JP2001515722A - 植物細胞周期蛋白質を調節する方法および手段ならびに植物細胞増殖の制御におけるそれらの使用 - Google Patents
植物細胞周期蛋白質を調節する方法および手段ならびに植物細胞増殖の制御におけるそれらの使用Info
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Abstract
(57)【要約】
細胞周期相互作用蛋白質をコードするDNA配列と共にそれを得る方法を提供する。さらに、原核および／または真核宿主細胞において発現を可能にする調節エレメントに機能的に結合しているDNA配列を含むベクターについて記述する。さらに、該DNA配列によってコードされる蛋白質、該蛋白質に対する抗体およびそれらを産生する方法を提供する。同様に、植物またはその一部において機能的である一つ以上の細胞周期調節蛋白質、および／またはそのような蛋白質をコードする一つ以上のDNA配列の組み込みおよび／または発現を含む植物および／または植物細胞の生長特徴を制御または変化させる方法についても記述する。同様に、該植物細胞がトランスジェニック植物の一部である、本発明のDNA配列を用いてサイクリン依存的蛋白質キナーゼの基質の発現を妨害することによって、植物細胞分裂を破壊する方法も提供する。前記DNA配列、蛋白質および抗体を含む診断的組成物についてさらに記述する。細胞周期を活性化または阻害することができる化合物を同定する方法についても記述する。さらに、トランスジェニック植物細胞、植物組織、ならびに上記DNA配列およびベクターを含む植物を、上記DNA配列、ベクター、蛋白質、抗体および／または本発明の方法によって同定された化合物を、植物細胞および組織の培養、植物の育種および／または農業に使用することについても記述する。
Description
【０００１】 本発明は細胞周期相互作用蛋白質をコードするDNA配列と共に、それを得る方 法に関する。本発明はまた、原核および／または真核宿主細胞において発現を可
能にする調節エレメントに機能的に結合しているDNA配列を含むベクターを提供 する。さらに、本発明は該DNA配列によってコードされる蛋白質、該蛋白質に対 する抗体およびそれらの製造法にも関する。本発明はまた、植物もしくはその一
部において機能的である一つ以上の細胞周期調節蛋白質および／またはそのよう
な蛋白質をコードする一つ以上のDNA配列の組み込みおよび／または発現を含む 、植物および／または植物細胞の増殖特徴を制御もしくは変化させる方法にも関
する。同様に、植物細胞がトランスジェニック植物の一部である、本発明のDNA 配列を用いてサイクリン依存的蛋白質キナーゼの基質の発現を妨害することによ
って、植物細胞分裂を破壊する方法についても提供する。本発明はさらに、前記
DNA配列、蛋白質および抗体を含む診断的組成物にも関する。本発明は、細胞周 期を活性化または阻害することができる化合物を同定する方法にも関する。さら
に、前記DNA配列およびベクターを含むトランスジェニック植物細胞、植物組織 および植物と共に、前記DNA配列、ベクター、蛋白質、抗体および／または本発 明の方法によって同定された化合物を、植物細胞および組織の培養、植物の育種
および／または農業において使用することに関する。
能にする調節エレメントに機能的に結合しているDNA配列を含むベクターを提供 する。さらに、本発明は該DNA配列によってコードされる蛋白質、該蛋白質に対 する抗体およびそれらの製造法にも関する。本発明はまた、植物もしくはその一
部において機能的である一つ以上の細胞周期調節蛋白質および／またはそのよう
な蛋白質をコードする一つ以上のDNA配列の組み込みおよび／または発現を含む 、植物および／または植物細胞の増殖特徴を制御もしくは変化させる方法にも関
する。同様に、植物細胞がトランスジェニック植物の一部である、本発明のDNA 配列を用いてサイクリン依存的蛋白質キナーゼの基質の発現を妨害することによ
って、植物細胞分裂を破壊する方法についても提供する。本発明はさらに、前記
DNA配列、蛋白質および抗体を含む診断的組成物にも関する。本発明は、細胞周 期を活性化または阻害することができる化合物を同定する方法にも関する。さら
に、前記DNA配列およびベクターを含むトランスジェニック植物細胞、植物組織 および植物と共に、前記DNA配列、ベクター、蛋白質、抗体および／または本発 明の方法によって同定された化合物を、植物細胞および組織の培養、植物の育種
および／または農業において使用することに関する。
【０００２】 細胞分裂は、ヒト、動物および植物の成長にとって必須である。2つの娘細胞 に分裂する前に、母細胞はそのDNAを複製する必要がある。細胞周期は、通常4つ
の段階に区分される。 G1：有糸分裂とDNA合成の開始時期との間隙期 S ：DNA合成の段階 G2：S期と有糸分裂期との間隙期 M ：核分裂から実際の細胞分裂に到る過程である有糸分裂の段階
の段階に区分される。 G1：有糸分裂とDNA合成の開始時期との間隙期 S ：DNA合成の段階 G2：S期と有糸分裂期との間隙期 M ：核分裂から実際の細胞分裂に到る過程である有糸分裂の段階
【０００３】 これらの4つの段階を区別することは、連続的な分裂期間を分割するために便 利である。ある目的にはこれらは有用であったが、主に癌の研究によって得られ
た最近の実験結果によって、これらは細胞周期の「四季」というよりも、より複
雑な状況であることが明らかになってきた。(Nasmyth, Science 274, 1643-1645
, 1996; Nurse, Nature 344, 503-508, 1990)。細胞周期の制御システムを制御 する基礎機構が詳細に研究されるようになったのは、最近のことである。植物を
含むすべての真核生物系では、この制御機構はタンパク質キナーゼ（サイクリン
依存性キナーゼまたはCDK）およびそれらの活性化に関連するサブユニットであ るサイクリンと呼ばれる、細胞分裂の基本プロセスを調節する鍵となる2つのタ ンパク質ファミリーに基づいている。これらのタンパク質複合体の活性は、細胞
周期の特定の時点でオンおよびオフの切替が行われる。G1/Sの移行期に活性化さ
れる特定のCDK-サイクリン複合体は、DNA複製を開始させる。G2/Mの移行期には 別のCDK-サイクリン複合体が活性化され、細胞分裂に到る有糸分裂を誘導する。
各々のCDK-サイクリン複合体は複数の標的タンパク質の様々な組み合わせを調節
することによって、その調節機能を発揮する。さらに、細胞分裂に影響を与える
多種多様の発生および環境シグナルが、すべてCDK活性の調節に収束する。した がって、CDKは細胞分裂を推進する中心的な駆動力と考えられる。
た最近の実験結果によって、これらは細胞周期の「四季」というよりも、より複
雑な状況であることが明らかになってきた。(Nasmyth, Science 274, 1643-1645
, 1996; Nurse, Nature 344, 503-508, 1990)。細胞周期の制御システムを制御 する基礎機構が詳細に研究されるようになったのは、最近のことである。植物を
含むすべての真核生物系では、この制御機構はタンパク質キナーゼ（サイクリン
依存性キナーゼまたはCDK）およびそれらの活性化に関連するサブユニットであ るサイクリンと呼ばれる、細胞分裂の基本プロセスを調節する鍵となる2つのタ ンパク質ファミリーに基づいている。これらのタンパク質複合体の活性は、細胞
周期の特定の時点でオンおよびオフの切替が行われる。G1/Sの移行期に活性化さ
れる特定のCDK-サイクリン複合体は、DNA複製を開始させる。G2/Mの移行期には 別のCDK-サイクリン複合体が活性化され、細胞分裂に到る有糸分裂を誘導する。
各々のCDK-サイクリン複合体は複数の標的タンパク質の様々な組み合わせを調節
することによって、その調節機能を発揮する。さらに、細胞分裂に影響を与える
多種多様の発生および環境シグナルが、すべてCDK活性の調節に収束する。した がって、CDKは細胞分裂を推進する中心的な駆動力と考えられる。
【０００４】 動物系および酵母における細胞周期の調節に関する理解は、現在では非常に進
んでいる。CDK-サイクリン複合体の活性は、5つのレベルで調節されている：(i)
CDKおよびサイクリン遺伝子の転写；(ii) 特定のCDKとその特定のサイクリンパ
ートナーとの会合；(iii) CDKおよびサイクリンのリン酸化/脱リン酸化；(iv) S
UC1/CKS1ホモログおよび細胞周期キナーゼ阻害因子(CKI)のような他の調節タン パク質との相互作用；および(v) 細胞周期の段階に依存したサイクリンおよびCK
Iの破壊。
んでいる。CDK-サイクリン複合体の活性は、5つのレベルで調節されている：(i)
CDKおよびサイクリン遺伝子の転写；(ii) 特定のCDKとその特定のサイクリンパ
ートナーとの会合；(iii) CDKおよびサイクリンのリン酸化/脱リン酸化；(iv) S
UC1/CKS1ホモログおよび細胞周期キナーゼ阻害因子(CKI)のような他の調節タン パク質との相互作用；および(v) 細胞周期の段階に依存したサイクリンおよびCK
Iの破壊。
【０００５】 植物における細胞周期の調節の研究は、動物や酵母よりも遅れていた。細胞周
期の制御の基礎的機構には、植物を含む真核生物間で保存されているようなもの
もある。植物もCDK、サイクリン、およびCKIを持つことが示されている。しかし
、植物は発生において独特の特徴を持っており、これは細胞周期の制御の特異的
特徴として反映されている。これらには、例えば細胞の移動の欠如、分裂組織と
呼ばれる特殊化した領域から、寿命全体を通して器官が形成されること、細胞壁
の形成、および非分裂細胞が細胞周期に戻る能力などがある。もう一つの特異的
な特徴は、特に貯蔵（例えば内乳（endosperm））に関わる多くの植物細胞は、 有糸分裂なしにDNA合成が繰り返されるために、倍数体であるということである 。このいわゆる核内倍加は、細胞周期の制御と密接に関係している。
期の制御の基礎的機構には、植物を含む真核生物間で保存されているようなもの
もある。植物もCDK、サイクリン、およびCKIを持つことが示されている。しかし
、植物は発生において独特の特徴を持っており、これは細胞周期の制御の特異的
特徴として反映されている。これらには、例えば細胞の移動の欠如、分裂組織と
呼ばれる特殊化した領域から、寿命全体を通して器官が形成されること、細胞壁
の形成、および非分裂細胞が細胞周期に戻る能力などがある。もう一つの特異的
な特徴は、特に貯蔵（例えば内乳（endosperm））に関わる多くの植物細胞は、 有糸分裂なしにDNA合成が繰り返されるために、倍数体であるということである 。このいわゆる核内倍加は、細胞周期の制御と密接に関係している。
【０００６】 このような基本的な差異のために、植物の細胞周期に関わる成分には、酵母お
よび動物と比較して独特のものがいくつもある。例えば植物には、アラビドプシ
ス（Arabidopsis：シロイヌナズナ）のCDC2bのような、構造的にも機能的にも動
物および酵母のCDKとは異なる独特のクラスのCDKが含まれている。
よび動物と比較して独特のものがいくつもある。例えば植物には、アラビドプシ
ス（Arabidopsis：シロイヌナズナ）のCDC2bのような、構造的にも機能的にも動
物および酵母のCDKとは異なる独特のクラスのCDKが含まれている。
【０００７】 植物における細胞周期の調節および他の真核細胞系との違いや類似性のさらな
る解明は、大きな研究課題である。厳密な比較の場合のために、酵母および動物
のシステムについて鍵となる要素を以下にさらに詳しく説明する。
る解明は、大きな研究課題である。厳密な比較の場合のために、酵母および動物
のシステムについて鍵となる要素を以下にさらに詳しく説明する。
【０００８】 上述のように、真核生物における細胞周期の進行の制御は、主として2つの移 行点において行われる。1つはG1後期でDNA合成の前、そしてもう1つはG2/Mの境 界である。これらの制御点を通過しての進行は、サイクリン依存性タンパク質キ
ナーゼ（CDK）複合体が仲介し、より詳しくいうと、この中にCDK遺伝子にコード
される約34 kDaの触媒サブユニットが含まれているのである。サッカロミセス? セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)および分裂酵母シゾサッカロミセス・ポ
ンベ(Schizosaccharomyces pombe)はいずれも、細胞周期の調節に1つのCDK遺伝 子しか利用していない。Sch.ポンベおよびS.セレビシエの遺伝子産物である、そ
れぞれp34CDC2およびp34CDC28のキナーゼの活性は、サイクリンと呼ばれる調節 タンパク質に依存している。p34CDC2/CDC28が順次、異なるサイクリンと会合す ることによって、異なる細胞周期の段階に進んでいくのである。高等真核生物に
おいてもこの調節機構が保存されているが、細胞周期の異なる段階の調節に複数
のCDKが使われるよう進化したために、状況はさらに複雑になっている。哺乳類 ではCDK1からCDK7と定義される7つのCDKが述べられており、各々特定のサイクリ
ンのサブセットに結合する。
ナーゼ（CDK）複合体が仲介し、より詳しくいうと、この中にCDK遺伝子にコード
される約34 kDaの触媒サブユニットが含まれているのである。サッカロミセス? セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)および分裂酵母シゾサッカロミセス・ポ
ンベ(Schizosaccharomyces pombe)はいずれも、細胞周期の調節に1つのCDK遺伝 子しか利用していない。Sch.ポンベおよびS.セレビシエの遺伝子産物である、そ
れぞれp34CDC2およびp34CDC28のキナーゼの活性は、サイクリンと呼ばれる調節 タンパク質に依存している。p34CDC2/CDC28が順次、異なるサイクリンと会合す ることによって、異なる細胞周期の段階に進んでいくのである。高等真核生物に
おいてもこの調節機構が保存されているが、細胞周期の異なる段階の調節に複数
のCDKが使われるよう進化したために、状況はさらに複雑になっている。哺乳類 ではCDK1からCDK7と定義される7つのCDKが述べられており、各々特定のサイクリ
ンのサブセットに結合する。
【０００９】 動物の系では、CDK活性はサイクリンとの会合で調節されるのみならず、刺激 性および抑制性のリン酸化も共に関与する。キナーゼ活性は、アミノ酸160〜170
（CDKタンパク質に依る）の間に存在するThr残基のリン酸化によって、正の調節
を受ける。このリン酸化は、興味深いことにCDK/サイクリン複合体自身であるCD
K活性化キナーゼ（CAK）が仲介する。抑制性のリン酸化は、ATP結合部位（高等 真核生物ではTyr15残基およびThr14）で起こり、少なくとも2つのタンパク質キ ナーゼによって実行される。特異的なホスファターゼCDC25は、G2/Mのチェック ポイントでこれらの残基を脱リン酸化し、CDK活性を活性化して、有糸分裂が開 始する。さらに、CDK活性は、CDK阻害因子（CKI）と呼ばれる主に低分子量のタ ンパク質からなるファミリーによって、負の調節を受ける。キナーゼ活性は、こ
れらのCKIとCDK/サイクリン複合体との強い会合によって阻害される。
（CDKタンパク質に依る）の間に存在するThr残基のリン酸化によって、正の調節
を受ける。このリン酸化は、興味深いことにCDK/サイクリン複合体自身であるCD
K活性化キナーゼ（CAK）が仲介する。抑制性のリン酸化は、ATP結合部位（高等 真核生物ではTyr15残基およびThr14）で起こり、少なくとも2つのタンパク質キ ナーゼによって実行される。特異的なホスファターゼCDC25は、G2/Mのチェック ポイントでこれらの残基を脱リン酸化し、CDK活性を活性化して、有糸分裂が開 始する。さらに、CDK活性は、CDK阻害因子（CKI）と呼ばれる主に低分子量のタ ンパク質からなるファミリーによって、負の調節を受ける。キナーゼ活性は、こ
れらのCKIとCDK/サイクリン複合体との強い会合によって阻害される。
【００１０】 植物における細胞周期の調節に関して、現在の技術水準を以下に要約する。ア
ラビドプシスでは、現在までにCDC2aAtおよびCDC2bAtという2つのCDK遺伝子のみ
が単離されており、これらの遺伝子産物は56％のアミノ酸の同一性を有している
。この2つのCDKは、いくつかの特徴によって区別される。まず、CDC2aAtのみが 酵母のp34CDC2/CDC28変異体に相補的である。第2に、CDC2aAtおよびCDC2bAtは異
なるサイクリン結合モチーフ（それぞれPSTAIREおよびPPTALRE）を有しており、
これらが異なるタイプのサイクリンに結合する可能性が示唆される。第3に、CDC
2aAtおよびCDC2bAtの空間的発現パターンは同じであるが、細胞周期の異なる段 階における特異的調節が見られる。CDC2aAt遺伝子は、細胞周期全体に渡って構 成的に発現される。対照的にCDC2bAtのmRNAレベルは変動し、S期およびG2期に最
も多くなる。また、アラビドプシスから複数のサイクリンが単離されている。大
部分は動物のＡおよびＢ型のクラスのサイクリンと強い配列類似性を示し、また
Ｄ型のサイクリンも同定されている。アラビドプシスのサイクリンの分類は、主
に配列の類似性に基づくものであるが、この分類が各サイクリンのクラスの異な
る機能に対応することを示唆するデータも、限られたものながら存在する。しか
しながら、任意のサイクリンがアラビドプシスのCDKサブユニットに直接結合す ることはまだ示されていない。
ラビドプシスでは、現在までにCDC2aAtおよびCDC2bAtという2つのCDK遺伝子のみ
が単離されており、これらの遺伝子産物は56％のアミノ酸の同一性を有している
。この2つのCDKは、いくつかの特徴によって区別される。まず、CDC2aAtのみが 酵母のp34CDC2/CDC28変異体に相補的である。第2に、CDC2aAtおよびCDC2bAtは異
なるサイクリン結合モチーフ（それぞれPSTAIREおよびPPTALRE）を有しており、
これらが異なるタイプのサイクリンに結合する可能性が示唆される。第3に、CDC
2aAtおよびCDC2bAtの空間的発現パターンは同じであるが、細胞周期の異なる段 階における特異的調節が見られる。CDC2aAt遺伝子は、細胞周期全体に渡って構 成的に発現される。対照的にCDC2bAtのmRNAレベルは変動し、S期およびG2期に最
も多くなる。また、アラビドプシスから複数のサイクリンが単離されている。大
部分は動物のＡおよびＢ型のクラスのサイクリンと強い配列類似性を示し、また
Ｄ型のサイクリンも同定されている。アラビドプシスのサイクリンの分類は、主
に配列の類似性に基づくものであるが、この分類が各サイクリンのクラスの異な
る機能に対応することを示唆するデータも、限られたものながら存在する。しか
しながら、任意のサイクリンがアラビドプシスのCDKサブユニットに直接結合す ることはまだ示されていない。
【００１１】 植物の成長、植物の構造、および/または植物の病気に関連する問題を総括処 理するために、植物の細胞分裂の調節に関与する植物遺伝子および遺伝子産物、
特に細胞周期および細胞周期のSおよびM期の終結を制御するCDKおよび/またはそ
れに相互作用するタンパク質をコードし、かつ相互作用する遺伝子および遺伝子
産物を同定、単離することが非常に重要だと考えられている。そのような新規の
遺伝子および/またはタンパク質が単離、分析されれば、植物全体の成長に影響 を与えることができる。特定の組織または器官の成長、そして植物の構造をも修
飾可能なのである。
特に細胞周期および細胞周期のSおよびM期の終結を制御するCDKおよび/またはそ
れに相互作用するタンパク質をコードし、かつ相互作用する遺伝子および遺伝子
産物を同定、単離することが非常に重要だと考えられている。そのような新規の
遺伝子および/またはタンパク質が単離、分析されれば、植物全体の成長に影響 を与えることができる。特定の組織または器官の成長、そして植物の構造をも修
飾可能なのである。
【００１２】 このように、本発明の基礎となる技術的問題は、農業ならびに植物細胞および
組織の培養において特に有用である、細胞周期蛋白質を調節する手段および方法
を提供することである。
組織の培養において特に有用である、細胞周期蛋白質を調節する手段および方法
を提供することである。
【００１３】 技術的問題の解決は、特許請求の範囲に特徴を記す態様を提供することによっ
て達成される。
て達成される。
【００１４】 したがって、本発明は、以下の配列からなる群より選択される、細胞周期相互
作用蛋白質または該蛋白質の免疫学的に活性な、および／または機能的な断片を
コードするDNA配列に関する： （a）配列番号：２に示すアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするヌクレオチド 配列を含むDNA配列； （b）配列番号：１に示すヌクレオチド配列を含むDNA配列； （c）（a）または（b）において定義したDNA配列の相補鎖とハイブリダイズし、
且つ（a）または（b）のDNA配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくと も80％同一であるアミノ酸配列をコードするDNA配列； （d）そのヌクレオチド配列が遺伝子コードの結果として（a）〜（c）のいずれ か一つに定義したようなDNA配列のヌクレオチド配列に対して縮重しているDNA配
列；および （e）（a）〜（d）のいずれか一つのDNA配列によってコードされる蛋白質の断片
をコードするDNA配列。
作用蛋白質または該蛋白質の免疫学的に活性な、および／または機能的な断片を
コードするDNA配列に関する： （a）配列番号：２に示すアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするヌクレオチド 配列を含むDNA配列； （b）配列番号：１に示すヌクレオチド配列を含むDNA配列； （c）（a）または（b）において定義したDNA配列の相補鎖とハイブリダイズし、
且つ（a）または（b）のDNA配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくと も80％同一であるアミノ酸配列をコードするDNA配列； （d）そのヌクレオチド配列が遺伝子コードの結果として（a）〜（c）のいずれ か一つに定義したようなDNA配列のヌクレオチド配列に対して縮重しているDNA配
列；および （e）（a）〜（d）のいずれか一つのDNA配列によってコードされる蛋白質の断片
をコードするDNA配列。
【００１５】 本明細書において用いられる「細胞周期相互作用蛋白質」という用語は、サイ
