JP2002514423A

JP2002514423A - 組換え植物ｅ２ｆペプチドを発現するトランスジェニック植物細胞

Info

Publication number: JP2002514423A
Application number: JP2000548472A
Authority: JP
Inventors: グティエレス−アルメンタ，クリサント; シェ，チー; ラミレスパルラ，エレーナ
Original assignee: コンセホ・スペリオル・デ・インヴェスティガシオンス・シエンティフィカス
Priority date: 1998-05-08
Filing date: 1999-05-07
Publication date: 2002-05-21
Also published as: CA2327546A1; WO1999058681A3; WO1999058681A2; AU3828099A; EP1084249A2

Abstract

(57)【要約】植物細胞におけるＥ２Ｆ活性を増加させるまたは減少させることを含む、植物増殖および／または細胞ＤＮＡ複製および／または細胞周期進行、分化および発生を調節する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ペプチドを含む、植物Ｅ２Ｆタンパク質またはその機能する変異体
をコードする核酸配列、並びに植物細胞周期段階および／またはその体構造を調
節するための前記配列の使用に関する。本発明はまた、抗体を産生するのに有用
な植物Ｅ２Ｆタンパク質およびペプチドも提供し、そして植物Ｅ２Ｆペプチドお
よびタンパク質の検出および増幅に使用するのに適した核酸も提供する。さらに
提供されるのは、細胞周期においてＧ１からＳ期の植物細胞の移行の機構に関与
するＥ２Ｆタンパク質およびその一部を過剰産生するまたは過少生産するトラン
スジェニック植物、植物の一部および植物細胞である。こうした植物、部分およ
び細胞は、Ｇ１またはＳ期で過ごす時間量の増加または減少が引き起こされてい
るため、他のタンパク質を過剰または過少産生する可能性がある。

【０００２】細胞周期進行は、複雑でそして高度に制御されたネットワークの結果である。
異なる細胞周期段階を通じた細胞の正しい推移に重要なのは、特定の遺伝子、例
えばＳ期特異的遺伝子の転写活性の厳密な制御である（Ｎｅｖｉｎｓ、１９９２
；Ｈｅｌｉｎ、１９９８に概説される）。

【０００３】哺乳動物細胞では、転写因子のＥ２Ｆファミリーが、Ｇ１／Ｓ移行の転写制御
におけるこの極めて重要な役割を果たす。これらの協調した作用が、細胞周期制
御遺伝子、例えばｃｄｃ２、サイクリンＡおよびＥ、Ｒｂ、ｐ１０７およびＥ２
Ｆ−１、並びにＤＮＡ代謝に関与する遺伝子、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ
、チミジンキナーゼ、チミジル酸シンターゼ、ＤＮＡポリメラーゼα、ＯＲＣ１
およびＣＤＣ６の発現を調節すると考えられる（Ｎｅｖｉｎｓ、１９９２；Ｈｅ
ｌｉｎ、１９９８に概説される）。遺伝子発現に対するＥ２Ｆ活性は、網膜芽腫
（Ｒｂ）腫瘍抑制因子タンパク質と共に、それに関連するｐ１０７およびｐ１３
０タンパク質により、異なるＥ２Ｆメンバーおよびポケットタンパク質の間の複
合体の形成を通じ、仲介される（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、１９９５に概説される）。
この方式では、例えば、最近ヒストン脱アセチラーゼに関し示されたように、Ｒ
ｂはＥ２Ｆ反応性遺伝子プロモーターに対し標的化され、そして隣接する因子と
の相互作用を通じ、転写を阻害する（Ｂｒｅｈｍら、１９９８；Ｍａｇｎａｇｈ
ｉ−Ｊａｕｌｉｎら、１９９８）。

【０００４】細胞増殖および可塑性、体構成および発生に関し特有の特性を持つ、植物など
の他の系において、特にＧ１／Ｓ移行で、細胞周期制御に関与する因子、および
それらの作用機構は、顕著に、より理解されていない点が多い。しかし、入手可
能なデータにより、細胞周期進行に関連し、そして原因となる遺伝子発現の厳密
な調節が植物細胞でも存在することが示唆され、該調節によりいくつかの遺伝子
が細胞周期を通じ特定の段階で発現されることが知られる（Ｓｔａｉｇｅｒおよ
びＤｏｏｎａｎ、１９９３；ＤｏｏｎａｎおよびＦｏｂｅｒｔ、１９９７に概説
される）。例えば、Ｂ型サイクリンがＧ２およびＭ期で集積する（Ｆｅｒｒｅｉ
ｒａら、１９９４；Ｆｏｂｅｒｔら、１９９４；Ｋｏｕｃｈｉら、１９９５；Ｉ
ｔｏら、１９９７；Ｉｔｏら、１９９８）一方、リボヌクレオチドレダクターゼ
およびヒストン遺伝子ｍＲＮＡは、Ｓ期特異的であるようである（Ｐｈｉｌｉｐ
ｐｓら、１９９５；ＳｈｅｎおよびＧｉｇｏｔ、１９９７）。したがって、Ｓ期
特異的転写因子が植物細胞に存在する可能性があるが、その分子的性質はまだ知
られていない。特に、これらが転写因子の動物Ｅ２Ｆファミリーに、何らかの構
造的および／または機能的類似性を有するかどうかは、いまだに答えを必要とす
る重要な問題の１つである。さらに、Ｓ期特異的プロテインキナーゼの活性が、
内胚乳発生の初期段階中に増加することが知られている（ＧｒａｆｉおよびＬａ
ｒｋｉｎｓ、１９９５）。

【０００５】Ｒｂ様経路が植物細胞において、Ｇ１／Ｓ移行を制御している可能性があるこ
とは、植物において３つの異なるＤ型サイクリンが単離され（Ｓｏｎｉら、１９
９５；Ｄａｈｌら、１９９５）、そして複製が宿主機能に依存する植物ＤＮＡウ
イルス由来のタンパク質が、ヒトＲｂ関連タンパク質と関連する可能性があるこ
とが観察されて（Ｘｉｅら、１９９５）、初めて示された。後に、保存されたＡ
／Ｂポケットドメインを持つタンパク質をコードする植物ｃＤＮＡが単離された
（Ｘｉｅら、１９９６；Ｇｒａｆｉら、１９９６；Ａｃｈら、１９９７ａ）。

【０００６】植物Ｒｂ様タンパク質は、そのヒト相対物と共通するいくつかの特徴を有し、
該特徴には、活性および３つの植物Ｄ型サイクリンとＬＸＣＸＥ依存方式で相互
作用する能力に必要な、ヒトＲｂのＣ６０７に相同な残基の存在が含まれる（Ｈ
ｕｎｔｌｅｙら、１９９８）。さらに、非常に興味深いことに、植物Ｒｂはヒト
細胞で発現すると、Ｅ２Ｆ反応性プロモーターを抑制することが可能である（Ｈ
ｕｎｔｌｅｙら、１９９８）。要するに、これらの研究は、おそらく動物細胞に
見られる転写因子のＥ２Ｆファミリーと関連した、植物細胞におけるＳ期特異的
転写因子（ＳＴＦ）の存在を予測する（Ｘｉｅら、１９９５）。しかし、植物に
おけるＥ２Ｆ様転写因子の同定は、ヒトＥ２ＦｃＤＮＡクローン由来の異種プ
ローブを用いた研究が成功してきていないことから、達成されにくいものとなっ
ている。

【０００７】本発明者は、現在、酵母ツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）系におい
て植物Ｒｂと相互作用する植物タンパク質をコードするｃＤＮＡを単離し、クロ
ーン化し、そして性質決定してきている。本発明者は、本ｃＤＮＡクローンが動
物Ｅ２Ｆタンパク質にアミノ酸相同性を持つ植物Ｅ２Ｆファミリーメンバー（Ｔ
ｍＥ２Ｆ）をコードすることを立証してきた。本発明者はさらに、驚くべきこと
に、非常に保存されたＤＮＡ結合ドメイン、より保存されていない二量体化ドメ
インおよび比較的関連していないトランス活性化およびＲｂ結合ドメインを含め
、植物が、ヒトＥ２Ｆのものと同様のドメイン構成を持つ単一のＥ２Ｆメンバー
を含むようであることを決定した。興味深いことに、該クローンのＲｂ結合ドメ
インは、動物Ｅ２Ｆに見られるものと異なるアミノ酸残基を含むが、その疎水性
または荷電特性の保存を示す。

【０００８】本明細書および請求項に関し、以下の技術用語が、以下の定義と一致して用い
られる。ペプチドまたはタンパク質の「機能する変異体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｖａ
ｒｉａｎｔ）」は、そのアミノ酸配列が、アミノ酸配列の変化にも関わらず、機
能する変異体が、当業者に検出可能な、元来のタンパク質の生物学的活性の少な
くとも１つの、少なくとも一部を保持するような方式で、１つまたはそれ以上の
アミノ酸残基の置換、欠失および／または付加により、元来のペプチドまたはタ
ンパク質のアミノ酸配列から由来する可能性がある、ポリペプチドである。機能
する変異体は、由来する可能性があるタンパク質に対し、一般的に少なくとも５
０％相同、好都合には少なくとも７０％相同、そしてさらに好都合には少なくと
も９０％相同である。好ましくは機能する変異体のアミノ酸配列は、元来のペプ
チドまたはタンパク質に対し、５０％同一、より好ましくは７０％同一、そして
最も好ましくは９０％同一である。タンパク質のいかなる機能する部分またはそ
の変異体もまた、機能する変異体と称される。

