FR2796653A1 - Acides nucleiques codant pour la proteine svn1, application a la modulation des mecanismes de mort cellulaire programmee, notamment la reponse hypersensible (hr), chez les plantes - Google Patents

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Abstract

La présente invention concerne un acide nucléique codant pour une protéine impliquée dans la mort cellulaire programmée chez les plantes, dans la réponse hypersensible (HR), et dans la résistance desdites plantes à divers pathogènes, la protéine SVN1. L'invention concerne aussi la protéine SVN1 codée par un tel acide nucléique ainsi que des anticorps dirigés spécifiquement contre cette protéine, utiles notamment comme outils de diagnostic.L'invention a également trait à des vecteurs recombinants comprenant un acide nucléique codant pour la protéine SVN1 ou une protéine homologue à des cellules hôtes transformées par un acide nucléique ou vecteur recombinant selon l'invention, ainsi qu'à des plantes transgéniques dont une partie ou la totalité des cellules sont transformées avec un acide nucléique ou un vecteur recombinant selon l'invention.

Description

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La présente invention concerne un acide nucléique codant pour une protéine impliquée dans la mort cellulaire programmée chez les plantes, dans la réponse hypersensible (HR), et dans la résistance desdites plantes à divers pathogènes, la protéine SVN1. L'invention concerne aussi la protéine SVN1 codée par un tel acide nucléique ainsi que des anticorps dirigés spécifiquement contre cette protéine, utiles notamment comme outils de diagnostic.
L'invention a également trait à des vecteurs recombinants comprenant un acide nucléique codant pour la protéine SVN1 ou une protéine homologue à des cellules hôtes transformées par un acide nucléique ou vecteur recombinant selon l'invention, ainsi qu'à des plantes transgéniques dont une partie ou la totalité des cellules sont transformées avec un acide nucléique ou un vecteur recombinant selon l'invention.
L'invention est aussi relative à des moyens destinés à augmenter ou au contraire à inhiber l'expression du gène svn1 dans des plantes, dans le but de moduler les mécanismes de mort cellulaire et/ou d'augmenter la résistance desdites plantes à différents pathogènes.
Pour assurer sa survie et son développement, un organisme peut être amené à éliminer sélectivement un certain nombre de ses cellules. Cette élimination sélective de certaines cellules est connue depuis longtemps chez les animaux sous le nom de mort cellulaire programmée (PCD), dont une composante essentielle est l'apoptose. La PCD est un phénomène nécessitant l'expression d'un véritable programme génétique, hautement régulé, et qui répond aussi bien à des stimuli endogènes qu'exogènes. Chez les végétaux, l'étude de la PCD, aujourd'hui bien amorcée, devrait conduire, grâce à l'isolement de mutants (Martienssen, 1997), à une meilleure compréhension du phénomène, actuellement fragmentaire.
La mort cellulaire programmée intervient dans de nombreux processus tels que le développement floral, l'établissement de tissus (xylème, liège, aérenchyme), l'élongation racinaire, la morphologie de la plante et dans la résistance à des agents pathogènes (Pennell et Lamb, 1997).
Dans leur environnement naturel, les plantes sont constamment exposées à des micro-organismes (bactéries, virus, champignons, nématodes). Leur résistance à ces agressions est souvent déclenchée par
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une reconnaissance spécifique du micro-organisme. Lorsqu'un agent pathogène possédant un gène d'avirulence (avr) déterminé entre en contact avec une plante possédant le gène de résistance (R) correspondant (théorie gène pour gène, (Flor, 1971)), une mort cellulaire rapide et localisée au site d'inoculation est initiée. Cette réaction communément appelée HR (réponse hypersensible) résulte d'une interaction plante micro-organisme dite incompatible et limite la progression du pathogène.
Lors de l'infection bactérienne, la reconnaissance de l'agent pathogène se réalise dans le cytoplasme où les facteurs d'avirulence sont injectés via un système de sécrétion codé par le cluster hrp (hypersensibility and pathogenicity) (Bonas et Van den Ackerveken, 1997). La nature de l'interaction protéine R/ facteurs avr est encore obscure bien qu'une interaction directe entre les protéines Pto et avrPto ait été mise en évidence dans la levure (Tang et al., 1996). Les protéines R présentent des similarités de structure (Bent, 1996) et seraient susceptibles d'intervenir également dans la voie de signalisation de la HR.
Suite à cette reconnaissance, des modifications physiologiques de la cellule sont observées, comprenant un changement dans l'état de phosphorylation des protéines accompagné de variations du potentiel redox et des flux ioniques (Yang et al., 1997). Ces événements interviennent rapidement et participent à la transduction du signal conduisant à la HR.
Parallèlement à la PCD, un système de résistance est mis en place autour de la zone de nécrose (LAR, local acquired resistance) ainsi que dans les autres parties de la plante (SAR, systemic acquired resistance). La SAR est également induite par une interaction compatible et est caractérisée par une résistance prolongée à large spectre d'hôte (production de protéines de défense comme les PR). L'acide salicylique (SA) joue un rôle important dans la mise en place de la SAR mais ne correspond pas au message diffusible qui permet de faire le lien entre l'événement de reconnaissance et le reste de la plante (Ryals étal., 1996).
La HR est une caractéristique des interactions incompatibles plantesagents pathogènes et est étroitement associée à la résistance. Les relations mécanistiques entre résistance et HR ne sont pas encore tout à fait claires et différentes approches devraient permettre de préciser ce point, par exemple l'étude de mutants altérés dans les processus de mort cellulaire.
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Des mutants 'mort cellulaire spontanée' sont actuellement disponibles et sont classés en deux catégories comprenant les mutants d'initiation [mlo
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(orge), cpr5, Isd2, Isd3, Isd4, Isd5, Isd6, Isd7, acd2 (A. thaliana)] présentant des lésions de taille définie, et les mutants de propagation (Ils1 (mais), Isd1, acdl) qui sont incapables de restreindre la taille des lésions. Ces mutants développent des lésions foliaires spontanées en l'absence de pathogènes. A ces lésions est associée l'expression de nombreux marqueurs de la HR tels
Figure img00030002

que des dépôts de callose (mlo), l'expression de PR (isdl, Isd2, Isd3, Isd4, Isd5, Isd6, Isd7). Ils présentent également une diminution de la sensibilité (/sd2, Isd3, Isd4, Isd5) voire une résistance (/sd6, Isd7, cpr5, mlo, acd1, acd2, Ils1) à des pathogènes fongiques et bactériens (Isd1, acd2) (Dietrich et al., 1994 ; Bowling et al., 1997 ; Wolter et al., 1993 ; Greenberg et al., 1993 ; Greenberg et al., 1994 ; Simmons et al., 1998). A partir de ces mutants, trois gènes ont été clonés (IIs1, mlo, Isd1), dont un seul chez Arabidopsis thaliana (Isd1). MLO (Büschges et al., 1997) code pour une protéine susceptible d'être membranaire et/ou nucléaire, dont la fonction est actuellement inconnue. LLS1 correspond à une deoxygénase du cycle aromatique hydroxylé (Gray et al., 1997). Enfin, LSD1 code pour un facteur transcriptionnel à doigt de zinc, probablement impliqué dans la gestion d'un signal superoxyde-dépendant, et dans la régulation négative d'une voie de mort cellulaire programmée.
Afin d'identifier et caractériser un gène impliqué dans la régulation des mécanismes de mort cellulaire programmée chez les plantes, le demandeur a réalisé un criblage de la banque de mutants d'insertion d'ADN-T de pGKB5 d'Arabidopsis thalania produite à Versailles (Schultz et al., 1994b). Ce criblage a visé, d'une part, à isoler des mutants présentant une modification de la réponse hypersensible suite à l'inoculation de Xanthomonas campestris pv. campestris. 147 et, d'autre part, à identifier des mutants altérés dans les programmes de mort cellulaire (lésions spontanées). Cette étude a permis d'identifier un mutant ayant un phénotype de "mort cellulaire spontanée ", le mutant svn1 (spontaneous vessel necrosis 1), qui, en conditions permissives, présente des lésions foliaires se propageant le long du système vasculaire. La ségrégation du phénotype de svn1 est compatible avec une mutation monogénique, nucléaire et récessive. Une analyse de la ségrégation du phénotype mutant et de la présence de l'ADN-T sur la
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troisième génération après croisements a permis de confirmer la relation de causalité entre l'insertion de l'ADN-T et le phénotype de svn1. Les fragments d'ADN génomique adjacents aux bordures droite et gauche de l'ADN-T ont été isolés en utilisant la technique de Devic et al. (1997) basée sur la PCR confirmant l'insertion d'un ADN-T unique chez les plantes mutantes snv1.
Une recherche d'homologie dans les banques de données a révélé que l'insertion de l'ADN T de pGKB5, dans le génome du mutant svn1 de A. thaliana, était localisée sur le chromosome 1 dans une région de 4 kb entre deux cadres ouverts de lecture (Open Reading Frame ou ORF) codant respectivement pour une protéine apparentée à l'oncogène Ras et une protéine de type ss Zip. Cette séquence de 4 kb est comprise dans l'insert d'un vecteur BAC de 1 état de la technique, le vecteur BAC T7123. Le vecteur BAC T7123 contient un insert de 106973 paires de bases de l'ADN génomique de A. thaliana qui a été séquence par Federspiel et al. et référencé dans la base de données GenBank sous le numéro d'accès n U89959. Une séquence EST (Expressed Séquence Tag) possédant 99% d'identité avec un segment de séquence localisé du côté 3' du cadre ouvert de lecture codant potentiellement pour la protéine de type ss Zip a été retrouvée dans les bases de données. Aucune séquence codante n'avait été identifiée jusqu'à présent dans la séquence génomique encadrée par les deux cadres ouverts de lecture décrits ci-dessus.
Il est fourni, selon l'invention, un acide nucléique codant pour une protéine impliquée dans la mort cellulaire programmée chez les plantes, en particulier chez A. thaliana. Plus précisément, le demandeur a isolé un acide nucléique codant pour la protéine SVN1, dont il a montré qu'une mutation, en l'occurrence une insertion d'ADN-T dans l'un des introns du gène, conduit, dans certaines conditions d'exposition à la lumière de la plante portant le gène svn1 ainsi muté, à un phénotype de mort cellulaire spontanée.
Contrairement aux mutants ayant un phénotype de mort cellulaire spontanée connus jusqu'à présent, qui présentaient des lésions circulaires initiées sur toute la surface de la feuille et qui se développaient, les plantes portant un gène svn1 muté initie des lésions au niveau du pétiole, autour du rachis, la propagation de ces lésions dans le limbe suivant préférentiellement les nervures.
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Sans vouloir être lié par une théorie particulière, le demandeur pense qu'une mutation sur le gène svn1 pourrait être responsable d'une dérégulation de la perception d'un signal produit lors de la réponse hypersensible (HR) et/ou affecter la production ou la translocation de ce signal.
Selon l'invention, il a été montré que des plantes portant une mutation dans le gène svn1, lorsqu'elles sont soumises à des conditions d'exposition à la lumière dépassant un seuil défini plus loin dans la description, développent spontanément des lésions cellulaires qui se propagent surtout le long du système vasculaire et conduisent à la mort de la feuille. Une plante mutée dans le gène svn1 présente donc, selon l'acception commune de l'homme du métier, un phénotype de la famille des mutants dit " de propagation ", dont il est couramment admis qu'ils sont affectés dans un gène suppresseur de la mort cellulaire.
Il a été également montré que des plantes portant une mutation dans le gène svn1, en condition permissive, c'est à dire dans des conditions d'exposition à la lumière dans lesquelles le phénotype " mort cellulaire spontanée " est observable, présentent une diminution de la résistance à un pathogène de plantes dit " nécrotrophe ", en particulier un pathogène avirulent pour les plantes non mutées sur le gène svn1, par comparaison à la résistance à ce même pathogène observée dans une plante d'un écotype sauvage.
Dans des conditions non permissives, la multiplication de ce pathogène nécrotrophe dans des plantes portant une mutation dans le gène svn1 est stoppée dès le deuxième jour après l'inoculation, notamment par un confinement des pathogènes dans les cellules infectées, puis la mort programmée de ces cellules, la plante mutante ayant ainsi une résistance audit pathogène comparable, voire supérieure, à la résistance développée chez une plante d'un écotype sauvage.
Le phénotype " mort cellulaire spontanée " peut être observé, chez les mutants svn1 de A. thalania selon l'invention, dans les conditions d'intensité d'exposition à la lumière suivantes (conditions dites permissives) : 146 Em- 2s-1.
En outre, il a également été montré selon l'invention que l'expression du gène svn1 était induite après inoculation de la plante avec un pathogène
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dit " compatible ", aussi bien qu'avec un pathogène dit " incompatible Il peut s'agir, par exemple, de la souche de Xanthomonas campestris pv. campestris 147 (X. c. c. 147) inoculée à une lignée de A. thaliana sauvage (conditions d'interaction " incompatibles ") ou inoculée à une lignée de A. thaliana, développant une interaction " compatible " avec X. c. c. 147.
Il a aussi été montré, par une analyse de l'expression de l'ARNm de svn1, que dans le cas d'une interaction compatible, le gène svn1 est exprimé précocement, dès environ huit heures après l'inoculation avec le pathogène, alors que lors d'une interaction compatible, le gène svn1 est exprimé plus tardivement, dès environ 24 heures après l'inoculation.
L'ADN-T inséré dans le gène svn1 dans les plantes mutantes comprend un gène rapporteur, le gène gus, et le demandeur a pu montrer que le gène gus de l'ADN-T inséré dans le génome des plantes mutées dans le gène svn1 décrites dans les exemples était en phase avec le promoteur du gène. Le demandeur a ainsi pu montrer, par détection de la synthèse de la protéine GUS ( Jefferson, 1987) sur des coupes histologiques préparées à partir des plantes mutées dans svn1, que ce gène est exprimé de manière prépondérante, voire exclusivement, dans les feuilles cotylédonaires sénescentes et dans les cellules des racines jeunes, c'est à dire à des localisations identiques de celles des lésions observées dans le cas d'une réponse hypersensible lors de l'infection par un pathogène, et à des stades de développement durant lesquels la régulation des mécanismes de mort cellulaire programmée est active.
Il a en outre été observé que la vaporisation d'acide salicylique sur une plante portant un gène svn1 muté, en conditions non permissives, induit des lésions se propageant sèches, indiquant une grande sensibilité à l'acide salicylique. Les composés de la classe à laquelle appartient l'acide salicylique sont hautement réactifs et sont susceptibles d'endommager les membranes, entraînant la mort de la cellule. La sensibilité accrue d'une plante portant un gène svn1 muté à l'acide salicylique pourrait indiquer l'existence d'une relation entre une mutation dans le gène svn1 et les phénomènes intervenant en réponse à un stress biotique, en particulier une infection par un pathogène de plante, par exemple viral, bactérien ou fongique.