クリン依存的キナーゼ、特に植物サイクリン依存的キナーゼと結合することがで
きる蛋白質を意味する。「細胞周期」という用語は、細胞の増殖、特にDNAの複 製および分裂の調節に関連した周期的な生化学および構造的事象を意味する。周
期はG0、ギャップ1（G1）、DNA合成（S）、ギャップ2（G2）、および分裂（M） と呼ばれる期に分けられる。
クリン依存的キナーゼ、特に植物サイクリン依存的キナーゼと結合することがで
きる蛋白質を意味する。「細胞周期」という用語は、細胞の増殖、特にDNAの複 製および分裂の調節に関連した周期的な生化学および構造的事象を意味する。周
期はG0、ギャップ1（G1）、DNA合成（S）、ギャップ2（G2）、および分裂（M） と呼ばれる期に分けられる。
【００１６】 本明細書で使用される「遺伝子」「ポリヌクレオチド」「核酸配列」「ヌクレ
オチド配列」「DNA配列」または「核酸分子」と言う用語は、リボヌクレオチド またはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのポリマー型ヌクレ
オチドを指す。この用語は、分子の一次構造のみを指している。したがって、こ
の用語には二本鎖および一本鎖DNAならびにRNAが含まれる。また、例えばメチル
化、1つまたは複数の天然のヌクレオチドのアナログによる「キャップ」置換な どの既知のタイプの修飾も含まれる。好ましくは、本発明のDNA配列は、上記の 細胞周期相互作用蛋白質をコードするコード配列を含む。
オチド配列」「DNA配列」または「核酸分子」と言う用語は、リボヌクレオチド またはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのポリマー型ヌクレ
オチドを指す。この用語は、分子の一次構造のみを指している。したがって、こ
の用語には二本鎖および一本鎖DNAならびにRNAが含まれる。また、例えばメチル
化、1つまたは複数の天然のヌクレオチドのアナログによる「キャップ」置換な どの既知のタイプの修飾も含まれる。好ましくは、本発明のDNA配列は、上記の 細胞周期相互作用蛋白質をコードするコード配列を含む。
【００１７】 「コード配列」とは、適当な調節配列の制御下におかれると、mRNAに転写およ
び/またはポリペプチドに翻訳されるヌクレオチド配列である。コード配列の境 界は、5'末端の翻訳開始コドンおよび3'末端の翻訳停止コドンにより決定される
。コード配列は、mRNA、cDNA、組換えヌクレオチド配列、またはゲノムDNAを含 み得るが、これらに限定されるわけではなく、状況によってはイントロンも存在
する可能性がある。
び/またはポリペプチドに翻訳されるヌクレオチド配列である。コード配列の境 界は、5'末端の翻訳開始コドンおよび3'末端の翻訳停止コドンにより決定される
。コード配列は、mRNA、cDNA、組換えヌクレオチド配列、またはゲノムDNAを含 み得るが、これらに限定されるわけではなく、状況によってはイントロンも存在
する可能性がある。
【００１８】 本発明に従って実施された２ハイブリッド系に関する研究により、これまで未
知の植物細胞周期調節ヌクレオチド配列を示す、CDC2aAtと相互作用する新規遺 伝子産物が同定された（以降クローンth65と呼ぶ）。配列番号：１において単離
されたクローンth65のコードヌクレオチド配列（リーディングフレーム）は３位
で始まり、コドンAGG（1184位）で終結する。N末端はグルタミン残基に富む領域
を含んでいた（配列番号：２）。グルタミンに富むドメインは、しばしばDNA結 合因子の転写活性化ドメインの一部となり（ミッチェル＆ティジアン（Mitchell and Tjian）、1989、Science, 245、371〜378）、蛋白質・蛋白質相互作用に関
係することも示されている（バオ（Bao）ら、1996、PNAS、93、5037〜5042）。t
h65のオープンリーディングフレームはまた、コンセンサスCDK燐酸化部位を３個
含む。th65がCDC2aAt関連蛋白質として同定されたことおよびこれらの燐酸化部 位が存在することから、th65蛋白質がCDKの基質であることが示される。
知の植物細胞周期調節ヌクレオチド配列を示す、CDC2aAtと相互作用する新規遺 伝子産物が同定された（以降クローンth65と呼ぶ）。配列番号：１において単離
されたクローンth65のコードヌクレオチド配列（リーディングフレーム）は３位
で始まり、コドンAGG（1184位）で終結する。N末端はグルタミン残基に富む領域
を含んでいた（配列番号：２）。グルタミンに富むドメインは、しばしばDNA結 合因子の転写活性化ドメインの一部となり（ミッチェル＆ティジアン（Mitchell and Tjian）、1989、Science, 245、371〜378）、蛋白質・蛋白質相互作用に関
係することも示されている（バオ（Bao）ら、1996、PNAS、93、5037〜5042）。t
h65のオープンリーディングフレームはまた、コンセンサスCDK燐酸化部位を３個
含む。th65がCDC2aAt関連蛋白質として同定されたことおよびこれらの燐酸化部 位が存在することから、th65蛋白質がCDKの基質であることが示される。
【００１９】 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のような核酸増幅技術を用いて、配列番号：１ に定義する配列を含むゲノムDNA断片を単離することができる。このように、分 子量約44 kDaである新規植物ヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を提供す
る。データベースにおける相同性検索により、植物のキネシン関連運動蛋白質と
の有意な相同性が示された。相同性検索は、プログラムBLASTN（バージョン2.0a
19MP-WashU[build Decunix3.2 01：53：29、1998年２月５日]（アルツシュル（A
ltschul）、Nucleic Acids Res. 25（1997）、3389〜3402を参照のこと）によっ
て、スタンフォードのATDB（http://genome-www2.stanford.edu/cgi-bin/AtDB/n
ph-blast2atdb）でシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）核酸データベース に関して実施した。th65のmRNA（AJ001729）をBLASTINに供して、シロイヌナズ ナ（AB011479）のゲノム配列との相同性を明らかにした（P(N)＝4.44e−118）。
ファンクションCOMPARE（GCG 9.1パッケージ、ジェネティクス・コンピューター
グループインク、マディソン、アメリカ）を用いて相同性および類似性の割合を
定量した。Gapの重み＝12および長さの重み＝２のパラメータを用いて、ファン クションCOMPAREから84.638％の類似性および79.420％の同一性を示す配置を得 た。ゲノム配列（AB011479、クローンMNA5）をKAOSサーバーからその注釈と共に
検索した。キネシン様蛋白質cが、エキソン22個を有するが相同ESTを有しない遺
伝子MNA5.12としてその配列（73733..80900）上に存在することが予想された。 次に、蛋白質配列（KAOSサーバー上で示される）を用いて、ヒトゲノムセンター
、ベイラー・医学カレッジによって提供されたBEAUTYポストプロセシングによっ
て、国立バイオテクノロジーセンター情報の非余剰蛋白質データベース（http:/
/dot.imgen.bcm.tmc.edu:9331/seq-search/protein-search.html）に対してBLAS
TP（バージョン2.0.4[1998年２月24日]）を実行して、シロイヌナズナとその他 の生物由来の無数のキネシンとの相同性を明らかにした。
る。データベースにおける相同性検索により、植物のキネシン関連運動蛋白質と
の有意な相同性が示された。相同性検索は、プログラムBLASTN（バージョン2.0a
19MP-WashU[build Decunix3.2 01：53：29、1998年２月５日]（アルツシュル（A
ltschul）、Nucleic Acids Res. 25（1997）、3389〜3402を参照のこと）によっ
て、スタンフォードのATDB（http://genome-www2.stanford.edu/cgi-bin/AtDB/n
ph-blast2atdb）でシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）核酸データベース に関して実施した。th65のmRNA（AJ001729）をBLASTINに供して、シロイヌナズ ナ（AB011479）のゲノム配列との相同性を明らかにした（P(N)＝4.44e−118）。
ファンクションCOMPARE（GCG 9.1パッケージ、ジェネティクス・コンピューター
グループインク、マディソン、アメリカ）を用いて相同性および類似性の割合を
定量した。Gapの重み＝12および長さの重み＝２のパラメータを用いて、ファン クションCOMPAREから84.638％の類似性および79.420％の同一性を示す配置を得 た。ゲノム配列（AB011479、クローンMNA5）をKAOSサーバーからその注釈と共に
検索した。キネシン様蛋白質cが、エキソン22個を有するが相同ESTを有しない遺
伝子MNA5.12としてその配列（73733..80900）上に存在することが予想された。 次に、蛋白質配列（KAOSサーバー上で示される）を用いて、ヒトゲノムセンター
、ベイラー・医学カレッジによって提供されたBEAUTYポストプロセシングによっ
て、国立バイオテクノロジーセンター情報の非余剰蛋白質データベース（http:/
/dot.imgen.bcm.tmc.edu:9331/seq-search/protein-search.html）に対してBLAS
TP（バージョン2.0.4[1998年２月24日]）を実行して、シロイヌナズナとその他 の生物由来の無数のキネシンとの相同性を明らかにした。
【００２０】 キネシンおよびキネシン関連蛋白質は、減数分裂および有糸分裂の際の小胞輸
送、紡錘糸集合、および染色体分離に関係する微小管運動蛋白質である。CDC2a がキネシン関連運動蛋白質と思われる物質と相互作用すること、および示された
th65クローンにCDK燐酸化コンセンサス部位が存在することが本発明において証 明されたことから、CDKがキネシン関連運動蛋白質の燐酸化を通じて細胞骨格を 直接改変することが示される。このように、本発明の核酸分子は、本来有する細
胞周期蛋白質との相互作用能に加えて、さらにキネシン関連運動蛋白質の生物活
性を示す蛋白質をコードすると予想される。
送、紡錘糸集合、および染色体分離に関係する微小管運動蛋白質である。CDC2a がキネシン関連運動蛋白質と思われる物質と相互作用すること、および示された
th65クローンにCDK燐酸化コンセンサス部位が存在することが本発明において証 明されたことから、CDKがキネシン関連運動蛋白質の燐酸化を通じて細胞骨格を 直接改変することが示される。このように、本発明の核酸分子は、本来有する細
胞周期蛋白質との相互作用能に加えて、さらにキネシン関連運動蛋白質の生物活
性を示す蛋白質をコードすると予想される。
【００２１】 「キネシン」という用語は、プラスおよびマイナス末端方向の多種を含み、微
小管含有細胞に広く分布している微小管に基づく運動蛋白質のスーパーファミリ
ーを意味する。キネシンの機能には膜に結合したオルガネラの運動および分裂が
含まれる場合がある。この用語はまた特にスーパーファミリーの一定のメンバー
に関しても用いられる（その他のメンバーはキネシン関連蛋白質であると思われ
る）。
小管含有細胞に広く分布している微小管に基づく運動蛋白質のスーパーファミリ
ーを意味する。キネシンの機能には膜に結合したオルガネラの運動および分裂が
含まれる場合がある。この用語はまた特にスーパーファミリーの一定のメンバー
に関しても用いられる（その他のメンバーはキネシン関連蛋白質であると思われ
る）。
【００２２】 「運動蛋白質」という用語は移動または輸送に関係する力学的化学的酵素を意
味する。
味する。
【００２３】 「力学的化学的酵素」という用語は、ヌクレオシド３リン酸の形の化学エネル
ギーを力または運動性のような力学エネルギーに変換する酵素を意味する。
ギーを力または運動性のような力学エネルギーに変換する酵素を意味する。
【００２４】 本発明はまた、それらが細胞周期相互作用蛋白質をコードする限り、上記核酸
分子とハイブリダイズするがこれらと比較して一つ以上の部位が異なる核酸分子
にも関する。「ハイブリダイズする」という用語は、そのような核酸分子が従来
のハイブリダイゼーション条件下、好ましくは例えばサムブルック（Sambrook）
の「分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Ma
nual）」、第二版、コールドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリン
グハーバー、ニューヨーク（1989））に記述されるような、ストリンジェントな
条件下でハイブリダイズすることを意味する。そのようなストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件の一例は、４×SSCで65℃でハイブリダイゼーション を行い、0.1×SSC中で65℃で１時間洗浄することである。または一例としてのス
トリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、50％ホルムアミド、４×SSC 中で42℃である。哺乳類、特にヒトのようなその他の生物に由来する細胞周期相
互作用蛋白質は、緩いハイブリダイゼーション条件下で植物細胞周期相互作用蛋
白質の配列とハイブリダイズし、且つ細胞周期蛋白質との相互作用能を有するペ
プチドの発現をコードするその他のDNA配列によってコードされてもよい。その ような非ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例は４×SSC中で50℃ 、および30〜40％ホルムアミド中で42℃でのハイブリダイゼーションである。そ
のような分子は、本発明の細胞周期相互作用蛋白質の断片、類似体、または誘導
体であるが、例えばアミノ酸および／またはヌクレオチドの一つまたは複数の欠
失、挿入、置換、付加および／もしくは組換え、または当技術分野で既知のその
他の改変を単独または組み合わせることによって、上記アミノ酸配列またはその
基礎となるヌクレオチド配列とは異なる分子を含む。本発明の核酸分子にそのよ
うな改変を導入する方法は、当業者に周知である。本発明はまた、その配列が遺
伝子コードの縮重のために上記核酸分子のいずれのヌクレオチド配列とも異なる
核酸分子にも関する。本発明の蛋白質のそのような断片、類似体および誘導体は
全て、上記のような本質的な特徴となる免疫学的および／または生物学的特性が
本質的に影響を受けない限り、本発明の範囲内に含まれる、すなわち本発明の新
規核酸分子は、先に述べたような核酸分子によってコードされることが可能で、
且つサイクリン依存的キナーゼ、特に植物のサイクリン依存的キナーゼとの結合
に関して同等または同一の特徴を有する、細胞周期相互作用蛋白質に対する抗体
と反応させることができるエピトープ一つ以上の一次構造立体配置の少なくとも
一部を有する蛋白質またはペプチドをコードする全てのヌクレオチド配列を含む
。したがって、本発明の一部はまた、本発明の核酸分子に含まれる核酸配列によ
ってコードされる細胞周期相互作用蛋白質の少なくとも機能的部分を含むポリペ
プチドをコードする核酸分子である。この例は、本発明のポリペプチドまたはそ
の断片がもう一つのアミノ酸配列の中に含まれる場合である。
分子とハイブリダイズするがこれらと比較して一つ以上の部位が異なる核酸分子
にも関する。「ハイブリダイズする」という用語は、そのような核酸分子が従来
のハイブリダイゼーション条件下、好ましくは例えばサムブルック（Sambrook）
の「分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Ma
nual）」、第二版、コールドスプリングハーバー研究所出版、コールドスプリン
グハーバー、ニューヨーク（1989））に記述されるような、ストリンジェントな
条件下でハイブリダイズすることを意味する。そのようなストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件の一例は、４×SSCで65℃でハイブリダイゼーション を行い、0.1×SSC中で65℃で１時間洗浄することである。または一例としてのス
トリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、50％ホルムアミド、４×SSC 中で42℃である。哺乳類、特にヒトのようなその他の生物に由来する細胞周期相
互作用蛋白質は、緩いハイブリダイゼーション条件下で植物細胞周期相互作用蛋
白質の配列とハイブリダイズし、且つ細胞周期蛋白質との相互作用能を有するペ
プチドの発現をコードするその他のDNA配列によってコードされてもよい。その ような非ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例は４×SSC中で50℃ 、および30〜40％ホルムアミド中で42℃でのハイブリダイゼーションである。そ
のような分子は、本発明の細胞周期相互作用蛋白質の断片、類似体、または誘導
体であるが、例えばアミノ酸および／またはヌクレオチドの一つまたは複数の欠
失、挿入、置換、付加および／もしくは組換え、または当技術分野で既知のその
他の改変を単独または組み合わせることによって、上記アミノ酸配列またはその
基礎となるヌクレオチド配列とは異なる分子を含む。本発明の核酸分子にそのよ
うな改変を導入する方法は、当業者に周知である。本発明はまた、その配列が遺
伝子コードの縮重のために上記核酸分子のいずれのヌクレオチド配列とも異なる
核酸分子にも関する。本発明の蛋白質のそのような断片、類似体および誘導体は
全て、上記のような本質的な特徴となる免疫学的および／または生物学的特性が
本質的に影響を受けない限り、本発明の範囲内に含まれる、すなわち本発明の新
規核酸分子は、先に述べたような核酸分子によってコードされることが可能で、
且つサイクリン依存的キナーゼ、特に植物のサイクリン依存的キナーゼとの結合
に関して同等または同一の特徴を有する、細胞周期相互作用蛋白質に対する抗体
と反応させることができるエピトープ一つ以上の一次構造立体配置の少なくとも
一部を有する蛋白質またはペプチドをコードする全てのヌクレオチド配列を含む
。したがって、本発明の一部はまた、本発明の核酸分子に含まれる核酸配列によ
ってコードされる細胞周期相互作用蛋白質の少なくとも機能的部分を含むポリペ
プチドをコードする核酸分子である。この例は、本発明のポリペプチドまたはそ
の断片がもう一つのアミノ酸配列の中に含まれる場合である。
【００２５】 添付の実施例において示されるように、本発明において、細胞周期相互作用蛋
白質の同定に適した２ハイブリッドスクリーニングアッセイが開発されている。
このように、もう一つの局面において、本発明はCDC2aをおとりとして、栄養植 物組織のcDNAライブラリを捕獲物質として用いる２ハイブリッドスクリーニング
アッセイを含む、細胞周期相互作用蛋白質を同定し、得る方法に関する。好まし
くはCDC2aはCDC2aAtである。しかし、哺乳類のようなその他の生物からのCDC2a も同様に用いてもよい。
白質の同定に適した２ハイブリッドスクリーニングアッセイが開発されている。
このように、もう一つの局面において、本発明はCDC2aをおとりとして、栄養植 物組織のcDNAライブラリを捕獲物質として用いる２ハイブリッドスクリーニング
アッセイを含む、細胞周期相互作用蛋白質を同定し、得る方法に関する。好まし
くはCDC2aはCDC2aAtである。しかし、哺乳類のようなその他の生物からのCDC2a も同様に用いてもよい。
【００２６】 上記アッセイにおいてCDC2aと相互作用することが同定された蛋白質またはペ プチドをコードする核酸分子は、当技術分野で既知の方法によって容易に得られ
シークエンシングすることができる；添付の実施例も参照のこと。したがって、
本発明は、本発明の方法によって得ることが可能な、細胞周期相互作用蛋白質を
コードするDNA配列にも関する。
シークエンシングすることができる；添付の実施例も参照のこと。したがって、
本発明は、本発明の方法によって得ることが可能な、細胞周期相互作用蛋白質を
コードするDNA配列にも関する。
【００２７】 好ましい態様において、本発明の核酸分子はRNAもしくはDNA分子であり、好ま
しくはcDNA、ゲノムDNAまたは合成されたDNAもしくはRNA分子である。好ましく は本発明の核酸分子は植物、好ましくはシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana
）に由来する。上記のように、シロイヌナズナにおいて本発明に従って同定され
た核酸分子によってコードされる蛋白質は、いくつかの生物のキネシンと何らか
の相同性を示す。したがって、類似の特性を示す対応する蛋白質がその他の植物
にも存在するはずである。本発明の核酸分子は、例えば上記核酸分子の、如何な
る起源の核酸分子（の試料）とのハイブリダイゼーションによっても得ることが
できる。上記核酸分子とハイブリダイズする核酸分子は一般に如何なる生物に由
来してもよいが、好ましくはそのような分子を有する植物、好ましくは単子葉ま
たは双子葉植物、特に如何なる生物、好ましくは穀物植物、すなわちイネ科植物
、ジャガイモのようなデンプン産生植物、キャッサバ（maniok）、マメ科植物、
菜種、麻の種子等の油産生植物、大豆のような貯蔵物質としてポリペプチドを利
用する植物、テンサイまたはサトウキビのような貯蔵物質として蔗糖を用いる植
物、木、観賞用植物等のような、農業、園芸、または木材栽培において重要な植
物に由来しうる。好ましくは、本発明の核酸分子はシロイヌナズナ（Arabidopsi
s thaliana）に由来する。上記核酸分子とハイブリダイズする核酸分子は例えば
、cDNAまたはゲノムライブラリのようなライブラリから、当技術分野で周知の技
法によって単離することができる。例えば、ハイブリダイズする核酸分子は、標
準的な技法によって該分子とハイブリダイズすることによってライブラリをスク
リーニングするプローブとして、上記核酸分子またはその断片もしくはその相補
