SK51199A3 - Polypeptides comprising gax protein domains, involved in repressing transcription and/or interacting with other proteins, corresponding nucleic acids and their use - Google Patents

Description

Polypeptidy obsahujúce domény proteínu GAX, ktoré sa zúčastňujú represie transkripcie, zodpovedajúce nukleové kyseliny a ich použitie

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka oblasti liečiv. Konkrétne sa týka nových terapeutických molekúl a ich použitia na liečenie kardiovaskulárnych chorôb.

Doterajší stav techniky

Post-angioplastická restenóza je lokalizovaná hyperproliferatívna porucha, ktorá sa vyvíja po nechirurgickom zásahu na úrovni aterosklerotického plátu. Liečenie aterosklerotických lézií angioplastickou metódou velmi často (až v 50% prípadov v niektorých štúdiách) spôsobuje restenózu ako následok mechanického poškodenia steny artérie.

Proliferácia buniek hladkého svalstva (SMC) v stene cievy je kľúčová udalosť vo vývoji aterosklerózy, restenózy v dôsledku angioplastiky a tiež zlyhanie koronárneho bypassu. SMC sú normálne v cievnej stene v pokojovom stave, ale aj nastane lézia, ktorá zničí cievny endotel, dostanú sa svalové bunky do kontaktu s rastovými faktormi v krvi. Na rozdiel od srdcových svalových buniek a buniek kostrového svalstva sa SMC môžu pod vplyvom rôznych rastových faktorov dediferencovať a tak znovu iniciovať proliferatívny cyklus. Tieto fenotypové modifikácie SMC sú dôsledkom výrazných zmien na úrovni expresie mnohých génov. Napr. expresia skorých génov, zúčastňujúcich sa bunkovej proliferácie, ako sú c-fos alebo c-myc, je výrazne zvýšená, zatiaľ čo expresia iných štruktúrnych génov, ako je napr. alfa2 aktín špecifický pre hladké svalstvo a tiež niektoré izoformy myozinu, podlieha regulácii.

Aj keď je úplne jasne známe, že terminálna diferenciácia buniek kostrového svalstva je regulovaná tzv. myogénnymi transkripčnými faktormi ako je Myo-D, doteraz je známych len veľmi málo faktorov zúčastňujúcich sa reverzibilnej diferenciácie SMC. Najnovšie štúdie odhalili existenciu transkripčných faktorov, ktoré majú homeobox v rôznych tkanivách • kardiovaskulárneho systému. Takého faktory rozpoznávajú práve prostredníctvom homeoboxu špecifické sekvencie v promótorovom úseku ich cieľového génu a podieľajú sa tak na regulácii bunkovej diferenciácie, proliferácie a migrácie. Jeden z týchto faktorov GAX (Growth-Arrest-Specific Homeobox) je exprimovaný v rôznych kardiovaskulárnych tkanivách vrátane SMC cievnej steny. Gén GAX sa pôvodne identifikoval v cDNA knižnici potkanej aorty. Kóduje proteín obsahujúci 303 aminokyselín. Sekvencia bola opísaná a klonovala sa cDNA (Gorski a kol., Mol. Celí. Biol. 1993, 6, 3722-3733). Tiež sa identifikoval, klonoval a sekvenoval ľudský gén (Dávid F. Le Page a kol. Genomics 1994, 535-540) . Kóduje proteín zložený z 302 aminokyselín. Gén GAX má niektoré vlastnosti podobné génom gas a Gadd, pretože sa zdá, že . tiež riadi prechod fázou Go/Gi v bunkovom cykle. Hladina GAX mRNA je v potkaních VMSC znížená lOx po dvojhodinovej expozícii PDGF (Gorski a kol.. Mol. Celí. Biol. 1993, 6, 3722-3733). Takže expresia génu GAX je potlačená v priebehu mitogénnej odpovede.

, VSMC. Ďalšou vlastnosťou génu GAX je špecifickosť jeho expresie.

Dospelé potkany majú gén GAX v podstate exprimovaný v kardiovaskulárnom systéme (aorta, srdce). V pečeni, mozgu, žalúdku a kostrovom svalstve sa pomocou northern prenosu nedetegovala žiadna GAX mRNA. Avšak gén GAX patrí do rodiny homeotických génov. Tieto gény kódujú transkripčné faktory, ktoré obsahujú konsenzus (súhlasné) sekvencie (čiže homeodomény), ktoré rozpoznávajú špecifické úseky DNA (čiže homeoboxy) (pozri prehľad Gehring a kol., Celí 78, 21-223,

1994). Homeodoména potkanieho proteínu GAX leží medzi aminokyselinami 185 a 245. Je zaujímavé, že doteraz identifikované homeotické gény sa zúčastňujú riadenia bunkovej rastu diferenciácie v embryogenéze, čo podporuje terapeutický potenciál génu GAX (pozri prehľad Lawrence a Morata, Celí 78: 181-189, 1994, Krumíauf, Celí 78: 191-201, 1994).

Jednou z vlastností GAX je tiež to, že je pod vplyvom negatívnej regulácie, ihneď ako SMC proliferujú a to buď in vitro odpoveď na rastové faktory alebo in vivo ako následok lézií endotelu cievnej steny. Táto represia je reverzibilná, pretože ak SMC sú in vitro v pokojovom stave vďaka nedostatku séra, expresia GAX pokračuje. Posledný výskum v našom laboratóriu ukázal, že nadmerná expresia (overexpression) GAX v SMC navodená adenovírusovým vektorom blokuje ich proliferáciu (FR95/04234 (ST95022)).

Post-angioplastická restenóza po mechanickom poškodení predstavuje najčastejší (50% prípadov v niektorých štúdiách) faktor poškodenia. Pričom proliferácia SMC je klúčovým prvkom v tomto jave a keďže je známa úloha GAX v jeho regulácii, javí sa GAX ako vhodný terapeutický gén na preventívne ošetrenie cievnej steny po angioplastike (FR9595/04234 (ST95022)).

Avšak mechanizmus pôsobenia GAX je dosiaľ málo dokumentovaný. Je potrebné ešte identifikovať cieľové sekvencie DNA homeoboxu GAX. Doteraz tiež neboli uskutočnené štúdie funkcie rôznych domén GAX. Identifikácia funkčných partnerov GAX predstavuje ďalší dôležitý aspekt, ktorý umožní identifikovať molekulovú kaskádu, na ktorej závisí GAX a ktorej je súčasťou.

Dôležitosť predkladaného vynálezu spočíva v tom, že poskytuje informácie práve k týmto bodom.

Počas nášho výskumu sa použili rôzne analytické metódy na identifikáciu molekúl, ktoré reagujú s GAX aby sa mohli identifikovať domény GAX nevyhnutné pre tieto interakcie a by sa mohol skúmať význam týchto domén pre funkciu GAX. Použil sa na to dvojhybridný systém aby sa mohli charakterizovať proteíny s knižnice z ľudských plúc interagujúcimi s GAX.

Tento postup umožnil identifikovať rôzne molekuly, z ktorých jedna a to antigén Ki, je osobitne výhodná. Antigén Ki je proteín s veľkosťou približne 32 kDa. Prvý krát sa identifikoval ako jadrový autoantigén rozpoznávaný sérom, ktoré sa získalo z pacientov trpiacich na lupus erythematosus (Nikaido a kol., 1989, Clin. Exp. Immunol 1990, 79, 209-214). Nedávne výskumy ukázali, že Ki je nadmerne exprimovaný v proliferujúcich bunkách alebo v bunkách transformovaných s onkogénom (Nikaido a kol., Exp. Celí Res. 182, 284-289).

Pokusy s koimunoprecipitáciou (Takeushi a kol., abstract 1995 Juntendo University, Tokyo, Japan) ukázali, že Ki sa vyskytuje vo forme komplexu s PCNA, markerom proliferácie (Almedral a kol., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci USA 84? 15751579).

Funkcia GAX sa tiež skúmala v pokusoch s prechodnou transfekciou cicavčích buniek pomocou génu GAX fúzovaného s heterologickou DNA väzbovou doménou a reportérovým systémom, čo umožnilo získať informácie o transkripčnej aktivite GAX po delécii rôznych úsekov molekuly. Ukázali sme tak, že GAX pôsobí v podstate ako represor transkripcie. Táto represorová aktivita je spojená osobitne s prvými 32 aminokyselinami GAX. Ďalej sme zistili, že represorová doména je lokalizovaná v úseku GAX (1 až 222), ktorý v kvasinkách vyžaduje interakciu s KI. Možnosti využitia represorového charakteru GAX a jeho interakcie s Ki budú podrobnejšie opísané ďalej.

Podstata vynálezu

Prvý aspekt predkladaného vynálezu sa týka fragmentov proteínu GAX, ktoré majú biologické vlastnosti.

Ďalší aspekt vynálezu sa týka domén GAX, ktoré sa podieľajú na biologickej aktivite GAX. To môžu byť osobitne domény zúčastňujúce sa interakcie GAX s inými molekulami alebo domény zodpovedné za biologickú aktivitu.

(represiu) expresie inhibujú interakciu

Vynález sa týka tiež chimérických molekúl obsahujúcich funkčnú doménu GAX. Týka sa tiež použitia GAX na potlačenie génov, a tiež použitie zlúčenín, ktoré GAX s určitými bunkovými partnermi na moduláciu aktivity GAX. Vynález sa tiež týka spôsobu screeningu (vyhľadávania) a/alebo identifikácie bunkových partnerov GAX.

Ako už bolo uvedené skôr, gén GAX má osobitne výhodné vlastnosti na použitie v génovej terapii hyperproliferatívnych porúch, konkrétne restenózy alebo iných porúch spojených s proliferáciou SMC. V patentovej prihláške FR95/04234 (ST95022) sa ukázalo, že prenos génu GAX in vivo umožňuje významne znížiť proliferáciu SMC a tým inhibovať redukciu luminálneho priemeru. V prihláške FR95/12871 (ST95057) sa tiež ukázalo, že gén GAX, exprimovaný v nádorových bunkách, umožňuje blokovať procesy bunkovej transformácie. Tieto rôzne údaje ukazujú na značný potenciál génu GAX na terapeutické využitie.

Prihláška predkladaného vynálezu opisuje identifikáciu funkčných domén GAX, konštrukciu derivátov GAX vykazujúcich biologickú aktivitu, identifikáciu partnerov proteínu GAX a vývoj metód, ktoré umožňujú testovať iných partnerov a identifikovať zlúčeniny schopné interagovať s aktivitou týchto partnerov. Presnejšie povedané, autor ukázal, že proteín GAX prejavuje aktivitu ako represor transkripcie. Tiež ukázal, že aktivita je nesená určitými úsekmi proteínu GAX, konkrétne potom N-koncovým úsekom. Okrem toho výsledky uvedené v príkladoch ukazujú, že funkčné domény GAX sa tiež zúčastňujú interakcie GAX s bunkovým proteínom Ki. Je známe z literatúry, že Ki reaguje s PCNA (Takeushi a kol., abstract 1995 Juntendo University, Tokyo, Japan) a že PCNA je nevyhnutný kofaktor pre DNA polymerázu na replikáciu DNA (Fukuda a kol., 1995, J. Biol. Chem. 270: 2252722534) . V príkladoch sa tiež ukázalo, že GAX reaguje s PCNA, takže sa dá predpokladať, že GAX by tiež mohol byť súčasťou replikačného komplexu v bunke.

Prvým predmetom predkladaného vynálezu je polypeptid, ktorý je buď celý GAX alebo čiastočný fragment proteínu GAX, ktorý má transkripčnú represorovú aktivitu a/alebo pozitívne či negatívne ovplyvňuje replikáciu DNA.

Výhodnejší polypeptid podľa predkladaného vynálezu obsahuje minimálne aminokyselinové zvyšky 1 až 32 ľudského proteínu GAX.

Podľa iného uskutočnenia predkladaného vynálezu polypeptid obsahuje aspoň aminokyselinové zvyšky 104 až 230 ludského proteínu GAX.

Ako špecifické príklady polypeptidov podľa predkladaného vynálezu je možné uviesť polypeptidy obsahujúce fragmenty zahrňujúce úseky aminokyselín 1 až 32, 33 až 302 a 1 až 104 ludského proteínu GAX. Príklady uvedené v ďalšej časti ukazujú, že takéto polypeptidy sú schopné inhibovať transkripciu génov a preto zachovávajú transkripčné represorové vlastnosti GAX.

Výhodnejšie obsahuje uvedený polypeptid navyše, okrem fragmentu proteínu GAX podía predkladaného vynálezu, fragment iného pôvodu. Fragmentom iného pôvodu sa chápe polypeptidový fragment, ktorý nepochádza s proteínu GAX. Môže to teda byť tak umelý, syntetický fragment ako aj fragment proteínu a pod. Tento fragment iného pôvodu môže mať rôzne funkcie.

Môže to byť napr. marker, ktorý umožňuje detegovať polypeptid a prípadne ho sledovať in vivo. Takýmto markerom môže

Ί byť napr. epitop rozpoznávaný monoklonálnou protilátkou. V odbornej literatúre sa opísali mnohé značkovacie sekvencie, tzv. tag-sekvencie, ktoré sa zvyčajne používajú. Môže sa uviesť napr. sekvencia tag-myc.

Tento fragment môže byť tiež fragmentom, ktorý má tu vlastnosť, že stabilizuje polypeptid. Vďaka tomu potom celý proteín alebo jeho časť má dlhší plazmatický polčas.

Nakoniec to môže byť aj cielový prvok, ktorý umožňuje, aby polypeptid dosiahol rýchlejšie a/alebo väčšiu špecifickosť požadovaného bunkového kompartmentu. Výhodne to môže byť jadrová lokalizačná sekvencia (NLS), polypeptid vykazujúci svoju aktivitu v bunkovom jadre. V odbornej literatúre sa opísali rôzne signály NLS, napr. signál T antigénu vírusu SV40, signál p53 a pod.

