JP2013522169A - 炎症および好中球減少症の処置のための化合物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、好中性細胞のアポトーシスをモデュレーションする化合物に関する。特に、本発明は、好中球依存性炎症過程を含む疾病の処置において使用するための、増殖細胞核抗原(PCNA)と、好中性細胞中の細胞質PCNAと結合しているタンパク質との間の相互作用を阻害する化合物に関する。本発明はまた、好中球依存性炎症過程の処置において使用するための化合物の同定法にも関する。本発明はさらに、好中球減少症の処置において使用するためのペプチドに関する。
Description
本発明は、好中性細胞のアポトーシスをモデュレーションする化合物に関する。特に、本発明は、炎症過程を含む疾病の処置において使用するための、増殖細胞核抗原(PCNA)と、好中性細胞中の細胞質PCNAと結合しているタンパク質との間の相互作用を阻害する化合物に関する。本発明はまた、好中球依存性炎症過程の処置において使用するための化合物の同定法にも関する。本発明はさらに、好中球減少症の処置において使用するためのペプチドに関する。
発明の背景
増殖細胞核抗原(PCNA)
増殖細胞核抗原(PCNA)は、DNAの合成および修復において重要な因子であり、初めはDNAポリメラーゼδ(デルタ)およびε(イプシロン)の補助タンパク質として特徴づけられた。今まで記載された全てのPCNA機能は専らその核における局在を反映する。過去数年間に、多くのタンパク質がPCNAと相互作用をすることが判明し、これには種々の酵素および調節タンパク質、例えばCDKまたはCDK阻害剤p21/waf1が挙げられる(Waga et al. 1994; Nature 369:574-578)。推論として、PCNAは、複製以外の細胞経路において、例えばヌクレオチド除去修復、ミスマッチ修復、細胞周期およびアポトーシスにおいて役割を果たし得、従って、これら全ての細胞過程を接続する「細胞コミュニケーター」として作用すると仮定されてきた。
増殖細胞核抗原(PCNA)
増殖細胞核抗原(PCNA)は、DNAの合成および修復において重要な因子であり、初めはDNAポリメラーゼδ(デルタ)およびε(イプシロン)の補助タンパク質として特徴づけられた。今まで記載された全てのPCNA機能は専らその核における局在を反映する。過去数年間に、多くのタンパク質がPCNAと相互作用をすることが判明し、これには種々の酵素および調節タンパク質、例えばCDKまたはCDK阻害剤p21/waf1が挙げられる(Waga et al. 1994; Nature 369:574-578)。推論として、PCNAは、複製以外の細胞経路において、例えばヌクレオチド除去修復、ミスマッチ修復、細胞周期およびアポトーシスにおいて役割を果たし得、従って、これら全ての細胞過程を接続する「細胞コミュニケーター」として作用すると仮定されてきた。
好中球および炎症
好中球は最終分化したエフェクター細胞であり、その主な機能は炎症部位に移動し、そこで抗感染作用および炎症誘発作用を発揮する。しかしながら、好中球は炎症過程をモデュレーションすることができることを示す証拠が増えている(Nathan et al. 2006; Nat. Rev. Immunol. 6:173-182)。
好中球は最終分化したエフェクター細胞であり、その主な機能は炎症部位に移動し、そこで抗感染作用および炎症誘発作用を発揮する。しかしながら、好中球は炎症過程をモデュレーションすることができることを示す証拠が増えている(Nathan et al. 2006; Nat. Rev. Immunol. 6:173-182)。
特に、それらは免疫調節に関与する多種多様なサイトカインおよびその寿命を増加させるタンパク質、例えばMcl−1、A1/Bfl−1、アネキシン−1およびガレクチンの両方を合成して、宿主防御におけるその機能を効率的に実施することができる。しかしながら、一旦そのエフェクターの役割が終わると、その時間的に調節されたアポトーシス、その後の組織マクロファージによる食作用が、成功裏の炎症の消退には必要である(Rossi et al. 2007; Biochem. Soc. Trans. 35:288-291)。従って、好中球のアポトーシスは、炎症の消退において中心的な役割を果たしているが、その分子機序は依然として不完全にしか解明されていない(Simon et al. 2003; Immunol. Rev. 193:101-110)。マクロファージおよび樹状細胞とは異なり、好中球は増殖せず、そして短い寿命を有する。しかし、それらはいくつかの細胞周期調節タンパク質、例えばサイクリン依存性キナーゼ2(CDK2)、p27およびサバイビンを発現し、増殖とアポトーシスとの間の密接な関係の観点から、好中球はそれらを使用して自身の生存を調節しているのかもしれない。
好中球は増殖せず、そして全く感染がないと非常に短い時間しか生存しない(約6時間)。しかしながら、感染が起こっている部位上では、好中球の生存時間は有意に増加する。しかしながら、好中球の蓄積は、感染生物にとって有害である。従って、好中球はマクロファージによって(食作用によって)効率的に破壊されなければならない。この食作用の工程は、炎症を消退させるための必須な工程である。適切な様式でそれが起こらなければ、炎症は適切に消退せず、そして慢性的な炎症に至り得る。
従って、好中球のアポトーシスを促進することのできる化合物を得ることが望ましく、このような化合物は炎症の処置を可能とする。
好中球および好中球減少症
好中球減少症は、血中の好中球(顆粒球)数の減少である。好中球減少症は、骨髄系細胞またはその前駆体の内因性の欠陥によって引き起こされ得る。好中球減少症はまた、特定の薬物の使用、骨髄浸潤または置換、特定の感染、または免疫反応からも生じ得る。最も一般的な原因としては、薬物の投与、感染および骨髄浸潤過程が挙げられる。
好中球減少症は、血中の好中球(顆粒球)数の減少である。好中球減少症は、骨髄系細胞またはその前駆体の内因性の欠陥によって引き起こされ得る。好中球減少症はまた、特定の薬物の使用、骨髄浸潤または置換、特定の感染、または免疫反応からも生じ得る。最も一般的な原因としては、薬物の投与、感染および骨髄浸潤過程が挙げられる。
好中球減少症が重度であれば、細菌感染および真菌感染のリスクおよび重度は増加する。好中球数が500/μLより下に下降すれば、内因性微生物叢(例えば口内または腸内)が感染を引き起こし得る。数が200/μLより下に下降すれば、炎症応答は存在しない場合がある。急性で重度の好中球減少症は、特に別の因子(例えば癌)も免疫系を損なっている場合、急速で致命的な感染の素因となる。
従って、好中球のアポトーシスを防ぐことのできる化合物を得ることが望ましく、このような化合物は好中球減少症の処置を可能とする。
発明の説明
本発明者らは、成熟した好中球が高いレベルのPCNAを発現し、これは驚くべきことに専ら好中球の細胞質に局在することを見出した。さらに、PCNAは、おそらくその活性化を防ぐために、プロカスパーゼと恒常的に結合していた。特に、細胞質のPCNAレベルは、好中球の生存率と平行して変化した。実際に、細胞質のPCNAレベルはアポトーシス中には減少し、そしてin vitroまたはin vivoにおける生存因子G−CSFへの曝露中には増加した。
本発明者らは、成熟した好中球が高いレベルのPCNAを発現し、これは驚くべきことに専ら好中球の細胞質に局在することを見出した。さらに、PCNAは、おそらくその活性化を防ぐために、プロカスパーゼと恒常的に結合していた。特に、細胞質のPCNAレベルは、好中球の生存率と平行して変化した。実際に、細胞質のPCNAレベルはアポトーシス中には減少し、そしてin vitroまたはin vivoにおける生存因子G−CSFへの曝露中には増加した。
顕著には、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤p21から誘導された競合ペプチドは、好中球のアポトーシスをトリガーし、従ってPCNAタンパク質相互作用の特異的なモデュレーションが好中球の生存に影響を及ぼすことを実証することが判明した。
PCNAから誘導されたペプチドはまた、PCNAタンパク質相互作用をモデュレーションするために使用することができ、そして好中球のアポトーシスを誘導または防止のいずれかを行なうことができることがさらに判明した。
PCNAは、マウス骨髄の好中球においても発現されたが、LPSにより誘導された肺炎症の消退中に回収されたアポトーシスする傾向のある好中球においてはほんの弱くしか発現されなかった。さらに、PCNAの過剰発現は、好中球に分化したPLB985骨髄細胞を、TRAILまたはグリオトキシンにより誘導されたアポトーシスに対して有意により耐性なものとした。多くのパートナーとの結合部位である、PCNAドメイン間接続ループにおける突然変異は、PCNAにより媒介される抗アポトーシス効果を有意に減少させた。これらの結果は、PCNAを、好中球の寿命のレギュレーターとして同定し、これにより、病的な炎症または好中球減少症をモデュレーションする新規なターゲットが強調される。
従って、本発明者らは、興味深いことに専らその細胞質にPCNAを発現する好中球におけるPCNAの意外な抗アポトーシス的な役割を同定した。従って、PCNAの生物学的活性を阻害またはトリガーする化合物を、それぞれ炎症または好中球減少症の処置に使用することができた。
炎症過程を含む疾病の処置における使用のための化合物
それ故、本発明は、炎症過程を含む疾病の処置における使用のための、増殖細胞核抗原(PCNA)と、PCNAと結合しやすい、特に好中性細胞中の細胞質PCNAと結合しやすい少なくとも1つのポリペプチドとの間の相互作用を阻害する化合物に関する。
それ故、本発明は、炎症過程を含む疾病の処置における使用のための、増殖細胞核抗原(PCNA)と、PCNAと結合しやすい、特に好中性細胞中の細胞質PCNAと結合しやすい少なくとも1つのポリペプチドとの間の相互作用を阻害する化合物に関する。
本発明による化合物は、例えば、ペプチド、小分子、抗体またはアプタマーに対応し得る。
好ましい態様において、前記化合物はペプチドである。「ペプチド」は、最大50アミノ酸長であるアミノ酸(天然、修飾および/または通常ではないアミノ酸を含む)の鎖を意味する。ペプチドは例えば約6〜50、10〜50、または15〜50、20〜50、6〜30、10〜30、15〜30、20〜30、または15〜25アミノ酸の長さを有し得る。
本発明によるペプチドは、例えば、PCNAの少なくとも6、10、15または20連続したアミノ酸のフラグメント、またはPCNAに結合しやすいポリペプチドのフラグメント、例えば、p21、Rfc1、Rfc3、FEN−1、DNAリガーゼ−1、トポイソメラーゼIIα、Cdt1、Rrm3、WRN、RECQ5、UNG2、MPG、hMYH、APE2、XPG、CAF−1、PARP−1、WSTF、DNMT1、Eco1、Chl1、p57、ING1bまたはp53に対応し得る。
好ましい態様において、ペプチドは、PCNAの少なくとも6、10、15または20連続したアミノ酸のフラグメントを含むまたはからなり得る。このようなフラグメントは、好ましくは、PCNAのドメイン間接続ループの少なくとも6、10、15または20連続したアミノ酸を含む。実際に、実施例9に示したように、配列番号3のPCNAフラグメントを含むペプチド3および4は、好中球のアポトーシスをトリガーすることができる。従って、ペプチドは、例えば、配列番号3の配列、またはその少なくとも80、85、90または95%同一である配列、またはその少なくとも6、10、15または20連続したアミノ酸のフラグメントを含むまたはからなり得る。
あるいは、ペプチドは、p21の少なくとも6、10、15または20連続したアミノ酸のフラグメントを含むまたはからなり得る。このようなフラグメントは、好ましくは、p21の残基141〜160におよぶ、配列番号23のp21フラグメントの少なくとも6、10、15または20連続したアミノ酸を含む。実際に、実施例6に示したように、配列番号23の配列を含むカルボキシp21ペプチドは、好中球のアポトーシスをトリガーすることができる。従って、ペプチドは、例えば、配列番号23の配列、またはその少なくとも80、85、90または95%同一な配列、またはその少なくとも6、10、15または20連続したアミノ酸のフラグメントを含むまたはからなり得る。
