EP1135497A1 - Polypeptides capables d'interagir avec la topoisomerase iii alpha humaine - Google Patents

Polypeptides capables d'interagir avec la topoisomerase iii alpha humaine

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EP1135497A1
EP1135497A1 EP99973067A EP99973067A EP1135497A1 EP 1135497 A1 EP1135497 A1 EP 1135497A1 EP 99973067 A EP99973067 A EP 99973067A EP 99973067 A EP99973067 A EP 99973067A EP 1135497 A1 EP1135497 A1 EP 1135497A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
polypeptide
topoisomerase
dna
sequence
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP99973067A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Alain Fournier
Hélène GOULAOUIC
Jean-François RIOU
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aventis Pharma SA
Original Assignee
Aventis Pharma SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pharma SA filed Critical Aventis Pharma SA
Publication of EP1135497A1 publication Critical patent/EP1135497A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to novel polypeptides capable of interacting with human topoisomerase III ⁇ and the nucleic acid sequences encoding these polypeptides. It further relates to a method of identifying compounds capable of interacting with said polypeptides as well as a method of identifying molecules capable of modulating the interaction of topoisomerase Ill ⁇ with said polypeptides.
  • DNA replication is a complex mechanism that involves a large number of factors. DNA comes in a physiological state in a super coiled form and access to the information it contains requires a significant change in the rate of coiling. Replication requires the removal of superturns, the separation of the two strands of the DNA double helix and the maintenance of the DNA in single strand form.
  • Modifying the winding rate is provided in vivo by topoisomerases which are enzymes capable of modifying the superstructures of the DNA.
  • topoisomerases which are enzymes capable of modifying the superstructures of the DNA.
  • type I topoisomerases which cut only one of two strands of DNA and which suppress superturns
  • type II topoisomerases which act by cutting the two strands of DNA and which are capable of suppressing or even creating the supertours.
  • the eukaryotic topoisomerases are less well known than their prokaryotic counterparts and to date, their mechanism of action has not yet been elucidated.
  • DNA helicases which act ATP-dependent manner to produce single-stranded DNA used as template for the replication process and of DNA transcription.
  • helicases attach to single-stranded DNA or to the junctions between single and double-stranded DNA, and move in one direction along DNA in the double-stranded region, destroying the bonds hydrogens joining the two strands.
  • All helicases exhibit DNA-dependent ATPase (or NTPase) activity which hydrolyzes gamma phosphate from ribonucleoside or deoxyribonucleoside 5'-triphosphate and provides the energy required for the reaction.
  • the first helicase was discovered in E. coli in 1976. Since then, more than 60 helicases have been isolated from prokaryotes and eukaryotes. The role of human helicases remains unclear in most cases, with the exception of HDHII (repair of lesions induced by X-rays), HDHIV (assembly of prebosomes), ERCC2 and ERCC3, involved in repair by excision and cell viability. Little is known about the structure of these helicases. Much of the available information on the structures and functions of helicases has been obtained by comparative analysis of amino acid sequences. In particular, conserved motifs have made it possible to group the helicases into subfamilies, based on the sequence homologies.
  • Human Topoisomerase III belongs to the family of type IA topoisomerases, and therefore presents sequence homologies with topoisomerases I and III of E. coli, yeast Topoisomerase III as well as the reverse gyrase of archaeobacteria. Human Topoisomerase III is now called Topoisomerase Ill ⁇ , in order to differentiate it from human topoisomerase Ill ⁇ , recently discovered during the sequencing of the locus of the human immunoglobulin ⁇ gene (Kawasaki, K., Minoshima, S., Nakato, E. , Shibuya, K., Shintani, A., Schmeits, JL, Wang, J. and Shimizu, N.
  • topoisomerase Ill ⁇ expressed in yeast and not purified has a partial relaxation activity of very negatively coiled DNA (Hanai, R., Caron, PR and Wang, JC 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3653 -3657).
  • Topoisomerase Ill ⁇ is a protein of 976 amino acids with a molecular weight of approximately 1 10 kDa.
  • the gene coding for human Topoisomerase Ill ⁇ is present in a single copy on chromosome 17pl 1.2-12 (Hanai, R., Caron, PR and Wang, JC 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3653-3657 ).
  • a murine counterpart of Topoisomerase III has been recently cloned (Seki, T., Deki, M., Katada, T. and Enomoto, T. 1998. Biochim Biophys Acta 1396: 127-131).
  • Topoisomerase Ill ⁇ exhibits strong sequence homology with yeast Topoisomerase III, namely 44% sequence identity and 61% similarity. The homology it presents with bacterial topoisomerases I and III is less strong, namely 24% identity and 44%) of similarity.
  • Topoisomerase III ⁇ resembles Topoisomerase I of E. coli more than other members of the group of topoisomerases type IA from the point of view of the organization of the protein in domains. Indeed, these two polypeptides contain a C-terminal domain without equivalent in Topoisomerase III from E. coli or yeast. This C-terminal domain contains motifs with 4 cysteines (3 motifs for Topoisomerase I from E. coli and 1.5 motif for human Topoisomerase Ma), as well as an extreme C-terminal domain for which it has been demonstrated, for the Topoisomerase I from E. coli, a role in DNA binding.
  • Topoisomerase Ill ⁇ seems to be essential, at least during embryogenesis, since the knockout of the murine counterpart of Topoisomer Ill ⁇ is lethal (Li, W. and Wang, JC 1998 Proc. Natl. Acad. Sci USA 95: 1010-1013).
  • the messenger RNAs of Topoisomerase Ill ⁇ are present in many tissues (heart, brain, placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney, pancreas) in the form of three transcripts of sizes 7.2, 6 and 4 kilobases (Fritz, ⁇ . , ⁇ lsea, SH, Patel, PI and Meyn, MS 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4538-4542).
  • Topoisomerase Ill ⁇ plays a role in maintaining the stability of the genome.
  • cDNA CAT4.5 coding for a truncated human Topoisomerase Ill ⁇ of 141 N-terminal amino acids, is able to complement the phenotype of hypersensitivity to ionizing radiation of AT cells (Ataxia-Telangectasia) presenting a mutation in the gene ATM (Fritz, E., Elsea, SH, Patel, PI and Meyn, MS 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4538-4542).
  • yeast two independent studies have shown the existence of an interaction between the helicase SGS1 and the yeast Topoisomerase III.
  • the sgsl- mutants are suppressors of the top3- phenotype (slow growth, hyper-recombination) in the yeast S. cerevisiae (Gangloff, S., McDonald, JP, Bendixen, C, Arthur, L. and Rothstein , R. 1994. Mol. Cell. Biol. 14: 8391-8398).
  • the first 500 amino acids of SGS1 interact with the yeast Topoisomerase III (Gangloff, S., McDonald, JP, Bendixen, C, Arthur, L. and Rothstein, R. 1994.
  • the present invention results from the discovery of new polypeptides capable of interacting with the topoisomerase Ill ⁇ (hereinafter called polypeptides partner of the topoisomerase Ill ⁇ ). It also results from the discovery that these polypeptides show a strong homology with proteins which have structural characteristics common to RNA helicases and for which no function had been described until now. The demonstration of this interaction and these homologies designate these proteins as DNA helicases partners of the topoisomerase Ill ⁇ . The identification of these partners makes it possible to envisage numerous applications based on the combined action of these partner proteins and of topoisomerase Ma; these applications relate in particular to:
  • This enzyme releases negatively twisted DNA and introduces positive supertours into circular DNA in an ATP-dependent fashion (Forterre, P., Mirambeau, G., Jaxel, C, Nadal, M. and Duguet, M. 1985. EMBO J. 4: 2123-2128).
  • This reverse eukaryotic gyrase activity can be used to eliminate particular DNA structures, such as cruciform DNA, Z DNA, mismatches, recombination intermediates etc.
  • topoisomerase Ma is capable of interacting with a protein possessing the properties of a DNA helicase, it is possible to envisage the production in vivo or in vitro of a topoisomerase Ma / protein complex. partner constituting an enzymatic complex having the functions of reverse gyrase type. It should be noted that such a positive DNA supercoiling function has never been described in eukaryotes before.
  • topoisomerase Ma Unlike helicase SGS1, known to interact with yeast topoisomerase III, the partner protein of topoisomerase Ma highlighted by the applicant does not belong to the family of RecQ type helicases.
  • the polypeptides according to the invention show a high degree of homology with the sequence of a human protein DDX14 published by Chung et al (Chung, J., Lee, SG., and Song, K. 1995. Korean J. Biochem. 27: 193-197).
  • the DDX14 protein has significant sequence homology with a murine RNA helicase, however the helicase activity of this protein has not yet been demonstrated and the function of DDX14 has not yet been elucidated.
  • the polypeptides according to the invention also show a high degree of homology with the sequence of a human protein DBX1 published by Lahn et al (Lahn, T. and Page, D.C. 1997. Science. 278: 675-680).
  • the DBX1 protein codes for a protein which has homologies with RNA helicases but its helicase activity has never been demonstrated and the function of the DBX1 protein has not yet been identified.
  • the DBXl protein codes for a protein of 662 amino acids.
  • the corresponding gene is located on the sex chromosome X and its counterpart located on the Y chromosome is 91% identical at the protein level.
  • the nucleic and polypeptide sequences of DBX1 are presented in the sequences SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 6.
  • the expression of the DBX1 gene seems to be ubiquitous. It has now been demonstrated that the DBX1 protein has the 8 motifs characteristic of helicases of the “DEAD” family.
  • helicase PL 10 belongs to the subfamily represented by the helicase PL 10, and whose members listed are the helicases DED1 and DBP1 of the yeast, the helicase An3 of the amphibians and the murine helicases PL 10, mDEAD2 and mDEAD3 ( Gee, SL and Conboy, JG 1994. Gene 140: 171-177).
  • the helicases belonging to this subfamily contain, in addition to the central catalytic domain containing the 8 conserved motifs of the helicases, specific N and C terminal domains.
  • the C-terminal domain is rich in arginines and serines, which recalls the domains of splicing factors.
  • this domain rich in arginines and serines is shorter and does not have as many RS dipeptides as in the prototype domain of splicing factors.
  • the invention also provides a method for identifying molecules capable of blocking the interaction between human Topoisomerase Ma and a partner polypeptide of topoisomerase Ma. Such a method makes it possible to identify molecules capable in particular of blocking the activity of the type reverse gyrase of these two proteins. Such molecules are useful for modulating the processes of division, replication, transcription, translation, splicing, repair or recombination of DNA. These molecules are also likely to have a anti-tumor activity, of cytotoxic type, due to the disruption of these fundamental processes at the level of DNA.
  • a first object of the invention therefore relates to nucleotide sequences coding for polypeptides capable of interacting with topoisomerase Ma.
  • nucleotide sequences according to the invention code for a polypeptide comprising all or part of the polypeptide sequence described in the sequence SEQ ID No. 4 or its derivatives.
  • the term derived polypeptide sequence designates any polypeptide sequence differing from the sequence considered, obtained by one or more modifications of a genetic and / or chemical nature, and having the capacity to interact with topoisomerase Ma.
  • modification of genetic and / or chemical nature is meant any mutation, substitution, deletion, addition and / or modification of one or more residues.
  • Such derivatives can be generated for different purposes, such as in particular that of improving its production levels, that of increasing its resistance to proteases or of improving its passage through cell membranes, that of increasing its efficiency therapeutic or to reduce its side effects, that of increasing the affinity of the peptide for its interaction site, or that of giving it new pharmacokinetic and / or biological properties.