分子を用いて同定および単離することができる。上記核酸分子に由来するオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を適用す ることによっても、そのような核酸分子が単離される可能性がある。前記核酸分
子のいずれかとハイブリダイズする核酸分子には、細胞周期相互作用蛋白質また
はその免疫学的もしくは機能的断片をコードする上記核酸分子の断片、誘導体、
および対立遺伝子変異体が含まれる。断片は記述の蛋白質または上記の定義のよ
うなその機能的もしくは免疫学的活性断片をコードするために十分な長さの核酸
分子の一部であると理解される。好ましくは、機能的断片は少なくとも１個の燐
酸化部位および／または図１に示すように蛋白質のN末端のグルタミンに富むド メインを含む；実施例２も参照のこと。
しくはcDNA、ゲノムDNAまたは合成されたDNAもしくはRNA分子である。好ましく は本発明の核酸分子は植物、好ましくはシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana
）に由来する。上記のように、シロイヌナズナにおいて本発明に従って同定され
た核酸分子によってコードされる蛋白質は、いくつかの生物のキネシンと何らか
の相同性を示す。したがって、類似の特性を示す対応する蛋白質がその他の植物
にも存在するはずである。本発明の核酸分子は、例えば上記核酸分子の、如何な
る起源の核酸分子（の試料）とのハイブリダイゼーションによっても得ることが
できる。上記核酸分子とハイブリダイズする核酸分子は一般に如何なる生物に由
来してもよいが、好ましくはそのような分子を有する植物、好ましくは単子葉ま
たは双子葉植物、特に如何なる生物、好ましくは穀物植物、すなわちイネ科植物
、ジャガイモのようなデンプン産生植物、キャッサバ（maniok）、マメ科植物、
菜種、麻の種子等の油産生植物、大豆のような貯蔵物質としてポリペプチドを利
用する植物、テンサイまたはサトウキビのような貯蔵物質として蔗糖を用いる植
物、木、観賞用植物等のような、農業、園芸、または木材栽培において重要な植
物に由来しうる。好ましくは、本発明の核酸分子はシロイヌナズナ（Arabidopsi
s thaliana）に由来する。上記核酸分子とハイブリダイズする核酸分子は例えば
、cDNAまたはゲノムライブラリのようなライブラリから、当技術分野で周知の技
法によって単離することができる。例えば、ハイブリダイズする核酸分子は、標
準的な技法によって該分子とハイブリダイズすることによってライブラリをスク
リーニングするプローブとして、上記核酸分子またはその断片もしくはその相補
分子を用いて同定および単離することができる。上記核酸分子に由来するオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を適用す ることによっても、そのような核酸分子が単離される可能性がある。前記核酸分
子のいずれかとハイブリダイズする核酸分子には、細胞周期相互作用蛋白質また
はその免疫学的もしくは機能的断片をコードする上記核酸分子の断片、誘導体、
および対立遺伝子変異体が含まれる。断片は記述の蛋白質または上記の定義のよ
うなその機能的もしくは免疫学的活性断片をコードするために十分な長さの核酸
分子の一部であると理解される。好ましくは、機能的断片は少なくとも１個の燐
酸化部位および／または図１に示すように蛋白質のN末端のグルタミンに富むド メインを含む；実施例２も参照のこと。
【００２８】 「誘導体」という用語は、本明細書においてこれらの核酸分子のヌクレオチド
配列が上記核酸分子の配列とはヌクレオチドの位置が１個以上異なるが、該核酸
分子とは非常に相同であることを意味する。相同性は少なくとも40％の配列同一
性、特に少なくとも60％の同一性、好ましくは80％以上、およびさらにより好ま
しくは90％以上の配列同一性を指すと理解される。「実質的に相同である」とい
う用語は、ORF（オープンリーディングフレーム）全体を比較した場合に、配列 が参照配列と少なくとも50％同一である、配列同一性が好ましくは少なくとも70
％、より好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも85％、特
に約90％以上、最も好ましくは95％、特に98％以上である被験物質、例えば核酸
を指す。上記核酸分子の配列からのずれは、ひとつまたは複数のヌクレオチドの
置換、欠失、付加、挿入、および／または組換えの結果となりうる；上記参照。
配列が上記核酸分子の配列とはヌクレオチドの位置が１個以上異なるが、該核酸
分子とは非常に相同であることを意味する。相同性は少なくとも40％の配列同一
性、特に少なくとも60％の同一性、好ましくは80％以上、およびさらにより好ま
しくは90％以上の配列同一性を指すと理解される。「実質的に相同である」とい
う用語は、ORF（オープンリーディングフレーム）全体を比較した場合に、配列 が参照配列と少なくとも50％同一である、配列同一性が好ましくは少なくとも70
％、より好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも85％、特
に約90％以上、最も好ましくは95％、特に98％以上である被験物質、例えば核酸
を指す。上記核酸分子の配列からのずれは、ひとつまたは複数のヌクレオチドの
置換、欠失、付加、挿入、および／または組換えの結果となりうる；上記参照。
【００２９】 相同性はさらに、それぞれの核酸分子またはコードされる蛋白質が機能的およ
び／または構造的に同等であることを意味する。上記の核酸分子と相同である核
酸分子および該核酸分子の誘導体である核酸分子は例えば、同じ生物機能を有す
る、特に同じまたは実質的に同じ生物機能を有する蛋白質をコードする改変を表
す該核酸分子の変異体である。それらは、その他の植物変種または種に由来する
配列、または変異のような、自然界に存在する変種であってもよい。これらの変
異は、自然界に生じるものでもよく、変異誘発技術によって得られるものでもよ
い。対立遺伝子変種は自然界に存在する変種と共に合成によって産生されたまた
は遺伝子操作された変種であってもよい；上記を参照のこと。
び／または構造的に同等であることを意味する。上記の核酸分子と相同である核
酸分子および該核酸分子の誘導体である核酸分子は例えば、同じ生物機能を有す
る、特に同じまたは実質的に同じ生物機能を有する蛋白質をコードする改変を表
す該核酸分子の変異体である。それらは、その他の植物変種または種に由来する
配列、または変異のような、自然界に存在する変種であってもよい。これらの変
異は、自然界に生じるものでもよく、変異誘発技術によって得られるものでもよ
い。対立遺伝子変種は自然界に存在する変種と共に合成によって産生されたまた
は遺伝子操作された変種であってもよい；上記を参照のこと。
【００３０】 上記核酸分子の様々な誘導体および変種によってコードされる蛋白質は、生物
活性、分子量、免疫反応性、立体配置等と共に、電気泳動移動度、クロマトグラ
フィー挙動、沈降係数、至適pH、至適温度、安定性、溶解性、分光測光特性等の
物理特性のような特定の共通の特徴を有する。
活性、分子量、免疫反応性、立体配置等と共に、電気泳動移動度、クロマトグラ
フィー挙動、沈降係数、至適pH、至適温度、安定性、溶解性、分光測光特性等の
物理特性のような特定の共通の特徴を有する。
【００３１】 本発明の核酸分子について可能性がある異なる適用例と共にそれらに由来する
分子の例を以下に詳細に記述する。
分子の例を以下に詳細に記述する。
【００３２】 したがって、さらなる態様において、本発明は上記の核酸分子またはその相補
鎖と特異的にハイブリダイズする、長さが少なくとも15ヌクレオチドの核酸分子
に関する。特異的ハイブリダイゼーションは好ましくはストリンジェントな条件
下で起こり、蛋白質を全くコードしない、または実質的に異なる蛋白質をコード
するヌクレオチド配列とは全くまたは非常にわずかしか交叉ハイブリダイゼーシ
ョンしないことを意味する。そのような核酸分子はプローブとしておよび／また
は遺伝子発現を制御するために用いてもよい。核酸プローブ技術は当業者に周知
であり、彼らはそのようなプローブの長さが変化してもよいことを容易に認識す
ると思われる。長さが16〜35ヌクレオチドの核酸プローブが好ましい。当然のこ
ととして、長さが最大で100ヌクレオチド以上の核酸を用いても適当であろう。 本発明の核酸プローブは様々な適用にとって有用である。一方でそれらは本発明
の核酸配列の増幅のためのPCRプライマーとして用いてもよい。該プライマーの デザインおよび使用は当業者に公知である。好ましくはそのような増幅プライマ
ーは、配列番号：１に示すヌクレオチド配列または配列番号：２のアミノ酸配列
をコードするヌクレオチド配列と、少なくとも６ヌクレオチド、特に13ヌクレオ
チド、好ましくは15〜25ヌクレオチド以上、同一または相補的である隣接配列を
含む。もう一つの適用は、ゲノムDNAまたはcDNAライブラリの相同性スクリーニ ングによって、本発明の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子を同定するため
のハイブリダイゼーションプローブとして使用することである。上記核酸分子と
相補的である、本発明のこの好ましい態様の核酸分子は、例えばアンチセンスも
しくは３重らせん作用によって細胞周期遺伝子の発現を抑制するために、または
本発明の核酸分子もしくはその一部を含む遺伝子の（プレ）mRNAを特異的に切断
する適当なリボザイム（例えば、欧州特許A1 0 291 533、欧州特許A1 0 321 201
号、欧州特許A2 0 360 257号を参照のこと）を構築するために用いてもよい。適
当な標的部位の選択および対応するリボザイムは例えば、スタイネッケ（Steine
cke）の「リボザイム、細胞生物学における方法50（Ribozyme, Methods in Cell
Biology）」、ガルブレイス（Galbraith）ら編、アカデミックプレスインク（1
995）、449〜460に記述のように行うことができる。さらに、当業者は特定の適 用のために、例えば生物、特に植物に由来する試料における本発明の核酸分子の
有無を検出するために、適当なマーカーによってそのような核酸プローブを標識
することが可能であることを十分に承知している。
鎖と特異的にハイブリダイズする、長さが少なくとも15ヌクレオチドの核酸分子
に関する。特異的ハイブリダイゼーションは好ましくはストリンジェントな条件
下で起こり、蛋白質を全くコードしない、または実質的に異なる蛋白質をコード
するヌクレオチド配列とは全くまたは非常にわずかしか交叉ハイブリダイゼーシ
ョンしないことを意味する。そのような核酸分子はプローブとしておよび／また
は遺伝子発現を制御するために用いてもよい。核酸プローブ技術は当業者に周知
であり、彼らはそのようなプローブの長さが変化してもよいことを容易に認識す
ると思われる。長さが16〜35ヌクレオチドの核酸プローブが好ましい。当然のこ
ととして、長さが最大で100ヌクレオチド以上の核酸を用いても適当であろう。 本発明の核酸プローブは様々な適用にとって有用である。一方でそれらは本発明
の核酸配列の増幅のためのPCRプライマーとして用いてもよい。該プライマーの デザインおよび使用は当業者に公知である。好ましくはそのような増幅プライマ
ーは、配列番号：１に示すヌクレオチド配列または配列番号：２のアミノ酸配列
をコードするヌクレオチド配列と、少なくとも６ヌクレオチド、特に13ヌクレオ
チド、好ましくは15〜25ヌクレオチド以上、同一または相補的である隣接配列を
含む。もう一つの適用は、ゲノムDNAまたはcDNAライブラリの相同性スクリーニ ングによって、本発明の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子を同定するため
のハイブリダイゼーションプローブとして使用することである。上記核酸分子と
相補的である、本発明のこの好ましい態様の核酸分子は、例えばアンチセンスも
しくは３重らせん作用によって細胞周期遺伝子の発現を抑制するために、または
本発明の核酸分子もしくはその一部を含む遺伝子の（プレ）mRNAを特異的に切断
する適当なリボザイム（例えば、欧州特許A1 0 291 533、欧州特許A1 0 321 201
号、欧州特許A2 0 360 257号を参照のこと）を構築するために用いてもよい。適
当な標的部位の選択および対応するリボザイムは例えば、スタイネッケ（Steine
cke）の「リボザイム、細胞生物学における方法50（Ribozyme, Methods in Cell
Biology）」、ガルブレイス（Galbraith）ら編、アカデミックプレスインク（1
995）、449〜460に記述のように行うことができる。さらに、当業者は特定の適 用のために、例えば生物、特に植物に由来する試料における本発明の核酸分子の
有無を検出するために、適当なマーカーによってそのような核酸プローブを標識
することが可能であることを十分に承知している。
【００３３】 上記核酸分子はDNAもしくはRNAまたはそのハイブリッドのいずれであってもよ
い。さらに、該核酸分子は例えば、オリゴヌクレオチドアンチセンスアプローチ
において一般的に用いられる、チオエステル結合および／またはヌクレオチド類
似体を含んでもよい。そのような改変は、細胞におけるエンドおよび／またはエ
キソヌクレアーゼに対する核酸分子の安定化にとって有用である可能性がある。
該核酸分子は、細胞において該核酸分子の転写を可能にするキメラ遺伝子を含む
適当なベクターによって転写してもよい。
い。さらに、該核酸分子は例えば、オリゴヌクレオチドアンチセンスアプローチ
において一般的に用いられる、チオエステル結合および／またはヌクレオチド類
似体を含んでもよい。そのような改変は、細胞におけるエンドおよび／またはエ
キソヌクレアーゼに対する核酸分子の安定化にとって有用である可能性がある。
該核酸分子は、細胞において該核酸分子の転写を可能にするキメラ遺伝子を含む
適当なベクターによって転写してもよい。
【００３４】 さらに、本発明の核酸分子の発現を検出または阻害するためにいわゆる「ペプ
チド核酸」（PNA）技法を用いることができる。例えば、相補的であって様々な 一本鎖RNAおよびDNA核酸分子へのPNAの結合は、熱変性およびBIAコア表面相互作
用技術を用いて秩序よく調べることができる（ジェンセン（Jensen）、Biochemi
stry 36（1997）、5072〜5077）。さらに、上記の核酸分子と共にそれに由来す るPNAは、BIAコアのような親和性センサーを有する試料から得られた核酸とのハ
イブリダイゼーションによって、点突然変異の検出に用いることができる；例え
ば、ゴトウ（Gotoh）、Rinsho Byori 45（1997）、224〜228を参照のこと。ペプ
チド核酸（PNA）オリゴマー列上でのハイブリダイゼーションに基づくDNAスクリ
ーニングは先行技術において、例えばワイラー（Weiler）、Nucleic Acids Rese
arch 25（1997）、2792〜2799に記載されている。PNAの合成は、当技術分野にお
いて公知の方法に従って、例えばコック（Koch）、J. Pept. Res. 49（1997）、
80〜88；フィン（Finn）、Nucleic Acids Research 24（1996）、3357〜3363に 記述のように実施することができる。そのようなPNAについてさらに考えられる 、例えば制限酵素または核酸オリゴヌクレオチドの合成の鋳型としての適用は、
当業者に公知であり、例えばベセルコフ（Veselkov）、Nature 379（1996）、21
4およびボーラー（Bohler）、Nature 376（1995）、578〜581に記載されている 。
チド核酸」（PNA）技法を用いることができる。例えば、相補的であって様々な 一本鎖RNAおよびDNA核酸分子へのPNAの結合は、熱変性およびBIAコア表面相互作
用技術を用いて秩序よく調べることができる（ジェンセン（Jensen）、Biochemi
stry 36（1997）、5072〜5077）。さらに、上記の核酸分子と共にそれに由来す るPNAは、BIAコアのような親和性センサーを有する試料から得られた核酸とのハ
イブリダイゼーションによって、点突然変異の検出に用いることができる；例え
ば、ゴトウ（Gotoh）、Rinsho Byori 45（1997）、224〜228を参照のこと。ペプ
チド核酸（PNA）オリゴマー列上でのハイブリダイゼーションに基づくDNAスクリ
ーニングは先行技術において、例えばワイラー（Weiler）、Nucleic Acids Rese
arch 25（1997）、2792〜2799に記載されている。PNAの合成は、当技術分野にお
いて公知の方法に従って、例えばコック（Koch）、J. Pept. Res. 49（1997）、
80〜88；フィン（Finn）、Nucleic Acids Research 24（1996）、3357〜3363に 記述のように実施することができる。そのようなPNAについてさらに考えられる 、例えば制限酵素または核酸オリゴヌクレオチドの合成の鋳型としての適用は、
当業者に公知であり、例えばベセルコフ（Veselkov）、Nature 379（1996）、21
4およびボーラー（Bohler）、Nature 376（1995）、578〜581に記載されている 。
【００３５】 本発明はまた、本発明の核酸分子を含むベクター、特にプラスミド、コスミド
、ウイルス、バクテリオファージ、および遺伝子操作において従来から用いられ
ているその他のベクターにも関する。当業者に周知の方法を用いて、様々なプラ
スミドおよびベクターを構築することができる；例えば、サムブルック（Sambro
ok）の「分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning, A Laborator
y Manual）」、コールドスプリングハーバー研究所（1989）、ニューヨーク州、
およびアウスユベール（Ausubel）の「分子生物学の現行プロトコール（Current
Protocols in Molecular Biology）」、グリーン・パブリッシング・アソシエ ーツ＆ウィリーインターサイエンス、ニューヨーク（1989）に記載の技術を参照
のこと。または、本発明の核酸分子およびベクターは、標的細胞に輸送するため
にリポソームの中に再構成することができる。
、ウイルス、バクテリオファージ、および遺伝子操作において従来から用いられ
ているその他のベクターにも関する。当業者に周知の方法を用いて、様々なプラ
スミドおよびベクターを構築することができる；例えば、サムブルック（Sambro
ok）の「分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning, A Laborator
y Manual）」、コールドスプリングハーバー研究所（1989）、ニューヨーク州、
およびアウスユベール（Ausubel）の「分子生物学の現行プロトコール（Current
Protocols in Molecular Biology）」、グリーン・パブリッシング・アソシエ ーツ＆ウィリーインターサイエンス、ニューヨーク（1989）に記載の技術を参照
のこと。または、本発明の核酸分子およびベクターは、標的細胞に輸送するため
にリポソームの中に再構成することができる。
【００３６】 好ましい態様において、ベクターに存在する核酸分子は原核および／または真
核細胞において核酸分子の発現を可能にする調節配列（一つまたは複数）に結合
している。
核細胞において核酸分子の発現を可能にする調節配列（一つまたは複数）に結合
している。
【００３７】 「調節配列」という用語は、それが連結されたコード配列の発現を実現するた
めに必要な調節性DNA配列を指す。このような調節配列の性質は宿主生物体によ って異なる。原核生物では一般に、調節配列にはプロモーター、リボソーム結合
部位、およびターミネーターが含まれる。真核生物では一般に、調節配列にはプ
ロモーター、ターミネーター、および場合によってはエンハンサー、トランスア
クチベーターまたは転写因子が含まれる。「調節配列」という用語は、最低限そ
の存在が発現に必要なすべての成分を含むことを意図しており、都合の良い別の
成分も含む可能性がある。
めに必要な調節性DNA配列を指す。このような調節配列の性質は宿主生物体によ って異なる。原核生物では一般に、調節配列にはプロモーター、リボソーム結合
部位、およびターミネーターが含まれる。真核生物では一般に、調節配列にはプ
ロモーター、ターミネーター、および場合によってはエンハンサー、トランスア
クチベーターまたは転写因子が含まれる。「調節配列」という用語は、最低限そ
の存在が発現に必要なすべての成分を含むことを意図しており、都合の良い別の
成分も含む可能性がある。
【００３８】 「機能的に結合」という用語は、その成分が意図したように機能することがで
きるような関係に並置されていることを指す。コード配列に「機能的に結合」さ
れた調節配列とは、調節配列に適合する条件下で、コード配列の発現が実現する
ように連結されたものである。調節配列がプロモーターの場合には、二本鎖核酸
が使用されることは当業者に明らかである。
きるような関係に並置されていることを指す。コード配列に「機能的に結合」さ
れた調節配列とは、調節配列に適合する条件下で、コード配列の発現が実現する
ように連結されたものである。調節配列がプロモーターの場合には、二本鎖核酸
が使用されることは当業者に明らかである。
【００３９】 したがって、本発明のベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベク
ター」とは、選択された宿主細胞の形質転換に使用可能であり、その選択された
宿主中でコード配列の発現を提供する構築物である。発現ベクターは、例えばク
ローニングベクター、バイナリーベクター、または組み込みベクター（integrat
ing vector）などである。発現は、好ましくは翻訳可能mRNAへの核酸分子の転写
を含む。原核および／または真核細胞において発現を確実にする調節エレメント
は当業者に周知である。真核細胞の場合、通常、それらは転写の開始を確実にす
るプロモーター、ならびに例えばカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）由来の
35S RNAなどの、選択的に転写の終結および転写物の安定化を確実にするポリAシ
グナルを含む。一般的に用いられるその他のプロモーターは、ポリユビキチンプ
ロモーターおよび広汎な発現に用いられるアクチンプロモーターである。通常用
いられる終結シグナルは、ノパリン・シンターゼプロモーターまたはCAMV 35Sプ
ロモーターに由来する。しばしば用いられる植物の翻訳エンハンサーはCAMVオメ