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L'identification et la caractérisation du gène svn1 et de la protéine codée par celui-ci rend désormais accessibles à l'homme du métier des moyens destinés à moduler (augmenter ou au contraire diminuer) l'expression de ce gène chez une plante afin de déclencher ou au contraire inhiber ou bloquer le phénomène de mort cellulaire programmée chez ladite plante, ou encore afin de réguler les mécanismes de résistance de ladite plante à divers pathogènes.
La présente invention met également à la disposition de l'homme du métier des moyens pour transformer une plante avec un acide nucléique comprenant tout ou partie de la séquence du gène svn1, afin d'augmenter la résistance de ladite plante à divers pathogènes de végétaux. L'invention fournit aussi des moyens destinés à moduler (augmenter ou au contraire inhiber ou bloquer) l'expression du gène svn1 dans une plante, dans le but de stimuler la résistance de cette plante à diverses infections, ou dans le but de retarder la sénescence de certaines catégories cellulaire, notamment en vue d'améliorer certains caractères d'intérêt agronomique de la plante.
L'invention décrit aussi des moyens de détection de l'expression du gène svn1, sous une forme sauvage ou mutée, et des moyens de détection de son produit d'expression, dans un échantillon.
Ainsi, un premier objet de l'invention consiste en un acide nucléique codant pour un polypeptide comprenant au moins 5 acides aminés consécutifs de la protéine SVN1 de séquence en acides aminés SEQ ID N 5 ou d'un polypeptide ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la protéine SVN1, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
De manière préférée, un acide nucléique selon l'invention se présente sous une forme isolée et/ou purifiée.
Le terme " isolé" au sens de la présente invention désigne un matériel biologique (acide nucléique ou protéine) qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement).
Par exemple un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante ou un animal n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante ou l'animal est considéré comme " isolé ".
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Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel.
Le terme " purifié " ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.
Un polynucléotide est à l'état " purifié " après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement 4 ou 5 ordres de grandeur.
Aux fins de la présente description, l'expression " séquence nucléotidique " peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression " séquence nucléotidique " englobe le matériel de génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
Les termes " acide nucléique ", " polynucléotide ", " oligonucléotide " ou encore " séquence nucléotidique englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple chaîne ou sous la forme de d uplex.
Le terme " nucléotide " désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (1) un analogue d'une purine, (2) un analogue d'une pyrimidine, ou (3) un sucre analogue, des exemples de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N WO 95/04 064.
Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant " complémentaire " d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée.
Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), ou C et G.
Selon l'invention, un premier acide nucléique ayant au moins 80% d'identité avec un second acide nucléique de référence, possédera au moins 80%, de préférence au moins 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 99,5% d'identité en nucléotides avec ce second polynucléotide de référence, le
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pourcentage d'identité entre deux séquences étant déterminé comme décrit ci-dessous.
Le " pourcentage d'identité " entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptide dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des " gaps ") par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences.
Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auquel une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par 100 afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus contenus dans le package de la Société WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor , Madison, WISCONSIN.
# titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être effectué à l'aide du logiciel BLAST (version BLAST 2. 0.6 de septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut (S. F Altschul et al, J. Mol. Biol. 1990 215 : S. F Altschul et al, Nucleic Acids Res.
1997 25: 3389-3402). BLAST recherche des séquences similaires/homologues à une séquence " requête " de référence, à l'aide de l'algorithme d'Altschul et al. La séquence requête et les bases de données utilisées peuvent être peptidiques ou nucléiques, toute combinaison étant possible.
La séquence génomique du gène svn1 est référencée comme la séquence SEQ ID N 1. Un autre objet de l'invention est un acide nucléique qui comprend ou est constitué de la séquence SEQ ID N 1.
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L'invention est aussi relative à un acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs du polynucléotide de séquence SEQ ID N 1.
La séquence du gène svn1 comprend 18 exons et 17 introns, dont les caractéristiques structurales sont détaillées respectivement dans les tableaux 1 et 2 ci-après.
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Tableau 1 : Séquences exoniques du gène svn1
Figure img00110001
<tb>
<tb> Exon <SEP> N <SEP> Position <SEP> du <SEP> nucléotide <SEP> en <SEP> 5' <SEP> Position <SEP> du <SEP> nucléotide <SEP> en <SEP> 3' <SEP> sur
<tb>
Figure img00110002

sur la SEQ ID N 1 la SEQ ID N 1
Figure img00110003
<tb>
<tb> 1 <SEP> 189 <SEP> 513 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 594 <SEP> 654 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 733 <SEP> 784 <SEP>
<tb> 4 <SEP> 858 <SEP> 931 <SEP>
<tb> 5 <SEP> 1004 <SEP> 1098 <SEP>
<tb> 6 <SEP> 1174 <SEP> 1290
<tb> 7 <SEP> 1358 <SEP> 1428 <SEP>
<tb> 8 <SEP> 1506 <SEP> 1664 <SEP>
<tb> 9 <SEP> 2269 <SEP> 2309
<tb> 10 <SEP> 2443 <SEP> 2529
<tb> il <SEP> 2632 <SEP> 2717 <SEP>
<tb> 12 <SEP> 2858 <SEP> 2911
<tb> 13 <SEP> 3025 <SEP> 3091 <SEP>
<tb> 14 <SEP> 3179 <SEP> 3277
<tb> 15 <SEP> 3469 <SEP> 3532
<tb> 16 <SEP> 3634 <SEP> 3674 <SEP>
<tb> 17 <SEP> 3746 <SEP> 3958 <SEP>
<tb> 18 <SEP> 4049 <SEP> 4286 <SEP>
<tb>
L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide exonique du gène snv1, tels que les polynucléotides 1 à 18 décrits dans le Tableau 1 cidessus, qui sont tous inclus dans l'acide nucléique de séquence SEQ ID N 1.
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De manière générale, un acide nucléique ayant au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence selon l'invention possédera avantageusement au moins 20,25, 30, 35, 40, 50,75, 100,150, 200,300, 400, 500, 1000, 2000,3000, 4000 nucléotides consécutifs de la séquence de référence, la longueur de nucléotides consécutifs étant naturellement limitée par la longueur de la séquence de référence.
Un tel acide nucléique code pour au moins une partie du polypeptide SVN1 et peut notamment être inséré dans un vecteur recombinant destiné à l'expression du produit de traduction correspondant dans une cellule hôte ou dans une plante transformée avec ce vecteur recombinant. Un tel acide nucléique peut aussi être utilisé pour la synthèse de sondes et d'amorces nucléotidiques destinées à la détection ou à l'amplification de séquences nucléotidiques comprises dans le gène svn1 dans un échantillon, le cas échéant de séquences du gène svn1 portant une ou plusieurs mutations, préférentiellement une ou plusieurs mutations de nature à modifier le phénotype d'une plante portant un tel gène svn1 muté, par exemple en modifiant la régulation des mécanismes de mort cellulaire programmée et plus particulièrement la régulation de la réponse à un stress biotique tel que l'infection par un pathogène des végétaux.
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Tableau 2 : Séquences introniques du gène svn1
Figure img00130001
<tb>
<tb> Intron <SEP> N <SEP> Position <SEP> du <SEP> nucléotide <SEP> en <SEP> 5' <SEP> Position <SEP> du <SEP> nucléotide <SEP> en <SEP> 3' <SEP> sur <SEP>
<tb> sur <SEP> la <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> la <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> N <SEP> 1
<tb> 1 <SEP> 514 <SEP> 593 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 655 <SEP> 732 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 785 <SEP> 857
<tb> 4 <SEP> 932 <SEP> 1003 <SEP>
<tb> 5 <SEP> 1099 <SEP> 1173 <SEP>
<tb> 6 <SEP> 1291 <SEP> 1357 <SEP>
<tb> 7 <SEP> 1429 <SEP> 1505
<tb> 8 <SEP> 1665 <SEP> 2268 <SEP>
<tb> 9 <SEP> 2310 <SEP> 2442 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 2530 <SEP> 2631 <SEP>
<tb> 11 <SEP> 2718 <SEP> 2857 <SEP>
<tb> 12 <SEP> 2912 <SEP> 3024 <SEP>
<tb> 13 <SEP> 3092 <SEP> 3178 <SEP>
<tb> 14 <SEP> 3278 <SEP> 3468 <SEP>
<tb> 15 <SEP> 3533 <SEP> 3633 <SEP>
<tb> 16 <SEP> 3675 <SEP> 3745 <SEP>
<tb> 17 <SEP>3959 <SEP> 4048 <SEP>
<tb>
L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide intronique du gène svn1, tels que les polynucléotides 1 à 17 décrits dans le tableau 2 ci-dessus, qui sont tous inclus dans l'acide nucléique de séquence SEQ ID N 1.
Un tel acide nucléique peut être utilisé comme sonde ou amorce oligonucléotidique pour détecter la présence d'au moins une copie du gène
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svn1 dans un échantillon, ou encore pour amplifier une séquence cible déterminée au sein du gène svn1.
Il a pu être montré selon l'invention que le gène svn1 est transcrit sous la forme d'un ARN messager qui a été isolé et caractérisé. Cet ARN messager comporte un cadre de lecture ouvert unique codant pour la protéine SVN1 d'une longueur de 644 acides aminés.
De part et d'autre du cadre ouvert de lecture, cet ARN messager comprend respectivement une région 5' non traduite (5'-UTR) et une région 3' non traduite (3'-UTR).
L'ADNc correspondant au cadre ouvert de lecture codant pour le polypeptide SVN1 est référencé comme la séquence SEQ ID N 2.
La séquence 5'-UTR de l'ARN messager transcrit par le gène svn1est constituée de la séquence allant du nucléotide en position 1 au nucléotide en position 188 de la séquence SEQ ID N 1, et référencée comme la séquence SEQ ID N 3.
La séquence 3'-UTR de l'ARN messager transcrit par le gène svn1est constituée de la séquence allant du nucléotide en position 4328 au dernier nucléotide à l'extrémité 3' de la séquence SEQ ID N 1, et référencée comme la séquence SEQ ID N 4.
L'invention concerne aussi un acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi parmi les séquences SEQ ID N 2 à 4, à un polynucléotide ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un tel acide nucléique ainsi qu'à un acide nucléique de séquence complémentaire audit acide nucléique ou audit polynucléotide.
Fait également partie de l'invention un acide nucléique qui comprend, ou qui est constitué de la séquence nucléotidique SEQ ID N 2.
Dans un mode de réalisation particulier d'un acide nucléique selon l'invention un tel acide nucléique comprendra à la fois le cadre de lecture ouvert codant pour le polypeptide SVN1 et la séquence 3'-UTR et/ou la séquence 5'-UTR, constituées respectivement des séquences SEQ ID N 3 et 4. Les régions 5'-UTR et 3'-UTR sont en effet susceptibles de contenir des éléments de régulation de la transcription et/ou de la traduction du gène svn1, tels qu'un ou plusieurs sites de liaison au ribosome, un ou plusieurs sites de polyadénylation, des séquences permettant la stabilité de l'ARN
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messager ou encore tout ou partie de la région promotrice de la transcription.
Les acides nucléiques selon l'invention, et en particulier les séquences nucléotidiques SEQ ID N 1 à 4, leurs fragments d'u moins 15 nucléotides, les séquences ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec au moins une partie des séquences SEQ ID N 1 à 4, ainsi que les acides nucléiques de séquence complémentaire, sont utiles pour la détection de la présence d'au moins une copie d'une séquence nucléotidique du gène SNV1 ou encore d'un fragment ou d'un variant allélique de cette dernière dans un échantillon.
Font également partie de l'invention les sondes et amorces nucléotidiques hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N 1 à 4.
Par conditions d'hybridation de forte stringence, au sens de l'invention, on entend les conditions d'hybridation suivantes : - préhybridation des filtres pendant 8 heures à 65 C dans un tampon composé de 6 x SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% SAB et 500 g/ml de sperme de saumon dénaturé ; - hybridation des filtres pendant 48 heures à 65 C en présence de tampon 1 x SSC correspondant à 0,15 M de NaCI et 0,05 M de citrate de sodium ; - trois lavages des filtres dans une solution contenant 2 x SSC et 0,1% SDS à 38 C pendant 15 minutes.
Les conditions d'hybridation décrites plus haut sont adaptées à l'hybridation dans des conditions de forte stringence, d'une molécule d'acide nucléique d'une longueur variable de 20 nucléotides à plusieurs centaines de nucléotides.
Il va sans dire que les conditions d'hybridation ci-dessus décrites peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon des techniques connues de l'homme du métier.
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985) ou encore dans l'ouvrage de F. AUSUBEL et al (1999).
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Les sondes ou les amorces nucléotidiques selon l'invention comprennent au moins 15 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N 1 à 4 ou de sa séquence complémentaire, d'un acide nucléique ayant 80% d'identité en nucléotides avec une séquence choisie parmi le séquences SEQ ID N 1 à 4 ou de sa séquence complémentaire ou encore d'un acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 1 à 4 ou de sa séquence complémentaire.
De préférence, des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention auront une longueur d'au moins 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000,2000, 3000 ou 4000 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier un acide nucléique de séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N 1 à 4, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.
Alternativement, une sonde ou une amorce nucléotidique selon l'invention consistera et/ou comprendra les fragments d'une longueur de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000, 3000 ou 4000 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, plus particulièrement d'un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N 1 à 4, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.
Des exemples d'amorces et de couples d'amorces permettant d'amplifier différentes régions du gène SVN1 sont par exemples les séquences SEQ ID N 6 à 9.
Le couple d'amorces de séquence SEQ ID N 6 et SEQ ID N 7 permet l'amplification de l'ADNc complet de svn1.
Le couple d'amorces SEQ ID N 8 et SEQ ID N 9 permet l'amplification d'un fragment d'environ 1,3 kb de l'ADNc de svn1.
Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de Narang et al. (1979) ou de Brown et al. (1979), la méthode aux diéthylphosphoramidites de Beaucage et al. (1980) ou encore
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la technique sur support solide décrite dans le brevet Européen N EP 0 707 592.
Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peut être marqué, si désiré, en incorporant un marqueur détectable par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.
Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32P, 3H, 35S), des molécules fluorescentes (5bromodeoxyuridine, fluorescéine , acétylaminofluorène, digoxigénine) ou encore des ligands tels que la biotine.