【０００９】配列相同性または同一性の比較および計算のため、アミノ酸およびヌクレオチ
ド配列を並列するのに使用するために適したアルゴリズムおよびソフトウェアは
、当業者に周知であろう。こうしたツールの重要な例は、Ｐｅａｒｓｏｎおよび
Ｌｉｐｍａｎ検索に基づくＦＡＳＴおよびＢＬＡＳＴプログラムである。これら
の詳細は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
２１５：４０３−１０；ＬｉｐｍａｎＤＪおよびＰｅａｒｓｏｎＷ
Ｒ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２７，ｐ１４３５−４１に見出すことが可
能である。公共に入手可能なＢＬＡＳＴの詳細は、‘ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎ
ｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ−ｈｅｌｐ．ｈｔｍ
ｌ’でインターネット上で見出すことが可能である。こうして、例えばＦＡＳＴ
ＡおよびＢＬＡＳＴｎソフトウェアを取り込んだ、商業的にまたは公共に入手可
能なソフトウェアパッケージを用い、またはインターネット上のコンピューター
サーバーにより、こうした相同性および同一性パーセンテージを確定してもよい
。前者の例は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ
ｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ（１９８４）１２（１）：３８７）お
よびＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＭａｔｈ
ｅｍａｔｉｃｓ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムを
使用するＢｅｓｔｆｉｔプログラム（ＵｎｉｘまたはＩＢＭ同等物のためのウィ
スコンシン配列解析パッケージ、例えばバージョン８、遺伝学コンピューターグ
ループ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＲｅｓｅａｒｃｈＰａｒｋ，５７５Ｓｃ
ｉｅｎｃｅＤｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１）である。多
くの国際集団、例えばＧｅｎｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌ
ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴを参照されたい）およびＥＭＢＬ：（ｈｔｔｐ
：／／ｗｗｗ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／Ｂｌａｓｔ２を参照さ
れたい）が、インターネットサービスを提供する。

【００１０】同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）という用語により、配列を最適に並列させると、
該配列が、最も高いパーセンテージのアミノ酸または塩基の並列を可能にするた
め、ギャップの導入を必要とする特定の位置における欠失または付加を有する可
能性があるという事実にも関わらず、同じ相対的な位置の参照配列において、請
求されるアミノ酸配列または塩基配列の言及されるパーセンテージが見られるこ
とを意味する。好ましくは、配列は、２０またはそれ以下のギャップを用い、並
列される。すなわち２つの配列に導入されるギャップの総数を合計した場合、２
０またはそれ以下、より好ましくは１０またはそれ以下である。こうしたギャッ
プの長さは、２つの定義されるＥ２Ｆ活性の１つまたは他方が保持される限り、
特に重要ではないが、一般的に５０未満、そして好ましくは１０アミノ酸未満、
または１５０そして好ましくは３０塩基未満であろう。

【００１１】ソフトウェアパッケージおよびインターネットサーバーで用いられるパラメー
ターは、適切な配列長と共に、そして前記のギャップ特性を念頭において、適用
するべきである。並列戦略は、ＷＯ９８／４０４８３の３９ないし４１ページ
にさらに論じられ、本文書は本明細書に援用される。

【００１２】ＢＬＡＳＴ検索のための好適なパラメーターは、デフォルト値であり、すなわ
ちＥＭＢＬＡｄｖａｎｃｅｄＢｌａｓｔ２には：ＢｌａｓｔｐＭａｔｒｉ
ｘＢＬＯＳＵＭＳ６２、Ｆｉｌｔｅｒデフォルト、Ｅｃｈｏｆｉｌｔｅｒ
ＸＥｘｐｅｃｔ１０、Ｃｕｔｏｆｆデフォルト、Ｓｔｒａｎｄ両方、Ｄｅｓ
ｃｒｉｐｔｉｏｎｓ５０、Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ５０である。ＢＬＡＳＴｎ
デフォルトもまた、好ましく用いられる。ＧＣＧウィスコンシンパッケージデフ
ォルトは、ギャップ加重１２、長さ加重４である。さらに好ましい相同性計算法
のため用いられるＦＡＳＴＤＢパラメーターはミスマッチペナルティー＝１．０
０、ギャップペナルティー＝１．００、ギャップサイズペナルティー＝０．３３
および連結ペナルティー＝３０．０である。

【００１３】「過剰産生」という用語は、本明細書において、可能な限り最も一般的な意味
で用いられる。特別の種類の分子、通常ポリペプチドまたはＲＮＡは、天然レベ
ルより有意にそして検出可能に高い（例えば２０％高い）レベルで産生される場
合、細胞において「過剰産生」されるといわれる。細胞における分子の過剰発現
は、伝統的な突然変異および選択技術並びに遺伝子操作法の両方を介し、達成し
てもよい。

【００１４】「異所性発現」という用語は、本明細書において、例えば異所的に発現される
ペプチドまたはタンパク質は、天然にはまったく（または検出可能に）発現され
ない植物の空間的点で産生される、すなわち前記ペプチドまたはタンパク質が前
記点で過剰産生されるという意味で、過剰産生の特別な実現を意味する。特に好
ましい異所性発現は、選択された組織でのみ機能するレベルに達し、そして植物
全体でこうしたレベルに達するのではないものである。この好ましい異所性発現
は、恒常的発現と対照的である。

【００１５】「過少産生」という用語は、天然レベルより有意に低い（例えば２０％または
それ以下）レベル、特に検出不可能なレベルでのポリペプチドまたはｍＲＮＡの
産生を含むよう意図される。

【００１６】本発明の第一の側面において、植物成長および／または細胞ＤＮＡ複製および
／または細胞周期進行、分化および発生を調節する方法であって、植物細胞にお
ける組換え植物Ｅ２Ｆペプチドまたはタンパク質の発現を通じ、その細胞におけ
るＥ２Ｆ活性を増加させるまたは減少させることを含む、前記方法が提供される
。

【００１７】好ましくは、該方法は、植物Ｅ２Ｆ活性が、（ｉ）植物網膜芽腫タンパク質に
結合する能力および（ｉｉ）植物ＤＮＡにおけるＥ２Ｆ転写因子結合部位に結合
する能力の１つまたは両方を含むことで特徴付けられる。これは、植物Ｅ２Ｆタ
ンパク質レベル、細胞レベル以下の局在、ＤＮＡ結合活性、タンパク質−タンパ
ク質結合活性、トランス活性化特性、および／またはＥ２Ｆ−Ｒｂ結合活性を改
変する段階を含んでもよい。植物Ｅ２Ｆは、単独でおよび／または植物Ｒｂのレ
ベルまたは活性の修飾と組み合わせて修飾されてもよい。

【００１８】植物ＤＮＡにおいてＥ２Ｆ転写因子結合部位に結合する能力は、必ずしも転写
活性化につながる必要はない。こうした活性化の阻害もまた、本発明を用い提供
される可能性がある。

【００１９】特に、該方法を用い、植物細胞または植物器官の形状を改変してもよく、そし
て該方法は、植物細胞または植物器官の大きさを増加させるように、細胞増殖特
性を改変してもよい。該方法はまた、他のタンパク質の発現を増加させてもまた
は減少させてもよい。

【００２０】本発明の第二の側面において、単離され、濃縮されている、細胞不含および／
または組換え的に産生されたタンパク質またはペプチドであって、（ｉ）植物網
膜芽腫タンパク質に結合する能力および（ｉｉ）植物ＤＮＡにおけるＥ２Ｆ転写
因子結合部位に結合する能力から選択される、１つまたは両方のＥ２Ｆ活性を有
することで特徴付けられる、ここで該タンパク質またはペプチドは、配列番号６の以下のドメイン：（ａ）ＴｙｒＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＡｓｐＸ
ａａＸａａＸａａＸａａＡｓｐＭｅｔＴｒｐＧｌｕおよび（ｂ）ＧｌｎＬｙｓＡｒｇＡｒｇＩｌｅＴｙｒＡｓｐＩｌｅＴ
ｈｒＡｓｎＶａｌＬｅｕＧｌｕＧｌｙＩｌｅＸａａＬｅｕＩ
ｌｅＧｌｕＬｙｓＸａａＸａａＬｙｓＡｓｎＸａａＩｌｅＡ
ｒｇＴｒｐから選択される１つまたは両方のアミノ酸配列を含む、但し該ペプチドまたはタンパク質がドメイン（ｂ）のみを含む場合、該ペプチド
またはタンパク質は、配列番号６のアミノ酸１−４０６の隣接する配列またはそ
の機能する変異体の配列の少なくとも３０％を含む、前記タンパク質またはペプチドを提供する。