ガ配列であり、イントロン一個（例えば、トウモロコシのシュランケン（Shrunk
en）遺伝子からのイントロン-1）を含めると、発現レベルが100倍まで増加する ことが示されている（メイト（Mait）、Transgenic Research 6（1997）、143〜
156；ニ（Ni）、Plant Journal 7（1995）、661〜676）。さらなる調節エレメン
トは、転写エンハンサーと共に翻訳エンハンサーを含んでもよい。原核宿主細胞
において発現を可能にすると考えられる調節配列は、例えば大腸菌のPL、lac、t
rpまたはtacプロモーターを含み、真核宿主細胞において発現を可能にする調節 エレメントの例は、酵母のAOX1もしくはGAL1プロモーター、またはCMV、SV40、R
SV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、CMVエンハンサー、SV40エンハンサー もしくは哺乳類およびその他の動物細胞におけるグロビンイントロンを含む。こ
の意味において、オカヤマ・ベルグcDNA発現ベクターpcDV1（ファルマシア社） 、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3（インビトロゲン社）、pSPORT1（ギブコBRL
社）のような、適した発現ベクターが当技術分野において公知である。本発明の
上記ベクターは選択および／またはスコア可能なマーカーを含むと都合がよい。
形質転換した植物細胞、カルス、植物組織および植物の選択において有用な選択
マーカー遺伝子は、当業者に周知であり例えば、メソトレキセートに対する抵抗
性を付与するdhfr（ライス（Reiss）、Plant Physiol.（Life Sci. Adv.）13（1
994）、143〜149）；アミノグリコシドであるネオマイシン、カナマイシン、お よびパロマイシンに対する抵抗性を付与するnpt（ヘレラ・エストレラ（Herrera
-Estrella）、EMBO J. 2（1983）、987〜995）およびヒグロマイシンに対する抵
抗性を付与するhygro（マーシュ（Marsh）、Gene 32（1984）、481〜485）のよ うな抗代謝物抵抗性を選択の基礎として含む。さらなる選択遺伝子が記述されて
おり、すなわち細胞にトリプトファンの代わりにインドールを利用させるtrpB；
細胞にヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用させるhisD（ハートマン（Hart
man）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85（1988）、8047）；細胞にマンノースを
利用させるマンノース-6-燐酸イソメラーゼ（国際公開公報第94/20627号）、お よびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である2-(ジフルオロメチル)-DL-オル
ニチン、DFMO（マッコンログ（McConlogue）、1987、「分子生物学の現在の情報
伝達（Current Communications in Molecular Biology）」、コールドスプリン グハーバー研究所編）に対する抵抗性を付与するODC（オルニチンデカルボキシ ラーゼ）、またはブラスチシジンSに対する抵抗性を付与するアスペルギルス・ テレウス（Aspergillus terreus）由来のデアミナーゼ（タムラ（Tamura）、Bio
sci. Biotechnol. Biochem. 59（1995）、2336〜2338）がある。
ター」とは、選択された宿主細胞の形質転換に使用可能であり、その選択された
宿主中でコード配列の発現を提供する構築物である。発現ベクターは、例えばク
ローニングベクター、バイナリーベクター、または組み込みベクター（integrat
ing vector）などである。発現は、好ましくは翻訳可能mRNAへの核酸分子の転写
を含む。原核および／または真核細胞において発現を確実にする調節エレメント
は当業者に周知である。真核細胞の場合、通常、それらは転写の開始を確実にす
るプロモーター、ならびに例えばカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）由来の
35S RNAなどの、選択的に転写の終結および転写物の安定化を確実にするポリAシ
グナルを含む。一般的に用いられるその他のプロモーターは、ポリユビキチンプ
ロモーターおよび広汎な発現に用いられるアクチンプロモーターである。通常用
いられる終結シグナルは、ノパリン・シンターゼプロモーターまたはCAMV 35Sプ
ロモーターに由来する。しばしば用いられる植物の翻訳エンハンサーはCAMVオメ
ガ配列であり、イントロン一個（例えば、トウモロコシのシュランケン（Shrunk
en）遺伝子からのイントロン-1）を含めると、発現レベルが100倍まで増加する ことが示されている（メイト（Mait）、Transgenic Research 6（1997）、143〜
156；ニ（Ni）、Plant Journal 7（1995）、661〜676）。さらなる調節エレメン
トは、転写エンハンサーと共に翻訳エンハンサーを含んでもよい。原核宿主細胞
において発現を可能にすると考えられる調節配列は、例えば大腸菌のPL、lac、t
rpまたはtacプロモーターを含み、真核宿主細胞において発現を可能にする調節 エレメントの例は、酵母のAOX1もしくはGAL1プロモーター、またはCMV、SV40、R
SV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、CMVエンハンサー、SV40エンハンサー もしくは哺乳類およびその他の動物細胞におけるグロビンイントロンを含む。こ
の意味において、オカヤマ・ベルグcDNA発現ベクターpcDV1（ファルマシア社） 、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3（インビトロゲン社）、pSPORT1（ギブコBRL
社）のような、適した発現ベクターが当技術分野において公知である。本発明の
上記ベクターは選択および／またはスコア可能なマーカーを含むと都合がよい。
形質転換した植物細胞、カルス、植物組織および植物の選択において有用な選択
マーカー遺伝子は、当業者に周知であり例えば、メソトレキセートに対する抵抗
性を付与するdhfr（ライス（Reiss）、Plant Physiol.（Life Sci. Adv.）13（1
994）、143〜149）；アミノグリコシドであるネオマイシン、カナマイシン、お よびパロマイシンに対する抵抗性を付与するnpt（ヘレラ・エストレラ（Herrera
-Estrella）、EMBO J. 2（1983）、987〜995）およびヒグロマイシンに対する抵
抗性を付与するhygro（マーシュ（Marsh）、Gene 32（1984）、481〜485）のよ うな抗代謝物抵抗性を選択の基礎として含む。さらなる選択遺伝子が記述されて
おり、すなわち細胞にトリプトファンの代わりにインドールを利用させるtrpB；
細胞にヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用させるhisD（ハートマン（Hart
man）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85（1988）、8047）；細胞にマンノースを
利用させるマンノース-6-燐酸イソメラーゼ（国際公開公報第94/20627号）、お よびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である2-(ジフルオロメチル)-DL-オル
ニチン、DFMO（マッコンログ（McConlogue）、1987、「分子生物学の現在の情報
伝達（Current Communications in Molecular Biology）」、コールドスプリン グハーバー研究所編）に対する抵抗性を付与するODC（オルニチンデカルボキシ ラーゼ）、またはブラスチシジンSに対する抵抗性を付与するアスペルギルス・ テレウス（Aspergillus terreus）由来のデアミナーゼ（タムラ（Tamura）、Bio
sci. Biotechnol. Biochem. 59（1995）、2336〜2338）がある。
【００４０】 有用なスコア可能マーカーも当業者に公知であり、市販されている。該マーカ
ーはルシフェラーゼ（ギアコミン（Giacomin）、Pl. Sci. 116（1996）、59〜72
；シカンタ（Scikantha）、J. Bact. 178（1996）、121）、緑色蛍光蛋白質（ゲ
ルデス（Gerdes）、FEBS Lett. 389（1996）、44〜47）またはβ-グルクロニダ ーゼ（ジェファーソン、EMBO J. 6（1987）、3901〜3907）をコードする遺伝子 であると都合がよい。この態様は、本発明のベクターを含む細胞、組織および器
官の単純かつ迅速なスクリーニングにとって特に有用である。
ーはルシフェラーゼ（ギアコミン（Giacomin）、Pl. Sci. 116（1996）、59〜72
；シカンタ（Scikantha）、J. Bact. 178（1996）、121）、緑色蛍光蛋白質（ゲ
ルデス（Gerdes）、FEBS Lett. 389（1996）、44〜47）またはβ-グルクロニダ ーゼ（ジェファーソン、EMBO J. 6（1987）、3901〜3907）をコードする遺伝子 であると都合がよい。この態様は、本発明のベクターを含む細胞、組織および器
官の単純かつ迅速なスクリーニングにとって特に有用である。
【００４１】 本発明はさらに、核酸分子が宿主細胞に対して異物である、上記のベクターま
たは本発明の核酸分子を含む宿主細胞に関する。
たは本発明の核酸分子を含む宿主細胞に関する。
【００４２】 「異物」とは、核酸分子が宿主細胞に対して異種である、この場合異なるゲノ
ム背景の細胞または生物に由来することを意味するか、または宿主細胞に関して
同種であるが、該核酸分子の自然界に存在する対部分とは異なるゲノム環境に存
在することを意味する。このことは、核酸分子が宿主細胞に対して同種である場
合には、核酸分子が該宿主細胞のゲノムの本来の位置には存在しないこと、特に
異なる遺伝子に取り囲まれていることを意味する。この場合、核酸分子は自身の
プロモーターの制御下、または異種プロモーターの制御下のいずれかに置かれる
。宿主細胞に存在する本発明のベクターまたは核酸分子は、宿主細胞のゲノムに
組み入れられてもよく、または染色体外で何らかの形で維持されてもよい。この
点において、本発明の核酸分子は相同組換えによって変異遺伝子を回復または作
製するために用いることができる（パズコフスキ（Paszkowski）編、「植物にお
ける相同組換えと遺伝子のサイレント化（Homologous Recombination and Gene
Silencing in Plants）」、クルワー・アカデミック・パブリッシャーズ（1994 ））。
ム背景の細胞または生物に由来することを意味するか、または宿主細胞に関して
同種であるが、該核酸分子の自然界に存在する対部分とは異なるゲノム環境に存
在することを意味する。このことは、核酸分子が宿主細胞に対して同種である場
合には、核酸分子が該宿主細胞のゲノムの本来の位置には存在しないこと、特に
異なる遺伝子に取り囲まれていることを意味する。この場合、核酸分子は自身の
プロモーターの制御下、または異種プロモーターの制御下のいずれかに置かれる
。宿主細胞に存在する本発明のベクターまたは核酸分子は、宿主細胞のゲノムに
組み入れられてもよく、または染色体外で何らかの形で維持されてもよい。この
点において、本発明の核酸分子は相同組換えによって変異遺伝子を回復または作
製するために用いることができる（パズコフスキ（Paszkowski）編、「植物にお
ける相同組換えと遺伝子のサイレント化（Homologous Recombination and Gene
Silencing in Plants）」、クルワー・アカデミック・パブリッシャーズ（1994 ））。
【００４３】 宿主細胞は細菌、昆虫、真菌、植物、または動物細胞のような、如何なる原核
細胞または真核細胞ともなりうる。好ましい真菌細胞は例えば、サッカロミセス
属、特にS. セレビジエ（S. cerevisiae）種の細胞である。
細胞または真核細胞ともなりうる。好ましい真菌細胞は例えば、サッカロミセス
属、特にS. セレビジエ（S. cerevisiae）種の細胞である。
【００４４】 本発明のもう一つの主題は、蛋白質の発現を可能にする条件下で、本発明のベ
クターまたは核酸分子の存在により、そのような蛋白質を発現することができる
本発明の宿主細胞を培養する段階、およびそのように産生された蛋白質を培養物
から回収する段階を含む、細胞周期相互作用蛋白質を調製する方法である。
クターまたは核酸分子の存在により、そのような蛋白質を発現することができる
本発明の宿主細胞を培養する段階、およびそのように産生された蛋白質を培養物
から回収する段階を含む、細胞周期相互作用蛋白質を調製する方法である。
【００４５】 「発現」という用語は、細胞においてタンパク質またはヌクレオチド配列が産
生されることを意味する。しかし、該用語には無細胞系におけるタンパク質の発
現も含まれる。これには、その産物をコードするDNAから、RNA産物への転写、転
写後修飾、および/またはタンパク質産物もしくはポリペプチドへの翻訳、なら びに時には翻訳後修飾が含まれる。
生されることを意味する。しかし、該用語には無細胞系におけるタンパク質の発
現も含まれる。これには、その産物をコードするDNAから、RNA産物への転写、転
写後修飾、および/またはタンパク質産物もしくはポリペプチドへの翻訳、なら びに時には翻訳後修飾が含まれる。
【００４６】 用いる特定の構築物および条件に応じて、蛋白質は細胞から、培養培地からま
たはその双方から回収してもよい。当業者にとって、本来の蛋白質を発現するこ
とが可能であるばかりか、融合ポリペプチドとして蛋白質を発現する、または宿
主細胞の特定の部分に蛋白質を指向する、例えばペプチドの培養培地への分泌等
を確実にするシグナル配列を加えることができることは周知である。さらに、そ
のような蛋白質およびその断片は、例えば下記の標準的な方法に従って化学合成
および／または改変することができる。
たはその双方から回収してもよい。当業者にとって、本来の蛋白質を発現するこ
とが可能であるばかりか、融合ポリペプチドとして蛋白質を発現する、または宿
主細胞の特定の部分に蛋白質を指向する、例えばペプチドの培養培地への分泌等
を確実にするシグナル配列を加えることができることは周知である。さらに、そ
のような蛋白質およびその断片は、例えば下記の標準的な方法に従って化学合成
および／または改変することができる。
【００４７】 「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本出願では互換可能に
使用される。「ポリペプチド」とは、アミノ酸のポリマー（アミノ酸配列）を指
し、特定の長さの分子を指すものではない。したがって、ポリペプチドの定義に
は、ペプチドおよびオリゴペプチドも含まれる。この用語は例えば、グリコシル
化、アセチル化、リン酸化のようなポリペプチドの翻訳後修飾も意味し、または
含む。例えば、1つまたは複数のアミノ酸アナログ（例えば非天然のアミノ酸な どを含む）を含むポリペプチド、置換された結合を持つポリペプチド、および当
技術分野で公知の他の修飾で天然に存在するものおよびしないものも、この定義
に含まれる。
使用される。「ポリペプチド」とは、アミノ酸のポリマー（アミノ酸配列）を指
し、特定の長さの分子を指すものではない。したがって、ポリペプチドの定義に
は、ペプチドおよびオリゴペプチドも含まれる。この用語は例えば、グリコシル
化、アセチル化、リン酸化のようなポリペプチドの翻訳後修飾も意味し、または
含む。例えば、1つまたは複数のアミノ酸アナログ（例えば非天然のアミノ酸な どを含む）を含むポリペプチド、置換された結合を持つポリペプチド、および当
技術分野で公知の他の修飾で天然に存在するものおよびしないものも、この定義
に含まれる。
【００４８】 本発明はさらに、本発明の核酸分子によってコードされる、または上記方法に
よって産生もしくは得られた蛋白質、ならびにそのような細胞周期相互作用蛋白
質の機能的および／または免疫学的活性断片に関する。本発明の蛋白質およびポ
リペプチドは必ずしも設計された核酸配列から翻訳する必要はない；ポリペプチ
ドは、例えば化学合成、組換え発現系の発現または適したウイルス系からの単離
を含む如何なる方法で産生してもよい。ポリペプチドはアミノ酸の類似体、燐酸
化アミノ酸または非天然アミノ酸を１個以上含んでもよい。アミノ酸の類似体を
配列に挿入する方法は当技術分野で公知である。ポリペプチドはまた、当業者に
公知である標識を一つ以上含んでもよい。この意味において、本発明の蛋白質は
当技術分野で公知の従来の方法によってさらに改変してもよいと理解される。本
発明の蛋白質を提供することによって、生物活性を保持している、すなわち成熟
した加工された型の断片を決定することも可能である。これによって、その結合
活性にとって必須である本発明の蛋白質に由来するアミノ酸配列、およびその他
の機能的アミノ酸配列、例えばGUSマーカー遺伝子（ジェファーソン（Jefferson
）、EMBO J. 6（1987）、3901〜3907）を含む、キメラ蛋白質およびペプチドを 構築することができる。その他の機能的アミノ酸配列は、例えば化学的手段によ
って、本発明の蛋白質と物理的に結合してもよく、または当技術分野で周知の組
換えDNA技法によって融合してもよい。
よって産生もしくは得られた蛋白質、ならびにそのような細胞周期相互作用蛋白
質の機能的および／または免疫学的活性断片に関する。本発明の蛋白質およびポ
リペプチドは必ずしも設計された核酸配列から翻訳する必要はない；ポリペプチ
ドは、例えば化学合成、組換え発現系の発現または適したウイルス系からの単離
を含む如何なる方法で産生してもよい。ポリペプチドはアミノ酸の類似体、燐酸
化アミノ酸または非天然アミノ酸を１個以上含んでもよい。アミノ酸の類似体を
配列に挿入する方法は当技術分野で公知である。ポリペプチドはまた、当業者に
公知である標識を一つ以上含んでもよい。この意味において、本発明の蛋白質は
当技術分野で公知の従来の方法によってさらに改変してもよいと理解される。本
発明の蛋白質を提供することによって、生物活性を保持している、すなわち成熟
した加工された型の断片を決定することも可能である。これによって、その結合
活性にとって必須である本発明の蛋白質に由来するアミノ酸配列、およびその他
の機能的アミノ酸配列、例えばGUSマーカー遺伝子（ジェファーソン（Jefferson
）、EMBO J. 6（1987）、3901〜3907）を含む、キメラ蛋白質およびペプチドを 構築することができる。その他の機能的アミノ酸配列は、例えば化学的手段によ
って、本発明の蛋白質と物理的に結合してもよく、または当技術分野で周知の組
換えDNA技法によって融合してもよい。
【００４９】 「配列の断片」または「配列の一部」という用語は、元の配列の切断された配
列を意味する。切断された配列（核酸またはタンパク質配列）の長さは様々であ
る。最小のサイズは、少なくとも元の配列に匹敵する機能および/または活性を 持つ配列を提供するために十分なサイズの配列であり、最大のサイズとしては、
臨界はない。ある種の用途では、最大のサイズは通常、元の配列の所望する活性
および/または機能を提供するために必要なサイズよりもそれほど大きくはない 。切断されたアミノ酸配列の長さは通常、約5から約60アミノ酸の範囲である。 しかし、より一般的には、配列の長さは最大約50アミノ酸で、好ましくは最大約
30アミノ酸である。少なくとも約10、12、15アミノ酸、最高約20または25アミノ
酸までの配列を選択することが通常は望ましい。
列を意味する。切断された配列（核酸またはタンパク質配列）の長さは様々であ
る。最小のサイズは、少なくとも元の配列に匹敵する機能および/または活性を 持つ配列を提供するために十分なサイズの配列であり、最大のサイズとしては、
臨界はない。ある種の用途では、最大のサイズは通常、元の配列の所望する活性
および/または機能を提供するために必要なサイズよりもそれほど大きくはない 。切断されたアミノ酸配列の長さは通常、約5から約60アミノ酸の範囲である。 しかし、より一般的には、配列の長さは最大約50アミノ酸で、好ましくは最大約
30アミノ酸である。少なくとも約10、12、15アミノ酸、最高約20または25アミノ
酸までの配列を選択することが通常は望ましい。
【００５０】 さらに、本発明の蛋白質の構造的モチーフの折り畳みシミュレーションおよび
コンピューターによる再デザインは、適当なコンピュータープログラムを用いて
実施することができる（オルスゼウスキー（Olszewski）、Protein 25（1996） 、286〜299；ホフマン（Hoffman）、Comput. Appl. Biosci. 11（1995）、675〜
679）。蛋白質折り畳み構造のコンピューターモデリングは、詳細なペプチドお よび蛋白質モデルの構造およびエネルギー分析のために用いることができる（モ
ンゲ（Monge）、J. Mol. Biol. 247（1995）、995〜1012；レナウフ（Renouf） 、Adv. Exp. Med. Biol. 376（1995）、37〜45）。特に、適当なプログラムを用
いて、相補的ペプチド配列のコンピューターによる検索（ファッシナ（Fassina ）、Immunomethods 5（1994）、114〜120）によって、蛋白質と、サイクリン依 存的キナーゼ、その受容体、そのリガンド、またはその他の相互作用蛋白質との
相互作用部位を同定することができる。蛋白質およびペプチドのデザインにさら
に適したコンピューターシステムは、先行技術において、例えばベリー（Beery ）、Biochem. Soc. Trans. 22（1994）、1033〜1036；ウォダック（Wodak）、An
n. N. Y. Acad. Sci. 501（1987）、1〜13；パボ（Pabo）、Biochemistry 25（1
986）、5987〜5991に記述されている。上記コンピューター分析から得られた結 果は例えば、本発明の蛋白質またはその断片のペプチド模倣体の調製に用いるこ
とができる。蛋白質の天然のアミノ酸配列のそのような偽ペプチド類似体は、親
蛋白質を非常に効率よく模倣する可能性がある（ベンキラン（Benkirane）、J.