Le marquage des sondes est fait de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5' ou 3'.
Des exemples de marquage non radioactifs de fragments d'acides nucléiques sont décrits notamment dans le brevet français n FR 78 109 75 ou encore dans les articles de Urdea et al. (1988) ou Sanchez-pescador et al. (1988).
De manière avantageuse, les sondes selon l'invention peuvent avoir des caractéristiques structurelles de nature à permettre une amplification du signal, telles que les sondes décrites par Urdea et al. (1991) ou encore dans le brevet européen n EP-0 225 807 (CHIRON).
Les sondes oligonucléotides selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN génomique de svn1 ou encore dans des hybridations à l'ARN messager de svn1 lorsque l'expression du transcrit correspondant est recherchée dans un échantillon.
Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements.
Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaques de microtitration, des lits de polystyrène, des lits magnétiques, des bandes de nitrocellulose, ou encore des microparticules telles que des particules de latex.
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En conséquence, la présente invention concerne également un procédé de détection de la présence d'un acide nucléique du gène svn1 dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes de :
1) mettre en contact une sonde ou une pluralité de sondes nucléotidiques selon l'invention avec l'échantillon à tester ;
2) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé de détection selon l'invention, la ou les sondes oligonucléotidiques sont immobilisées sur un support.
Selon un autre aspect, les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
L'invention concerne en outre un nécessaire ou kit pour la détection de la présence d'un acide nucléique selon l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques telles que décrites cidessus ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.
Selon un premier aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.
Selon un second aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit cidessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques conformes à l'invention qui pourront être utilisées pour détecter des séquences cibles d'intérêt de svn1 ou alternativement détecter des mutations dans les régions codantes ou les régions non codantes de svn1, plus particulièrement des acides nucléiques de séquences SEQ ID NO 1 à 4 ou les acides nucléiques de séquence complémentaire.
Les amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour amplifier un fragment nucléotidique quelconque (ADNg, ADNc, ARNm) de svn1, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID NO 1 à 4, ou encore un variant de celui-ci.
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Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement un acide nucléique de séquences SEQ ID N 1 à 4 ou un fragment ou un variant allélique de celui-ci contenu dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de : a) mettre en contact l'échantillon dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée avec une paire d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de la région de l'acide nucléique cible de svn1 dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification ; et b) détection de l'acide nucléique éventuellement amplifié.
Pour mettre en #uvre le procédé d'amplification tel que défini cidessus, on aura avantageusement recours à l'une quelconque des amorces nucléotidiques décrites ci-avant.
L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID N 1 à 4 , ledit nécessaire ou kit comprenant : a) un couple d'amorces nucléotidiques conformes à l'invention, dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de l'acide nucléique cible de svn1 dont l'amplification est recherchée ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.
Un tel nécessaire ou kit d'amplification comprendra avantageusement au moins une paire d'amorces nucléotidiques telles que décrites ci-dessus.
Selon un mode de réalisation préféré, des amorces selon l'invention comprennent tout ou partie d'un polynucléotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N 6 à 9.
On a vu précédemment que les plantes portant un gène svn1 muté développent spontanément, en conditions permissives, des lésions cellulaires localisées majoritairement au niveau du système vasculaire de la feuille. Il en résulte que, dans ces conditions, une altération dans l'expression de svn1 ou une altération dans la structure de la protéine SVN1 est susceptible d'accroître la résistance de la plante à un pathogène qui se
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multiplie uniquement à l'intérieur des cellules vivantes. Un tel pathogène est communément dénommé pathogène " biotrophe " et est représenté, par exemple, par de nombreux champignons tel que phytophtora. Les pathogènes biotrophes sont principalement rencontrés dans les régions d'Europe du Sud et il est donc d'un grand intérêt de stimuler la résistance aux pathogènes biotrophes particulièrement dans ces régions.
L'invention a également trait à des procédés et des moyens destinés à inhiber ou bloquer l'expression du gène svn1 chez les plantes, ou encore de provoquer l'expression d'une protéine SVN1 biologiquement inactive, en vue d'accroître leur résistance aux pathogènes biotrophes définis ci-dessus, et ceci par toute technique connue de l'homme du métier.
Afin d'inhiber ou de bloquer l'expression du gène svn1 chez une plante, l'homme du métier pourra recourir à l'utilisation de polynucléotides sens et antisens.
Ainsi, l'invention concerne aussi un polynucléotide sens ou un polynucléotide antisens, capable de s'hybrider spécifiquement à une région déterminée du gène svn1 et capable d'inhiber ou de bloquer sa transcription et/ou sa traduction. Un tel polynucléotide a la structure générale qui a été définie précédemment pour les sondes et les amorces selon l'invention.
De préférence, un polynucléotide antisens selon l'invention comprend une séquence correspondant à une séquence localisée dans la région de l'extrémité 5' de l'ARN messager svn1, et de manière tout à fait préférée à proximité du codon d'initiation de la traduction (ATG) du gène svn1.
Selon un second mode de réalisation préférentiel, un polynucléotide antisens selon l'invention comprend une séquence correspondant à l'une des séquences localisées au niveau des jonctions exon/intron du gène svn1 et de manière préférée des séquences correspondant à un site d'épissage.
Pour synthétiser des polynucléotides antisens tels que définis cidessus, l'homme du métier pourra se référer aux tableaux 1 et 2 dans lesquels sont détaillées les positions des différents exons et introns du gène svn1 dans la séquence SEQ ID N 1.
De manière générale, les polynucléotides antisens doivent avoir une longueur et une température de fusion suffisante pour permettre la formation d'un hybride duplex intracellulaire ayant une stabilité suffisante pour inhiber l'expression de l'ARNm de svn1. Des stratégies pour construire
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des polynucléotides antisens sont notamment décrites par Green et al.
(1986) et Izant et Weintraub (1984), le contenu de ces deux articles étant ici incorporé par référence.
Des méthodes de construction de polynucléotides antisens sont également décrites par Rossi et al. (1991) ainsi que dans les demendes PCT N WO 94/23026, WO 95/04141, WO 9218522 et dans la demande de brevet européen n EP 0 572 287, le contenu de ces documents étant incorporés par référence.
Avantageusement, un polynucléotide antisens selon l'invention a une longueur de 15 à 200 nucléotides. Un polynucléotide sens de l'invention a ainsi une longueur allant de 15,20, 25,30, 35, 40, 45 ou 50 à 75,100, 150 ou 200 nucléotides.
Afin d'inhiber ou de bloquer l'expression du gène svn1, on peut aussi avoir recours simultanément à une pluralité de polynucléotides antisens tels que définis ci-dessus, chacun des polynucléotides antisens hybridant avec une région distincte du gène svn1 ou de son ARN messager.
D'autres méthodes de mise en oeuvre des polynucléotides antisens sont par exemple celles décrites par Sczakiel et al. (1995) ou encore celles décrites dans la demande PCT n WO 95/24223.
Un autre stratégie pour inhiber ou bloquer l'expression du gène svn1 consiste à utiliser des polynucléotides capables de former une triple hélice d'ADN avec la région génomique d'ADN double brin protant le gène svn1. En général, des séquences d'homopurine sont considérées comme les plus utiles dans ce type de stratégie, bien que des séquences d'homopyrimidine puissent aussi être employées.
L'homme du métier peut avantageusement se référer à la séquence génomique SEQ ID N 1 de svn1 afin de sélectionner dans cette séquence des séquences d'homopurine ou d'homopyrimidine de 10 à 20 nucléotides de long, qui seront capables d'inhiber l'expression du gène snv1. De telles séquences se lient au sillon majeur de l'ADN initialement double brin, au niveau des régions d'appariement homopurine : homopyrimidine. L'efficacité des séquences d'homopurine ou d'homopyrimidine sélectionnées est vérifiée en introduisant des quantités variées de tels polynucléotides dans les cellules des plantes en culture et en mesurant l'expression résultante du gène snv1, par exemple selon des techniques conuues de l'homme du
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métier, telles que le Northern blot, les tests de protection à la Rnase, ou encore par des techniques d'amplification, par exemple par PCR.
Avantageusement, on aura recours à la technique de Northern blot décrite à l'exemple 4.
Les polynucléotides décrits ci-dessus utiles pour inhiber l'expression du gène svn1 selon une technique triple hélice peuvent être introduits dans les cellules selon des techniques bien connues de l'homme du métier. De préférence, ces polynucléotides seront introduits via des vecteurs recombinants qui seront décrits ci-après dans la description.
Des méthodes d'inhibition de l'expression d'un gène par la technique triple hélice sont par exemples décrites par Griffin et al. (1989), dont le contenu est ici incorporé par référence.
L'invention a donc également pour objet l'utilisation d'un polynucléotide antisens ou d'un polynucléotide homopurine ou homopyrimidine, tels que définis précédemment, ou d'un vecteur recombinant comprenant un tel polynucléotide, pour inhiber ou pour bloquer l'expression du gène svn1 dans une cellule de plante ou dans une plante entière.
Il a aussi été montré selon l'invention que les plantes mutées dans le gène svn1, lorsqu'elles sont cultivées en condition permissive, sont plus sensibles à un pathogène " nécrotrophe ", qui se multiplie majoritairement dans l'espace intercellulaire et pour lequel le développement d'une mort cellulaire précoce est favorable à sa propagation dans l'ensemble des tissus de la feuille. De tels pathogènes nécrotrophes sont principalement bactériens et sont souvent rencontrés dans l'Europe du Nord. La souche de Xanthomonas campestris , dont l'infection à été étudiée à l'exemple 3, constitue un tel pathogène nécrotrophe. Afin de stimuler la résistance d'une plante à un pathogène nécrotrophe, il sera donc avantageux de favoriser l'expression du gène svn1 qui, en condition permissive (qui correspond aux conditions moyennes d'ensoleillement en Europe), sera de nature à inhiber les mécanismes de mort cellulaire et à empêcher ainsi le développement d'un tel pathogène.
Une forte expression du gène svn1 chez une plante peut être atteinte soit par la surexpression du gène svn1, soit par l'insertion de multiples copies d'un polynucléotide codant pour la protéine SVN1 dans la plante, soit
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encore par une combinaison de ces deux stratégies. Pour l'insertion de multiples copies d'un polynucléotide codant pour la protéine SVN1 dans le génome d'une plante, on aura avantageusement recours à un vecteur recombinant selon l'invention, de préférence à un vecteur recombinant de type intégratif.
L'invention est également relative à un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon l'invention.
Avantageusement, un tel vecteur recombinant comprendra un acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques suivants : a) un acide nucléique codant pour au moins 5 acides aminés consécutifs de la protéine SVN1 de séquence en acides aminés SEQ ID N 5 ou d'un polypeptide ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la protéine SVN1 ; b) un acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide de séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 1 à 4 ; c) un acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide constitué de l'un des exons 1 à 18 du gène svn1, tels que définis ci-avant ; d) un acide nucléique comprenant un polynucléotide constitué de l'un des introns 1 à 17 du gène svn1, tels que définis ci-avant. e) un acide nucléique ayant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec l'une des séquences SEQ ID N 1 à 4. f) un polynucléotide antisens ou un polynucléotide homopurine ou homopyrimidine, tels que définis précédemment, utiles pour inhiber l'expression du gène svn1.
Par " vecteur " au sens de la présente invention on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme de simple brin ou double brin.
Un vecteur recombinant selon l'invention est indifféremment un vecteur de clonage, un vecteur d'expression, ou plus spécifiquement un vecteur d'insertion, un vecteur de transformation, ou un vecteur d'intégration.
Il peut s'agir d'un vecteur d'origine bactérienne ou virale.
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Selon un premier mode de réalisation, un vecteur recombinant selon l'invention est utilisé afin d'amplifier l'acide nucléique qui y est inséré après transformation ou transfection de l'hôte cellulaire désiré.
Selon un second mode de réalisation, il s'agit de vecteurs d'expression comprenant, outre un acide nucléique conforme à l'invention, des séquences régulatrices permettant d'en diriger la transcription et/ou la traduction.
Selon un mode de réalisation avantageux, un vecteur recombinant selon l'invention comprendra notamment les éléments suivants : (1) des éléments de régulation de l'expression de l'acide nucléique de svn1 à insérer, tels que des promoteurs et des séquences activatrices (" enhancers ") ; (2) la séquence comprise dans l'acide nucléique de svn1 conforme à l'invention à insérer dans un tel vecteur, ladite séquence étant placée sous le contrôle des signaux de régulation décrits en (1) ; et (3) des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriées.
En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention pourront inclure une ou plusieurs origines de réplication chez les hôtes cellulaires dans lesquels leur amplification ou leur expression est recherchée et des marqueurs de sélection.
Dans un mode de réalisation particulier, un vecteur recombinant selon l'invention comprend un polynucléotide antisens ou un polynucléotide homopurine ou homopyrimidine, tels que définis précédemment, le cas échéant placé sous le contrôle des séquences de régulation appropriées permettant d'en assurer l'expression dans une cellule hôte ou une plante choisie. Un tel vecteur recombinant est utilisé pour inhiber l'expression du gène snv1 dans la cellule ou dans la plante.
Selon un autre mode de réalisation particulier, un vecteur recombinant selon l'invention comprend un polynucléotide codant pour le polypeptide SVN1 ou un polypeptide ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec ce dernier et conservent l'activité biologique de SVN1, placé sous le contrôle de séquences de régulation permettant une expression à haut niveau de SVN1 ou de son homologue dans une cellule hôte ou dans une plante choisie. Un tel vecteur recombinant est utile pour permettre un haut niveau d'expression de svn1 chez une plante. Selon un aspect avantageux,
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un tel vecteur recombinant est un vecteur intégratif permettant l'insertion de multiples copies de la séquence codante de svn1 dans le génome d'une plante.
A titre d'exemple, les promoteurs bactériens pourront être les promoteurs Lacl, LacZ, les promoteurs de l'ARN polymérase du bactériophage T3 ou T7, les promoteurs PR, ou PL du phage lambda.
Des promoteurs pour l'expression d'un acide nucléique de svn1 selon l'invention dans les plantes sont le promoteur CaMV 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (McElroy et al., 1991) ou encore le promoteur du gène de l'actine 1 du riz (McElroy et al., 1990). D'autres promoteurs utiles pour l'expression d'un polynucléotide d'intérêt dans les plantes sont décrits dans les brevets US 5,750,866 et US 5,633,363, incorporés ici par référence.
De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al.
(1989) ou encore aux techniques décrites par Fuller et al. (1996).
Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR322 (ATCC37017) encore des vecteurs tels que pAA223- 3 (Pharmacia, Uppsala, Suède), et pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Wl, ETATS-UNIS).
On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60, pQE9 (Qiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG (Stratagene).
Il peut s'agir également de vecteurs de type baculovirus tel que le vecteur pVL1392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATCC N CRL 1711) dérivées de Spodoptera frugiperda.
Préférentiellement, on aura recours à des vecteurs spécialement adaptés pour l'expression de séquences d'intérêt dans des cellules de plantes, tels que les vecteurs suivants : - vecteur pBIN19 (Bevan et al., Nucleic Acids Research, 12 : 8711-8721, commercialisé par la Société CLONTECH, Palo Alto, Californie, USA) ; - vecteur 101 (Jefferson, 1987, Plant Molecular Biology Reporter, 5 : 387- 405, commercialisé par la Société CLONTECH) ;
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- vecteur pBI121 (Jefferson, 1987, Plant Molecular Biology Reporter, 5 : 387- 405, commercialisé par la Société CLONTECH) ; - vecteur pEGFP (Cormack, B. P. et al., 1996, Yang T. T. et al., 1996 ; commercialisé par la Société CLONTECH) ; - le vecteur pCAMBIA 1302, représenté à la Figure 6 et décrit à l'Exemple 2.
Un vecteur préféré selon l'invention est le vecteur p At SVN1 C dans lequel la séquence de l'ADNc complet svn1 est insérée, ce vecteur étant hébergé par la souche de E. coli déposée à la Collection Nationale de Microorganismes (CNCM) le 21 juillet 1999 sous le numéro d'accès I-2258.
Pour permettre l'expression des polynucléotides selon l'invention, ces derniers doivent être introduits dans une cellule hôte. L'introduction des polynucléotides selon l'invention dans une cellule hôte peut être réalisée in vitro, selon les techniques bien connues de l'homme du métier pour transformer ou transfecter des cellules, soit en culture primaire, soit sous la forme de lignées cellulaires.
L'invention a en outre pour objet une cellule hôte transformée avec un acide nucléique de snv1 ou par un vecteur recombinant selon l'invention.
Une telle cellule hôte transformée est préférentiellement d'origine bactérienne, fongique ou végétale.
Ainsi, peuvent être notamment utilisées des cellules bactériennes de différentes souches de E. coli ou encore d'Agrobacterium tumefaciens.
De manière préférée, la cellule hôte transformée est une cellule de plante ou encore un protoplaste de plante.
De manière tout à fait préférée, il s'agit d'une cellule ou d'un protoplaste de colza, de tabac, de maïs ou d'A. thaliana.
Une cellule hôte transformée préférée selon l'invention est la souche de E. coli contenant le plasmide p At SVN1 C dans lequel est inséré l'ADNc complet de svn1, la souche ayant été déposée le 21 juillet 1999 auprès de le Collection Nationale de Microorganismes (CNCM) sous le numéro d'accès 1- 2258.
L'invention concerne aussi un organisme multicellulaire végétal transformé, caractérisé en ce qu'il comprend une cellule hôte transformée ou une pluralité de cellules hôtes transformées avec un acide nucléique de svn1 ou avec un vecteur recombinant selon l'invention.
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Selon un premier aspect, l'organisme multicellulaire végétal est transformé avec un ou plusieurs polynucléotides antisens et/ou un ou plusieurs polynucléotides homopurine ou homopyrimidine afin d'inhiber ou de bloquer l'expression de svn1 chez cet organisme.
Selon un second aspect, l'organisme multicellulaire végétal est transformé avec une ou plusieurs copies d'un polynucléotide codant pour la protéine SVN1 ou pour un polypeptide ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec le polypeptide SVN1.
L'invention a encore pour objet une plante transgénique comprenant, sous une forme intégrée dans son génome, un acide nucléique de svn1, et préférentiellement un polynucléotide antisens ou un polynucléotide homopurine ou homopyrimidine ou encore un acide nucléique codant pour le polypeptide SVN1 ou un polypeptide homologue, ledit acide nucléique ayant été inséré dans le génome de la plante par transformation avec un acide nucléique de svn1 ou un vecteur recombinant selon l'invention.
Préférentiellement, une plante transgénique selon l'invention est un colza, un tabac, un maïs ou A. thaliana.
Selon un premier aspect, des plantes transgéniques telles que définies ci-dessus présentent une expression réduite, une expression indétectable ou une absence d'expression du gène svn1 et sont ainsi susceptibles de présenter une résistance accrue à des pathogènes de type biotrophe.
Selon un second aspect, les plantes transgéniques telles que définies ci-dessus ont la propriété d'exprimer fortement le polypeptide SVN1 et de posséder en conséquence un phénotype de " mort cellulaire spontanée " et de résistance accrue à divers pathogènes de végétaux, préférentiellement à des pathogènes dits " incompatibles " avec le végétal dans lequel svn1 a été inséré et est exprimé, et de manière tout à fait préférée à des pathogènes de type nécrotrophe. Outre une résistance accrue aux pathogènes de type nécrotrophes, de telles plantes transgéniques possèdent des mécanismes de mort cellulaire programmée inhibés, de nature à retarder la sénéscence de certains tissus observée naturellement à certains stades du développement naturel d'une plante. Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, le demandeur s'attend à ce qu'un fort niveau d'expression de svn1 obtenu par surexpression du gène ou par l'insertion de
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multiples copies du gène dans une plante, soit de nature à retarder significativement les processus normaux de sénescence des feuilles, en particulier au moment de la formation des graines, et à favoriser ainsi le rendement , notamment chez les plantes céréalières, et de manière générale chez l'ensemble des plantes d'intérêt agronomique pour lesquelles les graines représentent des produits industriellement exploités.
L'invention a en outre pour objet un procédé d'obtention d'une plante transgénique transformée avec un acide nucléique de svn1 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Obtention d'une cellule hôte végétale transformée telle que définie ci-dessus ; b) régénération d'une plante entière à partir de la cellule hôte végétale transformée obtenue à l'étape a) ; c) sélection des plantes obtenues à l'étape b) ayant intégré l'acide nucléique de svn1 d'intérêt.
L'invention est également relative à un procédé pour l'obtention d'une plante transgénique, transformée avec un acide nucléique de svn1 selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) transformer une cellule de plante avec un acide nucléique de svn1 selon ou avec un vecteur recombinant selon l'invention ; b) régénérer une plante entière à partir de cellules de plantes transformées obtenues à l'étape a) ; c) sélectionner les plantes ayant intégré l'acide nucléique de svn1 d'intérêt.
L'un quelconque des procédés d'obtention d'une plante transgénique ci-dessus décrits peut en outre comporter les étapes additionnelles suivantes : d) croisement entre elles de deux plantes transgénique telles qu'obtenues à l'étape c) ; e) sélection des plantes homozygotes pour le transgène.
Selon une alternative, l'un quelconque des procédés ci-dessus décrits pourra en outre comprendre les étapes suivantes : d) croisement d'une plante transgénique obtenue à l'étape c) avec une plante de la même espèce ;
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e) sélection des plantes issues du croisement de l'étape d) ayant conservé le transgène.
L'homme du métier est capable de mettre en #uvre de nombreux procédés de l'état de la technique afin d'obtenir des plantes transformées avec un acide nucléique de svn1 selon l'invention.
L'homme du métier pourra se référer avantageusement à la technique décrite par Bechtold et al. (1993) afin de transformer une plante à l'aide de la bactérie Agrobacterium tumefaciens. Des techniques utilisant d'autres types de vecteurs peuvent également être utilisées, telles que les techniques décrites par Bouchez et al. (1993) ou encore par Horsch et al. (1984).
L'invention a en outre pour objet une plante transgénique telle qu'obtenue selon l'un quelconque des procédés d'obtention décrits cidessus.
L'invention concerne également une semence de plante dont les cellules constitutives comprennent un acide nucléique de svn1 selon l'invention qui a été artificiellement inséré dans leur génome.
L'invention a encore pour objet une semence d'une plante transgénique telle que définie ci-avant.
Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation d'un acide nucléique de svn1 selon l'invention pour l'expression in vitro ou in vivo, de préférence in planta, de la protéine SVN1 ou d'un fragment peptidique de celle-ci.
De manière préférée, l'utilisation ci-dessus est caractérisée en ce qu'il s'agit d'une expression in vivo chez une plante transformée avec un tel acide nucléique.
Comme déjà mentionné précédemment, le gène svn1 code pour un polypeptide de 644 acides aminés de longueur. Le polypeptide SNV1 possède un poids moléculaire de 72,8 kDa et un point isoélectrique calculé de 5,6, tels que calculés par le logiciel ProtParam tool du Swiis Institute of Bioinformatics (SIB) ou encore le logiciel ExPASy (Appel et al., 1994)
Les calculs de prédiction de structure montrent la présence d'un domaine transmembranaire du côté de l'extrémité C-terminale, entre les acides aminés 554 et 571, comme indiqué à la Figure 2.
La protéine SVN1 ne semble pas posséder de peptide signal ni de séquences d'adressage de structure connue.
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La recherche de domaines par homologie à l'aide du logiciel ProDom (Corpet et al., 1999) a permis d'identifier plusieurs domaines conservés (figure 5). Le domaine A, localisé entre les acides aminés 114 et 219, possède 42 % d'identité avec celui d'une protéine de Saccharomyces cerevisiae appartenant à une famille de protéines potentiellement membranaires ce degré d'identité étant de 48,5 % entre les acides aminés 128 à 193. Le domaine B, localisé entre les acides aminés 322 et 461, possède 23% d'identité avec celui d'une protéine de Caenorhabditis elegans. En outre, les deux protéines possèdent à la fois un domaine potentiellement membranaire, ainsi qu'une région C-terminale ayant potentiellement la structure d'une hélice a.
Selon un autre aspect, l'invention concerne également un polypeptide codé par un acide nucléique de svn1, et de préférence à un polypeptide comprenant au moins 5 acides aminés consécutifs de le protéine SVN1.
De préférence, un tel polypeptide comprendra au moins 10,15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80,90, 100,150, 200,250, 300,350, 400,450, 500, 550 ou 600 acides aminés consécutifs du polypeptide SVN1 de séquence en acides aminés SEQ ID N 5.
Fait également partie de l'invention un polypeptide comprenant 10, 15, 20,25, 30,40, 50,60, 70, 80,90, 100, 150, 200,250, 300, 350, 400, 450,500, 550 ou 600 acides aminés consécutifs du polypeptide SVN1 de séquence en acides aminés SEQ ID N 5.
L'invention est également relative à un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence du polypeptide SVN1 SEQ ID N 5, ou un fragment peptidique de ce dernier.
Avantageusement, fait partie de l'invention un polypeptide ayant au moins 85%, 90%, 95% ou 99% d'identité en acides aminés avec la séquence du polypeptide SVN1 SEQ ID N 5, ou un fragment peptidique de ce dernier.
De manière générale, les polypeptides selon la présente invention se présentent sous une forme isolée ou purifiée.
L'invention est également relative à un procédé pour la production du polypeptide SVN1 de séquence SEQ ID N 5, ou d'un fragment peptidique ou d'un variant de ce dernier, ladite méthode comprenant les étapes de :
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a) insérer un acide nucléique codant pour ledit polypeptide SVN1, ou pour un fragment peptidique de ce dernier, dans un vecteur approprié ; b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfecter avec le vecteur recombinant de l'étape a) ; c) récupérer le milieu de culture conditionné ou lyser la cellule hôte, par exemple par sonication ou par choc osmotique ; d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir des lysats cellulaires obtenus à l'étape c), ledit polypeptide ; e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.
Les peptides selon l'invention peuvent être caractérisés par fixation sur une colonne de chromatographie d'immunoaffinité sur laquelle les anticorps dirigés contre ce polypeptide ou contre un fragment ou un variant de ce dernier ont été préalablement immobilisés.
Selon un autre aspect, un polypeptide recombinant selon l'invention peut être purifié par passage sur une série appropriée de colonnes de chromatographie, selon les méthodes connues de l'homme de l'art et décrites par exemple dans F.Ausubel et al (1989).
Un polypeptide selon l'invention peut être également préparé par les techniques classiques de synthèse chimique indifféremment en solution homogène ou phase solide.
A titre illustratif, un polypeptide selon l'invention pourra être préparé par la technique ou en solution homogène décrite par Houben Weyl (1974) ou encore la technique de synthèse en phase solide décrite par Merrifield (1965a; 1965b).
Font également partie de l'invention des polypeptides dits " homologues " à la protéine SVN1, ou de ses fragments ou variants.
De tels polypeptides homologues ont des séquences d'acides aminés possédant une ou plusieurs substitutions d'un acide aminé par un acide aminé équivalent, par rapport aux polypeptides de référence.
On entendra par acide aminé équivalent selon la présente invention, par exemple remplacement d'un résidu sous la forme L par un résidu sous la forme D ou encore le remplacement d'un acide glutamique (E) par un acide pyro-glutamique selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
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A titre illustratif, la synthèse de peptide contenant au moins un résidu sous la forme D est décrite par Koch (1977).
Selon un autre aspect, sont également considérés comme des acides aminés équivalents deux acides aminés appartenant à la même classe, c'est-à-dire deux acides aminés acide, basique, non polaire ou encore polaire non chargé.
Font également partis de l'invention des polypeptides comprenant au moins une liaison non peptidique telle qu'une liaison rétro-inverso (NHCO), une liaison carba (CH2CH2) ou encore une liaison cétométhylène (CO-CH2).
De préférence, les polypeptides selon l'invention comprenant une ou plusieurs additions, délétions, substitutions d'au moins un acide aminé conserveront leur capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides non modifiés, et comprenant de manière tout à fait préférée de 1,2, 3,4, 5,10 à 20 substitutions, additions ou substitutions d'un acide aminé, par rapport à la séquence d'acides aminés codé par un acide nucléique selon l'invention, et particulièrement la séquence SEQ ID N 5.
De manière préférée, les polypeptides selon l'invention comprenant une ou plusieurs additions, délétions et/ou substitutions d'au moins un acide aminé par rapport à la séquence d'acides aminés de la protéine SVN1, ou d'un fragment peptidique de cette dernière, conserveront leur capacité à moduler les mécanismes de mort cellulaire programmée chez une plante et, de manière tout à fait préférée, leur capacité à moduler la résistance de la plante à l'infection par divers pathogènes.
Un polypeptide dérivé de la protéine SVN1, tel que défini ci-dessus est utile notamment pour la préparation d'anticorps destinés à la détection de la présence du polypeptide SVN1 ou d'un fragment peptidique de ce dernier dans un échantillon.