  • the variants include deletions or mutations relating to amino acids the presence of which is not decisive for the activity of the derivative. Such amino acids can be identified, for example, by cell activity tests as described in the examples.
  • nucleotide sequences according to the invention comprise all or part of the nucleotide sequence described in the sequence SEQ ID No. 3 and coding for the sequence SEQ ID No. 4 or the sequences derived from this nucleotide sequence.
  • the term derived nucleotide sequence designates any sequence different from the sequence considered due to the degeneration of the genetic code, obtained by one or more modifications of a genetic and / or chemical nature, as well as any sequence hybridizing with these sequences or fragments thereof and coding for a polypeptide capable of interacting with Topoisomerase Ma.
  • modification of a genetic and / or chemical nature is meant any mutation, substitution, deletion, addition and / or modification of one or several residues.
  • the term derivative also includes sequences homologous to the sequence considered, derived from other cellular sources and in particular from cells of human origin, or from other organisms. Such homologous sequences can be obtained by hybridization experiments. Hybridizations can be carried out from a nucleic acid library, using as probe, the native sequence or a fragment thereof, under variable hybridization conditions.
  • the nucleotide sequences according to the invention can be of artificial origin or not. They can be genomic sequences, cDNA, RNA, hybrid sequences or synthetic or semi-synthetic sequences. These sequences can be obtained for example by screening DNA libraries (cDNA library, genomic DNA library) by means of probes produced on the basis of sequences presented above.
  • Such libraries can be prepared from cells of different origins by standard molecular biology techniques known to those skilled in the art.
  • the nucleotide sequences of the invention can also be prepared by chemical synthesis or also by mixed methods including chemical or enzymatic modification of sequences obtained by screening of libraries.
  • the nucleic acids of the invention can be prepared according to any technique known to those skilled in the art.
  • the present invention also relates to polypeptides capable of interacting with topoisomerase Ma.
  • topoisomerase Ma covers human topoisomerase Ma in itself as well as the homologous forms corresponding in particular to mutated forms of this protein.
  • polypeptides according to the invention comprise all or part of the polypeptide sequence described in SEQ ID No. 4 or its derivatives.
  • the present invention also relates to a polypeptide characterized in that it is a fragment of the protein DBX1, capable of interacting with topoisomerase Ma and comprising all or part of the polypeptide fragment which extends between the residues 318 - 662 and represented in the polypeptide sequence SEQ ID No. 6 or its derivatives.
  • the subject of the present invention is also the use of the polypeptides according to the invention or of fragments of these polypeptides, for slowing down, inhibition, stimulation or modulation of the activity of topoisomerase Ma.
  • topoisomerase Ma by means of the polypeptides according to the invention or their fragments and in particular to inhibit or slow down the activity of topoisomerase Ma.
  • This modification of the activity of topoisomerase Ma is capable of leading to a slowdown in growth. cell or blockage of the cell cycle or induce apoptosis.
  • Another object of the present invention relates to a process for the preparation of the polypeptides according to the invention according to which a cell containing a nucleotide sequence coding for said polypeptides is cultivated, under conditions of expression of said sequence and the polypeptide produced is recovered.
  • the part coding for said polypeptide is generally placed under the control of signals allowing its expression in a cellular host.
  • the choice of these signals can vary depending on the cell host used.
  • the nucleotide sequences of the invention can be part of a vector which can be autonomously replicating or integrative. More particularly, autonomously replicating vectors can be prepared using autonomously replicating sequences in the chosen host. As integrative vectors, these can be prepared, for example, by using sequences homologous to certain regions of the host genome, allowing, by homologous recombination, the integration of the vector.
  • the present invention also relates to host cells transformed with a nucleic acid comprising a nucleotide sequence according to the invention.
  • the cellular hosts which can be used for the production of the polypeptides of the invention by the recombinant route are both eukaryotic and prokaryotic hosts.
  • suitable eukaryotic hosts there may be mentioned animal cells, yeasts, or fungi.
  • yeasts mention may be made of yeasts of the genus Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, or Hansenula.
  • yeasts mention may be made of yeasts of the genus Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, or Hansenula.
  • Sf9 insect cells COS, CHO, C127 cells, of human neuroblastomas etc.
  • the mushrooms there may be mentioned more particularly Aspergillus ssp. or Trichoderma ssp.
  • prokaryotic hosts it
  • the host cells are advantageously represented by recombinant yeast strains.
  • the host cells comprise at least one sequence or a sequence fragment chosen from the nucleotide sequences SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 5, for the production of the polypeptides according to the invention.
  • nucleotide sequences according to the invention can be incorporated into viral or non-viral vectors, allowing their administration in vitro, in vivo or ex vivo.
  • Another subject of the invention also relates to any vector comprising a nucleotide sequence coding for a polypeptide according to the invention.
  • the vector of the invention can be for example a plasmid, a cosmid or any DNA not encapsulated by a virus, a phage, an artificial chromosome, a recombinant virus etc. It is preferably a plasmid or a recombinant virus.
  • viral vectors in accordance with the invention mention may very particularly be made of vectors of the adenovirus, retrovirus, adeno-associated virus, herpes virus or vaccinia virus type.
  • the present application also relates to defective recombinant viruses comprising a heterologous nucleic sequence coding for a polypeptide according to the invention.
  • Another object of the invention resides in antibodies or fragments of polyclonal or monoclonal antibodies directed against a polypeptide as defined above.
  • Such antibodies can be generated by methods known to those skilled in the art.
  • these antibodies can be prepared by immunization of an animal against a polypeptide the sequence of which is chosen from the sequences SEQ ID No. 4 or SEQ ID No. 6 or any fragment or derivative thereof, then removal of the blood and isolation of antibodies.
  • These antibodies can also be generated by preparing hybridomas according to techniques known to those skilled in the art.
  • the antibodies or antibody fragments according to the invention can in particular be used to inhibit and / or reveal the interaction between topoisomerase Ma and the polypeptides as defined above.
  • Another object of the present invention relates to a method of identifying compounds capable of binding to the polypeptides according to the invention.
  • the demonstration and / or isolation of these compounds or ligands, can be carried out according to the following steps:
  • a molecule or a mixture containing different molecules, possibly unidentified, is brought into contact with a polypeptide of the invention under conditions allowing interaction between said polypeptide and said molecule in the event that the latter has an affinity for said polypeptide, and,
  • such a method makes it possible to identify molecules capable of blocking the helicase type activity, and in particular the DNA helicase activity of the DBX1 protein or of the polypeptides according to the invention and thus of modulating the processes of division, replication, transcription of DNA. These molecules are likely to have an anti-tumor activity, of cytotoxic type, due to the disruption of these fundamental processes at the level of DNA.
  • another subject of the invention relates to compounds or ligands capable of binding to the polypeptides according to the invention and capable of being obtained according to the process defined above.
  • Another subject of the invention relates to the use of a compound or of a ligand identified and / or obtained according to the process described above as a medicament.
  • Such compounds are indeed capable of being used for the prevention, improvement or treatment of certain conditions involving a dysfunction of the cell cycle.
  • the invention also relates to any pharmaceutical composition comprising as active ingredient at least one ligand obtained according to the process described above.
  • Another object of the present invention relates to a method for identifying compounds capable of modulating or totally or partially inhibiting the interaction between topoisomerase Ma and the polypeptides according to the invention or the protein DBX1.
  • the detection and / or isolation of modulators or ligands capable of modulating or completely or partially inhibiting the interaction between topoisomerase Ma and the polypeptides according to the invention or the DBX1 protein can be carried out according to following steps :
  • topoisomerase Ma or the polypeptides according to the invention are displaced from the bond or prevented from binding; - Detecting and / or isolating the compounds which prevent or which hinder the binding between topoisomerase Ma and the polypeptides according to the invention.
  • this method of the invention is suitable for the detection and / or isolation of agonists and antagonists of the interaction between topoisomerase Ma and the polypeptides of the invention. Still according to a particular embodiment, the invention provides a method for identifying molecules capable of blocking the interaction between human Topoisomerase Ma and helicase DBX1.
  • Such a method makes it possible to identify molecules capable of blocking the reverse gyrase type activity of these two proteins and thus modulate the processes of division, replication, transcription, translation, splicing, repair or recombination of DNA. These molecules are likely to have an anti-tumor activity, of the cytotoxic type, due to the disruption of these fundamental processes at the level of DNA.
  • another subject of the invention relates to compounds or ligands capable of interfering at the level of the interaction between topoisomerase Ma and the polypeptides according to the invention or the protein DBX1 and capable of being obtained according to the method defined above.
  • the invention also relates to the use of a compound or a ligand identified and / or obtained according to the process described above as a medicament.
  • a compound or a ligand identified and / or obtained according to the process described above are indeed capable of being used for the prevention, improvement or treatment of certain conditions involving a dysfunction of the cell cycle.
  • the invention also relates to any pharmaceutical composition comprising as active ingredient at least one ligand obtained according to the process described above.
  • Figure 1 This figure shows the beginning and the end of the sequence SEQ ID No. 1 to present the introduction of the BamHI and SalI sites 5 'and 3' of the coding sequence of topoisomerase Ma and the position of the Xhol and HindIII.
  • the DNA fragments can be separated according to their size by electrophoresis in agarose or acrylamide gels, extracted with phenol or with a phenol / chloroform mixture, precipitated with ethanol and then incubated in the presence of the DNA ligase from phage T4 (Biolabs) according to the supplier's recommendations.
  • the filling of the protruding 5 ′ ends can be carried out by the Klenow fragment of DNA Polymerase I of E. coli (Biolabs) according to the supplier's specifications.
  • the destruction of the protruding 3 ′ ends is carried out in the presence of DNA polymerase from phage T4 (Biolabs) used according to the manufacturer's recommendations.
  • the destruction of the protruding 5 ′ ends is carried out by a gentle treatment with nuclease S 1.
  • Mutagenesis directed in vitro by synthetic oligodeoxynucleotides can be carried out according to the method developed by Taylor et al. [Nucleic Acids Res. L3 (1985) 8749-8764] using the kit distributed by Amersham.
  • Verification of the nucleotide sequences can be carried out by the method developed by Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5477] using the kit distributed by Amersham.
  • yeast strains used are:
  • strain yCM17 of the genus S. cerevisiae (MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801, trpl-901, leu2-3,112, canr, gal4-542, gal80-538, URA3 :: GALl / 10-lacZ-URA3) was used as a screening tool for the Hela cell fusion library by the two hybrid system.
  • the strain L40 of the genus S. cerevisiae (MATa, his3D200, trpl-901, le ⁇ û-3,112, ade2, LYS2 :: (lexAop) 4-HIS3, URA3: (lexAop) 8-LacZ, GAL4) was used to check the protein-protein interactions when one of the protein partners is fused to the LexA protein.
  • the latter is capable of recognizing the LexA response element controlling the expression of the reporter genes LacZ and His3.
  • Yeast extract (10g / l) (Difco), Bactopeptone
  • the strain TG1 of cherscherichia coli of genotype supE, hsd ⁇ 5, thi, ⁇ (lac-proAB), F '[tra D36 pro A B lacP lacZ ⁇ M 15] was used for the construction of the plasmids pLex-TopoIII ⁇ and pGBT-TopoIII ⁇ .
  • the TG1 strain was cultivated on LB medium: NaCl (5g / l) (Difco), Bactotryptone
  • the HB101 strain was cultivated on M9 medium: Na2HPO4 (7g / l) (Sigma), KH2PO4 (3g / l) (Sigma), NH4C1 (1 g / 1) (Sigma), NaCl (0.5g / l) ( Sigma), Glucose (20g / l) (Sigma), MgSO4 (1mm) (Sigma), Thiamine (0.001% o).
