ser Trp Thr
910 915 920 GGA GAC AGA GGA AGA ACC CTG GAG TCG GAA GCC AGA AGC AAA AGG CCC 2835 Gly Asp Arg Gly Arg Thr Leu Glu Ser Glu Ala Arg Ser Lys Arg Pro 925 930 935 940 CGG GCC AGT TCC TCA GAC ATG GGG TCC ACA GCA AAG AAA CCC CGG AAA 2883 Arg Ala Ser Ser Ser Asp Met Gly Ser Thr Ala Lys Lys Pro Arg Lys
945 950 955 TGC AGC CTT TGC CAC CAG CCT GGA CAC ACC CGT CCC TTT TGT CCT CAG 2931 Cys Ser Leu Cys His Gln Pro Gly His Thr Arg Pro Phe Cys Pro Gln
960 965 970 AAC AGA TGA GCTCAGGGTA GGGTAGAGAA GCTTGGAGTC GAC 2973 Asn Arg *
975 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE : (A) LONGUEUR : 1233 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc

<Desc/Clms Page number 35>

(iii) HYPOTHETIQUE : NON (iv) ANTI-SENS : (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : (B) EMPLACEMENT:1..1035 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2 : CAT TTG TTA GTA GCC ACT CCA GGA CGT CTA GTG GAT ATG ATG GAA AGA 48 His Leu Leu Val Ala Thr Pro Gly Arg Leu Val Asp Met Met Glu Arg
1 5 10 15 GGA AAG ATT GGA TTA GAC TTT TGC AAA TAC TTG GTG TTA GAT GAA GCT 96 Gly Lys Ile Gly Leu Asp Phe Cys Lys Tyr Leu Val Leu Asp Glu Ala
20 25 30 GAT CGG ATG TTG GAT ATG GGG TTT GAG CCT CAG ATT CGT AGA ATA GTC 144 Asp Arg Met Leu Asp Met Gly Phe Glu Pro Gln Ile Arg Arg Ile Val
35 40 45 GAA CAA GAT ACT ATG CCT CCA AAG GGT GTC CGC CAC ACT ATG ATG TTT 192 Glu Gln Asp Thr Met Pro Pro Lys Gly Val Arg His Thr Met Met Phe
50 55 60 AGT GCT ACT TTT CCT AAG GAA ATA CAG ATG CTG GCT CGT GAT TTC TTA 240 Ser Ala Thr Phe Pro Lys Glu Ile Gln Met Leu Ala Arg Asp Phe Leu
65 70 75 80 GAT GAA TAT ATC TTC TTG GCT GTA GGA AGA GTT GGC TCT ACC TCT GAA 288 Asp Glu Tyr Ile Phe Leu Ala Val Gly Arg Val Gly Ser Thr Ser Glu
85 90 95 AAC ATC ACA CAG AAA GTA GTT TGG GTG GAA GAA TCA GAC AAA CGG TCA 336 Asn Ile Thr Gln Lys Val Val Trp Val Glu Glu Ser Asp Lys Arg Ser
100 105 110 TTT CTG CTT GAC CTC CTA AAT GCA ACA GGC AAG GAT TCA CTG ACC TTA 384 Phe Leu Leu Asp Leu Leu Asn Ala Thr Gly Lys Asp Ser Leu Thr Leu
115 120 125

<Desc/Clms Page number 36>

GTG TTT GTG GAG ACC AAA AAG GGT GCA GAT TCT CTG GAG GAT TTC TTA 432 Val Phe Val Glu Thr Lys Lys Gly Ala Asp Ser Leu Glu Asp Phe Leu
130 135 140 TAC CAT GAA GGA TAC GCA TGT ACC AGC ATC CAT GGA GAC CGT TCT CAG 480 Tyr His Glu Gly Tyr Ala Cys Thr Ser Ile His Gly Asp Arg Ser Gln 145 150 155 160 AGG GAT AGA GAA GAG GCC CTT CAC CAG TTC CGC TCA GGA AAA AGC CCA 528 Arg Asp Arg Glu Glu Ala Leu His Gln Phe Arg Ser Gly Lys Ser Pro
165 170 175 ATT TTA GTG GCT ACA GCA GTA GCA GCA AGA GGA CTG GAC ATT TCA AAT 576 Ile Leu Val Ala Thr Ala Val Ala Ala Arg Gly Leu Asp Ile Ser Asn
180 185 190 GTG AAA CAT GTT ATC AAT TTT GAC TTG CCA AGT GAT ATT GAA GAA TAT 624 Val Lys His Val Ile Asn Phe Asp Leu Pro Ser Asp Ile Glu Glu Tyr
195 200 205 GTA CAT CGT ATT GGT CGT ACG GGA CGT GTA GGA AAC CTT GGC CTG GCA 672 Val His Arg Ile Gly Arg Thr Gly Arg Val Gly Asn Leu Gly Leu Ala
210 215 220 ACC TCA TTC TTT AAC GAG AGG AAC ATA AAT ATT ACT AAG GAT TTG TTG 720 Thr Ser Phe Phe Asn Glu Arg Asn Ile Asn Ile Thr Lys Asp Leu Leu 225 230 235 240 GAT CTT CTT GTT GAA GCT AAA CAA GAA GTG CCG TCT TGG TTA GAA AAC 768 Asp Leu Leu Val Glu Ala Lys Gln Glu Val Pro Ser Trp Leu Glu Asn
245 250 255 ATG GCT TAT GAA CAC CAC TAC AAG GGT AGC AGT CGT GGA CGT TCT AAG 816 Met Ala Tyr Glu His His Tyr Lys Gly Ser Ser Arg Gly Arg Ser Lys
260 265 270 AGC AGA TTT AGT GGA GGG TTT GGT GCC AGA GAC TAC CGA CAA AGT AGC 864 Ser Arg Phe Ser Gly Gly Phe Gly Ala Arg Asp Tyr Arg Gln Ser Ser
275 280 285 GGT GCC AGC AGT TCC AGC TTC AGC AGC AGC CGC GCA AGC AGC AGC CGC 912 Gly Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Ser Arg Ala Ser Ser Ser Arg

