EA003694B1 - Полипептиды, содержащие домены протеина gax, участвующие в подавлении транскрипции и/или взаимодействующие с другими протеинами, соответствующие нуклеиновые кислоты и их применение - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, включающим домены GAX, участвующие в биологической активности GAX. Это могут быть, в частности, домены, участвующие во взаимодействии GAX с другими молекулами, или домены, участвующие в биологической активности. Изобретение также относится к химерным молекулам, содержащим функциональный домен GAX. Оно также относится к применению GAX для подавления экспрессии генов, а также к применению соединений-ингибиторов взаимодействия GAX с некоторыми клеточными партнерами для изменения активности GAX. Оно также относится к методу просеивания и/или определения клеточных партнеров GAX.

Description

Настоящее изобретение относится к области терапии. В частности, оно относится к новым терапевтическим молекулам и к их применению для лечения сердечно-сосудистых патологий.

Постангиопластический рестеноз является локализованным гиперпролиферативным нарушением, которое развивается вследствие нехирургического вмешательства на уровне атеросклеротических бляшек. Таким образом, следствием лечения атеросклероза ангиопластикой очень часто (до 50% случаев согласно некоторым исследованиям) является рестеноз, возникающий в результате механического повреждения стенок артерий.

Пролиферация гладких мышечных клеток (ГМК) в стенках сосудов является ключевым явлением в развитии атеросклероза, в постангиопластическом рестенозе, а также в неудачах при коронарном шунтировании. В норме ГМК стенок сосудов находятся в состоянии покоя, но в результате повреждения сосудистого эндотелия они оказываются в контакте с кровяными факторами роста. В отличие от кардиомиоцитов и клеток скелетных мышц, ГМК могут, в ответ на действие различных факторов роста, подвергаться дедифференцировке и снова вступать в цикл пролиферации. Эти фенотипические изменения ГМК происходят в результате глубоких изменений на уровне экспрессии множества генов. Так, например, экспрессия ранних генов, участвующих в пролиферации клеток, таких как с-Гок или с-тус, существенно возрастает, в то время как экспрессия других структурных генов, таких как ГИК-специфичного альфаактина, а также некоторых изоформ миозина подвергается отрицательной регуляции.

Несмотря на то, что ясно показана роль факторов транскрипции, т.н. миогенных, таких как Муо-Ό, в конечной дифференцировке клеток скелетных мышц, в настоящее время известна лишь незначительная часть факторов, участвующих в обратимой дифференцировке ГМК. Недавние исследования выявили наличие факторов транскрипции, имеющих гомеобокс в различных тканях сердечно-сосудистой системы. Такие факторы распознают, благодаря своим гомеобоксам, специфические последовательности ДНК в промоторных участках соответствующих генов и таким образом могут участвовать в регуляции клеточной дифференцировки, пролиферации или миграции клеток. Экспрессия одного из этих факторов, дах (Сго\\И1-Лггс51-8рсс|Пс НотеоЬох), осуществляется в различных тканях сердечно-сосудистой системы, в т.ч. в ГМК стенок сосудов. Ген дах изначально был идентифицирован в банке кДНК аорты крысы. Он кодирует протеин из 303 аминокислот. Была определена его последовательность и клонирована его кДНК (Согкк1 и др., Мо1. Се11. Вю1. 1993, 6, 3722-3733). Ген дах человека также был клонирован и секвенирован (Эау1б Р. Ье Раде и др., Сепоткк 1994, 24, 535

540). Он кодирует протеин из 302 аминокислот. Ген дах обладает некоторыми свойствами, близкими к таковым генов дак и Сабб, поскольку он также, по-видимому, контролирует переход С0/С1 клеточного цикла. Так, уровень мРНК дах сокращается в ГМК сосудов крысы в 10 раз после 2 ч контакта с ΡΌΟΡ (Согкк1 и др., Мо1. Се11. Вю1. 1993, 6, 3722-3733). Экспрессия гена дах, таким образом, подавляется в ходе митогенного ответа ГМК сосудов. Другая особенность гена дах заключается в специфичности экспрессии. Так, у взрослой крысы экспрессия гена дах осуществляется исключительно в сердечно-сосудистой системе (аорта, сердце). Ыог1йегп В1о1 не обнаруживал мРНК в печени, в мозге, в желудке и в скелетных мышцах. С другой стороны, ген дах принадлежит к семейству гомеотических генов. Эти гены кодируют факторы транскрипции, которые содержат консенсусные последовательности (или гомеодомены), распознающие специфические участки ДНК (или гомеобоксы) (Сейппд и др., Се11. 78: 211223, 1994). Гомеодомен протеина дах крысы расположен между аминокислотами 185 и 245. Интересен тот факт, что гомеотические гены, определенные на данный момент, участвуют в контроле дифференцировки/роста клеток в ходе эмбриогенеза; это увеличивает терапевтический потенциал гена дах (Ьа^гепсе и Мога1а Се11 78: 181-189, 1994; Кгит1аиР, Се11 78: 191-201, 1994).

Одной из особенностей САХ является то, что он подвергается отрицательной регуляции с момента начала пролиферации ГМК как ίη уйго в виде ответа на действие факторов роста, так и ίη νί\Ό. вследствие повреждения эндотелия стенок сосудов. Эта репрессия является обратимой, поскольку, когда ГМК возвращаются в состояние покоя в отсутствие поступления сыворотки, ίη νίίΐΌ, экспрессия САХ возобновляется. В результатах работ нашей лаборатории недавно было показано, что суперэкспрессия САХ в ГМК с помощью аденовирусного вектора блокирует их пролиферацию РР. 95/04234 (8Т95022).

Постангиопластический рестеноз, развивающийся в результате механических повреждений, представляет собой наиболее частую причину неудач таких операций (по некоторым данным, 50% случаев). Поскольку ключевую роль здесь играет пролиферация ГМК, ген дах является, благодаря своей роли регулятора пролиферации, отличным терапевтическим геном, подходящим для превентивной обработки стенок сосудов после проведения ангиопластики (РР 95/04234 (8Т95022)).

Однако механизм действия САХ остается пока слабо задокументирован. Остается определить последовательности ДНК, на которые воздействует гомеобокс САХ. Кроме того, пока не проведены исследования функции различных участков САХ. Наконец, важным разделом ис следований является определение функциональных партнеров САХ, что позволило бы определить молекулярный каскад, от которого зависит САХ, или источником которого он является.

В настоящем изобретении была поставлена задача собрать необходимую информацию на этот счет.

В ходе этой работы были использованы различные аналитические подходы для определения молекул, взаимодействующих с САХ, для того, чтобы определить домен САХ, ответственный за это взаимодействие, и чтобы изучить значение различных доменов в функциях САХ. Для этого использовали двойную гибридную систему, полученную на основе банка легкого человека, чтобы выявить протеины, взаимодействующие с САХ.

Такой подход позволил определить различные молекулы, одна из которых, антиген Κι, представляет особый интерес. Антиген Κι представляет собой протеин (примерно, 32 кДа). Впервые он был определен как ядерный аутоантиген, распознаваемый элементами сыворотки, выделенной от больных эритематозной красной волчанкой (ΝίΚαίάο и др., 1989, С1ш. Ехр. 1ттиηοΐ. 1990, 79, 209-214). Недавние работы показали, что суперэкспрессия Κι происходит в клетках, находящихся на стадии пролиферации или трансформированных каким-либо онкогеном (ΝίΚαίάο и др., 1989, Ехр. Се11 Век. 1989, 182, 284-289). Эксперименты по соиммунопреципитации (ТакеикЫ и др., аЬ81гас! 1995 1ип1епйо Ишуегайу, Токуо, 1арап) показали, что Κι существует в виде комплекса, который он образует с РСВД, маркером пролиферации (А1тепйга1 и др., 1987, Ргос. Асай. 8ά. И8А, 84, 15751579).

Функцию САХ также изучали в опытах по транзитной трансфекции клеток млекопитающих, используя САХ, слитый с доменом связывания с гетерологичной ДНК, и генную систему-репортер, позволяющую получать информацию о транскрипционной активности САХ после делеции в различных участках молекулы. Таким образом было показано, что САХ действует главным образом как репрессор транскрипции. Такое действие связано, в частности, с 32 первыми аминокислотами САХ. Кроме того, этот репрессорный домен находится в участке (1-222) САХ, ответственном за взаимодействие с Κι в дрожжах. Возможное использование репрессорного характера САХ и его взаимодействие с Κι будут описаны далее.

Таким образом, в своем первом аспекте изобретение относится к фрагментам протеина САХ, обладающим биологическими свойствами.

В другом аспекте изобретение относится к доменам САХ, участвующим в биологической активности САХ. Это могут, например, быть домены, участвующие во взаимодействии САХ с другими молекулами, или домены, отвечающие за биологическую активность. Изобретение также относится к химерным молекулам, включающим в себя функциональный домен САХ. Оно также относится к применению САХ для подавления экспрессии генов, а также к применению соединений, ингибирующих взаимодействие САХ с некоторыми клеточными партнерами для управления активностью САХ. Оно также относится к методу просеивания и/или идентификации клеточных партнеров САХ.

Как указано выше, ген дах обладает выгодными свойствами, требуемыми для применения в генной терапии гиперпролиферативных нарушений, в частности, рестеноза и других патологий, связанных с пролиферацией ГМК. В заявке ЕВ 95/04234 (8Т95022) было показано, что перенос гена дах ίη у1уо позволяет существенно уменьшить пролиферацию ТМК и таким образом ингибировать сужение диаметра сосудов. В заявке ЕВ 95/12871 (8Т95057) было также показано, что ген дах при его экспрессии в опухолевых клетках препятствует трансформации клеток. Эти данные демонстрируют терапевтический потенциал гена дах.

В настоящей заявке описывается определение функциональных доменов САХ, конструкция производных САХ, обладающих биологической активностью, определение партнеров протеина САХ и осуществление методов, позволяющих находить других партнеров и определять соединения, способные оказывать воздействие на активность этих партнеров. В частности, заявителем показано, что протеин САХ действует как репрессор транскрипции. Также показано, что эта активность связана с определенными участками протеина САХ, в частности, с Ν-концевым участком. Кроме этого, результаты, представленные в примерах, показывают, что функциональные домены САХ участвуют также во взаимодействиях САХ с клеточным протеином Κι. Из литературных источников известно, что Κί взаимодействует с РСNА (ТакеикЫ и др., айк1гас1 1995 ЛпИепйо ип1уег511у, Токуо, 1арап) и что этот последний является кофактором ДНК-полимер азы, необходимым для репликации ДНК (Еикийа и др. 1995, 1. Вю1. СНет. 270, 22527-22534). В примерах показано, что САХ взаимодействует с РСNА, поэтому желательно, чтобы САХ мог также входить в состав репликационных комплексов клетки.

Первый объект изобретения относится, в частности, к полипептиду, отличающемуся тем, что он представляет собой, полностью или частично, фрагмент протеина САХ, обладающий репрессорной активностью в отношении транскрипции и/или оказывающий позитивное или негативное влияние на репликацию ДНК.

Предпочтительно полипептид по изобретению содержит, по меньшей мере, остатки 1-32 протеина САХ человека.

Согласно другому способу осуществления полипептид по изобретению содержит, по меньшей мере, остатки 104-230 протеина САХ человека.

В качестве частных примеров полипептидов по изобретению можно назвать полипептиды, содержащие фрагменты 1-32, 33-302 и 1-104 протеина САХ человека. Дальнейшие примеры показывают, что такие полипептиды способны ингибировать транскрипцию генов и, следовательно, сохраняют присущие САХ свойства репрессора транскрипции.

Предпочтительно этот полипептид содержит кроме фрагмента протеина САХ по изобретению также фрагмент другого происхождения. Под фрагментом другого происхождения подразумевают полипептидный фрагмент, полученный не из протеина САХ. Это может быть синтетический, искусственный фрагмент, фрагмент протеина и т.д. Этот фрагмент другого происхождения может выполнять различные функции.

Например, он может являться маркером, позволяющим обнаруживать полипептид и, возможно, перемещать его ίη νίνο. Таким маркером может быть, например, эпитоп, узнаваемый моноклональными антителами. Для этого могут применяться описанные в литературе и обычно используемые маркерные последовательности, т.н. последовательности Тад. Можно указать последовательность 1ад-шуе.

Этим фрагментом также может быть фрагмент со стабилизирующими свойствами. В этом качестве можно использовать протеин с большим периодом полужизни в плазмиде или его часть.

Наконец, это может быть элемент распознавания мишени, позволяющий полипептиду быстрее и/или более избирательно попадать в особые компартменты клетки. Предпочтительно таким элементом является сигнал ядерной локализации (ΝΤ8), полипептид, чье действие осуществляется, главным образом, в ядре клетки. В литературе описаны различные сигналы ΝΤ8, например, сигнал антигена Т вируса 8У 40 сигнал р53 и т.д.

Фрагмент другого происхождения может, кроме того, придавать полипептиду свойства, соответствующие какой-либо дополнительной биологической функции, или усиливать активность репрессорного домена. В качестве особенно предпочтительного примера можно назвать протеинный домен, способный специфически связывать ДНК. Этот тип химерной молекулы позволяет, таким образом, связывать ДНК в особых участках и ингибировать транскрипцию генов, расположенных в этих участках. В качестве особого примера можно назвать домен связывания с ДНК дрожжевого протеина САЬ4. Такие конструкции описаны в примерах. Они могут быть использованы для регуляции экспрессии генов у дрожжей или генов, контроли руемых сигналом экспрессии, включающим сайт связывания протеина САТ4. Другими протеинными доменами связывания с ДНК могут быть, например, Ьех А, домен связывания с ДНК ядерного рецептора, такого как рецептор эстрогена, или любой другой, относящийся к этому семейству и т.д. Это также может быть пептид, осуществляющий, с одной стороны, секрецию САХ или его части, а также его целенаправленный транспорт к мембранным рецепторам, которые осуществляют его интернализацию, увеличивая таким образом его способность к диффузии и область активности САХ, за счет эффекта «Вук1апйег». В этом качестве можно, в частности, использовать трансферин или его часть, или фрагмент молекулы внеклеточного матрикса, который может распознавать интегрины на поверхности ГМК.