本発明によるペプチドはさらに、タグ、例えば、細胞へのペプチドの侵入を増強するタグを含み得る。タグは、例えば、HIV−1Tatポリペプチドから誘導されたタグを含むまたはからなり得る。好ましくは、タグは、配列番号27のタグ(好ましくはペプチドのN末端に位置する)または配列番号8のタグ(好ましくはペプチドのC末端に位置する)を含むまたはからなる。配列番号11、12および24は、タグに融合したPCNAまたはp21の少なくとも6連続したアミノ酸のフラグメントからなる本発明によるペプチドの具体例である。
ペプチドはさらに、その溶解度またはバイオアベイラビリティを増強するための、例えばアセチル化などの化学的修飾を含み得る。
それ故、本発明は、炎症過程を含む疾病の処置において使用するための、ペプチド、好ましくは
a)配列番号3または23からなるアミノ酸配列;
b)タグに融合した配列番号3または23からなるアミノ酸配列;
c)配列番号11、配列番号12または配列番号24からなるアミノ酸配列;
d)(a)〜(c)のいずれか1つの配列と相同で、そして(a)〜(c)のいずれか1つの前記配列と少なくとも80%の同一性を提示する配列;または
e)(a)〜(c)のいずれか1つの配列の少なくとも6、10、15または20連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列
を含むまたはからなるペプチドに関する。
a)配列番号3または23からなるアミノ酸配列;
b)タグに融合した配列番号3または23からなるアミノ酸配列;
c)配列番号11、配列番号12または配列番号24からなるアミノ酸配列;
d)(a)〜(c)のいずれか1つの配列と相同で、そして(a)〜(c)のいずれか1つの前記配列と少なくとも80%の同一性を提示する配列;または
e)(a)〜(c)のいずれか1つの配列の少なくとも6、10、15または20連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列
を含むまたはからなるペプチドに関する。
ペプチドがPCNA以外の別のタンパク質から誘導された場合、本発明によるペプチドは、好ましくは、PCNAに、特に好中性細胞中の細胞質のPCNAに結合しやすい。
本発明の質問アミノ酸配列に対して少なくとも例えば95%「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、主題のポリペプチド配列が、質問アミノ酸配列の各100アミノ酸毎に5つまでのアミノ酸改変を含み得ることを除き、主題のポリペプチドのアミノ酸配列は質問配列と同一であることを意図する。別の言葉で言えば、質問アミノ酸配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、主題配列中の5%(100中5)までのアミノ酸残基を挿入、欠失または別のアミノ酸を用いて置換し得る。
2つ以上の配列の同一性または相同性を比較するための方法は当技術分野において周知である。その全長を考慮した場合に2つの配列の最適なアラインメント(ギャップを含む)を見つけるNeedleman-Wunschグローバルアラインメントアルゴリズム(Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453)を使用する「needle」プログラムを例えば使用し得る。needleプログラムは、例えば、ebi.ac.ukワールドワイドウェブサイト上で利用できる。本発明による同一率を、好ましくは、10.0に等しい「ギャップオープン」パラメーター、0.5に等しい「ギャップ伸長」パラメーター、およびBlosum62マトリックスを用いて、EMBOSS::needle(グローバル)プログラムを使用して計算する。
参照配列に対して「少なくとも80%、85%、90%または95%同一」であるアミノ酸配列を含むまたはからなるペプチドは、参照配列と比較して欠失、挿入および/または置換などの突然変異を含み得る。好ましい態様において、突然変異は、以下の表に示したような保存的置換に対応する。
本明細書全体を通して、「PCNA」という用語は、ヒト増殖細胞核抗原タンパク質を指す。好ましい態様において、「PCNA」は配列番号1の配列のタンパク質を指す。しかしながら、この用語はまた、配列番号1のタンパク質の対立遺伝子変異体およびスプライス変異体も包含する。本発明の背景において、PCNAタンパク質は、好ましくは、細胞質PCNA、最も好ましくは好中性細胞に見られる細胞質PCNAである。
「PCNAに結合しやすいポリペプチド」という表現は、PCNAと、好ましくは好中性細胞中の細胞質PCNAと相互作用することのできるタンパク質を指す。ドメイン間接続ループに対して強い親和性を有するペプチドについてスクリーニングすることを目的とした研究が、ペプチドバンクを使用して実施されている(Warbrick 2006, Oncogene 25:2850-2859)。p21は、PCNAに対して最も高い親和性で結合するものの中に含まれる(Moldovan et al. 2007; Cell 129:665-679)。PCNAの相互接続しているループドメインに結合する他のPCNAパートナーとしては、例えば、DNAポリメラーゼ、クランプローダー(Rfc1、Rfc3)、Flpa−エンドヌクレアーゼ(FEN−1)、DNAリガーゼ−1、トポイソメラーゼIIα、複製ライセンス因子(Cdt1)、ヘリカーゼおよびATPアーゼ(Rrm3、WRN、RECQ5)、ミスマッチ修復酵素(UNG2、MPG、hMYH、APE2)、ヌクレオチド除去修復酵素(XPG)、ヒストンシャペロン(CAF−1)、ポリ(ADP−リボース)ポリメラーゼ(PARP−1)、クロマチンリモデリング因子(WSTF)、DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT1)、姉妹染色分体接着因子(Eco1、Chl1)、細胞周期レギュレーター(p57)、およびアポトーシスレギュレーター(ING1b、p53)が挙げられる。従って、PCNAに結合しやすいポリペプチドは、こうしたタンパク質のいずれかに対応し得る。
より具体的には、本発明者らは、好中性細胞の細胞質PCNAが、カルボキシp21(実施例6参照)と、およびプロカスパーゼ−8、プロカスパーゼ−10、プロカスパーゼ−3およびプロカスパーゼ−9を含むいくつかのプロカスパーゼと(実施例8参照)相互作用しやすいことを見出した。
「相互作用を阻害すること」によって、分子が別の分子に結合するのを防ぐことを意味する。相互作用の阻害は、当業者に周知の種々の方法によって測定され得る。例えば、それはウェスタンブロットアッセイ、ELISA、免疫共沈降(co-ip)アッセイ、プルダウンアッセイ、架橋アッセイ、ラベル転移アプローチ(FRETまたはHTRFアッセイ)または酵母ツーハイブリッドアッセイによって測定され得る。当業者は、化合物が、PCNAと、PCNAに結合しやすいポリペプチド、例えばp21、カルボキシp21またはプロカスパーゼとの間の相互作用を阻害するかどうかを、競合結合アッセイを実施することによって容易に決定することができる。
本発明の背景において、前記化合物は、好ましくは、PCNAのドメイン間接続ループにおける、すなわち、配列番号1のL121残基からE132残基までにおよぶPCNAタンパク質の領域における、PCNAと、PCNAに結合しやすい少なくとも1つのポリペプチドとの相互作用を阻害する。実際に、本発明者らは、このドメインで行なわれている相互作用を阻害するペプチド(すなわちペプチド3、4およびカルボキシp21)が好中球のアポトーシスをトリガーすることを見出した。当業者は、化合物が、PCNAのドメイン間接続ループで行なわれている相互作用を阻害するかどうかを、例えば、PCNAのドメイン間接続ループに結合することが知られている、カルボキシp21を用いての競合的結合アッセイを実施することによって、容易に決定することができる。
本明細書において使用した「p21」という用語は、ヒトp21タンパク質を指し、これは、p21/Waf1/Cip1、CAP20、CDKN1、CIP1、MDA−6、p21CIP1、SDI1またはWAF1とも呼ばれる。好ましい態様において、「p21」は、配列番号26の配列のタンパク質を指す。しかしながら、この用語はまた、配列番号26のタンパク質の対立遺伝子変異体およびスプライス変異体も包含する。
本明細書全体を通して、「炎症過程を含む疾病」は、炎症と呼ばれる悪化した免疫応答に起因する疾病を指す。炎症は、例えば、以下の特徴によって特徴付けられる:発赤、発熱、腫脹および疼痛。悪化した炎症は、例えば、病原体による感染、火傷、化学的刺激、凍傷、毒素、物理的損傷、過敏症に因る免疫反応、自己免疫過程、自己炎症過程、電離放射線、異物、移植片拒絶または虚血によって引き起こされ得る。本明細書の背景において、炎症過程を含む疾病はまた炎症疾病とも呼ばれる。
好ましい態様において、炎症過程を含む疾病は好中性細胞によって媒介される。従って、本発明は、好中球のアポトーシスを誘導する際におよび/または好中性細胞によって媒介される炎症過程を含む疾病の処置において使用するための、PCNAと、PCNAに結合しやすい少なくとも1つのポリペプチドとの間の相互作用を阻害する化合物に関する。
より好ましくは、炎症過程を含む疾病は、心臓病態、血管病態、肺病態、消化管病態、皮膚病態または腎臓病態(感染によって引き起こされるまたは引き起こされない)である。さらにより好ましくは、炎症過程を含む疾病(すなわち炎症疾病)は、心虚血(特に発作から4日後)、細菌性心内膜炎、化膿性心膜炎(例えば、細菌性心内膜炎、肺炎、または縦隔感染症に関連)、結節性多発動脈炎、川崎病、白血球破砕性血管炎、顕微鏡的多発血管炎、細菌性血管腫症(例えばAIDSに関連)、成人呼吸促迫症候群、嚢胞性線維症、細菌性、ウイルス性、またはマイコプラズマ性気管支肺炎、潰瘍、クローン病、火傷、痛風(例えば急性痛風)、偽痛風、関節炎(例えば感染性関節炎、リウマチ様多発性関節炎、関節リウマチ、若年性関節炎または骨関節炎)、血清反応陰性脊椎関節症、移植片拒絶、心筋炎、アミロイドーシス、ホートン病、高安病、クリオグロブリン血症、血管炎、リウマチ性紫斑病、ANCA陽性血管炎(ウェゲナー肉芽腫症、チャーグ・ストラウス症候群)、アテローム、慢性閉塞性肺疾病、汎小葉型肺気腫、間質性肺炎、潰瘍性大腸炎、セリアック病、水疱性皮膚炎、好中球性皮膚炎、スチル病、微結晶性関節症(痛風、関節軟骨石灰化、ヒドロキシアパタイトの沈着)、乾癬性関節炎、股関節症、全身性ループス、炎症性筋疾患、壊死性筋疾患、糸球体腎炎、間質性腎症、肉芽腫性腎症、ブドウ膜炎からなる群より選択される。
本発明によると、「炎症細胞」という表現は、白血球、例えば顆粒球(好中球、好塩基球、好酸球)、単球、マクロファージ、樹状細胞またはリンパ球を指す。好ましくは、「炎症細胞」という表現は好中球を指す。
好ましい態様において、炎症過程を含む疾病の処置において使用するための化合物は、炎症細胞のアポトーシスを誘導する。より好ましくは、前記化合物は、好中性細胞のアポトーシスを誘導する。
化合物が炎症細胞のアポトーシスを誘導したかどうかの決定は、当業者により周知の種々の方法によって測定され得る。例えば、それは、例えばアネキシンVによる標識後に外面化したホスファチジルセリンの量を測定することによって定量され得る。このような実験において、外面化したホスファチジルセリンは、蛍光色素に結合したアネキシンVを用いて染色され得、従って、実施例1に記載のように、フローサイトメトリーによるアポトーシスの検出が可能となる。
「処置」という用語は、治癒目的(病態の発達を少なくとも軽減または停止させることを目的とする)または予防目的(病態が出現するリスクを減少させることを目的とする)のための処置を意味すると理解される。
好中球減少症の処置において使用するためのペプチド
別の局面において、本発明は、好中球減少症の処置において使用するための、PCNAのカルボキシ末端領域を含むペプチド、またはその少なくとも6つ連続したアミノ酸のフラグメントに関し、前記のPCNAのカルボキシ末端領域は、配列番号1のアミノ酸249〜261からなる領域として定義される。
別の局面において、本発明は、好中球減少症の処置において使用するための、PCNAのカルボキシ末端領域を含むペプチド、またはその少なくとも6つ連続したアミノ酸のフラグメントに関し、前記のPCNAのカルボキシ末端領域は、配列番号1のアミノ酸249〜261からなる領域として定義される。