<Desc/Clms Page number 37>

290 295 300 AGT GGC GGA GGT GGC CAC GGT AGC AGC AGA GGA TTT GGT GGA GGT GGC 960 Ser Gly Gly Gly Gly His Gly Ser Ser Arg Gly Phe Gly Gly Gly Gly 305 310 315 320 TAT GGA GGC TTT TAC AAC AGT GAT GGA TAT GGA GGA AAT TAT AAC TCC 1008 Tyr Gly Gly Phe Tyr Asn Ser Asp Gly Tyr Gly Gly Asn Tyr Asn Ser
325 330 335 CAG GGG GTT GAC TGG TGG GGT AAC TGA GCCTGCTTTG CAGTAGGTCA 1055 Gln Gly Val Asp Trp Trp Gly Asn *
340 345 CCCTGCCAAA CAAGCTAATA TGGAAACCAC ATGTAACTTA GCCAGACTAT ACCTTGTGTA 1115 GCTTCAAGAA CTCGCAGTAC ATTACCAGCT GTGATTCTCC ACTGAAATTT TTTTTTTAAG 1175 GGAGCTCAAG GTCACAAGAA GAAATGAAAG GAACAATCAG CAGCCCTGTT CAGAAGGA 1233 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR:3408 (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : ID NO: 3 :
1 TTT CCC CTT ACT CCG CTC CCC TCT TTT CCC TCC CTC TCC TCC CCT
AAA GGG GAA TGA GGC GAG GGG AGA AAA GGG AGG GAG AGG AGG GGA
46 TCC CTC TGT TCT CTC CTC CTC TTC CCC TCC CCT CCC CCG TCC GGG
AGG GAG ACA AGA GAG GAG GAG AAG GGG AGG GGA GGG GGC AGG CCC
91 GCA CTC TAT ATT CAA GCC ACC GTT TCC TGC TTC ACA AAA TGG CCA
CGT GAG ATA TAA GTT CGG TGG CAA AGG ACG AAG TGT TTT ACC GGT

<Desc/Clms Page number 38>

136 CCG CAC GCG ACA CCT ACG GTC ACG TGG CCT GCC GCC CTC TCA GTT
GGC GTG CGC TGT GGA TGC CAG TGC ACC GGA CGG CGG GAG AGT CAA 181 TCG GGA ATC TGC CTA GCT CCC ACT AAG GGG AGG CTA CCC GCG GAA
AGC CCT TAG ACG GAT CGA GGG TGA TTC CCC TCC GAT GGG CGC CTT 226 GAG CGA GGG CAG ATT AGA CCG GAG AAA TCC CAC CAC ATC TCC AAG
CTC GCT CCC GTC TAA TCT GGC CTC TTT AGG GTG GTG TAG AGG TTC 271 CCC GGG AAC TGA GAG AGG AAG AAG AGT GAA GGC CAG TGT TAG GAA
GGG CCC TTG ACT CTC TCC TTC TTC TCA CTT CCG GTC ACA ATC CTT 316 AAA AAA AAA CAA AAA CAA AAA AAA CGA AAA ACG AAA GCT GAG TGC
TTT TTT TTT GTT TTT GTT TTT TTT GCT TTT TGC TTT CGA CTC ACG 361 ATA GAG TTG GAA AGG GGA GCG AAT GCG TAA GGT TGG AAA GGG GGG
TAT CTC AAC CTT TCC CCT CGC TTA CGC ATT CCA ACC TTT CCC CCC 406 CGA AGA GGC CTA GGT TAA CAT TTT CAG GCG TCT TAG CCG GTG GAA
GCT TCT CCG GAT CCA ATT GTA AAA GTC CGC AGA ATC GGC CAC CTT 451 AGC GGG AGA CGC AAG TTC TCG CGA GAT CTC GAG AAC TCC GAG GCT
TCG CCC TCT GCG TTC AAG AGC GCT CTA GAG CTC TTG AGG CTC CGA 496 GAG ACT AGG GTT TTA GCG GAG AGC ACG GGA AGT GTA GCT CGA GAG
CTC TGA TCC CAA AAT CGC CTC TCG TGC CCT TCA CAT CGA GCT CTC 541 AAC TGG GAC AGC ATT TCG CAC CCT AAG CTC CAA GGC AGG ACT GCT
TTG ACC CTG TCG TAA AGC GTG GGA TTC GAG GTT CCG TCC TGA CGA 586 AGG GGC GAC AGG ACT AAG TAG GAA ATC CCT TGA GCT TAG ACC TGA
TCC CCG CTG TCC TGA TTC ATC CTT TAG GGA ACT CGA ATC TGG ACT 631 GGG AGC GCG CAG TAG CCG GGC AGA AGT CGC CGC GAC AGG GAA TTG
CCC TCG CGC GTC ATC GGC CCG TCT TCA GCG GCG CTG TCC CTT AAC 676 CGG TGT GAG AGG GAG GGC ACA CGT TGT ACG TGC TGA CGT AGC CGG
GCC ACA CTC TCC CTC CCG TGT GCA ACA TGC ACG ACT GCA TCG GCC 721 CTT TCC AGC GGG TAT ATT AGA TCC GTG GCC GCG CGG TGC GCT CCA
GAA AGG TCG CCC ATA TAA TCT AGG CAC CGG CGC GCC ACG CGA GGT 766 GAG CCG CAG TTC TCC CGT GAG AGG GCC TTC GCG GTG GAA CAA ACA
CTC GGC GTC AAG AGG GCA CTC TCC CGG AAG CGC CAC CTT GTT TGT 811 CTC GCT TAG CAG CGG AAG ACT CCG AGT TCT CGG TAC TCT TCA GGG
GAG CGA ATC GTC GCC TTC TGA GGC TCA AGA GCC ATG AGA AGT CCC
Met Ser His Val Ala Val Glu Asn Ala Leu Gly Leu Asp Gln Gln 856 ATG AGT CAT GTG GCA GTG GAA AAT GCG CTC GGG CTG GAC CAG CAG
TAC TCA GTA CAC CGT CAC CTT TTA CGC GAG CCC GAC CTG GTC GTC
Phe Ala Gly Leu Asp Leu Asn Ser Ser Asp Asn Gln Ser Gly Gly