  • This medium is made solid by the addition of 15 g / l of agar (Difco).
  • Leucine 50 mg / l
  • proline 50 mg / l
  • leucine was not added to the medium because the plasmids carry a Leu2 selection marker.
  • the plasmids used are:
  • Vector pGBT9 (+2) this plasmid is derived from the plasmid ⁇ GBT9 (Clontech). It presents a reading frame offset of +2, upstream of the EcoRl site, in the zone corresponding to the cloning multisites. The sequence difference between pGBT9 (+2) and pGBT9, upstream of the EcoRI site (underlined), is shown in bold below:
  • the vector pGBT9 (+2) is a 5.4 kb shuttle plasmid which has an origin of bacterial and yeast replication allowing it to replicate at high copy number in these two microorganisms.
  • This plasmid contains a multiple cloning site located downstream of the sequence coding for the DNA binding domain of GAL4 and upstream of a terminator to form a fusion protein. It also contains the TRPl gene of S. cerevisiae which makes it possible to complement yeasts of the trpl genotype in order to select them on a minimum medium which does not contain tryptophan.
  • This vector carries the ampicillin resistance gene which makes it possible to select bacteria on a medium containing ampicillin.
  • pGBT-HaRasVal 12 plasmid derived from pGBT9 and comprising the sequence coding for the protein HaRas mutated in position Val 12 known to interact with the mammalian Raf protein. This plasmid was used to test the specificity of interaction of the protein according to the invention with human topoisomerase Ma.
  • PGBT-Fe65 plasmid derived from pGBT9 and comprising part of the sequence coding for the protein Fe65 known to interact with the cytoplamic region of APP (Amyloid Peptide Precursor). This plasmid was used as a control to verify the specificity of interaction of the protein according to the invention with human topoisomerase Ma.
  • the vector pGAD GH supplied by Clontech and which allows the expression in yeast of fusion proteins between the GAL4 transactivating domain and a protein coded by the cDNA originating from a bank of Hela cells, inserted at the EcoRI sites and Xhol.
  • the vector pLex9 (pBTM116) (Bartel et al DA Hartley Ed, Oxford University press page 153) of 5kb homologous to pGBTIO which contains a multiple cloning site located downstream of the sequence coding for the bacterial repressor LexA and upstream of a terminator to form a fusion protein.
  • This pair of oligonucleotides was used to amplify by PCR, from a cDNA library of Hela cells, a fragment corresponding to the sequence coding for human topoisomerase Ma.
  • Top3Xhol and Top3Hind3 oligonucleotides made it possible to introduce the Xhol and HindIII sites respectively during a second PCR step on the fragment corresponding to the topoisomerasell ⁇ previously amplified using oligonucleotides 124 and 125.
  • the pair of PCS1 and PCS2 oligonucleotides made it possible to introduce into the plasmid pLex9 an Xhol site in phase with the coding sequence of human topoisomerasell ⁇ .
  • the insert comprising the gene coding for topoisomerase Ma was therefore recloned in this vector between the Xhol sites in 5 ′ and Sal I in 3 ′.
  • This oligonucleotide was used to sequence the inserts contained in the plasmids of the library two hybrid of Hela cell cDNAs.
  • the oligonucleotides are synthesized on the Applied System ABI 394-08 device. They are detached from the synthesis matrix with ammonia and precipitated twice with 10 volumes of n-butanol and then taken up in water. Quantification is carried out by measuring the optical density (the OD unit corresponds to 30 ⁇ g / ml).
  • the entire ligation volume (10 ⁇ l) is used to transform the TG1 bacteria made competent by the method of Chung et al, (PNAS, 1988 86, 2172-2175).
  • the TG1 bacteria are cultured in a liquid LB medium for a few hours in a shaking oven at 37 ° C., until an OD of 0.6 at 600 nm is obtained. The medium is then centrifuged at 6000 rpm for 10 min.
  • the bacteria are made competent by taking up the bacterial pellet with a volume of TSB (LB medium + 100 g / 1 of PEG 4000, 5% of DMSO, 10 mM of MgCl2, 10 mM of MgSO i) corresponding to 1/10 of the volume from the middle of the initial culture. After incubation at 4 ° C for 30 to 60 minutes, 200 ⁇ l of bacteria are brought into contact with the ligation for 15 minutes on ice. After adding 200 ⁇ l of LB, the bacteria are incubated for 30 min at 37 ° C. and then spread on an LB + ampicillin medium.
  • the library of two Hela cell cDNA hybrids is sold as bacteria.
  • the latter contain a plasmid pGAD GH containing an insert corresponding to a Hela cell cDNA.
  • the cDNAs of this bank are formed by means of an oligodT primer. These cDNAs are cloned in an oriented manner into the vector pGAD GH at the EcoRI and Xhol sites. 2.1)
  • the plasmid DNA from the brain cDNA library was extracted according to the
  • the batch of plasmid DNA was prepared from a number of isolated bacterial colonies corresponding to slightly more than twice the representativeness of the library or 4.10 colonies.
  • the yeasts previously cultivated in 100 ml of liquid medium are harvested by centrifugation (3000 rpm, 3 minutes). The pellet is washed twice by centrifugation with 1 ml of sterile water. The yeasts are then taken up in 1 ml of the transformation solution I (0.1 M LiAc, Tris-HCl pH 7.5 10 mM, EDTA ImM) and then centrifuged (3000 rpm, 3 minutes). The pellet is taken up in 1 ml of solution I of transformation.
  • the transformation solution I 0.1 M LiAc, Tris-HCl pH 7.5 10 mM, EDTA ImM
  • a transformation solution II 0.1 M LiAc, Tris-HCl pH 7 , 5 lOmM, EDTA ImM in PEG400O 40%>. This mixture is incubated at 28 ° C for 30 minutes. After application of a thermal shock (40 ° C, 15 minutes), the cells are harvested by centrifugation (15,000 rpm for 1 minute). This pellet is taken up in 200 ⁇ l of water and then spread over a minimum agar medium which does not contain the amino acids corresponding to the resistance markers carried by the plasmids transforming the yeasts. The yeasts are incubated for 72 hours at 28 ° C.
  • the yeast used was previously transformed with the plasmid pLexTopoIII ⁇ . It is cultivated in a minimum medium YNB + His + Lys + Ad + Leu (250 ml),
  • the cell pellet is taken up in 100 ml of water and centrifuged again. The pellet is then taken up in 10 ml of the transformation solution I and incubated for 1 hour at 28 ° C. with shaking. After centrifugation, the cells are again taken up in 2.5 ml of the transformation solution I, 100 ⁇ l of the cDNA library of Hela cells and 20 ml of the transformation solution II, then incubated for 1 hour at 28 ° C with stirring. A thermal shock is carried out on this transformation mixture at 42 ° C for 20 minutes. The cells are then centrifuged and the harvested cell pellet is washed with 10 ml of sterile water. This operation is repeated twice then the pellet is taken up with 2.5 ml of PBS.
  • the value of an average loop of a yeast clone is put in 200 ⁇ l of a TELT solution (Triton XI 00 2%, SDS 1%, NaCl lOOmM, Tris pH8 lOmM, EDTA ImM), in the presence of 3g of beads of glass 450 ⁇ m in diameter and 200 ⁇ l of phenol / chloroform. This mixture is stirred for 15 minutes, then centrifuged for 2 minutes at 14,000 rpm. The supernatant is collected without removing the protein cake and the DNA contained in this phase is precipitated with 2.5 volumes of absolute ethanol. After centrifugation for 2 minutes at 14,000 rpm, the DNA pellet is dried and taken up in 20 ⁇ l of TE-RNAse.
  • a TELT solution Triton XI 00 2%, SDS 1%, NaCl lOOmM, Tris pH8 lOmM, EDTA ImM
  • a nitrocellulose sheet is previously deposited on the Petri dish containing the individualized yeast clones. This sheet is then immersed in liquid nitrogen for 30 seconds in order to burst the yeasts and thus to release the ⁇ galactosidase activity. After thawing, the nitrocellulose sheet is deposited, colonies upwards, in another Petri dish containing Whatman 3M paper previously soaked with 1.5 ml of PBS solution (Na2HPO4 60mM, NaH2P ⁇ 4 40mM, KC1 lOmM, MgS04 ImM, pH7) and from 10 to 30 ⁇ l of X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl- ⁇ -D-galactoside) at 50 mg / ml of N, N-dimethylformamide. The dish is then incubated at 37 ° C.
  • Example 1 Construction of a vector allowing the expression of a fusion protein between human topoisomerase IH ⁇ and a DNA-binding protein.
  • the DNA fragment corresponding to the sequence coding for human topoisomerase Ma was amplified by PCR from a cDNA library of Hela cells (Clontech) using oligonucleotides 124 and 125. A second amplification step by PCR was carried out on the DNA fragment in order to introduce the Xhol and HindIII sites at both ends thanks to the pair of oligonucleotides Top3Xhol and Top3Hind3.
  • the plasmid pLex-TopoIII ⁇ was constructed by insertion of the Xhol-Sall fragment, of the preceding plasmid, corresponding to human topoisomeraselll ⁇ , in the plasmid pLex9 previously modified by insertion of the oligonucleotides PCS1 and PCS2 at the EcoRI-Pstll sites. This plasmid was used to screen a library of two Hela cell cDNA hybrids in order to identify proteins interacting with human topoisomerase Ma.
  • the plasmid pGBT-TopoIII ⁇ was constructed by insertion, at the BamHI and
  • SalI of the plasmid pGBT9 (+2) of a fragment obtained by partial digestion with BamHI and total with SalI and corresponding to human topoisomerase Ma. This plasmid was used to validate by the technique of two hybrids the specificity of interaction of the proteins selected during the screening with human topoisomerase Ma.
  • constructs were verified by DNA sequencing. This verification made it possible to show that the fragments of human topoisomerase a did not present mutations generated during the PCR reaction and that they were fused in the same open reading phase as that of the fragment corresponding to the LexA protein or to the GAL4 DB.
  • Example 2 Screening by the technique of two hybrids of a cDNA library of HeLa cells.
  • the screening of a fusion library makes it possible to identify clones producing proteins fused to the GAL4 transactivating domain, which can interact with topoisomerase Ma. This interaction makes it possible to reconstitute a transactivator which will then be able to induce the expression of His3 and LacZ reporter genes in the L40 strain used.
  • a fusion library produced from cDNA originating from Hela cells was chosen.
  • Transformation of yeast by the library of two Hela cell cDNA hybrids and selection of positive clones Transformation of yeast by the library of two Hela cell cDNA hybrids and selection of positive clones.
  • each plasmid independent of the fusion bank is present in at least one yeast at the same time as the plasmid pLex-TopoIII ⁇ .
  • a protocol of transformation of the yeast was chosen giving an efficiency of 10 cells transformed by ⁇ g of DNA.
  • an L40 yeast previously transformed by the plasmid pLex-TopoM ⁇ was used.
  • This strain containing pLex-TopoIII ⁇ , of the His-, Lys-, Leu- phenotype was transformed with 100 ⁇ g of plasmid DNA from the two hybrid library.
  • This quantity of DNA made it possible to obtain, after estimation (see Materials and Methods), 6 10 transformed cells, which corresponds to the number of independent plasmids that the bank constitutes. It can thus be estimated that less than all of the plasmids from the library were used to transform the yeasts.
  • the selection of the transformed cells, capable of reconstituting a functional GAL4 transactivator, was made on a YNB + Lys + Ad medium. At the end of this selection, approximately 500 clones of the His + phenotype were obtained.