Полипептиды по изобретению представляют особый интерес в терапевтическом плане и в плане прикладных исследований.

Терапевтическая активность заявляемых полипептидов связана, в частности, с их способностью к подавлению транскрипции или к влиянию на репликацию ДНК, по аналогии с протеином САХ, и, следовательно, с их способностью к регуляции экспрессии других протеинов.

В силу сказанного в настоящем изобретении рассматривается возможность применения протеина САХ или такого фрагмента, как указано выше, для подавления транскрипции гена и/или осуществления положительной или отрицательной регуляции репликации ДНК.

В силу того что их действие аналогично действию протеина САХ, они могут быть использованы вместо него для подавления транскрипции. С другой стороны, поскольку они включают в себя, полностью или частично, только тот домен протеина САХ, который отвечает за подавление транскрипции, можно предположить, что они будут менее чувствительны к различным воздействиям, которым подвергается протеин САХ. Таким образом, эти протеины или их производные могут сильнее проявлять репрессорные свойства в отношении транскрипции, чем натуральный протеин САХ.

Их можно также использовать для выявления новых партнеров САХ. В этой связи объектом настоящего изобретения также является способ просеивания и/или идентификации полипептидов, взаимодействующих с протеином САХ или с доменом САХ, отличающийся тем, что в нем используют полипептид по изобретению. Предпочтительно, этот полипептид выбирают из фрагментов 1-32 и 33-302 протеина САХ.

При этом заявитель неожиданно обнаружил, что домен протеина САХ может специфически взаимодействовать с другим клеточным протеином, протеином Κί. Как было сказано выше, Κί является аутоантигеном, появляю003694 щимся в случае аутоиммунных заболеваний, таких как эритематозная красная волчанка. Он описан как ядерная молекула, экспрессия которой возрастает в ходе пролиферации клеток, а также в фибробластах, измененных каким-либо онкогеном.

Нам удалось показать, что в дрожжах Ν’концевая часть ОЛХ отвечает за взаимодействие с Κι. Рекомбинантный протеин Κι специфически узнает ОЛХ, перенесенный из полиакриламидного денатурирующего геля на фильтр из нитроцеллюлозы.

Настоящее изобретение также относится в числе прочего к полипептиду, отличающемуся тем, что он представляет собой фрагмент протеина ОЛХ, способный взаимодействовать с протеином Κι.

Таким фрагментом является, предпочтительно, фрагмент 1-32 или 104-223 протеина ОЛХ.

Также заявителем было показано, что один из доменов протеина ОАХ может специфически взаимодействовать с маркером пролиферации ΡΟΝΑ (РгоШегаНид Се11 М.1с1еаг Апйдеи). Этот фактор необходим для репликации ДНК, а также играет роль в явлениях восстановления ДНК.

Таким образом, настоящее изобретение относится к полипептиду, отличающемуся тем, что он представляет собой фрагмент протеина ОАХ, способный взаимодействовать с ΡСNА.

С другой стороны в литературе отмечается, что Κι существует в виде комплекса с ΡСNА. Κι может, таким образом, взаимодействовать одновременно с ОАХ и ΡСNА, образуя, по меньшей мере, двухчастный комплекс с тем или другим из этих протеинов и предпочтительно трехчастный комплекс. Образование этих комплексов играет важную роль в развитии клеточного цикла (активирование или ингибирование).

Таким образом, в настоящем изобретении рассматривается также полипептид, отличающийся тем, что он представляет собой фрагмент протеина ОАХ, способный взаимодействовать с Κι и/или ΡСNА и образовывать, по меньшей мере, двухчастный или, по меньшей мере, трехчастный комплекс с этими протеинами.

Другой объект настоящего изобретения относится к любой нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, описанный выше. Это могут быть последовательности натурального или искусственного происхождения и, в частности, геномная ДНК, кДНК, мРНК, гибридные последовательности, или синтетические, или полусинтетические последовательности. Эта нуклеиновая кислота может происходить от человека, животного, растения, бактерии, вируса и т.д. Она может быть получена любым известным специалисту способом, в частности, просеиванием банков, химическим синтезом или смешанными методами, включающими химическое или энзиматическое изменение последовательностей, полученных просеиванием банков.

Они могут быть встроены в векторы, такие как плазмидные векторы.

Предпочтение отдают кДНК.

Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть использованы для получения зондов или антисмысловых молекул, позволяющих путем гибридизации обнаружить присутствие или экспрессию нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, которые содержат репрессорные домены по изобретению, или ингибировать экспрессию таких полипептидов. Зонды включают в себя, предпочтительно, более 10 оснований, лучше всего, от 10 до 300 оснований.

Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть использованы для экспрессии и/или получения полипептидов ίη νίνο, ίη νίίτο или ех νίνο для целей генной или клеточной терапии.

Таким образом, изобретение относится к кассетам экспрессии, содержащим нуклеиновую кислоту, как она определена выше, под контролем промотора, осуществляющего ее экспрессию.

В рамках настоящего изобретения могут быть использованы различные промоторы. Ими являются последовательности, способные осуществлять экспрессию нуклеиновых кислот в клетках млекопитающих.

Промотор выбирают, предпочтительно, из функциональных промоторов клеток человека. В частности, таким промотором является промотор, способный осуществлять экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты в гиперпролиферативной клетке (раковой, рестенозной и т.д.). В этом качестве могут быть использованы разные промоторы. Так, это может быть любой промотор или производная последовательность, стимулирующая или подавляющая, специфически или нет, индуктивно или нет, в сильной или слабой степени, транскрипцию какого-либо гена. Можно, в частности, назвать промоторные последовательности эукариотических или вирусных генов. Например, это могут быть промоторные последовательности, полученные из генома целевых клеток. Среди эукариотических промоторов можно, в частности, использовать убиквитарные промоторы (промотор генов НРРТ. ΡΟΚ. альфаактина, тубулина, ΌΗΡΚ. и т.д.), промоторы промежуточных филаментов (промотор генов ОРАР, десмина, виментина, нейрофиламентов, кератина и т.д.), промоторы терапевтических генов (например, промотор генов ΜΌΚ, СРТК, Фактора VIII, АроА1 и т.д.). тканеспецифические промоторы (промотор гена пируваткиназы, виллина, интестинального протеина связывания жирных кислот, альфа-актина гладких мышц и т. д.), клеточно-специфические промоторы делящихся клеток, таких как раковые клетки или промоторы, отвечающие на стимул (рецептор стероидных гормонов, рецептор ретиноевой кислоты, рецептор глюкокортикоидов и т.д.) или т. н. индукционные. Таким же образом мож но использовать промоторные последовательности, полученные из генома вируса, такие как, например, промоторы генов Е1А и МЬР аденовирусов, ранний промотор СМУ или промотор ЬТК вируса К.8У и т.д. Кроме того, эти промоторные участки могут быть изменены добавлением последовательностей активации, регуляции или отвечающих за тканеспецифичную или мажоритарную экспрессию.

Настоящее изобретение предусматривает создание новых терапевтических агентов, которые в силу их способности к подавлению транскрипции могут позволить воздействовать на многие клеточные дисфункции. С этой целью нуклеиновые кислоты или кассеты по изобретению могут быть введены непосредственно в то место, которое должно быть обработано, или инкубированы вместе с клетками, подлежащими разрушению или обработке. Было показано, что голые нуклеиновые кислоты могут проникать в клетки без помощи специального вектора. Однако в рамках настоящего изобретения предпочтительно использование вектора введения, улучшающего (1) эффективность проникновения в клетку, (й) эффективность поиска цели и (ш) вне- и внутриклеточную стабильность.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения нуклеиновую кислоту или кассету встраивают в вектор экспрессии. Используемый вектор может иметь химическое (липосома, наночастица, белковый комплекс, катионные липиды или полимеры и т.д.), вирусное (ретровирус, аденовирус, вирус герпеса, ААУ, вирус оспы и т.д.) или плазмидное происхождение.

Использование вирусных векторов основано на естественной способности вирусов к трансфекции. Так, можно использовать, например, аденовирусы, герпесвирусы, ретровирусы и аденоассоциированные вирусы. Эти векторы оказываются особенно эффективными в плане трансфекции. Поэтому предпочтительным объектом изобретения в этой связи будет дефектный рекомбинантный ретровирус, геном которого включает в себя определенную выше нуклеиновую кислоту.

Вектором по изобретению может быть также невирусный агент, способный выступать в роли промотора переноса и экспрессии нуклеиновых кислот в эукариотических клетках. Химические или биохимические, синтетические или природные векторы являются удачной заменой природным вирусам, в частности, из соображений удобства, безопасности, а также изза теоретически неограниченного размера ДНК, трансфекцию которой они могут осуществлять. Эти синтетические векторы выполняют две основные функции: компактизацию нуклеиновой кислоты, подлежащей трансфекции, и ее фиксацию в клетке, а также ее проведение через клеточную мембрану, и, возможно, через две ядерные мембраны. Чтобы компенсировать не достатки полианионной природы нуклеиновых кислот, все невирусные векторы содержат поликатионные участки.

Нуклеиновая кислота или вектор по изобретению могут быть сконструированы с учетом пути введения: топического, перорального, парентерального, интраназального, внутривенного, внутримышечного, подкожного, внутриглазного, чрескожного и т.д. Предпочтительно нуклеиновую кислоту или вектор используют в форме, адаптированной для инъекций. Они могут быть, следовательно, смешаны с любым фармацевтически приемлемым носителем, подходящим, в частности, для получения составов для прямых инъекций в области органов, подлежащих лечению. Это могут быть, в частности, стерильные, изотонические растворы или сухие композиции, в частности, лиофилизованные, которые при добавлении в зависимости от конкретного случая стерилизованной воды или физиологической сыворотки образуют растворы для инъекций. Используемые дозы нуклеиновой кислоты могут быть выбраны в зависимости от различных параметров, в частности, от используемых гена, вектора, пути введения, вида патологии или продолжительности лечения.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту, как она описана выше.

Оно также относится к фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, один вектор, как он определен выше.

В силу их антипролиферативных свойств, фармацевтические композиции по изобретению особенно подходят для лечения гиперпролиферативных нарушений, таких как рак и рестеноз. В рамках настоящего изобретения разработана особенно эффективная методика разрушения клеток, в частности гиперпролиферативных клеток. Ее можно использовать и применительно к опухолевым клеткам или к клеткам гладких мышц стенок сосудов (при рестенозе) для их разрушения. Она особенно хорошо подходит для лечения раковых заболеваний. В качестве примера можно упомянуть аденокарциномы ободочной кишки, рак щитовидной железы, карциномы легкого, лейкемии костного мозга, рак прямой кишки, рак молочной железы, рак легкого, рак желудка, эзофагиальный рак, лимфомы В, рак яичников, рак мочевого пузыря, глиобластомы, рак кости, кожи, поджелудочной железы, а также рак почек и предстательной железы, рак пищевода, рак гортани, раковые заболевания головы и шеи, аногенитальные НРУ-положительные раковые заболевания, ЕВУ-положительные раковые заболевания носоглотки и т. д.

С другой стороны, настоящее изобретение относится к применению соединений, ингибирующих активность протеина Κι или РСИА для ингибирования пролиферации гладких мышечных клеток.

Также настоящее изобретение относится к применению соединений по изобретению для получения двух- или трехчастного комплекса с протеинами Κι и/или ΡΟ'ΝΛ для осуществления положительной или отрицательной регуляции развития клеточного цикла.

Описание настоящего изобретения дополняют нижеследующие примеры и фигуры, которые можно считать отражением отдельных частных случаев осуществления изобретения.

Описание фигур

Фиг. 1. Анализ с помощью ΝογΙΙιογπ Ыо1йпд экспрессии протеина Κι на мРНК, выделенной из различных тканей.

Фиг. 2. Выявление локализации ΚίΗΑ в ядрах клеток методом иммунофлюоресценции.

Фиг. 3. Взаимодействие ίη νίΐτο протеинов Κι и ОАХ

Α) голубой Кумасси;

В) Раг Уейегп В1оПшд.

Фиг. 4. А) Конструкция гена РсроПсг. осуществляющего экспрессию бактериальной хлорамфениколацетилтрансферазы (САТ) под контролем искусственного промотора.

В) Количественное определение ферментной активности САТ в экстрактах клеток после трансфекции с векторами экспрессии, включающими, соответственно, ЕВ, ОАЬ УР16 и ЕВОАЬ УР16.

Фиг. 5. Сравнение конструкций различных мутантов делеции ОАХ по отношению к целому (1-302) протеину ОАХ.

Фиг. 6. Количественное определение ферментной активности САТ с различными химерами ОАЕ-ОАХ

A) без активатора ЕВ;

B) в присутствии активатора ЕВ.

Фиг. 7. Взаимодействие между О8Т-ОАХ и РСт.

Материалы и методы

А) Материалы.

1) Используемый дрожжевой штамм.

Штамм уСм79 рода 8.сеге\ак1ае (МАТа, ига3-52, Ык3-200, айе2-101. 1ук2-801, ΐτρΙ-901, 1еи2-3,112, сап1, да14-542, да180-538, шеИ6: :иВА3-рОАЬ1/10-Ьас2, ΗΙ83: :ОАЬ7ВЬЕ) использовали в качестве средства для просеивания банка сплавления легкого системой двойных гибридов.

Штамм культивируют в следующих культуральных средах:

полная среда ΥΡΌ: экстракт дрожжей (10 г/л) Όίίοο);

бактопептон (20 г/л) Όίίοο);

глюкоза (20 г/л) (Мегск).

Эту среду отверждают добавлением 20 г/л агара Όίίοο).

Минимальная среда ΥΝΒ: Υеакΐ Νίΐτο деп

Ваке (без аминокислот) (6,7 г/л) Όίίοο);

глюкоза (20 г/л) (Мегск).

Эта среда может быть отверждена добавлением 20 г/л агара (Όίίοο).