好ましい態様において、前記ペプチドは、PCNAのカルボキシ末端領域(配列番号1のアミノ酸249〜261)の少なくとも6、10、15または20連続したアミノ酸のフラグメントを含むまたはからなる。実際に、実施例9に示したように、配列番号7のPCNAフラグメントを含むペプチド8および9は、好中球のアポトーシスを防ぐことができる。従って、前記ペプチドは、例えば、配列番号7の配列、またはその少なくとも80、85、90または95%同一の配列、またはその少なくとも6、10、15または20連続したアミノ酸のフラグメントを含むまたはからなり得る。
本発明によるペプチドはさらに、タグ、例えば細胞へのペプチドの侵入を増強するタグを含み得る。タグは、例えば、HIV−1Tatポリペプチドから誘導されたタグ(好ましくはペプチドのN末端に位置する)またはRYIRSタグ(好ましくはペプチドのC末端に位置する)を含むまたはからなり得る。配列番号16および17は、タグに融合したPCNAのカルボキシ末端領域の少なくとも6つ連続したアミノ酸のフラグメントからなる本発明によるペプチドの具体例である。
ペプチドはさらに、その溶解度またはバイオアベイラビリティを増強するための、例えばアセチル化などの化学的修飾を含み得る。
それ故、本発明は、好中球減少症の処置において使用するための、ペプチド、好ましくは
a)配列番号7からなるアミノ酸配列;
b)タグに融合した配列番号7からなるアミノ酸配列;
c)配列番号16または配列番号17からなるアミノ酸配列;
d)(a)〜(c)のいずれか1つの配列に相同であり、そして(a)〜(c)のいずれか1つの前記配列と少なくとも80%の同一性を提示する配列;および
e)(a)〜(c)のいずれか1つの配列の少なくとも6つ連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列
を含むまたはからなるペプチドに関する。
a)配列番号7からなるアミノ酸配列;
b)タグに融合した配列番号7からなるアミノ酸配列;
c)配列番号16または配列番号17からなるアミノ酸配列;
d)(a)〜(c)のいずれか1つの配列に相同であり、そして(a)〜(c)のいずれか1つの前記配列と少なくとも80%の同一性を提示する配列;および
e)(a)〜(c)のいずれか1つの配列の少なくとも6つ連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列
を含むまたはからなるペプチドに関する。
好ましい態様において、好中球減少症の処置において使用するためのペプチドは、炎症細胞の、好ましくは好中性細胞のアポトーシスを防ぐおよび/または阻害する。化合物が炎症細胞のアポトーシスを誘導したかどうかの決定は、当業者により周知の種々の方法によって測定され得る。例えば、それは、例えばアネキシンVによる標識後に外面化したホスファチジルセリンの量を測定することによって定量され得る。このような実験において、外面化したホスファチジルセリンは、蛍光色素に結合したアネキシンVを用いて染色され得、従って、実施例1に記載のように、フローサイトメトリーによるアポトーシス細胞の検出が可能となる。
「好中球減少症」という用語は、異常に低い数の好中球、例えば血液1μLあたり1500以下の好中球、好ましくは血液1μLあたり1000以下の好中球、最も好ましくは血液1μLあたり500以下の好中球によって特徴付けられる血液学的疾患を指す。
本明細書において使用するこの用語は、慢性、周期性および急性好中球減少症を含む。好中球減少症は、例えば、慢性特発性好中球減少症、先天性好中球減少症または続発性好中球減少症、例えば感染誘発性好中球減少症、薬物誘発性好中球減少症、アルコール症誘発性好中球減少症、自己免疫性好中球減少症、AIDSにおける慢性続発性好中球減少症、骨髄置換によって引き起こされる好中球減少症、細胞傷害性化学療法によって引き起こされる好中球減少症、放射線療法によって引き起こされる好中球減少症、葉酸またはビタミンB12欠乏症によって引き起こされる好中球減少症、脾機能亢進によって引き起こされる好中球減少症、またはTγ−リンパ球増殖性疾病によって引き起こされる好中球減少症に対応し得る。
本発明によるペプチド
本発明の別の局面は、前記の段落において定義したようなペプチドに関する。
本発明の別の局面は、前記の段落において定義したようなペプチドに関する。
好ましくは、本発明によるペプチドは、PCNAタンパク質のアミノ酸配列から誘導される。
好ましい態様において、本発明によるペプチドは、
a)配列番号3または7からなるアミノ酸配列;
b)タグに融合した配列番号3または7からなるアミノ酸配列;
c)配列番号11、配列番号12、配列番号16または配列番号17からなるアミノ酸配列;および
d)(a)〜(c)のいずれか1つの配列に相同であり、そして(a)〜(c)のいずれか1つの前記配列に対して少なくとも80%の同一性を提示する配列
e)(a)〜(c)のいずれか1つの配列の少なくとも6、10、15または20の連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
a)配列番号3または7からなるアミノ酸配列;
b)タグに融合した配列番号3または7からなるアミノ酸配列;
c)配列番号11、配列番号12、配列番号16または配列番号17からなるアミノ酸配列;および
d)(a)〜(c)のいずれか1つの配列に相同であり、そして(a)〜(c)のいずれか1つの前記配列に対して少なくとも80%の同一性を提示する配列
e)(a)〜(c)のいずれか1つの配列の少なくとも6、10、15または20の連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
ペプチドがPCNA以外の別のタンパク質から誘導された場合、本発明によるペプチドは、好ましくは、PCNAに、特に好中性細胞中に見られる細胞質のPCNAに結合しやすい。
さらに、本発明によるペプチドは、好ましくは、炎症細胞の、好ましくは好中性細胞のアポトーシスをモデュレーション(すなわち誘導、防ぐまたは阻害する)する。例えば、配列番号3の配列を含むまたはからなるペプチドおよびそれから誘導されたペプチドは、好ましくは、炎症細胞のアポトーシスを誘導する。一方で、配列番号7の配列を含むまたはからなるペプチドおよびそれから誘導されたペプチドは、好ましくは、炎症細胞のアポトーシスを防ぐおよび/または阻害する。
本発明による薬学的組成物
本発明はさらに、本明細書において定義したようなペプチドおよび1つ以上の生理学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。
本発明はさらに、本明細書において定義したようなペプチドおよび1つ以上の生理学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。
本発明のペプチドを含む薬学的組成物は、全ての組成物を含み、前記ペプチドは、意図する目的を達成するのに効果的な量で含まれる。さらに、薬学的組成物は、薬学的に使用され得る調製物へと活性化合物を加工することを容易にする賦形剤および補助剤を含む適切な生理学的に許容される担体を含み得る。
「生理学的に許容される担体」という用語は、活性成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、そして投与される宿主に対して毒性ではない、任意の担体を包含することを意味する。適切な生理学的に許容される担体は当技術分野において周知であり、そして例えばRemington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, Easton, USA, 1985)に記載されており、これはこの分野における標準的な参考テキストである。例えば、非経口投与のために、上記活性成分は、食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンガー液などのビヒクルに、注射用の投与単位形で製剤化され得る。
生理学的に許容される担体とは別に、本発明の組成物はまた、少量の添加剤、例えば安定化剤、賦形剤、緩衝剤および保存剤を含み得る。本発明の組成物はさらに第二の活性成分を含み得る。
本発明のペプチドは、意図する目的を達成する任意の手段によって投与され得る。例えば、投与は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、脳内、クモ膜下腔内、鼻腔内、経口、直腸、経皮、頬側、外用、局所、吸入または皮下の使用を含むがそれらに限定されない多くの異なる経路によって達成され得る。非経口および外用経路が特に好ましい。
投与しようとする用量は、個々の必要性、所望の効果および選択した投与経路に依存する。投与する用量は、レシピエントの年齢、性別、健康状態、および体重、併用処置(あれば)、処置の頻度、および所望の効果の性質に依存することが理解される。各処置に必要とされる全用量は、複数回の用量または1回の用量によって投与され得る。
意図する送達経路に依存して、前記化合物は液体(例えば溶液、懸濁液)、固体(例えば丸剤、錠剤、坐剤)または半固体(例えばクリーム、ゲル)の剤形として製剤化され得る。
本発明はまた、本明細書において定義したようなペプチドの有効量をそれを必要とする被験体に投与する工程を含む、炎症過程を含む疾病または好中球減少症を処置する方法に関する。
「有効量」は、処置しようとする疾病を防ぐ、処置するまたは減速することのできるペプチドの濃度を達成するのに十分な量を意味する。このような濃度は、当業者によって規定通りに決定され得る。実際に投与される化合物の量は、典型的には、医師または獣医によって、処置しようとする容態、選択した投与経路、投与する実際の化合物、被験体の年齢、体重および応答、被験体の症状の重度などを含む、関連する環境を鑑みて決定される。また、投与量は、投与されるペプチドの安定性に依存し得ることが当業者によって理解されるだろう。
「それを必要とする被験体」は、処置しようとする炎症過程を含む疾病または好中球減少症に罹患しているまたは罹患しやすい個体を意味する。本発明の背景において処置しようとする個体は好ましくはヒトである。
本発明によるスクリーニング法
本発明者らは、PCNA、特に細胞質PCNAが、好中球などの炎症細胞におけるアポトーシスをモデュレーションする際に役割を果たすことを見出した。
本発明者らは、PCNA、特に細胞質PCNAが、好中球などの炎症細胞におけるアポトーシスをモデュレーションする際に役割を果たすことを見出した。
従って、本発明は、好中球減少症または炎症過程を含む疾病の処置のための薬物についてスクリーニングするためのターゲットとしてのin vitroにおけるPCNAの使用に関する。
より特定すると、本発明は、
a)候補化合物を、PCNAおよびPCNAと結合しやすい少なくとも1つのポリペプチドと接触させ;
b)候補化合物の存在下および非存在下において、PCNAと結合しやすい前記の少なくとも1つのポリペプチドに結合したPCNAの量を比較し;そして
c)PCNAに結合しやすい前記の少なくとも1つのポリペプチドに結合したPCNAの量が、前記候補化合物の非存在下よりも前記候補化合物の存在下の方が少なければ、候補化合物を選択することを含む、
好中球減少症または炎症過程を含む疾病の処置において使用するための化合物の同定法に関する。
a)候補化合物を、PCNAおよびPCNAと結合しやすい少なくとも1つのポリペプチドと接触させ;
b)候補化合物の存在下および非存在下において、PCNAと結合しやすい前記の少なくとも1つのポリペプチドに結合したPCNAの量を比較し;そして
c)PCNAに結合しやすい前記の少なくとも1つのポリペプチドに結合したPCNAの量が、前記候補化合物の非存在下よりも前記候補化合物の存在下の方が少なければ、候補化合物を選択することを含む、
好中球減少症または炎症過程を含む疾病の処置において使用するための化合物の同定法に関する。
この方法において、PCNAは好ましくは細胞質PCNAに対応する。最も好ましくは、PCNAは、好中性細胞から得られた細胞質PCNAに対応する。
候補化合物の存在下および非存在下においてPCNAに結合しやすい前記の少なくとも1つのポリペプチドに結合したPCNAの量の比較は、当業者に周知の種々の方法によって行なわれ得る。例えば、これは、実施例1に記載したように、免疫共沈降およびウェスタンブロットアッセイによって、または酵母ツーハイブリッドスクリーニングアッセイによって、またはフローサイトメトリーによって(例えばビアコアシステムを使用して)実施され得る。