Outre la détection de la présence de la protéine SVN1 ou d'un fragment peptidique de cette dernière dans un échantillon, des anticorps dirigés contre la protéine SVN1 sont utilisés pour quantifier la synthèse de SVN1, par exemple dans cellules d'une plante, et déterminer ainsi la capacité de cette plante à réguler les mécanismes de mort cellulaire programmée, et à déterminer plus particulièrement la capacité de la plante à résister à divers pathogènes de végétaux, préférentiellement des pathogènes dits " incompatibles " avec la plante considérée.
Par " anticorps " au sens de la présente invention, on entendra notamment des anticorps polyclonaux ou monoclonaux ou des fragments (par exemple les fragments F (ab)'2, Fab) ou encore tout polypeptide
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comprenant un domaine de l'anticorps initial reconnaissant le polypeptide ou le fragment de polypeptide cible selon l'invention .
Des anticorps monoclonaux peuvent être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par Kohler et Milstein (1975).
La présente invention concerne également des anticorps dirigés contre un polypeptide tel que décrit ci-dessus ou un fragment ou un variant de ce dernier, tels que produits dans la technique du trioma ou encore la technique d'hybridome décrite par Kozbor et al. (1983).
L'invention a également trait à des fragments d'anticorps simple chaîne Fv (ScFv) tels que décrits dans le brevet US N 4,946,778 ou encore par Martineau et al. (1998).
Les anticorps selon l'invention comprennent également des fragments d'anticorps obtenus à l'aide de banques de phages Ridder et al., (1995) ou encore des anticorps humanisés Reinmann et al. (1997) ; Leger et al., (1997).
Les préparations d'anticorps selon l'invention sont utiles dans des tests de détection immunologiques destinés à l'identification de la présence et/ou de la quantité de la protéine SVN1, ou d'un fragment peptidique de celle-ci, présents dans un échantillon.
Un anticorps selon l'invention pourra comprendre en outre un marqueur détectable isotopique ou non-isotopique, par exemple fluorescent ou encore être couplé à une molécule telle que la biotine, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Ainsi, la mention a en outre pour objet un procédé pour détecter la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de : a) mettre en contact l'échantillon à tester avec un anticorps tel que décrit ci-dessus ; b) détecter le complexe antigène/anticorps formé.
L'invention est également relative à un nécessaire ou kit de diagnostic ou pour la détection de la présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) un anticorps tel que défini ci-dessus ; b) un réactif permettant la détection des complexes antigène/anticorps formés.
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La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, aux figures et aux exemples ci-après.
La Figure 1 illustre une comparaison du phénotype mutant de svn1 par rapport au phénotype sauvage.
Les clichés A, C, D et E correspondent à des plants d'A. thaliana portants un gène svn1 muté par insertion de l'ADN-T dans l'intron 8. Le cliché B correspond à l'écotype sauvage Ws-0.
Les plantes sont cultivées en conditions permissives (clichés C, D et E) ou en conditions non permissives (clichés A et B).
Les lésions sont observées 16 jours (C) ou 20 jours (D) après transplantation sur les feuilles matures, et se propagent suivant la nervure centrale (E) jusqu'à entraîner la mort de la feuille.
La Figure 2 illustre la caractérisation des lésions chez une plante mutée dans le gène svn1 par coloration au bleu Evans et par visualisation de l'autofluorescence.
Clichés A, B, C, D et E : coloration au bleu Evans de feuilles du mutant en conditions permissive (B, C, D et E) ou non permissives (A). Ce colorant révèle les tissus en cours de mort cellulaire. Les feuilles représentées sur les clichés C, D et E sont prélevées 20 jours après transplantation, à différents niveaux de la rosette.
Clichés F, G et H :observation au microscope optique du mutant en conditions permissives (F et G) et non permissives (H), en lumière normale (F) et en fluorescence (G et H). Les conditions d'exposition à la lumière sont les suivantes : longueur d'onde d'excitation (Ex) =460 nm, longueur d'émission (Em) =500 nm.
La coloration au bleu Evans, comme l'autofluorescence, coïncident avec la présence de lésions.
La Figure 3 illustre la structure du gène svn1 de A. thaliana. Les petites boites grisées représentent les 18 exons du gène svn1. Les grandes boîtes grisées représentent respectivement une portion d'un gène codant pour une protéine de type p Zip localisé du côté 5' du gène svn1 et une portion d'un gène codant pour une protéine de liaison au GTP apparentée à
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l'oncogène Ras, localisé du côté 3' du gène snv1. La position de l'insertion de l'ADN-T de PGKB5, dans l'intron 8 du gène svn1 est représentée par la boîte située sur la ligne inférieure.
La Figure 4 illustre la structure du polypeptide SVN1. Les différentes boîtes contiguës représentent les différents domaines de la protéine, en particulier les domaines 1 et 2 possédant une homologie de séquence respectivement avec une protéine de S. cerevisiae et une protéine de C.
Elegans.
La Figure 5 illustre la comparaison entre la protéine codée par l'ADNc de svn1 et une protéine codée par le génome de Caenorhabditis elegans, de fonction inconnue. La ligne supérieure représente le shéma de la protéine SNV1 et la ligne inférieure le shéma de la protéine de C. elegans.
La Figure 6 illustre la construction du vecteur recombinant pCAMBIA 1302 utilisé pour cloner l'ADNc du gène svn1. Le vecteur pCAMBIA 1302est un plasmide de 10549 paires de bases comprenant deux gènes marqueurs de sélection : un gène de résistance à l'hygromycine et un gène de résistance à la kanamycine. Ce plasmide comprend aussi le gène lacZI, un gène rapporteur codant pour une protéine fluoescente, la GFP (" Green Fluorescent Protein "), et les deux bordures (droite et gauche) de l'ADN-T.
Le clonage de l'ADNc de svn1 dans le vecteur pCAMBIA 1302 a consisté à : - déléter le gène de la GFP par une doucle digestion à l'aide respectivement des enzymes de restriction Ncol et Bst EII ; - puis à insérer l'ADNc, obtenu par RT-PCR à l'aide des amorces de séquences SEQ ID N 6 et 7, à la place du gène de la GFP entre le promoteur CaMV35S et le terminateur (Nos poly-A) du gène de la GFP.
La Figure 7 illustre la vérification par PCR des clones recombinants possédant l'ADNc de svn1.
Pistes 2 à 7 : 6clones positifs contenant le plasmide intégratif avec l'ADNc de svn1 pour la complémentation du mutant.
Piste 8 : PCR négatif correspondant à une colonie contenant le plasmide intégratif sans insert.
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Piste 9 : Témoin PCR positif constitué de l'ADNc de svn1.
Pistes 10 et 10 : de taille de polynucléotides.
La Figure 8 illustre la caractérisation du phénotype pathologique de svn 1.
Le mutant svn1 en conditions permissives (A, en bas à gauche) et l'écotype sauvage Ws-0 (A, en bas à droite) développent une HR en réponse à une inoculation par X.c.c.147.
Le mutant en conditions permissives (A, en haut à gauche) présente des lésions ressemblant à la maladie développée par l'écotype Sf-2 (A, en haut à droite) en réponse à la souche de X c. c. 147.
Le cliché B montre une comparaison des symptômes observés sur svn1 en conditions permisives (à gauche) et non permissives (à droite), en réponse à la souche X. c. c. 147.
La Figure 9 illustre la mesure de la croissance bactérienne in planta en réponse à la souche X. c. c. 147 dans les écotypes Ws-0 (résistant) et Sf- 2 (sensibles) et dans le mutant svn1, soit en condition non permissive (Fig.
9-A), soit en condition permissive (Fig. 9-B)
En condition non permissive, les plantes mutées dans le gène svn1 ont une capacité plus grande à restreindre la croissance de Xanthomonas campestris que l'écotype sauvage WS-0.
En condition permissive, les plantes mutées dans le gène svn1 sont sucseptibles à l'infection par Xanthomonas campestris, cette susceptibilité accrue pouvant résulter à la fois de l'infection bactérienne et de la propagation rapide des lésions.
La Figure 10 illustre l'expression du gène svn1 lors d'une interaction incompatible (A) et compatible (B). A gauche, inoculation avec de l'eau distillée ; à droite, inoculation avec la souche X. c. c. 147.
Le gène svn1 est exprimé au bout de 8 heures au cours d'une interaction incompatible (A) et au bout de 24 heures au cours d'une interaction compatible (B). Les plantes inoculées avec de l'eau n'expriment pas le gène svn1.
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EXEMPLES MATERIEL ET METHODES 1) Souches bactériennes utilisées.
Le tableau 1 représente les différentes souches bactériennes utilisées au cours de ce travail. Les souches de Xanthomonas et de Pseudomonas sont cultivées à 28 C sur milieu Kado (Kado and Heskett, 1970) et King B (King étal., 1954), respectivement.
2) Matériel végétal.
Le mutant svn1 provient d'un criblage de la banque de mutant d'Arabidopsis produite à Versailles. Cette banque a été réalisée par insertion d'un vecteur binaire pGKB5 (Bouchez et al., 1993) chez Arabidopsis thaliana écotype Wassilewskija (Ws-0). Pour la caractérisation pathologique du mutant, les écotypes Ws-0 et Sf-2 (San Feliu stock CS1516, décrite dans le catalogue Internet du Arabidopsis Biological Resource Center), développant, respectivement, une interaction incompatible et compatible avec la souche X.c.c. 147 sont aussi utilisés.
3) Conditions de culture des plantes.
Des graines d'Arabidopsis sont stérilisées à l'hypochlorite de sodium (13%, 20 mn) puis rincées cinq fois avec de l'eau. Les graines sont mises à germer pendant cinq jours, sur milieu MS (Murashige and Skoog, 1962), à 20 c en jours longs (16 heures de lumière par cycle de 24 heures, 250 E m-2 s-1).
Puis les plantules sont transférées sur tourbe (jiffy) et placées en jours courts (22 C, 9 heures de lumière).
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4) Mesure de la croissance bactérienne in planta et inoculation Des cultures liquides sont préparées à partir de colonies étalées sur boite 2 à 3 jours auparavant. Ces cultures sont lavées deux fois, et resuspendues dans de l'eau stérile. La densité optique à 600 nm est ajustée de façon à ce que l'inoculum ait une concentration finale de 108 cfu ml-1 . Les plantes à inoculer sont maintenues en atmosphère humide propice à l'ouverture des stomates. La solution bactérienne est infiltrée dans la plante au moyen d'une seringue (Lummerzheim et al., 1993). Les plantes sont gardées en atmosphère humide pendant deux jours puis les bacs sont progressivement ouverts pour permettre l'établissement de lésions sèches.
Les feuilles sont prélevées (25 ) à différents temps, puis broyées avec de l'eau stérile.
*Différentes dilutions sont étalées sur milieu gélosé contenant les antibiotiques appropriés (Kado spectinomycine 50 pour X.c.c 147). Les bactéries sont comptées après deux à trois jours d'incubation à 28 C.
5) Histochimie et microscopie -Coloration : Des feuilles prélevées à différents stades sont colorées au bleu Evans par infiltration sous vide (7 mn) et décolorées dans de l'eau sur la nuit.
-Observation de l'autofluorescence : Les feuilles sont décolorées selon (Yu et al., 1993) sans fixation puis observées au microscope à fluorescence (Zeiss) à travers le filtre FITC (Ex=460 nm, Em>500 nm).
6) Criblage de la banque d'ADN génomique La banque d'ADN génomique CD4-11 (Schultz et al., 1994) obtenue à partir de l'écotype Ws-0 a été criblée. Cette banque cosmidique contient en moyenne l'équivalent de dix génomes. Chaque chapitre est titré puis étalé sur milieu gélosé (LB Kanamycine 50) à raison de 50000 bactéries pour le premier criblage et 15000 pour le second. Les colonies sont transférées sur membrane (voir protocole Hybond TM-c extra, Amersham), et les filtres sont hybridés avec la sonde ADNc, obtenue par RT-PCR à l'aide des amorces de séquences respectives SEQ ID N 8 et 9, comme décrit au paragraphe 8 ciaprès.
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7) Extraction des ARNs et Northern blot a) extraction des ARN Les ARN de plante ont été extraits par la méthode AGPC (Acid Guanidium Thiocyanate-Pnénol-Chloroform Extraction) (Chomczynski and Sacchi, 1987) modifiée dans le laboratoire. Cette méthode permet d'extraire plus rapidement les ARN avec un bon rendement. Les échantillons végétaux sont broyés dans l'azote liquide. La solution de dénaturation est rajoutée (750 l) à la poudre ainsi que l'acétate de sodium, (pH 4), 2 M (1/10 du volume). Un volume de phénol acide saturé en eau et 1/10 de volume de chloroformealcool isoamylique (49 : 1) sont egalement ajoutés au mélange. Les tubes sont vortexés pendant 10 secondes et laissés reposer 15 minutes dans la glace. La phase aqueuse est récupérée après 15 min de centrifugation à 4 C et à 10000g. Deux extractions au phenol-chloroforme (1/1) sont réalisées suivant l'état des phases aqueuses. Les ARN sont précipités dans un volume d'isopropanol à -20 C pendant 30 minutes, puis centrifugés à 10000g pendant 10 minutes à 4 C. Le culot est lavé deux fois à l'éthanol 80% puis est repris dans de l'eau DEPC (0,1%).
Après extraction, les échantillons sont dosés trois fois (260nm) et vérifiés par migration sur gel d'agarose (0,8%). b) Dénaturation et migration des ARN La dénaturation des ARN (15 g) se fait en présence de glyoxal (4% V/V), DMSO (14% V/V)et de tampon phosphate de sodium (pH 6,8, 14,3 mM) pendant 1 heure à 50 C. Les échantillons sont chargés sur un gel d'agarose 1,2%. Le tampon de migration utilisé ici est un tampon phosphate de sodium 10 mM. c) Transfert des ARN sur membrane Les ARN sont transférés sur la nuit dans du 20xSSC selon la procédure décrite par (Sambrook et al., 1989), sur membrane Hybond-N+, (Amersham). Les ARN sont fixés sur la membrane par exposition aux UV (1400 Joules, UV linker de stratagène). Le transfert est vérifié par visualisation des membranes de nitrocellulose sous lumière UV (260 nm). d) Hybridation et révélation La préhybridation et l'hybridation des membranes sont réalisées selon le protocole Amersham à 65 C. Les différentes sondes utilisées sont marquées au 32P par marquage aléatoire (Kit Ready To Go, Amersham).