Fragment iného pôvodu môže navyše udelovať polypeptidu ďalšiu biologickú funkciu alebo môže podporovať aktivitu represorovej domény. Ako mimoriadne výhodný príklad je možné uviesť proteínovú doménu schopnú viazať sa na DNA špecifickým spôsobom. Takýto typ chimérických molekúl umožňuje viazať DNA v špecifických úsekoch a inhibovať transkripciu génov lokalizovaných v týchto úsekoch. Ako príklad sa môže uviesť DNA väzbová doména kvasinkového proteínu GAL4. Takáto konštrukcia je opísaná v príkladoch. Tieto konštrukcie sa môžu použiť na reguláciu expresie génov v kvasinkách alebo génov, ktoré sú riadené expresnými signálmi obsahujúcimi väzbové miesto pre proteín GAL4. Iné proteínové domény pre väzbu DNA sú napr. LexA, DNA väzbová doména jadrového receptora ako je napr. estrogénový receptor alebo akýkoľvek iný člen tejto rodiny a pod. Môže to byť tiež peptid, ktorý umožňuje na jednej strane sekréciu celého alebo časti GAX a na druhej strane jeho cielenie na membránový receptor, ktorý umožňuje jeho internalizáciu a tým zvyšuje schopnosť difúzie a aktivitu domén GAX, čo sa nazýva efektom typu nezúčastneného diváka (bystander effect). V tomto zmysle sa môže použiť konkrétne celý transferín alebo jeho časť alebo fragmenty molekúl extracelulárny matrix, ktoré rozpoznávajú integríny na povrchu SMC.

Polypeptidy podlá predkladaného vynálezu sú osobitne dôležité z hľadiska terapeutického využitia a tiež z hladiska aplikovaného výskumu.

Terapeutická aktivita polypeptidov podľa vynálezu je spojená s ich schopnosťou potláčať transkripciu alebo ovplyvňovať replikáciu DNA, analogicky ako proteín GAX, majú preto kapacitu regulovať expresiu iných proteínov.

Vzhľadom na to sa predkladaný vynález týka tiež použitia proteínu GAX alebo jeho fragmentu podľa vynálezu pre represiu génovej transkripcie a/alebo pozitívne či negatívne ovplyvnenie replikácie DNA.

Tiež vzhľadom na analógiu so správaním proteínu GAX môžu tieto fragmenty výhodne nahradiť GAX vo funkcii represora transkripcie. Avšak pri predpoklade, že z proteínu GAX obsahujú celú alebo časť domény, ktorá sa podieľa na represii transkripcie, je možné sa domnievať, že budú menej citlivé na rôzne zmeny, ktorým je proteín GAX vystavený. Tieto polypeptidy samotné alebo ich deriváty, môžu mať vo zvýšenej miere transkripčné represorové vlastnosti v porovnaní s prirodzeným proteínom GAX.

Tiež sa dá predpokladať ich použitie na identifikáciu nových partnerov proteínov GAX. Vzhľadom na to je predmetom predkladaného vynálezu tiež spôsob screeningu a/alebo identifikácie polypeptidov interagujúcich s proteínom GAX alebo s doménami GAX, spočívajúcimi v tom, že sa používa polypeptid podľa vynálezu. Výhodnejšie sa polypeptid vyberie z fragmentov obsahujúcich aminokyseliny 1 až 32 a 33 až 302 z proteínu GAX.

Pôvodca neočakávane ukázal, že doména proteínu GAX môže špecificky reagovať s iným bunkovým proteínom, a to proteínom

Ki. Ako sa už vysvetlilo skôr, Ki je autoantigén, ktorý sa vyskytuje v priebehu ochorenia ako je lupus erythematosus. Opísal sa ako jadrová molekula, ktorej expresia sa zvyšuje v priebehu proliferácie a tiež pri transformácii fibroblastov onkogénom.

Ukázali sme, že u kvasiniek je N-koncová časť GAX nevyhnutná pre interakciu s Ki. Rekombinantný proteín Ki rozpoznáva špecificky GAX prenesený na nitrocelulózovú membránu z denaturačného polyakrylamidového gélu.

Predkladaný vynález sa tiež týka polypeptidu, ktorý je fragmentom proteínu GAX schopným reagovať s proteínom Ki.

Výhodnejšie je to fragment zahrňujúci aminokyseliny 1 až 32 alebo 104 až 223 z proteínu GAX.

Pôvodca tiež velmi prekvapivo ukázal, že doména proteínu GAX môže špecificky interagovať s markerom proliferácie PCNA (Proliferating Celí Nuclear Antigén) . Okrem toho za už opísalo v odbornej literatúre, že Ki sa vyskytuje vo forme komplexu s PCNA. Ki preto zrejme reaguje tak s GAX, ako aj s PCNA a to tak, že vytvára minimálne dvojzložkový komplex s jedným z týchto proteinov a výhodne trojzložkový komplex. Vytváranie týchto komplexov hrá hlavnú úlohu v priebehu bunkového cyklu (aktiváciu alebo inhibíciu). Takže predkladaný vynález sa tiež týka polypeptidu, ktorý je fragmentom a/alebo s PCNA proteínu GX schopným s Ki a/alebo s PCNA a vytvárajúceho aspoň alebo aspoň trojzložkové komplexy s týmito interagovať dvoj zložkové proteínmi.

Ďalší predmet predkladaného vynálezu sa týka akejkoľvek nukleovej kyseliny kódujúcej polypeptid, ako je definované vyššie. Môže to byť sekvencia prirodzeného alebo umelého pôvodu, osobitne potom genómová DNA, cDNA, mRNA, hybridná sekvencia alebo syntetické či semisyntetické sekvencie. Nukleová kyselina môže byť z človeka, zvieraťa, rastliny, baktérie, vírusu atď. .

screeningom knižníc, chemickou syntézou, prípadne kombináciou rôznych metód, vrátane chemickej alebo enzýmovej modifikácie sekvencie získanej screeningom knižníc. Tieto nukleové kyseliny môžu byť vložené do vektorov, ako sú napr. plazmidové vektory.

Výhodne je nukleová kyselina podlá predkladaného vynálezu cDNA.

Nukleové kyseliny podlá vynálezu sa môžu využiť na prípravu sond alebo antisense molekúl (s orientáciou proti smeru normálnej transkripcie), ktoré potom metódou hybridizácie umožňujú detegovať prítomnosť alebo expresiu nukleových kyselín kódujúcich polypeptidy obsahujúce represorové domény podľa vynálezu, alebo inhibovať expresiu takýchto polypeptidov. Čo sa týka sond, tie výhodne obsahujú viac ako 10 báz, výhodnejšie 10 až 300 báz.

Nukleové kyseliny podľa vynálezu sa môžu použiť na expresiu a/alebo produkciu polypeptidu in vitro, in vivo alebo ex vivo na génovú alebo bunkovú terapiu.

Preto sa predkladaný vynález tiež týka expresnej kazety, ktorá obsahuje nukleovú kyselinu opísanú vyššie, ktorá je riadená promótorom, ktorý umožňuje expresiu.

V rámci vynálezu je možné použiť rôzne promótory. Sú to sekvencie, ktoré umožňujú expresiu nukleovej kyseliny v cicavčej bunke.

Promótor je výhodne vybraný z promótorov, ktoré sú funkčné v ludských bunkách. Výhodnejšie je to taký promótor, ktorý umožňuje expresiu sekvencie nukleovej kyseliny v hyperproliferatívnej bunke (rakovinová bunka, restenóza a pod.). Môžu sa teda použiť rôzne promótory. Môže to byť akýkoľvek promótor alebo z neho odvodená sekvencia stimulujúca alebo reprimujúca (potláčajúca) transkripciu génu špecificky alebo nešpecifický, indukované alebo neindukovane, silno alebo slabo.

Možno uviesť konkrétne promótorové sekvencie eukaryotických alebo vírusových génov. Tak napr. to môžu byť promótorové sekvencie pochádzajúce z genómu cieľových buniek. Z eukaryotických promótorov sa môžu uviesť konkrétne všeobecne rozšírené promótory (ako je napr. promótor génov HPRT, PGK, alfa-aktínu, tubulínu, DHFR a pod.), promótory intermediárnych filamentov (promótor GFAP, desmínu, fimentínu, promótor génov neurofilamentov a keratínu a pod.), promótory terapeutických génov (napr. promótory génov MDR, CFTR, faktora VIII a Apol a pod.), tkanivovo špecifické pyruvátkinázy, vilínu, črevného kyseliny a alfa-aktínu hladkého svalstva promótory deliacich bunky, alebo promótory odpovedajúce na podnet (receptor steroidných hormónov, receptor kyseliny retinovej, glukokortikoidový receptor a pod.) a alebo tzv. indukovatelné promótory. Tiež to môžu byť promótorové sekvencie odvodené z vírusového genómu, ako sú napr. E1A a MLP z adenovírusov, skorý promótor CMV alebo promótor LTR RSV a pod. Navyše môžu byť promótorové úseky modifikované pripojením aktivačných alebo regulačných sekvencií umožňujúcich tkanivovo špecifickú a prevládajúcu expresiu.

promótory (promótor génu proteínu viažuceho mastné a pod.), bunkové sa buniek, ako sú napr.

špecifické rakovinové

Predkladaný vynález poskytuje terapeutické činidlo, ktoré umožňuje tým, že má schopnosť potláčať transkripciu, zasahovať pri rôznych bunkových dysfunkciách. Nukleové kyseliny alebo expresné kazety podľa vynálezu sa môžu injikovať ako také priamo do miesta, ktoré sa má ošetriť, alebo sa môžu inkubovať priamo s bunkami, ktoré sa majú ošetriť alebo zničiť. Vskutku sa publikovalo, že nahá (neobalená) DNA môže preniknúť do bunky bez zvláštneho vektora. Avšak podľa predkladaného vynálezu je výhodné na podávanie použiť vektor, ktorý umožní (I) zvýšiť účinnosť prieniku do bunky, (II) zlepšiť zacielenie a (III) zvýšiť extra- a intracelulárnu stabilitu.

V mimoriadne výhodnom uskutočnení predkladaného vynálezu je nukleová kyselina alebo kazeta vložená do expresného vektora. Použitý vektor môže byť chemického pôvodu (lipozómy, nanočastice, peptidové komplexy, lipidové alebo katiónové polyméry a pod.), vírusového pôvodu (retrovírusy, adenovírusy, herpetické vírusy, AAV, vírus vakcínie a pod.) alebo plazmidového pôvodu.

Použitie vírusových vektorov je založené na prirodzených transfekčných vlastnostiach vírusov. Môžu sa takto využiť retrovírusy, adenovírusy, herpetické vírusy a vírusy asociované s adenovírusmi. Takéto vektory sa ukázali osobitne účinné z hľadiska transfekcie. V tomto smere je výhodným podľa predkladaného vynálezu defektný rekombinantný retrovírus, ktorého genóm obsahuje nukleovú kyselinu podľa vynálezu. Ďalším predmetom vynálezu je defektný rekombinantný adenovírus, ktorého genóm obsahuje nukleovú kyselinu opísanú vyššie.

Vektor podľa predkladaného vynálezu môže byť tiež iné činidlo ako vírus, schopné podporiť prenos a expresiu nukleovej kysliny v eukaryotickej bunke. Chemické alebo biochemické, syntetické alebo prirodzené vektory predstavujú výhodnú alternatívu v prirodzeným vírusom, konkrétne vzhľadom na ich pohodlné použitie, bezpečnosť a tiež vzhľadom na to, že nemajú žiadny horný limit, čo sa týka veľkosti prenášanej DNA. Tieto syntetické vektory majú dve hlavné funkcie, a to zhutniť DNA, ktorá je prenášaná a podporiť jej prienik do bunky cez plazmatickú membránu a pokiaľ je to nutné, tiež cez dvojitú jadrovú membránu. Aby sa prekonala polyaniónový charakter nukleových kyselín, majú nevírusové vektory polykatiónové náboje.

Nukleové kyseliny alebo vektory podľa predkladaného vynálezu môžu byť formulované na podávanie topickou, perorálnou, parenterálnou, intranazálnou, intravenóznou, intramuskulárnou, subkutánnou, intraokulárnou a transdermálnou cestou a pod. Výhodne sa nukleová kyselina alebo vektor podlá vynálezu použijú v injikovanej forme. Môžu sa preto zmiešať s akýmkoľvek farmaceutický prijateľným nosičom pre injekčný prípravok, konkrétne na priamu injekciu v úrovni ošetrovaného miesta. To môžu byť predovšetkým izotonické sterilné roztoky alebo suché, konkrétne lyofilizované prípravky, ktoré po pridaní, v závislosti na prípade, sterilizovanej vody alebo fyziologického roztoku, umožňujú prípravu roztokov na injekcie. Dávky nukleovej kyseliny použité na injekciu a tiež počet podávaní, sa môže upraviť v závislosti na géne, vektore, spôsobe podávania, príslušnej patológie alebo alternatívne požadovanej dĺžky liečby.

Vynález sa tiež týka akéhokoľvek farmaceutického prípravku obsahujúceho aspoň jednu nukleovú kyselinu definovanú vyššie.

Vynález sa tiež týka akéhokoľvek farmaceutického prípravku obsahujúceho aspoň jeden vektor definovaný vyššie.

Vzhladom na ich antiproliferatívne vlastnosti sú farmaceutické prípravky podľa predkladaného vynálezu mimoriadne vhodné na liečenie hyperproliferatívnych porúch, ako sú konkrétne rakoviny a restenóza. Predkladaný vynález tak poskytuje mimoriadne účinný spôsob deštrukcie buniek, konkrétne hyperproliferatívnych buniek. Je preto využiteľný na deštrukciu nádorových buniek alebo buniek hladkého svalstva cievnej steny (restenózy). Je mimoriadne vhodný na liečenie rakoviny, Ako príklady sa môžu uviesť črevné adenokarcinómy, rakovina štítnej žlazy, plúcne karcinómy, myeloidná leukémia, kolorektálne karcinómy, rakovina prsníka, pľúcna rakovina, rakovina žalúdka, rakovina pažeráka, B-lymfómy, rakovina vaječníkov, rakovina močového mechúra, glioblastoméry, hepatokarcinóm, rakovina kostí, rakovina pankreasu, obličky alebo prostaty, rakovina hrtanu, rakovina hlavy a krku, anogenitálne rakoviny s HPV pozitivitou, EBV-pozitívne rakoviny nosohltanu a pod.

Okrem toho sa predkladaný vynález týka akéhokoľvek použitia zlúčenín inhibujúcich aktivitu proteínu Ki a/alebo PCNA na inhibíciu proliferácie buniek hladkého svalstva.

Predkladaný vynález sa tiež týka použitia zlúčenín podľa vynálezu na vytváranie dvoj- a trojzložkových komplexov s proteínom Ki a/alebo PCNA na pozitívne alebo negatívne ovplyvnenie priebehu bunkového cyklu.