Для обеспечения роста в этой среде ауксотрофных дрожжей необходимо добавить аминокислоты или азотированные основания из расчета 50 мг/мл.

2) Используемые штаммы бактерий.

Штамм ТО1 ЕксйепсЫа сой генотипа кирЕ, ΗκάΌ5, ΐΒί, 0(1ас-ргоАВ), Р'|1гаЭ36 рго А⁺В⁺ 1ас1^ч 1ас2ИМ15] использовали для амплификации и выделения используемых рекомбинантных плазмид.

Для получения рекомбинантных протеинов используют бактерии Е.сой ВЬ-21, полученные Рйаппааа. Е.сой. Они имеют генотип Р^-отрТ йкй8_ь (г_ь-т_ь ^-) да1 йст(ИЕ3).

ВЬ-21 является наилучшим штаммом для получения рекомбинантных протеинов, поскольку не содержит протеаз и имеет хрупкую мембрану, легко разрушаемую ультразвуком. Е.сой ВЬ-21 имеет систему подавления Т7 РНКполимеразы. Это подавление может быть инактивировано с помощью 1РТО, что позволяет контролировать работу генов, находящихся после сайта связывания Т7 РНК-полимеразы. Готовят культуру бактерий в 2 мл среды ЬВ (№101 5 г/л/ ТгурЮпе 10 г/л. Экстракт дрожжей 5 г/л) в смесителе при 37°С в течение ночи. 1 мл этой предкультуры используют для получения культуры в 50 мл среды 2хΥТ (ΝιΟ1 5 г/л, ТгурФпе 16 г/л. Экстракт дрожжей 10 г/л) при 37°С до достижения оптической плотности бактерий (Ό.Ο.) от 0,4 до 600 нм (экспонентная фаза роста). Культуру бактерий охлаждают на льду. Бактерии центрифугируют при 3300 об/мин в течение 20 мин.

Бактерии Е.сой, пригодные для получения рекомбинантных протеинов, получают, используя метод хлорида кальция. Для этого готовят 0,1М раствор бактерий в 5 мл СаС1₂. Бактерии повторно центрифугируют при 3300 об/мин, после чего снова помещают в 0,1М раствор 1 мл СаС1₂, содержащий 17,5 % глицерола. Этот раствор делят на равные части и хранят при -80°С.

3) Используемые плазмиды.

Используемыми плазмидами являются: векторы серии рОВТ и рА8. (С1оШесй), челночные плазмиды, содержащие сайты начала репликации, полученные от бактерий и дрожжей, что позволяет им реплицироваться в этих двух микроорганизмах в большом количестве. Эти плазмиды содержат множественный сайт клонирования, расположенный после последовательности, кодирующей домен связывания ДНК ОАЬ4 и раньше стоппера; такая структура позволяет получить протеин слияния. Они также содержат ген ТВР1 З.сеге^'Ыае, что позволяет добавить 4гр1 в генотип дрожжей для их селекции в минимальной среде, лишенной триптофана. Эти векторы содержат ген устойчивости к ампициллину, что позволяет осуществлять селекцию содержащих их бактерий в среде, содержащей ампициллин;

векторы серии рСЛЭ. (С1оп1есй), векторы, осуществляющие экспрессию в дрожжах, протеинов слияния между доменомтрансактиватором САБ4 и протеином, используемым по изобретению или кодируемым кДНК, полученной из банка легкого, встроенной в сайт ЕсоШ Хйо1;

векторы серии рЕТ29 (Ыоуадеп), векторы, осуществляющие экспрессию рекомбинантных протеинов в сой, слитых с 1ад8;

векторы серии рСЕХ (Рйагтааа), векторы, осуществляющие экспрессию рекомбинантных протеинов в сой, слитых с глутатион-3трансферазой (С8Т);

векторы серии ВШекспрГ (81га1адепе), векторы, позволяющие осуществить клонирование, а также серии р1С (1. Ба^гепсе Матей и др., Сепе, 1984, 32, 481-485) и рМТЬ (81е\е Р. Сйатйете и др., Сепе, 1998, 68, 139-149).

Плазмида рСЕХ-2Т-йСАХ является плазмидой, используемой для преобразования Е. Сой ВБ-21. Эта плазмида была получена на основе плазмиды рСЕХ-2Т и предоставлена доктором К. ХУаБй из 81. Е1|/аЬе1й'5 Ме61са1 Сеп1ег, Бостон. Базовая плазмида рСЕХ-2Т (Рйагтааа) позволяет получить протеин САХ, слитый с глутатион-8-трансферазой (С8Т), протеином, обладающим высоким сродством к глутатиону. Слияние С8Т-САХ облегчает очистку САХ, использующую сродство к глутатиону по спаренным агарозным структурам. Кроме того, существует сайт разрыва тромбином, который позволяет позднее разделить химерную структуру между С8Т и САХ. кДНК йСАХ контролируется гибридным промотором 1ас и оператором 1ас. Репрессор 1ас1, присоединяясь к оператору 1ас, мешает продвижению РНКполимеразы. Это подавление снимается аналогом лактозы, изопропил-З-О-тиогалактозидом (ИПТГ), который соединяется с 1ас1. Комплекс 1ас1-ИПТГ не может присоединяться к оператору 1ас, поэтому исчезает препятствие для РНКполимеразы.

4) Протеин К1.

Получение и очистка.

Провели клонирование гена протеина К1, слитого с эпитопом тус в плазмиде рЕТ-29 (Ыоуадеп), используя плазмиду рСАЭ, содержащуюся в дрожжах. Плазмида рЕТ-29 продуцирует протеин, слитый с эпитопом, называемым 8-Тад, который позволяет провести очистку К1 за счет сродства к 8-протеину по спаренным агарозным структурам. Химера 8тусК1 контролируется промотором Т7 и оператором 1ас. Превращение ВЬ-21 осуществляют в плазмиде рЕТ-29-тусК1. Как и в случае протеина С8Т-САХ, их помещают в культуру до получения оптической плотности от 0,7 до 600 нм. Затем индуцируют экспрессию 8тусК1 с помощью 0,1 мМ ИПТГ и Т7 РНК-полимеразы, про дуцируемой ВЬ-21. Бактерии обрабатывают ультразвуком. Супернатант затем очищают по следующей методике. Очистка 8тусК1 проходит за счет сродства к 8-протеину по спаренным агарозным структурам. Методика аналогична той, которая используется в случае С8Т-САХ, за исключением того, что смолу промывают в растворе, содержащем 20 мМ Тгте рН 7,5, 0,15М №1С’1 и 0,1% Тгйоп Х-100. Элюирование и диализ проводят так же, как для С8Т-САХ.

В) Методы.

Классические методы молекулярной биологии хорошо известны специалистам и широко описаны в литературе [Машайк Т. и сотр., «Мо1еси1аг С1ошпд, а БаЬога1огу Мапиа1», Со 16 8рппд НагЬог Ьайога1огу, Со16 8рппд НагЬог, Ν.Υ., 1982; Аи§цЬе1 Е.М. и сотр., «Сиггеп1 Рго1осо1к 1п Мо1еси1аг Вю1оду», 1ойп \ХШеу & 8опк, Хе\\ Υо^к, 1987].

1) Двойная гибридная система.

Эта система представляет собой метод клонирования за счет взаимодействия ΐπ νί\Ό в 8ассйаготусез сегеу181ае, принцип которого основан на модульной структуре дрожжевого фактора транскрипции САБ4 (7). Активатор транскрипции САЬ4 содержит два независимых домена, выполняющих разные функции. Домен связывания с ДНК (САБОВ для САЬ ΌΝΛ Вшбтд) позволяет САЬ4 фиксироваться на специфической последовательности ДНК на уровне промоторного участка гена. В этом случае САЬ4 оказывается пространственно близок к транскрипционному механизму и благодаря своему домену-трансактиватору (САЬТА) увеличивает частоту инициации транскрипции на прилегающем гене, вероятно, за счет взаимодействия с РНК-полимеразой или с ассоциированными протеинами. Принцип двойной гибридной системы заключается в том, что САБОВ и САБТА по отдельности сращивают с двумя различными протеинами Х и Υ, которые, при взаимодействии, образуют активный транскрипционный комплекс.

2) Просеивание дрожжей по технологии ПЦР (полимеразной цепной реакции).

Просеивание осуществляют непосредственно на дрожжах. Каждую колонию дрожжей помещают в раствор в 10 мкл воды с 0,08% Т\сееп 20. Т\сееп представляет собой неионный детергент, который позволяет усилить лизис дрожжей на первой стадии нагревания до 95°С. На следующих стадиях Т\сееп 20 действует как агент защиты Тад ДНК-полимеразы. Конечный объем дрожжевой суспензии доводят до 20 мкл при следующих конечных количествах или концентрациях: 10 пикомоль затравки 1, 10 пикомоль затравки 2, 1 единица Тад ДНКполимеразы, 75 мМ Тпк рН 9, 20 мМ (ΝΗ₄)₂8Ο₄, 0,01% Т\сееп 20, 2/5 мМ МдС1₂ и 125 мкМ каждого из 4 дезоксирибонуклеотидов (дАТФ, дТТФ, дГТФ и дЦТФ). На выходе из ПЦР одну фракцию смеси анализируют на геле агарозы.

Таким образом можно узнать, для каждой заданной пары затравок и для каждого клона дрожжей, является ли данная последовательность ДНК уже идентифицированной.

3) Получение плазмидных ДНК.

Большие количества ДНК получают, используя комплект для быстрого получения ДНК (Рготеда).

Малые количества ДНК получают следующим образом: бактерии, содержащие плазмиды, культивируют в течение, по меньшей мере, 4 ч в 2 мл среды ЕВ в смесителе. Затем их центрифугируют в течение 2 мин при 14000 об./мин в пробирках Эпендорфа, после чего осадок суспендируют в 100 мкл раствора I (50 мМ глюкозы, 25 мМ буфера Ττίκ НС1 рН 8, 10 мМ ΕΌΤΑ рН 8), лизируют с помощью 200 мкл раствора II (0,2М ΝαΟΗ, 1% 8Ό8). Лизирующий раствор затем нейтрализуют с помощью 150 мкл раствора III (3М ацетата калия, 11,5% (об./об.) ледяной уксусной кислоты). После взбалтывания пробирок и образования осадка в виде хлопьев добавляют 150 мкл смеси фенол/хлороформ (50% фенола и 50% хлороформа, насыщенных водой) и взбалтывают 30 с. После центрифугирования в течение 2 мин при 14000 об./мин, собирают водную фазу, содержащую ДНК. Затем ДНК осаждают добавлением 0,5 объема изопропанола, центрифугируют 5 мин при 14000 об./мин и высушивают на воздухе, после чего помещают в 20 мкл ТЕ РНКполимеразы (раствор Тпк-НС1 (10 мМ) и ΕΌΤΑ (1 мМ) с 50 мг/мл РНК-полимеразы).

4) Синтез и ферментативная амплификация ДНК или ПЦР.

Реакции ПЦР проводят в конечном объеме 100 мкл в присутствии ДНК-матрицы, дНТФ (0,2 мМ), буфера ПЦР (Тпк-НС1 рН 8,5 10 мМ, МдС1₂ 1 мМ, КС1 5 мМ, желатин 0,01%), 0,5 мкг каждого олигонуклеотида и 2,5 Ы АтрБ Тад ДНК-полимеразы (Регк1п Е1тег) с формамидом (5%) или без него. Смесь покрывают 2 каплями парафинового масла для уменьшения испарения. Используют аппарат «Стоеобйе II» (АррБ депе).

Использовали следующие температуры: температура денатурации 90°С, температура гибридизации олигонуклеотидов на матрице на 5-10°С ниже температуры разделения олигонуклеотидов и температура ферментативной элонгации 72°С.

Фрагменты, полученные с помощью ПЦР и предназначенные для клонирования, после каждого клонирования повторно секвенируют для выявления мутаций, которые могут возникать в ходе амплификации. Олигодезоксирибонуклеотиды синтезируют химическими методами согласно методике фосфорамидитов, используя β-цианоэтильные защитные группы (§1пНа 1984). По окончании синтеза защитные группы удаляют с помощью обработки нашатырным спиртом, а двукратное осаждение бутанолом позволяет осуществить очистку и концентрирование олигодезоксинуклеотидов (Зштабодо. 1991). Концентрацию ДНК определяют по оптической плотности, которая составляет 260 нм.

5) Сшивание.

Все реакции сшивания проводят при +14°С в течение ночи в конечном объеме 10 мкл в присутствии 100-200 нг вектора, 0,5-2 мкг вставок, 40 Ш фермента Т4 ДНК-лигазы (Вю1аЬк) и сшивочного буфера (Тпк-НС1 50 мМ рН 7,8; МдС1₂ 10 мМ; АТФ 1 мМ). Отрицательный контроль проводят с помощью сшивания вектора в отсутствие вставки.

В случае заполнения 5'-концов оно происходит перед сшиванием с помощью фрагмента К1епо\\· ДНК-полимеразы I Е. Со К (Вю1аЬк) согласно инструкции производителя. Разрушение 3'-концов происходит в присутствии ДНКполимеразы фага Т4 (В1о1аЬ8), используемой согласно инструкции производителя.

6) Трансформация бактерий.

Трансформацию бактерий с помощью плазмиды проводят согласно следующему протоколу: используют весь объем среды для сшивания (10 мкл) для трансформации бактерий ТС1, которые делают компетентными по методу Сйипд и др., (ΡΝΑ8, 1988 86, 2172-2175).

Готовят культуру бактерий ТС1 в жидкой среде ЬВ в течение нескольких часов в термостате при 37°С и при взбалтывании до получения оптической плотности от 0,6 до 600 нм. После этого среду центрифугируют при 6000 об./мин в течение 10 мин. Бактерии делают компетентными, помещая представленный бактериями осадок в один объем Т8В (среда ЬВ+100 г/л РЕС 4000, 5% ΌΜ8Ο, 10 мМ МдС1₂, 10 мМ Мд§О₄), соответствующий 1/10 объема среды первоначальной культуры. После инкубации при 4°С в течение 30-60 мин, 200 мкл бактерий вводят в контакт с продуктами сшивания на 15 мин на льду. После добавления 200 мкл ЬВ бактерии инкубируют 30 мин при 37°С, затем помещают на среду ЬВ+ампициллин.