<Desc/Clms Page number 39>

901 TTT GCT GGC CTA GAC CTG AAC TCT TCA GAT AAT CAG AGT GGA GGA
AAA CGA CCG GAT CTG GAC TTG AGA AGT CTA TTA GTC TCA CCT CCT
Ser Thr Ala Ser Lys Gly Arg Tyr Ile Pro Pro His Leu Arg Asn
946 AGT ACA GCC AGC AAA GGG CGC TAT ATT CCT CCT CAT TTA AGG AAC
TCA TGT CGG TCG TTT CCC GCG ATA TAA GGA GGA GTA AAT TCC TTG
Arg Glu Ala Thr Arg Gly Phe Tyr Asp Lys Asp Ser Ser Gly Trp
991 CGA GAA GCT ACT AGA GGT TTC TAC GAT AAA GAC AGT TCA GGG TGG
GCT CTT CGA TGA TCT CCA AAG ATG CTA TTT CTG TCA AGT CCC ACC
Ser Ser Ser Lys Asp Lys Asp Ala Tyr Ser Ser Phe Gly Ser Arg 1036 AGT TCT AGC AAA GAT AAG GAT GCG TAT AGC AGT TTT GGA TCT CGT
TCA AGA TCG TTT CTA TTC CTA CGC ATA TCG TCA AAA CCT AGA GCA
Ser Asp Ser Arg Gly Lys Ser Ser Phe Phe Ser Asp Arg Gly Ser 1081 AGT GAT TCA AGA GGG AAG TCT AGC TTC TTC AGT GAT CGT GGA AGT
TCA CTA AGT TCT CCC TTC AGA TCG AAG AAG TCA CTA GCA CCT TCA
Gly Ser Arg Gly Arg Phe Asp Asp Arg Gly Arg Ser Asp Tyr Asp 1126 GGA TCA AGG GGA AGG TTT GAT GAT CGT GGA CGG AGT GAT TAC GAT
CCT AGT TCC CCT TCC AAA CTA CTA GCA CCT GCC TCA CTA ATG CTA
Gly Ile Gly Ser Arg Gly Asp Arg Ser Gly Phe Gly Lys Phe Glu 1171 GGC ATT GGC AGC CGT GGT GAC AGA AGT GGC TTT GGC AAA TTT GAA
CCG TAA CCG TCG GCA CCA CTG TCT TCA CCG AAA CCG TTT AAA CTT
Arg Gly Gly Asn Ser Arg Trp Cys Asp Lys Ser Asp Glu Asp Asp 1216 CGT GGT GGA AAC AGT CGC TGG TGT GAC AAA TCA GAT GAA GAT GAT
GCA CCA CCT TTG TCA GCG ACC ACA CTG TTT AGT CTA CTT CTA CTA
Trp Ser Lys Pro Leu Pro Pro Ser Glu Arg Leu Glu Gln Glu Leu 1261 TGG TCA AAA CCA CTC CCA CCA AGT GAA CGC TTG GAA CAG GAA CTC
ACC AGT TTT GGT GAG GGT GGT TCA CTT GCG AAC CTT GTC CTTGAG
Phe Ser Gly Gly Asn Thr Gly Ile Asn Phe Glu Lys Tyr Asp Asp 1306 TTT TCT GGA GGC AAC ACT GGG ATT AAT TTT GAG AAA TAC GAT GAC
AAA AGA CCT CCG TTG TGA CCC TAA TTA AAA CTC TTT ATG CTA CTG
Ile Pro Val Glu Ala Thr Gly Asn Asn Cys Pro Pro His Ile Glu 1351 ATT CCA GTT GAG GCA ACA GGC AAC AAC TGT CCT CCA CAT ATT GAA
TAA GGT CAA CTC CGT TGT CCG TTG TTG ACA GGA GGT GTA TAA CTT
Ser Phe Ser Asp Val Glu Met Gly Glu Ile Ile Met Gly Asn Ile 1396 AGT TTC AGT GAT GTT GAG ATG GGA GAA ATT ATC ATG GGA AAC ATT
TCA AAG TCA CTA CAA CTC TAC CCT CTT TAA TAG TAC CCT TTG TAA
Glu Leu Thr Arg Tyr Thr Arg Pro Thr Pro Val Gln Lys His Ala 1441 GAG CTT ACT CGT TAT ACT CGC CCA ACT CCA GTG CAA AAG CAT GCT
CTC GAA TGA GCA ATA TGA GCG GGT TGA GGT CAC GTT TTC GTA CGA
Ile Pro Ile Ile Lys Glu Lys Arg Asp Leu Met Ala Cys Ala Gln 1486 ATT CCT ATT ATC AAA GAG AAA AGA GAC TTG ATG GCT TGT GCC CAA