Predkladaný vynález je ďalej podrobnejšie opísaný pomocou príkladov a obrázkov, ktoré majú vynález ilustrovať a v žiadnom prípade ho nijako neobmedzujú.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1.: Northern analýza expresie proteínu Ki na mRNA extrahovaných z rôznych tkanív.

Obr. 2.: Jadrová lokalizácia KiHA v transfekovaných bunkách detegovaná imunofluorescenčnou metódou.

Obr. 3. : Interakcia in vitro medzi proteínmi GAX a Ki detegovaná

a) zafarbením pomocou Coomassie modrej

b) Far-western analýzou

Obr. 4.:

A) Schéma konštrukcie reportérového génu exprimujúceho bakteriálnu chloramfenikolacetyltransferázu (CAT) pod kontrolou umelého promótora

B) Test enzýmovej aktivity CAT (CAT-assay) v bunkových extraktoch po transfekcii expresnými vektormi obsahujúcimi ER, GAL VPI6 a ER-GAL VPI6.

Obr. 5.: Porovnanie konštrukcií rôznych delečných mutantov GAC s celým proteínom GAX (aminokyseliny 1 až 302) .

Obr. 6.: Test enzýmovej aktivity CAT (CAT-assay) rôznych chimér GAL-GAX

A) bez aktivátora ER

B) s aktivátorom ER

Obr. 7.: Interakcia medzi GST-GAX a PCNA

Príklady uskutočnenia vynálezu

Materiál a metódy

Uvádzame tu prehľad materiálov a metód použitých v nasledujúcich príkladoch.

A) Materiál

Použitý kmeň kvasiniek:

Ako nástroj n atestovanie fúznej knižnice z pľúcneho tkaniva dvojitým hybridným systémom sa použil kmeň YCM79 S. cerevisiae (MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801, trp901, leu2-3 112, canl, ga!4-54, gal80-538, metlô: URA3-Pgall, lOlAcz, HIS3: -.GAL7BLE) .

Kmeň sa testoval v nasledovných kultivačných médiách:

YPD kompletné médium: - kvasničný extrakt (10g/l) (Difco)

- Bactopeptone (20 g/1) (Difco)

- glukóza (20 g/1) (Merck)

Médium sa spevnilo pridaním 20 g/1 agaru (Difco).

YNB minimálne médium: - kvasničný dusíkatý základ (bez aminokyselín) (6,7 g/1) (Difco)

- glukóza (20 g/1) (Merck)

Médium sa môže spevniť pridaním 20 g/1 agaru (Difco) .

Aby sa na tomto médiu umožnil rast auxotrofných mutantov kvasiniek, je nevyhnutné k nemu pridať aminokyseliny alebo dusíkatú bázu, ktorú potrebujú, v množstve 50 mg/ml.

Použité kmene baktérií:

Ako prostriedok na amplifikáciu a izoláciu použitých rekombinantných plazmidov sa použil kmeň E. coli TG1 s genotypom supE, hsdD5, thi, Δ(lac-proAB), F'[tra D36 pro A⁺B⁺ lacl^q lacZAMl5].

Na produkciu rekombinantných proteínov sa použili baktérie E. coli BL-21s získané z firmy Pharmacia. Majú genotyp F ompT hsdS_b (r_b~m_b~) gal dcm (DE3) .

BL-21 je vhodný kmeň na tvorbu rekombinantných proteínov, pretože nemá žiadnu proteázu a jeho membrána je fragilná a môže sa lahko porušiť jednoduchou sonikáciou. E. coli BL-21 má systém pre expresiu T7 RNA polymerázy. Táto represia sa môže zrušiť s IPTG, čo umožňuje kontrolu génov umiestnených downstream (v smere čítania) od väzbového miesta pre T7 RNA polymerázu. Baktérie sa pestujú v 2 ml LB média (NaCl 5g/l, Trypton 10 g/1, kvasničný extrakt 5 g/1) v trepačke pri 37 °C cez noc. 1 ml tejto predbežnej kultúry sa pestuje opäť v 50 ml 2 x YT média (NaCl 5 g/1, Trypton 16 g/1, kvasničný extrakt 10 g/1) pri 37 °C, pokiaľ baktérie nedosiahnu optickú hustotu (OD) 0,4 pri 600 nm (exponenciálna rastová fáza). Bakteriálna kultúra sa schladí na ľade a odstredí sa pri 3300 rpm 20 minút.

Kompetentné baktérie E. coli na produkciu rekombinantných proteínov sú pripravené kalciumchloridovou metódou. To sa uskutoční tak, že baktérie sa dajú do 5 ml roztoku O,1M CaCl2 (1/10 tkanivovej kultúry) . Opäť sa usadia pri 3300 rpm 10 minút. Potom sa opäť dajú do 1 ml roztoku O,1M CaCl2 obsahujúcom 17,5% glycerol. Baktérie sa rozdelia na alikvoty a uskladnia pri -80 °C.

Použité plazmidy:

Použili sa vektory radu pGBT a pAS (Clontech), kyvadlové (shuttle) plazmidy, ktoré majú kvasinkový a bakteriálny počiatok replikácie, ktorý im umožňuje replikovať sa v týchto dvoch organizmoch s vysokým počtom kópií. Tieto plazmidy obsahujú mnohopočetné klonovacie miesto (polylinker) situované v smere čítania od terminátora, na vytvorenie fúzneho proteínu. Obsahujú tiež gén TRPÍ zo S. cerevisiae, ktorý umožňuje geneticky komplementovať kvasinky s genotypom trpí tak, aby bolo možné ich selektovať na minimálnom médiu neobsahujúcom tryptofán. Tieto vektory nesú gén pre ampicilínovú rezistenciu, ktorý umožňuje selektovať baktérie, ktoré ho majú, na médiu obsahujúcom ampicilín.

Vektory radu pGAD (Clontech) sú vektory, ktoré umožňujú v kvasinkách expresiu fúznych proteínov medzi transaktivačnou doménou GAL4 a požadovaným proteínom alebo proteínov kódovaných cDNA knižnicou z pľúcnej knižnice, vloženou do miest EcoRI-Xhoľ.

Vektory radu pET29	(Novagen)	sú	vektory,	ktoré	umožňujú
expresiu rekombinantných	proteínov	v	E.	coli	fúzovaných so
značkou S (S tag).
Vektory radu pGEX	(Pharmacia)	sú	vektory,	ktoré	umožňujú
expresiu rekombinantých	proteínov	v	E.	coli	fúzovaných s
glutation-S-transferázou	(GST) .

Vektory radu Bluescript (Stratagene) s tiež vektory radu pIC (J. Lawrence Marsh a kol., Gene 32, 481-485, 1984) a pMTL (Steve P. Chambers a kol., Gene 68, 139-149, 1998) sú vektory, ktoré umožňujú uskutočňovať klonovanie.

Plazmid pGEX-2T-hGAX je plazmid použitý na transformáciu baktérií E. coli BL-21. Tento plazmid bol získaný z plazmidu pGEX-2T a poskytol ho Dr. K. Walshem zo St. Elizabeth's Medical Center v Bostone. Základný plazmid pGEX-2T (Pharmacia) umožňuje produkovať proteín GAX fúzovaný s glutation-S-tranferázou (GST), proteín, ktorý má silnú afinitu k glutationu. Fúzia GST-GAX uľahčuje purifikáciu GAX afinitou k agarózovým perličkám s naviazaným glutationom. Okrem toho existuje štiepne miesto pre trombín, ktoré umožňuje štiepiť chiméru medzi GST a GAX. Pod kontrolu hybridného promótora tac a operátora lac je vložená cDNA hGAX. Represor lacl pripojením k operátoru lac zabraňuje RNA polymeráze v pohybe. Táto represia je zrušená analógom laktózy, izopropyl^-D-tiogalaktozidom (IPTG), ktorý sa spája s lacl. Komplex lacI-IPTG sa nemôže už ďalej viazať na operátor lac, a teda už ďalej neexistuje prekážka pre RNA polymerázu.

4) Proteín Ki

Príprava a purifikácia

Klonovali sme gén pre proteín Ki fúzovaný k epitopu myc v plazmide pET-29 (Novagen) z plazmidu pGAD nachádzajúcom sa v kvasinkách. Plazmid pET-29 produkuje proteín fúzovaný k epitopu nazvanom značka S, ktorý umožňuje purifikáciu KI afinitou k agarózovým guľôčkam s naviazaným proteínom S. Chiméra SmycKI je pod kontrolou T7 promótora a operátora lac. BL-21s sú transformované plazmidom ρΕΤ-29-mycKI. Ako v prípade proteínu GST-GAX sú baktérie pestované dokiaľ sa nezíska OD 0,7 pri 600 nm. Potom sa indukuje expresia SmycKI s 0,1 mM IPTG a RNA polymerázou T7 tvorenou BL-21s. Baktérie sa sonikujú.

Supernatant sa potom purifikuje nasledovnou metódou. Purifikácia SmycKI sa uskutočňuje afinitnou metódou s agarózovými perličkami s naviazaným proteínom S. Metóda je rovnaká ako pre GST-GAX, okrem toho, že živica sa premyje z roztoku obsahujúcom 20 mM Tris pH 7,5, 0,15M NaCl a 0,1% Triton X-100. Elúcia a dialýza sú rovnaké ako pre GST-GAX.

B) Metódy

Metódy zvyčajne používané v molekulovej biológii sú odborníkom dobre známe a sú široko opísané v literatúre (Maniatis T. a kol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982,

Ausubel F.M. a kol. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987).

1) Systém dvojitého hybridu

Tento systém je metóda klonovania pomocou interakcie in vivo v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae, ktorej princíp je založený na modulárnej štruktúre kvasinkového transkripčného faktora GAL4 (7) . Transkripčný aktivátor GAL4 má dve nezávislé domény, ktoré majú odlišné funkcie. DNA väzbová doména (GALDB. pre väzbu GAL DNA) umožňuje GAL4 naviazať sa na špecifickú sekvenciu DNA na úrovni promótorovej oblasti génu. GAL4 sa potom nachádza stericky blízko k transkripčnému mechanizmu a pomocou svojej transaktivačnej domény (GALTA) zvyšuje rýchlosť, v ktorej je iniciovaná transkripcia na susednom géne, pravdepodobne interakciami s RNA polymerázou alebo pridruženými proteínmi. Princíp dvojitého hybridného systému spočíva v oddelenom fúzovaní GALDB a GALTA k dvom odlišným proteínom X a Y, ktoré tvoria, pokial navzájom reagujú, aktívny transkripčný komplex.

2) Testovanie kvasiniek technikou PCR (polymerázová reťazová reakcia)

Testovanie sa uskutočňovalo priamo na kvasinkách. Každá kvasinková kolónia sa dala do roztoku 10 μΐ vody s obsahom 0,08% Tween 20. Tween je neiónová detergent, ktorý umožňuje zvýšiť lýzu kvasiniek počas prvého stupňa zahriatia na 95 °C. V nasledujúcich štádiách pôsobí Tween 20 ako prípravok, ktorý chráni Taq DNA polymerázu. Suspenzia kvasiniek sa doplní na konečný objem 20 μΐ obsahujúci nasledujúce konečné koncentrácie alebo množstvá: 10 pM primér 1, 10 pM primér 2, 1 jednotka Taq DNA polymerázy, 75 mM Tris pH 9, 20 mM (NH₄)₂SO₄, 0,01% Tween 20,

2,5 mM MgCl₂ a 125μΜ každého zo štyroch deoxyribonukleotidov (dATP, dTTP, dGTP, dCTP). Na konci PCR sa časť zmesi analyzuje v agarózovom géle. Takto sa teda môže zistiť, pre daný pár primérov a pre každý kvasinkový kmeň, či sa v kvasinkách nachádza už identifikovaná DNA sekvencia.

3) Príprava plazmidových DNA

Veľké množstvá DNA sa pripravia s použitím rýchlej preparačnej súpravy Promega.

Malé množstva DNA sú pripravené nasledovným spôsobom: baktérie obsahujúce plazmid sa pestujú aspoň 4 hodiny v 2 ml LB média na trepačke s miešaním. Potom sa sedimentujú 2 minúty pri 14000 rpm v mikroskúmavkách (Eppendorf) a potom sa pelet resuspenduje v 100 μΐ roztoku I (50 mM glukóza, 25 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8), lyžuje sa s 200 μΐ roztoku II (0,2M NaOH, 1% SDS) . Lytický roztok sa potom neutralizuje so 150 μΐ roztoku III (3M octan sodný, 11,5% (v/v) ľadová kyselina octová). Po trepaní skúmaviek, pokial sa nezíska chumáčikovitý precipitát, sa pridá 150 μΐ zmesi fenol/chloroform (50% fenol a 50% chloroform, saturované vodou) a všetko sa 30 s prudko mieša. Vodná fáza obsahujúca DNA sa precipituje pridaním 0,5 objemu izopropanolu a potom sa usadí 5 minút pri 14000 rpm a usuší na vzduchu a nakoniec sa rozpustí v 20 μΐ TE RNáza (roztok 10 mM Tris-HCl a 1 mM EDTA s 50 gg/ml RNáza).

4) Syntéza a enzýmová amplifikácia DNA metódou PCR (polymerázová reťazová reakcia)

Reakcie PCR sa uskutočňujú v konečnom objeme 100 μΐ v prítomnosti templátovej DNA, dNTP (0,2 mM) , pufru PCR (10 mM Tris-HCl pH 8,5, 1 mM MgCl2, 5 mM KCl, 0,01% želatína), 0,5 μς každého oligonukleotidu z 2,5 IU AmpliTaq DNA polymerázy (Perkin Elmer) s formamidom (5%) alebo bez neho. Zmes sa prevrství 2 kvapkami parafínového oleja, aby sa obmedzilo vyparovanie vzorky. Použitý prístroj bol Crocodile II od firmy Appligene. Pre templát sme použili denaturačnú teplotu 90 °C, teplotu pre hybridizáciu oligonukleotidov k templátu o 5 až 10 stupňov nižšiu ako separačná teplota oligonukleotidov a teplotu pre predlžovanie enzýmom 72 °C.

Fragmenty získané s PCR, ktoré slúžili pre klonovanie, sú systematicky spätne sekvenované po klonovaní, aby sa skontrolovali možné mutácie objavujúce sa počas amplifikácie.

Oligodeoxynukleotidy sú chemicky syntetizované fosforamidovou metódou s použitím β-kyanoetylových ochranných skupín (Sinha 1984). Po syntéze sú ochranné skupiny odstránené s hydroxidom amónnym a dve pricipitácie butanolom umožňujú purifikovať a koncentrovať oligodeoxynukleotidy (Sawadogo, 1991). Koncentrácie DNA sa určia meraním optickej denzity pri 260 nm.