【００２１】より好ましくは、該ペプチドまたはタンパク質は、隣接する配列の少なくとも
５０％そしてさらにより好ましくはその少なくとも７０％を含む。最も好ましく
は、該ペプチドまたはタンパク質は、配列番号６またはその機能する変異体を含
む。好ましい変異体は、ドメイン（ａ）が欠失しているまたは例えば部位特異的
突然変異誘発により、ドメイン（ａ）が不活性化されているものである。

【００２２】したがって、本発明の特に好ましいペプチドまたはタンパク質は、配列番号６
または変異体のものであるが、アミノ酸配列配列番号２が、Ｒｂタンパク質に結
合する能力が配列番号２の天然配列のものより減少し、または完全に失われ、そ
れにより該ペプチドがＲｂ結合に制限されることなく、Ｅ２Ｆタンパク質として
作用することが可能であるように、突然変異するように、修飾されていることで
特徴付けられる。

【００２３】配列番号６のタンパク質のトランス誘導（ｔｒａｎｓｉｎｄｕｃｉｎｇ）特性
を持たない配列番号６またはその機能する変異体のペプチドまたはタンパク質が
提供されることが特に好ましく、これらは、好ましくは、Ｃ末端における配列番
号６のトランス誘導ドメインに突然変異または欠失または挿入を有する。

【００２４】本発明の好ましいペプチドまたはタンパク質は、配列（ｃ）ＬｅｕＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＬｅｕＸ
ａａＸａａＧｌｕＸａａＸａａＸａａＬｅｕＸａａＸａａＸ
ａａＧｌｕＸａａＸａａＬｅｕＡｓｐを含むことでさらに特徴付けられる。

【００２５】いくつかの目的には、減少した長さのペプチドまたはタンパク質、例えば１６
ないし３００、より好ましくは１６ないし１００アミノ酸を提供することが好適
であろう。

【００２６】さらに好ましいペプチドまたはタンパク質は、配列番号２またはその機能する
変異体のアミノ酸配列を含むことで特徴付けられる。さらにより好ましいのは、さらに、配列ＡｒｇＴｈｒＧｌｎＬｅｕＬｙｓＡｒｇＬｙｓＡｌａＴｈｒ
ＡｒｇＧｌｕＧｌｕである配列番号７、または核局在化シグナル（ＮＬＳ）として機能する活性を有
する、その機能する変異体の配列を含むことで特徴付けられる、本発明のペプチ
ドまたはタンパク質である。

【００２７】しかし、こうしたタンパク質の有用な変異体は配列番号７のＮＬＳが、該ペプ
チドが核に局在しないように、例えば部位特異的突然変異誘発により、例えばＰ
ＣＲを用い、修飾されているものである。

【００２８】さらに有用な、本発明のペプチドまたはタンパク質の変異体は、配列番号６の
植物Ｅ２Ｆのアミノ酸残基１４６−２０６またはその機能する変異体の配列であ
る、植物Ｅ２ＦＤＮＡ結合ドメインを含むことで特徴付けられる。

【００２９】植物ＤＮＡにおける特に好ましい標的Ｅ２Ｆ結合ドメインは、配列ＴＴＴ（Ｃ
／Ｇ）（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｇ）、特にＴＴＴ（Ｃ／Ｇ）（Ｃ
／Ｇ）ＣＧ（Ｃ／Ｇ）のものである。

【００３０】配列番号４ＴｙｒＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＡｓｐＸａａ
ＸａａＸａａＸａａＡｓｐＭｅｔＴｒｐＧｌｕを含む、単離され、濃縮されている、細胞不含および／または組換え的に産生さ
れたペプチドまたはタンパク質、あるいはその機能する変異体であって、本質的
なＥ２Ｆペプチドまたはタンパク質領域を欠く場合、例えば１６ないし１００、
より好ましくは１６ないし３０アミノ酸のペプチドである場合、該ペプチドまた
はタンパク質を用い、Ｒｂに結合させ、そして、したがって天然Ｅ２Ｆの効果を
増加させることが可能である。

【００３１】より好ましくは、該ペプチドは配列番号４またはその機能する変異体からなる
。いくつかの好ましい型において、該ペプチドは配列番号２のものであるが、ア
ミノ酸配列配列番号４が、Ｒｂタンパク質、例えば植物Ｒｂタンパク質に結合す
る能力が配列番号４の天然配列のものより増加するまたは減少する、あるいは完
全に失われるように、突然変異するように、修飾されている。特に、該ペプチド
またはタンパク質は、Ｅ２ＦＤＮＡ結合タンパク質として作用することが可能
であり、そして所望によりＲｂ結合により制限されることなく、転写活性化タン
パク質として作用することが可能である。こうした活性をその後、組織特異的ま
たは化学的誘導性プロモーターを用い、より密接に調節してもよい。

【００３２】本発明の第三の側面は、第一の側面に記載されるようなペプチドの発現をコー
ドする配列を含む、単離され、濃縮されている、細胞不含および／または組換え
核酸を提供する。好ましい核酸は、４，０００塩基対未満のＤＮＡを含む。好ま
しい核酸は、所望によりレポーター遺伝子と共に、ＤＮＡ配列をコードする１つ
のペプチドまたはタンパク質のみを含む。

【００３３】好ましくは、該核酸は、配列番号３を含め、植物Ｅ２Ｆまたはその機能する変
異体をコードし、例えば配列番号１のものである。好ましい核酸は、配列番号５
のＤＮＡまたはＲＮＡを含み、核酸がＲＮＡである場合、塩基ＴはＵに置換され
る。

【００３４】配列番号５の核酸は、１９９８年５月１２日に、１９７７年４月２８日の特許
目的のための国際微生物寄託認定に関するブダペスト条約の条件下に、Ｃｏｌｅ
ｃｃｉｏｎＥｓｐａｎｏｌａｄｅＣｕｌｔｉｖｏｓＴｉｐｏに、プラス
ミドｐＣＬＯＮ３５中で、寄託番号ＣＥＣＴ５０４３下に寄託されている。Ｂａ
ｍＨＩおよびＸｈｏＩを用い、該プラスミドから挿入ｃＤＮＡを切除することが
可能である。ｉｎｖｉｔｒｏ転写・翻訳のため、これらの酵素を用い、全長Ｔ
ｍＥ２ＦｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋にクローン化した。

【００３５】本発明の核酸は、ｃＤＮＡの二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡあるいは、例え
ばプローブとしての使用を有するであろうものなど、それに相補的な配列であっ
てもよい。

【００３６】好ましい核酸は、植物Ｅ２Ｆまたはその機能する変異体をコードすることで特
徴付けられ、配列番号３またはそれに相補的な配列を含む。さらに好ましい核酸
は、二本鎖または一本鎖、センスまたはそれに相補的な配列、いずれの配列番号
５のＤＮＡまたはＲＮＡも含む。好ましい核酸はｃＤＮＡを含み、例えば配列番
号３または５を含む。こうした核酸は、所望によりプロモーター、エンハンサー
または停止配列と共に提供されるが、他の遺伝子コード領域を含まない。

【００３７】本発明のＤＮＡまたはＲＮＡは、本発明のＥ２Ｆタンパク質またはペプチドを
コードする配列におけるコドンのヌクレオチドに、縮重置換を含む配列を有して
もよい。ＲＮＡではＵがＤＮＡのＴを置換する。好ましいＤＮＡまたはＲＮＡ自
体は、低ストリンジェンシーの条件において、本発明のペプチドまたはタンパク
質をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズすることが可能であり、好ま
しくはまた、高ストリンジェンシーの条件においても、こうしたハイブリダイゼ
ーションが可能である。

【００３８】「低ストリンジェンシーの条件」および「高ストリンジェンシーの条件」とい
う用語は、もちろん、当業者により完全に理解されるが、好適にはＵＳ５２０
２２５７の９および１０欄、並びにＷＯ９８／４０４８３の３ページに例証さ
れ；前記特許はどちらも本明細書に援用される。したがって、一般的に、本発明
の最も好ましい核酸は、これらの特許に記載される最もストリンジェントな条件
でハイブリダイズするであろうが、他の態様は、より穏やかなストリンジェンシ
ーまたは低ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするであろう。

【００３９】修飾が行われた場合、これらのＥ２Ｆペプチドまたはタンパク質配列に対応す
るアミノ酸として同じ種類の異なるアミノ酸を持つタンパク質の発現が導かれな
ければならない；すなわち、これらは保存的置換である。こうした置換は当業者
に知られており、例えば本明細書に援用されるＵＳ５３８０７１２を参照され
たい。そして該タンパク質が上に論じられるようなＥ２Ｆペプチドまたはタンパ
ク質として活性がある場合のみ、考慮される。