<Desc/Clms Page number 40>

TAA GGA TAA TAG TTT CTC TTT TCT CTG AAC TAC CGA ACA CGG GTT
Thr Gly Ser Gly Lys Thr Ala Ala Phe Leu Leu Pro Ile Leu Ser 1531 ACA GGG TCT GGA AAA ACT GCA GCA TTT CTG TTG CCC ATC TTG AGT
TGT CCC AGA CCT TTT TGA CGT CGT AAA GAC AAC GGG TAG AAC TCA
Gln Ile Tyr Ser Asp Gly Pro Gly Glu Ala Leu Arg Ala Met Lys 1576 CAG ATT TAT TCA GAT GGT CCA GGC GAG GCT TTG AGG GCC ATG AAG
GTC TAA ATA AGT CTA CCA GGT CCG CTC CGA AAC TCC CGG TAC TTC
Glu Asn Gly Arg Tyr Gly Arg Arg Lys Gln Tyr Pro Ile Ser Leu 1621 GAA AAT GGA AGG TAT GGG CGC CGC AAA CAA TAC CCA ATC TCC TTG
CTT TTA CCT TCC ATA CCC GCG GCG TTT GTT ATG GGT TAG AGG AAC
Val Leu Ala Pro Thr Arg Glu Leu Ala Val Gln Ile Tyr Glu Glu 1666 GTA TTA GCA CCA ACG AGA GAG TTG GCA GTA CAG ATC TAC GAA GAA
CAT AAT CGT GGT TGC TCT CTC AAC CGT CAT GTC TAG ATG CTT CTT
Ala Arg Lys Phe Ser Tyr Arg Ser Arg Val Arg Pro Cys Val Val 1711 GCC AGA AAA TTT TCA TAC CGA TCT AGA GTT CGT CCT TGC GTG GTT
CGG TCT TTT AAA AGT ATG GCT AGA TCT CAA GCA GGA ACG CAC CAA
Tyr Gly Gly Ala Asp Ile Gly Gln Gln Ile Arg Asp Leu Glu Arg 1756 TAT GGT GGT GCC GAT ATT GGT CAG CAG ATT CGA GAC TTG GAA CGT
ATA CCA CCA CGG CTA TAA CCA GTC GTC TAA GCT CTG AAC CTT GCA
Gly Cys His Leu Leu Val Ala Thr Pro Gly Arg Leu Val Asp Met 1801 GGA TGC CAT TTG TTA GTA GCC ACT CCA GGA CGT CTA GTG GAT ATG
CCT ACG GTA AAC AAT CAT CGG TGA GGT CCT GCA GAT CAC CTA TAC
Met Glu Arg Gly Lys Ile Gly Leu Asp Phe Cys Lys Tyr Leu Val 1846 ATG GAA AGA GGA AAG ATT GGA TTA GAC TTT TGC AAA TAC TTG GTG
TAC CTT TCT CCT TTC TAA CCT AAT CTG AAA ACG TTT ATG AAC CAC
Leu Asp Glu Ala Asp Arg Met Leu Asp Met Gly Phe Glu Pro Gln 1891 TTA GAT GAA GCT GAT CGG ATG TTG GAT ATG GGG TTT GAG CCT CAG
AAT CTA CTT CGA CTA GCC TAC AAC CTA TAC CCC AAA CTC GGA GTC
Ile Arg Arg Ile Val Glu Gln Asp Thr Met Pro Pro Lys Gly Val 1936 ATT CGT AGA ATA GTC GAA CAA GAT ACT ATG CCT CCA AAG GGT GTC
TAA GCA TCT TAT CAG CTT GTT CTA TGA TAC GGA GGT TTC CCA CAG
Arg His Thr Met Met Phe Ser Ala Thr Phe Pro Lys Glu Ile Gln 1981 CGC CAC ACT ATG ATG TTT AGT GCT ACT TTT CCT AAG GAA ATA CAG
GCG GTG TGA TAC TAC AAA TCA CGA TGA AAA GGA TTC CTT TAT GTC
Met Leu Ala Arg Asp Phe Leu Asp Glu Tyr Ile Phe Leu Ala Val 2026 ATG CTG GCT CGT GAT TTC TTA GAT GAA TAT ATC TTC TTG GCT GTA
TAC GAC CGA GCA CTA AAG AAT CTA CTT ATA TAG AAG AAC CGA CAT
Gly Arg Val Gly Ser Thr Ser Glu Asn Ile Thr Gln Lys Val Val 2071 GGA AGA GTT GGC TCT ACC TCT GAA AAC ATC ACA CAG AAA GTA GTT
CCT TCT CAA CCG AGA TGG AGA CTT TTG TAG TGT GTC TTT CAT CAA