この方法の背景において、カルボキシp21を、PCNAに結合しやすいポリペプチドとして使用し得る。実際に、カルボキシp21は、増殖細胞においてPCNAパートナーと干渉することが知られている(Warbrick et al. 2006; Oncogene 25:2850-2859)。さらに、実施例6において詳述したように、カルボキシp21は、PCNAにより媒介される好中球の抗アポトーシス作用を打ち消すことができるので、好中性細胞におけるPCNAと干渉することができる。それ故、競合結合アッセイにおける候補化合物によるカルボキシp21の置換は、候補化合物もまた、PCNAのドメイン間接続ループにおいてPCNAと結合し、そしてそれ故、炎症疾病の処置に使用することができることを示す。
あるいは、ペプチド3(配列番号11)、ペプチド4(配列番号12)またはペプチド8(配列番号16)もまた、本発明による方法の背景において、PCNAに結合しやすいポリペプチドとして使用され得る。特に、カルボキシp21、ペプチド3およびペプチド4は、炎症疾病の処置のための薬物をスクリーニングする場合に使用され得、そしてペプチド8は、好中球減少症の処置のための薬物についてスクリーニングする場合に使用され得る。
本発明の背景においてスクリーニングされる化合物および薬物としては、ペプチド、小分子、抗体、アプタマーおよび核酸、例えばアンチセンス核酸およびsiRNAが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において引用した全ての参考文献(ジャーナル記事または要約、公表された特許出願、発行された特許または任意の他の参考文献を含む)の全体が本明細書への参照により組み入れられ、これには引用された参考文献に提示された全てのデータ、表、図および本文が含まれる。
本発明は、以下の実施例および図面の観点からさらに評価される。
配列の簡単な説明
配列番号1は、PCNAポリペプチドの配列を示す。
配列番号2〜7は、PCNAポリペプチドから誘導されたペプチドの配列を示す。
配列番号8は、RYIRSタグの配列を示す。
配列番号9〜17は、そのC末端がRYIRSタグを用いてタグ化されているか、またはそのN末端がHIV−1Tatポリペプチドから誘導されたタグを用いてタグ化されているかのいずれかである、PCNAポリペプチドから誘導されたペプチドの配列を示す。配列番号9〜17のペプチドは、それぞれ、ペプチド1、2、3、4、5、6、7、8および9と呼ばれる。
配列番号18〜22は、実施例1に記載したペプチドの配列を示す。
配列番号23は、p21から誘導されたペプチドの配列を示す。
配列番号24は、そのC末端がRYIRSタグでタグ化されている、p21から誘導されたペプチドの配列を示す。このペプチドはカルボキシp21と呼ばれる。
配列番号25は、陰性コントロールとして使用されるペプチドの配列を示す。
配列番号26はp21ポリペプチドの配列を示す。
配列番号27はTATタグの配列を示す。
配列番号28は、pcDNA3−NLS(SV40)−PCNAプラスミドを構築するために使用されるオリゴヌクレオチドの配列を示す。
配列番号29は、pcDNA3−NLS(SV40)−PCNAプラスミドを構築するために使用されるオリゴヌクレオチドの配列を示す。
配列番号1は、PCNAポリペプチドの配列を示す。
配列番号2〜7は、PCNAポリペプチドから誘導されたペプチドの配列を示す。
配列番号8は、RYIRSタグの配列を示す。
配列番号9〜17は、そのC末端がRYIRSタグを用いてタグ化されているか、またはそのN末端がHIV−1Tatポリペプチドから誘導されたタグを用いてタグ化されているかのいずれかである、PCNAポリペプチドから誘導されたペプチドの配列を示す。配列番号9〜17のペプチドは、それぞれ、ペプチド1、2、3、4、5、6、7、8および9と呼ばれる。
配列番号18〜22は、実施例1に記載したペプチドの配列を示す。
配列番号23は、p21から誘導されたペプチドの配列を示す。
配列番号24は、そのC末端がRYIRSタグでタグ化されている、p21から誘導されたペプチドの配列を示す。このペプチドはカルボキシp21と呼ばれる。
配列番号25は、陰性コントロールとして使用されるペプチドの配列を示す。
配列番号26はp21ポリペプチドの配列を示す。
配列番号27はTATタグの配列を示す。
配列番号28は、pcDNA3−NLS(SV40)−PCNAプラスミドを構築するために使用されるオリゴヌクレオチドの配列を示す。
配列番号29は、pcDNA3−NLS(SV40)−PCNAプラスミドを構築するために使用されるオリゴヌクレオチドの配列を示す。
実施例
実施例1:材料および方法
好中球の単離、C34+前駆体の顆粒球への分化、および細胞培養。
健康なドナー(フランス血液機構(Etablissement Francais du Sang)、パリ)またはG−CSFで処理した健康ドナー(造血幹細胞の動員を誘導するために10mg/kgを5日間)(バイオ療法部門、ネッケル病院、フランス)からのヒト好中球を、EDTAで抗凝固化した血液から、Witko-Sarsat et al. (1999, Blood 94:2487-2496)に記載のように、ポリモルホプレップ(Nycomed)を通した密度勾配遠心分離を使用して単離した。血液ドナーは、本試験に参加するためにその書面によるインフォームドコンセントを提出し、これは、Inserm施設内審査委員会およびネッケル小児病院(パリ、フランス)の倫理委員会によって承認された。CD34+細胞から顆粒球への分化を、いくつかの小さな改変を加えて、Hino et al. (2000, Br. J. Haematol. 109:314-321)に記載のように誘導した。簡潔に言うと、CD34+細胞を臍帯血から単離し、そしてその後、幹細胞因子(SCF;10ng/ml)、IL−3(10ng/ml)およびIL−6(100ng/ml)と共に7日間かけて培養した。CD36−細胞を単離し、そしてその後、G−CSF(10ng/ml)、SCF(100ng/ml)およびIL−3(10ng/ml)と共に13日間かけてインキュベーションして、顆粒球への分化を促進した。種々の時点で染色したMGGを使用して、分化をモニタリングした(データは示さず)。
実施例1:材料および方法
好中球の単離、C34+前駆体の顆粒球への分化、および細胞培養。
健康なドナー(フランス血液機構(Etablissement Francais du Sang)、パリ)またはG−CSFで処理した健康ドナー(造血幹細胞の動員を誘導するために10mg/kgを5日間)(バイオ療法部門、ネッケル病院、フランス)からのヒト好中球を、EDTAで抗凝固化した血液から、Witko-Sarsat et al. (1999, Blood 94:2487-2496)に記載のように、ポリモルホプレップ(Nycomed)を通した密度勾配遠心分離を使用して単離した。血液ドナーは、本試験に参加するためにその書面によるインフォームドコンセントを提出し、これは、Inserm施設内審査委員会およびネッケル小児病院(パリ、フランス)の倫理委員会によって承認された。CD34+細胞から顆粒球への分化を、いくつかの小さな改変を加えて、Hino et al. (2000, Br. J. Haematol. 109:314-321)に記載のように誘導した。簡潔に言うと、CD34+細胞を臍帯血から単離し、そしてその後、幹細胞因子(SCF;10ng/ml)、IL−3(10ng/ml)およびIL−6(100ng/ml)と共に7日間かけて培養した。CD36−細胞を単離し、そしてその後、G−CSF(10ng/ml)、SCF(100ng/ml)およびIL−3(10ng/ml)と共に13日間かけてインキュベーションして、顆粒球への分化を促進した。種々の時点で染色したMGGを使用して、分化をモニタリングした(データは示さず)。
HeLa、PLB985およびNB4前骨髄球性細胞株を、10%ウシ胎児血清の補充されたRPMI中で培養した。NB4細胞をATRA(1mM)(Sigma)を用いて5日間かけて誘導して分化させ、そして顆粒球の分化をCD11bの発現によって、およびMGG染色後の形態学的分析によって検証した(データは示さず)。PLB985細胞の顆粒球への分化は、0.5%DMFに5日間さらすことによって誘導され、そしてNB4について検証した。NADPHオキシダーゼ活性の機能的分析を、ルシゲニン増幅化学発光を用いて単一光子ルミノメーター(AutoLumat LB953, Berthold Co.)で決定した。化学発光基質のルシゲニン(10,10−ジメチル−9,9−ビアクリジウムジナイトレート)を使用して、NADPHオキシダーゼ依存性細胞外スーパーオキシドアニオン形成を選択的に測定した。簡潔に言うと、5×105個の細胞、すなわち好中球またはPLB985細胞を含む100μlを、100μlのルシゲニン(0.2mM)および50μlの刺激物質、すなわちHBSSまたはPMAのいずれか(16μMの最終濃度)を含むポリスチレンチューブに分配した。発光を、40分間かけて2回測定し、そして合算した全数として表現した。
免疫蛍光標識および共焦点顕微鏡分析。
PCNA細胞内局在を研究するための好中球、HeLa、CD34+、PLB985またはNB4細胞の免疫標識を、Kantari et al. (2007, Blood 110:4086-4095)に記載のように実施した。細胞を20分間かけて氷上でPBS−3.7%ホルムアルデヒド(Sigma)で固定し、そして室温で5分間かけてTriton−X100(0.25%)を用いて、その後、10分間氷冷メタノールを用いて透過処理し、1:25に希釈したウサギpAb(Ab5、Calbiochem)と共に45分間かけて、その後、1:100に希釈したビオチニル化ウサギIgG(Dako Cytomation)と共に30分間かけて、その後、1:200に希釈したストレプトアビジン結合Alexa−555(2mg/ml,Molecular Probes)と共に30分間かけてインキュベーションした。核を、1:100に希釈したTO−PRO3ヨウ化物(1mM溶液、Molecular Probes)によって30分間かけて染色した。PCNAとの同場所局在のために、マウス抗プロカスパーゼ−8(クローン12F5、1:25希釈、Alexis Biochemicals)または抗プロカスパーゼ−9(クローンP10−F7,1:25希釈、Santa Cruz)mAbを一次抗体として使用し、その後、Alexafluor-488のコンジュゲーションした抗マウスmAb(Molecular Probe、1:100に希釈)を使用した。スライドにPermafluor封入剤(Vector Laboratories)を使用してマウントし、そしてZeiss LSM−5共焦点走査型レーザー顕微鏡を用いての共焦点顕微鏡によって分析した。蛍光を、イメージJソフトウェアバージョン1.42d(Becton-Dickinson)を使用して定量した。
PCNA細胞内局在を研究するための好中球、HeLa、CD34+、PLB985またはNB4細胞の免疫標識を、Kantari et al. (2007, Blood 110:4086-4095)に記載のように実施した。細胞を20分間かけて氷上でPBS−3.7%ホルムアルデヒド(Sigma)で固定し、そして室温で5分間かけてTriton−X100(0.25%)を用いて、その後、10分間氷冷メタノールを用いて透過処理し、1:25に希釈したウサギpAb(Ab5、Calbiochem)と共に45分間かけて、その後、1:100に希釈したビオチニル化ウサギIgG(Dako Cytomation)と共に30分間かけて、その後、1:200に希釈したストレプトアビジン結合Alexa−555(2mg/ml,Molecular Probes)と共に30分間かけてインキュベーションした。核を、1:100に希釈したTO−PRO3ヨウ化物(1mM溶液、Molecular Probes)によって30分間かけて染色した。PCNAとの同場所局在のために、マウス抗プロカスパーゼ−8(クローン12F5、1:25希釈、Alexis Biochemicals)または抗プロカスパーゼ−9(クローンP10−F7,1:25希釈、Santa Cruz)mAbを一次抗体として使用し、その後、Alexafluor-488のコンジュゲーションした抗マウスmAb(Molecular Probe、1:100に希釈)を使用した。スライドにPermafluor封入剤(Vector Laboratories)を使用してマウントし、そしてZeiss LSM−5共焦点走査型レーザー顕微鏡を用いての共焦点顕微鏡によって分析した。蛍光を、イメージJソフトウェアバージョン1.42d(Becton-Dickinson)を使用して定量した。