【００４０】アミノ酸に関して用いられる「保存的置換」という表現は、既定のアミノ酸の
、同じ種類の物理化学的特性を有するアミノ酸による置換に関する。したがって
、アミノ酸が疎水性を特徴とする基を有する場合、保存的置換は、やはり疎水性
を特徴とする基を有する別のアミノ酸により、該アミノ酸を置換する；他のこう
した種類は、性質決定基が親水性、陽イオン性、陰イオン性である、あるいはチ
オールまたはチオエステルを含む場合のものである。こうした置換は、生じたタ
ンパク質が、ＤＮＡおよびＲｂ結合に関し、論じられるようなＥ２Ｆペプチドま
たはタンパク質としての活性を有する場合のみ考慮される。

【００４１】本発明の核酸は、本明細書において配列表中に例証されるものに関し、縮重置
換されてもよい。「縮重置換」という表現は、同じアミノ酸をコードするコドン
を生じるものによるヌクレオチドの置換を指す；こうした縮重置換は、該タンパ
ク質を発現する細胞またはベクターが、ｃＤＮＡ供給源細胞のものに対し、転写
／翻訳のための異なるコドン優先性を有するような、ＤＮＡ供給源生物細胞と異
なる種類のものである場合、有益である。こうした縮重置換は、したがって、宿
主特異的であろう。

【００４２】植物または上に引用される寄託物から提供されるＤＮＡまたはＲＮＡは、突然
変異誘発性ポリメラーゼ連鎖反応プライマーの使用など、突然変異誘発手段によ
り、改変してもよい。本発明のＤＮＡまたはＲＮＡを細胞から発現させる使用を
含むことで特徴付けられる、本発明のタンパク質またはペプチドを産生する方法
もまた、本側面に提供される。

【００４３】植物Ｅ２Ｆに対するヒトＥ２Ｆ相違によりこれまで妨げられてきた方法である
、植物Ｅ２Ｆをスクリーニングする目的のため、配列番号５の配列から取られる
１０またはそれ以上の隣接するヌクレオチドに対応する配列の二本鎖または一本
鎖ＤＮＡ、但しヒトＥ２Ｆと比較的よく保存されているアミノ酸配列のみ、すな
わちＧｌｎＬｙｓＡｒｇＡｒｇＩｌｅＴｙｒＡｓｐＩｌｅＴｈｒ
ＡｓｎＶａｌＬｅｕＧｌｕＧｌｙＩｌｅＸａａＬｅｕＩｌｅ
ＧｌｕＬｙｓＸａａＸａａＬｙｓＡｓｎＸａａＩｌｅＡｒｇ
Ｔｒｐをコードするものから選択されない、前記ＤＮＡを含む、核酸プローブまたはプ
ライマーが提供される。

【００４４】こうしたプローブおよびプライマーはノーザンおよびサザンブロッティングに
おいて、そしてＲＴ−ＰＣＲ、およびＬＣＲを含むＰＣＲにおいて、用いてもよ
い。

【００４５】プローブとして使用するためのオリゴヌクレオチドは、好適には、本発明の配
列の少なくとも１８の隣接する塩基を含み、好ましくは３０ないし１００塩基長
であるが、全長配列までの、またはさらに長いいかなる長さのものであってもよ
い。ＰＣＲまたはＬＣＲプライマーとして使用するには、オリゴヌクレオチドは
、好ましくは、１０ないし２０塩基長であるが、より長くてもよい。プライマー
は一本鎖でなければならないが、プローブはまた二本鎖であってもよく、すなわ
ち相補的配列を含んでもよい。

【００４６】天然植物Ｅ２Ｆ発現を下方制御する目的のため、上述の、本発明のいかなる核
酸に対するアンチセンスＤＮＡもまた提供される。本技術は当業に周知であるが
、一般的に例としてＵＳ５３５６７９９およびＵＳ５１０７０６５に例示さ
れ、前記特許の各々は本明細書に援用される。

【００４７】本発明の第四の側面は、本発明の核酸を含むまたはそのアンチセンス核酸を含
む、核酸ベクターまたは構築物を提供する。本発明のペプチドまたはタンパク質
を植物に導入するのに適したベクターまたは構築物は、植物分子生物学の当業者
に思い浮かぶであろうが、好適にはトランスジェニック植物を産生するための方
法に関し、以下に論じられるものである。

【００４８】本発明の第五の側面は、本発明の第三の側面の組換え核酸、好ましくは組換え
ＤＮＡを含む、植物細胞を提供する。本発明の核酸は、特に、核酸またはそのア
ンチセンス核酸配列を含む核酸ベクターまたはＤＮＡ構築物の形で提供される。

【００４９】本発明の第六の側面は、天然植物Ｅ２Ｆの発現を下方制御することが可能なそ
のアンチセンス核酸を含む、植物細胞を提供する。本発明の第七の側面は、上述のような組換え核酸、ベクターまたは構築物を含
む、トランスジェニック植物またはその一部を含む。

【００５０】本発明のタンパク質およびペプチドを植物細胞に搬送する、最も効果的な方法
は、該ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸を、ｉｎｓｉｔｕで発現す
ることによることが理解されるであろう。こうした方法は、好適には、該ペプチ
ドまたはタンパク質をコードする配列を有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌ
クレオチドを、植物細胞ＤＮＡに取り込ませることにより実行される。こうした
ヌクレオチドはまた、遺伝子沈黙化共発現（ｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｃ
ｏｅｘｐｒｓｓｉｏｎ）により、またはアンチセンス戦略を通じ、天然Ｅ２Ｆ発
現を下方制御するのに用いてもよい。突然変異誘発技術、例えばＳＤＭを用いる
ことにより、本発明のヌクレオチドは、例えば結合に関し、本発明の機能する変
異体であるタンパク質およびペプチド、あるいはそうでなければ過剰活性化され
たまたは不活性化されたタンパク質およびペプチドをコードするよう設計し、そ
して産生してもよい。

【００５１】第七の側面の好ましい植物は、プロモーター、活性化配列またはそうでなけれ
ば制御配列と機能するように関連する構築物中の、本発明の核酸を含んでもよい
。好ましいプロモーターは組織特異的であり、したがって、生じたペプチドの発
現、およびしたがってその効果は、望ましい組織に局在する。ある程度の組織特
異性を持つプロモーターは、植物分子生物学の当業者に知られるであろう。これ
らのいくつかは以下に論じられる。

【００５２】本発明に用いることが可能なベクターおよび構築物を産生する方法は、慣用的
な分子生物学的技術を考慮し、当業者に思い浮かぶであろう。ＤＮＡ、ＲＮＡお
よびこれらを含むまたはコードするベクターを、植物細胞形質転換の分野におけ
る既知の方式で、標的細胞に導入してもよい。特に好ましいのは、エレクトロポ
レーションまたは遺伝子銃技術などの技術を用い、花粉細胞にＤＮＡまたはＲＮ
Ａを導入する方法である。

【００５３】本発明のＤＮＡまたはＲＮＡを植物全体で発現させるのが好ましい可能性があ
るが、組織特異的効果を利用しようとする場合、当業者には、組織特異的プロモ
ーター、エンハンサーまたは他の活性化因子を、ＤＮＡと機能する関連で、使用
するトランスジェニック細胞に取り込まなければならないことが理解されるであ
ろう。

【００５４】当業者には、適切なプロモーターは、異所性、連続性に活性があっても、また
は誘導性であってもよいことが理解されるであろう。当業者には、必要なときま
たは必要な場所でのみ、例えば特定の細胞発生段階で、あるいは、大きさの望ま
しい増加または減少あるいは欠失の対象にさえなるであろう、組織、例えば葉、
根、果実または種子あるいはその下位部分、例えば内胚乳において、前述のＥ２
Ｆペプチドまたはタンパク質活性の改変を提供することが可能である限り、誘導
性または組織特異的プロモーターは、利点を有するであろうことが認識されるで
あろう。

【００５５】使用されるべきプロモーターの種類に対し、いかなる特別の限定も想像されな
いが、よい結果を生じるのに、相応な量の実験的試験を行うことが期待される可
能性がある。組織特異的および誘導性プロモーターの例は、以下の特許文献に見
出だすことが可能である：ＵＳ５０８６１６９（花粉特異的）、ＵＳ５４５
９２５２およびＵＳ５６３３３６３（根特異的）、ＵＳ５０９７０２５（（
ｉ）種子、（ｉｉ）成熟植物）、ＵＳ５５８９６１０（雄蕊）、ＵＳ５４２
８１４６（傷）、ＵＳ５３９１７２５（（ｉ）葉緑体、（ｉｉ）細胞質ゾル）
、ＵＳ４８８６７５３（根粒）、ＵＳ４７１０４６１（花粉）、ＵＳ５６
７０３４９（病原体）、ＵＳ５６４６３３３（表皮）、ＵＳ５１１０７３２
（（ｉ）根、（ｉｉ）貯蔵根）、ＵＳ５８５９３２８（雌蕊）、ＵＳ５１８
７２６７（熱ショック）、ＵＳ５６１８９８８（貯蔵器官）、ＵＳ５４０１
８３６およびＵＳ５７９２９２５（根）、ＵＳ４９４３６７４（果実）、Ｕ
Ｓ５６８９０４４およびＵＳ５６５４４１４（化学薬品）、ＵＳ５４９５
００７（師部）、ＵＳ５５８９５８３（分裂組織）、ＵＳ５８２４８５７（
脈管構造）、前記特許は各々、本明細書に援用される。恒常的プロモータは、当
業者に周知であろうし、そして上述の文書に論じられ、そして以下に言及される
が、例えばＣａＭｖ３５Ｓおよびムラサキウマゴヤシ（ａｌｆａｌｆａ）（Ｍｓ
Ｈ３ｇ１）を含む（本明細書に援用されるＷＯ９７／２００５８を参照された
い）。