<Desc/Clms Page number 41>

Trp Val Glu Glu Ser Asp Lys Arg Ser Phe Leu Leu Asp Leu Leu 2116 TGG GTG GAA GAA TCA GAC AAA CGG TCA TTT CTG CTT GAC CTC CTA
ACC CAC CTT CTT AGT CTG TTT GCC AGT AAA GAC GAA CTG GAG GAT
Asn Ala Thr Gly Lys Asp Ser Leu Thr Leu Val Phe Val Glu Thr 2161 AAT GCA ACA GGC AAG GAT TCA CTG ACC TTA GTG TTT GTG GAG ACC
TTA CGT TGT CCG TTC CTA AGT GAC TGG AAT CAC AAA CAC CTC TGG
Lys Lys Gly Ala Asp Ser Leu Glu Asp Phe Leu Tyr His Glu Gly 2206 AAA AAG GGT GCA GAT TCT CTG GAG GAT TTC TTA TAC CAT GAA GGA
TTT TTC CCA CGT CTA AGA GAC CTC CTA AAG AAT ATG GTA CTT CCT
Tyr Ala Cys Thr Ser Ile His Gly Asp Arg Ser Gln Arg Asp Arg 2251 TAC GCA TGT ACC AGC ATC CAT GGA GAC CGT TCT CAG AGG GAT AGA
ATG CGT ACA TGG TCG TAG GTA CCT CTG GCA AGA GTC TCC CTA TCT
Glu Glu Ala Leu His Gln Phe Arg Ser Gly Lys Ser Pro Ile Leu 2296 GAA GAG GCC CTT CAC CAG TTC CGC TCA GGA AAA AGC CCA ATT TTA
CTT CTC CGG GAA GTG GTC AAG GCG AGT CCT TTT TCG GGT TAA AAT
Val Ala Thr Ala Val Ala Ala Arg Gly Leu Asp Ile Ser Asn Val 2341 GTG GCT ACA GCA GTA GCA GCA AGA GGA CTG GAC ATT TCA AAT GTG
CAC CGA TGT CGT CAT CGT CGT TCT CCT GAC CTG TAA AGT TTA CAC
Lys His Val Ile Asn Phe Asp Leu Pro Ser Asp Ile Glu Glu Tyr 2386 AAA CAT GTT ATC AAT TTT GAC TTG CCA AGT GAT ATT GAA GAA TAT
TTT GTA CAA TAG TTA AAA CTG AAC GGT TCA CTA TAA CTT CTT ATA
Val His Arg Ile Gly Arg Thr Gly Arg Val Gly Asn Leu Gly Leu 2431 GTA CAT CGT ATT GGT CGT ACG GGA CGT GTA GGA AAC CTT GGC CTG
CAT GTA GCA TAA CCA GCA TGC CCT GCA CAT CCT TTG GAA CCG GAC
Ala Thr Ser Phe Phe Asn Glu Arg Asn Ile Asn Ile Thr Lys Asp 2476 GCA ACC TCA TTC TTT AAC GAG AGG AAC ATA AAT ATT ACT AAG GAT
CGT TGG AGT AAG AAA TTG CTC TCC TTG TAT TTA TAA TGA TTC CTA
Leu Leu Asp Leu Leu Val Glu Ala Lys Gln Glu Val Pro Ser Trp 2521 TTG TTG GAT CTT CTT GTT GAA GCT AAA CAA GAA GTG CCG TCT TGG
AAC AAC CTA GAA GAA CAA CTT CGA TTT GTT CTT CAC GGC AGA ACC
Leu Glu Asn Met Ala Tyr Glu His His Tyr Lys Gly Ser Ser Arg 2566 TTA GAA AAC ATG GCT TAT GAA CAC CAC TAC AAG GGT AGC AGT CGT
AAT CTT TTG TAC CGA ATA CTT GTG GTG ATG TTC CCA TCG TCA GCA
Gly Arg Ser Lys Ser Ser Arg Phe Ser Gly Gly Phe Gly Ala Arg 2611 GGA CGT TCT AAG AGT AGC AGA TTT AGT GGA GGG TTT GGT GCC AGA
CCT GCA AGA TTC TCA TCG TCT AAA TCA CCT CCC AAA CCA CGG TCT
Asp Tyr Arg Gln Ser Ser Gly Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser 2656 GAC TAC CGA CAA AGT AGC GGT GCC AGC AGT TCC AGC TTC AGC AGC
CTG ATG GCT GTT TCA TCG CCA CGG TCG TCA AGG TCG AAG TCG TCG

