KR100422297B1 - 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 ｍｔａ1 사이의 상호작용억제제를 스크리닝 하기 위한 효모 2-하이브리드 시스템및 이를 이용한 스크리닝 방법 - Google Patents

히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 ｍｔａ1 사이의 상호작용억제제를 스크리닝 하기 위한 효모 2-하이브리드 시스템및 이를 이용한 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1 사이의 상호작용 억제제를 스크리닝 하기 위한 효모 2-하이브리드 시스템 및 이를 이용한 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 효모 2-하이브리드 시스템 및 스크리닝 방법은 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1 사이의 상호작용에 대한 억제제를 시험관 내가 아닌 세포 내에서 확인할 수 있기 때문에 생체 환경과 유사한 조건 하에서 스크리닝 결과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 용이하게 실시할 수 있는 장점이 있으며, 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1이 관여하는 암전이 및 혈관신생 억제제의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 ＭＴＡ1 사이의 상호작용 억제제를 스크리닝 하기 위한 효모 2-하이브리드 시스템 및 이를 이용한 스크리닝 방법{Novel Yeast 2-Hybrid Systems for Screening Inhibitors to Interaction between Histone Deacetylase 1 and MTA1 and Screening Methods Using the Same}
본 발명은 효모 2-하이브리드 시스템 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 단백질 사이의 상호작용을 억제하는 물질을 스크리닝 하기 위한 효모 2-하이브리드 시스템 및 이를 이용한 스크리닝 방법에 관한 것이다.
유전자 발현 억제 인자인 히스톤 탈아세틸화 효소는 RB, mSin3a, N-CoR과 같은 전사 억제 인자들과 상호 작용하여 거대 단백질 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 크로마틴 구조를 이루고 있는 히스톤 단백질을 탈아세틸화함으로써 유전자의 발현을 억제하는데 관여하는 것으로 알려져 있다 (Laszlo Nagy, Hung-Ying Kao, Debabrat Chakravarti, Richard J. Lin, Christian A. Hassig, Donald E. Ayer, Stuart L. Schreiber 및 Ronald M. Evans,Cell, 89:373-380(1997); Robin X. Lwo, Antonio A. Postigo, 및 Douglas C. Dean,Cell, 92:463-473(1998)). 히스톤 탈아세틸화 효소는 초파리, 효모 및 옥수수 등 진핵세포 내에서 보편적으로 존재하는데 효모의 경우에는 5 종류 (Rpd3, Hda1 그리고 HOS1, 2 및 3), 인간의 경우에는 17 종류의 유사형태가 현재까지 발견되었다 (Steven G., Gray 및 Tomas J. Ekstrom,Experimental Cell Research, 262:75-83(2001)).
인간의 히스톤 탈아세틸화 효소는 조직별, 환경인자 자극별로 발현량에 차이가 있으며 특히 각종 암세포 및 미분화 백혈병 세포에서 다량 발현된다는 사실이 공지되어 있다 (Wen-Ming Yang, Ya-Li Yao, Jian-Min Sun, James R. Davie 및 Edward Seto,Journal of Biological Chemistry, 272:28001-28007(1997)). 인간의 히스톤 탈아세틸화 효소는 크게 두 종류로 나뉘는데, 효모의 Rpd3와 유사한 I군의 HDAC 1, 2, 3 및 8, 그리고 Hda1과 유사한 Ⅱ군의 HDAC 4, 5, 6 및 7이 있다 (Steven G., Gray, Tomas J. Ekstrom,Experimental Cell Research, 262:75-83(2001)). 상기 Ⅰ군의 분자량은 45-55 kDa 정도이고, Ⅱ군의 경우는 80-131 kDa 정도로 그 크기가 큰데 I군과 달리 N-말단에 비촉매 부분을 포함하고 있다. I군의 경우는 mSin3a나 NuRD (nucleosome remodelling and deacetylating) 복합체와 결합하여 탈아세틸화 효소 기능을 수행하는 반면 Ⅱ군은 이러한 매개체들과의 상호작용 없이도 그 기능을 수행할 수 있는 것으로 알려져 있다(Eric Y. Huang, Jinsong Zhang, Eric A. Miska, Matthew G. Guenther, Tony Kouarides 및 Mitchell A. Lazar,Gene Development14:45-54(2000)).
인간의 히스톤 탈아세틸화 효소에 대한 항체를 사용한 면역 침강 실험을 통하여 분리된 복합체 내에서 발견된 약 80 kDa정도의 MTA1 (Metastasis-associated factor 1) 은 유방암 세포 전이 시 고발현되어 암전이에 관여할 것으로 알려졌으나 구체적인 기능은 아직 알려진 바가 없다 (Toh Y., Pencil S.D. 및 Nicolson G.L.,Journal of Biological Chemistry, 269 : 22958-22963(1994)). 상기 MTA1 단백질은 715개의 아미노산으로 구성되어 있고 C-말단 부분에 SH3-결합 모티프인 프롤린-풍부 부위가 존재한다. 히스톤 탈아세틸화 효소와 MTA1의 상호작용은 면역 침강반응을 통해 그 가능성이 확인된 바 있다 (Toh Y., Kuninaka S., Endo K., Oshiro T., Ikeda Y., Nakashima H., Baba H., Kohnoe S., Okamura T., Nicolson G.L. 및 Sugimachi K.,Journal of Experimental Clinical Cancer Research, 19:105-111(2000)).