アポトーシスの分析。
好中球のアポトーシスを、好中球を37℃で単独で(常時存在のアポトーシス)または抗FasmAb(10ng/ml;Beckman-Coulter)もしくはグリオトキシン(2mg/ml;Sigma)と共に(Ward et al. 1999, J. Biol. Chem. 274:4309-4318)指定した時間インキュベーションすることによってトリガーした。好中球のアポトーシスを、アネキシンV後のホスファチジルセリン外面化および7−AAD標識(Kantari et al. 2007, Blood 110:4086-4095);DiOC6標識後のミトコンドリア脱分極(Moriceau et al. 2009, J. Immunol.182:7254-7263);好中球溶解液における分光光度測定(Biovision)によって測定したカスパーゼ−3およびカスパーゼ−8の活性によって評価した。DMFにより分化したPLB985細胞において、アポトーシスをグリオトキシンまたはrTRAIL(10ng/ml;RD System)(Yin et al. 2005, Int. J. Biochem. Cell Biol. 37:1696-1708)によってトリガーし、そしてカスパーゼ−8およびカスパーゼ−9活性を、CD11b+細胞を開閉した後に、Caspase-Glow(登録商標)アッセイ(Promega)を使用して決定した。アポトーシス誘導クロマチン凝縮およびDNAフラグメンテーションをそれぞれ、青色蛍光色素ヘキスト(5mg/ml)を用いてのDNA染色およびヨウ化プロピジウム染色の後に評価した(Goepel et al. 2004, J. Leukoc. Biol. 75:836-843)。p21カルボキシ末端配列(残基141〜160)に対応し、そしてその細胞への侵入を促進するためのRYIRSカルボキシ末端伸長部分を含む、カルボキシp21(KRRQTSMTDFYHSKRRLIFSRYIRS、配列番号24)を合成および精製した(Genecust)。PCNAへのその結合に関与する荷電アミノ酸が、動的なシミュレーション研究に従って改変されている改変されたペプチドが(KRRQTGETDFDHAKAALIFSRYIRS、配列番号25)、コントロールとして作用した。PS−341(LC Laboratories)およびMG132の効果を、示したように好中球アポトーシスおよびPCNA発現について試験した。
好中球のアポトーシスを、好中球を37℃で単独で(常時存在のアポトーシス)または抗FasmAb(10ng/ml;Beckman-Coulter)もしくはグリオトキシン(2mg/ml;Sigma)と共に(Ward et al. 1999, J. Biol. Chem. 274:4309-4318)指定した時間インキュベーションすることによってトリガーした。好中球のアポトーシスを、アネキシンV後のホスファチジルセリン外面化および7−AAD標識(Kantari et al. 2007, Blood 110:4086-4095);DiOC6標識後のミトコンドリア脱分極(Moriceau et al. 2009, J. Immunol.182:7254-7263);好中球溶解液における分光光度測定(Biovision)によって測定したカスパーゼ−3およびカスパーゼ−8の活性によって評価した。DMFにより分化したPLB985細胞において、アポトーシスをグリオトキシンまたはrTRAIL(10ng/ml;RD System)(Yin et al. 2005, Int. J. Biochem. Cell Biol. 37:1696-1708)によってトリガーし、そしてカスパーゼ−8およびカスパーゼ−9活性を、CD11b+細胞を開閉した後に、Caspase-Glow(登録商標)アッセイ(Promega)を使用して決定した。アポトーシス誘導クロマチン凝縮およびDNAフラグメンテーションをそれぞれ、青色蛍光色素ヘキスト(5mg/ml)を用いてのDNA染色およびヨウ化プロピジウム染色の後に評価した(Goepel et al. 2004, J. Leukoc. Biol. 75:836-843)。p21カルボキシ末端配列(残基141〜160)に対応し、そしてその細胞への侵入を促進するためのRYIRSカルボキシ末端伸長部分を含む、カルボキシp21(KRRQTSMTDFYHSKRRLIFSRYIRS、配列番号24)を合成および精製した(Genecust)。PCNAへのその結合に関与する荷電アミノ酸が、動的なシミュレーション研究に従って改変されている改変されたペプチドが(KRRQTGETDFDHAKAALIFSRYIRS、配列番号25)、コントロールとして作用した。PS−341(LC Laboratories)およびMG132の効果を、示したように好中球アポトーシスおよびPCNA発現について試験した。
リアルタイムRT−PCRおよび一次転写物(PT)リアルタイムRT−PCR。
リアルタイムRT−PCRおよびPTリアルタイムRT−PCRを、Tamassia et al. (2008, J. Immunol.181:6563-6573)に記載のように、公共データベースRTプライマーDB(ワールドワイドウェブサイトmedgen.UGent.be/rtprimerdb/)で入手できる遺伝子特異的プライマー対(Invitrogen)を使用して、以下のエントリーコード下で実施した:ヒトPCNA(7839)、BLyS/TNFSF13B(7841)およびα2−ミクログロブリン(β2m)(3534)。反応条件は、以下のように、全てのプライマーセットについて同一であった:50℃で2分間、95℃で2分間、そしてその後、95℃で15秒間を40サイクル、および60℃で1分間。β2mは、白血球におけるその安定な発現レベルから正規化遺伝子として選択された。データをQ−Geneソフトウェア(ワールドワイドウェブサイトBioTechniques.com)を用いて計算し、そしてβ2m正規化後に平均発現(NME)単位として表現される。PTリアルタイムPCRを、Rossato et al. (2007, Eur. J. Immunol. 37:3176-3189)に記載のように、選択された遺伝子のイントロン領域から設計されたプライマーを使用して(公共データベースRTプライマーDBを参照)、以下のエントリーコード下で実施した:PT−PCNA(7840)、PT−BLyS(7842)およびβ2m(3534)。同じRNA試料を逆転写酵素の非存在下において処理し、そしてゲノムDNAコンタミに対するコントロールとして作用した。ノザンブロット分析をTamassia et al. (2008, J. Immunol.181:6563-6573)に記載の通りに実施した。
リアルタイムRT−PCRおよびPTリアルタイムRT−PCRを、Tamassia et al. (2008, J. Immunol.181:6563-6573)に記載のように、公共データベースRTプライマーDB(ワールドワイドウェブサイトmedgen.UGent.be/rtprimerdb/)で入手できる遺伝子特異的プライマー対(Invitrogen)を使用して、以下のエントリーコード下で実施した:ヒトPCNA(7839)、BLyS/TNFSF13B(7841)およびα2−ミクログロブリン(β2m)(3534)。反応条件は、以下のように、全てのプライマーセットについて同一であった:50℃で2分間、95℃で2分間、そしてその後、95℃で15秒間を40サイクル、および60℃で1分間。β2mは、白血球におけるその安定な発現レベルから正規化遺伝子として選択された。データをQ−Geneソフトウェア(ワールドワイドウェブサイトBioTechniques.com)を用いて計算し、そしてβ2m正規化後に平均発現(NME)単位として表現される。PTリアルタイムPCRを、Rossato et al. (2007, Eur. J. Immunol. 37:3176-3189)に記載のように、選択された遺伝子のイントロン領域から設計されたプライマーを使用して(公共データベースRTプライマーDBを参照)、以下のエントリーコード下で実施した:PT−PCNA(7840)、PT−BLyS(7842)およびβ2m(3534)。同じRNA試料を逆転写酵素の非存在下において処理し、そしてゲノムDNAコンタミに対するコントロールとして作用した。ノザンブロット分析をTamassia et al. (2008, J. Immunol.181:6563-6573)に記載の通りに実施した。
LPSにより誘導された気道炎症のin vivoモデル。
末梢血好中球および大腿からのBM成熟好中球を、パーコール密度勾配を使用して、Mocsai et al. (2002, Immunity 16:547-558)に記載のように単離した。マウスにおける鼻腔内LPS投与およびBALFからの細胞の回収を、Chignard et al. (2000, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279:L1083-1090)に記載の通りに実施した。マウスを、欧州動物福祉規則に準拠したInsermガイドラインに従って処置した。体重25〜30gの7週令の雄C57Bl/6マウスに(Charles Rivers)、ケタミンとキシラジンの混合物の筋肉内注射によって麻酔し、そしてその後、50μlの食塩水に溶解した330μg/kgのLPSを鼻腔内に沈着させた。種々の時点において、動物を致死量のペントバルビタールナトリウム(Sanofi)の腹腔内注射によって殺滅し、肺好中球を単離した。その後、各マウスの気管にカニューレを挿入し、そしてシリンジおよび複数サイクルの食塩水滴下(0.5ml)および吸引を用いて気管支肺胞洗浄を実施して、4mlの気管支肺胞洗浄液の容量を得た。後者を遠心分離にかけ、ペレット化した細胞を回収し、そしてサイトスピン遠心分離およびDiff-Quik製品を用いての染色後に細胞分画を行なった。気管支肺胞洗浄液中の好中球は、フィコール密度勾配遠心分離によって単離された。
末梢血好中球および大腿からのBM成熟好中球を、パーコール密度勾配を使用して、Mocsai et al. (2002, Immunity 16:547-558)に記載のように単離した。マウスにおける鼻腔内LPS投与およびBALFからの細胞の回収を、Chignard et al. (2000, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279:L1083-1090)に記載の通りに実施した。マウスを、欧州動物福祉規則に準拠したInsermガイドラインに従って処置した。体重25〜30gの7週令の雄C57Bl/6マウスに(Charles Rivers)、ケタミンとキシラジンの混合物の筋肉内注射によって麻酔し、そしてその後、50μlの食塩水に溶解した330μg/kgのLPSを鼻腔内に沈着させた。種々の時点において、動物を致死量のペントバルビタールナトリウム(Sanofi)の腹腔内注射によって殺滅し、肺好中球を単離した。その後、各マウスの気管にカニューレを挿入し、そしてシリンジおよび複数サイクルの食塩水滴下(0.5ml)および吸引を用いて気管支肺胞洗浄を実施して、4mlの気管支肺胞洗浄液の容量を得た。後者を遠心分離にかけ、ペレット化した細胞を回収し、そしてサイトスピン遠心分離およびDiff-Quik製品を用いての染色後に細胞分画を行なった。気管支肺胞洗浄液中の好中球は、フィコール密度勾配遠心分離によって単離された。
プラスミドベクター構築および組換えPCNA発現。
組換えPCNAを、ヒトPCNA cDNAを含むプラスミドPETPCNA(Dr Bruce Stillmanからの親切なるギフト、Cold Spring Harbor, NY)を使用してE.coliにおいて産生し、そしてWaga et al. (1994, Nature 369:574-578)に記載のように精製した。PLB985細胞におけるPCNAの過剰発現を得るために、PCNA cDNAを、発現ベクターpCDNA3/neo(Invitrogen)のHindIIIとNotI制限酵素部位との間にサブクローニングした。部位特異的突然変異誘発をQuickchange法(Stratagene)を使用して実施し、ドメイン間接続ループに位置する公知のp21相互作用配列内の荷電アミノ酸上で突然変異したPCNAを得た(PCNA−D120A−D122A−E124A−E130A−E132A、配列番号1の突然変異の位置)。全てのcDNA配列を直接的なシークエンスによって確認した。PLB985細胞を、AMAXA system(登録商標)装置を使用して、製造業者の指示に従ってトランスフェクションした。簡潔に言うと、細胞(2×106)を、1μgのプラスミド(コントロールpcDNA3−ネオマイシンまたはpcDNA3−PCNAまたはpcDNA3−突然変異PCNA)を含む100μlの細胞系溶液に再懸濁した。その後、細胞を電気穿孔し、そして培養プレートに移した。トランスフェクションされた細胞をクローニングし、そしてネオマイシン(1mg/ml)に対するその耐性に基づいて選択した。