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Après hybridation sur la nuit les membranes sont lavées deux fois 20 mn à 40 C dans du 2xSSC 0,1% SDS, puis deux fois 30 min à 55 C dans du 0,1xSSC 0,1%SDS. Les membranes sont mises en contact avec des autoradiogrammes et laissés à -80 C.
8) RT-PCR L'ARN (20 g) et les oligodT sont dénaturés à 70 C pendant 10 min. Le tampon, les oligonucléotides (amorces de séquences respectives SEQ ID N 8 et 9), le dithithreitol et la reverse transcriptase (Superscript II, GibcoBRL) sont rajoutées. Les mélanges sont incubés 50 mn à 42 C puis 15 mn à 70 C pour dénaturation de l'enzyme. Les ADNc obtenus ont servi à la production de la sonde ADNc et de l'ADNc pleine taille de SVN1.
La sonde est obtenue en utilisant des amorces spécifiques et un programme PCR comprenant un cycle [94 C / 2 min], 5 cycles [94 C I 1 min, 60 C / 1 min, 72 C I 1 min 30 ], 30 cycles [94 C / 20 s, 60 C / 30 s, 72 C I min 30] et un cycle [72 C / 3 min].
Pour obtenir l'ADNc complet, le kit Expand long PCR de Boehringer a été choisi pour la grande fidélité de sa polymérase. Les amorces choisies à partir des prédictions de structure du gène SVN1, ont permis l'amplification de l'ADN complémentaire et des régions 3' non traduites. Il s'agit des amorces de séquences respectives SEQ ID N 6 et 7. Le programme PCR utilisé pour l'amplification de ce fragment de 2,1 kb est composé de plusieurs cycles où la durée d'amplification à 68 C est progressivement augmentée de 20 secondes. La température d'hybridation descend progressivement de 58 C à 53 C.
9) Clonage de l'ADNc.
Le plasmide pCAMBIA 1302 (cambia@cambia.org.au) est digéré par Ncol et Bst EII. Le plasmide est récupéré par précipitation dans une solution de 1 xSTE, 1 volume d'acétate d'ammonium 4 M et 2 volumes d'éthanol. Les extrémités cohésives du plasmide sont remplies en utilisant la T4 DNA polymérase ainsi que la Kleenow (sequencing grade, Boehringer). Les deux enzymes sont inactivées à 65 C pendant 10 min.
La ligation s'effectue avec la T4 DNA ligase à 14 C pendant 12 heures. Les rapports insert/vecteur (en molécules) testés sont trois fois, dix fois et
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cinquante fois. Des cellules compétentes (Sambrook et al., 1989) sont transformées (Sambrook et al., 1989) avec les produits de ligation. Les colonies sont sélectionnées par résistance à la kanamycine (50) puis par PCR, en utilisant les amorces utilisées pour l'obtention de la sonde de 1,3 kb (voir plus haut). Le vecteur pCAMBIA 1302 est représenté sur le Figure 6.
Exemple 1 : Caractérisation phénotypique de svn1.
Le mutant svn1 a été isolé pour son phénotype mort cellulaire spontanée (fig. 1). Ce phénotype a été trouvé conditionnel, initié par des lumières de fortes intensités (146 E m-2 s-1) douze jours après transplantation. Les plantes cultivées sous de faibles intensités (69 E m-2 s-1) (protégées par un treillis à mailles resserrées) ressemblent au sauvage (Arabidopsis thaliana écotype Ws-0) (fig.1 A, B).
Le phénotype apparaît seize jours après transplantation et se traduit par la présence de tissus bruns le long de la nervure centrale, d'abord localisés au niveau du pétiole puis s'étendant vers l'apex de la feuille (fig.1 E). Ces lésions se propagent dans le limbe en suivant les nervures centrale et secondaires jusqu'à entraîner la mort de la feuille. Le mutant svn1 présente également des modifications morphologiques de la rosette et une légère altération de la croissance. Les feuilles sont plus courtes et possèdent un pétiole moins développé voire quasiment inexistant. Ceci réduit le diamètre de la rosette et lui donne un aspect plus dense et touffu (fig.1 C, D).
L'apparition des lésions dépend du stade de développement de la feuille.
Elles apparaissent uniquement sur les feuilles âgées à la base de la rosette (fig.1 C), épargnant les feuilles du centre de la rosette qui, continuant de se développer, initient à leur tour des lésions.
Des feuilles du mutant en condition permissive sont colorées au bleu Evans.
Ce colorant permet de localiser les zones en cours de mort cellulaire. Les tissus colorés (fig.2 B, C, D, E) correspondent aux lésions observées avant coloration. Aucune coloration n'est retrouvée dans le sauvage ainsi que dans le mutant en condition non permissive (fig.2 A). La mort cellulaire est bien initiée autour du rachis et se propage dans la feuille suivant les nervures (fig.2 C, D, E). Afin de déterminer la nature de cette mort, les feuilles présentant des lésions sont observées au microscope à fluorescence. Il a
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été montré que les tissus d'Arabidopsis thaliana présentant une HR sont modifiés et deviennent fluorescents en réponse à des souches avirulentes fongiques (Schroder et al., 1992) et bactériennes (Yu et al., 1993). Cette autofluorescence n'est pas observée sur des tissus sains ou sur des feuilles sénescentes (Yu et al., 1993). Elle est le résultat de la polymérisation de composés phénoliques permettant le renforcement des parois suite à une agression (Schroder et al., 1992). Les cellules localisées dans les lésions fluorescent délimitant parfaitement les tissus nécrosés des tissus sains (fig. 2 F, G). Le mutant en condition non permissive ainsi que le sauvage ne présentent aucune fluorescence des tissus parenchymateux foliaires (fig.2 H).
Ces résultats montrent que svn1 est un mutant conditionnel, dont le phénotype morphologique et 'mort cellulaire spontanée' est initié par des lumières de fortes intensités (146 E m-2 s-1) et dépend du stade de développement de la plante et de la feuille. Les lésions correspondent à des zones de mort cellulaire programmée s'apparentant peut être à celles observées lors de la HR. svn1 appartient à la catégorie des mutants de propagation.
Exemple 2 : Caractérisation moléculaire de svn1 1) Clonage du gène SVN1 et obtention de l'ADN complémentaire.
Afin de disposer du gène SVN1 et de son promoteur, une banque d'ADN génomique de l'écotype Ws-0 est criblée. Les chapitres de cette banque sont hybridés avec différentes sondes suite à l'isolement d'un grand nombre de faux positifs. Une dizaine de clones a été isolée après le troisième criblage des 30 derniers chapitres et seront prochainement séquences.
L'ADN complémentaire (2,1 kb) est obtenu par RT-PCR. Il comprend la région traduite ainsi qu'une partie de la région 3' non traduite. Son séquençage a permis de déterminer la structure exacte du gène (fig.3). SVN1 long de 4,09 kb comprend 18 exons et 17 introns. L'ADN-T s'est inséré au début du huitième intron causant une délétion de 56 paires de base .
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2) Etude de la protéine
L'ADNc code pour une protéine de 644 acides aminés (72,8 kDa), de point isoélectrique 5,6. Les prédictions de structure montrent la présence d'un domaine transmembranaire près de l'extrémité C-terminale, entre les acides aminés 554 et 571 (fig.4). De plus la protéine ne semble pas posséder de peptide signal ni de séquences d'adressage particulières. La recherche de domaine par homologie (ProDom) a permis d'isoler deux domaines conservés mais de fonctions inconnues (fig. 4). Le domaine 1, localisé entre les acides aminés 114 et 219, possède 42% d'identité avec celui d'une protéine de Saccharomyces cerevisiae appartenant à une famille de protéines supposées membranaires. Le domaine 2, entre les acides aminés 322 et 461, partage 23% d'identité avec celui d'une protéine de Caenorhabditis elegans. (fig.5).
3) Clonage de l'ADNc dans un plasmide intégratif.
En vue de la complémentation du mutant ainsi que de l'étude de la fonction du gène grâce à la génération de plantes sens et antisens, l'ADN complémentaire est cloné dans le plasmide intégratif pCAMBIA 1302 (Fig.
6). Plusieurs clones ont été obtenus (fig.7) et seront séquences afin de vérifier l'orientation du clonage.
Exemple 3 : Caractérisation du phénotype pathologique.
1) Réponse à des souches bactériennes virulentes et avirulentes
La réponse à différentes souches virulentes et avirulentes de svn1 en conditions permissive et non permissive a été observée.
Les souches utilisées sont représentées sur le Tableau 3 ci-après.
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Tableau 3 : Souches bactériennes utilisées
Figure img00440001
<tb>
<tb> Souche <SEP> Caractéristiques <SEP> Référence
<tb> Souches <SEP> utilisées <SEP> en
<tb> pathologie
<tb> Xanthomonas <SEP> campestris <SEP> Avirulente <SEP> sur <SEP> l'écotype <SEP> Ws- <SEP> Lummerzheim <SEP> et <SEP> al <SEP> . <SEP>
<tb> p.v; <SEP> campestris <SEP> 147 <SEP> 0, <SEP> virulente <SEP> sur <SEP> Sf-2.1993
<tb> (X.c.c. <SEP> 147) <SEP> Résistante <SEP> à <SEP> la
<tb> spectinomycine <SEP> (50 <SEP> g/ml)
<tb> Xanthomonas <SEP> campestris <SEP> Virulente <SEP> sur <SEP> les <SEP> écotypes <SEP> Turner, <SEP> 1984
<tb> p.v. <SEP> campestris <SEP> 8004 <SEP> Ws-0 <SEP> et <SEP> Sf-2. <SEP>
<tb>
(X.c.c. <SEP> 8004) <SEP> Résistante <SEP> à <SEP> la
<tb> spectinomycine <SEP> (50 <SEP> g/ml)
<tb> Pseudomonas <SEP> syringae <SEP> Virulente <SEP> sur <SEP> WS-0 <SEP> Staskawicz, <SEP> 1987
<tb> p.v. <SEP> tomato <SEP> DC <SEP> 3000 <SEP> Résitante <SEP> à <SEP> la <SEP> rifampicine
<tb> (100 <SEP> g/ml)
<tb> Pseudomonas <SEP> syringae <SEP> P.s.t. <SEP> DC <SEP> 3000 <SEP> contenant <SEP> le <SEP> Ritter, <SEP> 1996
<tb> p.v. <SEP> tomato <SEP> DC <SEP> 3000 <SEP> gène <SEP> d'avirulence <SEP> avrRpm1
<tb> avrRpm1 <SEP> Avirulente <SEP> sur <SEP> Ws-0
<tb> Résitante <SEP> à <SEP> la <SEP> rifampicine
<tb> (100 <SEP> g/ml)
<tb> Souches <SEP> utilisées <SEP> en
<tb> biologie <SEP> moléculaire
<tb> PCAMBIA <SEP> 1302 <SEP> E. <SEP> coli <SEP> possédant <SEP> le
<tb> plasmide <SEP> intégratif
<tb> pCAMBIA <SEP> 1302 <SEP> résistant <SEP> à
<tb> la <SEP> kanamycine <SEP> (50 <SEP> g/ml)
<tb> PC1302 <SEP> : <SEP> svn1 <SEP> cDNA <SEP> E. <SEP> coli <SEP> DH5[alpha] <SEP> contenant <SEP> le
<tb> plasmide <SEP> pCAMBIA <SEP> 1302
<tb> possédant <SEP> l'ADNc <SEP> de <SEP> svn1
<tb> resistant <SEP> à <SEP> la <SEP> kanamycine
<tb> (50 <SEP> g/ml)
<tb>
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Le sauvage (A. thaliana Ws-0) développe en réponse à l'infection par des souches avirulentes comme P.s.t.DC3000 avrRpm1 etX.c.c. 147 (tableau 3) une réaction d'hypersensibilité. Les zones d'inoculation présentent une mort cellulaire rapide, contrairement au reste de la feuille qui apparaît sain (fig.8). Par contre, en réponse à des bactéries virulentes, P.s.t. DC3000 et X.c.c 8004 (tableau 3), les écotypes Ws-0 et Sf-2 (Sf-2 est sensible aux souches avirulentes précédemment citées) développent la maladie. Elle se différentie de la HR par la présence de chlorose qui, partant de la zone d'inoculation, s'étend à toute la feuille jusqu'à ce que mort s'en suive (fig 8 A). Le mutant en condition non permissive se comporte comme le sauvage (fig.8 A). Il présente une HR en réponse aux souches avirulentes (P.s.t.DC3000 avrRpm1 et X.c.c. 147) et la maladie suite à l'inoculation des souches virulentes (P.s.t. DC3000, X.c.c 8004).
Par contre, le mutant en condition permissive inoculé avec les souches avirulentes ne forme pas de HR mais présente une réaction ressemblant à la maladie (fig. 8 A, B). Les résultats présentés sur la figure 8 correspondent à des données obtenues par cinq expériences d'inoculation indépendantes sur des mutants pris à différents stades de développement (avec ou sans lésions visibles).Les plantes témoins inoculées avec de l'eau ne présentent aucune réaction, montrant que le phénotype observé est du aux bactéries et que svn1 est insensible au stress mécanique.
Celui-ci s'explique soit par une sensibilité accrue du mutant à la souche avirulente, soit par une accélération du développement des lésions entraînant une chlorose généralisée du tissu foliaire.
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2) Etude de la croissance bactérienne chez les plantes sauvages et chez les plantes mutantes.
Afin d'expliquer le phénotype de svn1, la croissance bactérienne dans la plante est mesurée (fig. 9) pour la souche X.c.c. 147, soit en condition non permissive (fig. 9-A), soit en condition permissive (fig. 9-B).
En condition non permissive, les résultats de croissance bactérienne la figure 9-A montrent que la mutation dans le gène svn1 confère aux plantes mutantes un phénotype de résistance accrue au pathogène avirulent Xanthomonas campestris, par rapport à l'écotype sauvage WS-0. Il peut être observé une diminution drastique de la croissance bactérienne dans les plantes mutantes svn1 dès le deuxième jour après l'inoculation, alors que cette diminution n'est observée qu'au bout de quatre jours dans l'écotype sauvage WS-0.
En condition permissive, l'écotype Sf-2, sensible à cette souche, développe la maladie caractérisée par une croissance bactérienne exponentielle atteignant une densité maximum (plateau de la courbe de la figure 9-B) lorsque toute la feuille est colonisée. L'écotype Ws-0, qui est résistant, présente une forte croissance bactérienne rapidement stoppée (entre le deuxième et le quatrième jour) par la HR qui restreint le pathogène à la zone d'inoculation (Lummerzheim et al., 1993). Au bout de 4 jours, la courbe de croissance s'effondre traduisant l'arrêt de la colonisation. Le mutant svn1 en condition permissive montre une susceptibilité accrue au pathogène qui peut résulter à la fois de l'infection bactérienne et de la propagation rapide des lésions (fig. 9-B). Par conséquent, la présence de bactéries avirulentes déclenche l'évolution rapide de lésions sur le mutant en condition permissive.