Biol. Chem. 271（1996）、33218〜33224）。例えば、容易に入手できるアキラ ルΩアミノ酸残基を本発明の蛋白質またはその断片に組み入れた結果、脂肪族側
鎖のポリメチレン単位によるアミド結合の置換が起こり、それによってペプチド
模倣体を構築するための簡便な方法が提供される（バネルジー（Banerjee）、Bi
opolymers 39（1996）、769〜777）。その他のシステムにおける小さいペプチド
ホルモンの超活性ペプチド模倣類似体は先行技術において記述されている（ザン
グ（Zhang）、Biochem. Biophys. Res. Commun. 224（1996）、327〜331）。本 発明の蛋白質の適当なペプチド模倣体はまた、連続アミドアルキル化によるペプ
チド模倣体組合せライブラリの合成によって、および得られた化合物を例えばそ
の結合および免疫学的特性に関して調べることによって同定することができる。
ペプチド模倣体組合せライブラリを産生および使用する方法は先行技術、例えば
オストレッシュ（Ostresh）、Methods in Enzymology 267（1996）、220〜234お
よびドーナー（Dorner）、Bioorg. Med. Chem. 4（1996）、709〜715に記載され
ている。
コンピューターによる再デザインは、適当なコンピュータープログラムを用いて
実施することができる（オルスゼウスキー（Olszewski）、Protein 25（1996） 、286〜299；ホフマン（Hoffman）、Comput. Appl. Biosci. 11（1995）、675〜
679）。蛋白質折り畳み構造のコンピューターモデリングは、詳細なペプチドお よび蛋白質モデルの構造およびエネルギー分析のために用いることができる（モ
ンゲ（Monge）、J. Mol. Biol. 247（1995）、995〜1012；レナウフ（Renouf） 、Adv. Exp. Med. Biol. 376（1995）、37〜45）。特に、適当なプログラムを用
いて、相補的ペプチド配列のコンピューターによる検索（ファッシナ（Fassina ）、Immunomethods 5（1994）、114〜120）によって、蛋白質と、サイクリン依 存的キナーゼ、その受容体、そのリガンド、またはその他の相互作用蛋白質との
相互作用部位を同定することができる。蛋白質およびペプチドのデザインにさら
に適したコンピューターシステムは、先行技術において、例えばベリー（Beery ）、Biochem. Soc. Trans. 22（1994）、1033〜1036；ウォダック（Wodak）、An
n. N. Y. Acad. Sci. 501（1987）、1〜13；パボ（Pabo）、Biochemistry 25（1
986）、5987〜5991に記述されている。上記コンピューター分析から得られた結 果は例えば、本発明の蛋白質またはその断片のペプチド模倣体の調製に用いるこ
とができる。蛋白質の天然のアミノ酸配列のそのような偽ペプチド類似体は、親
蛋白質を非常に効率よく模倣する可能性がある（ベンキラン（Benkirane）、J.
Biol. Chem. 271（1996）、33218〜33224）。例えば、容易に入手できるアキラ ルΩアミノ酸残基を本発明の蛋白質またはその断片に組み入れた結果、脂肪族側
鎖のポリメチレン単位によるアミド結合の置換が起こり、それによってペプチド
模倣体を構築するための簡便な方法が提供される（バネルジー（Banerjee）、Bi
opolymers 39（1996）、769〜777）。その他のシステムにおける小さいペプチド
ホルモンの超活性ペプチド模倣類似体は先行技術において記述されている（ザン
グ（Zhang）、Biochem. Biophys. Res. Commun. 224（1996）、327〜331）。本 発明の蛋白質の適当なペプチド模倣体はまた、連続アミドアルキル化によるペプ
チド模倣体組合せライブラリの合成によって、および得られた化合物を例えばそ
の結合および免疫学的特性に関して調べることによって同定することができる。
ペプチド模倣体組合せライブラリを産生および使用する方法は先行技術、例えば
オストレッシュ（Ostresh）、Methods in Enzymology 267（1996）、220〜234お
よびドーナー（Dorner）、Bioorg. Med. Chem. 4（1996）、709〜715に記載され
ている。
【００５１】 さらに、本発明の蛋白質の三次元および／または結晶学的構造を、本発明の蛋
白質の生物活性のペプチド模倣体阻害剤のデザインに用いることができる（ロー
ズ（Rose）、Biochemistry 35（1996）、12933〜12944；ルーテンバー（Rutenbe
r）、Bioorg. Med. Chem. 4（1996）、1545〜1558）。
白質の生物活性のペプチド模倣体阻害剤のデザインに用いることができる（ロー
ズ（Rose）、Biochemistry 35（1996）、12933〜12944；ルーテンバー（Rutenbe
r）、Bioorg. Med. Chem. 4（1996）、1545〜1558）。
【００５２】 さらに、本発明は本発明の細胞周期相互作用蛋白質、またはそのような蛋白質
の一部、すなわち特異的断片もしくはエピトープを特異的に認識する抗体に関す
る。本発明の抗体を用いて、如何なる生物においても、好ましくは植物における
その他の細胞周期相互作用蛋白質および遺伝子を同定および単離することができ
る。これらの抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または合成抗体
と共に、Fab、Fv、またはscFv断片等のような抗体の断片となりうる。モノクロ ーナル抗体は例えば、ケーラー＆ミルスタイン（Kohler and Milstein）、Natur
e 256（1975）、495およびガルフレ（Galfre）、Meth. Enzymol. 73（1981）、3
に最初に記述され、マウス骨髄腫細胞と、免疫した哺乳動物に由来する脾細胞と
の融合を含む技法によって調製することができる。さらに、前記ペプチドに対す
る抗体またはその断片は、例えば、ハーロウ＆レーン（Harlow and Lane）、「 抗体、実験マニュアル（Antibodies, A Laboratory Manual）」、CSHプレス、コ
ールドスプリングハーバー、1988に記述された方法を用いて得ることができる。
これらの抗体は例えば、本発明の蛋白質の免疫沈降および免疫局在と共に、例え
ば組換え生物におけるそのような蛋白質の合成をモニターするために、および本
発明の蛋白質と相互作用する化合物を同定するために、用いることができる。例
えば、BIAコアシステムにおいて用いられる表面プラズモン共鳴を用いて、ファ ージ抗体の選択効率を増加させることができ、本発明の蛋白質のエピトープに結
合するファージ抗体の単一のライブラリからの親和性が大きく増加する（シアー
（Schier）、Human Antibodies Hybridomas 7（1996）、97〜105；マームボルグ
（Malmborg）、J. Immunol. Methods 183（1995）、7〜13）。多くの場合、抗原
に対する抗体の結合現象はその他のリガンド／抗リガンド結合と同等である。
の一部、すなわち特異的断片もしくはエピトープを特異的に認識する抗体に関す
る。本発明の抗体を用いて、如何なる生物においても、好ましくは植物における
その他の細胞周期相互作用蛋白質および遺伝子を同定および単離することができ
る。これらの抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または合成抗体
と共に、Fab、Fv、またはscFv断片等のような抗体の断片となりうる。モノクロ ーナル抗体は例えば、ケーラー＆ミルスタイン（Kohler and Milstein）、Natur
e 256（1975）、495およびガルフレ（Galfre）、Meth. Enzymol. 73（1981）、3
に最初に記述され、マウス骨髄腫細胞と、免疫した哺乳動物に由来する脾細胞と
の融合を含む技法によって調製することができる。さらに、前記ペプチドに対す
る抗体またはその断片は、例えば、ハーロウ＆レーン（Harlow and Lane）、「 抗体、実験マニュアル（Antibodies, A Laboratory Manual）」、CSHプレス、コ
ールドスプリングハーバー、1988に記述された方法を用いて得ることができる。
これらの抗体は例えば、本発明の蛋白質の免疫沈降および免疫局在と共に、例え
ば組換え生物におけるそのような蛋白質の合成をモニターするために、および本
発明の蛋白質と相互作用する化合物を同定するために、用いることができる。例
えば、BIAコアシステムにおいて用いられる表面プラズモン共鳴を用いて、ファ ージ抗体の選択効率を増加させることができ、本発明の蛋白質のエピトープに結
合するファージ抗体の単一のライブラリからの親和性が大きく増加する（シアー
（Schier）、Human Antibodies Hybridomas 7（1996）、97〜105；マームボルグ
（Malmborg）、J. Immunol. Methods 183（1995）、7〜13）。多くの場合、抗原
に対する抗体の結合現象はその他のリガンド／抗リガンド結合と同等である。
【００５３】 植物細胞分裂は３つの方法によって概念的に影響を受けうる：（i）細胞分裂 の阻害もしくは停止、（ii）細胞分裂の維持、促進、もしくは刺激、または（ii
i）有糸分裂および細胞質分裂からのDNA合成の非カップリング。本発明のヌクレ
オチド配列によってコードされるポリペプチドの発現の調節は、意外にも植物細
胞の分裂特徴に有利な影響を及ぼす、特にG1/Sおよび/またはG2/M移行期に関係 する遺伝子の発現レベルの破壊に影響を及ぼし、その結果関係する植物またはそ
の一部の全体的な構造に影響を及ぼす。そのような例は、サイクリン依存的蛋白
質キナーゼ複合体に対する特異的な基質の消失によって、DNA合成またはDNA複製
の進行が、負の影響を受けることである。
i）有糸分裂および細胞質分裂からのDNA合成の非カップリング。本発明のヌクレ
オチド配列によってコードされるポリペプチドの発現の調節は、意外にも植物細
胞の分裂特徴に有利な影響を及ぼす、特にG1/Sおよび/またはG2/M移行期に関係 する遺伝子の発現レベルの破壊に影響を及ぼし、その結果関係する植物またはそ
の一部の全体的な構造に影響を及ぼす。そのような例は、サイクリン依存的蛋白
質キナーゼ複合体に対する特異的な基質の消失によって、DNA合成またはDNA複製
の進行が、負の影響を受けることである。
【００５４】 「サイクリン依存性タンパク質キナーゼ複合体」という用語は、好ましくは機
能的なサイクリンが、好ましくは機能的なサイクリン依存性キナーゼと会合する
際に形成される複合体を意味する。そのような複合体は、リン酸化タンパク質に
おいて活性である可能性があり、別のタンパク質種を含む場合も含まない場合も
ある。
能的なサイクリンが、好ましくは機能的なサイクリン依存性キナーゼと会合する
際に形成される複合体を意味する。そのような複合体は、リン酸化タンパク質に
おいて活性である可能性があり、別のタンパク質種を含む場合も含まない場合も
ある。
【００５５】 植物細胞におけるCDKに対する基質の活性の有無は、本発明の遺伝子の操作に よって影響を受ける。本発明の産業上の利用能を分析するために、本発明のヌク
レオチド配列を過剰産生する形質転換植物を作製することができる。新規遺伝子
、蛋白質またはその不活性化変種のそのような過剰発現は、細胞分裂に正または
負の影響を及ぼす。発現レベルおよび／または活性を改変する方法は、当業者に
は公知であり、例えば過剰発現、共抑制、リボザイムの使用、センスおよびアン
チセンスストラテジー、遺伝子サイレント化アプローチが含まれる。「センス鎖
」という用語は、そのmRNA転写物と相同である二本鎖DNA分子の鎖を指す。「ア ンチセンス鎖」という用語は「センス鎖」の配列と相補的である逆方向配列を含
む。
レオチド配列を過剰産生する形質転換植物を作製することができる。新規遺伝子
、蛋白質またはその不活性化変種のそのような過剰発現は、細胞分裂に正または
負の影響を及ぼす。発現レベルおよび／または活性を改変する方法は、当業者に
は公知であり、例えば過剰発現、共抑制、リボザイムの使用、センスおよびアン
チセンスストラテジー、遺伝子サイレント化アプローチが含まれる。「センス鎖
」という用語は、そのmRNA転写物と相同である二本鎖DNA分子の鎖を指す。「ア ンチセンス鎖」という用語は「センス鎖」の配列と相補的である逆方向配列を含
む。
【００５６】 したがって、本発明の核酸分子は、植物の特徴を改変するために、および改変
した、好ましくは改善されたまたは有用な表現型を有する植物を得るために、植
物細胞の遺伝子操作にとって特に有用である。同様に、本発明はまた、細胞、好
ましくは植物細胞のインビトロ培養での細胞分裂および増殖を調節するために用
いることができる。
した、好ましくは改善されたまたは有用な表現型を有する植物を得るために、植
物細胞の遺伝子操作にとって特に有用である。同様に、本発明はまた、細胞、好
ましくは植物細胞のインビトロ培養での細胞分裂および増殖を調節するために用
いることができる。
【００５７】 このように、本発明は、植物、植物細胞もしくは植物組織のゲノムに本発明の
核酸分子またはベクターを導入することを含む、トランスジェニック植物、植物
細胞、または植物組織を製造する方法を提供する。
核酸分子またはベクターを導入することを含む、トランスジェニック植物、植物
細胞、または植物組織を製造する方法を提供する。
【００５８】 植物細胞においてセンスまたはアンチセンス方向に本発明の核酸分子を発現さ
せるために、分子を植物細胞において発現を確実にする調節エレメントの制御下
に置く。これらの調節エレメントは発現される核酸分子と共に形質転換すべき植
物種に関して異種または同種であってもよい。一般に、そのような調節エレメン
トは植物細胞において活性なプロモーターを含む。トランスジェニック植物の全
ての組織において発現を得るためには、好ましくはCaMVの35Sプロモーター（オ ーデル（Odell）、Nature 313（1985）、810〜812）、またはトウモロコシのポ リユビキチン遺伝子のプロモーター（クリステンセン（Christensen）、Plant M
ol. Biol. 18（1982）、675〜689）のような構成的プロモーターを用いる。トラ
ンスジェニック植物の特定の組織において発現させるためには、組織特異的プロ
モーター（例えば、ストックハウス（Stockhaus）、EMBO J. 8（1989）、2245〜
2251）を用いることが可能である。ジャガイモの塊茎またはトウモロコシ、ソラ
マメ、コムギ、オオムギ等の異なる植物種の種子において特に活性であるプロモ
ーターが知られている。発現を正確に制御することができるようにするためには
、誘導型プロモーターを用いてもよい。誘導型プロモーターの例は、熱ショック
蛋白質をコードする遺伝子のプロモーターである。同様に、ミクロスポア特異的
調節エレメントおよびその使用についても記述されている（国際公開公報第96/1
6182号）。さらに、化学的に誘導可能な試験システム（ガッツ（Gatz）、Mol. G
en. Genet. 227（1991）；229〜237）を用いてもよい。さらに適したプロモータ
ーは当業者に公知であり、例えばワード（Ward、Plant Mol. Biol. 22（1992） 、361〜366）に記述されている。調節エレメントはさらに、植物細胞において機
能的な転写および／または翻訳エンハンサーを含んでもよい。さらに、調節エレ
メントはポリAシグナルのような転写終結シグナルを含んでもよく、それによっ て転写物へのポリAテールが付加され、その安定性が改善する可能性がある。
せるために、分子を植物細胞において発現を確実にする調節エレメントの制御下
に置く。これらの調節エレメントは発現される核酸分子と共に形質転換すべき植
物種に関して異種または同種であってもよい。一般に、そのような調節エレメン
トは植物細胞において活性なプロモーターを含む。トランスジェニック植物の全
ての組織において発現を得るためには、好ましくはCaMVの35Sプロモーター（オ ーデル（Odell）、Nature 313（1985）、810〜812）、またはトウモロコシのポ リユビキチン遺伝子のプロモーター（クリステンセン（Christensen）、Plant M
ol. Biol. 18（1982）、675〜689）のような構成的プロモーターを用いる。トラ
ンスジェニック植物の特定の組織において発現させるためには、組織特異的プロ
モーター（例えば、ストックハウス（Stockhaus）、EMBO J. 8（1989）、2245〜
2251）を用いることが可能である。ジャガイモの塊茎またはトウモロコシ、ソラ
マメ、コムギ、オオムギ等の異なる植物種の種子において特に活性であるプロモ
ーターが知られている。発現を正確に制御することができるようにするためには
、誘導型プロモーターを用いてもよい。誘導型プロモーターの例は、熱ショック
蛋白質をコードする遺伝子のプロモーターである。同様に、ミクロスポア特異的
調節エレメントおよびその使用についても記述されている（国際公開公報第96/1
6182号）。さらに、化学的に誘導可能な試験システム（ガッツ（Gatz）、Mol. G
en. Genet. 227（1991）；229〜237）を用いてもよい。さらに適したプロモータ
ーは当業者に公知であり、例えばワード（Ward、Plant Mol. Biol. 22（1992） 、361〜366）に記述されている。調節エレメントはさらに、植物細胞において機
能的な転写および／または翻訳エンハンサーを含んでもよい。さらに、調節エレ
メントはポリAシグナルのような転写終結シグナルを含んでもよく、それによっ て転写物へのポリAテールが付加され、その安定性が改善する可能性がある。
【００５９】 本発明の核酸分子がセンス方向に発現される場合、蛋白質が植物細胞の望まし
い細胞内区画に存在するようにコード配列を改変することは基本的に可能である
。これらには、核、小胞体、液胞、ミトコンドリア、プラスチド、アポプラスト
、細胞質等が含まれる。本発明の蛋白質の相互作用成分であるCDC2は細胞質およ
び／または核においてその作用を発揮するため、本発明の蛋白質を同じ細胞内区
画に指向させるためには対応するシグナル配列が好ましい。このような改変を実
施する方法および所望の細胞内区画に確実に存在させるシグナル配列は当業者に
周知である。
い細胞内区画に存在するようにコード配列を改変することは基本的に可能である
。これらには、核、小胞体、液胞、ミトコンドリア、プラスチド、アポプラスト
、細胞質等が含まれる。本発明の蛋白質の相互作用成分であるCDC2は細胞質およ
び／または核においてその作用を発揮するため、本発明の蛋白質を同じ細胞内区
画に指向させるためには対応するシグナル配列が好ましい。このような改変を実
施する方法および所望の細胞内区画に確実に存在させるシグナル配列は当業者に
周知である。
【００６０】 異物DNAを植物に導入する方法もまた当技術分野において周知である。これら には、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefa
ciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes） を用いたT-DNAによる植物細胞もしくは組織の形質転換、プロトプラスト融合、 直接遺伝子移入（例えば欧州特許A 164 575号を参照のこと）、インジェクショ ン、電気穿孔、粒子衝撃のようなバイオリスティック（Biolistic）法、花粉媒 介形質転換、植物RNAウイルス媒介形質転換、リポソーム媒介形質転換、損傷し たもしくは酵素によって分解した未成熟胚を用いた形質転換、または損傷もしく
は酵素によって分解した胚発生カルス、および当技術分野で公知のその他の方法
が含まれる。本発明の方法において用いられるベクターはさらに機能的なエレメ
ント、例えば、植物ゲノムへの安定的な組み込みを可能にするアグロバクテリウ
ムのT-DNAの「左境界」および「右境界」配列を含んでもよい。さらに、マーカ ーを含まないトランスジェニック植物、すなわち選択またはスコア可能マーカー
遺伝子が植物の発生または植物栽培の特定の段階で失われている植物の作製を可
能にする方法およびベクターは、当業者に公知である。これは、例えば共形質転
換（リズニック（Lyznik）、Plant Mol. Biol. 13（1989）、151〜161；ペン（P
eng）、Plant Mol. Biol. 27（1995）、91〜104）によっておよび／または植物 において相同組換えを促進することができる酵素を利用するシステム（例えば、
国際公開公報第97/08331号；ベイレイ（Bayley）、Plant Mol. Biol. 18（1992 ）、353〜361；ロイド（Lloyd）、Mol. Gen. Genet. 242（1994）、653〜657； マエサー（Maeser）、Mol. Gen. Genet. 230（1991）、170〜176；オノウチ（On
ouchi）、Nucl. Acids. Res. 19（1991）、6373〜6378）を用いることによって 達成することができる。適当なベクターを調製する方法は例えば、サムブルック
（Sambrook）の「分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning, A L
aboratory Manual）」、第二版（1989）、コールドスプリングハーバー研究所出
版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）に記載されている。アグロ
バクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の適当な株お よびベクターと共に、アグロバクテリウムの形質転換ならびに適当な増殖培地お
よび選択培地は当業者に周知であり、先行技術（GV3101（pMK90RK）、クロンツ （Kroncz）、Mol. Gen. Genet. 204（1986）、383〜396；C58C1（pGV 3850kan）
、デブラエル（Deblaere）、Nucl. Acid. Res. 13（1985）、4777；ビーバン（B
evan）、Nucleic. Acids. Res. 12（1984）、8711；クロンツ（Kroncz）、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86（1989）、8467〜8471；クロンツ（Kroncz）、Plant
Mol. Biol. 20（1992）、963〜976；クロンツ（Kroncz）、「遺伝子タグおよび 発現研究用の専門ベクター（Specialized vectors for gene tagging and expre
ssion studies）」、「植物の分子生物学マニュアル第二巻（Plant Molecular B
iology Manual）」、ゲルビン＆シルペロオルト（Gelvin and Schilperoort）編
、ドルドレヒト、オランダ；クルワーアカデミック出版（1994）、1〜22；欧州 特許A120 516号；ホーケマ（Hoekema）「バイナリ植物ベクターシステム（Binar
y Plant Vector System）」オフセットドルッケリ・カンタースB. V.（Offsetdr
ukkerij Kanters, B. V.）、アルブラッセルダム（1985）、第V章、フラレー（F
raley）、Crit. Rev. Plant Sci. 4、1〜46；アン（An）、EMBO J. 4（1985）、
277〜287）に記載されている。本発明の方法にはアグロバクテリウム・ツメファ
シエンス（Agrobacterium tumefaciens）を使用することが好ましいが、アグロ バクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）のようなその他のアグ
ロバクテリウム株も、例えば該株によって付与される表現型が望ましい場合には
用いてもよい。
ciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes） を用いたT-DNAによる植物細胞もしくは組織の形質転換、プロトプラスト融合、 直接遺伝子移入（例えば欧州特許A 164 575号を参照のこと）、インジェクショ ン、電気穿孔、粒子衝撃のようなバイオリスティック（Biolistic）法、花粉媒 介形質転換、植物RNAウイルス媒介形質転換、リポソーム媒介形質転換、損傷し たもしくは酵素によって分解した未成熟胚を用いた形質転換、または損傷もしく
は酵素によって分解した胚発生カルス、および当技術分野で公知のその他の方法
が含まれる。本発明の方法において用いられるベクターはさらに機能的なエレメ
ント、例えば、植物ゲノムへの安定的な組み込みを可能にするアグロバクテリウ
ムのT-DNAの「左境界」および「右境界」配列を含んでもよい。さらに、マーカ ーを含まないトランスジェニック植物、すなわち選択またはスコア可能マーカー
遺伝子が植物の発生または植物栽培の特定の段階で失われている植物の作製を可