  • the plasmids originating from the two hybrid yeast library selected during the double hybrid screening were extracted.
  • the DNA of the yeast strains of the His + and ⁇ Gal + phenotype is used to transform the E. coli HB101 strain.
  • the plasmid DNAs of the bacterial colonies obtained after transformation with yeast DNA extracts were analyzed by digestion with restriction enzymes and by separation of the DNA fragments on agarose gel. Two different restriction profiles were obtained on 15 yeast clones analyzed. One of these profiles was strongly represented. These results show that at least 2 different plasmids were isolated during this screening, the DNA fragment originating from the cDNA library contained in the most represented plasmid was retained for the rest of the study.
  • Example 4 Determination of the sequence of the insert contained in the selected plasmid.
  • the sequencing was carried out on the most represented plasmid.
  • the sequencing is carried out from the oligonucleotide GAL4TA complementary to the region close to the insertion site of the cDNA library of Hela cells, at 52 base pairs from the EcoRI site.
  • the nucleotide and polypeptide sequence of DBX1 is presented in the sequence SEQ ID No. 5.
  • the sequence of the gene cloned by two hybrids begins at nucleotide 952 relative to the supposed initiation codon, ie at the 318 th amino acid and contains a sequence homologous to the sequence coding for the C-terminal part of the DBX1 protein including the stop codon. .
  • Example 5 analysis of the specificity of interaction between topoisomerase Hl ⁇ and the polypeptides of the invention.
  • TopoM ⁇ comprises the gene coding for human topoisomerase Ma fused to the DNA binding domain of GAL4.
  • the yCM17 strain was transformed by the plasmid isolated during the screening of the two hybrid library and by the plasmid pGBT-TopoIII ⁇ . Interaction specificity controls were also carried out by transforming this strain with the control plasmids pGBT-HaRasVall2 or pGBT-Fe65, in place of the plasmid pGBT-TopoM ⁇ .
  • a ⁇ -Gal activity test on the cells transformed by the various plasmids was carried out to demonstrate the protein-protein interactions.
  • test results showed that only the yeasts transformed by the plasmid isolated during the screening of the two hybrid library and by the plasmid pGBT-TopoIII ⁇ exhibited a ⁇ -Gal + activity, thus showing an interaction between the human topoisomerase Ma and the region C- terminal of the polypeptides according to the invention. These results also show that this interaction is independent of the fusion protein used.

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Abstract

La présente invention concerne de nouveaux polypeptides capables d'interagir avec la topoisomérase IIIα humaine et les séquences d'acides nucléiques codant pour ces polypeptides. Elle concerne en outre une méthode d'identification de composés capables d'ineragir avec lesdits polypeptides ainsi qu'une méthode pour identifier des molécules capables de moduler l'interaction de la topoisomérase IIIα avec lesdits polypeptides.

Description

POLYPEPTIDES CAPABLES D'INTERAGIR AVEC LA TOPOISOMERASE 111 ALPHA HUMAINE
La présente invention concerne de nouveaux polypeptides capables d'interagir avec la topoisomerase Illα humaine et les séquences d'acides nucléiques codant pour ces polypeptides. Elle concerne en outre une méthode d'identification de composés capables d'interagir avec lesdits polypeptides ainsi qu'une méthode pour identifier des molécules capables de moduler l'interaction de la topoisomerase Illα avec lesdits polypeptides.
La réplication du DNA est un mécanisme complexe qui fait intervenir un grand nombre de facteurs. Le DNA se présente à l'état physiologique sous une forme super enroulée et l'accès à l'information qu'il contient requiert une modification importante du taux d'enroulement. La réplication nécessite la suppression des supertours, la séparation des deux brins de la double hélice d'ADN et le maintien de l'ADN sous forme simple brin.
La modification du taux d'enroulement est assurée in vivo par les topoisomérases qui sont des enzymes capables de modifier les superstructures du DNA. On distingue les topoisomérases de type I qui ne coupent que l'un de deux brins du DNA et qui suppriment les supertours et les topoisomérases de type II qui agissent en coupant les deux brins du DNA et qui sont capables de supprimer ou bien encore de créer les supertours. Les topoisomérases des eucaryotes sont moins bien connues que leurs homologues procaryotes et à ce jour, leur mécanisme d'action n'est pas encore élucidé.
La séparation des deux brins d'un duplex d'ADN est catalysée par un groupe d'enzymes, appelées DNA hélicases, qui agissent de façon ATP-dépendantes afin de produire l'ADN simple-brin utilisé comme matrice pour les processus de réplication et de transcription de l'ADN. Généralement, les hélicases se fixent à l'ADN simple-brin ou aux jonctions entre de l'ADN simple et double-brin, et se déplacent dans une seule direction le long de l'ADN dans la région double-brin, détruisant les liaisons hydrogènes joignant les deux brins. Toutes les hélicases présentent une activité ATPase (ou NTPase) dépendante de l'ADN qui hydrolyse le phosphate gamma du ribonucleoside ou deoxyribonucleoside 5'-triphosphate et fournit l'énergie nécessaire à la réaction. La première hélicase fut découverte chez E. coli en 1976. Depuis, plus de 60 hélicases ont été isolées chez les procaryotes et les eucaryotes. Le rôle des hélicases humaines reste encore non élucidé dans la plupart des cas, à l'exception de HDHII (réparation des lésions induites par les rayons X), HDHIV (assemblage des préribosomes), ERCC2 et ERCC3, impliquées dans la réparation par excision et la viabilité cellulaire. On connaît peu de choses sur la structure de ces hélicases. Une grande partie de l'information disponible sur les structures et les fonctions des hélicases a été obtenue par analyse comparative des séquences en acides aminés. En particulier, des motifs conservés ont permis de regrouper les hélicases en sous-familles, en se basant sur les homologies de séquences.
La Topoisomerase III humaine appartient à la famille des topoisomérases de type IA, et présente donc des homologies de séquence avec les topoisomérases I et III de E. coli, la Topoisomerase III de levure ainsi que la réverse gyrase des archéobactéries. La Topoisomerase III humaine est maintenant appelée Topoisomerase Illα, afin de la différencier de la topoisomerase Illβ humaine, découverte récemment lors du séquençage du locus du gène de l'immunoglobulin λ humaine (Kawasaki, K., Minoshima, S., Nakato, E., Shibuya, K., Shintani, A., Schmeits, J.L., Wang, J. and Shimizu, N. 1997, Génome Research 7: 250-261), et pour laquelle aucune activité fonctionnelle n'a été montrée. La topoisomerase Illα exprimée dans la levure et non purifiée présente une activité de relaxation partielle d'un ADN très surenroulé négativement (Hanai, R., Caron, P.R. and Wang, J.C. 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3653-3657).
La Topoisomerase Illα est une protéine de 976 acides aminés et de poids moléculaire d'environ 1 10 kDa. Le gène codant pour la Topoisomerase Illα humaine est présent en une seule copie sur le chromosome 17pl 1.2-12 (Hanai, R., Caron, P.R. and Wang, J.C. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3653-3657). Un homologue murin de la Topoisomerase III a été clone récemment (Seki, T., Deki, M., Katada, T. and Enomoto, T. 1998. Biochim Biophys Acta 1396: 127-131).
La Topoisomerase Illα présente une forte homologie de séquence avec la Topoisomerase III de levure, à savoir 44% d'identité de séquence et 61% de similarité. L'homologie qu'elle présente avec les topoisomérases I et III bactériennes est moins forte, à savoir 24% d'identité et 44%) de similarité. Cependant, la Topoisomerase Illα ressemble plus à la Topoisomerase I de E. coli qu'aux autres membres du groupe des topoisomérases de type IA du point de vue de l'organisation de la protéine en domaines. En effet, ces deux polypeptides contiennent un domaine C-terminal sans équivalent chez la Topoisomerase III de E. coli ou de levure. Ce domaine C-terminal contient des motifs à 4 cystéines (3 motifs pour la Topoisomerase I de E. coli et 1.5 motif pour la Topoisomerase Ma humaine), ainsi qu'un domaine C-terminal extrême pour lequel il a été démontré, pour la Topoisomerase I de E. coli, un rôle de fixation à l'ADN.
Le rôle de la topoisomerase Illα humaine dans la cellule n'a pas encore été identifié.
La Topoisomerase Illα humaine semble être indispensable, au moins au cours de l'embryogenèse, puisque le knock-out de l'homologue murin de la Topoisomerase Illα est létal (Li, W. and Wang, J.C. 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1010-1013). Les ARN messagers de la Topoisomerase Illα sont présents dans de nombreux tissus (coeur, cerveau, placenta, poumon, foie, muscle squelettique, rein, pancréas) sous la forme de trois transcrits de tailles 7.2, 6 et 4 kilobases (Fritz, Ε., Εlsea, S.H., Patel, P.I. and Meyn, M.S. 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4538-4542).
D'autre part, il a été supposé que la Topoisomerase Illα joue un rôle dans le maintien de la stabilité du génome. En effet, le cDNA CAT4.5, codant pour une Topoisomerase Illα humaine tronquée de 141 acides aminés N-terminaux, est capable de complémenter le phénotype d'hypersensibilité aux rayonnements ionisants des cellules AT (Ataxie-Télangectasie) présentant une mutation dans le gène ATM (Fritz, E., Elsea, S.H., Patel, P.I. and Meyn, M.S. 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4538- 4542).
Chez la levure, deux études indépendantes ont montré l'existence d'une interaction entre l'hélicase SGS1 et la Topoisomerase III de levure. D'une part, les mutants sgsl- sont des suppresseurs du phénotype top3- (croissance lente, hyper- recombinaison) chez la levure S. cerevisiae (Gangloff, S., McDonald, J.P., Bendixen, C, Arthur, L. and Rothstein, R. 1994. Mol. Cell. Biol. 14: 8391- 8398). D'autre part, il a été montré que les 500 premiers acides aminés de SGS1 interagissent avec la Topoisomerase III de levure (Gangloff, S., McDonald, J.P., Bendixen, C, Arthur, L. and Rothstein, R. 1994. Mol. Cell. Biol. 14: 8391- 8398, Lu, J., Mullen, J.R., Brill, S.J., Kleff, S., Romeo, A.M. and Sternglanz, R. 1996. Nature 383: 678-679). Cependant, à ce jour, aucune interaction entre une hélicase et la Topoisomerase Illα humaine n'a été identifiée. L'identification de partenaires de la topoisomerase Illα humaine constitue donc un enjeu majeur pour la compréhension du rôle de la topoisomerase Illα humaine, et de son mécanisme d'action.
La présente invention résulte de la mise en évidence de nouveaux polypeptides capables d'interagir avec la topoisomerase Illα (ci-après nommés polypeptides partenaires de la topoisomerase Illα). Elle résulte également de la découverte que ces polypeptides montrent une forte homologie avec des protéines qui présentent des caractéristiques de structure communes aux RNA hélicases et pour lesquelles aucune fonction n'avait été décrite jusqu'alors. La mise en évidence de cette interaction et de ces homologies, désignent ces protéines comme DNA hélicases partenaires de la topoisomerase Illα. L'identification de ces partenaires permet d'envisager de nombreuses applications basées sur l'action combinée de ces protéines partenaires et de la topoisomerase Ma ; ces applications concernent notamment :
1) La destruction de la structure nucléosomale : afin de procéder à certains processus tels que la réplication, la transcription, la réparation ou encore la recombinaison, l'ADN doit être accessible aux machineries enzymatiques correspondantes, et pour ce faire, la structure nucléosomale doit être détruite de façon transitoire. Il est ainsi envisageable que l'hélicase sépare localement les brins d'ADN et crée des supertours positifs devant elle et des supertours négatifs derrière elle. La torsion positive est absorbée par la disruption des nucléosomes, tandis que la torsion négative est relâchée sélectivement par la topoisomerase de type IA.