5) Ligácia

Všetky ligačné reakcie sa uskutočňujú pri 14 °C cez noc v konečnom objeme 10 μΐ v prítomnosti 100 až 200 ng vektora, 0,5 až 2 gg inzertu, 40 IU enzýmu T4 DNA ligázy (Biolabs) a ligačného pufru (50 mM Tris-HCl pH 7,8, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP). Negatívna kontrola spočíva v ligácii vektora bez inzertu.

Doplnenie prečnievajúcich 5^Z-koncov sa uskutočňuje tam kde je to nutné, pred ligáciou Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I z E. coli (Biolabs) podía dodávateľových inštrukcií. Odstránenie prečnievajúcich 3' koncov · sa uskutočňuje v prítomnosti DNA polymerázy fága T4 (Biolabs) použitej podía odporučenia výrobcu.

6) Transformácia baktérií

Transformácia baktérií plazmidom sa uskutočňuje podía nasledovného postupu: celý objem ligácie (10 μΐ) sa použije na transformáciu baktérií TG1, ktoré sa pripravia kompetentné metódou Chunga a kol. (PNAS 86, 2172-2175, 1988).

Baktérie TG1 sa pestujú v tekutom LB médiu niekoľko hodín v inkubátore s trepaním pri 37 °C, pokiaľ sa nedosiahne OD 0,6 pri 600 nm. Médium sa potom scentrifuguje pri 6000 rpm 10 minút. Kompetentné baktérie sa pripravia prenesením peletu baktérií do objemu TSB (LB médium + 100 g/1 PEG 4000, 5% DMSO, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSOJ zodpovedajúcemu 1/10 objemu počiatočného kultivačného média. Po inkubácii pri 4 °C počas 30 až 60 minút, sa 200 μΐ baktérií zmieša s ligačnými produktmi 15 minút na ľade. Po pridaní 200 μΐ LB sa baktérie inkubujú 30 minút pri 30 °C a potom sa vysejú na médium LB s ampicilínom.

7) Separácia a extrakcia DNA

Separácia DNA sa uskutočňuje podlá veľkosti elektroforézou. Aby sa tak stalo, použijú sa rôzne gélu podľa veľkosti fragmentov, ktoré sa majú separovať:

- 1% agarózový gél (Gibco BRL) v TBE pufri (90 mM Tris báza, 90 mM borát, 2 mM EDTA) na separáciu veľkých DNA fragmentov (väčších ako 500 bp)

- 2% agarózový gél z agarózy NuSieve (FMC Bioproducts) v TBE pufri na separáciu malých fragmentov (menších ako 500 bp) .

Všetky migrácie v agarózovom géle alebo v polyakrylamidovom géle sa uskutočňujú v TBE pufri a v prítomnosti štandardu na určenie molekulovej hmotnosti (rebrík štandardov 1 kb, Gibco BRL) . DNA sa zmieša s 1/10 objemu nanášacej modrej (200g/l fikol, 0,5 g/1 brómfenolová modrá), 50 mM EDTA) pred nanesením na gél. Po migrácii pri 100 V a zafarbení s etídiumbromidom (koncentrácia 0,5 gg/ml v géle) sa pásy vizualizujú pod UV lampou.

Extrakcia DNA z pásov v agarózovom géle sa uskutočňuje elektroelúciou nasledovne: kúsok gélu obsahujúceho fragment DNA sa vyreže skalpelom a umiestni do dialyzačnej trubice uzavretej dvoma svorkami a obsahujúcimi 100 až 500 μΐ TBE. Všetko sa umiestni do nádržky pre elektroforézu, ktorá sa vystaví elektrickému poľu 100 V. DNA po opustení gélu sa purifikuje dvoma extrakciami fenol/chloroform, potom nasledujú extrakcie chloroformom a potom sa precipituje v prítomnosti 0,3M octanu sodného a 2,5 objemov absolútneho etanolu. Po stočení (5 minút pri 14000 rpm) sa pelet DNA usuší a potom sa nasaje do 20 μΐ vody.

8) Fluorescenčné sekvenovanie plazmidovej DNA

Sekvenovanie sa uskutočňuje podlá metódy podlá Sangera s použitím 4 dideoxyribonukleotidov majúcich odlišný fluorescenčný marker. Inkorporácia jedného z týchto dideoxyribonukleotidov spôsobí zastavenie replikácie Taq DNA polymerázou, ktorá sa sekvenuje. Táto reakcia dáva DNA fragmenty s rôznou veľkosťou, všetky končia na 3' jedným zo 4 dideoxyribonukleotidov.

μς plazmidu a 4 pM priméru sa pridajú k 9,5 μΐ predzmesi poskytnuté firmou Applied Biosystems pod menom Prism®. Konečný objem by mal byť 20 μΐ, aby sa uskutočnila reakcia PCR s 25 cyklami, ktoré sa skladajú z denaturačného kroku 30 sekúnd v 96 °C, nasadanie primárov 15 sekúnd pri 50 °C a extenzia 4 minúty pri 60 °C.

DNA fragmenty získané po amplifikácii sa purifikujú na vylučovacej kolóne (Chromaspin-30 z firmy Clontech) a sú potom usušené vo vákuu v prístroji Speed Vac. Všetko sa nasaje do 5 μΐ zmesi zloženej z 24 μΐ EDTA (50 mM) a 120 μΐ deionizovaného formamidu. Po denaturácii pri 96 °C 3 minúty sa 3 až 5 μΐ nanesú na gél pre elektroforézu. Rôzne fragmenty DNA sa separujú podľa veľkosti a postupne prejdú pred laserovým čítacím zariadením DNA sekvenátora typ 370 (Applied Biosystems), kde sa detegujú rôzne typy fluorescencie.

9) Príprava plazmidov z knižnice pľúcneho tkaniva (Clontech®)

Fúzna cDNA knižnica pľúcneho tkaniva sa predáva vo forme baktérií. Táto knižnica pochádza z klonovania do miest EcoRIXhol plazmidu pGAD424 (pozri materiál) z cDNA zodpovedajúcej celkovej RNA ľudských pľúc.

Po skontrolovaní titra knižnice sa 2 μΐ baktérií z pľúcnej fúznej knižnice, predtým prenesenej do 8 ml LB, vyseje na pevné médium tak, aby nesplývali, na udržanie reprezentatívnosti tejto knižnice. Vysiali sme 16 misiek s plochu 770 cm², ktoré obsahovali LB médium s ampicilínom. Kolónie, ktoré sa objavili, sú odobraté po jednej na misku s 30 ml tekutého LB s ampicilínom. Získané suspenzie sú potom umiestnené v Erlenmayerových bankách a inkubované na trepačke pri 37 °C 3 hodiny. DNA sa potom z týchto kmeňov extrahuje technikou maxipreparácie (Maxiprep) . Koncentrácia DNA sa určuje pri 260 nm.

10) Transformácia kvasiniek plazmidom

Kvasinky, ktoré sa dopredu pestovali v 100 ml tekutého média, sa zozbierajú po usadení pri 3000 rpm 3 minúty a resuspendujú v 1 ml sterilnej vody. Po usadení pri 3000 rpm 3 minúty sa bunkový pelet resuspenduje v 1 ml sterilnej vody a potom sa opäť usadí. Tento postup sa opäť opakuje, aby sa odstránili všetky stopy kultivačného média. Kvasinky sa potom nasajú do 1 ml transformačného roztoku I (0,1 M LiAc, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA) a potom sa usadia pri 3000 rpm 3 minúty. Bunkový pelet sa opäť nasaje do 1 ml transformačného roztoku I. Do 50 μΐ tejto kvasinkovej suspenzie sa vnesie 50 μς DNA zo spermií lososa a 1 až 5 μς plazmidovej DNA. Potom sa pridá 300 μΐ transformačného roztoku II (0,1 M LiAc, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA v 40% PEG 4000) a všetko sa inkubuje pri 28 °C 30 minút. Potom sa na transformačnú zmes aplikuje tepelný šok vo vodnom kúpeli pri 40 °C 15 minút a potom sa všetko stočí pri 15000 rpm 1 minútu aby sa usadil bunkový pelet. Tento pelet sa prenesie do 200 μΐ vody a potom sa vyseje na minimálne médium s agarom, ktoré neobsahuje niektoré aminokyseliny v závislosti na markeroch poskytnutých transformačným plazmidom. Kvasinky sa potom pestujú 72 hodín pri 28 °C.

V špecifickom prípade transformácie kvasiniek pľúcnou cDNA knižnicou sa postup uskutočňuje nasledovným spôsobom:

Použité kvasinky obsahujú plazmid pGAL4DB-GAX exprimujúci proteín GAX vo forme fúzovanej k DNA väzbovej doméne GAL4. Pestujú sa v 250 ml minimálneho média YPG pri 28 °C s trepaním, dokial sa nedosiahne denzita 10⁷ buniek/ml. Bunky sa potom zozbierajú stočením pri 3000 rpm 10 minút a prenesú do 250 ml vody. Po ďalšom stočení sa bunkový pelet prenesie do 100 ml vody a opäť stočí. Pelet sa potom prenesie do 10 ml transformačného roztoku I a inkubuje 1 hodinu pri 28 °C s trepaním. Po stočení sa bunky opäť prenesú do 2,5 ml transformačného roztoku I, 100 μΐ pľúcnej cDNA knižnice a 20 ml transformačného roztoku II a potom sa inkubujú 1 hodinu pri 28 °C s trepaním. Na túto transformačnú zmes sa aplikuje tepelný šok pri 42 °C 20 minút. Stočenie (3000 rpm 5 minút) sa opakuje trikrát po sebe, vždy sa pelet prenesie do 10 ml sterilnej vody. Tretíkrát sa pelet prenesie do 2,5 ml PBS. Tak sa odstráni PEG, ktorý je toxický pre bunky. 2,4 ml tejto suspenzie sa použije na inokuláciu 250 ml minimálneho média obsahujúceho aminokyseliny His, Lys, Met a bázy Ura a Ade a pestuje sa cez noc trepačke pri 28 °C. Zvyšných 100 μΐ suspenzie slúži na kontrolu účinnosti transformácie, čo sa uskutoční riedením tejto suspenzie 10-², 10-³ a 10-⁴. Kultúra, ktorá rastie cez noc, sa stočí (3000 rpm 5 minút) a premyje sa sterilnou vodou dvakrát po sebe. Pelet sa potom prenesie do 2,5 ml vody. 2,4 ml, ktoré sa doplnia do 10 ml sterilnou vodou, sa použije na inokuláciu 10 misiek s plochou 435 cm², ktoré obsahujú médium YNB+Lys+met+His+Ade a inkubuje sa 3 dni. Zvyšných 100 μΐ sa použije na uskutočnenie toho istého postupu, ako počas určenia rýchlosti transformácie, aby sa určila rýchlosť amplifikácie počtu kolónií počas celonočnej kultivácie.

11) Izolácia kvasinkovej (genómovej a plazmidovej) DNA

Množstvo kvasinkového klonu odobraté s priemernou očkovacou slučkou sa umiestni do 200 μΐ roztoku TELT (2% Triton X100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA) v prítomnosti 3 g sklenených perličiek s priemerom 450 μιη a 20 μΐ fenol/chloroform. Táto zmes sa vortexuje 15 minút a potom sa usadí 2 minúty pri 14000 rpm. Supernatant sa zbiera bez odstránenia proteínového koláča a DNA nachádzajúca sa v tejto fáze sa zráža s 2,5 objemami absolútneho etanolu. Po usadení 2 minúty pri 14000 rpm sa DNA pelet usuší a prenesie do 20 μΐ TE-RNáza. Tento roztok DNA, ktorý zodpovedá zmesi genómovej a plazmidovej DNA, slúži priamo na transformáciu baktérií. Iba plazmidová DNA je schopná replikovať sa v baktériách a môže sa analyzovať technikou minipreparácie.

12) Test aktivity β-galaktozidázy

Nitrocelulózová membrána sa dopredu vloží na Petriho misku obsahujúcu oddelené kvasinkové klony. Pomocou fenoménu adsorpcie sa získa presný obraz pozície klonov. Táto membrána sa potom ponorí na 30 sekúnd do tekutého dusíka, aby sa rozrušili kvasinky a tým sa uvolnila β-galaktozidázová aktivita. Po roztopení sa nitrocelulózová membrána uloží kolóniami navrch, do ďalšej Petriho misky obsahujúcej filtračný papier Whatman dopredu impregnovaný s 1,5 ml roztoku PBS (60 mM Na₂HPO₄, 40 mM NaH₂PO₄, 10 mM KC1, 1 mM MgSO₄, pH 7) a 10 až 30 μΐ X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl^-D-galaktozid) v 50 mg/ml N,N-dimetylformamidu. Miska sa potom umiestni do inkubátora pri 37 °C s uzavretým vrchnákom, aby sa zabránilo vyschnutiu. Čas do objavenia sa modrej farby môže byť velmi variabilný, od niekoľkých minút po niekoľko hodín. Tento test by mal byť vždy uskutočňovaný v prítomnosti pozitívnej kontroly, ktorej interakcia je známa a rýchlo vytvára modré sfarbenie.

13) Konštrukcia expresných vektorov a reportérového génu

a) Expresné vektory cDNA pre estrogénový receptor (ER) sa získa reverznou transkripciou (RT) s pomocou komerčnej súpravy (First strand cDNA synthesis kit od firmy Pharmacia) z celkovej RNA extrahovanej z myšacej maternice, za čím nasleduje amplifikácia PCR. Použili sme pár špecifických primérov hybridizujúcich na 5'-konci s prvými 20 nukleotidmi z ER a vnášajúcich miesto EcoRI hneď v protismere čítania od prvého kodónu (5'gagc ga a t tATGACCATGACCCTTCACACm, SEQ ID NO.: 6, nukleotidy kurzívou predstavujú miesto EcoRI a podčiarknuté veľké písmená prvý kodón), na 3'-konci spätný primér začína v stop kodóne ER a tiež vnáša miesto EcoRI (5'-gacgaattcACTGATCGTGTTGGGGAAGC, SEQ ID NO.: 7, nukleotidy kurzívou predstavujú miesto EcoRI a podčiarknuté veľké písmená stop kodón). Získaný PCR fragment sa purifikoval, štiepil s EcoRI a potom klonoval do toho istého miesta v expresnom vektore pCDNA3 (Invitrogen). Tento vektor je nazvaný pCMV-ER. Rôzne delečné mutanty GAX fúzované k DNA väzbovej doméne GAL4 (pCMV-GADB/GAX, pozri príklad 9), sa tiež klonovali do vektora pCDNA3.

b) reportérový gén

Reportérový gén sa zostrojil podlá stratégie opísanej Martinezom a kol. (Martinez a kol., Mol. Celí. Biol. 11, 29372945, 1991) okrem toho, že použitý klonovací vektor je pG5CAT (Clontech, CAT = chloramfenikolacetyltransferáza). Syntetizovali sme dvojvláknový oligonukleotid (pozri nižšie) obsahujúci dve špecifické miesta (hrubo), jedno rozpoznávané DNA väzbovou doménou GA4 (Gal-17mer, Carey a kol., J. Mol. Biol., 209, 423432, 1989) a druhé je súhlasná sekvencia z Estrogen Responsive Element (ERE, Beato, M., Celí 56, 335-344, 1989), ktorá viaže estrogénový receptor. Tento adaptérový oligonukleotid má na

5'-konci prečnievajúce miesto Xhol a na 3'-konci miesto Xbal, ktoré umožňujú klonovanie do miest Xhol a Xbal z pG5CAT.