한편, 효모 2-하이브리드 시스템 (yeast two-hybrid system)은 단백질간의 상호 결합을 시험관 내가 아닌 살아있는 효모 세포 내에서 리포터 유전자의 전사 활성을 통해 분석할 수 있는 방법으로서, cDNA 라이브러리와 게놈 융합 라이브러리를 탐색하는 방법으로 많이 이용되고 있다 (Usual Manual, Clontech). 효모 2 하이브리드 시스템은 단백질의 상호 작용을 생체 내에서 볼 수 있다는 장점이 있어 고등 동물의 세포 내에서 일어나는 단백질간의 상호 작용을 연구하는데 크게 기여하고 있다. 예를 들어, GAL4를 이용한 효모 2 하이브리드의 경우에는 효모의 GAL4 전사 인자의 DNA 결합 도메인과 전사 활성 도메인을 분리하여 발현되도록 하고 리포터 유전자 (예:lacZ)의 프로모터의 업스트림쪽에 GAL4 업스트림 활성서열 (UAS)이 존재하도록 제작된 효모 2 하이브리드 시스템이 알려져 있다 (Usual Manual, Clontech).
GAL4 시스템 다음으로 개발된 LexA 시스템은 대장균의 SOS 유전자의 억제제로 기능하는 LexA 단백질을 DNA 결합 도메인으로 이용하고 효모에서 전사기능을 할 수 있는 대장균의 B42 단백질을 전사 활성 도메인으로 도입하였고, 이 경우lacZ리포터 유전자의 업스트림 쪽에는 LexA 결합 부분이 존재하게 되도록 제작되었다 (Usual Manual, Clontech).
상기 시스템들을 통해서 상호 작용하는 두 단백질을 각각 DNA 결합부위 및 전사 활성 부위와 함께 발현시키게 되면 GAL4의 DNA 결합 부위 또는 LexA가 DNA 상에 위치하게 되고 이들과 하나의 형태로 발현된 단백질은 전사 활성 부위와 발현된 단백질과 결합하게 되며 상기 전사 활성 부위는 RNA 중합효소 Ⅱ와 상호 작용하여 최종적으로 리포터 유전자인lacZ가 발현하게 된다. 따라서, 이렇게 발현된 리포터 유전자의 전사 활성을 정량적으로 분석하여 실제로 효모 세포 내에서 두 단백질이 상호작용하고 있음을 확인할 수 있게 되는 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
따라서, 본 발명의 목적은 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1 사이의 상호작용 억제제를 스크리닝 하기 위한 효모 2-하이브리드 시스템을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 효모 2-하이브리드 시스템에 의해 형질전환된 사카로마이세스 세레비제 (Saccharomyces cerevisiae)를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1 사이의 상호작용 억제제의 스크리닝 방법를 제공하는 데 있다.
도 1은 PCR 증폭된 히스톤 탈아세틸화 효소 1 유전자 및 MTA1 유전자의 겔 사진;
도 2는 본 발명의 pLexA-HDAC1 벡터의 유전자 지도;
도 3은 본 발명의 pB42AD-MTA1 벡터의 유전자 지도;
도 4는 본 발명의 효모 2-하이브리드 시스템의 작동을 확인하는 베타-갈락토시다아제 활성 분석 결과를 나타내는 그래프;
도 5는 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 동정된 억제제의 활성을 재확인하는 GST 풀 다운 실험의 결과를 나타내는 오토라디오그램; 및
도 6은 p8op-lacZ 리포터 플라스미드의 유전자 지도.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 효모에서 작동하는 복제 원점,상기 복제 원점의 다운 스트림에 위치하는 프로모터, 상기 프로모터의 다운 스트림에 위치하는 LexA 단백질의 DNA 결합 도메인을 코딩하는 서열, 상기 서열의 다운 스트림에 위치하고 해독되는 경우에는 상기 LexA 단백질의 DNA 결합 도메인과 접합되어 발현되도록 상기 서열에 연결되어 있는 히스톤 탈아세틸화 효소 1을 코딩하는 서열, 및, 영양 요구성 마커 유전자로서 특정 아미노산 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 결합 도메인 파트너 벡터; 그리고, (b) 효모에서 작동하는 복제 원점, 상기 복제 원점의 다운 스트림에 위치하는 프로모터, 상기 프로모터의 다운 스트림에 위치하는 B42 단백질의 전사 활성 도메인을 코딩하는 서열, 상기 서열의 다운 스트림에 위치하고 해독되는 경우에는 상기 B42 단백질의 전사 활성 도메인과 접합되어 발현되도록 상기 서열에 연결되어 있는 MTA1 (Metastasis-associated factor 1)을 코딩하는 서열, 및, 영양 요구성 마커 유전자로서 특정 아미노산 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 전사 활성 도메인 파트너 벡터를 포함하는 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1 사이의 상호작용 억제제를 스크리닝 하기 위한 효모 2-하이브리드 시스템을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "DNA 결합 도메인 파트너 벡터"는 숙주 세포로 이용되는 효모 세포 내의 리포터 유전자의 업스트림에 위치한 전사 조절 서열에 결합하는 DNA 결합 도메인을 암호화하는 서열이 포함된 벡터를 의미한다. 또한, 용어 "전사 활성 도메인 파트너 벡터"는 숙주 세포로 이용되는 효모 세포 내의 유전자의 업스트림에 위치한 전사 조절 서열에 결합하는 RNA 중합효소 Ⅱ의 활성을 조절하는 전사 활성 도메인을 암호화하는 서열이 포함된 벡터를 의미한다.
한편, 본 명세서에서 용어 "효모"와 "사카로마이세스 세레비제 (Saccharomyces cerevisiae)"는 동일한 의미를 갖는 것으로 한다.
본 발명의 효모 2-하이브리드 시스템은 적합하게 변이된 효모 세포로 형질전환 되어, 단백질 사이의 상호작용을 시험관 내가 아닌 살아 있는 효모 세포를 통하여 확인하게 된다.