7) Разделение и экстракция ДНК.

ДНК разделяют электрофорезом по их размеру. Для этого используют различные гели, выбираемые в зависимости от размера разделяемых фрагментов:

1% гель агарозы (С Фео ВЯЬ) в буфере ТВЕ (Ττίκ основной 90 мМ; борат 90 мМ; ΕΌΤΑ 2 мМ) для разделения крупных фрагментов ДНК (более 500 пар оснований)

2% гель агарозы №.ф|еуе (ЕМС Вюртобие15) в буфере ТВЕ для разделения мелких фрагментов (менее 500 пар оснований).

Миграцию на геле агарозы или на полиакриламидном геле осуществляют в буфере ТВЕ и в присутствии маркера молекулярной массы (1 КЬ 1аббет, СФео ВЯЬ). ДНК смешивают с 1/10 окрашенного синим сток-раствора (200 г/л фикола, 0,5 г/л бромфенолового синего, 50 мМ ΕΌΤΑ), после чего помещают на гель. После миграции при 100 В и окрашивания бромидом этидия (в концентрации 0,5 мкг/мл геля) полосы становятся видимыми в УФ.

Экстракцию ДНК из геля агарозы осуществляют электроэлюированием следующим образом. Кусочек геля, содержащего фрагмент ДНК вырезают скальпелем и помещают в диализную спираль, закрытую с помощью двух зажимов и содержащую от 100 до 500 мкл ТВЕ. Все вместе помещают в кювету для электрофореза и воздействуют электрическим полем 100 В. После извлечения из геля ДНК очищают двукратной экстракцией с помощью смеси фенол/хлороформ, затем двукратной экстракцией хлороформом, затем осаждают в присутствии ацетата натрия 0,3 М и 2,5 объема абсолютного этанола. После центрифугирования (5 мин при 14000 об./мин) осадок ДНК высушивают, затем помещают в 20 мкл воды.

8) Флюоресцентное секвенирование плазмидных ДНК.

Секвенирование проводят по методу 8апдег, используя 4 дидезоксирибонуклеотида, содержащих различные флюоресцентные маркеры. Встраивание одного из этих дидезоксирибонуклеотидов приводит к остановке репликации Тас.|-полимеразой секвенируемой ДНК. В результате этой реакции получают фрагменты ДНК разных размеров, каждый из которых заканчивается на 3'-конце одним из этих 4 дидезоксирибонуклеотидов.

мкг плазмиды и 4 пикомоль праймера добавляют к 9,5 мкл «премикса», поставляемого Аррйеб Вю8у81еш8 под маркой Рпзтс®. Конечный объем должен составлять 20 мкл для проведения 25 циклов ПЦР, каждый из которых делится на этап денатурации при 96°С в течение 30 с, этап гибридизации при 50°С в течение 15 с и этап элонгации при 60°С в течение 4 мин.

Фрагменты ДНК, полученные после амплификации, очищают на эксклюзионной колонке (С1гота8рт-30, С1оп1ес11). затем высушивают на 8рееб Уас и отбирают в 5 мкл смеси, состоящей из 24 мкл ΕΌΤΆ (50 мМ) и 120 мкл дезионизованного формамида. После денатурации в течение 3 мин при 96°С помещают от 3 до 5 мкл на гель для электрофореза. Различные фрагменты ДНК разделяют в соответствии с их размером и проводят считывание лазером на аппарате 370 ΌΝΆ хесщепсег (Аррйеб Вю8у81етз), который определяет различные флюоресцентные участки.

9) Получение плазмид из банка легкого (С1оп1есй®).

Банк слияния кДНК легкого продается в форме бактерий. Этот банк происходит от клонирования на уровне сайта ЕсоР1-Х1ю1 плазмиды рСАО424 (Материалы и Методы) кДНК, соответствующей всем РНК клеток легкого человека.

После проверки титров банка 2 мкл бактерий банка слияния легкого в 8 мл ЬВ помещают на твердую среду, таким образом, чтобы избежать их слияния и сохранить репрезентативность банка. Таким образом были подготовлены 16 плашек по 770 см², содержащие среду ЕВ+ампициллин. Полученные колонии собирают из каждой плашки с помощью 30 мл жидкой среды ЬВ+ампициллин. Полученные суспензии помещают в Ег1еп и инкубируют в шейкере при 37°С в течение 3 ч. ДНК экстрагируют из штаммов по технологии Мах1ргер. Концентрация ДНК составляет 260 нм оптической плотности.

10) Трансформация дрожжей с помощью плазмиды.

Дрожжи культивируют в 100 мл жидкой среды и после центрифугирования при 3000 об./мин в течение 3 мин суспендируют в 1 мл стерильной воды. После центрифугирования при 3000 об./мин в течение 3 мин клеточный осадок ресуспендируют в 1 мл стерильной воды, после чего опять центрифугируют. Эту операцию опять повторяют для удаления всех следов культуральной среды. Затем дрожжи помещают в 1 мл раствора для трансформации I (Ь1Лс 0,1М, ТГ18-НС1 рН 7,5 10 мМ, ΕΌΤΆ 1 мМ), затем центрифугируют при 3000 об./мин в течение 3 мин. Клеточный осадок снова помещают в 1 мл раствора для трансформации I. К 50 мкл этой дрожжевой суспензии добавляют 50 мкг ДНК спермы лосося и от 1 до 5 мкг плазмидной ДНК. После этого добавляют 300 мкл раствора для трансформации II (Ь1Лс 0,1М, Тп8-НС1 рН

7,5 10 мМ/ ΕΌΤΆ 1 мМ в 40% РЕС4000), затем все вместе инкубируют при 28°С в течение 30 мин. Затем трансформационную смесь подвергают термическому шоку на водяной бане при 40°С в течение 15 мин, затем ее центрифугируют при 15000 об./мин в течение 1 мин и собирают клеточный осадок. Этот осадок помещают в 200 мкл воды, затем выкладывают на минимальную среду с добавленным агар-агаром, не содержащую аминокислот, соответствующих маркерам, содержащимся в трансформирующих плазмидах. После этого дрожжи культивируют в течение 72 ч при 28°С.

В частном случае трансформации дрожжей с помощью банка кДНК легкого действуют следующим образом.

Используемые дрожжи содержат плазмиду рСАЬ4ПВ-САХ, осуществляющую экспрессию протеина САХ, слитую с доменом связывания с ДНК САЬ4. Их культивируют в 250 мл минимальной среды УРС при 28°С и при взбалтывании до получения плотности 10⁷ клеток/мл. Клетки отбирают центрифугированием при 3000 об./мин в течение 10 мин и помещают в 250 мл воды. После повторного центрифугирования клеточный осадок помещают в 100 мл воды и центрифугируют снова. Осадок собирают в 10 мл раствора для трансформации I и инкубируют в течение 1 ч при 28°С при взбалтывании. После центрифугирования клетки снова собирают в 2,5 мл раствора для трансформации I, 100 мкл банка кДНК легкого и 20 мл раствора для трансформации II, затем инкубируют в течение 1 ч при 28°С при взбалтывании. Проводят термический шок этой трансформационной смеси при 42°С в течение 20 мин. Центрифугирование (3000 об./мин в течение 5 мин) проводят 3 раза подряд, каждый раз собирая осадок в 10 мл стерильной воды. Третий раз осадок собирают в 2,5 мл РВ8. Таким образом удаляют токсичный для клеток РЕС, 2,4 мл этой суспензии используют для высевания на 250 мл минимальной среды, содержащей аминокислоты НЦ, Ьук, Ме! и основания Ига и Лбе, и культивируют в течение ночи в шейкере при 28°С. Оставшиеся 100 мкл этой суспензии используют для проверки эффективности трансформации, для этого готовят разведения 10^-2, 10^-3 и 10^-4 этой суспензии.

Культуру, выращенную за ночь, центрифугируют (3000 об./мин в течение 5 мин) и промывают стерильной водой 2 раза подряд. Затем осадок собирают в 2,5 мл воды, 2,4 мл объем которых доводят до 10 мл добавлением стерильной воды, используют для высеивания в 10 плашек по 435 см², содержащих среду УКВ+Ьук+МеН НЦ+Лбе, которые затем инкубируют в течение 3 суток. Оставшиеся 100 мкл используют в тех же операциях, как и при определении степени амплификации, для определения степени амплификации числа колоний в ходе культивации в течение ночи.

11) Получение ДНК (геномных и плазмидных) дрожжей.

Количество, соответствующее среднему значению статистической кривой, клона дрожжей помещают в 200 мкл раствора ТЕЬТ (2% Ттйои Х100, 1% 8Ό8, 100 мМ ЫаС1, 10 мМ Тпз рН 8, ЕЭТА 1 мМ) в присутствии 3 г стеклянных шариков диаметром 450 мкм и 200 мкл смеси фенол/хлороформ. Эту смесь перемешивают в аппарате Уот!ех в течение 15 мин, затем центрифугируют в течение 2 мин при 14000 об./мин. Собирают супернатант, не трогая слой протеинов, и осаждают ДНК, содержащуюся в этой фазе, с помощью 2,5 объема абсолютного этанола. После центрифугирования в течение 2 мин при 14000 об./мин, осадок ДНК высушивают и собирают в 20 мкл ТЕ-ДНК-полимеразы. Этот раствор ДНК, соответствующий смеси геномной и плазмидной ДНК, непосредственно используют для трансформации бактерий. Только плазмидная ДНК способна реплицироваться в бактериях и может быть подвергнута анализу по технологии М1шртер.

12) Тестирование активности β-галактозидазы.

Лист нитроцеллюлозы заранее поместили на чашку Петри, содержащую индивидуализированные клоны дрожжей. Благодаря явлению абсорбции, получают точную картину размещения клонов. Затем этот лист погружают на 30 с в жидкий азот, чтобы разрушить дрожжевые клетки и высвободить активную βгалактозидазу. После размораживания лист нитроцеллюлозы помещают таким образом, чтобы колонии находились с верхней стороны, в другую чашку Петри, содержащую кусок листа ватмана, предварительно пропитанный 1,5 мл раствора Р8В (60 мМ Ыа₂НРО₄, 40 мМ ЫаН₂РО₄, 10 мМ КС1, 1 мМ Мд§О₄, рН7) и от 10 до 30 мкл Х-Са1 (5-бром-4-хлор-3-индоил-Ь-О-галактозид) в Ν,Ν-диметилформамиде в концентрации 50 мг/мл. Чашку помещают в термостат при 37°С и накрывают крышкой во избежание высыхания. Время проявления синего цвета может сильно варьировать, от нескольких минут до многих часов. Этот тест нужно проводить всегда в присутствии положительного контрольного образца, степень взаимодействия которого известна и который быстро окрашивается в синий цвет.

13) Конструкция векторов экспрессии и гена-репортера.

а) Векторы экспрессии.

кДНК рецептора эстрогена (ЕЯ) получают обратной транскрипцией (ЯТ) с помощью стандартного набора (Пгз! йтапб οΩΝΛ 5уп!е5к Кй, РЬатшас1а), используя полный экстракт РНК из матки мыши, и последующей амплификацией в ПЦР. Использовали пару специфичных гибридизующихся праймеров, 5'-конец которых содержал 20 первых нуклеотидов ЕЯ; при этом вводили сайт ЕсоЯ1 непосредственно перед первым кодоном (5'-дадсдааПсАТСАССАТСАС ССТТСАСАС 8ЕО ΙΌ Νο 6, нуклеотиды, обозначенные наклонным шрифтом, соответствуют сайту ЕсоЯ1, а подчеркнутые - первому кодону); на 3'-конце возвратный праймер начинается со стоп-кодона ЕЯ; при этом также вводят сайт ЕсоЯ1 (5'-дадсдаайсАСТ6АТС6Т6ТТ6660 ААСС 8ЕО ΙΌ № 7, нуклеотиды, обозначенные наклонным шрифтом, соответствуют сайту ЕсоЯ1, а подчеркнутые - стоп-кодону). Полученный фрагмент ПЦР очищали, расщепляли с помощью ЕсоЯ1, затем клонировали на месте в векторе экспрессии рС^NА3 Цпуйтодеп). Этот вектор был назван рСМУ-ЕЯ. Различные делеционные мутанты САХ, слитые с доменом связывания с ДНК ОАБ4 (рСМУ-бАБИВ/ОАХ, см. пример 9) также были клонированы в векторе рС^А3.

б) Ген-репортер.

Ген-репортер был сконструирован согласно стратегии, описанной Майше/ и др. (МагЦпех и др., Мо1. Се11. Вю1. 11, 2937-2945), с тем отличием, что в качестве вектора клонирования использовали рО8САТ (С1оп!ес11. САТ= Хлорамфениколацетилтрансфераза). Был синтезирован двухцепочечный олигонуклеотид (см. ниже), содержащий два специфичных сайта (выделенных жирным шрифтом), из которых один распознается доменом связывания с ДНК ОАЕ4 (Са117мер, Сагеу и др. 1989, 1. Мо1. Вю1. 209, 423432), а другой представляет собой консенсусную последовательность ЕЯЕ («Ейгодеп Яе21 кронкше Е1етеп1») (Веа1о Μ. 1989, Се11 56, 335344), которая связывает рецептор с эстрогенами. Этот олигонуклеотидный адаптер содержит на 5'-конце протрузивный сайт ΧΙιοΙ. а на З'-конце сайт ХЬа1, который позволяет провести клонирование в сайтах ΧΙιοΙ и ХЬа1 рС5САТ.