2) Le surenroulement positif de l'ADN : l'interaction entre l'hélicase et la topoisomerase de type IA est susceptible de reconstituer dans un organisme eucaryote, l'activité réverse gyrase des archéobactéries thermophiles. En effet, il a été montré que la réverse gyrase de Sulfolobus acidoealdarius possède en N-terminal un domaine hélicase, contenant les 8 motifs des hélicases à motif « DEAD », et en C-terminal un domaine topoisomerase homologue aux topoisomérases de type IA (Confalonieri, F., Edie, C, Nadal, M., Bouthier de la Tour, C, Forterre, P. and Duguet, M. 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4753-4757); cette enzyme relâche l'ADN supertorsadé négativement et introduit des supertours positifs dans l'ADN circulaire de façon ATP- dépendante (Forterre, P., Mirambeau, G., Jaxel, C, Nadal, M. and Duguet, M. 1985. EMBO J. 4: 2123-2128 ). Cette activité réverse gyrase eucaryote peut servir à éliminer des structures particulières d'ADN, telles que l'ADN cruciforme, l'ADN Z, les mésappariements, les intermédiaires de recombinaison etc. A partir de ces observations et de la mise en évidence que la topoisomerase Ma est capable d'interagir avec une protéine possédant les propriétés d'une DNA hélicase, on peut envisager la réalisation in vivo ou in vitro d'un complexe topoisomerase Ma / protéine partenaire constituant un complexe enzymatique ayant les fonctions de type reverse gyrase. Il est à noter, qu'une telle fonction de surenroulement positif de l'ADN n'a encore jamais été décrite chez les eucaryotes.
3) La ségrégation des chromosomes nouvellement répliqués : à la fin de la réplication de l'ADN, des problèmes topologiques apparaissent au niveau du point de convergence de deux fourches de réplication. Un mécanisme qui permet de résoudre ce problème topologique implique l'action concertée d'une hélicase et d'une topoisomerase de type IA, capable de décaténer deux molécules d'ADN simple-brin. Ce modèle (Wang, J.C. 1991. J. Biol. Chem. 266: 6659-6662 ; Rothstein, R. and Gangloff, S. 1995. Génome Research 5: 421-426) propose qu'au point de rencontre des deux fourches de réplication, la réplication est stoppée, laissant des portions d'ADN simple- brin entremêlés. Ceux-ci sont séparés grâce à l'action concertée de l'hélicase et de la topoisomerase. La synthèse d'ADN est alors complétée au niveau des régions simple- brin.
4) La recombinaison et la stabilité du génome : il a été montré que des mutants de levure Top3- ou des mutants Sgsl- présentent tous deux un phénotype d'hyperecombinaison, tandis que les doubles mutants Top3-/Sgsl- récupèrent un phénotype normal. Ceci montre que la Topoisomerase III de levure et l'hélicase SGS 1 agissent probablement de concert pour maintenir un faible taux de recombinaison par exemple par une activité de surenroulement positif de type réverse gyrase, ou par un mécanisme plus direct au niveau des appariements des intermédiaires de recombinaison.
A la différence de l'hélicase SGS1, connue pour interagir avec la topoisomerase III de levure, la protéine partenaire de la topoisomerase Ma mise en évidence par la demanderesse n'appartient pas à la famille des hélicases de type RecQ.
Les polypeptides selon l'invention montrent un fort degré d'homologie avec la séquence d'une protéine humaine DDX14 publiée par Chung et al (Chung, J., Lee, S-G., and Song, K. 1995. Korean J. Biochem. 27: 193-197). La protéine DDX14 présente une homologie de séquence significative avec une ARN hélicase d'origine murine, cependant l'activité hélicase de cette protéine n'a pas encore été démontrée et la fonction de DDX14 n'a pas encore été élucidée.
Les polypeptides selon l'invention montrent également un fort degré d'homologie avec la séquence d'une protéine humaine DBXl publiée par Lahn et al (Lahn, T. and Page, D.C. 1997. Science. 278: 675-680). La protéine DBXl code pour une protéine qui présente des homologies avec des ARN hélicases mais son activité hélicase n'a jamais été démontrée et la fonction de la protéine DBXl n'a pas encore été identifiée.
La protéine DBXl code pour une protéine de 662 acides aminés. Le gène correspondant est situé sur le chromosome sexuel X et son homologue situé sur le chromosome Y est identique à 91% au niveau protéique. Les séquences nucléiques et polypeptidiques de DBXl sont présentées dans les séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6. L'expression du gène DBXl semble ubiquitaire. Il a maintenant été mis en évidence que la protéine DBXl possède les 8 motifs caractéristiques des hélicases de la famille « DEAD ». Plus précisément, elle appartient à la sous-famille représentée par l'hélicase PL 10, et dont les membres répertoriés sont les hélicases DED1 et DBP1 de la levure, l'hélicase An3 des amphibiens et les hélicases murines PL 10, mDEAD2 et mDEAD3 (Gee, S.L. and Conboy, J.G. 1994. Gène 140: 171-177). Les hélicases appartenant à cette sous-famille contiennent en plus du domaine catalytique central contenant les 8 motifs conservés des hélicases, des domaines N et C terminaux particuliers. Le domaine C-terminal est riche en arginines et serines, ce qui rappelle les domaines des facteurs d'épissage. Cependant, dans le cas des hélicases de cette sous- famille, ce domaine riche en arginines et serines est plus court et ne possède pas autant de dipeptides RS que dans le domaine prototype des facteurs d'épissage.
L'invention fournit également un procédé d'identification de molécules capables de bloquer l'interaction entre la Topoisomerase Ma humaine et un polypeptide partenaire de la topoisomerase Ma. Un tel procédé permet d'identifier des molécules susceptibles notamment de bloquer l'activité de type réverse gyrase de ces deux protéines. De telles molécules sont utiles pour moduler les processus de division, de réplication, de transcription, de traduction, d'épissage, de réparation ou de recombinaison de l'ADN. Ces molécules sont également susceptibles de posséder une activité antitumorale, de type cytotoxique, du fait de la perturbation de ces processus fondamentaux au niveau de l'ADN.
Un premier objet de l'invention concerne donc des séquences nucléotidiques codant pour des polypeptides capables d'interagir avec la topoisomerase Ma.
Préférentiellement les séquences nucléotidiques selon l'invention codent pour un polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence polypeptidique décrite dans la séquence SEQ ID N°4 ou ses dérivées.
Au sens de la présente invention, le terme séquence polypeptidique dérivée désigne toute séquence polypeptidique différant de la séquence considérée, obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique, et possédant la capacité d'interagir avec la topoisomerase Ma. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on entend toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'augmenter sa résistance à des protéases ou d'améliorer son passage à travers les membranes cellulaires, celui d'augmenter son efficacité thérapeutique ou de réduire ses effets secondaires, celui d'augmenter l'affinité du peptide pour son site d'interaction, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques. Avantageusement, les variants comprennent des délétions ou des mutations portant sur des acides aminés dont la présence n'est pas déterminante à l'activité du dérivé. De tels acides aminés peuvent être identifiés par exemple par des tests d'activité cellulaire comme décrit dans les exemples.
De préférence encore, les séquences nucléotidiques selon l'invention comprennent tout ou partie de la séquence nucléotidique décrite dans la séquence SEQ ID N°3 et codant pour la séquence SEQ ID N°4 ou les séquences dérivées de cette séquence nucléotidique. Au sens de la présente invention, le terme séquence nucléotidique dérivée désigne toute séquence différant de la séquence considérée en raison de la dégérescence du code génétique, obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique, ainsi que toute séquence hybridant avec ces séquences ou des fragments de celles-ci et codant pour un polypeptide capable d'interagir avec la Topoisomerase Ma. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on entend toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. Le terme dérivé comprend également les séquences homologues à la séquence considérée, issues d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes. De telles séquences homologues peuvent être obtenues par des expériences d'hybridation. Les hybridations peuvent être réalisées à partir de banque d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde, la séquence native ou un fragment de celle-ci, dans des conditions variables d'hybridation.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces séquences peuvent être obtenues par exemple par criblage de banques d'ADN (banque d'ADNc, banque d'ADN génomique) au moyen de sondes élaborées sur la base de séquences présentées ci-avant.
De telles banques peuvent être préparées à partir de cellules de différentes origines par des techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier. Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. D'une manière générale les acides nucléiques de l'invention peuvent être préparés selon toute technique connue de l'homme du métier.
La présente invention a également pour objet des polypeptides capables d'interagir avec la topoisomerase Ma. Au sens de la présente invention la dénomination topoisomerase Ma couvre la topoisomerase Ma humaine en elle même ainsi que les formes homologues correspondant notamment à des formes mutées de cette protéine.
De préférence, les polypeptides selon l'invention comprennent tout ou partie de la séquence polypeptidique décrite dans la SEQ ID N°4 ou de ses dérivées.
La présente invention vise également un polypeptide caractérisé en ce qu'il s'agit d'un fragment de la protéine DBXl, capable d'interagir avec la topoisomerase Ma et comprenant tout ou partie fragment polypeptidique qui s'étend entre les résiddus 318 - 662 et représenté dans la séquence polypeptidique SEQ ID N°6 ou ses dérivées.
La présente invention a également pour objet l'utilisation des polypeptides selon l'invention ou de fragments de ces polypeptides, pour un ralentissement, une inhibition, une stimulation ou une modulation de l'activité de la topoisomerase Ma.
En effet, il est envisageable de réguler le fonctionnement de la topoisomerase
Ma par le biais des polypeptides selon l'invention ou de leurs fragments et notamment d'inhiber ou de ralentir l'activité de la topoisomerase Ma. Cette modification de l'activité de la topoisomerase Ma est susceptible de conduire à un ralentissement de la croissance cellulaire ou un blocage du cycle cellulaire ou d'induire l'apoptose.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de préparation des polypeptides selon l'invention selon lequel on cultive une cellule contenant une séquence nucléotidique codant pour lesdits polypeptides, dans des conditions d'expression de ladite séquence et on récupère le polypeptide produit. Dans ce cas, la partie codant pour ledit polypeptide est généralement placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. Le choix de ces signaux (promoteurs, terminateurs, séquence leader de sécrétion, etc.) peut varier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. Par ailleurs, les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent faire partie d'un vecteur qui peut être à réplication autonome ou intégratif. Plus particulièrement, des vecteurs à réplication autonome peuvent être préparés en utilisant des séquences à réplication autonome chez l'hôte choisi. S'agissant de vecteurs intégratifs, ceux-ci peuvent être préparés, par exemple, en utilisant des séquences homologues à certaines régions du génome de l'hôte, permettant, par recombinaison homologue, l'intégration du vecteur.
La présente invention a également pour objet des cellules hôtes transformées avec un acide nucléique comportant une séquence nucléotidique selon l'invention. Les hôtes cellulaires utilisables pour la production des polypeptides de l'invention par voie recombinante sont aussi bien des hôtes eucaryotes que procaryotes. Parmi les hôtes eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules d'insecte Sf9, les cellules COS, CHO, C127, de neuroblastomes humains etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme hôtes procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes E.coli, Bacillus, ou Streptomyces.
Selon un mode préféré, les cellules hôtes sont avantageusement représentées par des souches de levures recombinantes.