能にする方法およびベクターは、当業者に公知である。これは、例えば共形質転
換（リズニック（Lyznik）、Plant Mol. Biol. 13（1989）、151〜161；ペン（P
eng）、Plant Mol. Biol. 27（1995）、91〜104）によっておよび／または植物 において相同組換えを促進することができる酵素を利用するシステム（例えば、
国際公開公報第97/08331号；ベイレイ（Bayley）、Plant Mol. Biol. 18（1992 ）、353〜361；ロイド（Lloyd）、Mol. Gen. Genet. 242（1994）、653〜657； マエサー（Maeser）、Mol. Gen. Genet. 230（1991）、170〜176；オノウチ（On
ouchi）、Nucl. Acids. Res. 19（1991）、6373〜6378）を用いることによって 達成することができる。適当なベクターを調製する方法は例えば、サムブルック
（Sambrook）の「分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning, A L
aboratory Manual）」、第二版（1989）、コールドスプリングハーバー研究所出
版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）に記載されている。アグロ
バクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の適当な株お よびベクターと共に、アグロバクテリウムの形質転換ならびに適当な増殖培地お
よび選択培地は当業者に周知であり、先行技術（GV3101（pMK90RK）、クロンツ （Kroncz）、Mol. Gen. Genet. 204（1986）、383〜396；C58C1（pGV 3850kan）
、デブラエル（Deblaere）、Nucl. Acid. Res. 13（1985）、4777；ビーバン（B
evan）、Nucleic. Acids. Res. 12（1984）、8711；クロンツ（Kroncz）、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86（1989）、8467〜8471；クロンツ（Kroncz）、Plant
Mol. Biol. 20（1992）、963〜976；クロンツ（Kroncz）、「遺伝子タグおよび 発現研究用の専門ベクター（Specialized vectors for gene tagging and expre
ssion studies）」、「植物の分子生物学マニュアル第二巻（Plant Molecular B
iology Manual）」、ゲルビン＆シルペロオルト（Gelvin and Schilperoort）編
、ドルドレヒト、オランダ；クルワーアカデミック出版（1994）、1〜22；欧州 特許A120 516号；ホーケマ（Hoekema）「バイナリ植物ベクターシステム（Binar
y Plant Vector System）」オフセットドルッケリ・カンタースB. V.（Offsetdr
ukkerij Kanters, B. V.）、アルブラッセルダム（1985）、第V章、フラレー（F
raley）、Crit. Rev. Plant Sci. 4、1〜46；アン（An）、EMBO J. 4（1985）、
277〜287）に記載されている。本発明の方法にはアグロバクテリウム・ツメファ
シエンス（Agrobacterium tumefaciens）を使用することが好ましいが、アグロ バクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）のようなその他のアグ
ロバクテリウム株も、例えば該株によって付与される表現型が望ましい場合には
用いてもよい。
【００６１】 バイオリスティック（biolistic）法を用いた形質転換法は当業者に周知であ る；例えば、ワン（Wan）、Plant Physiol. 104（1994）、37〜48；バジル（Vas
il）、Bio/Technology 11（1993）、1553〜1558およびクリストウ（Christou） （1996）、Trends in Plant Science 1、423〜431を参照のこと。マイクロイン ジェクションはポトリクス＆スパンゲンベルグ（Potrykus and Spangenberg）編
、「植物への遺伝子移入（Gene Transfer To Plants）」スプリンガー・バーラ グ、ベルリン、ニューヨーク州（1995）に記述のように実施することができる。
ほとんどの双子葉植物の形質転換は上記の方法を用いて可能である。しかし、単
子葉植物の形質転換に関しては、成功した形質転換技法がいくつか開発されてい
る。これらの中には、例えば上記のようにバイオリスティック（biolistic）法 を用いる形質転換と共にプロトプラスト形質転換、部分透過細胞の電気穿孔、ガ
ラスファイバーを用いたDNA導入等が含まれる。
il）、Bio/Technology 11（1993）、1553〜1558およびクリストウ（Christou） （1996）、Trends in Plant Science 1、423〜431を参照のこと。マイクロイン ジェクションはポトリクス＆スパンゲンベルグ（Potrykus and Spangenberg）編
、「植物への遺伝子移入（Gene Transfer To Plants）」スプリンガー・バーラ グ、ベルリン、ニューヨーク州（1995）に記述のように実施することができる。
ほとんどの双子葉植物の形質転換は上記の方法を用いて可能である。しかし、単
子葉植物の形質転換に関しては、成功した形質転換技法がいくつか開発されてい
る。これらの中には、例えば上記のようにバイオリスティック（biolistic）法 を用いる形質転換と共にプロトプラスト形質転換、部分透過細胞の電気穿孔、ガ
ラスファイバーを用いたDNA導入等が含まれる。
【００６２】 本明細書において用いられる「形質転換」という用語は、移入に用いられる方
法によらず、宿主細胞に外因性のポリヌクレオチドを移入することを指す。ポリ
ヌクレオチドは宿主細胞に一過性的または安定的に導入してもよく、例えば、プ
ラスミドとして非組み込み体で維持してもよく、または宿主ゲノムに組み込まれ
てもよい。得られた形質転換植物細胞を用いて、当業者に公知の方法によって形
質転換植物を再生させることができる。
法によらず、宿主細胞に外因性のポリヌクレオチドを移入することを指す。ポリ
ヌクレオチドは宿主細胞に一過性的または安定的に導入してもよく、例えば、プ
ラスミドとして非組み込み体で維持してもよく、または宿主ゲノムに組み込まれ
てもよい。得られた形質転換植物細胞を用いて、当業者に公知の方法によって形
質転換植物を再生させることができる。
【００６３】 一般に、本発明に従って改変することができ、本発明の蛋白質の過剰発現、ま
たは該蛋白質の合成の減少のいずれかを示す植物は、如何なる所望の植物種から
誘導できる。それらは単子葉植物とも双子葉植物ともなりうるが、好ましくはそ
れらは、穀物植物（例えば、トウモロコシ、コメ、オオムギ、コムギ、ライ麦、
オート麦等）、ジャガイモ、油産生植物（例えば、菜種、ヒマワリ、ピーナッツ
、大豆等）、ワタ、テンサイ、サトウキビ、マメ科植物（例えば、インゲン豆、
エンドウ豆等）、木材産出植物、好ましくは木などのような、農業、木材の栽培
または園芸において重要な植物種に属する。
たは該蛋白質の合成の減少のいずれかを示す植物は、如何なる所望の植物種から
誘導できる。それらは単子葉植物とも双子葉植物ともなりうるが、好ましくはそ
れらは、穀物植物（例えば、トウモロコシ、コメ、オオムギ、コムギ、ライ麦、
オート麦等）、ジャガイモ、油産生植物（例えば、菜種、ヒマワリ、ピーナッツ
、大豆等）、ワタ、テンサイ、サトウキビ、マメ科植物（例えば、インゲン豆、
エンドウ豆等）、木材産出植物、好ましくは木などのような、農業、木材の栽培
または園芸において重要な植物種に属する。
【００６４】 このように、本発明はまた、植物細胞における核酸分子の発現を可能にする調
節エレメントに結合して、ゲノムに安定的に組み入れられた本発明の核酸分子を
含み、核酸分子がトランスジェニック植物細胞にとって異物である、トランスジ
ェニック植物細胞にも関する。異物の意味に関しては前述の記載を参照のこと。
節エレメントに結合して、ゲノムに安定的に組み入れられた本発明の核酸分子を
含み、核酸分子がトランスジェニック植物細胞にとって異物である、トランスジ
ェニック植物細胞にも関する。異物の意味に関しては前述の記載を参照のこと。
【００６５】 トランスジェニック植物細胞に核酸分子が存在して発現されることにより、そ
のような細胞を含む植物において細胞周期相互作用蛋白質が合成され、生理学的
変化および表現型の変化が起こる。
のような細胞を含む植物において細胞周期相互作用蛋白質が合成され、生理学的
変化および表現型の変化が起こる。
【００６６】 このように、本発明はまた、本発明のトランスジェニック植物細胞を含むトラ
ンスジェニック植物および植物組織にも関する。本発明の細胞周期相互作用蛋白
質の（過剰）発現により、例えば発生段階および／またはそれらが本来存在しな
い植物組織において、これらのトランスジェニック植物は、野生型植物と比較し
て様々な生理学的な生育の改変および／または形態学的改変を示す可能性がある
。例えば、これらのトランスジェニック植物は変化した細胞伸長を示す可能性が
ある。
ンスジェニック植物および植物組織にも関する。本発明の細胞周期相互作用蛋白
質の（過剰）発現により、例えば発生段階および／またはそれらが本来存在しな
い植物組織において、これらのトランスジェニック植物は、野生型植物と比較し
て様々な生理学的な生育の改変および／または形態学的改変を示す可能性がある
。例えば、これらのトランスジェニック植物は変化した細胞伸長を示す可能性が
ある。
【００６７】 したがって、本発明の一部は、植物細胞分裂ならびに／または植物細胞、植物
組織、植物器官、および／もしくは植物体全体の生長を調節するために、植物細
胞周期遺伝子および／または植物細胞周期蛋白質を利用することである。本発明
の核酸分子によって植物細胞を形質転換することによって、植物細胞におけるサ
イクリン依存的蛋白質キナーゼの活性に影響を及ぼす方法および／または該分子
の発現の操作も本発明の範囲内に属する。より詳しく述べると、本発明の核酸分
子を使用すれば、サイクリン依存的蛋白質キナーゼに対する基質の発現を妨害す
ることによって、植物細胞分裂の破壊を達成することができる。後者の目標は、
例えば活性な細胞周期相互作用蛋白質の量を減少させる方法によって達成しても
よい。
組織、植物器官、および／もしくは植物体全体の生長を調節するために、植物細
胞周期遺伝子および／または植物細胞周期蛋白質を利用することである。本発明
の核酸分子によって植物細胞を形質転換することによって、植物細胞におけるサ
イクリン依存的蛋白質キナーゼの活性に影響を及ぼす方法および／または該分子
の発現の操作も本発明の範囲内に属する。より詳しく述べると、本発明の核酸分
子を使用すれば、サイクリン依存的蛋白質キナーゼに対する基質の発現を妨害す
ることによって、植物細胞分裂の破壊を達成することができる。後者の目標は、
例えば活性な細胞周期相互作用蛋白質の量を減少させる方法によって達成しても
よい。
【００６８】 したがって、本発明はまた、核酸分子またはその一部の転写および／または発
現によって、細胞周期相互作用蛋白質の合成が減少する、（ゲノムに安定的に組
み入れられた）本発明の核酸分子またはその一部を含むトランスジェニック植物
細胞にも関する。
現によって、細胞周期相互作用蛋白質の合成が減少する、（ゲノムに安定的に組
み入れられた）本発明の核酸分子またはその一部を含むトランスジェニック植物
細胞にも関する。
【００６９】 好ましい態様において、減少はアンチセンス、センス、リボザイム、共抑制お
よび／または優性変異作用によって達成される。
よび／または優性変異作用によって達成される。
【００７０】 「アンチセンス」および「アンチセンスヌクレオチド」とは、自然界に存在す
る遺伝子産物の発現を遮断するDNAまたはRNA構築物を意味する。例えば、本発明
において、「th65アンチセンスRNA」を生じるDNA構築物を使用することにより、
「th65 mRNA」を破壊または不活化することによって「th65」の発現が遮断され る。
る遺伝子産物の発現を遮断するDNAまたはRNA構築物を意味する。例えば、本発明
において、「th65アンチセンスRNA」を生じるDNA構築物を使用することにより、
「th65 mRNA」を破壊または不活化することによって「th65」の発現が遮断され る。
【００７１】 本発明の核酸分子を提供することにより、上記のように蛋白質のレベルが減少
した、そしてこのように細胞周期相互作用蛋白質の蓄積が欠損したトランスジェ
ニック植物細胞を作製する可能性が開かれる。これを達成する技術は当業者に周
知である。これらには例えば、アンチセンスおよびリボザイム機能を合わせた分
子、および／または共抑制作用を提供する分子のアンチセンスRNA、リボザイム の発現が含まれる；上記も参照のこと。植物細胞において細胞周期相互作用蛋白
質の量を減少させるアンチセンスアプローチを用いる場合、アンチセンスRNAを コードする核酸分子は好ましくは、形質転換に用いる植物種に関して同種起源で
ある。しかし、細胞周期相互作用蛋白質をコードする、内因性的に存在する核酸
分子と高度の相同性を示す核酸分子を用いることも可能である。この場合、相同
性は好ましくは80％以上、特に90％以上であり、さらになお好ましくは95％以上
である。
した、そしてこのように細胞周期相互作用蛋白質の蓄積が欠損したトランスジェ
ニック植物細胞を作製する可能性が開かれる。これを達成する技術は当業者に周
知である。これらには例えば、アンチセンスおよびリボザイム機能を合わせた分
子、および／または共抑制作用を提供する分子のアンチセンスRNA、リボザイム の発現が含まれる；上記も参照のこと。植物細胞において細胞周期相互作用蛋白
質の量を減少させるアンチセンスアプローチを用いる場合、アンチセンスRNAを コードする核酸分子は好ましくは、形質転換に用いる植物種に関して同種起源で
ある。しかし、細胞周期相互作用蛋白質をコードする、内因性的に存在する核酸
分子と高度の相同性を示す核酸分子を用いることも可能である。この場合、相同
性は好ましくは80％以上、特に90％以上であり、さらになお好ましくは95％以上
である。
【００７２】 トランスジェニック植物細胞において本発明の蛋白質合成が減少すると、例え
ば、細胞分裂に変化を生じうる。そのような細胞を含むトランスジェニック植物
では、これは様々な生理学的、発生的および／または形態学的変化となりうる。
ば、細胞分裂に変化を生じうる。そのような細胞を含むトランスジェニック植物
では、これは様々な生理学的、発生的および／または形態学的変化となりうる。
【００７３】 このように、本発明はまた、上記トランスジェニック植物細胞を含むトランス
ジェニック植物にも関する。これらは例えば、減少した生長特性を示す可能性が
ある。
ジェニック植物にも関する。これらは例えば、減少した生長特性を示す可能性が
ある。
【００７４】 本発明はまた、本発明の蛋白質の過剰発現またはそのような蛋白質合成の減少
のいずれかを示す、上記のトランスジェニック植物細胞を含む培養した植物組織
にも関する。
のいずれかを示す、上記のトランスジェニック植物細胞を含む培養した植物組織
にも関する。
【００７５】 本発明に従って得られた如何なる形質転換植物も、同じ特徴を有する形質転換
植物をより多く産生するために通常の栽培計画またはインビトロ植物繁殖に用い
ることができ、および／または同じもしくは関連する種のその他の変種に同じ特
徴を導入するために用いることができる。そのような植物も本発明の一部である
。形質転換植物から得られた種子もまた遺伝的に同じ特徴を含み、本発明の一部
である。先に述べたように、本発明は当業者に公知の如何なる形質転換法によっ
ても形質転換することができる植物および穀物に原則的に適用することができ、
それらには例えば、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、コメ、脂肪種子穀物、ワ
タ、木材種、テンサイ、キャッサバ、トマト、ジャガイモ、その他の多くの野菜
、果物が含まれる。
植物をより多く産生するために通常の栽培計画またはインビトロ植物繁殖に用い
ることができ、および／または同じもしくは関連する種のその他の変種に同じ特
徴を導入するために用いることができる。そのような植物も本発明の一部である
。形質転換植物から得られた種子もまた遺伝的に同じ特徴を含み、本発明の一部
である。先に述べたように、本発明は当業者に公知の如何なる形質転換法によっ
ても形質転換することができる植物および穀物に原則的に適用することができ、
それらには例えば、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、コメ、脂肪種子穀物、ワ
タ、木材種、テンサイ、キャッサバ、トマト、ジャガイモ、その他の多くの野菜
、果物が含まれる。
【００７６】 さらにもう一つの局面において、本発明はまた、本発明の核酸分子を発現する
トランスジェニック植物細胞または所望の蛋白質レベルの減少を示す細胞のいず
れかを含む、本発明のトランスジェニック植物の収穫可能な部分および繁殖材料
にも関する。収穫可能な植物は原則的に植物の如何なる有用な部分、例えば花、
花粉、実生、塊茎、葉、茎、果実、種子、根等ともなりうる。繁殖材料には例え
ば、種子、果実、挿し木、実生、塊茎、根茎等が含まれる。
トランスジェニック植物細胞または所望の蛋白質レベルの減少を示す細胞のいず
れかを含む、本発明のトランスジェニック植物の収穫可能な部分および繁殖材料
にも関する。収穫可能な植物は原則的に植物の如何なる有用な部分、例えば花、
花粉、実生、塊茎、葉、茎、果実、種子、根等ともなりうる。繁殖材料には例え
ば、種子、果実、挿し木、実生、塊茎、根茎等が含まれる。
【００７７】 本発明はさらに、以下の段階を含む、細胞周期蛋白質のアクチベーターまたは
インヒビターを同定し、得る方法に関する： （a）適当な条件下で蛋白質と相互作用することができる読み出し系と本発明の 蛋白質とを含む反応混合物と、スクリーニングすべき化合物とを合わせる段階； （b）該読み出し系と蛋白質との相互作用を可能にする条件下で、化合物または 複数の化合物を含む試料の存在下で反応混合物を維持する段階； （c）読み出し系の抑制または活性化に至る、試料および化合物を個別に同定ま たは確認する段階。
インヒビターを同定し、得る方法に関する： （a）適当な条件下で蛋白質と相互作用することができる読み出し系と本発明の 蛋白質とを含む反応混合物と、スクリーニングすべき化合物とを合わせる段階； （b）該読み出し系と蛋白質との相互作用を可能にする条件下で、化合物または 複数の化合物を含む試料の存在下で反応混合物を維持する段階； （c）読み出し系の抑制または活性化に至る、試料および化合物を個別に同定ま たは確認する段階。
【００７８】 本発明の文中における「読み出し系」という用語は、細胞、組織、または生物
において転写および／または発現の際にスコア可能なおよび／または選択可能な
表現型を提供するDNA配列を意味する。そのような読み出し系は当業者に周知で あり、例えば、上記および添付の実施例に記述する組換え型DNA分子およびマー カー遺伝子を含む。
において転写および／または発現の際にスコア可能なおよび／または選択可能な
表現型を提供するDNA配列を意味する。そのような読み出し系は当業者に周知で あり、例えば、上記および添付の実施例に記述する組換え型DNA分子およびマー カー遺伝子を含む。
【００７９】 本発明の方法における「複数の化合物」という用語は、同一であってもなくて
もよい複数の物質であると理解される。
もよい複数の物質であると理解される。
【００８０】 該化合物または複数の化合物は例えば、試料、例えば植物、動物、または微生
物由来の細胞抽出物に含まれていてもよい。さらに、該化合物は当技術分野で公
知であるが、これまで細胞周期相互作用蛋白質を抑制または活性化できることが
知られていないものであってもよい。反応混合物は細胞を含まない抽出物であっ
てもよく、細胞または組織培養物を含んでもよい。本発明の方法に適したセット
アップは当業者に公知であり、例えば、アルバーツ（Alberts）ら、「細胞の分 子生物学（Molecular Biology of the Cell）」第三版（1994）、特に第17章に 一般的に記述されている。複数の化合物は例えば、反応混合物、培養培地に加え
てもよく、または細胞に注射してもよい。
物由来の細胞抽出物に含まれていてもよい。さらに、該化合物は当技術分野で公
知であるが、これまで細胞周期相互作用蛋白質を抑制または活性化できることが
知られていないものであってもよい。反応混合物は細胞を含まない抽出物であっ
てもよく、細胞または組織培養物を含んでもよい。本発明の方法に適したセット
アップは当業者に公知であり、例えば、アルバーツ（Alberts）ら、「細胞の分 子生物学（Molecular Biology of the Cell）」第三版（1994）、特に第17章に 一般的に記述されている。複数の化合物は例えば、反応混合物、培養培地に加え
てもよく、または細胞に注射してもよい。
【００８１】 一つの化合物または複数の化合物を含む試料が本発明の方法において同定され
れば、細胞周期相互作用蛋白質を抑制または活性化することができる化合物を含
むものとして同定されたもとの試料から化合物を単離することが可能であるか、
または例えばもとの試料が複数の異なる化合物を含む場合、試料あたりの異なる
物質数を減少させるためにもとの試料をさらに分割して、分割した試料について
この方法をさらに繰り返すことができる。試料の複雑さに応じて、上記の段階を
数回行うことができ、好ましくは本発明の方法によって同定された試料が限られ
た数、または唯一の物質を含むようになるまで行うことができる。好ましくは試
料は類似の化学および／または物理的特性を有する物質を含み、最も好ましくは
該物質は同一である。好ましくは上記方法によって同定された化合物またはその
誘導体はさらに、植物の栽培または植物細胞および組織の培養に適用するために
適した形で製剤化される。
れば、細胞周期相互作用蛋白質を抑制または活性化することができる化合物を含
むものとして同定されたもとの試料から化合物を単離することが可能であるか、
または例えばもとの試料が複数の異なる化合物を含む場合、試料あたりの異なる
物質数を減少させるためにもとの試料をさらに分割して、分割した試料について
この方法をさらに繰り返すことができる。試料の複雑さに応じて、上記の段階を
数回行うことができ、好ましくは本発明の方法によって同定された試料が限られ
た数、または唯一の物質を含むようになるまで行うことができる。好ましくは試
料は類似の化学および／または物理的特性を有する物質を含み、最も好ましくは
該物質は同一である。好ましくは上記方法によって同定された化合物またはその
誘導体はさらに、植物の栽培または植物細胞および組織の培養に適用するために
適した形で製剤化される。
【００８２】 本発明の方法に従って試験および同定することができる化合物は発現ライブラ
リ、例えばcDNA発現ライブラリ、ペプチド、蛋白質、核酸、抗体、小有機化合物
、ホルモン、ペプチド模倣体、PNA等であってもよい（ミルナー（Milner）、Nat
ure Medicine 1（1995）、879〜880；ハップ（Hupp）、Cell 83（1995）、237〜
245；ギブス（Gibbs）、Cell 79（1994）、193〜198および上記で引用した参考 文献）。さらに、細胞周期相互作用遺伝子の調節物質と思われる物質をコードす
る遺伝子および／または本発明の細胞周期相互作用蛋白質の上流または下流にそ
の作用を及ぼす遺伝子を、例えば当技術分野で公知の遺伝子ターゲティングベク
ター（例えば、ハヤシ（Hayashi）、Science 258（1992）、1350〜1353；フリッ
ツェ＆ワルデン（Fritze and Walden）「T-DNAタギングによる遺伝子の活性化（
Gene Activation by T-DNA tagging）」、「分子生物学の方法（Methods in Mol
ecular Biology）」 44（ガートランド&ダベイ（Gartland, K.M.A. and Davey,
M.R.）編、トトワ・ヒューマンプレス（1995）、281〜294）、またはトランスポ
ゾンタギング（チャンドリー（Chandlee）、Physiologia Plantarum 78（1990）
、105〜115）を用いた、例えば挿入変異誘発を用いて同定してもよい。該化合物
はまた既知のインヒビターまたはアクチベーターの機能的誘導体または類似体と
もなりうる。化学的誘導体および類似体を調製する方法は当業者に周知であり、
例えばベイルスタイン（Beilstein）、「有機化学ハンドブック（Handbook of O
rganic Chemistry）」スプリンガー版ニューヨークインク、アメリカニューヨー
ク州10010、ニューヨーク市５番街175、および「有機合成（Organic Synthesis ）」、ウィリー、ニューヨーク、アメリカに記述されている。さらに、そのよう
な誘導体および類似体は当技術分野で公知の方法に従ってそれらの作用について