8ЕО ΙΌ № 8 СсдадАСЮТСАТАТТОЛССТаадсЪССвввТСввЛвТАСТОТССТССОАСТОСсаЪаЪдС оТССАаТАТААСТО<5АЪСсдаа0СССАОССГСАТОЛСАО<ЗА«Э<ЭСТОАССдЪаеаса2а1с ЛоХ ЖЯХ СЫ~27мх Лл X

Принцип этого гена-репортера (рЕВЕС1САТ, фиг. 4, пример 11) основан на том факте, что ЕВ является активатором транскрипции, обладающим в случае мышиного ЕВ конституционной активностью, которая возрастает в ответ на действие своего природного лиганда - эстрадиола 17-β. Эта система была использована Майше/ и др. для изучения синергизма ЕВ и второго фактора транскрипции ΝΡ1, у которого домен-активатор транскрипции был слит с доменом связывания с ДНК дрожжевого протеина САЬ4 (САЬПВ). Этот репортер позволяет, таким образом, учитывать степень транскрипции, проходящей исключительно за счет одного или другого из этих факторов транскрипции или их совместного действия, без учета влияния эндогенных молекул. Эта система позволяет, таким образом, изучить транскрипционную активность всего или части протеина САХ, слитого с СЛЕП В (фиг. 5, 6 и примеры 12, 13).

Сконструировали плазмиду, отвечающую за экспрессию гена люциферазы под контролем промотора СМУ (рСМУ-Ьис). Эта конструкция была получена после клонирования фрагмента ПЦР (фланкированного на 5'- и 3'-концах сайтом ВатН1), содержащего промотор СМУ вектора ρС^NА3 (ΙηνίΐΓο^η), в сайте ВдШ вектора рСйЗ-ВакК (Рготеда). Эта плазмида служила внутренним стандартным образцом во всех нижеследующих опытах по транзитной трансфекции.

14) Опыты по транзитной котрансфекции.

Все исследования проводили на фибробластах эмбриона мыши ΝΙΗ-3Τ3 (АТСС). Эти клетки содержались, как обычно, в ЭМЕМ (С1ВСО), куда было добавлено 100 и/мл пенициллина (С1ВСО), 100 мкг/мл стрептомицина (С1ВСО), 2 мМ Ь-глутамина (С1ВСО) и 10% зародышевой телячьей сыворотки (8УЕ, С1ВСО). Эту среду обозначают аббревиатурой ЭМЕМ-СР8/8УЕ.

Для проведения опытов по транзитной трансфекции ΝΙΗ-3Τ3 высеивают с плотностью 100000 клеток на лунку в 24-лунковую плашку (Еа1соп) в объеме 1 мл ЭМЕМ-СР8/8УЕ. Через 1620 ч после распределения и укоренения клеток клетки промывают 0,5 мл ЭМЕМ-СР8 (без 8УЕ), затем помещают в 0,5 мл ЭМЕМ-СР8. Добавляют 50 мкл на лунку трансфекционной смеси. Получение этой смеси приведено в табл. 3.

Таблица 3

	1*	2*	3*	4*
рСМУ-Ьис	50 нг	50 нг	50 нг	50 нг
рЕВЕС1САТ*	650 нг	650 нг	650 нг	650 нг
рСМУ-ЕВ	-	150 нг	-	150 нг
рСМУ-САйОВ/САХ	-	-	150 нг	150 нг
ρС^NА3**	300 нг	-	-	-
Липофектамин** *	8 мкг	8 мкг	8 мкг	8 мкг
Н2О с.|к до	50 мкл	50 мкл	50 мкл	50 мкл

*Различные смеси, обозначенные цифрами 1-4, составлены для того, чтобы изучить, соответственно, базовую активность промотора ЕВЕС1САТ, активность ЕВ или САЭВ/САХ по отдельности и, наконец, одновременное действие ЕВ и САЬПВ/САХ.

**ρС^NА3 используют для дополнения каждой смеси до общих 10 мкг ***2 мкг/мл липофектамина (дЬсо) используют в отношении 8/1 (липофектамин/

ДНК).

Клетки вводят в контакт с разными трансфекционными смесями на 4 ч при 37°С в стандартных условиях работы с культурами. Затем ЭМЕМ-СР8 заменяют вместе с трансфекционной смесью на 1 мл ЭМЕМ-СР8/8УЕ, после чего клетки оставляют в культуре на 24 ч. Каждую трансфекционную смесь вводят минимум в 4 лунки.

По истечении 24 ч клетки промывают с помощью 0,5 мл Эи1Ьессо'к РВ8 (С1ВСО), затем собирают в 0,5 мл 0,2% раствора трипсина в РВ8 (С1ВСО). Трипсин нейтрализуют с помощью 10 мкл 8УЕ. Эту клеточную суспензию центрифугируют в течение 2 мин при 10000д, удаляют супернатант, клетки ресуспендируют в 150 мкл 0,25М Тг1к-НС1, рН 7,8. 50 мкл этой суспензии используют для измерения активности люциферазы с комплектом «1исИегаке Аккау 8ук1ет» (Рготеда) и с помощью луминометра ЬИМАТ ЬВ 9501 (ЕС&С ВейЬоМ). Цитозольные протеины клеток в оставшихся 150 мкл экстрагируют 5 циклами замораживания/оттаивания (жидкий азот, 37°С). Эти экстракты, нормализованные по отношению к люциферазной активности, используют далее для измерения активности САТ согласно методике, описанной Согтап и др. (Согтап и др., 1982, Мо1. Се11. Вю1. 5, 1044-1051).

15) Взаимодействие ίη νίΙΐΌ протеинов Κί и САХ.

Его проводят по методике Еаг-\Уек1ет В1оШ1щ

В то время как \Уек1ет В1ойтд заключается в электрофоретическом разделении протеинов на денатурирующем геле с последующим электропереносом протеинов на нитроцеллюлозную мембрану и прямой или непрямой иммунодетекцией. Еаг-\Уек1ет В1оШ1щ представляет собой \Уек1ет В1ойшд, к которому добавляется стадия взаимодействия протеин-протеин между фиксированным на нитроцеллюлозной мембране протеином-мишенью и растворенным фактором.

а) Электрофорез.

Образцы нагревают до 95°С в течение 10 мин в буфере для денатурации протеинов, содержащем 50 мМ Тп8 рН 6,8, 2% 8Ό8 (Натрийдодецилсульфат), 10% глицерина, 300 мМ Ьмеркаптоэтанола и 0,1% бромфенолового синего. 10 мл образцов помещают на 14% акриламидный Тгк-глициновый гель (Тп8-С1усте Се1з, Nονеx). Миграция протекает в течение 1 ч при постоянном напряжении 120В в буфере для разделения протеинов (35 мМ 8Ό8, 1,92 М глицина и 85 мМ Тп8 рН 8,3). Молекулярную массу протеинов определяют по параллельной миграции окрашенного подвижного контрольного образца с известной молекулярной массой (МиШМагкТМ Ми1й-Со1огей 81апйай, Nονеx). Этот гель готовят в двойном экземпляре, чтобы иметь возможность параллельно окрашивать один из двух голубым Кумасси (метанол 30%, вода 60%, уксусная кислота 10%, голубой Кумасси 0,1%). Окрашивание длится 1 ч. Обесцвечивание проводят в течение нескольких часов, несколько раз меняя обесцвечивающий раствор (метанол 30%, уксусная кислота 10%, вода 60%). Порог чувствительности этого метода составляет 50 нг протеина. Этот окрашенный гель позволяет, таким образом, визуально обнаруживать все отложившиеся протеины. Другой гель используют для «Баг-\Уе81егп Β1οΐΐί移.

б) Полусухой перенос на нитроцеллюлозную мембрану.

Нитроцеллюлозную мембрану (НуЬопй С. Атегзбат) и гель помещают между 3 листами ватмана, предварительно погруженными в буфер переноса (150 мМ глицина, 25 мМ ТгБ. 20% метанола, воды де до 1 л, рН 8,3). Перенос осуществляют в течение 40 мин при 2,5 мА/см² геля (аппарат М1ШЬ1о1ТМ-СгарЫ1е Е1ес1гоЬ1о11ег II, Мйброге).

в) Взаимодействие протеин-протеин.

Мембрану насылают в течение 30 мин при взбалтывании и при комнатной температуре в ΡΒ8, содержащем 5% (вес/об.) порошкового обезжиренного молока (С1опа), 0,2% (об./об.) Тетееп 20. Затем ее погружают на 1 ч при взбалтывании и при комнатной температуре в 5 мл ΡΒ8, содержащего 5% (вес/об.) обезжиренного порошкового молока (С1опа), 0,2% (об./об.) Тетееп 20 и 75 мкг ΚΙ. По окончании инкубации мембрану промывают 3 раза в течение 10 мин в ΡΒ8, содержащем 0,2% (об./об.) Т\сееп 20. Для визуального наблюдения взаимодействия между С8Т-САХ, фиксированным на нитроцеллюлозной мембране и тусК1, этот последний проявляют, как С8Т-САХ, с помощью моноклональных антител мьши, направленных к эпитопу тус (8ап1а Сгих) и поликлональных антител кролика, спаренных с пероксидазой, направленных к 1дС мьши (№гйю 1ттипо1оду).

Примеры

Пример 1. Конструирование вектора экспрессии протеина слияния САХ с доменом связывания с ДНК САБ4.

Просеивание банка с использованием двойной гибридной системы требует, чтобы протеин САХ был слит с доменом связывания с ДНК протеина-трансактиватора САБ4. Экспрессия этого протеина слияния происходит благодаря вектору рСΒТ10 (см. материалы и методы), в который введен, в одной рамке считывания с последовательностью, соответствующей домену связывания с ДНК САБ4 (СА^4^Β), фрагмент, кодирующий протеин САХ или его часть. Особый фрагмент содержит фрагмент ЕсоК.1-8а11, полученный от рНСАХ и который встроен на уровне сайта ЕсоВ1-8а11 рСΒТ10, благодаря чему получают плазмиду рСМ199.

Проводят секвенирование этой конструкции, чтобы убедиться, что протеин САХ действительно находится в одной открытой фазе считывания с фрагментом, соответствующим СА^4^Β.

Пример 2. Просеивание банка слияния легкого.

Просеивание банка слияния позволяет установить клоны, продуцирующие протеины, слитые с доменом-трансактиватором САЕ4, которые могут взаимодействовать с протеином САХ или с доменами этого протеина. Это взаимодействие позволяет создать трансактиватор, способный индуцировать экспрессию генов иВА3, ΒΕΕ и Баю2 в штамме УСМ79.

Для этого просеивания был выбран банк слияния, собранный на основе кДНК из легкого человека. Поскольку этот банк был поставлен в форме бактерий, в первую очередь провели очистку плазмидной ДНК этого банка.

2.1) Получение плазмидной ДНК банка слияния.

Плазмидную ДНК банка кДНК легкого экстрагировали в соответствии с протоколом С1оп1ес6® (см. материалы и методы, §10). Важно было в процессе получения сохранить репрезентативность банка, т. е. сохранить число составляющих его независимых плазмид (7-10⁶).

Во избежание потерь плазмид из банка в ходе этого получения, использовали число изолированных колоний бактерий, в три с небольшим раза превосходящее репрезентативность банка, т.е. 25-10⁶.

2.2) Трансформация с помощью банка легкого и селекция с помощью тестирования активности бета-галактозидазы.

В ходе просеивания необходимо сохранить вероятность того, что каждая независимая плазмида банка слияния присутствует, по меньшей мере, в одной колонии дрожжей одновременно с плазмидой С А БАЭЗ-С АХ. Для сохранения такой вероятности важно, чтобы трансформация дрожжей была эффективной. Для этого был выбран метод трансформации, при котором эффективность трансформации составляет 10⁵ трансформированных клеток на 1 мкг ДНК. Кроме того, поскольку котрансформация дрожжей двумя разными плазмидами снижает эту эффективность, было решено использовать дрожжи, предварительно трансформированные с помощью плазмиды рСАЯ4ОВ-САХ. Этот дрожжевой штамм трансформировали с помощью 100 мкг плазмидной ДНК банка слияния. Это количество ДНК позволило получить по подсчетам (см. материалы и методы) 4,2-10⁷ трансформированных клеток, что составляет число, превосходящее число независимых плазмид в банке. На основании этого результата можно предположить, что практически все плазмиды банка участвовали в трансформации дрожжей. Селекцию трансформированных клеток, способных составлять функциональный трансактиватор САЯ4, проводили на среде УЫВ+Ьук+МеЕ+Нщ+Айе. В результате этой селекции получили 190 клонов с фенотипом Ита+ и ЬСа1+.

Пример 3. Идентификация вставок селекционированных плазмид. Выявление взаимодействия с Κι.

Плазмиды экстрагировали из дрожжевых клеток, ввели в бактерии, затем их получали так, как описано в разделе Материалы и методы. Секвенирование начинали с комплементарного олигонуклеотида СТАТТССАТСАТ СААСАТАСССС (8ЕЕ) ΙΌ Νο 1) из участка САЯ4ТА. который находится вблизи сайта встраивания банка кДНК легкого, на расстоянии 52 пар оснований от сайта ЕсоКЕ

Сравнение этих последовательностей с последовательностями банка данных СЕNВаηк и ЕМВЬ (Еигореап Мо1еси1аг Вю1оду ЬаЬ) показало, что одна из идентифицированных плазмид содержит кДНК, идентичную фактору Κι, определенному в качестве аутоантигена у больных красной волчанкой. Эту плазмиду назвали рСМ282. Эта плазмида, в случае ее котрансформации в дрожжах вместе с рСМ199, способна активировать их референтные гены, как это показано в табл. 1. Эта таблица также показывает специфичность активации, которая означает, что Κι способен специфически взаимодействовать с САХ.

Таблица 1

Векторы	Активность бета-да1
рСМ199+рСАО424	0
рСМ199+рСМ282	+
рСВТ10+рСМ282	0
рСВТ10+рСАЭ424	0

В этом примере описывается конструирование векторов, кодирующих различные варианты протеина САХ и используемых для определения структуры/функции этого протеина, и в частности, для выявления активных доменов и доменов, отвечающих за взаимодействие с протеином Κι.

Для осуществления делеции 153 Сконцевых аминокислот плазмиду рСМ199 расщепляют с помощью Еад 1-8а11, затем удаляют малый фрагмент, дефосфорилируют концы с помощью обработки 1<1епо\\' и соединяют их. Полученная плазмида называется рСМ238. Она кодирует протеин, содержащий остатки 1-104 протеина САХ.