<Desc/Clms Page number 42>

Ser Arg Ala Ser Ser Ser Arg Ser Gly Gly Gly Gly His Gly Ser 2701 AGC CGC GCA AGC AGC AGC CGC AGT GGC GGA GGT GGC CAC GGT AGC
TCG GCG CGT TCG TCG TCG GCG TCA CCG CCT CCA CCG GTG CCA TCG
Ser Arg Gly Phe Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Phe Tyr Asn Ser 2746 AGC AGA GGA TTT GGT GGA GGT GGC TAT GGA GGC TTT TAC AAC AGT
TCG TCT CCT AAA CCA CCT CCA CCG ATA CCT CCG AAA ATG TTG TCA
Asp Gly Tyr Gly Gly Asn Tyr Asn Ser Gln Gly Val Asp Trp Trp 2791 GAT GGA TAT GGA GGA AAT TAT AAC TCC CAG GGG GTT GAC TGG TGG
CTA CCT ATA CCT CCT TTA ATA TTG AGG GTC CCC CAA CTG ACC ACC
Gly Asn *** 2836 GGT AAC TGA GCC TGC TTT GCA GTA GGT CAC CCT GCC AAA CAA GCT
CCA TTG ACT CGG ACG AAA CGT CAT CCA GTG GGA CGG TTT GTT CGA 2881 AAT ATG GAA ACC ACA TGT AAC TTA GCC AGA CTA TAC CTT GTG TAG
TTA TAC CTT TGG TGT ACA TTG AAT CGG TCT GAT ATG GAA CAC ATC 2926 TTT CAA GAA CTC GCA GTA CAT TAC CAG CTG TGA TTC TCC ACT GAA
AAA GTT CTT GAG CGT CAT GTA ATG GTC GAC ACT AAG AGG TGA CTT 2971 ATT TTT TTT TTA AGG GAG CTC AAG GTC ACA AGA AGA AAT GAA AGG
TAA AAA AAA AAT TCC CTC GAG TTC CAG TGT TCT TCT TTA CTT TCC 3016 AAC AAT CAG CAG CCC TGT TCA GAA GGT GGT TTG AAG ACT TCA TTG
TTG TTA GTC GTC GGG ACA AGT CTT CCA CCA AAC TTC TGA AGT AAC 3061 CTG TAG TTT GGA TTA ACT CCC CTC CCG CCT ACC CCC ATC CCA AAC
GAC ATC AAA CCT AAT TGA GGG GAG GGC GGA TGG GGG TAG GGT TTG 3106 TGC ATT TAT AAT TTT GTG ACT GAG GAT CAT TTG TTT GTT AAT GTA
ACG TAA ATA TTA AAA CAC TGA CTC CTA GTA AAC AAA CAA TTA CAT 3151 CTG TGC CTT TAA CTA TAG ACA ACT TTT TAT TTT GAT GTC CTG TTG
GAC ACG GAA ATT GAT ATC TGT TGA AAA ATA AAA CTA CAG GAC AAC 3196 GCT CAG TAA TGC TCA AGA TAT CAA TTG TTT TGA CAA AAT AAA TTT
CGA GTC ATT ACG AGT TCT ATA GTT AAC AAA ACT GTT TTA TTT AAA 3241 ACT GAA CTT GGG CTA AAA TCA AAC CTT GGC ACA CAG GTG TGA TAC
TGA CTT GAA CCC GAT TTT AGT TTG GAA CCG TGT GTC CAC ACT ATG 3286 AAC TTA ACA GGA ATC ATC GAT TCA TCC ATA AAT AAT ATA AGG AAA
TTG AAT TGT CCT TAG TAG CTA AGT AGG TAT TTA TTA TAT TCC TTT 3331 AAC TTA TGC GGT AGC CTG CAT TAG GGC TTT TTG ATA CTT GCA GAT
TTG AAT ACG CCA TCG GAC GTA ATC CCG AAA AAC TAT GAA CGT CTA 3376 TGG GGG AAA ACA ACA AAT GTC TTG AAG CAT ATT AAT GGA ATT AGT
ACC CCC TTT TGT TGT TTA CAG AAC TTC GTA TAA TTA CCT TAA TCA 3421 TTC TAA TGT GGC AAA CTG TAT TAA GTT AAA GTT CTG ATT TGC TCA

<Desc/Clms Page number 43>

AAG ATT ACA CCG TTT GAC ATA ATT CAA TTT CAA GAC TAA ACG AGT 3466 CTC TAT CCT GGA TAG GTA TTT AGA ACC TGA TAG TCT TTA AGC CAT
GAG ATA GGA CCT ATC CAT AAA TCT TGG ACT ATC AGA AAT TCG GTA 3511 TCC AGT CAT GAT GAG GTG ATG TAT GAA TAC ATG CAT ACA TTC AAA
AGG TCA GTA CTA CTC CAC TAC ATA CTT ATG TAC GTA TGT AAG TTT 3556 GCA CTG TTT TCA AAG TTA ATG CAA GTA AAT ACA GCA ATT CCT CTT
CGT GAC AAA AGT TTC AAT TAC GTT CAT TTA TGT CGT TAA GGA GAA 3601 TCA ACG TTT AGG CAG ATC ATT AAT TAT GAG CTA GCC AAA TGT GGG
AGT TGC AAA TCC GTC TAG TAA TTA ATA CTC GAT CGG TTT ACA CCC 3646 CAT ACT ATT ACA GGG AAA GTT TAA AGG TCT GAT AAC TTG AAA ATA
GTA TGA TAA TGT CCC TTT CAA ATT TCC AGA CTA TTG AAC TTT TAT 3691 GGT TTT TAG GAG AAT TCA TCT ACT TAG ACT TTT TAA GTG CCT GCC
CCA AAA ATC CTC TTA AGT AGA TGA ATC TGA AAA ATT CAC GGA CGG 3736 ATA AAT GAA ATT GAA ATG GTA GAA TGG CTG ACC ACA GCA ATG ACC
TAT TTA CTT TAA CTT TAC CAT CTT ACC GAC TGG TGT CGT TAC TGG 3781 AGC CCT CAT TAG GGC CCT GGA TGA TTT TTG GTC TAA TAA CGC ATG
TCG GGA GTA ATC CCG GGA CCT ACT AAA AAC CAG ATT ATT GCG TAC 3826 CTA GTG TTG ATG TTT TTT GGT CAG AGG GTA TGA ACA GGA AGA ATT
GAT CAC AAC TAC AAA AAA CCA GTC TCC CAT ACT TGT CCT TCT TAA 3871 AAA TGC AGC AGG CTT TAT TTT AAA TGC CGA TTC ACA TTA CTC TGT
TTT ACG TCG TCC GAA ATA AAA TTT ACG GCT AAG TGT AAT GAG ACA 3916 TCA AGC TGC GTT GAG ATG TTA AAC TGG CTT ACT ATA GAC TTC GTA
AGT TCG ACG CAA CTC TAC AAT TTG ACC GAA TGA TAT CTG AAG CAT 3961 AAA ATG GCT CCA GAA AAG TAA CAA ACT GAA ATC TTT GAG ATC ACA
TTT TAC CGA GGT CTT TTC ATT GTT TGA CTT TAG AAA CTC TAG TGT 4006 CAG GTT GGA AAT ATG TAC ATA ACT GCA CAA GGT GTC AAT TCT GCT
GTC CAA CCT TTA TAC ATG TAT TGA CGT GTT CCA CAG TTA AGA CGA 4051 CTA CAG TGC AGT TTT AGT CAG TTT TAG TTG CAT AGG TTT CCA TTG
GAT GTC ACG TCA AAA TCA GTC AAA ATC AAC GTA TCC AAA GGT AAC 4096 TAT TTA TAG TCT GTT TAT GCT AAA TCT GGC CAA AGA TGA ACA TTG
ATA AAT ATC AGA CAA ATA CGA TTT AGA CCG GTT TCT ACT TGT AAC 4141 TCC ACC ACT AAA ATG CCT CTG CCA CTT TGA ATT CTG TGC TAA TTT
AGG TGG TGA TTT TAC GGA GAC GGT GAA ACT TAA GAC ACG ATT AAA 4186 TGT GGC CAG AAT GCG GTG ATC AAA ACG CTC CAT CTT TTT ACA GTG
ACA CCG GTC TTA CGC CAC TAG TTT TGC GAG GTA GAA AAA TGT CAC