調べることができる。さらに、ペプチド模倣体および／またはコンピューターに
よる適当な誘導体および類似体のデザインを、例えば上記の方法に従って用いる
ことができる。本発明の方法において用いてもよい細胞または組織は、下記の態
様に記述する本発明の宿主細胞、植物細胞、または植物組織である。
リ、例えばcDNA発現ライブラリ、ペプチド、蛋白質、核酸、抗体、小有機化合物
、ホルモン、ペプチド模倣体、PNA等であってもよい（ミルナー（Milner）、Nat
ure Medicine 1（1995）、879〜880；ハップ（Hupp）、Cell 83（1995）、237〜
245；ギブス（Gibbs）、Cell 79（1994）、193〜198および上記で引用した参考 文献）。さらに、細胞周期相互作用遺伝子の調節物質と思われる物質をコードす
る遺伝子および／または本発明の細胞周期相互作用蛋白質の上流または下流にそ
の作用を及ぼす遺伝子を、例えば当技術分野で公知の遺伝子ターゲティングベク
ター（例えば、ハヤシ（Hayashi）、Science 258（1992）、1350〜1353；フリッ
ツェ＆ワルデン（Fritze and Walden）「T-DNAタギングによる遺伝子の活性化（
Gene Activation by T-DNA tagging）」、「分子生物学の方法（Methods in Mol
ecular Biology）」 44（ガートランド&ダベイ（Gartland, K.M.A. and Davey,
M.R.）編、トトワ・ヒューマンプレス（1995）、281〜294）、またはトランスポ
ゾンタギング（チャンドリー（Chandlee）、Physiologia Plantarum 78（1990）
、105〜115）を用いた、例えば挿入変異誘発を用いて同定してもよい。該化合物
はまた既知のインヒビターまたはアクチベーターの機能的誘導体または類似体と
もなりうる。化学的誘導体および類似体を調製する方法は当業者に周知であり、
例えばベイルスタイン（Beilstein）、「有機化学ハンドブック（Handbook of O
rganic Chemistry）」スプリンガー版ニューヨークインク、アメリカニューヨー
ク州10010、ニューヨーク市５番街175、および「有機合成（Organic Synthesis ）」、ウィリー、ニューヨーク、アメリカに記述されている。さらに、そのよう
な誘導体および類似体は当技術分野で公知の方法に従ってそれらの作用について
調べることができる。さらに、ペプチド模倣体および／またはコンピューターに
よる適当な誘導体および類似体のデザインを、例えば上記の方法に従って用いる
ことができる。本発明の方法において用いてもよい細胞または組織は、下記の態
様に記述する本発明の宿主細胞、植物細胞、または植物組織である。
【００８３】 化合物が細胞周期相互作用蛋白質を抑制または活性化することができるか否か
を決定することは、例えば、DNA複製および細胞分裂をモニターすることによっ て行うことができる。これはさらに、化合物と接触させた本発明の細胞の表現型
特徴をモニターして、それを野生型植物の特徴と比較することによって行うこと
ができる。さらなる態様において、そのような特徴は、細胞周期相互作用蛋白質
を抑制または活性化することができる、もしくはできないことがわかっている化
合物と接触させた細胞の特徴と比較してもよい。
を決定することは、例えば、DNA複製および細胞分裂をモニターすることによっ て行うことができる。これはさらに、化合物と接触させた本発明の細胞の表現型
特徴をモニターして、それを野生型植物の特徴と比較することによって行うこと
ができる。さらなる態様において、そのような特徴は、細胞周期相互作用蛋白質
を抑制または活性化することができる、もしくはできないことがわかっている化
合物と接触させた細胞の特徴と比較してもよい。
【００８４】 上記方法によって同定されたインヒビターまたはアクチベーターは、除草剤、
殺虫剤、および／または植物生長調節物質として有用となる可能性がある。この
ように、さらなる態様において、本発明は、化合物が細胞周期相互作用蛋白質の
アクチベーターである、または細胞周期相互作用蛋白質のインヒビターである、
本発明の方法に従って得られたまたは同定された化合物に関する。上記化合物は
例えば、細胞周期キナーゼインヒビターを含む。「細胞周期キナーゼインヒビタ
ー」（CKI）はCDK／サイクリン活性を阻害し、細胞分裂を一時的または連続的に
妨害しなければならない場合に産生および／または活性化される蛋白質である。
殺虫剤、および／または植物生長調節物質として有用となる可能性がある。この
ように、さらなる態様において、本発明は、化合物が細胞周期相互作用蛋白質の
アクチベーターである、または細胞周期相互作用蛋白質のインヒビターである、
本発明の方法に従って得られたまたは同定された化合物に関する。上記化合物は
例えば、細胞周期キナーゼインヒビターを含む。「細胞周期キナーゼインヒビタ
ー」（CKI）はCDK／サイクリン活性を阻害し、細胞分裂を一時的または連続的に
妨害しなければならない場合に産生および／または活性化される蛋白質である。
【００８５】 そのような有用な化合物は例えば、本発明の細胞周期相互作用蛋白質に結合す
るトランス作用因子となりうる。トランス作用因子の同定は、当技術分野におい
て標準的な方法を用いて行うことができる（例えば、サムブルック（Sambrook）
、上記およびアウスユベール（Ausubel）、上記を参照のこと）。本発明の蛋白 質にある蛋白質が結合するか否かを調べるために、標準的な未変性ゲルシフトア
ッセイ法を行うことができる。本発明の蛋白質と結合するトランス作用因子を同
定するために、本発明の蛋白質は標準的な蛋白質精製法においてアフィニティ試
薬として、または発現ライブラリをスクリーニングするためのプローブとして用
いることができる。トランス作用因子が同定されれば、例えば本発明の蛋白質と
トランス作用因子との結合に対するインヒビターのスクリーニングから始めて、
本発明の細胞周期相互作用蛋白質に対するその結合の調節を追求することができ
る。そうすれば、トランス作用因子（もしくはその阻害物質）またはそれをコー
ドする遺伝子を、例えばトランスジェニック植物用のベクターに適用することに
よって、植物における細胞周期相互作用蛋白質の活性化または抑制を達成するこ
とができる。さらに、トランス作用因子の活性化型が二量体である場合、その活
性を阻害するためにトランス作用因子のドミナント・ネガティブ変異体を作製す
ることができる。さらに、トランス作用因子が同定されれば、細胞周期の制御に
関係する遺伝子の活性化（例えばシグナル伝達）または抑制に至る経路における
さらなる成分を同定することができる。次に、動物および植物において細胞周期
を調節するさらなる薬物および方法を開発するために、これらの成分の活性の調
節を追跡することができる。
るトランス作用因子となりうる。トランス作用因子の同定は、当技術分野におい
て標準的な方法を用いて行うことができる（例えば、サムブルック（Sambrook）
、上記およびアウスユベール（Ausubel）、上記を参照のこと）。本発明の蛋白 質にある蛋白質が結合するか否かを調べるために、標準的な未変性ゲルシフトア
ッセイ法を行うことができる。本発明の蛋白質と結合するトランス作用因子を同
定するために、本発明の蛋白質は標準的な蛋白質精製法においてアフィニティ試
薬として、または発現ライブラリをスクリーニングするためのプローブとして用
いることができる。トランス作用因子が同定されれば、例えば本発明の蛋白質と
トランス作用因子との結合に対するインヒビターのスクリーニングから始めて、
本発明の細胞周期相互作用蛋白質に対するその結合の調節を追求することができ
る。そうすれば、トランス作用因子（もしくはその阻害物質）またはそれをコー
ドする遺伝子を、例えばトランスジェニック植物用のベクターに適用することに
よって、植物における細胞周期相互作用蛋白質の活性化または抑制を達成するこ
とができる。さらに、トランス作用因子の活性化型が二量体である場合、その活
性を阻害するためにトランス作用因子のドミナント・ネガティブ変異体を作製す
ることができる。さらに、トランス作用因子が同定されれば、細胞周期の制御に
関係する遺伝子の活性化（例えばシグナル伝達）または抑制に至る経路における
さらなる成分を同定することができる。次に、動物および植物において細胞周期
を調節するさらなる薬物および方法を開発するために、これらの成分の活性の調
節を追跡することができる。
【００８６】 本発明はまた、上記核酸分子、ベクター、蛋白質、抗体、または化合物および
選択的に適した検出手段を少なくとも一つ含む診断的組成物にも関する。
選択的に適した検出手段を少なくとも一つ含む診断的組成物にも関する。
【００８７】 該診断的組成物は、細胞からmRNAを単離する段階およびそのように得られたmR
NAを上記の核酸プローブを含むプローブとハイブリダイズ条件下で接触させる段
階、プローブとハイブリダイズしたmRNAの存在を検出する段階、およびそれによ
って細胞における蛋白質の発現を検出する段階を含む、対応するmRNAの存在を検
出することによって細胞周期相互作用蛋白質の発現を検出する方法に用いてもよ
い。本発明の蛋白質の存在を検出するさらなる方法は、当技術分野で周知の免疫
技法、例えば酵素結合イムノソルベントアッセイ法を含む。さらに、植物の栽培
における分子マーカーとして本発明の核酸分子を用いることも可能である。
NAを上記の核酸プローブを含むプローブとハイブリダイズ条件下で接触させる段
階、プローブとハイブリダイズしたmRNAの存在を検出する段階、およびそれによ
って細胞における蛋白質の発現を検出する段階を含む、対応するmRNAの存在を検
出することによって細胞周期相互作用蛋白質の発現を検出する方法に用いてもよ
い。本発明の蛋白質の存在を検出するさらなる方法は、当技術分野で周知の免疫
技法、例えば酵素結合イムノソルベントアッセイ法を含む。さらに、植物の栽培
における分子マーカーとして本発明の核酸分子を用いることも可能である。
【００８８】 当業者は、哺乳類または昆虫のようなその他の生物における細胞分裂の進行に
影響を及ぼすために、酵母および動物のようなその他の生物からの本発明の蛋白
質を利用することができる。好ましい態様において、本発明の一つ以上のDNA配 列、ベクターもしくは蛋白質、または例えば上記の抗体もしくは化合物は、形質
転換植物、特に以下における細胞周期プロセスにおけるG1/Sおよび／またはG2/M
移行期に関係する遺伝子の発現レベルの破壊を特に妨害するために用いられる： ・完全な植物において ・選択した植物器官、組織または細胞タイプにおいて ・低温、熱、乾燥もしくは塩ストレスのような非生物的ストレスまたは病原体の
攻撃のような生物的ストレスを含む特定の環境条件下で ・特定の生育期の際に
影響を及ぼすために、酵母および動物のようなその他の生物からの本発明の蛋白
質を利用することができる。好ましい態様において、本発明の一つ以上のDNA配 列、ベクターもしくは蛋白質、または例えば上記の抗体もしくは化合物は、形質
転換植物、特に以下における細胞周期プロセスにおけるG1/Sおよび／またはG2/M
移行期に関係する遺伝子の発現レベルの破壊を特に妨害するために用いられる： ・完全な植物において ・選択した植物器官、組織または細胞タイプにおいて ・低温、熱、乾燥もしくは塩ストレスのような非生物的ストレスまたは病原体の
攻撃のような生物的ストレスを含む特定の環境条件下で ・特定の生育期の際に
【００８９】 本発明のもう一つの局面は、本発明の一つ以上のDNA配列、ベクター、もしく は蛋白質、または上記抗体もしくは化合物を例えば、植物またはその一部の貯蔵
細胞、貯蔵組織および／または貯蔵器官における核内倍加を調節するために用い
ることができる。「核内倍加」という用語はその後有糸分裂および細胞質分裂を
伴わない再発性のDNA複製を意味する。
細胞、貯蔵組織および／または貯蔵器官における核内倍加を調節するために用い
ることができる。「核内倍加」という用語はその後有糸分裂および細胞質分裂を
伴わない再発性のDNA複製を意味する。
【００９０】 核内倍加を調節するための好ましい標的貯蔵器官およびその一部は、例えば種
子（シリアル、脂肪種子穀物など）、根（テンサイの場合のような）、塊茎（ジ
ャガイモのような）および果実（野菜および果実の種子のような）である。さら
に貯蔵器官およびその一部における核内倍加の増加は、貯蔵能の増加に相関し、
それによって収率が改善すると予想される。本発明のさらにもう一つの態様にお
いて、植物体全体またはその一部における核内倍加が調節された植物は、上記手
段によって当業者に公知の方法で細胞を形質転換することによって単一の植物細
胞から得ることができる。
子（シリアル、脂肪種子穀物など）、根（テンサイの場合のような）、塊茎（ジ
ャガイモのような）および果実（野菜および果実の種子のような）である。さら
に貯蔵器官およびその一部における核内倍加の増加は、貯蔵能の増加に相関し、
それによって収率が改善すると予想される。本発明のさらにもう一つの態様にお
いて、植物体全体またはその一部における核内倍加が調節された植物は、上記手
段によって当業者に公知の方法で細胞を形質転換することによって単一の植物細
胞から得ることができる。
【００９１】 前述の内容を考慮して、本発明はまた、本発明のDNA配列、ベクター、蛋白質 、抗体または化合物を、植物の細胞周期、植物細胞分裂および／または生長を調
節するために、植物細胞におけるサイクリン依存的蛋白質キナーゼの活性に影響
を及ぼすために、サイクリン依存的蛋白質キナーゼの基質の有無に影響を及ぼす
ことによって、または基質の発現を妨害することによって植物細胞の分裂を破壊
するために、上記の宿主における細胞分裂の進行に影響を及ぼすために、または
細胞周期蛋白質のインヒビターもしくはアクチベーターを同定するためのスクリ
ーニング法において用いるために、使用することに関する。本発明の核酸分子を
改変した特徴を有する植物の遺伝子操作のために用いる、および相同な分子を同
定するために用いる上記の可能性のほかに、記載の核酸分子は、その他のいくつ
かの応用に、例えば上記の細胞周期蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核
酸分子を同定するために用いてもよい。このことは上記のアッセイ法のような当
技術分野で周知のアッセイ法によって達成することができ、同様に、例えばいわ
ゆる酵母の「ツーハイブリッド系」を使用するスコフィールド（Scofield、Scie
nce 274（1996）、2063〜2065）に記述されたアッセイ法が含まれる；添付の実 施例も参照のこと。この系において、本発明の核酸分子またはその小さい一部に
よってコードされる蛋白質は、GAL4転写因子のDNA結合ドメインに結合している 。この融合蛋白質を発現し、且つGAL4転写因子によって認識される適当なプロモ
ーターによって駆動されるlacZリポーター遺伝子を含む酵母株を、活性化ドメイ
ンと融合した植物蛋白質またはそのペプチドを発現するcDNAライブラリによって
形質転換する。このように、cDNAの一つによってコードされるペプチドが本発明
の蛋白質のペプチドを含む融合ペプチドと相互作用することができる場合、複合
体はリポーター遺伝子の発現を指向することができる。このようにして、本発明
の核酸分子およびコードされるペプチドは細胞周期相互作用蛋白質と相互作用す
るペプチドおよび蛋白質を同定するために用いることができる。次に、この系お
よび類似の系をさらに相互作用蛋白質の結合のインヒビターの同定のために活用
してもよいことは当業者には明らかであると思われる。
節するために、植物細胞におけるサイクリン依存的蛋白質キナーゼの活性に影響
を及ぼすために、サイクリン依存的蛋白質キナーゼの基質の有無に影響を及ぼす
ことによって、または基質の発現を妨害することによって植物細胞の分裂を破壊
するために、上記の宿主における細胞分裂の進行に影響を及ぼすために、または
細胞周期蛋白質のインヒビターもしくはアクチベーターを同定するためのスクリ
ーニング法において用いるために、使用することに関する。本発明の核酸分子を
改変した特徴を有する植物の遺伝子操作のために用いる、および相同な分子を同
定するために用いる上記の可能性のほかに、記載の核酸分子は、その他のいくつ
かの応用に、例えば上記の細胞周期蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核
酸分子を同定するために用いてもよい。このことは上記のアッセイ法のような当
技術分野で周知のアッセイ法によって達成することができ、同様に、例えばいわ
ゆる酵母の「ツーハイブリッド系」を使用するスコフィールド（Scofield、Scie
nce 274（1996）、2063〜2065）に記述されたアッセイ法が含まれる；添付の実 施例も参照のこと。この系において、本発明の核酸分子またはその小さい一部に
よってコードされる蛋白質は、GAL4転写因子のDNA結合ドメインに結合している 。この融合蛋白質を発現し、且つGAL4転写因子によって認識される適当なプロモ
ーターによって駆動されるlacZリポーター遺伝子を含む酵母株を、活性化ドメイ
ンと融合した植物蛋白質またはそのペプチドを発現するcDNAライブラリによって
形質転換する。このように、cDNAの一つによってコードされるペプチドが本発明
の蛋白質のペプチドを含む融合ペプチドと相互作用することができる場合、複合
体はリポーター遺伝子の発現を指向することができる。このようにして、本発明
の核酸分子およびコードされるペプチドは細胞周期相互作用蛋白質と相互作用す
るペプチドおよび蛋白質を同定するために用いることができる。次に、この系お
よび類似の系をさらに相互作用蛋白質の結合のインヒビターの同定のために活用
してもよいことは当業者には明らかであると思われる。
【００９２】 本発明の蛋白質または該分子をコードする核酸分子と相互作用する化合物を同
定するその他の方法は、例えばファージディスプレイシステムによるインビトロ
スクリーニングと共にフィルター結合アッセイまたは例えばBIAコア装置（ファ ルマシア社）を用いた相互作用の「リアルタイム」測定である；前述の内容で引
用された参考文献を参照のこと。。
定するその他の方法は、例えばファージディスプレイシステムによるインビトロ
スクリーニングと共にフィルター結合アッセイまたは例えばBIAコア装置（ファ ルマシア社）を用いた相互作用の「リアルタイム」測定である；前述の内容で引
用された参考文献を参照のこと。。
【００９３】 これらおよびその他の態様は本発明の説明および実施例によって開示され、そ
の中に含まれる。本発明に従って用いられる方法、使用および化合物のいずれか
一つに関するさらなる文献は、例えば電子的装置を用いて公共の図書館から検索
してもよい。例えば、インターネット上で利用できる公共のデータベースである
「メッドライン」http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.htmlを用いて もよい。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/、http://www.infobiogen.fr/、http://
www.fmi.ch/biology/research_tools.html、http://www.tigr.org/のようなさら
なるデータベースおよびアドレスは当業者に公知であり、例えばhttp://www.lyc
os.comを用いて得ることができる。バイオテクノロジーにおける特許情報の概要
ならびにレトロスペクティブ調査用および現状認識に有用な関連特許情報源の調
査は、バークス（Berks）、TIBTECH 12（1994）、352〜364において得られる。
の中に含まれる。本発明に従って用いられる方法、使用および化合物のいずれか
一つに関するさらなる文献は、例えば電子的装置を用いて公共の図書館から検索
してもよい。例えば、インターネット上で利用できる公共のデータベースである
「メッドライン」http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.htmlを用いて もよい。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/、http://www.infobiogen.fr/、http://
www.fmi.ch/biology/research_tools.html、http://www.tigr.org/のようなさら
なるデータベースおよびアドレスは当業者に公知であり、例えばhttp://www.lyc
os.comを用いて得ることができる。バイオテクノロジーにおける特許情報の概要
ならびにレトロスペクティブ調査用および現状認識に有用な関連特許情報源の調
査は、バークス（Berks）、TIBTECH 12（1994）、352〜364において得られる。
【００９４】 本発明を、以下の非制限的な図および実施例を参考にすることによってさらに
説明する。
説明する。
【００９５】 実施例により本発明を説明する： 実施例に特に記述がないかぎり、すべての組換えDNA技術は、サムブルック（Sam
brook）ら(1989)、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning
: A Laboratory Manual）」Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY(1982)ま
たはアウスベル（Ausubel）ら(1994)「分子生物学の最新プロトコール、最新プ ロトコール（Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols） 」第1および2巻に記載されたプロトコールにしたがった。植物の分子研究の標準
的な材料および方法は、BIOS科学出版（BIOS Scientific Publications Ltd）(U
K)およびブラックウェル科学出版（Blackwell Scientific Publications）(UK) の共同出版による、R.D.D.クロイ（Croy）「植物の分子生物学Labfase (Plant M
olecular Biology Labfase)」(1993)に記載されている。
brook）ら(1989)、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning
: A Laboratory Manual）」Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY(1982)ま
たはアウスベル（Ausubel）ら(1994)「分子生物学の最新プロトコール、最新プ ロトコール（Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols） 」第1および2巻に記載されたプロトコールにしたがった。植物の分子研究の標準
的な材料および方法は、BIOS科学出版（BIOS Scientific Publications Ltd）(U
K)およびブラックウェル科学出版（Blackwell Scientific Publications）(UK) の共同出版による、R.D.D.クロイ（Croy）「植物の分子生物学Labfase (Plant M
olecular Biology Labfase)」(1993)に記載されている。
【００９６】 実施例１：細胞周期相互作用蛋白質の同定 用いられるベクターおよび株はマッチメイカー・ツーハイブリッドシステム（
クロンテック社、パロアルト、カリフォルニア州）によって供給された。CDC2aA
tを用いたおとりはPCR断片をpGBT9ベクターに挿入することによって構築した。P
CR断片はEcoRI制限酵素部位を組み入れるようにプライマーを用いることによっ てcDNAから作製した。CDC2aAtに関しては、プライマー5'-CGAGATCTGAATTCATGGAT
CAGTA-3'（配列番号：３）および5'-CGAGATCTGAATTCCTAAGGCATGCC-3'（配列番号
：４）を用いた。CDC2bAtに関しては、プライマー5'-CGGATCCGAATTCATGGAGAACGA
G-3'（配列番号：５）および5'-CGGATCCGAATTCTCAGAACTGAGA-3'（配列番号：６ ）を用いた。PCR断片をEcoRIによって切断してpGBT9のEcoRI部位にクローニング
して、プラスミドpGBTCDC2AおよびpGBTCDC2Bを得た。３週齢のシロイヌナズナ栄
養植物のGAL4活性化ドメインcDNA融合ライブラリをクロンテック社から得た。ス
クリーニングに関して、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisi
ae）株HF7c（MATa ura3-52 his3-200 ade2-101 lys2-801 trp1-901 leu 2-3,112
gal4-542 gal80-538 LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3 URA3::GAL417mers(3x)-CyC1 TATA -LacZ）をpGBTCDC2A 590 μg、ライブラリのDNA 1100 μg、およびサケ精子
担体DNA 40 mgによって、酢酸リチウム法（ギエツ（Gietz）ら、1992、Nucleic.