Полное расщепление рСМ199 с помощью Вд12 и 8а11, последующая обработка 1<1епо\\' и связывание с вектором позволяют сохранить 32 первые аминокислоты САХ. Получаемая плазмида называется рСМ244. Она кодирует протеин, содержащий остатки 1-32 протеина САХ.

Полное расщепление рСМ199 с помощью Вд12 и 8а11 позволяет выделить фрагменты размером примерно 270 пар оснований и 572 пары оснований. Первый фрагмент клонируют в рСВТ11 в сайте Ватй1-8а11 и получают плазмиду рСМ245, с помощью которой можно осуществить слияние 79 С-концевых аминокислот с САЯ4ЭВ. Второй фрагмент клонируют в рСВТ10 в сайте Ватй1 и получают плазмиду рСМ246, с помощью которой можно осуществить слияние аминокислот 33-222 с САЯ4ЭВ.

Плазмиду рСМ280 получили путем расщепления рСМ246 с помощью Эта3 и р§П. После обработки Т4-полимеразой плазмида принимает замкнутую форму. Она кодирует протеин, содержащий остатки 33-63 САХ.

Плазмиду рСМ199 расщепляют с помощью Νώ;1 и Ρδΐ 1. Вставочный фрагмент клонируют в плазмиде рА81 и получают плазмиду рСМ301. Эта плазмида осуществляет экспрессию протеина САХ, потерявшего в результате делеции первые 32 аминокислоты и слитого с САЯ4ЭВ. Она кодирует протеин, содержащий остатки 33-302 протеина САХ.

Структура протеина слияния, экспрессию которого осуществляют эти различные векторы, представлена на фиг. 1.

Пример 5. Расположение области взаимодействия САХ с ΚΙ.

Дрожжевой штамм уСМ79 подвергают трансформации с помощью различных векторов, описанных в примерах 1 и 4, одновременно с рСМ282 и рСАЭ424. Активность бетагалактозидазы определяют, как описано в разделе Материалы и методы. Полученные результаты представлены в табл. 2.

Пример 4. Конструирование вектора экспрессии в дрожжах протеина слияния различных мутантов делеции САХ с доменом связывания с ДНК САЯ4.

Таблица 2

Векторы	Активность бетагалактозидазы
рСМ199+рСАО424	0
рСМ199+рСМ282	+
рСМ238+рСАО424	0
рСМ238+рСМ282	0
рСМ244+рСАО424	0
рСМ244-рСМ282	0
рСМ245+РСАО424	0
рСМ245+рСМ282	0
рСМ246+рСАО424	0
рСМ246+рСМ282	0
рСМ280+рСАО424	+
рСМ280+рСМ282	+
рСВТ10+рСМ282	0
рСМ301+рСМ282	0

Эти результаты позволяют выявить участок САХ, который взаимодействует с фактором Κι (табл. 2). Действительно, можно предположить, что участки, при отсутствии которых активность пропадает, являются необходимыми, но не достаточными. Так, участки 1-32 и 104223 имеют, по-видимому, важное значение для взаимодействия с Κι. То обстоятельство, что рСМ238 не дает положительного сигнала бетагалактозидазной активности, позволяет предположить, что существует С-концевой участок 104-302 протеина САХ, который является необходимым для взаимодействия в дрожжах.

Пример 6. Профиль экспрессии мРНК в различных тканях и ядерная локализация протеина, экспрессия которого осуществляется транзитно.

Для определения партнеров САХ трансформировали имеющийся дрожжевой двойной гибридный штамм, уже содержащий плазмиду, осуществляющую экспрессию белка слияния САЬ-САХ (1-302) в качестве антигена, с помощью банка кДНК легкого, слитого с САЬ4 ТА, который имелся в лаборатории (пример 2). К моменту амплификации получили более 41 миллиона независимых клонов и только 190 клонов, в которых проходила экспрессия всех трех селекционируемых генов (ген ПКА3, ген Ьас2 и ген ВЬЕ). В этих 190 клонах удалось определить 9 кДНК, кодирующих различные протеины. Особый интерес был направлен к кДНК, кодирующей антиген Κι.

Ген Κι является убиквитарным, судя по анализу с помощью ΝογΙΙιογπ Ыойшд (фиг. 1) его экспрессии на основе мРНК, экстрагированной из различных тканей (Нитап Ми1йр1е Тщки ΝοΠΙιογπ В1о18, С1оп1ес11). в котором выявляется мРНК размером около 3 т.п.н. Можно отметить присутствие одной формы мРНК, которая иначе проходит созревание (1,4 т.п.н.) в сердце и скелетных мышцах.

Вектор экспрессии протеина Κι, слитого с 1;щ НА, в клетках млекопитающих получили следующим образом: фрагмент №о1-Х1ю1 плазмиды рСМ282 встроили в плазмиду рА81 на уровне сайтов №о1-Х1ю1 и получили плаэмиду рСМ322. Затем фрагмент ЕсоК.1-Эга1 плазмиды рСМ322 встроили в вектор экспрессии ρί'.ΌΝΛ3 на уровне сайтов ЕсоВ1-ЕсоВУ. Полученная плазмида рСМ323 осуществляет экспрессию протеина Κι, слитого с 1;щ НА в клетках млекопитающих.

С помощью непрямой иммунофлюоресценции было показано, что ЕтНА имеет ядерную локализацию в клетках, трансфицированных этой химерой (фиг. 2).

Пример 7. Экспрессия и очистка протеина Κι, слитого с 1;щ 8 и 1ад тус.

Нижеследующие олигонуклеотиды гибридизировали вместе, фосфорилировали, затем соединяли с рЕТ29В, предварительно расщепленным с помощью Ысо 1.

САТСААССТТАТССАССАСААССТСАТСТ СССАССАССАССТССАССТТС (8ЕО ΙΌ Νο 2) и

САТССАТССАССТССАССТССТССТСССА САТСАССТТСТССТССАТААССТТ (8ЕТ) ГО Νο 3).

Полученную плазмиду назвали рСМ320. Ген, кодирующий протеин Κι, амплифицировали с олигонуклеотидами СССССАТСССАТССССТССТТССТС (8ЕТ) ГО Νο 4) и СТАСАССТССАСТСАСТАСАСАСТСТСТСС (8ЕТ) ГО Νο 5).

Полученный фрагмент расщепили с помощью Ват11 Х1о1, затем, после соединения, ввели в сайты ЬатН1-Х1ю1 плазмиды рВСкк и получили плазмиду рСМ305. Затем эту плазмиду расщепили с помощью Ват1 1 Х1 о1. Таким образом выделенный вставочный фрагмент соединили с сайтом Ват1 1 и Х1 о1 плазмиды рСМ320 и получили плазмиду рСМ321. Экспрессию и очистку рекомбинантного протеина проводят согласно указаниям производителя (№уадеп), используя рСМ321.

Пример 8. Экспрессия и очистка протеина САХ, слитого с С8Т.

Колонии ВЬ-21, трансформированные с помощью плазмиды рСЕХ-2Т-1 -САХ, помещают на ночь в первичную культуру в 30 мл ЬВ с ампициллином (50 мкг/мл) при 37°С. 5 мл этой культуры помещают в культуру в 500 мл ЬВ с ампициллином при 37°С до получения оптической плотности от 0,7 до 600 нм. Экспрессию С8Т-САХ индуцируют с помощью 0,1 мМ 1РТС в течение 2 ч при 30°С. Культуру центрифугируют при 6000 об./мин в течение 10 мин. Осажденные бактерии помещают в раствор в 10 мл холодного РВ8, затем распределяют в 10 пробирок Эппендорфа. Бактериальные протеины экстрагируют с помощью обработки ультразвуком в течение 10 мин с циклами по 12 с и с паузами 24 с и последующего центрифугирования при 15000 об./мин в течение 15 мин. Собирают су пернатанты, составляющие растворимую фракцию, которая будет использована при очистке. Осадок составляет нерастворимую фракцию.

Очистку ОЛХ осуществляют благодаря сродству О8Т на спаренных агарозных структурах к глутатиону.

Супернатант, полученный после обработки бактерий ультразвуком, инкубируют со смолой в течение 1 ч на вращательном взбалтывателе при комнатной температуре. Затем смолу, с которой связывается протеин, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант удаляют, а смолу промывают 3 раза, используя каждый раз 50 мл РВ8, содержащего 1% Ттйои Х-100, в течение 20 мин на вращательном взбалтывателе. О8Т-ОАХ можно отделить от смолы элиюрованием с помощью гуанидинтиоцианата. Элюирование проводят, используют 1,5 объема (от объема смолы) 2М гуанидинтиоцианата, 20 мМ Тгй рН 7,5, 0,15М ЫаС1 и 0,1% Ттйои X-100, на вращательном взбалтывателе в течение 30 мин. Проводят диализ элюата с РВ8 в течение ночи для удаления гуанидинтиоцианата. Протеин консервируют в РВ8 при 4°С. К препарату протеина добавляют, в количестве 1/200 от количества этого препарата, коктейль ингибиторов протеаз в равных количествах (лейпептин 1 мг/мл, пепстатин 1 мг/мл, апротинин 1 мг/мл, бензамидин 500 мМ).

Пример 9. Взаимодействие ίη νίΐτο протеинов Κί и ОЛХ.

Для изучения взаимодействия ОЛХ и Κί ίη νίΐτο в ЕксйепсЫа Сой получили два рекомбинантных химерных протеина. О8Т-ОЛХ очищали на смоле, сцепленной с глутатионом благодаря каталитическому сайту глутатион-8трансферазы (О8Т); при этом 8тусК1 содержит эпитоп тус, а эпитоп 8 позволяет осуществить очистку на смоле, сцепленной с протеином 8.

Указанные количества бычьего альбумина, протеина О8Т или О8Т-ОЛХ после расщепления тромбином (сайт, созданный между О8Т и ОЛХ), а также увеличивающиеся количества О8Т-ОЛХ разделили на денатуриующем полиакриламидном геле, затем окрашивали голубым Кумасси (фиг. 3А).

Протеины из геля, идентичного используемому в случае А, переместили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану инкубировали последовательно в присутствии 8тусК1 в растворе, содержащем моноклональные мышиные антитела к эпитопу тус (8ан1а Сгих). и, наконец, в растворе для определения антител анти-тус.

Результаты ясно показывают, что Κί специфически распознает О8Т-ОАХ, причем это зависит от дозы, в то время как с бычьим альбумином или О8Т не наблюдается никакой реакции. Следует подчеркнуть, что Κί взаимодействует с ОАХ даже после расщепления тромбином (фиг. 3В).

Пример 10. Конструирование векторов экспрессии в клетках млекопитающих протеина слияния различных делеционных мутантов ОАХ и домена связывания с ДНК ОАЬ4.

10.1. Конструирование плазмидных векторов.

Плазмиды рСМ199 и рСМ301 расщепляют с помощью ΗίηάΙΙΙ. Вставочные фрагменты клонируют в правильном направлении в ρί.ΌΝΑ3 (шуйгодей) в сайте ΗίηάΙΙΙ и получают, соответственно, плазмиды рСМ291 и рСМ327, осуществляющие экспрессию протеинов слияния в клетках млекопитающих.

Плазмиды рСМ238, рСМ244, рСМ301, рСМ246 и рСМ280 расщепляют с помощью ΗίηάΙΙΙ и №ей Вставочные фрагменты клонируют в правильном направлении в ρί.ΌΝΑ3 (ίηуйтодей) в сайте ШЫШ-ЕсоКУ и получают соответственно плазмиды рСМ292, рСМ326, рСМ327, рСМ294 и рСМ295, осуществляющие экспрессию протеинов слияния в клетках млекопитающих.

10.2. Конструирование вирусных векторов.

В одном из своих аспектов изобретение относится к конструированию и использованию вирусных векторов переноса и экспрессии ίη у|уо нуклеиновых кислот, определенных выше.

В частности, среди аденовирусов были изучены различные серотипы с не сильно варьирующими структурой и свойствами. Среди этих серотипов предпочтение в рамках настоящего изобретения отдают аденовирусам человека типа 2 или 5 (АО 2 или Αά 5) или аденовирусам животных (см. заявку \УО 94/26914). Среди аденовирусов животных, которые могут быть использованы в рамках настоящего изобретения, можно назвать аденовирусы собак, крупного рогатого скота, мышей (пример: Мау1. ВеаМ и др., У1го1оду 75 (1990) 81), овец, свиней, птиц или обезьян (пример: 8АУ). Предпочтительно в качестве аденовируса животных используют аденовирус собак, преимущественно аденовирус САУ2 [например, штамм Маийайаи или А26/61 (АТТС УК-800)]. Предпочтительно в рамках изобретения используют аденовирусы человека или собаки, или смешанные.

Предпочтительно, дефектные аденовирусы по изобретению содержат IΤР, последовательность, контролирующую инкапсидирование и нуклеиновую кислоту по изобретению. Еще лучше, если, по меньшей мере, участок Е1 генома аденовирусов по изобретению является нефункциональным. Рассматриваемый вирусный ген можно сделать нефункциональным любым известным специалистам способом, в частности, общей супрессией, замещением, частичной делецией или добавлением в один или несколько таких генов одного или нескольких оснований. Такие модификации могут быть получены ίη ν Иго (на выделенной ДНК) или ίη 5 Шт например, методами генной инженерии или обработкой мутагенными агентами. Другие участки также могут быть модифицированы, в частности, это относится к участку Е3 (XVО

95/02697), Е2 (№0 94/28938), Е4 (№0 94/28152, №0 94/12649, №0 95/02697) и Ь5 (№0 95/02697). Согласно одному из предпочтительных способов осуществления делеция имеет место в участках Е1 и Е4 аденовируса по изобретению. Согласно другому предпочтительному способу осуществления делеция происходит в участке Е1, на уровне которого встраивают участок Е4 и последовательность нуклеотидов по изобретению (см. ЕК 94 13355). В вирусах по изобретению делеция в участке Е1 предпочтительно распространяется с нуклеотидов 4553329 на последовательность аденовируса АЙ5.