<Desc/Clms Page number 44>

4231 GCA TAG GAA GAC GGC AAA AAT TTC CTA AAG TGC AAT AGA TTT TCA
CGT ATC CTT CTG CCG TTT TTA AAG GAT TTC ACG TTA TCT AAA AGT 4276 AGT GTA TTG TGC CTT GTT CTA AAA CTT TTA TTA AGT AGG TGC ACT
TCA CAT AAC ACG GAA CAA GAT TTT GAA AAT AAT TCA TCC ACG TGA 4321 TGA CAG TAT TGA GGT CAT TTG TTA TGG TGC TAT TTC AAT TAG TCT
ACT GTC ATA ACT CCA GTA AAC AAT ACC ACG ATA AAG TTA ATC AGA 4366 AGG TTT AGG CCC TTG TAC ATT TTG CCC ATA ACT TTT TAC AAA GTA
TCC AAA TCC GGG AAC ATG TAA AAC GGG TAT TGA AAA ATG TTT CAT 4411 CTT CTT TTA TTG CAC ATT CAG AGA ATT TTA TAT ATA TGT CTT GTG
GAA GAA AAT AAC GTG TAA GTC TCT TAA AAT ATA TAT ACA GAA CAC 4456 TGC GTG TCC TTA AAC TTC CAA TCT TAC TTT GTC TCT TGG AGA TTG
ACG CAC AGG AAT TTG AAG GTT AGA ATG AAA CAG AGA ACC TCT AAC 4501 TTG AAC GCA GCT TGT CTA GGA AGG GGA TGG GAC TAG ATT CTA AAA
AAC TTG CGT CGA ACA GAT CCT TCC CCT ACC CTG ATC TAA GAT TTT 4546 TTT ATT TGG GAC CAT GGG AAT GAT AGT TGG GAA GAA AAC TAT TTG
AAA TAA ACC CTG GTA CCC TTA CTA TCA ACC CTT CTT TTG ATA AAC 4591 CAC ACG ACA GAT TTC TAG ATA CTT TTT GCT GCT AGC TTT ATG TAA
GTG TGC TGT CTA AAG ATC TAT GAA AAA CGA CGA TCG AAA TAC ATT 4636 TAT TTA TTG AAC ATT TTG ACA AAT ATT TAT TTT TGT AAG CCT AAA
ATA AAT AAC TTG TAA AAC TGT TTA TAA ATA AAA ACA TTC GGA TTT 4681 AGT GAT TCT TTG AAA GTT TAA AGA AAC TTG ACC AAA AGA CAG TAC
TCA CTA AGA AAC TTT CAA ATT TCT TTG AAC TGG TTT TCT GTC ATG 4726 AAA AAC ACT GGC ACT TGA ATG TTG AAT GTC ACC GTA TGC GTG AAA
TTT TTG TGA CCG TGA ACT TAC AAC TTA CAG TGG CAT ACG CAC TTT 4771 TTA TAT ATT TCG GGG TAG TGT GAG CTT TTA ATG TTT AAG TCA TAT
AAT ATA TAA AGC CCC ATC ACA CTC GAA AAT TAC AAA TTC AGT ATA 4816 TAA ACT CTT AAG TCA AAT TAA GCA GAC CCG GCG TTG GCA GTG TAG
ATT TGA GAA TTC AGT TTA ATT CGT CTG GGC CGC AAC CGT CAC ATC 4861 CCA TAA CTT TCT GAT GTT AGT AAA AAC AAA ATT GGC GAC TTG AAA
GGT ATT GAA AGA CTA CAA TCA TTT TTG TTT TAA CCG CTG AAC TTT 4906 TTA AAT TAT GCC AAG GTT TTG ATA CAC TTG TCT TAA GAT ATT AAT
AAT TTA ATA CGG TTC CAA AAC TAT GTG AAC AGA ATT CTA TAA TTA 4951 GAA ACA CTT CAA AAC ACT GAT GTG AAG TGT CCA GAT TCT CAG ATG
CTT TGT GAA GTT TTG TGA CTA CAC TTC ACA GGT CTA AGA GTC TAC 4996 TTT GTT GTG TGG ATT TTG TTT AGT TGT GTG TTT TTT TTT TTT TCA
AAA CAA CAC ACC TAA AAC AAA TCA ACA CAC AAA AAA AAA AAA AGT