Sekvencia SEQ ID NO.: 8 tcga^AGGTCATATTGACCTaagcttCGGGTCGGAGTACTGTCCTCCGACTGCcatatgt cTCCAGTATAACTGGAttcgaaGCCCAGCCTCATGACAGGAGGCTGACGgtatacacjatc

Xhol ERE Gal-17mer Xbal

Princíp tohto reportérového génu (pEREGICAT, obr. 4., príklad 11) je založený na fakte, že ER je transkripčný aktivátor, ktorý má, ako je to v prípade myšacieho ER, konštitutívnu aktivitu, ktorá sa zvyšuje ako odpoveď na jeho prirodzený ligand 17p-estradiol. Tento systém použil Martinez a kol na štúdium synergie medzi ER a druhým transkripčným faktorom NF1, ktorého transkripčná aktivačná doména sa fúzovala k DNA väzbovej doméne kvasinkového proteínu GAL4 (GALDB). Táto reportérová konštrukcia teda umožňuje prirátať transkripčnú rýchlosť iba jednému alebo druhému transkripčnému faktoru alebo ich kooperácii, bez interferencie spôsobenej endogénnymi molekulami. Tento systém nám preto umožňuje študovať transkripčnú aktivitu celého alebo časti proteínu GAX fúzovaného k GALDB (obr. 5, 6 a príklady 12, 13) .

Skonštruoval sa tiež plazmid exprimujúci luciferázový gén pod kontrolou promótora CMV (pCMV-Lux). Táto konštrukcia sa získala po klonovaní PCR fragmentu (ohraničeného na 5'- A 3' konci miestom BamHI) obsahujúcim promótor CMV z vektora pCDNA3 (Invitrogen) do miesta BglII vektora pGL3-Basic (Promega). Tento plazmid slúžil ako vnútorný štandard vo všetkých prechodných transfekčných pokusoch, ktoré sú v nasledujúcich príkladoch.

14) Pokusy s prechodnou transfekciou

Všetky štúdie sme uskutočňovali na myšacích embryonálnych fibroblastoch NIH-3T3 (ATCC). Tieto bunky sa rutinne udržiavali v DMEM (Gibco) doplnenom so 100 U/ml penicilín (Gibco), 100 gg/ml streptomycín (Gibco), 2 mM L-glutamín (Gibco) a 10% fetálne telacie sérum (FCS, Gibco). Toto médium sa bude označovať skratkou DMEM-GPS/FCS.

Na experimenty s prechodnou transfekciou sú NIH-3T inokulované s hustotou 100000 buniek na jamku na 24-jamkové kultivačné doštičky (Falcon) s objemom 1 ml DMEM-GPS/FCS. 16 až 20 hodín neskoršie po prichytení a rozšírení buniek sa bunky premyli s 0,5 ml DMEM-GPS (bez FCS) a potom sa opäť umiestnili do 0,5 ml DMEM-GPS. Na kultivačnú jamku sa potom pridá 50 μΐ transfekčnej zmesi. Zmes sa získa ako je zhrnuté v nasledovnej tabulke.

Tabuľka 3

	1*	2*	3*	4*
PCMV-Luc	50 ng	50 ng	50 ng	50 ng
PEREG1CAT*	650 ng	650 ng	650 ng	650 ng
PCMV-ER	—	150 ng	-	150 ng
PCMV-GALDB/GAX	-	-	150 ng	150 ng
PCDNA3**	300 ng	-	-	-
Lipofektamin***	8 μα	θ μα	θ μα	8 μς
H20 qs	50 μΐ	50 μΐ	50 μΐ	50 μΐ

* Rôzne zmesi, očíslované od 1 po 4 sa navrhli na štúdium bazálnej aktivity promótora EREG1CAT, aktivity ER alebo samotného GALDB/GAX a konečne simultánneho účinku ER a GALDB/GAX v príslušnom poradí.

** Na doplnenie každej zmesi na 10 gg je použitý pCDNA3.

*** Lipofektamin s koncentráciou 2 gg/μΐ (Gibco) je použitý v pomere 8/1 (lipofektamin/DNA)

Bunky sú skontaktované s rôznymi transfekčnými zmesami 4 hodiny pri 37 °C pri štandardných kultivačných podmienkach. DMEM-GPS s transfekčnou zmesou sa potom nahradí s 1 ml DMEMGPS/FCS a bunky sa potom udržujú v kultúre 24 hodín. Každá transfekcia sa uskutočňuje minimálne v 4 jamkách. Na konci 24hodinového času sú bunky premyté s 0,5 ml Dulbeccovho PBS (Gibco) a potom sa zozbierajú do 0,5 ml 0,2% roztoku trypsínu (Gibco) . Trypsín sa neutralizuje s 10 μΐ FCS. Táto bunková suspenzia sa usadí 2 minúty pri 10000 g, supernatant sa odsaje a potom sa bunky resuspendujú v 150 μΐ 0,25M Tris-HCl pH 7,8. 50 μΐ tejto suspenzie sa použije na testovanie luciferázovej aktivity podía Luciferase Assay System Kit (Promega) a s pomocou luminometra LUMAT AB 9501 (EG&G Berthold) . Cytosólové proteíny z buniek zo zvyšných 150 μΐ sa extrahujú v piatich cykloch zmrazenia/rozmrazenia (tekutý dusík/37 °C). Extrakty, relatívne štandardizované k luciferázovej aktivite, sa potom použili na testovanie CAT aktivity podía metódy skôr opísanej Gormanom a kol. (Gorman a kol., Mol. Celí. Biol. 5, 1044-1051, 1982).

15) Interakcia in vitro medzi proteínmi Ki a GAX

Táto interakcia medzi proteínmi Ki a GAX in vitro sa skúma metódou Far-Western prenosom.

Zatial čo western prenos spočíva v elektroforetickej separácii proteínov v denaturačnom géle, následnom prenose proteínov na nitrocelulózovú membránu a priamej či nepriamej imunodetekcii, Far-western prenos je western prenos, ku ktorému sa pridal krok interakcie proteín-proteín medzi cieľovou molekulou imobilizovanou ma nitrocelulózovej membráne a faktorom v roztoku.

a) Elektroforéza

Vzorky sa zahrejú na 10 minút pri 95 °C v denaturačnom pufri pre proteíny obsahujúcom 50 mM Tris pH 6,8, 2% SDS (dodecylsulfát sodný), 10% glycerol, 300 mM β-merkaptoetanol 0,1% brómfenolová modrá. 10 ml vzorky sa nanesie na Tris-glycínový 14% akrylamidový gél (Tris-Glycine Gels, Novex). Migrácia trvá 1 hodinu pri konštantnom napätí 120 V v separačnom pufri pre proteíny (35 mM SDS, 1,92 M glycín a 85 mM Tris pH 8,3). Molekulová hmotnosť proteínov sa určuje paralelnou migráciou zafarbeného a prenosného štandardu molekulovej hmotnosti (Multimark™ Multi-Colored Standard, Novex) . Tento gél sa uskutočňuje v dvojitom uskutočnení, aby sa mohol jeden z nich paralelne zafarbiť s Coomassie modrou (30% metanol, 60% voda, 10% kyselina octová, 0,1% Coomassie modrá). Farbenie trvalo 1 hodinu. Odfarbenie sa uskutočňovalo niekolko hodín niekolkonásobnou výmenou odfarbovacieho roztoku (30% metanol, 10% kyselina octová), 60% voda). Detekčný limit tejto metódy je 50 ng proteínov. Takto zafarbený gél nám preto umožnil vizualizovať všetky nanesené proteíny. Ďalší gél sa použije na Far-Western prenos.

b) Polosuchý prenos na nitrocelulózovú membránu

Nitrocelulózová membrána (Hybond C, Amsterdam) a gél sa umiestnili medzi 3 vrstvy papiera dopredu ponoreného do prenosového pufru (150 mM glycín, 25 mM Tris, 20% metanol, voda 1 1, pH 8,3). Prenos trval 40 minút pri 2,5 mA/cm² gélu (Milliblot™ - Graphite Electroblotter II, Millipore)

c) Interakcia proteín-proteín

Membrána je saturovaná 30 minút za trepania a pri teplote miestnosti v PBS obsahujúcom 5% (w/v) odtučnené sušené mlieko (Glória) 0,2% (v/v) Tween 20. Potom sa 1 hodinu ponorí za trepania pri teplote miestnosti do 5 ml PBS obsahujúceho 5% (w/v) odtučnené sušené mlieko (Glória), 0,2% (v/v) Tween 20 a 75 gg Ki. Ihneď ak je inkubácia kompletná, membrána je 3x premytá 10 minút v PBS obsahujúcom 0,2% (v/v) Tween 20. Aby sa vizualizovala interakcia medzi GST-GAX imobilizovaným na nitrocelulózovej membráne a mycKi, je tento detegovaný, rovnako ako GST-GAX, pomocou myšacej monoklonálnej protilátky namierenej proti epitopu myc (Santa Cruz) a králičej polyklonálnej protilátky konjugovanej s peroxidázou namierenej proti myšacím IgG (Nordic Immunology).

Príklad 1

Konštrukcia vektora umožňujúceho expresiu fúzneho proteínu medzi GAX a DNA väzbovou doménou GAL4

Screening knižnice s použitím dvojitého hybridného systému vyžaduje, aby proteín GAX bol fúzovaný k DNA väzbovej doméne transaktivačného proteínu GAL4. Expresia tohto fúzneho proteínu sa uskutočňuje s použitím vektora pGBTIO (pozri Materiál a metódy), do ktorého sme vložili, a to do istého čítacieho rámca ako je sekvencia zodpovedajúca DNA väzbovej doméne GAL4 (GAL4DB), fragment kódujúci celý proteín GAX alebo jeho časť. Konkrétny fragment zahrňuje fragment EcoRI-Sall z pGBTIO, takže vznikol plazmid pCM199.

Konštrukcia sa sekvenovala, čo umožňovalo skontrolovať, že proteín GAX je naozaj v tom istom otvorenom čítacom rámci, ako proteín fragmentu zodpovedajúceho GAL4DB.

Príklad 2

Screening fúznej knižnice pľúcneho tkaniva

Testovanie fúznej knižnice umožňuje identifikovať klony produkujúce proteíny fúzované k transaktivačnej doméne GAL4, schopnej interagovať s proteínom GAX alebo jeho doménami. Táto interakcia umožňuje rekonštituovať transaktivátor, ktorý bude potom schopný vyvolať expresiu reportérových génov URA3, BLE a LacZ v kmeni YCM79.

Pre tento screening sme vybrali fúznu knižnicu vytvorenú z cDNA získanej z ľudských pľúc. Pretože nám bola poskytnutá táto knižnica vo forme baktérií, najskôr sa z knižnice purifikovala plazmidová DNA.

2.1) Izolácia plazmidovej DNA z fúznej knižnice

Plazmidová DNA z knižnice cDNA pľúcneho tkaniva sa extrahovala podľa protokolu Clontech® (pozri Materiál a metódy, odsek 10) . Počas tejto izolácie bolo dôležité zachovať reprezentatívnosť knižnice, čo znamená zachovať počet nezávislých plazmidov, ktoré ju tvorili a ktorých je 7 xlO⁶.

Aby sme sa vyhli strate plazmidov z knižnice počas tejto izolácie, bola dávka plazmidovej DNA, ktorú sme vytvorili, získaná z velkého počtu izolovaných bakteriálnych kolónií zodpovedajúcemu viac ako trikrát reprezentatívnosti knižnice, čo je 25xl0⁶ kolónií.

2.2) Transformácia knižnicou pľúcneho tkaniva a selekcia pomocou testu na β-galaktozidázovú aktivitu.

Počas testovania je nutné zachovať pravdepodobnosť, že každý nezávislý plazmid z fúznej knižnice je prítomný aspoň v jednej kvasinke súčasne ako plazmid GAL4DB -GAX. Aby sa táto pravdepodobnosť zachovala, je dôležité mať dobrú účinnosť transformácie kvasiniek. Preto sme vybrali protokol na transformáciu kvasiniek poskytujúci účinnosť 10⁵ transformovaných buniek na gg DNA. Ďalej, pretože spoločná transformácia (kotransformácia) kvasiniek s dvoma odlišnými plazmidmi znižuje túto účinnosť, preferovali sme použitie kvasiniek dopredu transformovaných plazmidom pGAL4DB-GAX. Tento kmeň sa transformoval so 100 pg plazmidovej DNA z fúznej knižnice. Toto množstvo DNA nám umožnilo získať, po vyhodnotení (pozri Materiál a metódy), 4,2xl0⁷ transformovaných buniek, čo zodpovedá číslu väčšiemu ako bol počet nezávislých plazmidov, ktoré tvoria knižnicu. Podľa tohto výsledku sa môže zdať, že prakticky všetky plazmidy z knižnice slúžili na transformáciu kvasiniek. Selekcia transformovaných buniek, schopných rekonštituovať funkčný transaktivátor GAL4, sa uskutočňovala na médiu YNB+Lys+Met+His+Ade. Na konci tejto selekcie sa získalo 190 klonov s fenotypom Ura⁺ PGal⁺.