組換えPCNAを、ヒトPCNA cDNAを含むプラスミドPETPCNA(Dr Bruce Stillmanからの親切なるギフト、Cold Spring Harbor, NY)を使用してE.coliにおいて産生し、そしてWaga et al. (1994, Nature 369:574-578)に記載のように精製した。PLB985細胞におけるPCNAの過剰発現を得るために、PCNA cDNAを、発現ベクターpCDNA3/neo(Invitrogen)のHindIIIとNotI制限酵素部位との間にサブクローニングした。部位特異的突然変異誘発をQuickchange法(Stratagene)を使用して実施し、ドメイン間接続ループに位置する公知のp21相互作用配列内の荷電アミノ酸上で突然変異したPCNAを得た(PCNA−D120A−D122A−E124A−E130A−E132A、配列番号1の突然変異の位置)。全てのcDNA配列を直接的なシークエンスによって確認した。PLB985細胞を、AMAXA system(登録商標)装置を使用して、製造業者の指示に従ってトランスフェクションした。簡潔に言うと、細胞(2×106)を、1μgのプラスミド(コントロールpcDNA3−ネオマイシンまたはpcDNA3−PCNAまたはpcDNA3−突然変異PCNA)を含む100μlの細胞系溶液に再懸濁した。その後、細胞を電気穿孔し、そして培養プレートに移した。トランスフェクションされた細胞をクローニングし、そしてネオマイシン(1mg/ml)に対するその耐性に基づいて選択した。
ウェスタンブロット分析および免疫共沈降実験。
好中球に超音波をかけ、そして細胞質タンパク質を、PC10mAbまたはAb5pAb抗PCNAのいずれかを使用して標準的なイムノブロット手順に従って(Moriceau et al. 2009, J. Immunol.182:7254-7263)分析した。免疫共沈降実験を、空洞現象によって得られた好中球細胞質を使用して実施した(Witko-Sarsat et al. 1999, Blood 94:2487-2496)。細胞質(500mg)を50mlのプロテインGおよびAb5pAbと混合し、そして振とう下で4℃で30分間インキュベーションした。試料を、ストリンジェントな洗浄緩衝液(50mMトリス、500mM NaCl、1%NP−40、0.5%TritonX−100)で洗浄した、セファロースでコーティングされた磁気ビーズ(Milteny)を含むカラムにのせた。カラムを、この緩衝液を用いて2回、NaClが300mMであること以外は同じ緩衝液を用いて2回、そして最後に塩濃度の低い緩衝液(20mMトリスpH7.5)を用いて5回洗浄した。試料は、30mlの5回の試料緩衝液を用いてカラムから溶出され、そして可能性あるパートナーに対する種々のmAbを使用してウェスタンブロットによって分析した。PCNAは、PC10mAbを用いてウェスタンブロット上で検出され、そして、プロカスパーゼは、抗プロカスパーゼ−8(Calbiochem)mAbまたはマウス抗プロカスパーゼ−10(Santa Cruz)または抗プロカスパーゼ−9(Santa Cruz)または抗プロカスパーゼ−3(Santa Cruz)mAbのいずれかを用いて、その後、セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲーションした抗マウスIgG(Nordic Immunology、1:5000に希釈)を用いて、SuperSignal West Pico検出キット(Pierce)を使用して検出された。
好中球に超音波をかけ、そして細胞質タンパク質を、PC10mAbまたはAb5pAb抗PCNAのいずれかを使用して標準的なイムノブロット手順に従って(Moriceau et al. 2009, J. Immunol.182:7254-7263)分析した。免疫共沈降実験を、空洞現象によって得られた好中球細胞質を使用して実施した(Witko-Sarsat et al. 1999, Blood 94:2487-2496)。細胞質(500mg)を50mlのプロテインGおよびAb5pAbと混合し、そして振とう下で4℃で30分間インキュベーションした。試料を、ストリンジェントな洗浄緩衝液(50mMトリス、500mM NaCl、1%NP−40、0.5%TritonX−100)で洗浄した、セファロースでコーティングされた磁気ビーズ(Milteny)を含むカラムにのせた。カラムを、この緩衝液を用いて2回、NaClが300mMであること以外は同じ緩衝液を用いて2回、そして最後に塩濃度の低い緩衝液(20mMトリスpH7.5)を用いて5回洗浄した。試料は、30mlの5回の試料緩衝液を用いてカラムから溶出され、そして可能性あるパートナーに対する種々のmAbを使用してウェスタンブロットによって分析した。PCNAは、PC10mAbを用いてウェスタンブロット上で検出され、そして、プロカスパーゼは、抗プロカスパーゼ−8(Calbiochem)mAbまたはマウス抗プロカスパーゼ−10(Santa Cruz)または抗プロカスパーゼ−9(Santa Cruz)または抗プロカスパーゼ−3(Santa Cruz)mAbのいずれかを用いて、その後、セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲーションした抗マウスIgG(Nordic Immunology、1:5000に希釈)を用いて、SuperSignal West Pico検出キット(Pierce)を使用して検出された。
動的シミュレーションを使用した改変されたp21ペプチドのインシリコでの設計。
PCNAに結合せず、コントロールペプチドとして使用できる改変されたp21ペプチドを設計するために、本発明者らはまず、3つのカルボキシp21ペプチド(RQTSMTDFYHSKR、配列番号18)と複合体を形成したPCNAの20ns長の分子動力学(MD)シミュレーションから得られた軌道に基づいたPCNA−p21相互作用(データは示さず)の原子レベルでの詳細度の一覧表を作った。その後、本発明者らは、PCNAと強い相互作用を形成するp21ペプチドアミノ酸を同定し、そして続いて、改変されたp21ペプチド(RQTGETDFDHAKA、配列番号19)と複合体を形成したPCNAの新たなMDシミュレーションを行なった。分子動力学(MD)シミュレーションに使用された最初の座標セットを、ペプチドSAVLQKKITDYFHPKK (PDB ID 1VYJ、配列番号20)と複合体を形成したPCNAのX線構造から調製した。PCNAトリマーの3つのシミュレーションを行なった:(i)MD1:3つの各モノマー(X線ファイルにおいて標識されたA、BおよびE)と相互作用するp21ペプチド(RQTSMTDFYHSKR、配列番号21)とPCNAトリマー、(ii)MD2:3つの改変されたペプチド(RQTGETDFDHAKA、配列番号22)とPCNA、および(iii)MD3;2つのp21ペプチド(PCNAモノマーAおよびC上)および1つの改変されたペプチド(PCNAモノマーE上)とPCNA。シミュレーション戦略は、実走行を20ns続けること以外は以前に記載のように実施した。システムは、明確な水分子、タンパク質および対イオンを含む、約100000原子を含む。計算は、NAMDソフトウェアを使用してCrayXT4の256コア上で実施した。得られた軌道の分析は、PCNAと改変されたp21ペプチドの間の戦略的な相互作用がないことを示し、それはPCNAにほとんど結合することができないという証拠を提供する。カルボキシp21とPCNAとの間の相互作用は、20nsのシミュレーション中にも安定であり続けた。
PCNAに結合せず、コントロールペプチドとして使用できる改変されたp21ペプチドを設計するために、本発明者らはまず、3つのカルボキシp21ペプチド(RQTSMTDFYHSKR、配列番号18)と複合体を形成したPCNAの20ns長の分子動力学(MD)シミュレーションから得られた軌道に基づいたPCNA−p21相互作用(データは示さず)の原子レベルでの詳細度の一覧表を作った。その後、本発明者らは、PCNAと強い相互作用を形成するp21ペプチドアミノ酸を同定し、そして続いて、改変されたp21ペプチド(RQTGETDFDHAKA、配列番号19)と複合体を形成したPCNAの新たなMDシミュレーションを行なった。分子動力学(MD)シミュレーションに使用された最初の座標セットを、ペプチドSAVLQKKITDYFHPKK (PDB ID 1VYJ、配列番号20)と複合体を形成したPCNAのX線構造から調製した。PCNAトリマーの3つのシミュレーションを行なった:(i)MD1:3つの各モノマー(X線ファイルにおいて標識されたA、BおよびE)と相互作用するp21ペプチド(RQTSMTDFYHSKR、配列番号21)とPCNAトリマー、(ii)MD2:3つの改変されたペプチド(RQTGETDFDHAKA、配列番号22)とPCNA、および(iii)MD3;2つのp21ペプチド(PCNAモノマーAおよびC上)および1つの改変されたペプチド(PCNAモノマーE上)とPCNA。シミュレーション戦略は、実走行を20ns続けること以外は以前に記載のように実施した。システムは、明確な水分子、タンパク質および対イオンを含む、約100000原子を含む。計算は、NAMDソフトウェアを使用してCrayXT4の256コア上で実施した。得られた軌道の分析は、PCNAと改変されたp21ペプチドの間の戦略的な相互作用がないことを示し、それはPCNAにほとんど結合することができないという証拠を提供する。カルボキシp21とPCNAとの間の相互作用は、20nsのシミュレーション中にも安定であり続けた。
統計学的分析。
統計学的分析を、Statviewソフトウェアパッケージを使用して実施した。スチューデントt検定を使用して比較を行なった。P<0.05の場合に差異を有意と判断した。
統計学的分析を、Statviewソフトウェアパッケージを使用して実施した。スチューデントt検定を使用して比較を行なった。P<0.05の場合に差異を有意と判断した。
ペプチド合成。
配列番号9〜17のペプチドは、GeneCustによって供給された。これらのペプチドは、細胞へのペプチドの侵入を容易にするためのタグを含む。その後、ペプチドをPBS中で希釈するか、またはエタノールもしくはDMSO中に可溶化した。
配列番号9〜17のペプチドは、GeneCustによって供給された。これらのペプチドは、細胞へのペプチドの侵入を容易にするためのタグを含む。その後、ペプチドをPBS中で希釈するか、またはエタノールもしくはDMSO中に可溶化した。
好中球アポトーシスに対するペプチドの効果。
好中球を、健康なボランティアの血液からポリモルホプレップを使用して単離した(Witko-Sarsat et al. 1999; Blood 94:2487-96)。その後、これらの好中球の生理学的なアポトーシスを、10%血清の補充されたRPMI培養培地中で37℃で16時間インキュベーションすることによって活性化した。これらの条件下で、好中球は自発的なアポトーシスを受け、これはホスファチジルセリン外面化を測定することによって評価され得る(Kantari et al. 2007; Blood 110:4086-95; Moriceau et al. 2009; J Immunol 182:7254-63)。ホスファチジルセリンを蛍光色素に結合したアネキシンVを使用して染色し、Facscan(Beckton Dickinson)を使用したフローサイトメトリーによるアポトーシスを受けた好中球の検出が可能となる。アネキシンVで染色された好中球はホスファチジルセリンを発現し、そしてマクロファージによって認識され食作用を受ける。さらに、7AADインターカレーター剤を用いての二次染色を使用して、後期アポトーシスを示した(Durant et al. 2004; J Leukocyte Biol 75:87-98)。従って、全アポトーシスは、7−AAD陽性またはアネキシンV陽性のいずれかである細胞の比率によって測定される(残りの細胞は生存と判断される)。早期アポトーシスは、アネキシンV陽性でかつ7−AAD陰性である好中球の比率によって測定される。後期アポトーシスは、アネキシンV陽性でかつ7−AAD陽性である好中球の比率によって測定される。7AAD陽性である壊死細胞は、フローサイトメトリー分析によってサイズ/粒度分布のデータに基づいて分析から排除される。試験したペプチドは、200μMの最終濃度で好中球培養液に加えられた。