Préférentiellement, les cellules hôtes comprennent au moins une séquence ou un fragment de séquence choisis parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N°3 ou SEQ ID N° 5, pour la production des polypeptides selon l'invention.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être incorporées dans des vecteurs viraux ou non viraux, permettant leur administration in vitro, in vivo ou ex vivo.
Un autre objet de l'invention concerne en outre tout vecteur comprenant une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'invention. Le vecteur de l'invention peut être par exemple un plasmide, un cosmide ou tout ADN non encapsidé par un virus, un phage, un chromosome artificiel, un virus recombinant etc. Il s'agit de préférence d'un plasmide ou d'un virus recombinant. A titre de vecteurs viraux conformes à l'invention on peut tout particulièrement citer les vecteurs de type adénovirus, rétrovirus, virus adéno-associés, virus de l'herpès ou virus de la vaccine. La présente demande a également pour objet des virus recombinants défectifs comprenant une séquence nucléique hétérologue codant pour un polypeptide selon l'invention.
Un autre objet de l'invention réside dans des anticorps ou fragments d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un polypeptide tel que défini ci- avant. De tels anticorps peuvent être générés par des méthodes connues de l'homme du métier. En particulier ces anticorps peuvent être préparés par immunisation d'un animal contre un polypeptide dont la séquence est choisie parmi les séquences SEQ ID N°4 ou SEQ ID N°6 ou tout fragment ou dérivé de celles-ci, puis prélèvement du sang et isolement des anticorps. Ces anticorps peuvent également être générés par préparation d'hybridomes selon les techniques connues de l'homme de l'art. Les anticorps ou fragments d'anticorps selon l'invention peuvent notamment être utilisés pour inhiber et/ ou révéler l'interaction entre la topoisomerase Ma et les polypeptides tels que définis ci-avant.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé d'identification de composés capables de se lier aux polypeptides selon l'invention. La mise en évidence et/ou l'isolement de ces composés ou ligands, peut-être réalisée selon les étapes suivantes :
- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec un polypeptide de l'invention dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle-ci posséderait une affinité pour ledit polypeptide, et,
- on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide de l'invention.
Selon un mode particulier, un tel procédé permet d'identifier des molécules capables de bloquer l'activité de type hélicase, et en particulier l'activité DNA hélicase de la protéine DBXl ou des polypeptides selon l'invention et de moduler ainsi les processus de division, de réplication, de transcription de l'ADN. Ces molécules sont susceptibles de posséder une activité antitumorale, de type cytotoxique, du fait de la perturbation de ces processus fondamentaux au niveau de l'ADN.
A cet égard, un autre objet de l'invention concerne des composés ou ligands capables de se lier aux polypeptides selon l'invention et susceptibles d'être obtenu selon le procédé défini ci-avant.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un composé ou d'un ligand identifié et/ou obtenu selon le procédé décrit ci-avant comme médicament. De tels composés sont en effet susceptibles d'être utilisés pour la prévention, l'amélioration ou le traitement de certaines affections impliquant un dysfonctionnement du cycle cellulaire.
L'invention a encore pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un ligand obtenu selon le procédé décrit ci-avant.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé d'identification de composés capables de moduler ou d'inhiber totalement ou partiellement l'interaction entre la topoisomerase Ma et les polypeptides selon l'invention ou la protéine DBXl.
La mise en évidence et/ou l'isolement de modulateurs ou de ligands capables de moduler ou d'inhiber totalement ou partiellement l'interaction entre la topoisomerase Ma et les polypeptides selon l'invention ou la protéine DBXl, peut-être réalisée selon les étapes suivantes :
- on réalise la liaison de la topoisomerase Ma ou d'un fragment de celle-ci à un polypeptide selon l'invention ;
- on ajoute un composé à tester pour sa capacité à inhiber la liaison entre la topoisomerase Ma et les polypeptides selon l'invention ;
- on détermine si la topoisomerase Ma ou les polypeptides selon l'invention sont déplacés de la liaison ou empêchés de se lier ; - on détecte et/ou isole les composés qui empêchent ou qui gênent la liaison entre la topoisomerase Ma et les polypeptides selon l'invention.
Dans un mode particulier, ce procédé de l'invention est adapté à la mise en évidence et/ou l'isolement d'agonistes et d'antagonistes de l'interaction entre la topoisomerase Ma et les polypeptides de l'invention. Toujours selon un mode particulier, l'invention fournit un procédé d'identification de molécules capables de bloquer l'interaction entre la Topoisomerase Ma humaine et l'hélicase DBXl.
Un tel procédé permet d'identifier des molécules susceptibles de bloquer l'activité de type réverse gyrase de ces deux protéines et ainsi moduler les processus de division, de réplication, de transcription, de traduction, d'épissage, de réparation ou de recombinaison de l'ADN. Ces molécules sont susceptibles de posséder une activité antitumorale, de type cytotoxique, du fait de la perturbation de ces processus fondamentaux au niveau de l'ADN.
A cet égard, un autre objet de l'invention concerne des composés ou ligands capables d'interférer au niveau de l'interaction entre la topoisomerase Ma et les polypeptides selon l'invention ou la protéine DBXl et susceptibles d'être obtenu selon le procédé défini ci-avant.
L'invention concerne également l'utilisation d'un composé ou d'un ligand identifié et/ou obtenu selon le procédé décrit ci-avant comme médicament. De tels composés sont en effet susceptibles d'être utilisés pour la prévention, l'amélioration ou le traitement de certaines affections impliquant un dysfonctionnement du cycle cellulaire.
L'invention a encore pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un ligand obtenu selon le procédé décrit ci-avant.
D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent et qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : Cette figure reprend le début et la fin de la séquence SEQ ID N°l pour présenter l'introduction des sites BamHI et Sali en 5' et 3' de la séquence codante de la topoisomerase Ma et la position des sites Xhol et HindIII.
MATERIEL ET METHODES
1 ) Techniques générales de biologie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'electrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extractions de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T. et al, "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur.
Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S 1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. L3 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de
PCR [Polymérase-catalyzed Chain Réaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985)
1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant.
La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463- 5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
2) Les souches de levures utilisées sont :
La souche yCM17 du genre S. cerevisiae (MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801, trpl-901, leu2-3,112, canr, gal4-542, gal80-538, URA3::GALl/10-lacZ- URA3) a été utilisée comme outil de criblage de la banque de fusion de cellules Hela par le système deux hybrides.
La souche L40 du genre S. cerevisiae (MATa, his3D200, trpl-901, leιû-3,112, ade2, LYS2:: (lexAop)4-HIS3, URA3:(lexAop)8-LacZ, GAL4) a été utilisée pour vérifier les interactions protéine-protéine quand l'un des partenaires protéiques est fusionné à la protéine LexA. Cette dernière est capable de reconnaître l'élément de réponse LexA contrôlant l'expression des gènes rapporteurs LacZ et His3.
Elles ont été cultivées sur les milieux de culture suivants :
Milieu YPD complet : Extrait de levures (10g/l) (Difco), Bactopeptone
(20g/l) (Difco), Glucose (20g/l) (Merck). Ce milieu a été rendu solide par addition de 20g/l d'agar (Difco). Milieu YNB minimum : Yeast Nitrogen Base (sans acides aminés) (6,7g/l) (Difco), Glucose (20g/l) (Merck). Ce milieu peut être rendu solide par addition de 20g/l d'agar (Difco). Ce milieu est complémenté avec les acides aminés ou les bases azotées (50mg/ml) nécessaires pour assurer la croissance des levures auxotrophes. De ampicilline (100 μg/ml) est ajoutée au milieu afin d'éviter les contaminations bactériennes.
3) Les souches de bactéries utilisées sont :
La souche TG1 d Εscherichia coli de génotype supE, hsdΔ5, thi, Δ(lac-proAB), F'[tra D36 pro A B lacP lacZΔM 15] a été utilisée pour la construction des plasmides pLex-TopoIIIα et pGBT-TopoIIIα.
La souche HB101 d Εscherichia coli de génotype supE44, aral4, galK2, lacYl, Δ(gpt-proA)62, rpsL20(Strr), xyl-5, recA13, Δ(mcrC-mrr), HsdS"(r"m") a été employée comme moyen d'amplification et d'isolement de plasmides provenant de la banque d'ADNc de cellules Hela.
La souche TG1 a été cultivée sur Milieu LB : NaCl (5g/l) (Difco), Bactotryptone
(10g/l) (Difco), Extrait de levure (5g/l) (Difco). Ce milieu peut être rendu solide par addition de 20g/l d'agar (Difco). L 'ampicilline a été utilisée à 100 μg/ml pour la sélection des bactéries ayant reçu les plasmides portant comme marqueur le gène de résistance à cet antibiotique.
La souche HB101 a été cultivée sur Milieu M9: Na2HPO4 (7g/l) (Sigma), KH2PO4 (3g/l) (Sigma), NH4C1 ( 1 g/1) (Sigma), NaCl (0,5g/l) (Sigma), Glucose (20g/l) (Sigma), MgSO4 (1mm) (Sigma), Thiamine (0,001%o). Ce milieu est rendu solide par addition de 15g/l d'agar (Difco).
De la leucine (50mg/l) (Sigma) et de la proline (50mg/l) (Sigma) sont ajoutées au milieu M9 pour permettre la croissance de la souche HB101. Lors de la sélection de plasmides provenant de la banque deux hybrides d'ADNc de cellules Hela, la leucine n'a pas été ajoutée au milieu car les plasmides portent un marqueur de sélection Leu2. 3) Les plasmides utilisés sont :
Vecteur pGBT9 (+2) : ce plasmide dérive du plasmide ρGBT9 (Clontech). Il présente un décalage du cadre de lecture de +2, en amont du site EcoRl, dans la zone correspondant au multisites de clonage. La différence de séquence entre pGBT9 (+2) et pGBT9, en amont du site EcoRI (souligné), est représentée en gras ci-dessous :
SEQ ID N°7 pGBT9 (+2) :
TCG CCG GAA TTG AAT TCC CGG GGA TCC GT
SEQ ID N°8 pGBT9 :
TCG CCG GAA TTC CCG GGG ATC CGT
Le vecteur pGBT9 (+2) est un plasmide navette de 5,4 kb qui possède une origine réplication bactérienne et de levure lui permettant de se répliquer à haut nombre de copies chez ces deux micro-organismes. Ce plasmide contient un site multiple de clonage situé en aval de la séquence codant pour le domaine de liaison à l'ADN de GAL4 et en amont d'un terminateur pour former une protéine de fusion. Il contient également le gène TRPl de S. cerevisiae qui permet de complémenter les levures de génotype trpl afin de les sélectionner sur un milieu minimum ne contenant pas de tryptophane. Ce vecteur porte le gène de résistance à l'ampicilline qui permet de sélectionner les bactéries sur un milieu contenant de l'ampicilline.
pGBT-HaRasVal 12 : plasmide dérivé de pGBT9 et comprenant la séquence codant pour la protéine HaRas mutée en position Val 12 connue pour interagir avec la protéine Raf de mammifère. Ce plasmide a été utilisé pour tester la spécificité d'interaction de la protéine selon l'invention avec la topoisomerase Ma humaine.
PGBT-Fe65 : plasmide dérivé de pGBT9 et comprenant une partie de la séquence codant pour la protéine Fe65 connue pour interagir avec la région cytoplamique de l'APP (Précurseur du Peptide Amyloïde). Ce plasmide a été utilisé comme contrôle pour vérifier la spécificité d'interaction de la protéine selon l'invention avec la topoisomerase Ma humaine. Le vecteur pGAD GH : fourni par Clontech et qui permet l'expression chez la levure de protéines de fusion entre le domaine transactivateur de GAL4 et une protéine codée par l'ADNc provenant d'une banque de cellules Hela, inséré au niveau des sites EcoRI et Xhol.