Príklad 3

Identifikácia inzertov vybraných plazmidov: demonštrácia interakcie s Ki

Plazmidy sú extrahované z kvasiniek, vnesené do baktérií a potom izolované, ako je opísané v časti Materiál a metódy. Sekvenovanie sa uskutočňovalo pomocou oligonukleotidu CTATTCGATGATGAAGATACCCC (SEQ ID NO.: 1) komplementárneho k oblasti GAL4TA v susedstve miesta inzercie cDNA pľúcnej knižnice, 52 bp od miesta EcoRI.

Porovnanie sekvencií so sekvenciami nachádzajúcimi sa v databankách GenBank a EMBL (European Molecular Biology Lab 36

Európske laboratórium molekulárnej biológie) ukázalo, že jeden z plazmidov takto identifikovaných obsahuje cDNA identickú s faktorom Ki identifikovaným ako autoantigén u pacientov trpiacich na lupus. Tento plazmid sa nazval pCM282. Tento plazmid, ak sa transformuje do kvasiniek spoločne s pCM199, je úplne schopný aktivovať svoje reportérové gény, ako je uvedené nižšie v tabuľke 1. Táto tabuľka navyše ukazuje, že aktivácia je špecifická, čo indikuje, že Ki je schopný špecificky interagovať s GAX.

Tabuľka 1

Vektory	Aktivita β-Gal
pCM199 + pGAD424	0
pCM199 + pCM282	+
pGBTIO + pCM282	0
pGBTIO + pGAD424	0

Príklad 4

Konštrukcia vektorov umožňujúcich expresiu fúzneho proteínu medzi rôznymi delečnými mutantmi GAX a DNA väzbovej domény GAL4 v kvasinkách

Tento príklad opisuje konštrukciu vektorov kódujúcich rôzne varianty proteínu GAX, ktoré sa môžu použiť na určenie závislosti funkcie na štruktúre tohto proteínu a predovšetkým na demonštráciu aktívnych domén a domén zodpovedných za interakciu s proteínom Ki.

Delécia aminokyselín C-koncovej časti 153 sa získa štiepením plazmidu pCM199 a Eagľ-Sall, potom sa odstráni malý fragment, konce sa doplnia (zatupia) opracovaním s Klenowovým enzýmom a degradujú. Plazmid takto získaný sa nazval pCM238. Kóduje proteín obsahujúci aminokyselinové zvyšky 1-104 z GAX.

Kompletné štiepenie pCM199 s BglII a Sali a potom degradácia vektora po opracovaní s Klenowovým enzýmom umožňuje zachovať prvých 32 aminokyselín z GAX. Plazmid takto získaný sa nazval pCM244. Kóduje proteín obsahujúci aminokyselinové zvyšky

1-32 z GAX.

Kompletné štiepenie pCM199 s BglII a Sali umožňuje izolovať fragment s veľkosťou približne 270 bp a 572 bp. Prvý fragment sa klonuje do pGBTll v mieste BamHI-SalI za vzniku plazmidu pCM245, ktorý umožňuje fúziu 79 aminokyselín C-koncovej časti s GAL4DB. Druhý fragment sa klonuje do pGBTIO do miesta BamHI za vzniku plazmidu pCM246, ktorý umožňuje fúziu aminokyselín 33 až 222 s GAL4DB.

Plazmid pCM280 sa získal štiepením pCM246 s DralII a Pstl. Po opracovaní s T4 polymerázou sa plazmid liguje sám so sebou. Kóduje proteín obsahujúci aminokyselinové zvyšky 33-63 z GAX.

Plazmid pCM199 je štiepený s Ndel a Pstl. Inzert sa klonuje do plazmidu pASI za vzniku plazmidu pCM301. Tento plazmid umožňuje expresiu proteínu GAX skráteného o týchto prvých 32 aminokyselín fúzovaných ku GAL4DB. Kóduje proteín zahrňujúci aminokyselinové zvyšky 33-302 z GAX.

Štruktúra fúznych proteínov exprimovaných týmito rôznymi vektormi je uvedená na obrázku 1.

Príklad 5

Lokalizácia zóny interakcie GAX s Kl

Kvasinkový genóm YCM79 sa transformoval rôznymi vektormi opísanými v príkladoch 1 a 4 súčasne ako pCM282 alebo ako pGAD424. β-Gal aktivita sa detegovala, ako je opísané v časti Materiál a metódy. Získané výsledky sú uvedené v nasledovnej tabuľke 2.

Tieto výsledky umožňujú definovať oblasť GAX, ktorá interaguje s faktorom Ki (tabuľka 2) . Skutočne, oblasti spôsobujúce stratu aktivity tým, že chýbajú, umožňujú urobiť záver, že sú nevyhnutné pre interakciu, ale nie sú postačujúce. Teda oblasti aminokyselín 1 až 32 a 104 až 223 sa zdajú dôležité pre interakciu s Ki. Fakt, že pCM238 nedáva pozitívny signál pre β-Gal, svedčí o tom, že existuje C-koncová oblasť 104-302 GAX, ktorá je nevyhnutná pre interakciu v kvasinkách.

Tabuľka 2

Vektory	Aktivita β-Gal
pCM199 + pGAD424	0
pCM199 + pCM282	+
pC238 + pGAD424	0
pCM238 + pCM282	0
pCM244 + pGAD424	0
pCM244 + pCM282	0
pCM245 + pGAD424	0
pCM245 + pCM282	0
pCM246 + pGAD424	0
pCM246 + pCM282	0
pCM280 + pGAD424	+
pCM280 + pCM282	+
pGBTIO + pCM282	0
pCM301 + pCM282	0

Príklad 6

Profil expresie mRNA v rôznych tkanivách a jadrová lokalizácia prechodne exprimovaného proteínu

Na identifikáciu partnerov GAX sa dvojitý hybridný kvasinkový kmeň, už obsahujúci plazmid umožňujúci expresiu fúzie GAL-GAX (1-302) ako nástrahy, transformoval plúcnou cDNA knižnicou fúzovanou ku GAL4TA, dostupnou v laboratóriu (príklad 2) . Pred amplifikáciou sme boli schopní získať viac ako 41 miliónov nezávislých klonov a iba 190 klonov, v ktorých sú exprimované tri selektovatelné gény (t.j. gén URA3, gén LacZ a gén BLE). Z týchto 190 klonov sa mohlo identifikovať 9 cDNA kódujúcich rôzne proteíny. Konkrétne nás zaujímali tie, ktoré kódujú Ki antigén.

Gén Ki sa zdá byť všadeprítomný, ako naznačuje analýza jeho expresie northern prenosom (obrázok 1) s použitím mRNA extrahovaných z rôznych tkanív (membrány s prenesenou mRNA ludských tkanív Multiple Tissue Northern Blots od firmy Clontech), ktorá detegovala mRNA s približnou veľkosťou 3 kb. Môže sa uviesť výskyt formy mRNA v srdci a kostrových svaloch s odlišnou formou maturácie (1,4 kb) .

Konštrukcie vektora umožňujúceho expresiu proteínu Ki fúzovaného so značkou HA v cicavčích bunkách sa uskutočňovala nasledovným spôsobom: fragment Ncol-Xhol z plazmidu pCM282 je vložený do plazmidu pASl na úrovni miest Ncol-Xhol za vzniku plazmidu pCM322. Ďalej je fragment EcoRI-Dral z plazmidu pCM322 vložený do expresného plazmidu pCDNA3 do miest EcoRI-EcoRV. Získaný plazmid pCM323 umožňuje expresiu proteínu Ki fúzovaného so značkou HA v cicavčích bunkách.

Nepriamou imunofluorescenciou je ukázané, že KiHA je lokalizovaný v jadre v bunkách transfekovaných touto chimérou (pozri obrázok 2).

Príklad 7

Expresia a purifikácia proteínu Ki fúzovaného so značkou S a značkou myc

Nasledovné oligonukleotidy sa spolu hybridizovali, fosforylovali a potom ligovali s pET29B dopredu naštiepeného s Ncol.

CATCAAGCTTATGGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGCAGCTTC (sekvencia SEQ ID NO.: 2)

CATGGATCCACGTGCAGGTCCTCCTCGGAGATCAGCTTCTGCTCCATAAGCTT (sekvencia SEQ ID NO.: 3)

Získaný plazmid s nazval pCM320. Gén kódujúci proteín Ki je amplif ikovaný pomocou PCR s oligonukleotidovými primérmi CGCGGATCCCATGGCCTCGTTGCTG (sekvencia SEQ ID NO.: 4) a GTAGAGCTCGAGTCAGTACAGAGTCTCTGC (sekvencia SEQ ID NO.: 5). Získaný fragment sa štiepi s BamHI-XhoI a potom sa po ligácii vloží do miest BamHI-XhoI plazmidu pBCks za vzniku plazmidu pCM305. Druhý uvedený je potom štiepený s BamHI-XhoI. Tým uvoľnený inzert je ligovaný do miesta BamHI a Xhol pCM320 za vzniku plazmidu pCM321. Expresia a purifikácia rekombinantného proteínu sa uskutočňujú podlá dodávateľových inštrukcií (Novagen) s použitím pCM321.

Príklad 8

Expresia a purifikácia proteínu GAX fúzovaného s GST

Kolónie BL-21 transformované plazmidom pGEX-2T-h-GAX sú predkultivované v 30 ml LB s ampicilínom (50 gg/ml) pri 37 ’C cez noc. 5 ml tejto kultúry sa kultivuje opäť v 500 ml LB s ampicilínom pri 37 °C, pokiaľ sa nedosiahne optická denzita 0,7 pri 600 nm. Expresia GST-GAX je indukovaná 0,1 mM IPTG 2 hodiny pri 30 °C. Kultúra sa stočí pri 6000 rpm 10 minút. Bakteriálne pelety sa resuspendujú v 10 ml chladného PBS a potom sa rozdelia do 10 skúmaviek Eppendorf. Bakteriálne proteíny sa extrahujú sonikáciou 10 minút s cyklami 12s a prestávkami 24s, s nasledovným stočením pri 15000 rpm 15 minút. Supernatanty sa spoja a vytvoria rozpustnú frakciu, ktorá sa použije na purifikáciu. Zvyšné pelety predstavujú nerozpustnú frakciu.

Purifikácia GAX sa uskutočňuje GST afinitnou metódou s agarózovými perličkami spojenými s glutationom.

Supernatant získaný po sonikácii baktérií sa inkubuje so živicou jednu hodinu na rotačnej trepačke pri teplote miestnosti. Ďalej sa živice, ku ktorým je naviazaný proteín, stočí pri 1000 rpm 10 minút. Ihneď po odstránení supernatantu sa živica 3x premyje s 50 ml PBS obsahujúcim 1% Triton X-100 20 minút na rotačnej trepačke. GST-GAX sa môže eluovať zo živice guanidiumtiokyanátom. Elúcia sa uskutočňuje l,5x objemom živice 2M guanidiniumtiokyanátom, 20 mM Tris pH 7,5, 0,15 M NaCl a 0,1% Triton X-100 na rotačnej trepačke 30 minút. Eluát sa dialyzuje proti PBS cez noc, aby sa odstránil guanidiniumtiokyanát. Proteín sa uskladní v PBS pri 4 °C. K proteínovému preparátu sa pridá 1/200 zmesi inhibítorov proteáz v rovnomernom množstve (Leupeptin 1 mg/ml, Pepstatin 1 mg/ml, Aprotinin 1 mg/ml, Benzamidin 500 mM).

Príklad 9

Interakcia in vitro medzi proteínmi Ki a GAX

Na štúdium interakcie medzi GAX a Ki in vitro sme vytvorili dva chimérické rekombinantné proteíny v Escherichia coli. GSTGAX sa purifikoval na živici spojenej s glutationom pomocou katalytického miesta glutation-S-transferázy (GST), SmycKi nesúci epitop myc a epitop S umožňujúci purifikáciu na živici spojenej s proteínom S.

Príslušné množstvá hovädzieho albumínu, proteínu GST alebo GST-GAX po štiepení trombínom (miesto vytvorené medzi GST a GAX), a tiež stúpajúcim množstvom GST-GAX, sa separovala na denaturačnom polyakrylamidovom géle a potom zafarbila Coomassie modrou (obrázok 3A).

Proteiny sa preniesli na nitrocelulózovú membránu z gélu totožného s gélom v oddiele A. Membrána sa inkubovala postupne v prítomnosti SmycKi, v roztoku obsahujúcom myšaciu monoklonálnu protilátku namierenú proti epitopu myc (Santa Cruz) a nakoniec roztoku na detekciu protilátok anti-myc.

Naše výsledky jasne ukazujú, že Ki špecificky rozpoznáva GST-GAX spôsobom závislým na dávke, zatiaľ čo u hovädzieho albumínu alebo GST sa nepozorovala žiadna reakcia. Treba poznamenať, že po štiepení s trombínom Ki stále interaguje s GAX (obrázok 3B).

Príklad 10

Konštrukcie vektorov umožňujúcich expresiu fúzneho proteínu medzi rôznymi delečnými mutantmi GAX a DNA väzbovej domény GAL4 v cicavčích bunkách

10.1) Konštrukcie plazmidových vektorov

Plazmidy pCM199 a pCM301 sú štiepené s HindlII. Inzerty sa klonujú v správnej orientácii do pCDNA3 (Invitrogen) do miesta HindlII za vzniku plazmidov pCM291 a pCM237, umožňujúcimi expresiu fúzie v cicavčích bunkách.

Plazmidy pCM238, pCM244, pCM301, pCM246 a pCM280 sú štiepené s HindlII a Nael. Inzerty sa klonujú v správnej orientácii do pCDNA3 (Invitrogen) do miesta HindlII-EcoRV za vzniku plazmidov pCM292, pCM326 pCM327, pCM294 a pCM295, umožňujúcimi expresiu fúzie v cicavčích bunkách.

10.2) Konštrukcie vírusových vektorov

Jeden aspekt vynálezu spočíva v konštrukcii a použití vírusových vektorov umožňujúcimi prenos a expresiu in vivo nukleových kyselín, ako sú definované vyššie.

Čo sa týka konkrétne adenovírusov, charakterizovali sa rôzne sérotypy, ktorých kultúra a vlastnosti sa trochu líšia. Medzi týmito sérotypmi je podlá predkladaného vynálezu výhodné použitie typ2 alebo typ5 ludského adenovírusu (Ad2 alebo Ad5) alebo adenovírusov zvieracieho pôvodu (pozri patentová prihláška WO94/26914). Z adenovírusov zvieracieho pôvodu, ktoré sa môžu použiť v rámci predkladaného vynálezu, sa môžu uviesť adenovírusy pôvodu psieho, hovädzieho, myšacieho (príklad: MAVI, Beard a kol., Virology 75, 81, 1990), ovčieho, prasacieho, vtáčieho alebo alternatívne opičieho (príklad: SAV). Výhodne je adenovírus CAV [napríklad kmeň Manhattan alebo A26/61 (ATCC VR800)] . Výhodne sú podlá predkladaného vynálezu použité adenovírusy ludského alebo psieho alebo zmiešaného pôvodu.