好中球を、健康なボランティアの血液からポリモルホプレップを使用して単離した(Witko-Sarsat et al. 1999; Blood 94:2487-96)。その後、これらの好中球の生理学的なアポトーシスを、10%血清の補充されたRPMI培養培地中で37℃で16時間インキュベーションすることによって活性化した。これらの条件下で、好中球は自発的なアポトーシスを受け、これはホスファチジルセリン外面化を測定することによって評価され得る(Kantari et al. 2007; Blood 110:4086-95; Moriceau et al. 2009; J Immunol 182:7254-63)。ホスファチジルセリンを蛍光色素に結合したアネキシンVを使用して染色し、Facscan(Beckton Dickinson)を使用したフローサイトメトリーによるアポトーシスを受けた好中球の検出が可能となる。アネキシンVで染色された好中球はホスファチジルセリンを発現し、そしてマクロファージによって認識され食作用を受ける。さらに、7AADインターカレーター剤を用いての二次染色を使用して、後期アポトーシスを示した(Durant et al. 2004; J Leukocyte Biol 75:87-98)。従って、全アポトーシスは、7−AAD陽性またはアネキシンV陽性のいずれかである細胞の比率によって測定される(残りの細胞は生存と判断される)。早期アポトーシスは、アネキシンV陽性でかつ7−AAD陰性である好中球の比率によって測定される。後期アポトーシスは、アネキシンV陽性でかつ7−AAD陽性である好中球の比率によって測定される。7AAD陽性である壊死細胞は、フローサイトメトリー分析によってサイズ/粒度分布のデータに基づいて分析から排除される。試験したペプチドは、200μMの最終濃度で好中球培養液に加えられた。
柔軟性があり親水性のリンカー配列は、Leonhardt et al. 2000; J Cell Biol. 149:271-280に記載のpEVRFプラスミドからであった。ダイマー化したオリゴヌクレオチドを、Not1およびXho1によって消化されたpcDNA3−PCNAと直接ライゲーションした。
実施例2:成熟したヒト好中球は、その細胞質において専らPCNAを発現する。
好中球溶解液のウェスタンブロット分析は、容易に、リンパ球におけるそれと同等な量のPCNAを検出したが、PLB985前骨髄球細胞系におけるそれよりも少ない量のPCNAを検出した(図1A)。
好中球溶解液のウェスタンブロット分析は、容易に、リンパ球におけるそれと同等な量のPCNAを検出したが、PLB985前骨髄球細胞系におけるそれよりも少ない量のPCNAを検出した(図1A)。
驚くべきことに、好中球の細胞内分画は、細胞質のみにおける高いPCNA含量を示し、そして核および顆粒におけるその不在を示した(図1B)。分画手順の品質は、それぞれ細胞質、顆粒および核に対して、α−アクチン、エラスターゼおよびラミン−Bの特異的マーカーの検出によって検証された。
実施例3:核から細胞質へのPCNAの再局在化は、顆粒球分化中に起こる。
PCNA細胞内局在はまた、臍帯血から単離され、そしてIL−3およびG−CSFと共に培養した、ヒトCD34+細胞のin vitroにおける顆粒球分化の経過中のPCNA免疫標識後の共焦点顕微鏡によって研究された。完全な顆粒球の成熟を、メイグリュンワルドギムザ(MGG)染色後に形態学的分析によって評価した。分化を誘導する前は、PCNAはCD34+細胞の核にほぼ専ら検出可能であったが、IL3−G−CSF処理から7日後には、前記タンパク質は細胞質と核の混合した分布を示した(図1C)。13日目に、殆どの細胞が、多葉性の核を有し、PCNAは細胞質に局在し、これは、成熟した末梢好中球に観察されたものと似ている。
PCNA細胞内局在はまた、臍帯血から単離され、そしてIL−3およびG−CSFと共に培養した、ヒトCD34+細胞のin vitroにおける顆粒球分化の経過中のPCNA免疫標識後の共焦点顕微鏡によって研究された。完全な顆粒球の成熟を、メイグリュンワルドギムザ(MGG)染色後に形態学的分析によって評価した。分化を誘導する前は、PCNAはCD34+細胞の核にほぼ専ら検出可能であったが、IL3−G−CSF処理から7日後には、前記タンパク質は細胞質と核の混合した分布を示した(図1C)。13日目に、殆どの細胞が、多葉性の核を有し、PCNAは細胞質に局在し、これは、成熟した末梢好中球に観察されたものと似ている。
核局在、細胞質局在、または核と細胞質の混合した局在を有する細胞を計測することからなる、定量分析(図1Cのヒストグラム参照)は、分化した好中球の核から細胞質へのこのPCNAの再分布を確認した。
実施例4:PCNAは、好中球アポトーシスの間にプロテアソーム分解にターゲティングされるが、それはG−CSFによって安定化される。
その現在の名称によって示されるように、PCNAレベルは細胞周期中にモデュレーションされ、そして増殖細胞のS期の間に特に高い。以下に示したように、PCNA発現はまた、しかしながらその生存状態の関数として、非増殖好中球においてもモデュレーションされているようであった。実際に、常時存在のまたはより顕著な抗Fasまたはグリオトキシンにより増強されたアポトーシス後に観察され得るように、PCNA発現は、死の経路とは関係なく、アポトーシスを受けた好中球において減少していた(図2A)。アポトーシス過程は、ホスファチジルセリン外面化によって評価され(図2B)、これは予期された通り、37℃で15時間インキュベーションした後のアネキシン−V+および7−アミノアクチノマイシンD(7−AAD)−細胞の有意な増加を確認し、これはさらに抗FasmAbまたはグリオトキシンによって増強された。同様に、カスパーゼ−8(図2C)およびカスパーゼ−3(図2D)活性の時間依存的な増加が、常時存在のアポトーシス中の好中球において観察され、これもさらに、抗Fasまたはグリオトキシン曝露後に増強された。最後に、好中球アポトーシスはまた、DiOC6標識後のミトコンドリア脱分極によって実証された。従って、減少したPCNA発現(図2A)は、使用した試験または実験条件に関係なく、アポトーシス度と平行するようである。特に、プロテアソーム阻害剤(PS−341)(図2E)およびMG132はアポトーシスにより誘導されるPCNA減少を逆転し、そして結果として、好中球の死滅を有意に阻害した。興味深いことに、PS−341もまた、抗Fasまたはグリオトキシンと共に6時間好中球をインキュベーションした後に行なわれるPCNA分解を逆転し(図2F)、よって、プロテアソームにより媒介されるPCNA分解がそれぞれ死のレセプターおよびミトコンドリアアポトーシス経路で起こっていると推測される。
その現在の名称によって示されるように、PCNAレベルは細胞周期中にモデュレーションされ、そして増殖細胞のS期の間に特に高い。以下に示したように、PCNA発現はまた、しかしながらその生存状態の関数として、非増殖好中球においてもモデュレーションされているようであった。実際に、常時存在のまたはより顕著な抗Fasまたはグリオトキシンにより増強されたアポトーシス後に観察され得るように、PCNA発現は、死の経路とは関係なく、アポトーシスを受けた好中球において減少していた(図2A)。アポトーシス過程は、ホスファチジルセリン外面化によって評価され(図2B)、これは予期された通り、37℃で15時間インキュベーションした後のアネキシン−V+および7−アミノアクチノマイシンD(7−AAD)−細胞の有意な増加を確認し、これはさらに抗FasmAbまたはグリオトキシンによって増強された。同様に、カスパーゼ−8(図2C)およびカスパーゼ−3(図2D)活性の時間依存的な増加が、常時存在のアポトーシス中の好中球において観察され、これもさらに、抗Fasまたはグリオトキシン曝露後に増強された。最後に、好中球アポトーシスはまた、DiOC6標識後のミトコンドリア脱分極によって実証された。従って、減少したPCNA発現(図2A)は、使用した試験または実験条件に関係なく、アポトーシス度と平行するようである。特に、プロテアソーム阻害剤(PS−341)(図2E)およびMG132はアポトーシスにより誘導されるPCNA減少を逆転し、そして結果として、好中球の死滅を有意に阻害した。興味深いことに、PS−341もまた、抗Fasまたはグリオトキシンと共に6時間好中球をインキュベーションした後に行なわれるPCNA分解を逆転し(図2F)、よって、プロテアソームにより媒介されるPCNA分解がそれぞれ死のレセプターおよびミトコンドリアアポトーシス経路で起こっていると推測される。
PCNAレベルが好中球の生存と密接に連関しているという観察は、好中球の寿命を延ばすと記載されている、G−CSFによって維持される安定なPCNAレベルによって実証された(Maianski et al. 2004; J. Immunol. 172:7024-7030)。事実、PCNA発現動態の分析は、37℃で6時間インキュベーションした後に観察された減少が、G−CSFによって完全に防止され、PCNAは15時間まで上昇したままであったことを明らかとした(図3A)。このようなG−CSFにより誘導されたPCNAレベル安定化は用量依存性であり、延長された好中球の生存と明瞭に関連していた(図3B)。21時間までG−CSFと共に好中球をインキュベーションしても、それぞれリアルタイムRT−PCRおよび一次転写物リアルタイムRT−PCRによって評価したところ、PCNA mRNA発現または転写は改変されなかったが、BLyS遺伝子発現はアップレギュレーションされた(Scapini et al. 2003; J. Exp. Med. 197:297-302)(図3C)。これらの観察は、PCNA遺伝子特異的プライマーの種々の対およびノザンブロット実験を使用することによって確認された。特に、細菌に由来したホルミル化ペプチドではなく、インターフェロン−gが、PCNA分解を防ぎ、ここでも好中球の生存に対するその防御的効果を支持する。好中球の生存を正に調節する上でのPCNAの関与はさらに、G−CSFで5日間かけて処理した健康ドナーの血液から単離された好中球を調べることによって確認された。実際に、イムノブロットによって評価されたこれらの好中球におけるPCNA含量は、G−CSF処理前に比較して顕著に増加した(図3D)。
共焦点顕微鏡分析(図3E)によっても確認された、G−CSF処理ドナーにおけるより高い好中球細胞質PCNA発現は、常時存在のアポトーシスを受けるこれらの好中球の傾向が減少したことに明解に関連していた(図3D)。
実施例5:リポ多糖(LPS)により誘導された肺炎症の消退中に単離されたマウス好中球における低いPCNAレベル。