Дефектные рекомбинантные аденовирусы по изобретению могут быть получены любым известным специалистам способом (Ьетгего и др., Сепе 101 (1991) 195, ЕР 185 573; Стайат, ЕМВ0 1. 3 (1984) 2917). В частности, они могут быть получены методом гомологичной рекомбинации между аденовирусом и плазмидой, содержащей, в числе прочих, последовательность нуклеотидов или комбинацию последовательностей нуклеотидов по изобретению. Гомологичная рекомбинация происходит после котрансфекции указанных аденовируса и плазмиды в соответствующую линию клеток. Используемая линия клеток должна предпочтительно (1) быть способной к трансформации указанными элементами и (ίί) содержать последовательности, которые могут быть комплементарными к части генома дефектного аденовируса, предпочтительно, в интегрированном виде во избежание рекомбинации. В качестве примера линии клеток можно назвать линию клеток почки эмбриона человека 293 (Сгайат и др., 1. Сеп. У1го1. 36 (1977) 59), которая содержит, в частности, интегрированной в геном, левую часть генома аденовируса Ай5 (12%) или линии, способные содержать элементы, комплементарные функциям Е1 и Е4, такие, как описано, в частности, в заявках №№ №0 94/26914 и №0 95/02697 или в Уеп и др., 1. У1го1. 70 (1996) 559).

Далее размноженные вирусы собирают и очищают обычными методами молекулярной биологии.

Среди аденоассоциированных вирусов (ААВ) используют ДНК-содержащие вирусы относительно малых размеров, которые устойчиво и сайт-специфически встраиваются в геномы инфицируемых ими клеток. Они могут инфицировать широкую гамму клеток, не оказывая эффекта на рост, морфологию или дифференцировку клеток. Кроме того, они, повидимому, не участвуют в развитии патологий у человека. Геном ААВ клонировали, секвенировали и охарактеризовывали. Он включает в себя около 4700 оснований и содержит на каждом конце повторяющийся обращенный участок (1ТК) размером около 145 оснований, который выполняет функции участка начала репликации вируса. Остальная часть генома подразделяется на два основных участка, выполняющих функ ции инкапсидирования: левую часть генома, которая содержит ген гер, участвующий в репликации вируса и в экспрессии вирусных генов; и правую часть генома, которая содержит ген сар, кодирующий протеины капсида вируса.

Использование векторов от ААВ для переноса генов ίη νίίτο и ίη νίνο было описано в литературе (см. в частности №0 91/18088; №0 93/09239; И8 4 797 368, И8 5 139941, ЕР 488 528). В этих заявках описаны различные конструкции, полученные на основе ААВ, в которых гены гер и/или сар подверглись делении и были замешены нужным геном, и их применение для переноса ίη νίίτο (на культуру клеток) или ίη νίνο (непосредственно в организм) указанного нужного гена. Дефектные рекомбинантные ААВ по изобретению могут быть получены котрансфекцией в линии клеток, инфицированной вспомогательным вирусом человека (например, аденовирусом), плазмиды, содержащей последовательность нуклеотидов или комбинацию последовательностей нуклеотидов по изобретению между двумя повторяющимися обращенными участками (1ТК) ААВ, и плазмиды, несущей гены инкапсидирования (гены гер и сар) ААВ. Используемой линией клеток может быть, например, линия 293. Другие системы для получения описаны, например, в заявках №0 95/14771; №0 95/13365; №0 95/13392 или №0 95/06743. Полученные рекомбинантные ААВ очищают обычными способами.

В отношении вирусов герпеса и ретровирусов, получение рекомбинантных векторов было широко описано в литературе (см., в частности, ВтеакйеИ и др., Νον Βίο^ίκί 3 (1991) 203; ЕР 453 242, ЕР 178 220, ВетДеш и др., денет Епд. 7 (1985) 235; ΜοΟοιμοΕ ВюТесйгю^ду 3 (1985) 689 и т.д. В частности, ретровирусы являются интегративными вирусами, избирательно инфицирующими делящиеся клетки. Таким образом, использование этих вирусов в качестве векторов представляет интерес для лечения рака. Геном ретровирусов включает, главным образом, два ЬТК. одну последовательность инкапсидирования и три кодирующих участка (дад, рο1 и ст ). В рекомбинантных векторах - производных ретровирусов гены дад, рο1 и ет^г обычно подвергаются делеции, полностью или частично, и обычно бывают замещены нужной гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты. Эти векторы могут быть получены на основе различных типов ретровирусов, в частности, ΜοΜιιΕ-У («титше Мο1οηеу 1еикет1а νίπικ»; также называемый ΜοΜΕν), М8У («титше Мο1οηеу катета νίπικ»). На8У («Нагуеу каттота νίπικ»), 8Νν («кр1ее1т иестокЕ νίπικ»); В8У («Ροιικ каттота νίπικ») или вируса Френда. Для получения рекомбинантных ретровирусов по изобретению, содержащих последовательность нуклеотидов или комбинацию последовательностей нуклеотидов по изобретению, конструируют плазмиду, содержащую, в частности, БТК, последовательность инкапсидирования и указанную последовательность нуклеотидов, затем ее используют в трансфекции т.н. инкапсидирующей линии клеток, способной поставлять в плазмиду, в трансположении, дефектные функциональные вирусные участки. Т.е. инкапсидирующие линии клеток обычно способны к экспрессии генов дад, ро1 и епу. Такие инкапсидирующие линии описаны в уровне техники, в частности, линия РА317 (И8 4 861 719); линия РыСК1Р (УО 90/02806) и линия СР+епуАш-12 (УО 89/07150). Кроме этого, БТК рекомбинантных ретровирусов могут быть модифицированы для подавления транскрипционной активности, а последовательности инкапсидирования могут быть увеличены и содержать часть гена дад (Вепйег и др., 1. У1го1. 61 (1987) 1639). Полученные рекомбинантные ретровирусы очищают обычными способами.

10.3. Химические векторы.

Нуклеиновые кислоты или плазмидные векторы экспрессии, описанные в предыдущих примерах, могут быть введены в чистом виде ίη νίνο или ех νίνο. Действительно, было показано, что чистые нуклеиновые кислоты могут проникать в клетки. Однако для повышения эффективности переноса предпочтительно использовать в рамках настоящего изобретения вектор переноса. Это может быть вирусный вектор (пример 9.2.) или синтетический агент трансфекции.

Среди разработанных синтетических векторов предпочтение в рамках настоящего изобретения отдают катионным полимерам типа полилизина, (БКБК)п (БККБ)п (РСТ/РК/00098), полиэтиленимина (ЛУО 96/02655) и ОЕАЕдекстрана, а также катионным липидам или липофектантам. Они способны конденсировать ДНК и способствовать ее соединению с клеточной мембраной. Среди последних можно назвать липополиамины (липофектамин, трансфектам и т.д.), различные катионные или нейтральные липиды (ΌΟΤΜΛ. ΌΟΟ8, ПОРЕ и т.д.), а также пептиды ядра. Кроме того, была разработана концепция трансфекции, согласно которой трансфекция осуществляется при участии рецептора, использующего принцип конденсации ДНК благодаря катионному полимеру и при этом направляющего процесс фиксации комплекса на мембране за счет химического связывания с лигандом мембранного рецептора на поверхности того или иного типа прививаемых клеток. Так было описано распознавание рецепторов трансферина, инсулина или рецепторов азиалогликопротеинов гепатоцитов. Композиция по изобретению, в которой используют такой химический вектор, может быть получена любым известным специалистам способом; обычно ее получают обычным смешиванием различных составляющих.

Пример 11. Использование методики изучения транскрипционной активности САХ.

Использовали систему транзитной трансфекции для изучения собственной транскрипционной активности протеинов слияния САБОВ САХ, а также эффекта, оказываемого ими на активаторы транскрипции, такие как рецептор эстрогенов (ЕК) или домен кислотной активации протеина УР16 вируса Не грек К1тр1ех, слитого с САБОВ. Для количественного определения транскрипционной активности каждого из или комбинации нескольких факторов был создан ген-мишень (Репортер), осуществляющий экспрессию бактериальной хлорамфениколацетилтрансферазы (САТ) под контролем искусственного промотора. Этот промотор содержит бокс ТАТА, взятый из гена Е1 В аденовируса Ай2 (Е1В ТАТА) перед сайтом инициации транскрипции гена САТ (фиг. 4А). Протеин ТВР комплекса ТР1ГО распознает бокс ТАТА и вставляет комплекс преинициации (ТРПО+-ТРП А, В, Е, Р), кодирующий РНК-полимеразу типа II (Ро111), которая затем выступает инициатором транскрипции гена САТ. Перед этим базовым промотором вставили сайт связывания САБОВ (17мер), который распознается химерами САБОВ-САХ или САБОВ-УР16. Также выше 17мера клонировали элемент ответа на эстрогены (ЕКЕ), с которым связывается ЕК для активации транскрипции. Этот репортер позволяет изучить различные схематичные комбинации, учитывая изменения количества САТ в клетке, которые соответствуют активации или подавлению транскрипции. Количественное измерение ферментной активности САТ в клеточных экстрактах после трансфекции используют при оценке транскрипционного эффекта.

ЕК и САБ4-УР16 представляют собой очень сильные активаторы транскрипции. ЕК усиливает активность САТ более чем в 100 раз, а САБ4-УР16 - примерно в 85 раз. Соэкспрессия ЕК и САБ4-УР16 приводит к усилению активности САТ в более чем 300 раз по сравнению с активностью неактивированного репортера, причем этот эффект оказывается больше суммы эффектов обоих активаторов по отдельности. Это позволяет прийти к выводу, что ЕК и САБ4-УР16, несмотря на их большие пространственные размеры, могут присоединяться к одному и тому же промотору и активировать его (фиг. 4В).

Пример 12. Изучение транскрипционной активности протеинов слияния САБОВ-САХ и определение домена-репрессора транскрипции.

Ген дах кодирует протеин, который у человека имеет размер 302 аминокислоты. В первичной структуре этого протеина различают различные домены, функция которых неизвестна. САХ принадлежит к семейству т.н. гомеобоксовых генов. Гомеобокс необходим для узнавания и связывания этих протеинов с специфическими последовательностями ДНК в промоторах генов-мишеней, экспрессию которых они контролируют. На сегодняшний день ни одна последовательность ДНК, узнаваемая протеином ОАХ, не была идентифицирована. ОАХ имеет в Ν-концевой части участок, богатый остатками гистидина (ΗΙ8), функция которого не установлена.

Для понимания функции ОАХ подвергли делеции различные участки гена дах человека, чтобы получить протеины, усеченные как в Νконцевой, так и в С-концевой части, числа показывают позицию первой и последней аминокислоты каждого делеционного мутанта по отношению к целому ОАХ 1-302 (фиг. 5). В отсутствие сведений о последовательностях ДНК, естественным образом узнаваемых ОАХ, были созданы химерные конструкции из различных делеционных мутантов и домена связывания с гетерологичной ДНК (слитого с их Νконцевыми частями), полученного от транскрипционного фактора дрожжей ОАБ4 (ОАББВ). Были созданы векторы экспрессии для осуществления транзитной экспрессии различных химер в культуре клеток млекопитающих.

Осуществляли экспрессию различных химер ОАБ-ОАХ, отдельно или в присутствии БК, для изучения их воздействия, соответственно, на базовую транскрипцию или на транскрипционную активность ЕК.

Цельный ОАХ в контексте слияния ОАБОАХ 1-302 снижает более чем в 8 раз активность САТ по отношению к неактивированному репортеру. Этот эффект подавления слабо изменяется при отсутствии 32 Ν-концевых аминокислот ОАХ (ОАБ-ОАХ 33-302), но полностью исчезает при дополнительной делеции Сконцевой части ОАХ (ОАБ-ОАХ 33-222). Присутствия этих 32 аминокислот достаточно в контексте ОАБ-ОАХ 1-32, чтобы уменьшить активность САТ (фиг. 6 А).

Соэкспрессия ОАБ-ОАХ 1-302 и ЕК приводит к снижению активности САТ более чем в 25 раз по сравнению с активностью, показанной только с ЕК. Этот эффект подавления связан, как и в А с 32 первыми аминокислотами ОАХ (сравнит. ОАБ-ОАХ 1-302, ОАБ-ОАХ 33-302 и оАб-ОАХ 33-222). Эти 32 Ν-концевые аминокислоты (ОАБ-ОАХ 1-32) снижают активность ЕК только в 2 раза (сравнит. ОАБ-ОАХ 1-32, ОАБ-ОАХ 1-104) и требуют, по меньшей мере, присутствия остатков 33-222 для максимальной активности (фиг. 6В).

Исследовали последовательности, в отсутствие которых пропадала активность, что позволило прийти к выводу об их необходимости для взаимодействия, но не достаточности.

Представленные результаты показывают, что ОАХ подавляет транскрипцию используемого гена-репортера. Этот эффект подавления связан, главным образом, с Ν-концевым пептидом (1-32), оптимальная активность которого требует присутствия участка 33-222 протеина

ОАХ, и предпочтительно, участка 33-104 Оах.

Используя различные варианты делеции ОАХ, слитые с доменом связывания с ДНК ОАБ4, определили в дрожжах (с помощью двойной гибридной системы, пример 5) участки ОАХ, имеющие важное значение для взаимодействия с Κί. Таким участком является Νконцевая часть до остатка 222. Этот участок содержит, как было показано выше, доменрепрессор.

Пример 13. Взаимодействие ίη νΐίΓο между ОАХ и РСт.

13.1 Клонирование кДНК «РгоНГегаБид Се11 Шс1еаг АиБдеи» человека (ΡСNА) и получение рекомбинантного протеина.