Neúplné adenovírusy podlá vynálezu výhodne zahrňujú ITR, sekvenciu umožňujúcu enkapsidáciu (zabalenie) a nukleovú kyselinu podlá vynálezu. Ešte výhodnejšie je v genóme adenovírusov vynálezu aspoň E1 oblasť nefunkčná. Uvažovaný vírusový gén sa môže znefunkčniť každou technikou známou odborníkom, konkrétne supresiou, substitúciou, čiastočnou deléciou alebo adíciou jednej, alebo viacerých báz v uvažovaných génoch. Takéto modifikácie sa môžu získať in vitro (na izolovanej DNA) alebo in situ, napríklad prostredníctvom techník genetického inžinierstva alebo alternatívne opracovaním mutagénnymi prípravkami. Ďalšie oblasti sa môžu modifikovať, tiež a to konkrétne oblasť E3 (pozri WO95/02697), E2 (WO94/28938), Ε4 /WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) a L5 (WO95/02697). Podľa výhodného uskutočnenia zahrňuje adenovírus podľa vynálezu deléciu v oblastiach E1 a E4. Podľa ďalšieho výhodného uskutočnenia zahrňuje deléciu v oblasti E1 na úrovni, do ktorej sú vložené oblasť E4 a nukleotidová sekvencia podľa predkladaného vynálezu (pozri FR94/13355). Vo vírusoch podľa vynálezu delécia v oblasti E1 výhodne zaujíma úsek nukleotidov 455 až 3329 na adenovírusovej sekvencii Ad5.

Neúplné rekombinantné adenovírusy podľa vynálezu môžu byť pripravené akoukoľvek technikou odborníkovi známou (Levrero a kol., Gene 101, 195, 1991, EP 185 573, Graham, EMBO J. 3, 2917, 1984) . Môžu sa konkrétne pripraviť homologickou rekombináciou medzi adenovírusom a plazmidom nesúcim inter alia nukleovú sekvenciu alebo kombináciou nukleových sekvencii vynálezu. Homologická rekombinácia nastáva po spoločnej transfekcii uvedeným adenovírusom a plazmidom do príslušnej bunkovej línie. Použitá bunková línia by mala byť výhodne (i) transformovateľná uvedenými prvkami a (ii) zahrňovať sekvencie schopné doplniť neúplnú časť adenovírusového genómu, výhodne v integrovanej forme, aby sa zabránilo riziku rekombinácie. Ako príklad bunkovej línie sa môže uviesť línia ľudských embryonálnych obličiek 293 (Graham a kol., J. Gen. Virol. 36, 59, 1977), ktorá obsahuje konkrétne ľavú časť genómu adenovírusu Ad5 (12%) integrovanú do svojho genómu alebo línie schopné doplniť funkcie E1 a E4, ako sú konkrétne opísané v prihláškach č. WO94/26914 a WO95/02697 alebo v Yeh a kol. (J. Virol. 7, 559, 1996). Ďalej, adenovirusy, ktoré sa namnožili, sa získajú späť a purifikujú zvyčajnými technikami molekulovej biológie.

Čo sa týka vírusov pridružených k adenovírusom (AAV), sú to DNA vírusy s relatívne malou veľkosťou, ktoré sa integrujú do genómu buniek, ktoré infikovali, stabilným a miestne špecifickým spôsobom. Sú schopné infikovať široké spektrum buniek bez vyvolania akéhokoľvek vplyvu na bunkový rast, morfológiu alebo diferenciáciu.’ Okrem toho sa zdá, že nie sú zapojené do patologických procesov u človeka. Genóm AAV sa klonoval, sekvenoval a charakterizoval. Zahŕňa približne 4700 báz a na každom konci obsahuje invertovanú koncovú repetíciu (inverted terminál repeat - ITR) približne s 145 bázami, slúžiacimi pre vírus ako počiatok replikácie. Zvyšok genómu je rozdelený do dvoch esenciálnych oblastí nesúcich funkcie pre enkapsidáciu: ľavá časť genómu, ktorá obsahuje gén rep zapojený do replikácie vírusu a expresie vírusových génov, pravá časť genómu, ktorá obsahuje gén cap kódujúci proteiny vírusového kapsidu.

Použitie vektorov pochádzajúcich z AAV na prenos génov in vitro a in vivo bol v odbornej literatúre už opísaný (pozri konkrétne WO91/18088, WO93/09239, US 4 797 368, US 5 139 941, EP 488 528) . Tieto uvedené prihlášky opisujú rôzne konštrukcie derivované z AAV, v ktorých sú odstránené gény rep a/alebo cap a sú nahradené požadovanými génmi, a ich použitie na prenos týchto génov in vitro (na bunky v tkanivovej kultúre) alebo in vivo (priamo do organizmu). Neúplné rekombinanty AAV podlá vynálezu sa môžu pripraviť spoločnou transfekciou do bunkovej línie infikovanej ľudským pomocným vírusom (helper vírus) (to môže byť napr. adenovirus), plazmidom obsahujúcim nukleovú kyselinu alebo kombináciu nukleových sekvencií vynálezu ohraničenú dvoma AAV enkapsidačnými génmi (gény rep a cap). Bunková línia, ktorá sa môže použiť, je napríklad línia 293. Ďalšie spôsoby prípravy sú opísané napríklad v prihláškach WO95/14771, WO95/13365,

WO95/13392 alebo WO95/06743. Vytvorené rekombinantné AAV sú potom purifikované zvyčajnými technikami.

Čo sa týka herpesvírusov a retrovírusov, konštrukcie rekombinantných vektorov sú široko opísané v literatúre: pozri konkrétne Breakfield a kol, New Biologist 3, 203, 1991, EP 453242, EP 178220, Bernstein a kol., Genet Eng. 7, 235, 1985,

McCormick, BioTechnology 3, 689, 1985 a pod. Retrovírusy sú konkrétne integratívne vírusy, ktoré selektívne infikujú deliace sa bunky. Preto tvoria vektory zaujímavé na použitie v prípade rakovinových ochorení. Genóm retrovírusov obsahuje esenciálne dve LTR, enkapsidačnú sekvenciu a tri kódujúce oblasti (gag, pol a env). V rekombinantných vektoroch pochádzajúcich z retrovírusov sú všeobecne gény gag, pol a env odstránené, úplne alebo čiastočne, a sú nahradené heterologickou sekvenciou nukleovej kyseliny. Tieto vektory sa môžu tvoriť z rôznych typov retrovírusov, ako je konkrétne MoMuLV (Moloney murine leukémia virus - vírus Moloneyovho myšacej leukémie, tiež nazvaný MoMLV), MSV (murine Moloney sarcoma virus - vírus myšacieho Moloneyovho sarkómu), HaSV (Harvey sarcoma virus - vírus Harveyovho sarkómu), SNV (spleen necrosis virus - nekrotický vírus sleziny), RSV (Rous sarcoma virus - vírus Rousovho sarkómu) alebo Friendov vírus. Na konštrukciu rekombinantných retrovírusov podía vynálezu, sa vytvorí plazmid obsahujúci konkrétne LTR, enkapsidačnú sekvenciu a uvedenú nukleovú sekvenciu a potom sa použije na transfekciu takzvanej enkapsidačnej bunkovej línie schopnej poskytnúť v plazmide neúplné retrovírusové funkcie pôsobiace v trans. Všeobecne sú enkapsidačné línie teda schopné exprimovať gény gag, pol a env. Takéto enkapsidačné línie sa opísali v predchádzajúcom stave techniky, konkrétne línia PA317 (SU 4 861 719), línia PsiCRIP (W090/02806) a línia GP+envAm-12 (W089/07150). Okrem toho môžu rekombinantné retrovírusy obsahovať modifikácie na úrovni LTR, aby potláčali transkripčnú aktivitu a tiež rozšírené enkapsidačné sekvencie obsahujúce časť génu gag (Bender a kol., J. Virol. 61, 1639, 1987). Vytvorené rekombinantné retrovírusy sú potom purifikované zvyčajnými technikami.

10.3) Chemické vektory

Nukleové kyseliny alebo opísané plazmidové expresné vektory v predchádzajúcich príkladoch sa môžu podávať ako také in vivo alebo ex vivo. Skutočne sa ukázalo, že samotné nukleové kyseliny môžu transformovať bunky. Ale aby sa zvýšila účinnosť prenosu, je výhodné použiť v rámci vynálezu prenosový vektor. Môže to byť vírusový vektor (príklad 9.2) alebo syntetický transfekčný prostriedok.

Zo všetkých vyvinutých syntetických vektorov je výhodné použiť v rámci vynálezu katiónové polyméry polylyzínového typu (LKLK)n, (LKKL)n, (PCT/FR/00098), polyetylénimín (WO96/02655) a dextrán-DEAE, alebo alternatívne katiónové lipidy alebo lipofektanty. Majú tú vlastnosť, že kondenzujú DNA a podporujú jej spojenie s bunkovou membránou. Ako príklad za všetky sa môžu uviesť lipopolyamíny (lipofektamín, transfektam, a pod.), rôzne katiónové alebo neutrálne lipidy (DOTMA, DOGS, DOPE, atď.) a tiež peptidy jadrového pôvodu.

Navyše sa vyvinula koncepcia cielenej transfekcie, sprostredkovanej receptorom, ktorá využíva princíp kondenzácie DNA na základe katiónového polyméru, za smerovania pripojenia komplexu k membráne následkom chemickej väzby medzi katiónovým polymérom a ligandom membránového receptora prítomného na povrchu bunkového typu, ktorý sa má transfekovať. Tak sa opísalo testovanie receptora pre transferín, pre inzulín alebo receptora pre asialoglykoproteíny hepatocytov. Príprava prostriedku podľa vynálezu s použitím takéhoto chemického vektora sa uskutočňuje podľa techník odborníkovi známych, všeobecne jednoducho tak, že sa rôzne zložky skontaktujú.

Príklad 11

Vývoj metódy umožňujúcej študovať transkripčnú aktivitu GAX

Na štúdium transkripčnej aktivity špecifickej pre fúzie GALDB-GX a tiež ich účinok na transkripčné aktivátory, ako je estrogénový receptor (ER) alebo kyslá aktivačná doména proteínu VP16 vírusu Herpex simplex fúzovaná k GALDB, sme použili prechodný transfekčný systém. Aby sa kvantifikovala transkripčná aktivita každého faktora alebo kombinácia niekoľkých faktorov, vytvorili sme cieľový (reportérový) gén exprimujúci bakteriálnu chloramfenikolacetyltransferázu (CAT) pod kontrolou umelého promótora. Tento promótor obsahuje TATA box, pochádzajúci z génu E1B adenovírusu Ad2 (E1B TATA), v protismere od miesta počiatku transkripcie génu CAT (obrázok 4A) . Proteín TBP komplexu TFIID rozpozná TATA box a umiestni preiniciačný komplex (TFIID + TFIIA,B,E,F), ktorý priťahuje RNA polymerázu typu II (Polil), ktorá iniciuje transkripciu génu CAT. V protismere tohto bazálneho promótora sme vložili GALDB väzbové miesto (17mér), ktoré sa rozpoznáva chimérami GALDB-GAX alebo GALDB-VP16. Tiež sme klonovali v protismere od 17méru estrogénový responzívny element (ERE), ku ktorému sa viaže ER, aby sa aktivovala transkripcia. Táto reportérová konštrukcia nám umožní študovať rôzne kombinácie, pričom následkom aktivácie alebo represie transkripcie je modifikácia množstva CAT v bunke. Na hodnotenie transkripčného účinku sa používa test enzýmovej aktivity CAT v bunkových extraktoch po transfekcii.

ER a GAL4-VP16 sú velmi silné transkripčné aktivátory. Aktivita CAT je ER zvýšená viac ako lOOx a GAL4-VP16 približne 85X. Následkom spoločnej expresie ER a GAL4-VP16 je aktivita CAT, ktorá je 300x vyššia ako aktivita neaktivovaného reportérového génu a väčšia ako súčet aktivity dvoch aktivátorov exprimovaných jednotlivo. To svedčí o tom, že ER a GAL4.VP16, napriek sterickým prekážkam, môžu obsadiť a aktivovať rovnaký promótor (obrázok 4B).

Príklad 12

Štúdium transkripčnej aktivity fúzie GALDB-GAX a identifikácia transkripčnej represorovej domény

Gén GAX človeka kóduje proteín zložený z 302 aminokyselín. Primárna štruktúra tohto proteínu odkrýva rôzne domény, ktorých funkcia zostáva neznáma. Homeobox je nevyhnutný pre replikáciu a pre väzbu týchto proteínov na špecifické sekvencie DNA prítomné v promótore cielových génov, ktorých expresiu kontrolujú. Doteraz sa neidentifikovala žiadna DNA sekvencia rozpoznávaná s GAX. GAX má oblasť bohatú na histidínové (HIS) zvyšky na svojej N-koncovej časti, ktorých funkcia zostáva neznáma.

Na porozumenie funkcie GAX sa odstránili rôzne oblasti ľudského génu GAX tak, aby sa vytvorili skrátené proteíny tak na ich N-koncovej ako aj na C-koncovej časti (obr. 5) . Čísla označujú pozíciu prvej a poslednej aminokyseliny každého delečného mutanta relatívne v celému proteínu GAX zahrňujúcemu aminokyseliny 1-302 (obr. 5). Nepoznajúc DNA sekvenciu, ktorá je prirodzene rozpoznávaná s GAX, sme tvorili chiméry medzi rôznymi delečnými mutantmi a heterologickou DNA väzbovou doménou (fúzovanou k jej N-koncovej časti) pochádzajúcej z kvasinkového transkripčného faktora GAL4 (GALDB). Na prechodnú expresiu rôznych chimér v kultivovaných cicavčích bunkách sa skonštruovali expresné vektory.

Rôzne chiméry GAL-GAX sa exprimovali samotné alebo v prítomnosti ER, aby sa mohol študovať ich účinok na bazálnu transkripciu a na transkripčnú aktivitu ER.