본 발명의 벡터에 포함되는 서열 중 효모에서 작동하는 복제 원점은 2 μ복제원점, ARS, ARS1 및 ARS2 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 상기 효모에서 작동하는 복제 원점은 2 μ복제원점이다.
상기 효모에서 작동하는 복제 원점의 다운 스트림에 위치하는 프로모터는 ADH1 프로모터, GAL1 프로모터, CYC1 프로모터, PGK 프로모터 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 바람직한 프로모터는 ADH1 프로모터 또는 GAL 1 프로모터이다.
본 발명의 DNA 결합 도메인 파트너 벡터에 포함되는 히스톤 탈아세틸화 효소 1을 코딩하는 서열은 바람직하게는 첨부한 서열 5에 기재된 염기 서열이다.
본 발명의 벡터에 포함되는 영양 요구성 (auxotrophic) 마커 유전자는 히스티딘의 생합성에 관여하는 HIS3 유전자, 트립토판의 생합성에 관여하는 TRP1 유전자, 루이신의 생합성에 관여하는 LEU1 유전자, 우라실 합성에 관여하는 URA3 유전자 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는 상기 마커 유전자는 HIS3 유전자 또는 TRP1 유전자이다. 또한, 본 발명의 두 종의 벡터는 서로 다른 영양 요구성 마커 유전자를 갖는 것이 바람직하다. 이는 본 발명의 두종의 벡터에 의해 형질전환된 효모 세포의 선별작업을 보다 정확하게 할 수 있기 때문이다.
본 발명의 전사 활성 도메인 파트너 벡터에 포함되는 MTA1을 코딩하는 서열은 바람직하게는 서열 7에 기재된 염기 서열을 갖는다.
본 발명의 효모 2-하이브리드 시스템을 구성하는 벡터 중 DNA 결합 도메인 파트너 벡터는 가장 바람직하게는 도 2에 도시된 유전자 지도를 갖이고, 전사 활성 도메인 파트너 벡터는 가장 바람직하게는 도 3에 도시된 유전자 지도를 갖는 것이다.
본 발명의 DNA 결합 도메인 파트너 벡터가 해독되는 경우에는 LexA의 DNA 결합 도메인 및 히스톤 탈아세틸화 효소 1이 접합되어 발현되고, 전사 활성 도메인 파트너 벡터의 경우에는 B42의 전사 활성 도메인 및 MTA1이 접합되어 발현된다.
본 발명의 효모 2-하이브리드 시스템이 리포터 유전자 및 LexA 오퍼레이터를 갖는 효모 세포 내에서 발현되는 경우에는, LexA DNA 결합 도메인이 상기 오퍼레이터에 결합되고, LexA DNA 결합 도메인에 접합되어 있는 히스톤 탈아세틸화 효소 1은 MTA1과 상호작용을 하며, MTA1에 접합되어 있는 B42의 전사활성 도메인은 RNA 중합효소 Ⅱ와 상호작용을 하여 리포터 유전자의 발현을 증가시키게 된다. 따라서, 이러한 본 발명의 효모 2-하이브리드 시스템이 기본적인 작동 원리에 기초하여, 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1 간의 상호작용을 변화시키는 물질을 스크리닝할 수 있는 것이다.
본 발명의 효모 2-하이브리드 시스템은 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1사이의 상호작용을 하이브리드 시스템에 처음으로 적용하여 구축된 것으로서, 상기 상호작용을 변화시키는 물질, 즉 암전이 및 혈관신생을 억제할 수 있는 물질을 스크리닝할 수 있는 수단을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 효모 2-하이브리드 시스템에 의해 형질전환된 사카로마이세스 세레비제 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 사카로마이세스 세레비제 형질전환체는, 바람직하게는 리포터 유전자 및 상기 리포터 유전자의 업스트림에 위치한 LexA 오퍼레이터를 포함하며, 이러한 DNA 서열들은 세포의 염색체 내 또는 별도의 벡터 내에 존재할 수 있고, 가장 바람직하게는 별도의 벡터 내에 상기한 DNA 서열이 존재하는 것이다.
또한, 본 발명의 사카로마이세스 세레비제 형질전환체는 선별 작업을 용이하게 하기 위하여, 특정 아미노산 (예: 트립토판, 히스티딘, 루이신 또는 그의 조합)의 생합성능이 결여되도록 변이된 변이체가 바람직하다.
상기한 상기 리포터 유전자는 당업계에서 통상적으로 이용되는 모든 리포터 유전자가 사용될 수 있고, 예컨대, lacZ 유전자, leu2 유전자 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 상기 리포터 유전자는 lacZ 유전자이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 본 발명의 형질전환 사카로마이세스 세레비제에 스크리닝 시료를 처리하는 단계; (b) 상기 형질전환사카로마이세스 세레비제를 배양하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환 사카로마이세스 세레비제 내의 리포터 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계를 포함하는 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1 사이의 상호작용 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 스크리닝 방법에 있어서, 이용되는 형질전환 사카로마이세스 세레비제는 리포터 유전자 및 상기 리포터 유전자의 업스트림에 위치한 LexA 오퍼레이터를 포함하며, 특정 아미노산 (예: 트립토판, 히스티딘, 루이신 또는 그의 조합)의 생합성능이 결여되도록 변이된 변이체이다. 이와 같은 사카로마이세스 세레비제를 이용하는 경우에는 상기 배양은 트립토판, 히스티딘, 및 그의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산이 결여된 배지에서 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 리포터 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계는 숙주 세포가 갖고 있는 리포터 유전자 (예: lacZ, leu2)에 대해 당업계에 통상적으로 공지된 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들면, 리포터 유전자로서 lacZ를 이용하는 경우에는 기질 (예: ONPG)과의 반응에 의해 형성되는 발색의 흡광도를 측정함으로써 발현 정도를 측정할 수 있다 (Miller, J.H.Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, 352-356 (1972)).