Клонирование кДНК ΡСNА осуществляют с помощью обратной транскрипции и ПЦР. Первый этап обратной транскрипции (КТ) осуществляют, используя набор «ΡΪΓδί 81гаиБ с^NА зуиШеыз» (РБагшас1а). Общую РНК экстрагируют из клеток гладкой мускулатуры человека в первичной культуре (ОоиеБсз) по методу, описанному Р. СБотс/уизк и Ν. 8ассБ1 (Аиа1. ΒίοсБет. 1987, 162: 156-159). 10 мкг этой общей РНК нагревают в 20 мкл воды в течение 10 мин при 65°С, охлаждают на льду, затем смешивают с 11 мкл «Ви1к ΡΪΓδί 8БаиБ геасБои ш1х» из набора для КТ (С1оиеБ, БРБСриге®, Мипие Кетегзе Т^аи8с^^рίа8е, Кηа8е/^иа8е-Б^ее В 8 А, БАТР, БСТР, БОТР аиБ БТТР), 1 мкл БТТ и 1 мкл затравки ρϋ(Ν)6. Реакционную среду КТ инкубируют 1 ч при 37°С. Реакцию останавливают нагреванием в течение 5 мин при 90°С, затем среду охлаждают на льду.

Второй этап заключается в амплификации в ПЦР кДНК ΡСNА. Для этой реакции ПЦР используют следующие затравки:

5-ССС6даа11ЪсТ<лТТС<лАС6С6С<лССТССТССАСб-3'

РЕАВЬУОС

5'-ССТСдааБЕсТААбАТССТТСТТСАТССТССАТС-З' * 36ΕΕΌΕΙΚ

Обе затравки несут сайт ЕсоК1 (подчеркнутые строчные буквы). Аминокислоты ΡСNА, содержащиеся в затравках, отмечены буквенными кодами (заглавные буквы) под соответствующими кодонами. * означает стоп-кодон

РСт.

мкл реакционной среды КТ, описанной выше, доводят до конечного объема 50 мкл с следующими конечными содержаниями или концентрациями: 50 пикомоль затравки 1, 50 пикомоль затравки 2, одна единица Тад АГЖполимеразы (Регкт Е1тег), 5 мкл МдС1₂ (25 мМ), 2 мкл смеси 200 мМ всех 4 дезоксинуклеотидов (дАТФ, дТТФ, дГТФ и дЦТФ) и 5 мкл десятикратно концентрированного буфера ПЦР (Регкт Е1тег).

Амплификацию в ПЦР проводят в пробирках М1соатр™ (Регкт Е1тег) при помощи термоциклера РТС-100™ (МБ КезеагсБ, 1ис.). Эта амплификация состоит из этапа денатурации при 95°С в течение 2 мин и 30 циклов, вклю37 чающих этап денатурации продолжительностью 15 с при 95°С, этап гибридизации продолжительностью 30 с при 55°С и этап удлинения цепи продолжительностью 1 мин при 72°С. За этими тридцатью циклами следует дополнительный этап удлинения цепи продолжительностью 5 мин, затем продукт реакции ПЦР консервируют при 10°С.

Клонирование РСNА в векторе РСВ11 (1пуйгодеп) осуществляют, используя «Опдта1 ТА С1ошпд® ΚίΙ» (1пуйгодеп). 3 мкл продукта ПЦР, 1 мкл буфера сшивания 10Х, 2 мкл вектора РСВ11 (25 нг/мкл), 3 мкл воды и 1 мкл Т4 ДНКлигазы инкубируют при 16°С в течение 16 ч.

мл этой среды сшивания используют для трансформации вышеописанных компетентных бактерий ТС1. Затем бактерии культивируют при 37°С в течение 16 ч на твердой среде ЬВ, содержащей 1,5% агара, 100 мкг/мл ампициллина в присутствии Х-да1 для селекции по цвету рекомбинантных клонов (альфа-комплементация β-галактозидазы).

Рекомбинантные клоны (белые колонии) помещают в 10 мкл воды и подвергают обработке в условиях, идентичных вышеописанным условиям ПЦР, за исключением того, что к среде добавляют Тгйоп Х-100 в конечной концентрации 0,01% об./об.

Несколько положительных клонов используют для получения небольших количеств ДНК, в которых часть 5' вставочного фрагмента РСNА находится после сайта ЕсоВУ рСВ11 и которые секвенируют и оставляют для использования на этапе последующего клонирования.

Клонирование РСNА в плазмиде рЕТ29 осуществляют следующим образом: фрагмент РСNА ЕсоВУ-НтйШ, полученный из РСВ11РСNА, встраивают на уровне сайта ЕсоВУНшйШ рЕТ29. Эту плазмиду потом используют для получения химерного рекомбинантного протеина 8-РСNА. Этапы трансформации, получения и очистки 8-РСNА идентичны этапам получения антигена Κι, слитого с эпитопом тус.

13.2. Изучение взаимодействия ш νίΙΐΌ САХ с РСт.

Исследование проводят по методу, использованному в примере 9 для изучения взаимодействия рекомбинантных протеинов С8Т-САХ и 8тус1<г.

Возрастающие количества рекомбинантного С8Т и химеры С8Т-САХ (50, 250, 500 и 750 нг) разделяют на 14% полиакриламидном денатурирующем геле Щоуех). Протеины переносят с геля на нитроцеллюлозную мембрану, которую затем инкубируют в растворе, содержащем рекомбинантный протеин 8-РСNА, после чего проводят мечение РСNА с помощью моноклональных антител к РСNА (8ап1а Сгих).

На фиг. 7 показано слабое взаимодействие С8Т с РСNА исключительно при высоких дозах С8Т (500 и 750 нг). Сродство к РС№А С8Т-САХ значительно выше, чем у С8Т.

Это специфичное взаимодействие САХ и РСNА позволяет предположить, что антипролиферативная активность САХ опосредована захватом РСNА. Тот факт, что Κι может взаимодействовать одновременно с САХ и с РСNА говорит в пользу образования двух- или трехчастных комплексов, которые могут играть важную роль (активация или ингибирование) в развитии клеточного цикла.

Описание последовательностей

1) Общая информация

ί) Заявитель

A) ИМЯ : ВНОХЕ-РОиЬЕ^ ВОВЕВ 8.А.

B) Улица: 20, ауепие Ваутопй Агоп

C) Город: АпЮпу

Е) Страна: Франция

Е) Почтовый индекс: 92165 ίί) Название изобретения: Полипептиды, содержащие домены протеина, участвующего в подавлении транскрипции и/или взаимодействующего с протеинами, соответствующие нуклеиновые кислоты и их применение.

ίίί) Число последовательностей: 8 ίν) Форма, читаемая компьютером:

A) Тип носителя: Таре

B) Компьютер: 1ВМ РС совместимый

C) Операционная система: РС-ОО8/М8ΌΟ8

Ό) Программа: Ра1епйп Ве1еаке #1.0, версия #1.25 (ОЕВ)

2) Информация по 8Е0 ΙΌ № 1

ί) Характеристики последовательности:

A) Длина: 23 пары оснований

B) Тип: нуклеиновая кислота

C) Число цепочек: простая

Ό) Конфигурация: линейная ίί) Тип молекулы: кДНК ίίί) Гипотетичность: нет ίίί) Антисмысловая: нет χί) Описание последовательности: 8Е0 ΙΌ № 1

СТАТТССАТВ АТЕААОАТАС ССС ' 23

2) Информация по 8Е0 ΙΌ № 2

ί) Характеристики последовательности:

A) Длина: 50 пар оснований

B) Тип: нуклеиновая кислота

C) Число цепочек: простая

Ό) Конфигурация: линейная ίί) Тип молекулы: кДНК ίίί) Гипотетичность: нет ίίί) Антисмысловая: нет χί) Описание последовательности 8Е0 ΙΌ № 2:

САТСААОСГТ АТССАССАОА АОСТСАТСТС СОАОБАОСАС СТОСАССТТС 50

2) Информация по 8Е0 ΙΌ № 3:

ί) Характеристики последовательности:

A) Длина: 53 пары оснований

B) Тип: нуклеиновая кислота

C) Число цепочек: простая

Ό) Конфигурация: линейная ίί) Тип молекулы: кДНК ίίί) Гипотетичность: нет ίίΐ) Антисмысловая: нет χΐ) Описание последовательности 8ЕР ГО Νο 3:

САТССАТССА ССТССА6СТС СТССТСОСАС АТСАССТТСТ ОСТССАТААС СТТ 53

2) Информация по 8ЕР ГО Νθ 4

1) Характеристики последовательности:

A) Длина: 25 пар оснований

B) Тип: нуклеиновая кислота

C) Число цепочек: простая

Ό) Конфигурация: линейная ΐΐ) Тип молекулы: кДНК ΐΐΐ) Гипотетичность: нет ΐΐΐ) Антисмысловая: нет χΐ) Описание последовательности 8ЕР ГО Νο 4:

СССССАТССС АТССССТССТ ТССТС 25

2) Информация по 8ЕР ГО Νθ 5

1) Характеристики последовательности:

A) Длина: 30 пар оснований

B) Тип: нуклеиновая кислота

C) Число цепочек: простая

Ό) Конфигурация: линейная ΐΐ) Тип молекулы: кДНК ΐΐΐ) Гипотетичность: нет ΐΐΐ) Антисмысловая: нет χΐ) Описание последовательности 8ЕР ГО Νο 5

ОТасасСТСО асгсастаСа слстстстсс зо

2) Информация по 8ЕР ГО Νθ 6:

1) Характеристики последовательности:

A) Длина: 30 пар оснований

B) Тип: нуклеиновая кислота

C) Число цепочек: простая

Ό) Конфигурация: линейная ΐΐ) Тип молекулы: кДНК ΐΐΐ) Гипотетичность: нет ΐΐΐ) Антисмысловая: нет χΐ) Описание последовательности 8ЕР ГО Νο 6

САОССААТТС АТСАССАТСА СССТТСАСАС 30

2) Информация по 8ЕР ГО Νθ 7

ι) Характеристики последовательности:

A) Длина: 30 пар оснований

B) Тип: нуклеиновая кислота

C) Число цепочек: простая

Ό) Конфигурация: линейная ΐΐ) Тип молекулы: кДНК ΐΐΐ) Гипотетичность: нет ΐΐΐ) Антисмысловая: нет χΐ) Описание последовательности 8ЕР ГО Νθ 7

6А6ССААТТС АСТСАТССТС ТТССССААСС 30

2) Информация по 8ЕР ГО Νθ 8

ι) Характеристики последовательности:

A) Длина: 60 пар оснований

B) Тип: нуклеиновая кислота

C) Число цепочек: двойная

Ό) Конфигурация: линейная ΐΐ) Тип молекулы: кДНК ΐΐΐ) Гипотетичность: нет ΐΐΐ) Антисмысловая: нет χΐ) Описание последовательности 8ЕР ГО Νθ 8

ТССАСАССТС АТАТТСАССТ ААССТТСССС ТСССАСТАСТ СТССТСССАС ТСССАТАТСТ СТССАС ТАТААСТбСА ТТССААСССС АСССТСАТСА СЛССАСССТС АСОСТАТАСАСАТС

Claims (24)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Полипептид, отличающийся тем, что он представляет собой фрагмент протеина САХ (Сго^Ф-АггекЕЗресШс НотеоЬоχ) человека, содержащий, по меньшей мере, остатки 1-32 протеина САХ и обладающий репрессорной активностью в отношении транскрипции и/или оказывающий положительное или отрицательное влияние на репликацию ДНК.
2. 2. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно содержит остатки 140-230 протеина САХ человека.
3. 3. Полипептид, отличающийся тем, что содержит, по меньшей мере, один фрагмент, выбранный из фрагментов 1-32, 33-302 и 1-104 протеина САХ человека и обладающий репрессорной активностью в отношении транскрипции и/или оказывающий положительное или отрицательное влияние на репликацию ДНК.
4. 4. Полипетид, отличающийся тем, что он содержит, по меньшей мере, один фрагмент, выбранный из фрагментов 1-32 и 104-223 протеина САХ и способный взаимодействовать с протеином К1.
5. 5. Полипептид по одному из пп.1-3, отличающийся тем, что он способен взаимодействовать с ΡСNА.
6. 6. Полипептид по одному из пп.1-3, отличающийся тем, что он способен взаимодействовать с К1 и/или ΡСNА и образовывать, по меньшей мере, двухчастный или, по меньшей мере, трехчастный комплекс с этими протеинами.
7. 7. Полипетид, отличающийся тем, что кроме фрагмента протеина САХ, обладающего репрессорной активностью в отношении транскрипции, он дополнительно содержит, по меньшей мере, один фрагмент другого происхождения.
8. 8. Полипептид по п.7, отличающийся тем, что фрагмент другого происхождения обладает биологической активностью и является маркером или элементом для определения мишени.
9. 9. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по одному из пп.1, 2, 5 или 6.
10. 10. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по одному из пп.3, 5 или 6.
11. 11. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по одному из пп.4-6.
12. 12. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по п.7.
13. 13. Нуклеиновая кислота по одному из пп.9-12, отличающаяся тем, что она представляет собой кДНК.
14. 14. Кассета экспрессии, включающая в себя нуклеиновую кислоту по одному из пп.9-13 под контролем промотора.
15. 15. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по одному из пп.9-13 или кассету экспрессии по п.14.
16. 16. Вектор по п.15, отличающийся тем, что он является вирусным вектором.
17. 17. Вектор по п.16, отличающийся тем, что он представляет собой аденовирус.
18. 18. Вектор по п.16, отличающийся тем, что он представляет собой ретровирус.
19. 19. Применение полипептида по одному из пп.1-7 для подавления транскрипции генов и/или оказания положительного или отрицательного влияния на репликацию ДНК.
20. 20. Применение полипептида по одному из пп.1-7 для получения двух- или трехчастного комплекса с протеинами Κι и/или РСNА и ока зания положительного или отрицательного влияния на развитие клеточного цикла.
21. 21. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что она содержит, по меньшей мере, один полипептид по одному из пп.1-7.
22. 22. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что она содержит вектор по одному из пп.15-18.
23. 23. Способ просеивания и/или определения полипептидов, взаимодействующих с протеином САХ или одним из доменов САХ, отличающийся тем, что используют полипептид по одному из пп.1-7.
24. 24. Способ по п.23, отличающийся тем, что полипептид выбирают из фрагментов 1-32 и 33302 протеина САХ.