Celý GAX, v kontexte fúzie GAL-GAX1-302 znižuje viac ako 8x aktivitu CAT relatívne k neaktivovanému reportérovému génu. Táto represia je slabo ovplyvnená, ak chýba 36 aminokyselín na Nkoncovej časti GAX (GAL-GAX33-302), ale je kompletne zvýšená, ak ďalšia delécia potlačí C-koncovú časť GAX (GAL-GAX33-222) . Týchto 32 aminokyselín postačuje v kontexte GAL-GAX1-32 znížiť aktivitu CAT (obrázok 6A).

Následkom spoločnej expresie GAL-GAX1-302 a ER je aktivita CAT viac ako 25x nižšia ako v prípade expresie samotného ER. Táto represia, ako v prípade A, je spôsobená prvými 32 aminokyselinami GAX (porovnaj GAL-GAX1-302, GAL-GAX33-302 a GALGAX33-222). Týchto 32 aminokyselín N-koncovej časti (GAL-GAXl32) znižuje aktivitu ER iba dvakrát (porovnaj GAL-GAX1-32, GAL50

GAX1-104) na pre maximálnu aktivitu vyžaduje prítomnosť aminokyselinových zvyškov 33 až 222 (obrázok 6B) .

Týmto spôsobom sú hľadané sekvencie spôsobujúce svojou neprítomnosťou stratu aktivity, čo umožňuje uvažovať, že sú nutné pre interakciu, ale nie sú postačujúce.

Predkladané výsledky ukazujú, že GAX potláča transkripciu použitého reportérového génu. Táto represia je esenciálne spôsobená peptidom N-koncovej časti (aminokyseliny 1 až 32), ktorého optimálna aktivita vyžaduje prítomnosť úseku aminokyselín 33 až 222 GAX a výhodne prítomnosť oblasti aminokyselín 33 až 104 GAX.

S použitím rôznych delécií GAX fúzovaných k DNA väzbovej doméne GAX sme boli schopní v kvasinkách identifikovať (dvojitým hybridným systémom, pozri príklad 5) oblasti GAX, ktoré sú dôležité pre interakcie s Ki. Je to N-koncová časť až k zvyšku 222. Táto oblasť obsahuje, ako sme už dokázali vyššie, represorovú doménu GAX.

Príklad 13

Interakcia in vitro medzi GAX a PCNA

13.1) Klonovanie cDNA ľudského jadrového antigénu proliferujúcej bunky (PCNA, Proliferating Celí Nuclear Antigén) a vytvorenie rekombinantného proteínu.

Klonovanie cDNA PCNA sa uskutočňovalo reverznou transkripciou a následnou PCR. Prvý krok reverznej transkripcie (RT) sa uskutočňuje s použitím súpravy First Strand cDNA synthesis od firmu Pharmacia. Celková RNA sa extrahuje z primárnej kultúry buniek ľudského hladkého svalstva (Clonetics) podľa metódy opísanej autormi P. Chromczynski a N. Sacchi (Anál. Biochem. 162, 156-159, 1987). 10 gg tejto celkovej RNA sa prenesie do 20 μΐ vody, zahreje sa 10 minút pri 65 °C, ochladí na lade a potom sa zmieša s 11 μΐ reakčnej zmesi Bulk First Strand zo súpravy RT (Cloned, FPLCpure®, myšacia reverzná transkriptáza, RNase/DNase-Free BSA, dATP, dCTP, dGTP a dTTP), 1 μΐ DTT a 1 μΐ primérov pD(N)6- Reakcia RT sa inkubuje 1 hodinu pri 37 °C, zastaví sa zahriatím pri 90 °C a potom sa ochladí a lade. Druhý krok spočíva v amplifikácii cDNA PCNA pomocou PCR. Použité oligonukleotidové priméry pre reakciu PCR sú nasledovné:

1: 5' -CGCGgaattcTGTTCGAGGCGCGCCTGGTCCAGG-3'

FEARLVQG : 5' -GGTCgaatccTAAGATCCTTCTTCATCCTCGATC-3' *SGEEDEIK

Tieto dva priméry vnášajú miesto EcoRI (malé podčiarknuté písmena) . Aminokyseliny PCNA nachádzajúce sa v priméroch sú predstavované ich kódom (veľké písmena) pod zodpovedajúcimi kodónmi. * predstavuje stop kodón μΐ reakcie RT opísanej vyššie sa upraví na konečný objem 50 μΐ obsahujúci nasledovné konečné množstvá alebo koncentrácie: 50 pM priméru 2, jedna jednotka Taq DNA polymeráza (Perkin Elmer) , 5 μΐ MgCl2 (25 mM), 2 μΐ zmesi 4 deoxynukleotidov (dATP, dCTP, dGTP a dTTP) a 5 μΐ lOx koncentrovaného pufru pre PCR (Perkin Elmer). Amplifikácia PCR sa uskutočňuje v skúmavkách Micoamp™ (Perkin Elmer) pomocou termocyklera PTC-100™ (MJ research, Inc.). Táto amplifikácia spočíva z denaturačného kroku 2 minúty pri 95 °C nasledovaného 30 cyklami, ktoré obsahujú denaturáciu 15 sekúnd pri 95 °C, nasadanie primérov 30 sekúnd pri 55 ’C a extenziu 1 minútu pri 72 °C. Týchto 30 cyklov je nasledovaných (ďalšími 5 minútami extenzie a potom sa reakcie PCR uchovávajú pri 10 ’C.

Vlastné klonovanie PCNA do vektora pCRII (Invitrogen) sa uskutočňuje s Originál TA Cloning® Kit (Invitrogen) . 3 μΐ produktu PCR, 1 μΐ lOx ligačného pufru, 2 μΐ vektora pCRII (25 ng/μΐ) , 3 μΐ vody a 1 μΐ T4 DNA ligázy sa inkubujú 16 hodín pri 16 °C. 2 μΐ tejto ligačnej reakcie sa použije na transformáciu kompetentných baktérií TG1, ako už bolo opísané vyššie. Baktérie sa potom pestujú 16 hodín pri 37 °C na pevnom LB médiu obsahujúcom 1,5% agar, 100 μg/ml ampicilín v prítomnosti X-gal pre modrobielu selekciu rekombinantných klonov (alfa komplementácia β-galaktozidázy)

Rekombinantné klony (biele kolónie) sa prenesú do 10 μΐ vody a preveria sa pomocou PCR pri rovnakých podmienkach ako PCR na reakciu RT opísaných vyššie, okrem toho, že sa k reakcii pridá Triton X-100 do konečnej koncentrácie 0,01% v/v.

Niekoľko pozitívnych klonov sa použije na minipreparácie DNA, a tie, v ktorých je 5'-koncová časť inzertu PCNA umiestnená v smere čítania od miesta EcoRV z pCRII, sa sekvenujú a uchovávajú pre nasledovné klonovanie.

Klonovanie PCNA do plazmidu pET29 sa uskutočňuje nasledovným spôsobom: PCNA fragment EcoRV-HindlII pochádzajúci z pCRII-PCNA je vložený do miest EcoRV-HindlII pET-29. Tento plazmid sa potom použije na produkciu chimérického rekombinantného proteínu S-PCNA. Kroky transformácie, produkcie a purifikácia S-PCNA sú totožné s krokmi použitými na produkciu antigénu Ki fúzovaného s epitopom myc.

13.2) Štúdium interakcie GAX s PCNA in vitro

Táto štúdia sa uskutočňovala podľa rovnakej metódy použitej v príklade 9 na študovanie interakcie medzi rekombinantnými proteínmi GST-GAX a SmycKi. Stúpajúce množstvo rekombinantného

GST a chiméry GST-GAX (50, 250, 500 a 750 ng) sa separovali na 14% denaturačnom polyakrylamidovom géle (Novex) . Proteíny sa prenesú z gélu na nitrocelulózovú membránu, táto membrána sa potom inkubuje v roztoku obsahujúcom rekombinantný proteín S-PCNA, potom nasleduje imunologické značenie PCNA pomocou monoklonálnej protilátky anti-PCNA (Santa Cruz).

Obrázok 7 ukazuje slabú interakciu medzi GST a PCNA iba vo vysokých dávkach GST (500 a 750 ng) . Afinita GST-GAX k PCNA je podstatne vyššia ako afinita GST.

Táto špecifická interakcia medzi GAX a PCNA svedčí o tom, že antiproliferačná aktivita GAX je sprostredkovaná sekvestráciou (maskovaním) PCNA. Fakt, že Ki môže interagovať tak s GAX ako aj s PCNA, je na prospech tvorby dvoj- alebo trojdielnych komplexov, ktoré môžu hrať hlavnú úlohu (aktiváciu alebo inhibíciu) v bunkovom cykle.

ZOZNAM SEKVENCIÍ (2) Informácia o sekvencií SEQ ID NO: 1:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 23 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: nie (iv) opačná orientácia: nie (xi) opis sekvencie SEQ ID NO.: 1:

CTATTCGATG ATGAAGATAC CCC 23 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 2:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 50 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: nie (iv) opačná orientácia: nie (xi) opis sekvencie SEQ ID NO.: 2:

CATCAAGCTT ATGGAGCAGA AGCTGATCTC CGAGGAGGAC CTGCAGCTTC (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 3:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 53 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: nie (iv) opačná orientácia: nie (xi) opis sekvencie SEQ ID NO.: 3:

CATGGATCCA CGTGCAGGTC CTCCTCGGAG ATCAGCTTCT GCTCCATAAG CTT (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 4:

(i) charakteristika sekvencie:

	(A)	dĺžka: 25 bázových párov
	(B)	typ: nukleová kyselina
	(C)	typ vlákna: jednoduché
	(D)	topológia: lineárna
(ii)	typ	molekuly: cDNA
(iii)	i hypotetická: nie

(iv) opačná orientácia: nie (xi) opis sekvencie SEQ ID NO.: 4:

CGCGGATCCC ATGGCCTCGT TGCTG (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 5:

(i) charakteristika sekvencie:

	(A) dĺžka: 30 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna
(ii)	typ	molekuly: cDNA
(iii)	hypotetická: nie

(iv) opačná orientácia: nie (xi) opis sekvencie SEQ ID NO.: 5:

GTAGAGCTCG AGTCAGTACA GAGTCTCTGC 30 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 6:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 30 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: nie (iv) opačná orientácia: nie (xi) opis sekvencie SEQ ID NO.: 6:

GAGCGAATTC ATGACCATGA CCCTTCACAC (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 7:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 30 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: nie (iv) opačná orientácia: nie (xi) opis sekvencie SEQ ID NO.: 7:

GAGCGAATTC ACTGATCGTG TTGGGGAAGC (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 8:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 60 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: nie (iv) opačná orientácia: nie (xi) opis sekvencie SEQ ID NO.: 8:

TCGAGAGGTC ATATTGACCT AAGCTTCGGG TCGGAGTACT GTCCTCCGAC TGCCATATGT

CTCCAG TATAACTGGA TTCGAAGCCC AGCCTCATGA CAGGAGGCTG ACGGTATACAGATC

Claims (16)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polypeptid, ktorý je fragmentom ludského proteínu GAX obsahujúcim minimálne aminokyselinové zvyšky 1 až 32 proteínu GAX a ktorý prejavuje transkripčnú represorovú aktivitu a/alebo pozitívne či negatívne ovplyvňuje replikáciu DNA.

   »
2. 2. Polypeptid podľa nároku 1, ktorý obsahuje ďalej minimálne * aminokyselinové zvyšky 140 až 230 ľudského proteínu GAX.
3. 3. Polypeptid, ktorý obsahuje minimálne jeden fragment vybraný z fragmentov zahrňujúcich úseky aminokyselín 1 až 32, 33 až 302 a 1 až 104 ludského proteínu GAX, a prejavuje transkripčnú represorovú aktivitu a/alebo pozitívne či negatívne ovplyvňuje replikáciu DNA.
4. 4. Polypeptid, ktorý obsahuje minimálne jeden fragment vybraný z fragmentov zahrňujúcich úseky aminokyselín 1 až 32 a 104 až * 223 proteínu GAX a ktorý je schopný interakcie s proteínom Ki.

   a

   5. Polypeptid podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, ktorý je schopný interakcie s PCNA. 6. Polypeptid podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, ktorý je schopný interakcie s Ki a/alebo PCNA a ktorý tvorí s týmito

   proteínmi aspoň dvojzložkový alebo aspoň trojzložkový komplex.
5. 7. Polypeptid, ktorý obsahuje okrem fragmentu proteínu GAX, ktorý prejavuje transkripčnú represorovú aktivitu tiež aspoň jeden fragment iného pôvodu.
6. 8. Polypeptid podlá nároku 7, kde fragment iného pôvodu má biologickú aktivitu alebo je to marker alebo zacieľovací element.
7. 9. Nukleová kyselina, ktorá kóduje polypeptid podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7.
8. 10. Nukleová kyselina podľa nároku 9, ktorá je cDNA.
9. 11. Expresná kazeta, ktorá obsahuje nukleovú kyselinu podľa nároku 9 alebo 10 riadenú promótorom.
10. 12. Expresný vektor, ktorý obsahuje nukleovú kyselinu podľa nároku 9 alebo 10 alebo expresnú kazetu podľa nároku 11.

    Vektor podľa

    Vektor podľa

    Vektor podľa nároku 12, nároku 13, nároku 13, ktorý je vírusový vektor.

    ktorý je adenovírus.

    ktorý je retrovírus.
11. 16. Použitie polypeptidu podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 na represiu transkripcie génov a/alebo na pozitívne či negatívne ovplyvnenie replikácie DNA.
12. 17. Použitie zlúčenín inhibujúcich aktivitu proteínu Ki a/alebo PCNA na získanie liečiva určeného na inhibíciu proliferácie buniek hladkého svalstva.
13. 18. Použitie polypeptidu podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 na vytvorenie dvojzložkového alebo trojzložkového komplexu s proteínom Ki a/alebo PCNA a na pozitívne či negatívne ovplyvnenie priebehu bunkového cyklu.
14. 19. Farmaceutický prípravok vyznačujúci sa tým, že obsahuje aspoň jeden polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 alebo vektor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 12 až 15.
15. 20. Spôsob vyhľadávania a/alebo identifikácie polypeptidu interagujúceho s proteínom GAX alebo doménou proteínu GAX, vyznačujúci sa tým, že sa použije polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7.
16. 21. Spôsob podlá nároku 20 vyznačujúci sa tým, že sa polypeptid vyberie z fragmentov zahrňujúcich aminokyselinové zvyšky 1 až 32 a 33 až 302 proteínu GAX.