【００５６】適切な制御配列と関連するｃＤＮＡの挿入により、トランスジェニック植物を
産生するのに用いられる方法の多くの特異的な例は、当業者に周知であろう。植
物形質転換ベクターは、Ｄｅｎｅｃｋｅら（１９９２）ＥＭＢＯＪ．１１
，２３４５−２３５５に記載されてきており、そしてトレハロースを産生する
トランスジェニック植物を産生する、さらなる使用が米国特許出願第０８／２９
０，３０１号に記載された。ＥＰ０３３９００９Ｂ１およびＵＳ５２５０
５１５は、異種遺伝子を植物に挿入するための戦略を記載する（ＵＳ５２５０
５１５の８ないし２６欄を参照されたい）。トランスジェニック単子葉および双
子葉植物両方を産生するための花粉のエレクトロポレーションが、ＵＳ５６２
９１８３、ＵＳ７５３０４８５およびＵＳ７３５０３５６に記載されている
。さらなる詳細は、ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．（１９９７）ＲｏｃｋｙＳ．Ｔｕａｎ監修，Ｈｕ
ｍａｎａＰｒｅｓｓ．ＩＳＢＮ０−８９６０３−３３３−３；０−８９
６０３−４８０−１などの参考書に見出すことが可能である。これらの文書はす
べて、本明細書に援用される。トランスジェニック植物の種類に対し、いかなる
特別の限定も想像されない；すべての種類の植物、単子葉または双子葉植物も、
該植物におけるＥ２Ｆ活性が恒常的にまたは異所性に改変されるように、本発明
の核酸を取り込んだトランスジェニック型で産生することが可能である。

【００５７】本発明の第八の側面において、本発明者は、本発明の第一の側面の植物Ｅ２Ｆ
因子ペプチドまたはタンパク質と特異的に結合することが可能であり、したがっ
て例えばウェスタンブロッティングなどの技術を用い、本発明のさらなるペプチ
ドおよびタンパク質並びにそれをコードする核酸配列を同定しそして単離するこ
とを可能にする、抗体を提供してきている。

【００５８】本発明は、ここで、以下の限定されない実施例に対する言及により、さらに例
示されるであう。付随する請求項の範囲内に属するさらなる態様が、これらを考
慮し、当業者に思い浮かぶであろう。

【００５９】

【実施例】実施例１：植物Ｅ２ＦｃＤＮＡクローンの単離植物Ｒｂと相互作用するタンパク質を同定するため、我々は、懸濁培養中で増
殖する、増殖コムギ（ｗｈｅａｔ）細胞から作成したコムギｃＤＮＡライブラリ
ーの酵母ツーハイブリッドスクリーニングを行った。多数の陽性相互作用因子が
回収され、これらは非常にストリンジェントな条件下（２０−３０ｍＭ３Ａ
Ｔ）で酵母共形質転換体を増殖させ、そして陽性β−ｇａｌシグナルを生じた。
ＤＮＡ配列決定解析により、強い相互作用因子の２つが、およそ１．１ｋｂの
ｃＤＮＡ挿入物を含み、そして同一のＤＮＡ配列を有することが明らかになった
。このＤＮＡ配列をＢＬＡＳＴ検索のクエリー（ｑｕｅｒｙ）として用いると、
Ｅ２Ｆファミリーのいくつかのメンバーが回収された。特に、単離ｃＤＮＡクロ
ーンの推定アミノ酸配列は、ヒトＥ２Ｆ−５のヘテロ二量体化ドメインと有意な
相同性を示した。ｃＤＮＡと共にその５’由来のオリゴヌクレオチドを用い、コ
ロニーハイブリダイゼーションにより、コムギｃＤＮＡライブラリーをスクリー
ニングした。およそ２．０ｋｂの挿入物を含む、４つの陽性クローンを回収し
た。図１に示される最長のｃＤＮＡ挿入物の配列は、１３７１ｂｐの単一のＯ
ＲＦを含み、４５８アミノ酸のタンパク質をコードする可能性がある。本ＯＲＦ
には、５’および３’非翻訳領域の、それぞれ１７０ｂｐおよび４３９ｂｐ
が隣接する。

【００６０】植物Ｒｂ相互作用ｃＤＮＡクローンは、動物Ｅ２Ｆの植物相同体をコードする
。ノーザン解析により、全長ＴｍＥ２ＦＯＲＦをコードする能力を持つ、長さ
およそ２．０ｋｂのメッセージは、大部分の細胞が増殖しない苗条（ｓｈｏｏ
ｔ）および葉から調製したＲＮＡと共に、根分裂組織および増殖している懸濁培
養細胞から調製したＲＮＡに存在することが示された（図２）。本明細書に提示
される研究では、我々は、他のより遠くＥ２Ｆに関連している遺伝子が存在する
可能性を、完全には除外しきれない。これまでに、サザン解析により、コムギＥ
２Ｆが単一コピー遺伝子であることが、強く示唆されている。全長ＴｍＥ２Ｆ
ｃＤＮＡ挿入物を含むプラスミドで計画されたｉｎｖｉｔｒｏ転写・翻訳反応
は、およそ５８−６０ｋＤａの見かけの分子量に対応する移動度の主要な産物
を生じ（図２）、推定されるアミノ酸配列から予測されるよりわずかに大きい。

【００６１】ＴｍＥ２ＦｃＤＮＡクローンが動物相対物に相同な植物Ｅ２Ｆタンパク質を
コードするという見解は、植物Ｅ２Ｆのアミノ酸相同性およびドメイン構成の解
析により、補強される。ＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムで得られる対状の距離解析
に基づき、植物Ｅ２Ｆは、ヒトＥ２Ｆ−１（Ｈｅｌｉｎら、１９９２；Ｋａｅｌ
ｉｎら、１９９２；Ｓｈａｎら、１９９２）、Ｅ２Ｆ−２（Ｉｖｅｙ−Ｈｏｙｌ
ｅら、１９９３；Ｌｅｅｓら、１９９３）およびＥ２Ｆ−３（Ｌｅｅｓら、１９
９３）により形成されるサブセットと全体でおよそ２４．０−２７．５％アミノ
酸類似性を示し、Ｅ２Ｆ−４（Ｂｅｉｊｅｒｓｂｅｒｇｅｎら、１９９４；Ｇｉ
ｎｓｂｅｒｇら、１９９４；Ｓａｒｄｅｔら、１９９５）およびＥ２Ｆ−５（Ｓ
ａｒｄｅｔら、１９９５）とわずかに高い類似性（およそ２５．０−２９．８％
）を示し、そしてショウジョウバエＥ２Ｆ（Ｄｙｎｌａｃｈｔら、１９９４；Ｏ
ｈｔａｎｉら、１９９４）とはるかに低い類似性（１８．８％）を示す。

【００６２】植物および動物Ｅ２Ｆタンパク質のアミノ酸並列により、植物Ｅ２Ｆの類似の
ドメイン構成およびいくつかの特異的な特徴が明らかになった。最も保存される
ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインであるようであり、該ドメインは、すべてのメ
ンバーの間で非常に相同である（図３）。本ドメインは、完全に保存される１５
アミノ酸の伸長（残基１８２−１９６）を含み、該伸長は、保存されるｂＨＬＨ
ドメインの推定上のαへリックスの１つに対応する（Ｃｒｅｓｓら、１９９３）
。植物および動物Ｅ２Ｆタンパク質の間のかなりの度合いの保存はまた、特徴的
なロイシンジッパーモチーフ（残基２１９−２４０）を含む、ホモおよびヘテロ
二量体化ドメイン内にも見られた。しかし、本相同性解析に基づき、いくつかの
ヒトメンバーに特徴的である典型的なサイクリンＡボックスは、植物Ｅ２Ｆでは
明らかでなかった。同様に、ヒトＥ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２およびＥ２Ｆ−３に典
型的な核局在化シグナル（ＮＬＳ）は、植物Ｅ２Ｆの同じ位置に見られない。し
かし、ヒトＥ２ＦよりＮ末端の位に位置する、ＮＬＳとして作用する可能性があ
る短いアミノ酸伸長（残基７４−７６）が、植物Ｅ２Ｆに存在する（図３）。