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 본 발명의 형질전환 사카로마이세스 세레비제 및 X-갈을 포함하는 고체 배지를 제조하는 단계; (b) 스크리닝 시료가 처리된 종이 디스크를 준비하는 단계; (c) 상기 고체 배지상에 상기 종이 디스크를 놓고 배양하는 단계; 및 (d) 종이 디스크 주위에 형성된 청색의 환으로부터 시료의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1 사이의 상호작용 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기의 본 발명의 스크리닝 방법에서 이용되는 형질전환 사카로마이세스 세레비제는 리포터 유전자로서 lacZ를 갖는 것이다. 상기의 본 발명의 스크리닝 방법은 상술한 본 발명의 효모 2-하이브리드 시스템을 종이 디스크 플레이트 분석법 (paper disc plate assay)에 적용한 것이다. 이러한 본 발명의 스크리닝 방법은 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1 사이의 상호작용 억제제를 매우 간단하게 동정할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상기 제 11 항의 사카로마이세스 세레비제를 포함하며 루이신이 결여된 배양액을 다수의 웰을 갖는 플레이트에 옮기는 단계; (b) 스크리닝 시료를 상기 플레이트에 처리하는 단계; 및 (c) 상기 사카로마이세스 세레비제의 생육도를 측정하는 단계를 포함하는 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1 사이의 상호작용 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기의 본 발명의 스크리닝 방법에서 이용되는 형질전환 사카로마이세스 세레비제는 리포터 유전자로서 LEU2 유전자를 갖는 것이다. 본 방법에서 이용되는 플레이트는 다수의 웰을 갖는 플레이트면 어떠한 것도 가능하고, 예를 들어 용이하게 구입할 수 있는 96-웰 플레이트를 이용할 수 있다. 본 방법은 플레이트 상에서 효모의 생장을 간단하게 측정 (예: 육안 관찰)함으로써, 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1 사이의 상호작용 억제제를 매우 간단하게 동정할 수 있는 장점이 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 히스톤 탈아세틸화 효소와 MTA1 유전자의 증폭
히스톤 탈아세틸화 효소 유전자를 GeneBank accession number: NM_004964에 개시된 서열 (참조: 서열 5)을 주형으로 하고, 서열 1 및 서열 2의 염기 서열을 갖는 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다. 또한, MTA1 유전자를 GeneBank accession number : NM_004689에 개시된 서열 (참조: 서열 7)을 주형으로 하고, 서열 3 및 서열 4의 염기 서열을 갖는 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다.
PCR 증폭 시 이용된 반응액의 조성은, 10 ng DNA 주형, 10 pmol 프라이머, 200 μM dNTPs, VentR반응 완충액 (10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 20 mM Tris-HCl pH 8.8, 2 mM MgSO4및 0.1% Triton X-100) 및 벤트 (Vent) DNA 중합효소 (New England BioLab)이었고, 전체 부피는 50 ㎕로 조정하였다. 또한, PCR 증폭의 사이클 조건은 95℃에서 3 분 (1 사이클), 94℃에서 1 분, 56℃에서 1 분 및 72℃에서 1 분 30 초 (25 사이클), 그리고 72℃에서 7 분(1 사이클)이다.
그런 다음, PCR 생성물을 0.7% 아가로스 겔에서 전기영동하여 1.4 kb의 인간의 히스톤 탈아세틸화 효소 유전자 및 2.1 kb의 MTA1 유전자가 증폭되었음을 확인하였다 (참조: 도 1).
실시예 2: 효모 2 하이브리드 플라스미드 제작
상기 실시예 1에서 증폭된 각각의 PCR 증폭물 중 인간의 히스톤 탈아세틸화 효소 유전자의 양 말단에 생성된 제한효소 자리에 해당하는 제한효소BamHI과SalI을 상기 증폭된 유전자에 처리하였다. 또한, PCR 증폭물 중 인간의 MTA1 유전자의 양 말단에 생성된 제한효소 자리에 해당하는 제한효소EcoRI과XhoI을 상기 증폭된 유전자에 처리하였다.
한편, pLexA 벡터 (Clontech)를 상기한 인간의 히스톤 탈아세틸화 효소 유전자에 처리한 동일한 제한효소로 처리하였다. 또한, pB42AD 벡터 (Clontech)를 상기한 MTA1 유전자에 처리한 동일한 제한효소로 처리하였다.
이렇게 처리된 상기 유전자 및 벡터를 T4 DNA 연결효소로 16℃에서 연결하여 pLexA-HDAC1 및 pB42AD-MTA1을 제조하였다. 첨부한 도 2는 pLexA-HDAC1의 유전자 지도로서, LexA는 LexA 단백질의 DNA 결합 도메인을 코딩하는 서열, PADH1은 ADH1의 프로모터, TADH1은 ADH1의 전사 종결 서열,HIS3는 영양요구성 마커 유전자로서 히스티딘 합성을 위한 단백질을 코딩하는 서열,bla는 베타 락타마아제 서열을 나타내는 것이다. 첨부한 도 3은 pB42AD-MTA1의 유전자 지도로서, B42AD는 대장균의 B42 전사 활성 도메인을 코딩하는 서열, PGAL1은 GAL1의 프로모터, TADH1은 ADH1의 전사 종결 서열,TRP1은 영양요구성 마커 유전자로서 트립토판 합성을 위한 단백질을 코딩하는 서열,bla는 베타 락타마아제 서열을 나타내는 것이다.