Le vecteur pLex9 (pBTM116) (Bartel et al D.A Hartley Ed, Oxford University press page 153) de 5kb homologue au pGBTIO qui contient un site multiple de clonage situé en aval de la séquence codant pour le répresseur bactérien LexA et en amont d'un terminateur pour former une protéine de fusion.
4 ) les oligonucléotides de synthèse employés sont :
SEQ ID N°9 oligonucléotide 124
CGAGGTCTGAGGATGATCTT
SEQ ID N° 10 oligonucléotide 125
CTGAGAAAGTGGCGTTCTCT
Ce couple d'oligonucléotides a servi à amplifier par PCR, à partir d'une banque d'ADNc de cellules Hela, un fragment correspondant à la séquence codant pour la topoisomerase Ma humaine.
SEQ ID N°l 1 oligonucléotide Top3Xhol
AAGTTACTCGAGATGGCCCTCCGAGG
SEQ ID N°12 : oligonucléotide Top3Hind3
ACGAGCAAGCTTCTCTACCCTACCCTG
Le couple d'oligonucléotidesTop3Xhol et Top3Hind3 a permis d'introduire respectivement les sites Xhol et HindIII lors d'une deuxième étape de PCR sur le fragment correspondant à la topoisoméraselllα préalablement amplifiée grâce aux oligonucléotides 124 et 125.
SEQ ID N° 13 : oligonucléotide PCS 1 AATTGCGAATTCTCGAGCCCGGGGATCCGTCGACTGCA
SEQ ID N° 14 : oligonucléotide PCS2
GTCGCAGGATCCCCGGGCTCGAGAATTCGC
Le couple d'oligonucléotides PCS1 et PCS2 a permis d'introduire dans le plasmide pLex9 un site Xhol en phase avec la séquence codante de la topoisoméraselllα humaine. L'insert comportant le gène codant pour la topoisomerase Ma a donc été recloné dans ce vecteur entre les sites Xhol en 5' et Sal I en 3'.
SEQ ID N°15 oligonucléotide GAL4TA
CCACTACAATGGATGATG
Cet oligonucléotide a été utilisé pour séquencer les inserts contenus dans les plasmides de la banque deux hybrides d'ADNc de cellule Hela.
Les oligonucléotides sont synthétisés sur l'appareil Applied System ABI 394- 08. Ils sont décrochés de la matrice de synthèse par de l'ammoniac et précipités deux fois par 10 volumes de n-butanol puis repris dans de l'eau. La quantification est effectuée par mesure de la densité optique (lunité DO correspond à 30 μg/ml).
5) Transformation des bactéries TG1
La totalité du volume de ligation (10 μl) est utilisée pour transformer les bactéries TG1 rendues compétentes par la méthode de Chung et col, ( PNAS,1988 86, 2172-2175).
Les bactéries TG1 sont mises en culture dans un milieu LB liquide pendant quelques heures dans une étuve à agitation à 37°C, jusqu'à obtenir une DO de 0,6 à 600 nm. Le milieu est ensuite centrifugé à 6000 rpm pendant 10 mn. Les bactéries sont rendues compétentes en reprenant le culot bactérien avec un volume de TSB (milieu LB + 100 g/1 de PEG 4000, 5% de DMSO, 10 mM de MgCl2, 10 mM de MgSO i) correspondant à 1/10 du volume du milieu de la culture initiale. Après incubation à 4°C pendant 30 à 60 minutes, 200 μl de bactéries sont mises au contact des produits de ligation pendant 15 minutes sur la glace. Après addition de 200μl de LB, les bactéries sont incubées 30 mn à 37°C puis étalées sur un milieu LB + ampicilline.
6) Préparation de plasmides de la banque deux hybrides d'ADNc de cellules Hela(Clontech®).
La banque deux hybrides d'ADNc de cellules Hela est vendue sous forme de bactéries. Ces dernières contiennent un plasmide pGAD GH renfermant un insert correspondant à un ADNc de cellules Hela. Les ADNc de cette banque sont constitués grâce à une amorce oligodT. Ces cDNA sont clones de façon orientée dans le vecteur pGAD GH au niveau des sites EcoRI et Xhol. 2.1)
L'ADN plasmidique de la banque d'ADNc de cerveau a été extrait suivant le
® protocole Clontech . Afin de conserver la représentativité de la banque qui est constituée de 1,2.10 plasmides indépendants, le lot d'ADN plasmidique a été préparé à partir d'un nombre de colonies bactériennes isolées correspondant à un peu plus de deux fois la représentativité de la banque soit 4.10 colonies.
Après vérification du titre de la banque, 2 μl de bactéries de la banque deux hybrides d'ADNc de cellules Hela, mis préalablement dans 8 ml de LB, sont étalés sur
2 un milieu solide (16 boites / 770 cm en milieu LB+ampicilline). Les colonies apparues sont reprises pour chacune des boites avec 30ml de LB+ampicilline liquide. Les suspensions obtenues sont incubées à 37°C pendant 3 heures. L'ADN est ensuite extrait de ces souches par la technique d'extraction d'ADN plasmidique en grande quantité. La concentration en ADN est déterminée à 260 nm.
7) Transformation de la levure
Les levures préalablement cultivées dans 100ml de milieu liquide sont récoltées par centrifugation (3000 rpm, 3 minutes). Le culot est lavé deux fois par centrifugation avec 1ml d'eau stérile. Les levures sont ensuite reprises par 1 ml de la solution I de transformation (LiAc 0.1 M, Tris-HCl pH 7,5 lOmM, EDTA ImM) puis centrifugées (3000 rpm, 3 minutes). Le culot est repris dans 1 ml de la solution I de transformation. 50 μl de cette suspension de levures sont mis en présence de 50μg d'ADN de sperme de saumon et de 1 à 5 μg d'ADN plasmidique et de 300μl d'une solution II de transformation (LiAc 0.1 M, Tris-HCl pH 7,5 lOmM, EDTA ImM dans du PEG400O 40%>). Ce mélange est incubé à 28°C pendant 30 minutes. Après application d'un choc thermique (40°C , 15 minutes), les cellules sont récoltées par centrifugation (15000 rpm pendant 1 mn). Ce culot est repris dans 200 μl d'eau puis étalé sur un milieu minimum gélose ne contenant pas les acides aminés correspondant aux marqueurs de résistance portés par les plasmides transformants les levures. Les levures sont incubées 72 heures à 28°C.
8) Transformation de la levure par la banque deux hybrides d'ADNc de cellules Hela.
La levure utilisée a été préalablement transformée par le plasmide pLexTopoIIIα. Elle est cultivée en milieu minimum YNB+His+Lys+Ad+Leu (250 ml),
7 à 28 °C, sous agitation jusqu'à une densité de 10 cellules/ml. Les cellules sont récoltées par centrifugation (3000 rpm, 10 minutes) puis reprises dans 250 ml d'eau.
Après une nouvelle centrifugation, le culot cellulaire est repris dans 100 ml d'eau et de nouveau centrifugé. Le culot est alors repris dans 10ml de la solution I de transformation et incubé pendant 1 heure à 28 °C sous agitation. Après centrifugation, les cellules sont de nouveau reprises dans 2,5 ml de la solution I de transformation, de 100 μl de la banque d'ADNc de cellules Hela et de 20 ml de la solution II de transformation, puis incubées pendant 1 heure à 28 °C sous agitation. Un choc thermique est effectué sur ce mélange de transformation à 42 °C pendant 20 minutes. Les cellules sont ensuite centrifugées et le culot cellulaire récolté est lavé avec 10 ml d'eau stérile. Cette opération est répétée deux fois puis le culot est repris avec 2,5 ml de PBS. A ce stade, le PEG toxique pour les cellules est éliminé. 2,4 ml de cette suspension sont utilisés pour ensemencer 250 ml de milieu minimum contenant les acides aminés His, Lys, Ad et cultivés durant une nuit dans un shaker à 28 °C. Les 100 μl de cette suspension restants servent à déterminer l'efficacité de la transformation par dilution sur milieu minimum solide enprésence de His, Lys et Ad. La culture de nuit est ensuite centrifugée (3000 rpm pendant 5 mn) et lavée deux fois à l'eau stérile. Le culot est ensuite repris dans 2,5 ml d'eau. Un aliquot de 2,4 ml de ce mélange est amené à 10ml
2 dans de l'eau stérile, cette solution est utilisée pour ensemencer 10 boites de 435 cm contenant 200 ml de milieu YNB+Lys+Ad et mis à incuber pendant 3 jours. Les 100 μl restants sont utilisés pour déterminer le taux d'amplification du nombre de colonies au cours d'une nuit de culture. 9 ) Extraction d'acides nucléiques de levures.
La valeur d'une anse moyenne d'un clone de levure est mise dans 200μl d'une solution TELT (Triton XI 00 2%, SDS 1%, NaCl lOOmM, Tris pH8 lOmM, EDTA ImM), en présence de 3g de billes de verre de 450 μm de diamètre et de 200μl de phénol/chloroforme. Ce mélange est agité pendant 15 minutes, puis centrifugé pendant 2 minutes à 14000 rpm. Le surnageant est collecté sans prélever la galette protéique et l'ADN contenu dans cette phase est précipité avec 2,5 volumes d'éthanol absolu. Après centrifugation pendant 2 minutes à 14000 rpm, le culot d'ADN est séché et repris dans 20 μl de TE-RNAse. 3 μl de cette solution d'ADN préalablement dialysée contre de l'eau, qui correspond à un mélange d'acides nucléiques, sert directement à transformer des bactéries HB101. Seul l'ADN plasmidique est capable de se répliquer dans les bactéries et peut être analysé par la technique de préparation d'ADN plasmidique de bactéries en petite quantité.
10) Test d'activité de la β-galactosidase.
Une feuille de nitrocellulose est préalablement déposée sur la boite de Pétri contenant les clones de levures individualisés. Cette feuille est ensuite plongée dans de l'azote liquide pendant 30 secondes afin de faire éclater les levures et de libérer ainsi l'activité βgalactosidase. Après décongélation, la feuille de nitrocellulose est déposée, colonies vers le haut, dans une autre boite de Pétri contenant un papier Whatman 3M préalablement imbibé de 1,5ml de solution PBS (Na2HPO4 60mM, NaH2Pθ4 40mM, KC1 lOmM, MgS04 ImM, pH7) et de 10 à 30μl de X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl- β-D-galactoside) à 50mg/ml de N,N-diméthylformamide. La boite est ensuite incubée à 37°C.
Exemple 1 : Construction d'un vecteur permettant l'expression d'une protéine de fusion entre la topoisomerase IHα humaine et une protéine se liant à l'ADN.
Le criblage d'une banque d'ADNc utilisant le système double hybride nécessite au préalable que la topoisomerase Ma humaine soit fusionnée à une protéine capable de se fixer sur les promoteurs contrôlant l'expression des gènes rapporteurs comme la protéine LexA du répresseur bactérien ou le domaine de liaison à l'ADN (DB) de GAL4. L'expression des protéines de fusion est réalisée grâce au vecteur pLex9 dans le cas d'une fusion avec la protéine LexA ou grâce au vecteur pGBT9 (+2) pour une fusion avec le DB de GAL4 (cf. Matériel et Méthodes). La séquence codant pour la topoisomerase Ma humaine présentée en SEQ ID N° 1 , a été introduite dans ces deux types de vecteur dans le même cadre de lecture que la séquence correspondant à la protéine LexA ou au DB de Gal4.