【００６３】植物Ｅ２Ｆの興味深い特徴は、ヒトＥ２Ｆメンバーにおいてトランス活性化お
よびＲｂ結合ドメインを含む、該タンパク質のＣ末端の三分の一内の相同性が、
一次配列のレベルで非常に減少していることである。特に、ヒトＥ２ＦにＲｂ結
合能を与えるＣ末端１８アミノ酸の配列は、植物Ｅ２Ｆに存在しないが、植物Ｅ
２ＦのＣ末端残基は、Ｒｂ結合に必要とされる（以下を参照されたい）。しかし
、並列出力の手動調整により、すべての動物種のメンバーで完全に保存される動
物Ｅ２ＦのＲｂ結合モチーフに相同である可能性がある、植物Ｅ２Ｆにおける１
６アミノ酸モチーフ（ＹＸ₆ＤＸ₄ＤＭＷＥ；位４０７−４２２）の同定が可能に
なる。興味深いことに、必須のアミノ酸の間の同様の間隔の取り方と共にいくつ
かの必須の残基の酸性および疎水性性質の保存は、該配列が植物Ｅ２Ｆの最小Ｒ
ｂ結合モチーフに相当する可能性があるという我々の提案を強く支持する。実施例２：Ｅ２Ｆ／ＺｍＲｂ１相互作用に必要とされるタンパク質ドメイン植物Ｅ２ＦおよびＲｂの間の相互作用に関するアミノ酸必要条件を調べるため
、我々は、いくつかの一部切除したタンパク質を用い、酵母ツーハイブリッド解
析を行った。ヒトＲｂおよび関連タンパク質は、そのＡ７Ｂポケットドメインを
用い、Ｅ２Ｆファミリーメンバーに結合する（Ｌｅｅｓら、１９９３）。植物Ｒ
ｂにおいて植物Ｅ２Ｆと相互作用するのに必要なタンパク質ドメインを確かめる
ため、酵母細胞を、Ｇａｌ４ＡＤ−Ｅ２Ｆ融合タンパク質を発現するプラスミド
およびＧａｌ４ＢＤのみまたは植物Ｒｂのいくつかの一部切除型に融合している
Ｇａｌ４ＢＤを発現するプラスミドで、共形質転換した。細胞を、３−ＡＴを補
ったヒスチジンを含むまたは含まないプレート上で、図４に示されるように増殖
させた。ヒスチジンを欠くプレート上の増殖は、植物ＲｂおよびＥ２Ｆタンパク
質両方の存在および相互作用に完全に依存した。植物Ｒｂの１２５のＣ末端残基
の欠失（ＺｍＲｂ−ΔＣ２）は、タンパク質相互作用を顕著に減少させず、また
、Ａ／ＢポケットおよびＣ末端ドメインを含む一部切除Ｒｂタンパク質（ＺｍＲ
ｂ−ΔＮ）でも同様であった。Ａ／Ｂポケットのみ（ＺｍＲｂ１−ΔＮΔＣ２）
は相互作用を支持することが可能であったが、効率はわずかに減少した（図４）
。酵母共形質転換体のこれらの増殖特性は、β−ガラクトシダーゼ活性の発現と
よく相関した。

【００６４】Ｒｂ結合に関与する植物Ｅ２Ｆの領域を決定するため、同様の実験を行った。
ヒトＥ２Ｆにおいて、ポケットドメインはＣ末端残基に結合する（Ｓｌａｎｓｋ
ｙおよびＦａｒｎｈａｍ、１９９６に概説される）。一部切除植物Ｅ２Ｆ（２３
６−４５８）を発現する酵母共形質転換体は、ヒスチジンの非存在下で増殖する
ことが可能であった（図４）。しかし、Ｃ末端残基の除去（ＴｍＥ２Ｆ２３６
−３７３）は、ヒスチジンの非存在下での増殖を可能にしなかった（図４）。こ
れは、植物Ｅ２ＦのＣ末端ドメインがＲｂ結合モチーフを含むことを示す。さら
に、植物Ｅ２Ｆ−Ｒｂ相互作用に関与するこれらのＣ末端残基は、本研究で同定
された１６アミノ酸モチーフを含む（図３の並列を参照されたい）。要するに、
これらの研究により、植物Ｅ２Ｆは転写因子のＥ２Ｆファミリーの新規メンバー
に相当し、異なるタンパク質ドメインで、いくつかの度合いのアミノ酸保存を認
めることが可能であることが結論付けられる。実施例３：植物Ｅ２Ｆ：ドメイン構成および特性植物およびヒトＥ２Ｆタンパク質のドメイン構成の比較を図５に示す。

【００６５】ＤＮＡ結合ドメイン突然変異解析に基づき、ヒトＥ２Ｆ−１は、元来、塩基性へリックス・ループ
・へリックス（ｂＨＬＨ）タンパク質として記載された（Ｃｒｅｓｓら、１９９
３）。植物Ｅ２ＦのＤＮＡ結合ドメイン（残基１４６−２０９）は、哺乳動物Ｅ
２Ｆメンバーだけでなく、ショウジョウバエＥ２Ｆでも、該タンパク質の最も保
存された領域である。この高い度合いの保存に基づいた１つの予測は、植物Ｅ２
Ｆがコンセンサス・ヒトＥ２Ｆ結合部位（ＴＴＴ（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｇ）ＣＧ（Ｃ
／Ｇ）；Ｃｏｂｒｉｎｉｋ、１９９６に概説される）と非常によく似たＤＮＡ配
列に結合するはずであるというものである。クローン化され、そして配列決定さ
れている植物プロモーターの中で、Ｅ２Ｆコンセンサス結合配列は、ニコティア
ナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）のリボヌクレオチドレダ
クターゼ遺伝子に見出されてた（Ｃ．Ｇｉｇｏｔ、私信）。

【００６６】Ｒｂ結合モチーフ植物Ｅ２Ｆの１つの際立った特徴は、すべての動物Ｅ２Ｆにおける、他のドメ
イン、例えばＤＮＡ結合ドメインの高い相同性と比較して、Ｒｂ結合モチーフを
含む、Ｃ末端領域のアミノ酸類似性が低いことである。比較的高い比率の酸性残
基を含む、ヒトＥ２Ｆ−１のＣ末端ドメインにおけるアミノ酸４０９−４２６は
、Ｒｂに結合するのに十分であり、そしてこの短い領域内の点突然変異は、ヒト
Ｅ２Ｆ−１がＲｂと関連する能力を劇的に修飾することが見出されてきている（
Ｃｒｅｓｓら、１９９３；Ｈｅｌｉｎら、１９９３）。これらの中で、すべての
動物Ｅ２Ｆで完全に保存され（図３も参照されたい）、ヒト細胞におけるＲｂに
対するＥ２Ｆ−１結合に必須であることが示されてきている（Ｓｈａｎら、１９
９６）、１６アミノ酸モチーフ（ＹＸ₇ＥＸ₃ＤＬＦＤ）（ヒトＥ２Ｆ−１におけ
る位４１１ないし４２６）を見出すことが可能である。植物Ｅ２Ｆは１６アミノ
酸モチーフ（ＹＸ₆ＤＸ₄ＤＭＷＥ；位４０７−４２２）を含む。興味深いことに
、必須のアミノ酸の間の同様の間隔の取り方と共に酸性および疎水性残基の保存
は、該配列が植物Ｒｂに対する結合を指示するという我々の提案を強く支持する
。

【００６７】植物Ｅ２Ｆの推定上のＮＬＳヒトＥ２Ｆの転写活性は、細胞レベル以下の局在における変化により、精巧に
制御されているようであることが最近示されてきている（Ｖｅｒｏｎａら、１９
９７）。実際、Ｅ２Ｆ−１、２および３は、Ｅ２Ｆ−４にはない、短いアミノ酸
伸長を含み、該伸長は局在化シグナル（ＮＬＳ）として作用し、そしてｃ−ｍｙ
ｃのものと関連する（ＤａｎｇおよびＬｅｅ、１９８８）。植物Ｅ２Ｆはこうし
たコンセンサス配列を含まない。したがって、植物Ｅ２Ｆは他のパートナータン
パク質により、核に移動されると推測することが可能である。あるいは、異なる
ＮＬＳが植物Ｅ２Ｆに存在している可能性がある。実際、残基６９ないし８１（
ＲＴＲＱＬＫＲＫＡＴＲＥＥ）を含む植物Ｅ２Ｆの領域は、ＮＬＳとして作用す
る可能性がある。トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）Ｒｂが大部分核に局在することが
示されてきていることを言及するのは重要である（Ａｃｈら、１９９７）。トウ
モロコシＲｂには明確なＮＬＳが明らかでないため、Ｅ２ＦＮＬＳがＲｂ／Ｅ
２Ｆ複合体において、植物細胞の核へ、Ｒｂを標的化すると考えられる可能性が
ある。本複合体からＥ２Ｆを除くことは、核からＲｂを除く、制御法である可能
性がある。ここで、これが遺伝子のＲｂ抑制を避ける方法であることが提案され
る。

【００６８】材料および方法ＤＮＡ操作およびプラスミド構築標準的なＤＮＡ操作技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，
Ｅ．Ｆ．＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ニューヨー
ク州コールドスプリングハーバーに記載されるように適用した。