상기한 재조합 벡터를 대장균 JM109 (New England BioLab.)에 CaCl2방법 (Cohen S.N. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 9:2110(1973))으로 형질전환한 후 암피실린 선택배지에서 배양한 다음, 성장한 콜로니들로부터 알칼린 파쇄 방법 (Sambrook et al.,Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989))으로 DNA를 얻어 제한 효소를 처리하여 상기의 재조합 벡터를 갖는 클론을 확인하고, 소망하는 클론을 선택하였다.
실시예 3: 효모 EGY48[p8op-lacZ]의 형질전환
우선, 형질전환하기 위한 pLexA-HDAC1 및 pB42AD-MTA1 벡터를 상기 실시예 2에서 얻은 형질전환 대장균 JM109으로부터 알칼린 파쇄 방법 (Sambrook et al.,Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989))으로 얻었다.
이어, EGY48[p8op-lacZ] 사카로마이세스 세레비제 (Clontech)를 우라실이 없는 10 ㎖의 선택배지 (아미노산이 결여된 효모 질소 베이스 6.7 g, 2% 포도당 및10 ×DO 용액/1 ℓ)에서 250 rpm 및 30℃ 진탕 배양기를 이용하여 24 시간 동안 배양하여 OD600= 1 정도 되도록 하였다. 숙주 세포로 이용한 상기의 EGY48[p8op-lacZ]은 메이팅 타입이 α이고, HIS3, TRP1 및 URA3 유전자가 없는 변이체이며, 지놈 내의 LEU2 리포터 유전자는 LexA 오퍼레이터에 의해 조절되고, LexA 오퍼레이터에는 LexA 이합체가 결합할 수 있는 부위가 6개 존재한다. 또한, 상기의 숙주 세포는 p8op-lacZ 리포터 플라스미드 (참조: 도 6)에 의해 형질전환된 것으로서, 이 플라스미드에 존재하는 LexA 오퍼레이터에는 LexA 이합체가 결합할 수 있는 부위가 8개 존재한다. 성장한 세포를 4000 ×g로 원심 분리하여 회수한 다음, TE 완충액 (pH 7.5) 내의 0.1 M LiAc 5 ㎖를 첨가하고 다시 4000 × g로 원심분리 한 후 TE 완충액 (pH 7.5) 내의 0.1 M LiAc 2 ㎖를 첨가하고 20℃의 진탕 배양기에서 30분 동안 배양하였다. 배양된 세포를 다시 4000 ×g로 원심분리 회수하고 TE 완충액 (pH 7.5) 내의 0.1 M LiAc 100 ㎕에 용해한 다음, 10 ㎍/㎖의 캐리어 DNA (Sigma) 및 pLexA-HDAC1 및 pB42AD-MTA1 벡터 각각 5 ㎍를 첨가하고 잘 혼합하였다.
이어, 700 ㎕의 40% PEG 4000용액 (40% PEG 4000 in 0.1 M LiAc, TE pH 7.5)을 혼합하고 30℃의 진탕 배양기에서 250 rpm으로 30분 동안 배양하였다. 배양물을 42℃에서 8분 동안 열을 가하고 이 반응액에서 세포만을 얻어 200 ㎕의 TE 완충액 (pH 7.5)을 첨가한 다음 그 중 100 ㎕를 선택배지 (아미노산이 결여된 효모 질소 베이스 6.7 g , 2% 포도당 및 10 ×DO 용액/1 ℓ)에 분주해 30℃ 배양기에서 3-4일 동안 배양하였다.
배양을 통해 성장한 효모 세포는 본 발명의 벡터인 pLexA-HDAC1 및 pB42AD-MTA1으로 형질전환된 것이다. 이렇게 형질전환된 EGY48[p8op-lacZ] 효모 세포를 "Saccharomyces cerevisiae/EGY-HM"라 명명하고, 상기 세포를 생명공학연구소 유전자 은행에 2001년 5월 22자로 기탁하고, 기탁번호 KCTC 1015BP를 부여받았다.
실시예 4: 액체배양을 통한 리포터 유전자 베타-갈락토시다아제의
활성 측정
SD 선택배지 (아미노산이 결여된 효모 질소 베이스 6.7 g, 20 g 포도당, 30 ㎎ 이소루신, 150 ㎎ 발린, 20 ㎎ 아데닌, 20 ㎎ 아르기닌, 100 ㎎ 루이신, 30 ㎎ 리신, 20 ㎎ 메티오닌, 50 ㎎ 페닐알라닌, 200 ㎎ 트레오닌, 30 ㎎ 티로신/1 ℓ) 10 ㎖에 상기 실시예 3에서 수득한 형질전환 효모 세포를 접종하고 30℃에서 24시간 진탕 배양하였다. 이어, 배양액 2 ㎖을 8 ㎖의 SD 유도 배지 (아미노산이 결여된 효모 질소 베이스 6.7 g, 20 g 갈락토스, 10 g 라피노즈, 30 ㎎ 이소루신, 150 ㎎ 발린, 20 ㎎ 아데닌, 20 mg 아르기닌, 30 ㎎ 리신, 20 ㎎ 메티오닌, 50 ㎎ 페닐알라닌, 200 ㎎ 트레오닌, 30 ㎎ 티로신/1 ℓ)로 옮겨 OD600= 0.5-0.8이 되도록 배양하였다. 그런 다음, 1.5 ㎖의 세포 배양액을 튜브에 넣고 4000 ×g로 원심분리한 다음, 상층액은 버리고 1.5 ㎖의 Z 완충액 (16.5 g Na2HPO4ㆍ7H2O, 5.5 g NaH2PO4ㆍH2O, 0.75 g KCl, 0.246 g MgSO4ㆍ7H2O/1 ℓ, pH 7.0)을 첨가하고 다시 4000 ×g로 원심분리 하였다. 그리고 나서, 다시 상층액을 버리고 300 ㎕의 Z 완충액을 넣고 세포를 잘 혼합하였다. 이어, 100 ㎕의 세포를 취해서 새 튜브에 넣고 액체 질소에 30초 동안 넣었다가 37℃로 옮기기를 2번 정도 반복하였다. 이렇게 세포를 파쇄한 다음, 베타-머캅토에탄올이 함유된 Z 완충액 (100 ㎖ Z 완충액 내에 0.27 ㎖ β-머캅토에탄올)을 0.7 ㎖ 첨가하고 미리 30℃에서 1-2시간 동안 녹여 두었던 4 ㎎/㎖ ONPG를 160 ㎕ 첨가하였다. 그런 다음, 30℃에서 반응시키고 색이 변화될 때까지의 반응시간을 기록하였다. 반응물의 색이 노란색으로 변하면 1M Na2CO30.4 ㎖를 첨가하여 반응을 종결시키고 10분 동안 12,000 ×g에서 원심분리한 다음, 상층액의 OD420값을 측정하였다. 이렇게 측정된 값으로부터의 베타-갈락토시다아제의 정량은 다음과 같은 수학식에 따라 계산하였다:
베타-갈락토시다아제 유니트 = 1,000 ×{OD420/(t×V×OD600)}
상기 수학식에서, t 는 변색까지의 반응시간이고, V는 0.1 ml ×농도 계수이며 그리고 OD600은 효모 배양액의 흡광도이다.