<Desc/Clms Page number 45>

5041 GTG AAT GTC TGG CAC ATT GCA ATC CTC AAA CAT GTG GTT ATC TTT
CAC TTA CAG ACC GTG TAA CGT TAG GAG TTT GTA CAC CAA TAG AAA 5086 GTT GTA TTG GCA TAA TCA GTG ACT TGT ACA TTC AGC AAT AGC ATT
CAA CAT AAC CGT ATT AGT CAC TGA ACA TGT AAG TCG TTA TCG TAA 5131 TGA GCA AGT TTT ATC AGC AAG CAA TAT TTT CAG TTA ATA AGG TTT
ACT CGT TCA AAA TAG TCG TTC GTT ATA AAA GTC AAT TAT TCC AAA 5176 CAA AAA TCA TGT AAG GAT TTA AAC TTG CTG AAT GTA AAG ATT GAA
GTT TTT AGT ACA TTC CTA AAT TTG AAC GAC TTA CAT TTC TAA CTT 5221 CCT CAA GTC ACT GTA GCT TTA GTA ATT GCT TAT TGT ATT AGT TTA
GGA GTT CAG TGA CAT CGA AAT CAT TAA CGA ATA ACA TAA TCA AAT 5266 GAT GCT AGC ACT GCA TGT GCT GTG CAT ATT CTG ATT TTA TTA AAA
CTA CGA TCG TGA CGT ACA CGA CAC GTA TAA GAC TAA AAT AAT TTT 5311 TAA AAA AAA AA
ATT TTT TTT TT

Claims (16)

REVENDICATIONS

1. Séquence nucléotidique codant pour un polypeptide capable d'interagir avec la topoisomérase III[alpha].

2. Séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence polypeptidique SEQ ID N 2 ou de ses dérivées.

3. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID N 2 ou de ses dérivées.

4. Polypeptide caractérisé en ce qu'il est capable d'interagir avec la topoisomérase III[alpha].

5. Polypeptide selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence polypeptidique SEQ ID N 2 ou d'une séquence dérivée de celle-ci.

6. Polypeptide selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il est constitué de la séquence polypeptidique correspondant aux résidus 318-662 de la séquence SEQ ID N 3 ou d'une séquence dérivée de celle-ci.

7. Utilisation d'un polypeptide ou d'un fragment de polypeptide selon les revendications 4 ou 6, pour un ralentissement, une inhibition, une stimulation ou une modulation de l'activité de la topoisomérase III[alpha].

8. Anticorps ou fragment d'anticorps dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 4 ou 6.

<Desc/Clms Page number 47>

9. Procédé de mise en évidence ou d'identification de composés capables de se lier avec un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes : a - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 4 ou 6 dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle-ci posséderait une affinité pour ledit polypeptide, et, b - on détecte et/ou isole les molécules liées avec ledit polypeptide.

10. Procédé de mise en évidence ou d'identification de composés capables de moduler ou d'inhiber l'interaction entre la topoisomérase III -a et un polypeptide tel que défini selon les revendications 4 à 6, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes : a - on réalise la liaison de la topoisomérase III[alpha] ou d'un fragment de celle-ci avec ledit polypeptide ; b - on ajoute un composé à tester pour sa capacité à inhiber la liaison entre la topoisomérase III[alpha] et ledit polypeptide ; c - on détermine le déplacement ou l'inhibition de la liaison de la topoisomérase IIIa avec ledit polypeptide ; d - on détecte et/ou isole les composés qui empêchent ou qui gênent la liaison entre la topoisomérase IIIa et ledit polypeptide.

11. Ligand d'un polypeptide tel que défini selon les revendications 4 à 6, susceptible d'être obtenu selon le procédé de la revendication 9.

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12. Ligand capable de moduler ou d'inhiber l'interaction entre la topoisomérase III[alpha] et un polypeptide tel que défini selon les revendications 4 à 6, susceptible d'être obtenu selon le procédé de la revendication 10.

13. Utilisation d'un ligand selon la revendication 11ou 12 pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention, à l'amélioration ou au traitement des maladies impliquant un dysfonctionnement du cycle cellulaire.

14. Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins ligand selon l'une des revendications 11ou 12 ou un anticorps selon la revendication 8.

15. Composition selon la revendication 14 destinée à moduler ralentir ou inhiber l'activité de topoisomérase III[alpha].

16. Composition selon l'une des revendications 14 ou 15 destinée à la prévention, à l'amélioration ou au traitement des maladies impliquant un dysfonctionnement du cycle cellulaire.