【００６９】ＤＮＡ配列決定は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ３７３Ａ装置を用
い、行った。オリゴヌクレオチドは、ＩｓｏｇｅｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＢ
Ｖ（オランダ・マーセン）から得た。プラスミドｐＧＢＴ−ＺｍＲｂ１は、Ｚｍ
Ｒｂ１ｃＤＮＡ（１５）をｐＧＢＴ８のＧａｌ４^BDに同一読み枠でクローン化
することにより、ｐＧＢＴ−ＺｍＲｂ１ΔＣ２（１−５５８）はｐＧＢＴ−Ｚｍ
Ｒｂ１のＭｓｃＩ−ＸｈｏＩ断片を欠失させることにより、そしてｐＧＢＴ−Ｚ
ｍＲｂ１ΔＮΔＣ２（６９−５５８）はｐＧＢＴ−ＺｍＲｂ１ΔＮのＭｓｃＩ−
ＸｈｏＩ断片を欠失させることにより、構築した。プラスミドｐＧＢＴ−ＺｍＲ
ｂ１ΔＮ（６９−６８３）は、ＺｍＲｂ１のＮ末端欠失を含む。プラスミドｐＧ
ＡＤＴｍＥ２Ｆ（２３６−４５８）は、スクリーニングにおいて単離された部分
的クローンであり、そしてｐＧＡＤＴｍＥ２Ｆ（２３６−３７３）は、ＳｓｐＩ
−ＸｈｏＩ断片を欠失させることにより、作成した。ｉｎｖｉｔｒｏ転写・翻
訳には、全長ＴｍＥ２ＦｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋にクローン
化した。それぞれヒトＥ２Ｆ−１およびＥ２Ｆ−５を含む、プラスミドｐＧＡＤ
Ｅ２Ｆ−１およびｐＧＡＤＥ２Ｆ−５は、Ｎ．ＬａＴｈａｎｇｕｅおよびＳ．
ｄｅｌａＬｕｎａにより提供され、そしてプラスミドｐ１３０Ｒｂｒ２（
２０）およびｐＧＴ−ＲＢ（２１）はＭ．Ｓｅｒｒａｎｏにより提供された。

【００７０】コムギ培養細胞由来の酵母ツーハイブリッドｃＤＮＡライブラリーの構築コムギ懸濁培養細胞から単離された５マイクログラムのポリ（Ａ）⁺ ｍＲＮ
Ａを、製造者の指示にしたがい、ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
を用い、ｃＤＮＡ合成のための基質として使用した。ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ
末端を含む、生じた二本鎖ＤＮＡは、１．３ｋｂの平均の大きさを有した。本
ｃＤＮＡの試料（５００ｎｇ）を７５０ｎｇのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化ｐ
ＧＡＤ−ＧＨベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に、８℃で４８時間、連結した。連
結後、ライブラリーを再蒸留水に対して透析し、そして大腸菌ＤＨ１０Ｂ（Ｇｉ
ｂｃｏ）にエレクトロポレーションした。初代の形質転換体を、アンピシリンを
加えた５０枚の１５０ｍｍＬＢプレートに蒔くことにより、トータルライブ
ラリーＤＮＡを得た。コロニーをＬＢ（＋Ａｍｐ）培地に掻き取り、そしてプラ
スミドＤＮＡをＳａｍｂｒｏｏｋに記載されるように調製した。

【００７１】酵母ツーハイブリッドスクリーニング酵母株ＨＦ７ｃ（ＭＡＴａｕｒａ３−５２ｈｉｓ３−２００ａｄｅ２−
１０１ｌｙｓ２−８０１ｔｒｐ１−９０１ｌｅｕ２−３，１１２ｇａｌ
４−５４２ｇａｌ８０−５３８ＬＹＳ２：：ＧＡＬ１_UAS−ＧＡＬ１_TATA−
ＨＩＳ３ＵＲＡ３：：ＧＡＬ４₁₇マー_(x3)−ＣｙＣ１_TATA−ＬａｃＺ；Ｆｅｉｌｏｔｔｅｒら１９９４、２つのレポーター遺伝子ＬａｃＺおよびＨＩＳ３を含
む）をツーハイブリッドスクリーニングに用いた。酵母をまず、ｐＧＢＴ８ベク
ターにおいて、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメイン（ＢＤ；ＴＲＰ１マーカー）に融
合しているトウモロコシＲｂタンパク質（Ｘｉｅら、１９９６）を含むプラスミ
ド、ｐＧＢＴＺｍＲｂ１で形質転換した。その後、酵母をｐＧＡＤ−ＧＨ（ＡＤ
；ＬＥＵ２マーカー）コムギｃＤＮＡライブラリーで形質転換した。形質転換混
合物を、偽陽性増殖コロニーの出現を減少させるため、トリプトファン、ロイシ
ンおよびヒスチジンを欠き、そして５ｍＭおよび１０ｍＭ３−アミノ−１
，２，４，トリアゾール（３−ＡＴ）を補った酵母脱落選択培地上に蒔いた。形
質転換体を３ないし８日の期間、日常的に回収し、そして２０ｍＭまでの３−
ＡＴの存在下で増殖に関し調べた。２つの融合タンパク質の間の相互作用を確認
するため、記載されるようなレプリカフィルターアッセイにより、β−ガラクト
シダーゼ活性をアッセイした。大腸菌ＭＨ４はｌｅｕＢ^-であり、そしてその欠
損を、ｐＧＡＤ−ＧＨプラスミドに存在するＬＥＵ２遺伝子により補うことが可
能であるため、該株を形質転換することにより、陽性コロニーからプラスミドＤ
ＮＡを回収した。

【００７２】ＧＳＴ融合タンパク質の精製並びにｉｎｖｉｔｒｏ転写および翻訳大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体を０．６−０．９のＯＤ₆₀₀まで増殖さ
せ、そして１ｍＭＩＰＴＧで誘導した。グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い、ＧＳＴ融合タンパク質を精製した。ＴＮ
Ｔキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いることにより、³⁵Ｓ−メチオニン標識ＴｍＥ
２Ｆタンパク質を得た。

【００７３】コムギ細胞培養トリティクム・モノコックム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ）懸
濁培養（Ｐ．Ｍ．Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ；ＪｏｈｎＩｎｎｅｓＣｅｎｔｒ
ｅ、英国）は記載されるように維持した（１３）。細胞は、１０ｍＭのヒドロ
キシ尿素（ＨＵ）で４８時間同調させた。

【００７４】ノーザンおよびサザン解析１０マイクログラムの総コムギ細胞ＲＮＡを変性させ、２．２Ｍホルムア
ルデヒドを加えた１．２％アガロースゲル中で分画化し、そしてＺｅｔａ−Ｐｒ
ｏｂｅ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。ＴｍＥ２Ｆ（ｎｔ９３５−１６３５）
およびコムギヒストンＨ４（ＸｉｅおよびＧｕｔｉｅｒｒｅｚ、未公表）プロー
ブを、ランダムプライミングにより、α−³²Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、そしてハイ
ブリダイゼーションのため混合した。１０μｇのゲノムコムギＤＮＡを示される
酵素で消化し、０．８％アガロースゲル中で分画化し、ＢｉｏＤｙｎｅ（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ）膜に移し、そしてＳａｍｂｒｏｏｋらに記載されるように探査した
（ｐｒｏｂｅｄ）。実施例４：植物Ｅ２Ｆタンパク質に特異的に結合する抗体の産生植物Ｅ２Ｆタンパク質に特異的に結合することが可能なポリクローナル抗体は
、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中で２３６−４５８Ｃ末端断片を用いＧＳＴ融合物を
産生することにより、提供された。該融合物を大腸菌で過剰発現させ、そしてグ
ルタチオンビーズカラム上で精製した。標準的な免疫化プロトコルを用い、ラッ
トに１日目および１４日目に注射し、そしてこれらから得られた血清をポリクロ
ーナル試薬として用いた。本血清は、ウェスタンブロット目的に１／１０００希
釈で使用することが可能であった（ＭａｎｕａｌｏｆＡｎｔｉｂｏｄｙＰ
ｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ
の標準法を参照されたい）。参考文献−本明細書に援用される

【００７５】

【表１】

【００７６】

【００７７】

【００７８】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｅ２Ｆタンパク質をコードするコムギｃＤＮＡのＤＮＡ配列およ
び推定されるアミノ酸配列。

【図２】コムギＥ２ＦをコードするｍＲＮＡを同定するためのノーザン解
析。

【図３】ヒトおよびショウジョウバエＥ２Ｆタンパク質とコムギＥ２Ｆの
アミノ酸並列。

【図４】酵母ツーハイブリッド解析による植物網膜芽腫タンパク質（Ｚｍ
Ｒｂ１）および植物Ｅ２Ｆタンパク質の間の相互作用。

【図５】ヒトＥ２Ｆ−１およびコムギＥ２Ｆタンパク質のドメイン構成。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ラミレスパルラ，エレーナスペイン国エ−28049 マドリード，セエセイセ−ウアエメ，セントゥロ・デ・ビオロヒア・モレクラル