Exemple 4 : Profil d'expression du gène svn1 et étude de son induction par X.c.c. 147 au cours d'une interaction compatible et d'une interaction non compatible.
L'expression de SVN1 a été observé (northern) au cours de l'interaction compatible (Sf-2 / X. c. c. 147) et incompatible (Ws-0 / X. c. c.
147) (fig.10). Le gène s'exprime précocement (8 heures) au cours d'une interaction incompatible et plus tardivement pour une interaction compatible
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(24 heures). Aucune expression n'est observée dans les plantes inoculées avec de l'eau confirmant que les résultats sont bien dus à la présence des bactéries SVN1 apparaît être un gène s'exprimant spécifiquement en réponse à un pathogène, mais différemment selon la nature de l'interaction.
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LISTE DE SEQUENCES <110> Institut National de la Recherche Agronomique (INR <110> Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) <120> Acides nucléiques codant pour la protéine SVN1;
Application à la modulation des mécanismes de mort cellulaire programmée, notamment la réponse hypersensible (HR), chez les plantes <130> Gene SVN1 - INRA <140> <141> <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 4916 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 ttatgtccaa gtttctcatt tatttttaag ctctcattac gttggtatca tgtaaatttg 60 aggattgatt aaattgagtc ttgtggtttt gtgaggactc acaatctttc tcatttaata 120 catgagcaga cacggcacct aactaatggc ccaaaggtgg cccgccaaat tgaatacaag 180 ggtaagaaat gggccaagaa agtgagagcc caaaagaggc cgatcgttcg tttttgactc 240 aatggccgtt gacgttgaca tcgtacgccg cacccaacga ccgccaaaca gcaaacaaca 300 acactttccc ctttctctct ctaaacatgg cgatgctttc tactgcttcc gtttcgggga 360 gcgtcgacct tcctcgagga accatgaagg ttgactcgtc tgcgtctccg gaggtcgtat 420 ccgatctccc accatcttcc ccaaagggct cacctgatcg ccatgaccct tccacttctt 480 ctccgagccc cagtcgtggt ggtgacaatc aggtatctga tgaattctct ctgcttcgat 540 ctattcgttt ccttggttta tgacctggat ttcttcttac ttattctcct ctagtctgaa 600 gtcatatcca agagtgaaga gtatcggcaa ttgtttcggc ttccagctga cgaagtaagt 660 attgcctctc tcgtcttgaa attccatcaa tgagagaagt actgactcca ccattgcttc 720 cgaattgtgt agatccttgt tcaagatttt aactgtgctt gtcaggagag tattcttatg 780 caggttaggt acttttatct ttctctcttt gcgaatactt accttatctt ttaatcatct 840 ttactttttg ttgcagggtc atatgtacct cttcatccat tatatctgct tttactccaa 900 catctttggt tatgagacca aggtgccgcc attgttgctc tcctccactc acttttgttt 960 cttccctttt tcctcttcaa tattgatcgg aactctcttt gcagaaaatt atcccatttg 1020 ctgaaatatc ttgtgttaaa cgagccaaga ctgctggtat ttttcctaat gccattgaga 1080 ttttagctgg agggaagaag gtaccactag ttccctcttt actcgatatt ggttggtgcg 1140 tctgtcctga tctttgaacc gcattctctc ccagtacttt tttgcatcgt ttctttcccg 1200 cgatgaagct ttcaagctta tccatgatgg atggttggaa tatggtagtg ctgtcaaatc 1260 agaaggcgag attctggtga ccgaaccgca ggtgggtgca acacacactc ttattttact 1320 gcttaatcct tgtttcctta tctgagtcca aaatccaggt aagcgatgga gttgttaaaa 1380 gggcacgcag ttccatggat ttggccaatg aactagatat tccagtaagg tgcgtttatc 1440 tcttccatat ggtgttccat ctttctgttt cttactgctt tatcgctcac tatacttcct 1500 tctcagggat gaaactcttc atctttccag cagttccagt cttcctgtca ttagtcagaa 1560 tggcgttcca ccttcatccg ttcagcggca cgctgaacca gatgtagatg ttgtggcggc 1620 caatactttc aactggaagc ctgaagatac agatgcacct aaatgtagtt aaactccttc 1680 ctcgctttta ccttagttct ttttggttgg tttgggtagt gtggtagatt atctttttca 1740 agtcaactgt ttaaggatgt gaatgctagt gttttcagta aattcaacgg gttttttttt 1800 ttttgctggg gtcaggtcaa cctgttggta aagagtatta aaaatgcaga cgcttgggtt 1860 tctcctaact cctttaaagt tcctttaaag tggacaatca gttaacttct tactgtttct 1920 aggtatatgt cattatgtgt ctatctttta gcttgttttc tttgcaatat aaattgtttg 1980 aaatttaaat ggtcaatggg aaacggtctc ttaatggttt tgctaaataa ggcctatcag 2040 gatggggtag cttagcttta tgatcttgtc ttttggtgct acttcacaag ttgcactagt 2100
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tctcagtttg tcccaacgag cttgcactca gtatggagat cctatattac tgaaccggtt 2160 atttcgtttt tgcatacatg atctctcatc tatttctttt ggttatcgtg atctcttttc 2220 ttgttctcat ttgtattcac cacacaaatt tgtgttcctt gcacgcagtg tcatctgact 2280 ttacaaaggt agcagaggca aagttttcgg taatgtctcg ttctttgtct tatcagctag 2340 aggaaattat ggaaccattc tcattcaaat ttatgagaat ataagcattg actggatgca 2400 gaagtttcat atacctaaat agactttagt ttatatttgc agattccagt agaagagttc 2460 tttagattgt ttttttcaga tggtgctgtc agttttgttg aatctttcca taaaaattgt 2520 ggagacaaag gtaaagctat aagtgatgga atcattttgc tcctgtgttt agctgttttc 2580 tctctctttc tcggtgttct tttaaccaga agagatattt gtacttgcag agtttaggtg 2640 tacctcttgg caacctcatg aaaagcttgg acacacccgc aatgtctcat ttcaacatcc 2700 gataaaaatt tattttggta atattttttc tttcctatag ataaacagta ctagattacg 2760 gtttatatca aatatatatt tttttggtgt aattatataa aatagattac ggtttatatc 2820 aaatatatgt atgcatgact ctggctttcg tttaaaggtg caaagtttgg tggctgccag 2880 gagtcacaga aatttcggat gtacagaaat aggtacagaa attttgtaat gttttttggt 2940 tttattctat atcgtcaaag caaagctagt ctgaactcat gcatgcttat cctctgttag 3000 ctaatattgt aatttcctat gctagccatc tggttattga aacatcacag gagatcagcg 3060 atgtgcctta tgcagattat tttacggtag aggtagggga aatttacatc aaatgctatc 3120 aatattttgt tgtttgatgt gtgttacatg tgaaaaattt tacctttggc tgatcccagg 3180 gagtctggga cttgaaaaga gattgcagag actcggtaga aggttgtata ttggatgttt 3240 atgtcaatgt ggccttctct aaaagaacag tgtggaaagg tttgttaagc ctaatttact 3300 cttctttatc cttgattttt ttcactcttg cctcctatca atgaagaaat ttcaattaat 3360 agttcaagag tgtttgctgc ggattctcgt tcttatagat ttggaaatct ttcagctttg 3420 ttgaatttga tggttcttga atctggcttg acgtctatga atttttacag ggaaaatagt 3480 gcagtctact ttagaagaat gtagagaagc ttatgcacat tggataagaa tggtacttga 3540 tcaggggcca ttgggtcaac attttttttt ttttagtttc tgcaggaatt taaacaagtt 3600 tatatatatt tttcttcatt attatctttg gaggcacatg aactgttgaa gcagaagaag 3660 ctggagaacc aagaaggtta gtgttgtaga ctgatgatta acagaagctt ttccccgaag 3720 aaagctggct gacaccatat tctacaggga ataagttgat tgaggatggt gaaccgctag 3780 cagcaaggga agaaagagta tctgaatgtg acgaggaggg gaaggtggaa atggtgggcg 3840 aaggggtagt taaaaaaagc ttaaaggaag catgggtgaa tctgacttca tttgtgaaga 3900 ggcaaagcgg gacaaggcag gttatagtat tagcgtttgc agtaatctta ctgatgcagg 3960 tatgtgtatt ttggataaat tggtagtgaa agagagagag agggagatag agaaaaaaaa 4020 aagctaacaa taggtggaag tgtggacagg tgacgatagt ggtgctactg aaaaaaggag 4080 gaggggggca agtggagtat catgagaggt acgacgagta cagtgtaaac ggggagactt 4140 tggggtggtt agagaagaga atgcatttcc tgagggaaga gatgatgatg gttgaggatc 4200 gtttgcagag gatgcgacaa gaccatgccg ccttgaaggc tcagttccac catttggaac 4260 gcctcctccg ccgcaacaaa cagtaaattt gctacaccct actctctgtt tgtgcagaat 4320 gcggatggat atatgcatgt atgtatgtaa tgtattatcg gacgttactt tgcaaagttg 4380 ttgttatacc tacctactca tatgaatatg agcagagact ctgttaaacg aaatgatgta 4440 atcaattgta ttcgtgttgc acctgtatca aagattaaat tcacactggt gactccactt 4500 tctcgctatt ggattctctc aatgtctcaa tcaaacaaac aaaagttgat tctaatttaa 4560 attcccgaga cgattatctt tgttttcaat gatgatcacg tttgatatag gaaaaaacaa 4620 tttgtgggtt ttaaatcgag tcgtagaaca ttgttatgca aagaaaccca tagaaaacca 4680 ctaaaggcag aaatgaaaaa caagaatgtt ggaaagatga ggacctcatc atgaggtaaa 4740 gcaaatagga aacgtgaaaa acagaataat aaccaaccaa aggagcttaa ttacagacaa 4800 gacagatttg gggggatgtt gtgtaaaaac caagtagtag tgaattggag cctagtcaaa 4860 agaaggaaca cgtgttctaa gattggaaag gatattgcta ggctggtcac gtcaat 4916 <210> 2 <211> 2155 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 atgggccaag aaagtgagag cccaaaagag gccgatcgtt cgtttttgac tcaatggccg 60 ttgacgttga catcgtacgc cgcacccaac gaccgccaaa cagcaaacaa caacactttc 120 ccctttctct ctctaaacat ggcgatgctt tctactgctt ccgtttcggg gagcgtcgac 180 cttcctcgag gaaccatgaa ggttgactcg tctgcgtctc cggaggtcgt atccgatctc 240 ccaccatctt ccccagaggg ctcacctgat cgccatgacc cttccacttc ttctccgagc 300
<Desc/Clms Page number 55>
cccagtcgtg gtggtgacaa tcagtctgaa gtcatatcca agagtgaaga gtatcggcaa 360 ttgtttcggc ttccagctga cgaaatcctt gttcaagatt ttaactgtgc ttgtcaggag 420 agtattctta tgcagggtca tatgtacctc ttcatccatt atatctgctt ttactccaac 480 atctttggtt atgagaccaa gaaaattatc ccatttgctg aaatatcttg tgttaaacga 540 gccaagactg ctggtatttt tcctaatgcc attgagattt tagctggagg gaagaagtac 600 ttttttgcat cgtttctttc ccgcgatgaa gctttcaagc ttatccatga tggatggttg 660 gaatatggta gtgctgtcaa atcagaaggc gagattctgg tgaccgaacc gcaggtaagc 720 gatggagttg ttaaaagggc acgcagttcc atggatttgg ccaatgaact agatattcca 780 gtaagggatg aaactcttca tctttccagc agttccagtc ttcctgtcat tagtcagaat 840 ggcgttccac cttcatccgt tcagcggcac gctgaaccag atgtagatgt tgtggcggcc 900 aatacttcca actggaagcc tgaagataca gatgcaccta aattgtcatc tgactttaca 960 aaggtagcag aggcaaagtt ttcgattcca gtagaagagt tctttagatt gtttttttca 1020 gatggtgctg tcagttttgt tgaatctttc cataaaaatt gtggagacaa agagtttagg 1080 tgtacctctt ggcaacctca tgaaaagctt ggacacaccc gcaatgtctc atttcaacat 1140 ccgataaaaa tttattttgg tgcaaagttt ggtggctgcc aggagtcaca gaaatttcgg 1200 atgtacagaa atagccatct ggttattgaa acatcacagg agatcagcga tgtgccttat 1260 gcagattatt ttacggtaga gggagtctgg gacttgaaaa gagattgcag agactcggta 1320 gaaggttgta tattggatgt ttatgtcaat gtggccttct ctaaaagaac agtgtggaaa 1380 gggaaaatag tgcagtctac tttagaagaa tgtagagaag cttatgcaca ttggataaga 1440 atggcacatg aactgttgaa gcagaagaag ctggagaacc aagaagggaa taagttgatt 1500 gaggatggtg aaccgctagc agcaagggaa gaaagagtat ctgaatgtga cgaggagggg 1560 aaggtggaaa tggtgggcga aggggtagtt aaaaaaagct taaaggaagc atgggtgaat 1620 ctgacttcat ttgtgaagag gcaaagcggg acaaggcagg ttatagtatt agcgtttgca 1680 gtaattttac tgatgcaggt gacgatagtg gtgctactga aaaaaggagg aggggggcaa 1740 gtggagtatc atgagaggta cgacgagtac agtgtaaacg gggagacttt ggggtggtta 1800 gagaagagaa tgcatttcct gagggaagag atgatgatgg ttgaggatcg tttgcagagg 1860 atgcgacaag accatgccgc cttgaaggct cagttccacc atttggaacg cctcctccgc 1920 cgcaacaaac agtaaatttg ctacacccta ctctctgttt gtgcagaatg cggatggata 1980 tatgcatgta tgtatgtaat gtattatcgg acgttacttt gcaaagttgt tgttatacct 2040 acctactcat atgaatatga gcagagactc tgttaaacga aatgatgtaa tcaattgtat 2100 tcgtgttgca cctgtatcaa agattaaatt cacactggtg actccacttt ctcgc 2155 <210> 3 <211> 188 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana <400> 3 ttatgtccaa gtttctcatt tatttttaag ctctcattac gttggtatca tgtaaatttg 60 aggattgatt aaattgagtc ttgtggtttt gtgaggactc acaatctttc tcatttaata 120 catgagcaga cacggcacct aactaatggc ccaaaggtgg cccgccaaat tgaatacaag 180 ggtaagaa 188 <210> 4 <211> 630 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana <400> 4 atttgctaca ccctactctc tgtttgtgca gaatgcggat ggatatatgc atgtatgtat 60 gtaatgtatt atcggacgtt actttgcaaa gttgttgtta tacctaccta ctcatatgaa 120 tatgagcaga gactctgtta aacgaaatga tgtaatcaat tgtattcgtg ttgcacctgt 180 atcaaagatt aaattcacac tggtgactcc actttctcgc tattggattc tctcaatgtc 240 tcaatcaaac aaacaaaagt tgattctaat ttaaattccc gagacgatta tctttgtttt 300 caatgatgat cacgtttgat ataggaaaaa acaatttgtg ggttttaaat cgagtcgtag 360 aacattgtta tgcaaagaaa cccatagaaa accactaaag gcagaaatga aaaacaagaa 420 tgttggaaag atgaggacct catcatgagg taaagcaaat aggaaacgtg aaaaacagaa 480 taataaccaa ccaaaggagc ttaattacag acaagacaga tttgggggga tgttgtgtaa 540
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aaaccaagta gtagtgaatt ggagcctagt caaaagaagg aacacgtgtt ctaagattgg 600 aaaggatatt gctaggctgg tcacgtcaat 630 <210> 5 <211> 644 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 5 Met Gly Gin Glu Ser Glu Ser Pro Lys Glu Ala Asp Arg Ser Phe Leu
1 5 10 15 Thr Gin Trp Pro Leu Thr Leu Thr Ser Tyr Ala Ala Pro Asn Asp Arg
20 25 30 Gin Thr Ala Asn Asn Asn Thr Phe Pro Phe Leu Ser Leu Asn Met Ala
35 40 45 Met Leu Ser Thr Ala Ser Val Ser Gly Ser Val Asp Leu Pro Arg Gly
50 55 60 Thr Met Lys Val Asp Ser Ser Ala Ser Pro Glu Val Val Ser Asp Leu
65 70 75 80 Pro Pro Ser Ser Pro Glu Gly Ser Pro Asp Arg His Asp Pro Ser Thr
85 90 95 Ser Ser Pro Ser Pro Ser Arg Gly Gly Asp Asn Gin Ser Glu Val Ile
100 105 110 Ser Lys Ser Glu Glu Tyr Arg Gin Leu Phe Arg Leu Pro Ala Asp Glu
115 120 125 Ile Leu Val Gin Asp Phe Asn Cys Ala Cys Gin Glu Ser Ile Leu Met
130 135 140 Gin Gly His Met Tyr Leu Phe Ile His Tyr Ile Cys Phe Tyr Ser Asn 145 150 155 160 Ile Phe Gly Tyr Glu Thr Lys Lys Ile Ile Pro Phe Ala Glu Ile Ser