Acids. Research, 20、1425頁）を用いて共形質転換した。独立した共形質転換
体の数を推定するために、形質転換混合物の1000倍希釈液をLeu-およびTrp-培地
上に播種した。形質転換混合物の残りを培地上に播種して、ヒスチジン原栄養性
（Trp-、Leu-、His-）に関して選択した。30℃で６日間増殖させた後、２ mm以 上のコロニーを10 mM 3-アミノ-1,2,4-トリアゾール（シグマ社、セントルイス 、ミズーリ州）を加えたヒスチジン欠損培地上で画線培養した。これらの条件で
増殖することができるコロニーに関してβ-ガラクトシダーゼ活性を調べた。活 性化ドメインプラスミドをHis+およびLacZ+コロニーから単離した。プライマー5
'-ATACCACTACAATGGATG-3'（配列番号：７）および5'-AGTTGAAGTGAACTTGCGGG-3' （配列番号：８）を用いてpGAD10インサートをPCR増幅した。PCR断片をAluIで消
化して２％アガロースゲル上で分離した。そのPCR産物が異なる制限酵素パター ンを生じるプラスミドを大腸菌XL-1-Blueに電気穿孔し、インサートのDNA配列を
決定した。抽出したDNAを用いて、相互作用の特異性を調べるためにHF7cの再形 質転換を行った。
クロンテック社、パロアルト、カリフォルニア州）によって供給された。CDC2aA
tを用いたおとりはPCR断片をpGBT9ベクターに挿入することによって構築した。P
CR断片はEcoRI制限酵素部位を組み入れるようにプライマーを用いることによっ てcDNAから作製した。CDC2aAtに関しては、プライマー5'-CGAGATCTGAATTCATGGAT
CAGTA-3'（配列番号：３）および5'-CGAGATCTGAATTCCTAAGGCATGCC-3'（配列番号
：４）を用いた。CDC2bAtに関しては、プライマー5'-CGGATCCGAATTCATGGAGAACGA
G-3'（配列番号：５）および5'-CGGATCCGAATTCTCAGAACTGAGA-3'（配列番号：６ ）を用いた。PCR断片をEcoRIによって切断してpGBT9のEcoRI部位にクローニング
して、プラスミドpGBTCDC2AおよびpGBTCDC2Bを得た。３週齢のシロイヌナズナ栄
養植物のGAL4活性化ドメインcDNA融合ライブラリをクロンテック社から得た。ス
クリーニングに関して、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisi
ae）株HF7c（MATa ura3-52 his3-200 ade2-101 lys2-801 trp1-901 leu 2-3,112
gal4-542 gal80-538 LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3 URA3::GAL417mers(3x)-CyC1 TATA -LacZ）をpGBTCDC2A 590 μg、ライブラリのDNA 1100 μg、およびサケ精子
担体DNA 40 mgによって、酢酸リチウム法（ギエツ（Gietz）ら、1992、Nucleic.
Acids. Research, 20、1425頁）を用いて共形質転換した。独立した共形質転換
体の数を推定するために、形質転換混合物の1000倍希釈液をLeu-およびTrp-培地
上に播種した。形質転換混合物の残りを培地上に播種して、ヒスチジン原栄養性
（Trp-、Leu-、His-）に関して選択した。30℃で６日間増殖させた後、２ mm以 上のコロニーを10 mM 3-アミノ-1,2,4-トリアゾール（シグマ社、セントルイス 、ミズーリ州）を加えたヒスチジン欠損培地上で画線培養した。これらの条件で
増殖することができるコロニーに関してβ-ガラクトシダーゼ活性を調べた。活 性化ドメインプラスミドをHis+およびLacZ+コロニーから単離した。プライマー5
'-ATACCACTACAATGGATG-3'（配列番号：７）および5'-AGTTGAAGTGAACTTGCGGG-3' （配列番号：８）を用いてpGAD10インサートをPCR増幅した。PCR断片をAluIで消
化して２％アガロースゲル上で分離した。そのPCR産物が異なる制限酵素パター ンを生じるプラスミドを大腸菌XL-1-Blueに電気穿孔し、インサートのDNA配列を
決定した。抽出したDNAを用いて、相互作用の特異性を調べるためにHF7cの再形 質転換を行った。
【００９７】 実施例２：新規細胞周期遺伝子の特徴分析 GAL4 DNA結合ドメインとCDC2aAtとの間の融合蛋白質をおとりとして用いて上 記２ハイブリッドスクリーニングを行った。GAL4活性化ドメインをスクリーニン
グするために、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の３週齢栄養組織から
構築したcDNA融合ライブラリを用いた。連続した選択ラウンドの後、CDC2aAt-特
異的相互作用蛋白質をコードする興味深いクローンが同定され、th65と命名され
、これは配列番号：２に対応するアミノ酸394個のオープンリーディングフレー ム（図１）を含むように思われるが、データベース上の如何なる蛋白質とも有意
な相同性を示さなかった。N末端はグルタミン残基に富む領域を含んだ（配列番 号：２）。グルタミンに富むドメインはしばしば、DNA結合因子の転写活性化ド メインの一部であり（ミッチェル＆ティジアン（Mitchell and Tjian）、1989、
Science 245、371〜378）、蛋白質・蛋白質相互作用に関係していることも示さ れている（バオ（Bao）ら、1996、PNAS 93、5037〜5042）。th65オープンリーデ
ィングフレームはまた、３つのコンセンサスCDK燐酸化部位を含む。th65がCDC2a
At-関連蛋白質として同定されたことおよびこれらの燐酸化部位が存在すること は、th65蛋白質がCDKの基質であることを示している。
グするために、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の３週齢栄養組織から
構築したcDNA融合ライブラリを用いた。連続した選択ラウンドの後、CDC2aAt-特
異的相互作用蛋白質をコードする興味深いクローンが同定され、th65と命名され
、これは配列番号：２に対応するアミノ酸394個のオープンリーディングフレー ム（図１）を含むように思われるが、データベース上の如何なる蛋白質とも有意
な相同性を示さなかった。N末端はグルタミン残基に富む領域を含んだ（配列番 号：２）。グルタミンに富むドメインはしばしば、DNA結合因子の転写活性化ド メインの一部であり（ミッチェル＆ティジアン（Mitchell and Tjian）、1989、
Science 245、371〜378）、蛋白質・蛋白質相互作用に関係していることも示さ れている（バオ（Bao）ら、1996、PNAS 93、5037〜5042）。th65オープンリーデ
ィングフレームはまた、３つのコンセンサスCDK燐酸化部位を含む。th65がCDC2a
At-関連蛋白質として同定されたことおよびこれらの燐酸化部位が存在すること は、th65蛋白質がCDKの基質であることを示している。
【００９８】 実施例３：変化した細胞周期を有するトランスジェニック植物の産生 TH65遺伝子のゲノムクローンを標準的な技法によって得て、完全にシークエン
シングした。次に、完全長のコード領域を、構成的CaMV 35Sプロモーターの制御
下でバイナリベクターPGSV4（ヘロウアート（Herouart）ら、1994、Plant Physi
ol. 104、873〜886）においてセンスおよびアンチセンス方向にクローニングし た。さらに、コンセンサスCDK燐酸化部位の非燐酸化部位への置換を含む構築物 を点突然変異によって構築して、CaMV 35Sプロモーターの制御下でPGSV4にクロ ーニングした。得られたバイナリベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエ
ンス（Agrobacterium tumefaciens）に形質転換した。これらの株を用いて、リ ーフディスクプロトコール（ホルシュ（Horsh）ら、1985、Science 227、1229〜
1231）によりタバコ変種プチハバナ（Nicotiana tabacum cv. Petit havana）を
形質転換し、根形質転換プロトコール（バルベケンス（Valvekens）ら、1988、P
NAS 85、5536〜5540）を用いてシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）を形質
転換した。
シングした。次に、完全長のコード領域を、構成的CaMV 35Sプロモーターの制御
下でバイナリベクターPGSV4（ヘロウアート（Herouart）ら、1994、Plant Physi
ol. 104、873〜886）においてセンスおよびアンチセンス方向にクローニングし た。さらに、コンセンサスCDK燐酸化部位の非燐酸化部位への置換を含む構築物 を点突然変異によって構築して、CaMV 35Sプロモーターの制御下でPGSV4にクロ ーニングした。得られたバイナリベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエ
ンス（Agrobacterium tumefaciens）に形質転換した。これらの株を用いて、リ ーフディスクプロトコール（ホルシュ（Horsh）ら、1985、Science 227、1229〜
1231）によりタバコ変種プチハバナ（Nicotiana tabacum cv. Petit havana）を
形質転換し、根形質転換プロトコール（バルベケンス（Valvekens）ら、1988、P
NAS 85、5536〜5540）を用いてシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）を形質
転換した。
【配列表】
【図１】 配列のC末端部分においてth65クローン、TPNK、SPGR、およびSPVR（太字およ び下線）によってコードされるアミノ酸配列は、CDKコンセンサス燐酸化部位で ある。配列のN末端領域ではアミノ酸残基Q（下線）が繰り返し存在する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 33/53 5/00 Ｂ Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ
Claims (29)
- 【請求項１】 以下の配列からなる群より選択される、細胞周期相互作用蛋
白質をコードする、または該蛋白質の免疫学的活性および／もしくは機能的断片
をコードするDNA配列： （a）配列番号：２に示すアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするヌクレオチド 配列を含むDNA配列； （b）配列番号：１に示すヌクレオチド配列を含むDNA配列； （c）（a）もしくは（b）に定義されるDNA配列の相補鎖とハイブリダイズし、且
つ（a）もしくは（b）のDNA配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくと も80％同一であるアミノ酸配列をコードするDNA配列； （d）そのヌクレオチド配列が、遺伝子コードの結果として、（a）〜（c）のい ずれか一つに定義されるDNA配列のヌクレオチド配列に対して縮重しているDNA配
列；および （e）（a）〜（d）のいずれか一つのDNA配列によってコードされる蛋白質の断片
をコードするDNA配列。 - 【請求項２】 CDC2aをおとりとして、栄養植物組織のcDNAライブラリを捕 獲対象として用いる２ハイブリッドスクリーニング解析を含む、細胞周期相互作
用蛋白質を同定し、得る方法。 - 【請求項３】 CDC2aがCDC2aAtである、請求項２記載の方法。
- 【請求項４】 請求項２または３記載の方法によって得ることができる細胞
周期相互作用蛋白質をコードするDNA配列。 - 【請求項５】 請求項１もしくは４記載のDNA配列、またはその相補鎖と特 異的にハイブリダイズする、長さが少なくとも15ヌクレオチドである核酸分子。
- 【請求項６】 請求項１または４記載のDNA配列を含むベクター。
- 【請求項７】 DNA配列が、原核および／または真核宿主細胞における発現 を可能にする一つもしくは複数の調節配列に機能的に結合されている、発現ベク
ターである請求項６記載のベクター。 - 【請求項８】 請求項６もしくは７記載のベクターまたは請求項１もしくは
４記載のDNA配列を含む宿主細胞。 - 【請求項９】 細菌、昆虫、真菌、植物または動物細胞である、請求項８記
載の宿主細胞。 - 【請求項10】 蛋白質の発現を可能にする条件下で請求項８または９記載の
宿主細胞を培養する段階、および生じた蛋白質を培養物から回収する段階を含む
、細胞周期相互作用蛋白質またはその免疫学的活性もしくは機能的断片を製造す
る方法。 - 【請求項11】 請求項１もしくは４記載のDNA配列がコードすることができ る、または請求項２、３もしくは10記載の方法によって得ることができる細胞周
期相互作用蛋白質またはその免疫学的活性もしくは機能的断片。 - 【請求項12】 請求項11記載の蛋白質またはその断片もしくはエピトープを
特異的に認識する抗体。 - 【請求項13】 請求項１、４、もしくは５記載のDNA配列または請求項６も しくは７記載のベクターを、植物、植物細胞、または植物組織のゲノムに導入す
る段階を含む、トランスジェニック植物、植物細胞、または植物組織の製造方法
。 - 【請求項14】 植物組織または植物細胞から植物体を再生する段階をさらに
含む、請求項13記載の方法。 - 【請求項15】 植物細胞においてDNA配列の転写および／もしくは発現を可 能にする調節エレメントに機能的に結合している請求項１もしくは４記載のDNA 配列を含む、または請求項13もしくは14記載の方法に従って得ることができるト
ランスジェニック植物細胞。 - 【請求項16】 DNA配列またはベクターが植物細胞のゲノムに安定的に組み 込まれている、請求項15記載のトランスジェニック植物細胞。
- 【請求項17】 請求項15または16記載の植物細胞を含むトランスジェニック
植物または植物組織。 - 【請求項18】 植物細胞の分裂および／または増殖が変化している、請求項
17記載のトランスジェニック植物。 - 【請求項19】 DNA配列またはその一部の転写および／または発現によって 細胞における請求項11記載の蛋白質の合成が減少する、ゲノムに安定的に組み込
まれた請求項１、４もしくは５記載のDNA配列もしくはその一部を含む、または 請求項13もしくは14記載の方法に従って得ることができるトランスジェニック植
物細胞。 - 【請求項20】 減少がアンチセンス、センス、リボザイム、共抑制および／
または優性変異作用によって得られる、請求項19記載の植物細胞。 - 【請求項21】 請求項19または20記載の植物細胞を含むトランスジェニック
植物または植物組織。 - 【請求項22】 植物細胞の分裂および／または増殖の欠損を示す請求項21記
載のトランスジェニック植物。 - 【請求項23】 請求項15、16、19もしくは20記載の植物細胞を含む、請求項
17、18、21、もしくは22のいずれか一項に記載の植物の収穫可能な部分または繁
殖材料。 - 【請求項24】 以下の段階を含む、細胞周期タンパク質のアクチベーターま
たはインヒビターを同定し、得る方法： （a）請求項11記載の蛋白質および適当な条件下で蛋白質と相互作用することが できる読み出し系を含む反応混合物と、スクリーニングする化合物とを組合わせ
る段階； （b）蛋白質と該読み出し系との相互作用を可能にする条件下で、複数の化合物 を含む化合物または試料の存在下で反応混合物を維持する段階； （c）読み出し系の抑制または活性化に至る、試料および化合物をそれぞれ同定 または確認する段階。 - 【請求項25】 請求項24記載の方法の段階および、段階（c）において得ら れたもしくは同定された化合物またはその誘導体を農業もしくは植物細胞および
組織培養での適用に適した形で処方する段階を含む植物除草剤の製造方法。 - 【請求項26】 細胞周期相互作用蛋白質のアクチベーターまたはインヒビタ
ーである、請求項24記載の方法によって得られる、または同定される化合物。 - 【請求項27】 請求項１、４もしくは５記載のDNA配列、請求項６もしくは ７記載のベクター、請求項11記載の蛋白質、請求項12記載の抗体または請求項26
記載の化合物および選択的に適した検出手段を含む、診断的組成物。 - 【請求項28】 植物細胞周期、植物細胞分裂および／または増殖を調節する
こと、植物細胞におけるサイクリン依存的蛋白質キナーゼの活性化に影響を与え
ること、サイクリン依存的蛋白質キナーゼに対する基質の有無に影響を与える、
もしくは基質の発現を妨害することによって植物細胞分裂を破壊すること、請求
項９に定義した宿主における細胞分裂進行に影響を与えること、または細胞周期
蛋白質のインヒビターもしくはアクチベーターを同定するスクリーニング方法に
おいて用いることを目的とする、請求項１、４もしくは５記載のDNA配列、請求 項６もしくは７記載のベクター、請求項11記載の蛋白質、請求項12記載の抗体、
または請求項26記載の化合物の使用。 - 【請求項29】 増殖調節物質および／または除草剤としての、請求項26記載
の化合物の使用。
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