계산된 베타-갈라토시다아제의 양은 첨부한 도 4에 나타나 있다. 도 4에서 확인할 수 있듯이, 히스톤 탈아세틸화 효소 및 MTA1이 발현된 효모에서 베타-갈락토시다아제가 크게 발현되는 것을 알 수 있다.
실시예 5: 본 발명의 형질전환 효모를 이용한 단백질 상호작용 저
해제의 스크리닝 (96 웰 플레이트를 이용한 분석)
SD 선택배지 10 ㎖에 상기 실시예 3에서 수득한 형질전환 효모 세포를 접종하고 30℃에서 24시간 진탕 배양하였다. 이어, 배양액을 SD 유도 배지로 옮겨 대략 104세포/㎖이 되도록 희석하였다. 그런 다음, 96 웰 플레이트에 100 ㎕씩 배양액을 옮긴 후 히스톤 탈아세틸화 효소와 MTA1의 상호작용을 저해하는 물질을 검색하기 위한 미생물 배양 상등액의 아세톤 추출물들을 각 웰 당 5 ㎕씩 처리하였다. 이 96 웰 플레이트를 30℃에서 24시간 진탕 배양한 후 루이신 리포터 유전자의 발현에 따른 효모의 생육도를 측정하여 미생물 배양 상등액의 아세톤 추출물들을 처리하지 않은 효모의 생육 정도보다 낮은 경우 저해제 물질이 존재하는 것으로 판단하여 선별하였다.
실시예 6: 본 발명의 형질전환 효모를 이용한 단백질 상호작용
저해제의 스크리닝 (종이 디스크 플레이트 분석)
상기 실시예 3의 형질전환된 효모를 우라실/히스티딘/트립토판/루이신이 결여된 SD/갈락토스/라피노스 액체 배지 50 ㎖에서 30℃에서 배양하였다. 이어, 상기 배양액을 취하여 SDS와 혼합하여 2% 세포 배양액 및 0.001% SDS가 되도록한 다음, 이 혼합물을 15% 아가가 함유된 SD/갈락토스/라피노스/X-갈에 혼합하고 이를 플레이트에 부어 고체 배지를 제조하였다.
한편, 히스톤 탈아세틸화 효소와 MTA1 상호작용의 저해제 후보 물질을 얻기위하여 상기 과정과는 별도로 토양으로부터 분리된 약 2000 여개의 미생물을 배양한 배양 상등액의 아세톤 추출물을 히스톤 탈아세틸화 효소와 MTA1 상호작용의 저해제 후보 물질로서 이용하였다. 상기 저해제 후보 물질 40 ㎕로 종이 디스크 (Avantec)를 균일하게 적신 다음, 상기 제조된 고체 배지 1개 당 9개의 종이 디스크를 놓았다. 이어, 30℃ 배양기에서 24-48시간 동안 배양하고, 종이 디스크 주위에 베타-갈락토시다아제 리포터 유전자의 발현을 통한 고밀도의 균생육과 푸른색 강도로 히스톤 탈아세틸화 효소와 MTA1 상호작용의 저해 및 활성화시키는 물질을 확인하였다.
한편, 스크리닝 시료로 이용된 상기 미생물 배양 추출물의 효모에 대한 독성에 의해 액체배양 시나 종이 디스크 주위에 균의 생육 저해가 나타날 수 있고, 이같은 저해는 히스톤 탈아세틸화 효소와 MTA1 상호작용의 저해에 의해 나타나는 저해과 육안으로 혼동을 유발하여 오류 결과를 나오게 할 수도 있다. 이에, 생장저해를 나타내는 것으로 확인된 스크리닝 시료 중에서 정상 효모에 대한 생육 억제 활성을 통해 생장저해를 나타내는 시료를 제거하였다. 그 결과, 히스톤 탈아세틸화 효소와 MTA1 단백질의 상호작용 저해를 통해서만 생육저해를 나타내는 저해제 후보물질을 진정으로 선별할 수 있었다.