Le fragment d'ADN correspondant à la séquence codant pour la topoisomerase Ma humaine a été amplifié par PCR à partir d'une banque d'ADNc de cellules Hela (Clontech) grâce aux oligonucléotides 124 et 125. Une deuxième étape d'amplification par PCR a été réalisée sur le fragment d'ADN afin d'introduire aux deux extrémités les sites Xhol et HindIII grâce au couple d'oligonucléotides Top3Xhol et Top3Hind3. Le nouveau fragment d'ADN obtenu, digéré par Xhol et HindIII, a été introduit aux sites correspondant dans le vecteur pBlueBacHis2A (Invitrogen) qui donne la possibilité d'utiliser de nouveaux sites de restriction BamHI et Sali (représentés en gras avec les sites Xhol et HindIII sur la figure 1) pour réaliser les constructions finales.
Le plasmide pLex-TopoIIIα a été construit par insertion du fragment Xhol-Sall, du plasmide précédant, correspondant à la topoisoméraselllα humaine, dans le plasmide pLex9 préalablement modifié par insertion des oligonucléotides PCS1 et PCS2 aux sites EcoRI-Pstll. Ce plasmide a été utilisé pour cribler une banque deux hybrides d'ADNc de cellules Hela dans le but d'identifier des protéines interagissant avec la topoisomerase Ma humaine.
Le plasmide pGBT-TopoIIIα a été construit par insertion, aux sites BamHI et
Sali du plasmide pGBT9 (+2), d'un fragment obtenu par digestion partielle avec BamHI et totale avec Sali et correspondant à la topoisomerase Ma humaine. Ce plasmide a été utilisé pour valider par la technique du deux hybrides la spécificité d'interaction des protéines sélectionnées lors du criblage avec la topoisomerase Ma humaine.
Les constructions ont été vérifiées par séquençage de l'ADN. Cette vérification a permis de montrer que les fragments de la topoisomerase a humaine ne présentaient pas de mutations générées au cours de la réaction de PCR et qu'ils étaient fusionnés dans la même phase ouverte de lecture que celle du fragment correspondant à la protéine LexA ou au DB de GAL4.
Exemple 2 : criblage par la technique du deux hybrides d'une banque d'ADNc de cellules HeLa.
Le criblage d'une banque de fusion permet d'identifier des clones produisant des protéines fusionnées au domaine transactivateur de GAL4, pouvant interagir avec la topoisomerase Ma. Cette interaction permet de reconstituer un transactivateur qui va alors être capable d'induire l'expression des gènes rapporteurs His3 et LacZ dans la souche L40 utilisée.
Pour effectuer ce criblage, une banque de fusion réalisée à partir d'ADNc provenant de cellules Hela a été choisie.
Transformation de la levure par la banque deux hybrides d'ADNc de cellule Hela et sélection des clones positifs.
Lors du criblage il est nécessaire de préserver la probabilité que chaque plasmide indépendant de la banque de fusion soit présent dans au moins une levure en même temps que le plasmide pLex-TopoIIIα. Pour préserver cette probabilité, il est important d'avoir une bonne efficacité de transformation de la levure, à cette fin , il a été choisi un protocole de transformation de la levure donnant une efficacité de 10 cellules transformées par μg d'ADN. De plus, comme la cotransformation de la levure par deux plasmides différents réduit cette efficacité, une levure L40 préalablement transformée par le plasmide pLex-TopoMα a été utilisée. Cette souche contenant pLex-TopoIIIα, de phénotype His-, Lys-, Leu-, a été transformée par 100 μg d'ADN plasmidique de la banque deux hybrides. Cette quantité d'ADN a permis d'obtenir après estimation (voir Matériel et Méthodes) 6 10 cellules transformées, ce qui correspond au nombre de plasmides indépendants que constitue la banque. On peut ainsi estimer que moins de la totalité des plasmides de la banque a servi à transformer les levures. La sélection des cellules transformées, capables de reconstituer un transactivateur GAL4 fonctionnel, a été faite sur un milieu YNB+Lys+Ad. A l'issue de cette sélection environ 500 clones de phénotype His+ ont été obtenus. Sur ces transformants un test d'activité β-galactosidase a été effectué afin de déterminer le nombre de clones exprimant l'autre gène rapporteur, LacZ. Sur 500 clones obtenus, soixante-trois présentaient le double phénotype His+ et βGal+ montrant ainsi qu'ils expriment des protéines pouvant interagir avec la topoisomerase Ma humaine.
Exemple 3 : isolement des plamides à partir des clones de levure sélectionnés
Afin d'identifier les protéines qui interagissent avec la topoisomerase Ma humaine, les plasmides provenant de la banque deux hybrides des levures sélectionnées lors du criblage double hybride ont été extraits. L'ADN des souches de levures de phénotype His+ et βGal+ est utilisé pour transformer la souche E. coli HB101.
Les ADN plasmidiques des colonies bactériennes obtenues après transformation par des extraits d'ADN de levures ont été analysés par digestion avec des enzymes de restriction et par séparation des fragments d'ADN sur gel d'agarose. Il a été obtenu deux profils de restriction différents sur 15 clones de levure analysés. Un de ces profil était fortement représenté. Ces résultats montrent qu'au moins 2 plasmides différents ont été isolés lors de ce criblage, le fragment d'ADN provenant de la banque d'ADNc contenu dans le plasmide le plus représenté a été retenu pour la suite de l'étude.
Exemple 4 : détermination de la séquence de l'insert contenu dans le plasmide sélectionné.
Le séquençage a été réalisé sur le plasmide le plus représenté. Le séquençage est effectué à partir de l'oligonucléotide GAL4TA complémentaire de la région à proximité du site d'insertion de la banque de cDNA de cellules Hela , à 52 paires de bases du site EcoRI.
La comparaison de la séquence obtenue avec les séquences contenues dans les banques de données GenBank et EMBL (European Molecular Biology Lab) a montré que la séquence de l'ADNc présent dans le plasmide sélectionné présente 98.2 %> au niveau nucléique avec le gène humain codant pour la protéine Dead Box X isoform (DBXl) appelée aussi hélicase like protéine 2 (DDX14) ayant le numéro d'accession AF000982 et U50553 respectivement. La comparaison de séquence de l'ADNc présent dans le plasmide sélectionné montre également 98.1 % d'identité avec la protéine DDX14.
La séquence nucléotidique et polypeptidique de DBXl est présentée dans la séquence SEQ ID N°5. La séquence du gène clone par deux hybrides commence au nucléotide 952 par rapport au codon d'initiation supposé, soit au 318 ème acide aminé et contient une séquence homologue à la séquence codant pour la partie C-terminale de la protéine DBXl incluant le codon stop.
Ce résultat montre que le domaine d'interaction des protéines ou polypeptides partenaires de la topoisomerase Ma humaine est contenu dans la seconde moitié C- terminale desdits partenaires.
Des différences ont été notées par rapport à la séquence DBXl publiée, notamment le codon AGT (en position 1768 par rapport au codon d'initiation, soit en position 2624 sur la séquence SEQ ID N°5) codant pour la serine 590, est absent dans le fragment clone.
De même, il a été noté la présence d'un résidu C à la place d'un T en position 2068 de l'ATG.
La séquence du fragment clone est représentée en SEQ ID N°3.
Exemple 5 : analyse de la spécificité d'interaction entre la topoisomerase Hlα et les polypeptides de l'invention.
La spécificité d'interaction entre la topoisomerase Ma humaine et le polypeptide selon l'invention a été confirmée dans un test d'interaction deux hybrides en utilisant le plasmide pGBT-TopoIIIα à la place du plasmide pLex-TopoMα. Le plasmide pGBT-
TopoMα comprend le gène codant pour la topoisomerase Ma humaine fusionné au domaine le liaison à l'ADN de GAL4. La souche yCM17 a été transformée par le plasmide isolé lors du criblage de la banque deux hybrides et par le plasmide pGBT-TopoIIIα. Des contrôles de spécificité d'interaction ont également été effectués en transformant cette souche par les plasmides de contrôle pGBT-HaRasVall2 ou pGBT-Fe65, à la place du plasmide pGBT- TopoMα. Un test d'activité β-Gal sur les cellules transformées par les différents plasmides a été effectué pour mettre en évidence les interactions protéine-protéine.
Les résultats du test ont montrés que seules les levures transformées par le plasmide isolé lors du criblage de la banque deux hybrides et par le plasmide pGBT- TopoIIIα présentaient une activité β-Gal+ montrant ainsi une interaction entre la topoisomerase Ma humaine et la région C-terminale des polypeptides selon l'invention. Ces résultats montrent également que cette interaction est indépendante de la protéine de fusion utilisée.

Claims

REVENDICATIONS
1. Séquence nucléotidique codant pour un polypeptide capable d'interagir avec la topoisomerase Ma.
2. Séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence polypeptidique SEQ ID N° 4 ou de ses dérivées.
3. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID N°3 ou de ses dérivées.
4. Polypeptide caractérisé en ce qu'il est capable d'interagir avec la topoisomerase Ma.
5. Polypeptide selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence polypeptidique SEQ ID N°4 ou d'une séquence dérivée de celle-ci.
6. Polypeptide selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il est constitué de la séquence polypeptidique correspondant aux résidus 318-662 de la séquence SEQ ID N°5 ou d'une séquence dérivée de celle-ci.
7. Utilisation d'un polypeptide ou d'un fragment de polypeptide selon les revendications 4 à 6, pour un ralentissement, une inhibition, une stimulation ou une modulation de l'activité de la topoisomerase Iïïα.
8. Anticorps ou fragment d'anticorps dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 4 à 6.
9. Procédé de mise en évidence ou d'identification de composés capables de se lier avec un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes :
a - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 4 à 6 dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle-ci posséderait une affinité pour ledit polypeptide, et,
b - on détecte et/ou isole les molécules liées avec ledit polypeptide.
10. Procédé de mise en évidence ou d'identification de composés capables de moduler ou d'inhiber l'interaction entre la topoisomerase III -α et un polypeptide tel que défini selon les revendications 4 à 6, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes :
a - on réalise la liaison de la topoisomerase Ma ou d'un fragment de celle-ci avec ledit polypeptide ;
b - on ajoute un composé à tester pour sa capacité à inhiber la liaison entre la topoisomerase Ma et ledit polypeptide ;
c - on détermine le déplacement ou l'inhibition de la liaison de la topoisomerase Ma avec ledit polypeptide ;
d - on détecte et/ou isole les composés qui empêchent ou qui gênent la liaison entre la topoisomerase Ma et ledit polypeptide.
11. Ligand d'un polypeptide tel que défini selon les revendications 4 à 6, susceptible d'être obtenu selon le procédé de la revendication 9.
12. Ligand capable de moduler ou d'inhiber l'interaction entre la topoisomerase Ma et un polypeptide tel que défini selon les revendications 4 à 6, susceptible d'être obtenu selon le procédé de la revendication 10.
13. Utilisation d'un ligand selon la revendication 11 ou 12 pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention, à l'amélioration ou au traitement des maladies impliquant un dysfonctionnement du cycle cellulaire.
14. Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins ligand selon l'une des revendications 11 ou 12 ou un anticorps selon la revendication 8.
15. Composition selon la revendication 14 destinée à moduler ralentir ou inhiber l'activité de topoisomerase Ma.
16. Composition selon l'une des revendications 14 ou 15 destinée à la prévention, à l'amélioration ou au traitement des maladies impliquant un dysfonctionnement du cycle cellulaire.
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