165 170 175 Cys Val Lys Arg Ala Lys Thr Ala Gly Ile Phe Pro Asn Ala Ile Glu
180 185 190 Ile Leu Ala Gly Gly Lys Lys Tyr Phe Phe Ala Ser Phe Leu Ser Arg
195 200 205 Asp Glu Ala Phe Lys Leu Ile His Asp Gly Trp Leu Glu Tyr Gly Ser
210 215 220 Ala Val Lys Ser Glu Gly Glu Ile Leu Val Thr Glu Pro Gin Val Ser 225 230 235 240 Asp Gly Val Val Lys Arg Ala Arg Ser Ser Met Asp Leu Ala Asn Glu
245 250 255 Leu Asp Ile Pro Val Arg Asp Glu Thr Leu His Leu Ser Ser Ser Ser 1) CI 265 270
<Desc/Clms Page number 57>
Ser Leu Pro Val Ile Ser Gin Asn Gly Val Pro Pro Ser Ser Val Gin
275 280 285 Arg His Ala Glu Pro Asp Val Asp Val Val Ala Ala Asn Thr Ser Asn
290 295 300 Trp Lys Pro Glu Asp Thr Asp Ala Pro Lys Leu Ser Ser Asp Phe Thr 305 310 315 320 Lys Val Ala Glu Ala Lys Phe Ser Ile Pro Val Glu Glu Phe Phe Arg
325 330 335 Leu Phe Phe Ser Asp Gly Ala Val Ser Phe Val Glu Ser Phe His Lys
340 345 350 Asn Cys Gly Asp Lys Glu Phe Arg Cys Thr Ser Trp Gin Pro His Glu
355 360 365 Lys Leu Gly His Thr Arg Asn Val Ser Phe Gin His Pro Ile Lys Ile
370 375 380 Tyr Phe Gly Ala Lys Phe Gly Gly Cys Gin Glu Ser Gin Lys Phe Arg 385 390 395 400 Met Tyr Arg Asn Ser His Leu Val Ile Glu Thr Ser Gin Glu Ile Ser
405 410 415 Asp Val Pro Tyr Ala Asp Tyr Phe Thr Val Glu Gly Val Trp Asp Leu
420 425 430 Lys Arg Asp Cys Arg Asp Ser Val Glu Gly Cys Ile Leu Asp Val Tyr
435 440 445 Val Asn Val Ala Phe Ser Lys Arg Thr Val Trp Lys Gly Lys Ile Val
450 455 460 Gin Ser Thr Leu Glu Glu Cys Arg Glu Ala Tyr Ala His Trp Ile Arg 465 470 475 480 Met Ala His Glu Leu Leu Lys Gin Lys Lys Leu Glu Asn Gin Glu Gly
485 490 495 Asn Lys Leu Ile Glu Asp Gly Glu Pro Leu Ala Ala Arg Glu Glu Arg
500 505 510 Val Ser Glu Cys Asp Glu Glu Gly Lys Val Glu Met Val Gly Glu Gly
515 520 525 Val Val Lys Lys Ser Leu Lys Glu Ala Trp Val Asn Leu Thr Ser Phe
530 535 540 Val Lys Arg Gin Ser Gly Thr Arg Gin Val Ile Val Leu Ala Phe Ala
545 550 555 560 Val Ile Leu Leu Met Gin Val Thr Ile Val Val Leu Leu Lys Lys Gly
565 570 575 Gly Gly Gly Gin Val Glu Tyr His Glu Arg Tyr Asp Glu Tyr Ser Val
580 585 590
<Desc/Clms Page number 58>
Asn Gly Glu Thr Leu Gly Trp Leu Glu Lys Arg Met His Phe Leu Arg
595 600 605 Glu Glu Met Met Met Val Glu Asp Arg Leu Gin Arg Met Arg Gin Asp
610 615 620 His Ala Ala Leu Lys Ala Gin Phe His His Leu Glu Arg Leu Leu Arg 625 630 635 640 Arg Asn Lys Gln <210> 6 <211> 25 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana <400> 6 atgggccaag aaagtgagag cccaa 25 <210> 7 <211> 25 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana <400> 7 gagtctctgc tcatattcat atgag 25 <210> 8 <211> 21 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana <400> 8 tgatggatgg tgggaatatg g 21 <210> 9 <211> 24 <212> ADN <213> Arabidopsis thaliana <400> 9 gcatcagtaa gattactgca aacg 24

Claims (41)

REVENDICATIONS
1. Acide nucléique codant pour un polypeptide comprenant au moins 5 acides aminés consécutifs de la protéine SVN1 de séquence en acides aminés SEQ ID N 5 ou d'un polypeptide ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la protéine SVN1, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
2. Acide nucléique selon la revendication 1 comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe des séquences nucléotidiques SEQ ID N 1 à 4 ou d'un polynucléotide ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec au moins l'une desdites séquences nucléotidiques, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
3. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N 1, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
4. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N 2, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
5. Acide nucléique selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la séquence 5'-UTR SEQ ID N 3.
6. Acide nucléique selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend en outre la séquence 3'-UTR SEQ ID N 4.
7. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il a une longueur d'au moins 20, 25, 30, 35,40, 50, 75, 100,150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000,3000 ou 4000 nucléotides.
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8. Sonde ou amorce nucléotidique utiles pour la détection ou l'amplification d'une séquence du gène, de l'ARNm ou de l'ADNc codant pour la protéine SVN1, choisie dans le groupe constitué des séquences suivantes : a) les séquences nucléotidiques hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 7 ; b) les séquences nucléotidiques comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 7.
9. Amorce nucléotidique selon la revendication 8, comprenant une séquence choisie dans le groupe des séquences SEQ ID N 6 à 9.
10. Polynucléotide, choisi parmi les polynucléotides antisens et les polynucléotides homopurine ou homopyrimidine, capable d'hybrider, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4.
11. Vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.
12. Vecteur recombinant selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les vecteurs de clonage, les vecteurs d'expression et les vecteurs de transformation et les vecteurs d'intégration.
13. Vecteur recombinant selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur d'origine bactérienne ou virale.
14. Vecteur selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur p At SVN1 C hébergé par la souche de E. coli déposée
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à la Collection Nationale de Microorganismes (CNCM) le 21 juillet 1999 sous le numéro d'accès I-2258.
15. Cellule hôte transformée avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 7 ou un vecteur recombinant selon l'une des revendications 11 à 14.
16. Cellule hôte transformée selon la revendication 15, choisie dans le groupe comprenant les cellules hôtes d'origine bactérienne, fongique ou végétale.
17. Cellule hôte transformée selon l'une des revendications 15 ou 16, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de plante ou d'un protoplaste de plante.
18. Cellule hôte selon l'une des revendications 15 et 16, caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche de E. coli contenant le plasmide p At SVN1 C dans lequel est inséré l'ADNc complet de svn1, la souche ayant été déposée le 21 juillet 1999 auprès de le Collection Nationale de Microorganismes (CNCM) sous le numéro d'accès I-2258.
19. Organisme multicellulaire végétal transformé avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 7 ou par un vecteur recombinant selon l'une des revendications 11 à 14.
20. Organisme multicellulaire végétal comprenant au moins une cellule hôte transformée selon l'une des revendications 15 à 17.
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21. Plante transgénique, dont une partie ou la totalité des cellules sont transformées avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 7 ou avec un vecteur selon l'une des revendication 11 à 14.
22. Procédé pour l'obtention d'une plante transgénique comprenant au moins les étapes suivantes : a) Obtention d'une cellule hôte végétale transformée selon l'une des revendications 15 à 17; b) régénération d'une plante entière à partir de la cellule hôte végétale transformée obtenue à l'étape a) ; c) sélection des plantes obtenues à l'étape b) ayant intégré l'acide nucléique de svn1 d'intérêt.
23 Procédé d'obtention d'une plante transgénique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) transformer une cellule de plante avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 7 ou avec un vecteur recombinant selon l'une des revendications 11 à 14 : b) régénérer une plante entière à partir de cellules de plantes transformées obtenues à l'étape a) ; c) sélectionner les plantes ayant intégré l'acide nucléique de svn1 d'intérêt
24. Procédé d'obtention d'une plante transformée selon l'une des revendications 22 et 23, caractérisé en ce qu'il comporte en outre les étapes de: d) croisement entre elles de deux plantes transgénique telles qu'obtenues à l'étape c) ; e) sélection des plantes homozygotes pour le transgène.
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25. Procédé d'obtention d'une plante transformée selon l'une des revendications 22 et 23, caractérisé en ce qu'il comporte en outre les étapes de: d) croisement d'une plante transgénique obtenue à l'étape c) avec une plante de la même espèce ; e) sélection des plantes issues du croisement de l'étape d) ayant conservé le transgène.
26. Plante transgénique, telle qu'obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 22 à 25.
27. Semence de plante dont les cellules constitutives comprennent un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 7 qui a été artificiellement inséré dans leur génome.
28. Semence d'une plante transgénique selon l'une des revendication 21 et 26.
29. Utilisation d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 6 pour l'expression in vitro ou in vivo de la protéine SVN1.
30. Utilisation selon la revendication 29, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une expression in vivo chez une plante transformée avec un tel acide nucléique.
31. Utilisation d'un polynucléotide selon la revendication 10, ou d'un vecteur recombinant comprenant un polynucléotide selon la revendication 10, pour inhiber ou pour bloquer l'expression du gène svn1 dans une cellule de plante ou dans une plante entière.
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32. Procédé de détection d'un acide nucléique constitutif du gène svn1 dans un échantillon, comprenant les étapes de : a) mettre en contact une sonde ou une pluralité de sondes selon la revendication 8 avec l'acide nucléique susceptible d'être contenu dans l'échantillon ; b) détecter l'hybride éventuellement formé entre l'acide nucléique de l'échantillon et la ou les sondes.
33. kit ou nécessaire de détection d'un acide nucléique constitutif du gène svn1 dans un échantillon, comprenant : a) une sonde ou une pluralité de sondes selon la revendication 8; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à le réaction d'hybridation.
34 Procédé pour amplifier un acide constitutif du gène svn1 dans un échantillon, comprenant les étapes de : a) mettre en contact un couple d'amorces selon l'une des revendications 8 ou 9 avec l'acide nucléique susceptible d'être contenu dans l'échantillon ; b) réaliser au moins un cycle d'amplification de l'acide nucléique contenu dans l'échantillon ; c) détecter l'acide nucléique éventuellement amplifié.
35 Kit ou nécessaire pour l'amplification d' un acide constitutif du gène svn1 dans un échantillon, comprenant : a) un couple d'amorces selon l'une des revendications 8 ou 9, b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réalisation de la réaction d'amplification.
<Desc/Clms Page number 65>
36. Polypeptide codé par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 6.
37. Polypeptide selon la revendication 36 comprenant une séquence d'acides aminés SEQ ID N 5 ou un polypeptide ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N 5.
38. Polypeptide comprenant des modifications d'acides aminés de 1, 2,3, 4, 5, 10 à 20 substitutions, additions ou délétions d'un acide aminé par rapport à la séquence d'acides aminés d'un polypeptide selon la revendication 36 ou 37.
39. Anticorps dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 36 à 38.
40. Procédé pour détecter la présence d'un polypeptide selon l'une des revendications 36 à 38 dans un échantillon, comprenant les étapes de : a) mise en contact de l'échantillon avec un anticorps selon la revendication 39 ; b) détection du complexe antigène/anticorps formé.
41. Nécessaire de diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide selon l'une des revendications 36 à 38 dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) un anticorps selon la revendication 39 ; b) le cas échéant, un réactif permettant la détection des complexes anigène/anticorps formés.
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