히스톤 탈아세틸화 효소와 MTA1 단백질의 상호작용을 저해하는 것으로 나타난 것은 상기 스크리닝 시료 중 곰팡이 배양 상등액의 아세톤 추출액이었다. 히스톤 탈아세틸화 효소의 활성저해제로 알려진 트리코스타틴 에이(trichostatin A)나 단백질 합성 저해제인 사이클로 헥시마이드(cycloheximide)의 경우 히스톤 탈아세틸화 효소와 MTA1 단백질의 상호작용을 저해하지 못하는 것이 확인되어 상기 곰팡이 배양 상등액으로부터 얻은 아세톤 추출액의 성분은 기존에 알려진 것과는 다른 히스톤 탈아세틸화 효소 저해제일 것으로 볼 수 있다. 이 같은 결과는 본 검색계가 기존의 히스톤 탈아세틸화 효소의 활성 저해제와는 다른 저해 양식의 저해제를 검색하는데 활용될 수 있음을 보여준다.
실시예 7: GST 풀 다운 (pull down)에 의한 본 발명 시스템의 스
크리닝 능력 확인
GST (Glutathione-S-transferase) 결합 히스톤 탈아세틸화 효소를 발현시키는 벡터로 형질전환된 대장균 세포를 37℃에서 24시간 동안 진탕 배양기에서 배양하였다. 이어, 2 ×YT LB 배지로 상기 배양액을 옮긴 후 OD600= 1까지 성장시킨 다음, 0.4 mM IPTG를 넣고 단백질을 발현시켰다. 단백질이 발현된 세포를 회수하여 10 ㎖ PBST (2 mM EDTA, 0.1% BME 및 0.2 mM PMSF 포함)에 용해하고 1 ㎎/㎖ 리소자임을 넣은 후 30분 동안 얼음에 둔 후 파쇄하였다. 이어, 20,000 ×g에서 30분 동안 4℃ 원심분리 하여 상층액만 취하였다. 상기 상층액에 GST-아가로스 비드 (Sigma)를 넣고 4℃에서 한시간 동안 혼합하였다. 원심 분리하여 GST 결합 히스톤 탈아세틸화 효소가 붙어있는 GST-아가로스 비드를 가라앉히고 상층액은 버렸다. 상기 GST-아가로스 비드를 PBST로 여러 번 세척하였다.
그런 다음, GST 결합 히스톤 탈아세틸화 효소가 붙어있는 상기 세척된 GST-아가로스 비드에 상기 실시예 5에서 히스톤 탈아세틸화 효소와 MTA1 단백질의 상호작용을 저해하는 것으로 확인된 시료를 첨가하고 30분 동안 상온에서 반응시켰다. 그리고 나서, 반응 용액 (0.1% NonidetP, 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA 및 150 mM NaCl)으로 세척하고, 새로운 반응 용액 500 ㎕와 시험관 내 전사/해독을 통해35S-메티오닌이 포함된 MTA1 단백질을 첨가하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다.
한편, 상기35S-메티오닌이 포함된 MTA1 단백질은 다음과 같이 시험관 내 전사/해독을 통해 얻어진 것이다: TNT인 비트로전사/해독 키트(Promega)내에 존재하는 토끼 적혈구 혼합물에 0.5 ng의 pcDNA-MTA1 DNA와35S-메티오닌을 넣고 1시간 동안 30℃에서 시험관내 전사/해독 반응이 일어나도록 하였다.
반응이 종결된 다음, 반응 용액으로 여러 번 세척하고, SDS-PAGE를 수행한 다음, 감광 필름화 하였으며 그 결과는 도 5에 나타나 있다. 첨부 도 5에서 MTA1 레인은 MTA1만을 로딩한 것이고, GST 레인은 GST와 MTA1의 반응물을 로딩한 것이며, C 레인은 GST-HDAC1과 MTA1의 반응물을 로딩한 것이고, 나머지 레인은 시료가 처리된 GST-HDAC1과 MTA1의 반응물을 로딩한 것이다. G695는 실시예 5 및 6에서 저해 활성을 나타내지 않는 것으로 확인된 것으로서 네가티브 대조군으로 로딩한 것이다. 도 5에서 확인할 수 있듯이, 실시예 5 및 6에서 본 발명의 효모 2 하이브리드 시스템에 의해 저해 활성이 확인된 G699 (곰팡이의 배양 상등액의 아세톤 추출물) 및 G707 (곰팡이의 배양 상등액의 아세톤 추출물)은 본 실시예에서도 저해 활성이 있는 것으로 나타났다. 더욱이, G699는 G707과는 달리 1 ㎕가 첨가된 경우에도 저해 활성이 확인되어 G707보다 큰 저해 활성을 갖음을 알 수 있다. 그리고 기존에 알려진 히스톤 탈아세틸화 효소의 활성 저해제인 트리코스타틴 에이 (참조: TSA 레인)나 단백질 합성저해제인 사이클로 헥시마이드 (참조: CHX 레인)에 의한 히스톤 탈아세틸화 효소와 MTA1 단백질간의 상호작용은 저해되지 않았다.
따라서, 본 발명의 효모 2 하이브리드 시스템은 히스톤 탈아세틸화 효소 1과 MTA1 단백질의 상호작용을 저해하는 물질을 스크리닝 하는 데 효과적이고 비교적 높은 신뢰도로 이용될 수 있음을 입증하였다.