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】植物成長および／または細胞ＤＮＡ複製および／または細
胞周期進行、分化および発生を調節する方法であって、植物細胞における組換え
植物Ｅ２Ｆペプチドまたはタンパク質の発現を通じ、その細胞におけるＥ２Ｆ活
性を増加させるまたは減少させることを含む、前記方法。
【請求項２】Ｅ２Ｆ活性が、（ｉ）植物網膜芽腫タンパク質に結合する
能力および（ｉｉ）植物ＤＮＡにおけるＥ２Ｆ転写因子結合部位に結合する能力
の１つまたは両方を含むことで特徴付けられる、請求項１に請求されるような方
法。
【請求項３】植物Ｅ２Ｆタンパク質レベル、細胞レベル以下の局在、Ｅ
２ＦＤＮＡ結合活性、Ｅ２Ｆタンパク質−タンパク質結合活性、Ｅ２Ｆトラン
ス活性化特性、および／またはＥ２Ｆ−Ｒｂ結合活性を改変することを含むこと
で特徴付けられる、請求項１に請求されるような方法。
【請求項４】植物Ｅ２Ｆが単独でおよび／または植物Ｒｂのレベルまた
は活性の修飾と組み合わせて修飾されることで特徴付けられる、請求項１ないし
３のいかなる１つでもよい請求項に請求されるような方法。
【請求項５】細胞の形状を改変することで特徴付けられる、先行する請
求項のいかなる１つでもよい請求項に請求されるような方法。
【請求項６】植物細胞または植物器官の大きさを増加させるように、細
胞増殖特性を改変することで特徴付けられる、先行する請求項のいかなる１つで
もよい請求項に請求されるような方法。
【請求項７】他のタンパク質の発現を増加させるまたは減少させること
で特徴付けられる、先行する請求項のいかなる１つでもよい請求項に請求される
ような方法。
【請求項８】単離され、濃縮されている、細胞不含および／または組換
え的に産生されたタンパク質またはペプチドであって、（ｉ）植物網膜芽腫タン
パク質に結合する能力および（ｉｉ）植物ＤＮＡにおけるＥ２Ｆ転写因子結合部
位に結合する能力から選択される、１つまたは両方の植物Ｅ２Ｆ活性を有するこ
とで特徴付けられる、ここで該タンパク質またはペプチドは、配列番号６の以下のドメイン：（ａ）ＴｙｒＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＡｓｐＸ
ａａＸａａＸａａＸａａＡｓｐＭｅｔＴｒｐＧｌｕ（ｂ）ＧｌｎＬｙｓＡｒｇＡｒｇＩｌｅＴｙｒＡｓｐＩｌｅＴ
ｈｒＡｓｎＶａｌＬｅｕＧｌｕＧｌｙＩｌｅＸａａＬｅｕＩ
ｌｅＧｌｕＬｙｓＸａａＸａａＬｙｓＡｓｎＸａａＩｌｅＡ
ｒｇＴｒｐから選択される１つまたは両方のアミノ酸配列を含む、但し該ペプチドまたはタンパク質がドメイン（ｂ）のみを含む場合、該ペプチド
またはタンパク質は、配列番号６のアミノ酸１−４０６の隣接する配列の少なく
とも５０％を含む、前記タンパク質またはペプチド。
【請求項９】配列（ｃ）ＬｅｕＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＸａａＬｅｕＸ
ａａＸａａＧｌｕＸａａＸａａＸａａＬｅｕＸａａＸａａＸ
ａａＧｌｕＸａａＸａａＬｅｕＡｓｐを含むことでさらに特徴付けられる、請求項８に請求されるようなペプチドまた
はタンパク質。
【請求項１０】１６ないし１００アミノ酸であることで特徴付けられる
、請求項８または請求項９に請求されるようなペプチドまたはタンパク質。
【請求項１１】配列番号２またはその機能する変異体のアミノ酸配列を
含むことで特徴付けられる、請求項８ないし１０のいかなる１つでもよい請求項
に請求されるようなペプチドまたはタンパク質。
【請求項１２】配列番号６のものであるが、アミノ酸配列配列番号２が
、Ｒｂタンパク質に結合する能力が配列番号２の天然配列のものより減少し、ま
たは完全に失われ、それにより該ペプチドがＲｂ結合に制限されることなく、Ｅ
２Ｆタンパク質として作用することが可能であるように、突然変異するように、
修飾されていることで特徴付けられる、請求項８ないし１１のいかなる１つでも
よい請求項に請求されるようなペプチドまたはタンパク質。
【請求項１３】さらに、配列ＡｒｇＴｈｒＧｌｎＬｅｕＬｙｓＡｒｇＬｙｓＡｌａＴｈｒ
ＡｒｇＧｌｕＧｌｕである配列番号７、または核局在化シグナル（ＮＬＳ）として機能する活性を有
する、その機能する変異体の配列を含むことで特徴付けられる、先行するいかな
る請求項でもよい請求項に請求されるようなペプチドまたはタンパク質。
【請求項１４】配列番号７のＮＬＳが、該ペプチドが核に局在しないよ
うに修飾されている、先行する請求項のいかなる１つでもよい請求項に請求され
るようなペプチド。
【請求項１５】配列番号６の植物Ｅ２Ｆのアミノ酸残基１４６−２０６
またはその機能する同等物の配列である、ＤＮＡ結合ドメインを含むことで特徴
付けられる、先行する請求項８ないし１４のいかなる１つでもよい請求項に請求
されるようなペプチド。
【請求項１６】配列ＴＴＴ（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｇ）
（Ｃ／Ｇ）のＥ２ＦＤＮＡ結合部位に結合することで特徴付けられる、請求項
８ないし１５のいかなる１つでもよい請求項に請求されるようなペプチド。
【請求項１７】配列番号８ないし１６のいかなる１つでもよい請求項に
記載されるようなペプチドまたはタンパク質の発現をコードする配列またはそれ
に相補的な配列を含む、単離され、濃縮されている、細胞不含および／または組
換え核酸。
【請求項１８】配列番号３またはそれに相補的な配列を含む、植物Ｅ２
Ｆペプチドまたはタンパク質あるいはその機能する変異体をコードすることで特
徴付けられる、請求項１６に請求されるような核酸。
【請求項１９】配列番号５のＤＮＡまたはＲＮＡあるいはそれに相補的
な配列を含む、請求項１７または１８に請求されるような核酸。
【請求項２０】ｃＤＮＡを含むことで特徴付けられる、請求項１７ない
し１９のいかなる１つでもよい請求項に請求されるような核酸。
【請求項２１】所望によりプロモーター、エンハンサーまたは停止配列
を共に含むが、他の遺伝子コード領域を含まない、配列番号３または５を含むこ
とで特徴付けられる、請求項１９に請求されるような核酸。
【請求項２２】配列番号５の配列から取られる１０またはそれ以上の隣
接するヌクレオチドに対応する配列の二本鎖または一本鎖ＤＮＡ、但しアミノ酸
配列ＧｌｎＬｙｓＡｒｇＡｒｇＩｌｅＴｙｒＡｓｐＩｌｅＴｈｒ
ＡｓｎＶａｌＬｅｕＧｌｕＧｌｙＩｌｅＸａａＬｅｕＩｌｅ
ＧｌｕＬｙｓＸａａＸａａＬｙｓＡｓｎＸａａＩｌｅＡｒｇ
Ｔｒｐをコードするものから選択されない、前記ＤＮＡを含む、核酸プローブまたはプ
ライマー。
【請求項２３】請求項１６ないし２０のいかなる１つでもよい請求項に
請求されるような核酸を含む、またはそのアンチセンス核酸配列を含む、核酸ベ
クターまたは構築物。
【請求項２４】請求項１６ないし２０のいかなる１つでもよい請求項に
請求されるような組換え核酸を含む、植物細胞。
【請求項２５】請求項１６ないし２０のいかなる１つでもよい請求項に
請求されるような、天然植物Ｅ２Ｆの発現を下方制御することが可能な、植物Ｅ
２Ｆ発現核酸に対するアンチセンス核酸を含む、植物細胞。
【請求項２６】先行する請求項のいかなる１つでもよい請求項に請求さ
れるような、ペプチド、タンパク質、組換え核酸、ベクターまたは構築物を含む
、トランスジェニック植物またはその一部。
【請求項２７】Ｅ２Ｆタンパク質を異所性に発現する、天然Ｅ２Ｆタン
パク質に対する植物Ｒｂタンパク質の結合を阻害するＥ２Ｆタンパク質またはペ
プチド、あるいは植物Ｒｂタンパク質の影響に耐性であるＥ２Ｆタンパク質を発
現することで特徴付けられる、トランスジェニック植物。
【請求項２８】Ｅ２Ｆが配列番号６のものまたはその機能する変異体で
あることで特徴付けられる、請求項２５に請求されるような植物。
【請求項２９】請求項１７ないし２３のいかなる１つでもよい請求項に
請求されるような核酸を、植物細胞に導入することを含むことで特徴付けられる
、植物または植物細胞または植物の一部を産生する方法。
【請求項３０】請求項８ないし１６のいかなる１つでもよい請求項に請
求されるようなペプチドまたはタンパク質に結合することで特徴付けられる抗体
。