본 발명은 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1 사이의 상호작용 억제제를 스크리닝 하기 위한 효모 2-하이브리드 시스템을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 효모 2-하이브리드 시스템에 의해 형질전환된 사카로마이세스 세레비제를 제공한다. 한편, 본 발명은 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1 사이의 상호작용 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 스크리닝 방법은 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1 사이의 상호작용에 대한 억제제를 시험관 내가 아닌 세포 내에서 확인할 수 있기 때문에 생체 환경과 유사한 조건하에서 스크리닝 결과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 용이하게 실시할 수 있는 장점이 있으며, 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1이 관여하는 암전이 및 혈관신생 억제제의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (15)

  1. 다음을 포함하는 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1 사이의 상호작용 억제제를 스크리닝 하기 위한 효모 2-하이브리드 시스템:
    (a) 효모에서 작동하는 복제 원점, 상기 복제 원점의 다운 스트림에 위치하는 프로모터, 상기 프로모터의 다운 스트림에 위치하는 LexA 단백질의 DNA 결합 도메인을 코딩하는 서열, 상기 서열의 다운 스트림에 위치하고 해독되는 경우에는 상기 LexA 단백질의 DNA 결합 도메인과 접합되어 발현되도록 상기 서열에 연결되어 있는 히스톤 탈아세틸화 효소 1을 코딩하는 서열, 및, 영양 요구성 마커 유전자로서 특정 아미노산 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 결합 도메인 파트너 벡터; 그리고,
    (b) 효모에서 작동하는 복제 원점, 상기 복제 원점의 다운 스트림에 위치하는 프로모터, 상기 프로모터의 다운 스트림에 위치하는 B42 단백질의 전사 활성 도메인을 코딩하는 서열, 상기 서열의 다운 스트림에 위치하고 해독되는 경우에는 상기 B42 단백질의 전사 활성 도메인과 접합되어 발현되도록 상기 서열에 연결되어 있는 MTA1을 코딩하는 서열, 및, 영양 요구성 마커 유전자로서 특정 아미노산 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 전사 활성 도메인 파트너 벡터.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 효모에서 작동하는 복제 원점은 2 μ복제원점, ARS,ARS1 및 ARS2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1 사이의 상호작용 억제제를 스크리닝 하기 위한 효모 2-하이브리드 시스템.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 효모에서 작동하는 복제 원점의 다운 스트림에 위치하는 프로모터는 ADH1 프로모터, GAL1 프로모터, CYC1 프로모터 및 PGK 프로모터로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1 사이의 상호작용 억제제를 스크리닝 하기 위한 효모 2-하이브리드 시스템.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 히스톤 탈아세틸화 효소 1을 코딩하는 서열은 서열 5에 기재된 염기 서열을 갖는 것임을 특징으로 하는 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1 사이의 상호작용 억제제를 스크리닝 하기 위한 효모 2-하이브리드 시스템.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 영양 요구성 마커 유전자로서 특정 아미노산 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 서열은 HIS3 유전자, TRP1 유전자, LEU1 유전자 및 URA3 유전자로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1 사이의 상호작용 억제제를 스크리닝 하기 위한 효모 2-하이브리드 시스템.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 MTA1을 코딩하는 서열은 서열 7에 기재된 염기 서열을 갖는 것임을 특징으로 하는 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1 사이의 상호작용 억제제를 스크리닝 하기 위한 효모 2-하이브리드 시스템.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 DNA 결합 도메인 파트너 벡터는 도 2에 도시된 유전자 지도를 갖는 것을 특징으로 하는 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1 사이의 상호작용 억제제를 스크리닝 하기 위한 효모 2-하이브리드 시스템.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 전사 활성 도메인 파트너 벡터는 도 3에 도시된 유전자 지도를 갖는 것을 특징으로 하는 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1 사이의 상호작용 억제제를 스크리닝 하기 위한 효모 2-하이브리드 시스템.
  9. 상기 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 효모 2-하이브리드 시스템에 의해 형질전환된 사카로마이세스 세레비제 (Saccharomyces cerevisiae).
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 형질전환 사카로마이세스 세레비제는 리포터 유전자 및 상기 리포터 유전자의 업스트림에 위치한 LexA 오퍼레이터를 포함하는 추가적인 벡터를 갖고 있으며, 특정 아미노산의 생합성능이 결여되도록 변이된 변이체인 것을 특징으로 하는 형질전환된 사카로마이세스 세레비제.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 lacZ 유전자 또는 leu2 유전자인 것을 특징으로 하는 형질전환된 사카로마이세스 세레비제.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 lacZ 유전자인 것을 특징으로 하는 형질전환된 사카로마이세스 세레비제.
  13. 다음과 같은 단계를 포함하는 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1 사이의 상호작용 억제제의 스크리닝 방법:
    (a) 상기 제 11 항의 형질전환된 사카로마이세스 세레비제에 스크리닝 시료를 처리하는 단계;
    (b) 상기 형질전환된 사카로마이세스 세레비제를 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 형질전환된 사카로마이세스 세레비제 내의 리포터 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계.
  14. 다음과 같은 단계를 포함하는 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1 사이의 상호작용 억제제의 스크리닝 방법:
    (a) 상기 제 12 항의 형질전환된 사카로마이세스 세레비제 및 X-갈을 포함하는 고체 배지를 준비하는 단계;
    (b) 스크리닝 시료가 처리된 종이 디스크를 준비하는 단계;
    (c) 상기 고체 배지상에 상기 종이 디스크를 놓고 배양하는 단계; 및
    (d) 종이 디스크 주위에 형성된 청색의 환으로부터 시료의 활성을 측정하는 단계.
  15. 다음과 같은 단계를 포함하는 히스톤 탈아세틸화 효소 1 및 MTA1 사이의 상호작용 억제제의 스크리닝 방법:
    (a) 상기 제 11 항의 사카로마이세스 세레비제를 포함하며 루이신이 결여된 배양액을 다수의 웰을 갖는 플레이트에 옮기는 단계;
    (b) 스크리닝 시료를 상기 플레이트에 처리하는 단계; 및
    (c) 상기 사카로마이세스 세레비제의 생육도를 측정하는 단계.
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