in vivoにおける好中球生存を調節する際のPCNAの役割についてより多くの洞察を得るために、本発明者らは、骨髄(BM)または末梢血のいずれかから単離されたマウス好中球を研究し、そしてそれらがその細胞質内でPCNAを発現することを観察した(図4A)。ヒト好中球における以前の所見に沿って、グリオトキシンは、アネキシンV標識によって評価したところ、用量依存的にBM好中球においてアポトーシスをトリガーする(図4B)。適切に、プロカスパーゼ−3およびPCNA発現の平行的な減少がウェスタンブロット分析によって観察され、従って、PCNAがマウス好中球生存に関連することを確認した。本発明者らは次に、炎症消退中における炎症好中球の調査を可能とする、マウスLPS誘導肺炎症モデルに切り換えた。以前に記載されているように(Chignard et al. 2000; Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279:L1083-1090)、LPSの鼻腔内滴下は、気道内における大量の好中球の動員をトリガーし、24時間後に最大に蓄積される(図4C)。炎症の消退はLPS投与から48時間後に始まり、そして動員された好中球の減少した流入、増加したアポトーシス、およびマクロファージにより媒介される食作用によって特徴付けられる(図4C)。特に、好中球数は72時間後に非常に低く、そして96時間後に、全ての好中球はマクロファージによって消失したようである(Chignard et al. 2000; Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279:L1083-1090)。実際に、LPS攻撃から16時間後に気管支肺胞洗浄液(BALF)から単離された肺好中球は細胞質PCNAを発現したが、LPS攻撃から48時間後には、細胞質PCNAの発現は、PCNA免疫標識後の共焦点顕微鏡分析によって示されたように殆ど検出できなかった(図4D)。LPS攻撃から48時間後にBMまたはBALFから単離された好中球におけるPCNAのウェスタンブロット分析は、後者における低いPCNA発現を確認した(図4E)。興味深いことに、LPS攻撃から48時間後に単離された好中球は、BM好中球と比較して、37℃で一晩培養した後にアネキシンV陽性の増加した比率によって実証されたように、弱い生存能を示した(図4F)。ここでも、高いBM好中球生存率は、顕著に上昇したPCNAレベルと関連していた。これとは対照的に、肺好中球はPCNAおよびプロカスパーゼ−3を鋭く消失させ、これによりそのアポトーシス促進状態が実証される(図4E)。
in vivoにおける好中球生存を調節する際のPCNAの役割についてより多くの洞察を得るために、本発明者らは、骨髄(BM)または末梢血のいずれかから単離されたマウス好中球を研究し、そしてそれらがその細胞質内でPCNAを発現することを観察した(図4A)。ヒト好中球における以前の所見に沿って、グリオトキシンは、アネキシンV標識によって評価したところ、用量依存的にBM好中球においてアポトーシスをトリガーする(図4B)。適切に、プロカスパーゼ−3およびPCNA発現の平行的な減少がウェスタンブロット分析によって観察され、従って、PCNAがマウス好中球生存に関連することを確認した。本発明者らは次に、炎症消退中における炎症好中球の調査を可能とする、マウスLPS誘導肺炎症モデルに切り換えた。以前に記載されているように(Chignard et al. 2000; Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279:L1083-1090)、LPSの鼻腔内滴下は、気道内における大量の好中球の動員をトリガーし、24時間後に最大に蓄積される(図4C)。炎症の消退はLPS投与から48時間後に始まり、そして動員された好中球の減少した流入、増加したアポトーシス、およびマクロファージにより媒介される食作用によって特徴付けられる(図4C)。特に、好中球数は72時間後に非常に低く、そして96時間後に、全ての好中球はマクロファージによって消失したようである(Chignard et al. 2000; Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279:L1083-1090)。実際に、LPS攻撃から16時間後に気管支肺胞洗浄液(BALF)から単離された肺好中球は細胞質PCNAを発現したが、LPS攻撃から48時間後には、細胞質PCNAの発現は、PCNA免疫標識後の共焦点顕微鏡分析によって示されたように殆ど検出できなかった(図4D)。LPS攻撃から48時間後にBMまたはBALFから単離された好中球におけるPCNAのウェスタンブロット分析は、後者における低いPCNA発現を確認した(図4E)。興味深いことに、LPS攻撃から48時間後に単離された好中球は、BM好中球と比較して、37℃で一晩培養した後にアネキシンV陽性の増加した比率によって実証されたように、弱い生存能を示した(図4F)。ここでも、高いBM好中球生存率は、顕著に上昇したPCNAレベルと関連していた。これとは対照的に、肺好中球はPCNAおよびプロカスパーゼ−3を鋭く消失させ、これによりそのアポトーシス促進状態が実証される(図4E)。
これらのデータはin vitroにおける所見を拡張し、そしてPCNAが、好中球の生存能を調節することによって、炎症消退中の好中球の生存/アポトーシスバランスを制御する際に主要なプレイヤーとして作用し得るという概念を支持する。
実施例6:PCNAパートナーと干渉することが知られるp21ペプチドは、PCNAにより媒介される好中球の抗アポトーシス効果に対抗する
PCNAは内因性の酵素活性を全く有さず、そしてその生物学的役割は、種々のパートナーとの会合を媒介するその能力に依拠する(Warbrick et al. 2000; Bioessays 22:997-1006, Maga et al. 2003; J. Cell Sci. 116:3051-3060)。殆どのPCNA相互作用はドメイン間接続ループで起こる。現在知られているPCNAに対して最も高い親和性を有するタンパク質はCDK阻害剤p21であり、これは結合ポケットを実質的に満たし、これは細胞複製の阻害および他のPCNAにより調節される機能におけるその主な役割を説明する。
PCNAは内因性の酵素活性を全く有さず、そしてその生物学的役割は、種々のパートナーとの会合を媒介するその能力に依拠する(Warbrick et al. 2000; Bioessays 22:997-1006, Maga et al. 2003; J. Cell Sci. 116:3051-3060)。殆どのPCNA相互作用はドメイン間接続ループで起こる。現在知られているPCNAに対して最も高い親和性を有するタンパク質はCDK阻害剤p21であり、これは結合ポケットを実質的に満たし、これは細胞複製の阻害および他のPCNAにより調節される機能におけるその主な役割を説明する。
それ故、本発明者らは、増殖細胞においてPCNAパートナーと干渉することができるとして以前に確証された、p21(いわゆるカルボキシp21)の残基141〜160に対応するペプチドの効果を試験した(Warbrick et al. 2006; Oncogene 25:2850-2859)。
成熟好中球においてはp21は基礎条件下で殆ど検出できず(Klausen et al. 2004; J. Leukoc. Biol. 75:569-578)、それにより、細胞質PCNAの抗アポトーシス活性の調節におけるその関与は除外される。PCNAに結合しない改変されたカルボキシp21ペプチドはまた分子動力学的シミュレーションを使用して設計され、そしてコントロールとして使用された(図5A)。
PCNAに結合しそしてPCNAパートナーと競合すると推定されるカルボキシp21は、好中球のアポトーシスをトリガーし、これはDiOC6標識後の脱分極したミトコンドリアを有する細胞の比率がより高いことによって評価され、一方、改変されたカルボキシp21ペプチドではこのような活性は全く観察されなかった(図5B)。カルボキシp21のアポトーシス促進効果はまた、アネキシンV標識後に外面化したホスファチジルセリンを有する細胞の有意に増加した比率によって実証された(図5C)。カルボキシp21によりトリガーされたアポトーシスは、PCNA発現の用量依存的な減少と平行したことに注意されたい(図5D)。さらに、カルボキシp21はG−CSFにより誘導された好中球の生存を有意に阻害し(図5E)、ここでも好中球生存におけるPCNAの調節的な役割を強く示唆する。
これらのデータに基づいて、本発明者らは、カルボキシp21は、細胞周期依存的な機序を介して、おそらく細胞質PCNAパートナーと競合することによって、好中球アポトーシスをトリガーしたと結論づけた。
実施例7:PCNA過剰発現は、好中球の細胞モデルである分化したPLB985においてアポトーシスの誘導を遅延させる。
好中球は、トランスフェクション実験には適さない、短寿命で非増殖性の初代細胞である。それ故、ジメチルホルムアミド(DMF)処理時に好中球へと分化し得る、PLB985のような、前骨髄球性細胞株は、成熟好中球を模倣した価値ある細胞モデルを構成する(Pedruzzi et al. 2002; Br. J. Haematol. 117:719-726)。
好中球は、トランスフェクション実験には適さない、短寿命で非増殖性の初代細胞である。それ故、ジメチルホルムアミド(DMF)処理時に好中球へと分化し得る、PLB985のような、前骨髄球性細胞株は、成熟好中球を模倣した価値ある細胞モデルを構成する(Pedruzzi et al. 2002; Br. J. Haematol. 117:719-726)。
従って、PLB985細胞はpcDNA3PCNA(PLB985−PCNA)を用いて安定にトランスフェクションされ、これは細胞分化の前後のPCNA免疫標識後の共焦点顕微鏡によって確認された(図6A)。蛍光定量は、空プラスミドで安定にトランスフェクションされたコントロールPLB985と比較して、安定にトランスフェクションされたPLB−PCNAにおける有意に増加したPCNA発現を示した(図6A)。DMF処理後、分化した顆粒球のそれぞれの表現型および機能的マーカーである、そのCD11b発現またはNADPHオキシダーゼ活性における差異は全く観察されなかった。予期されたように、分化前にはスーパーオキシド産生は全く得られず、一方、有意な化学発光が、コントロールおよびPCNAを過剰発現するPLB985の両方においてホルボール−12−ミリステート−13(PMA)によってトリガーされた。従って、PCNA過剰発現は顆粒球分化および応答性に影響を及ぼさなかった。以前に記載されたように、アポトーシスは、PLB985細胞において、死のレセプター経路を介してTRAILを使用して、またはミトコンドリア経路を介してグリオトキシンを使用してトリガーされ得る(Moriceau et al. 2009; J. Immunol. 182:7254-7263)。DMF誘導分化後、PCNAを過剰発現するPLB985細胞は、DNAフラグメンテーション(図6B)またはクロマチン凝縮(図6C)によって判断したところ、コントロールプラスミドでトランスフェクションされた分化したPLB985と比較して、TRAILまたはグリオトキシンにより誘導されたアポトーシスに対して防御された。さらに、ミトコンドリア脱分極またはカスパーゼ−8活性のいずれかは、常時存在、TRAILまたはグリオトキシンにより誘導されたアポトーシス後のPLB985−PCNAにおいて、コントロールと比較して有意により低かった(図6D、E)。その後、PCNA配列の残基120〜132に対応するp21相互作用ドメインでもあるPCNAドメイン間接続ループにおける荷電突然変異を使用して、このPCNAドメインがその抗アポトーシス活性に関与しているかどうかを決定し、よって、ドメイン間接続ループの突然変異したPCNAを発現するPLB985細胞を作製した。ミトコンドリア脱分極によって評価されるPCNAの抗アポトーシス活性は、PLB985−PCNAと比較して、ドメイン間接続ループの突然変異したPCNAを発現するPLB985において有意に減少した(図6D)。同様に、この突然変異体PCNAを用いて安定にトランスフェクションされたPLB985はまた、TRAILまたはグリオトキシン誘導アポトーシス後に、PLB985−PCNAと比較して増加したカスパーゼ−8活性を有していた(図6E)。アポトーシス刺激の非存在下で、PCNAは分化により誘導されるアポトーシスから防御し、これは好中球の生理学的なアポトーシスを反映し得る。
まとめると、これらのデータは、いくつかのPCNAタンパク質パートナー(群)はPCNAドメイン間接続ループに結合して、観察される抗アポトーシス効果を媒介し得ることを強く示唆する。これらの観察はまた、カルボキシp21が、PCNA部位に特異的に結合することによって、好中球のアポトーシスをトリガーすることを示した結果を実証する。
実施例8:PCNAはプロカスパーゼ−8、プロカスパーゼ−10、プロカスパーゼ−3、プロカスパーゼ−9と会合し、そして後者の活性化を干渉する。
最後に、本発明者らは、好中球細胞質を使用して免疫共沈降(IP)実験を実施して、その抗アポトーシス活性に関与し得る、可能性ある細胞質PCNAパートナーを同定した。
最後に、本発明者らは、好中球細胞質を使用して免疫共沈降(IP)実験を実施して、その抗アポトーシス活性に関与し得る、可能性ある細胞質PCNAパートナーを同定した。
Mcl−1は好中球において発現される最も重要なBcl−2ホモログの1つであり、その発現はアポトーシス中に減少する。それは増殖中の細胞におけるPCNAパートナーとして以前に記載されたので(Fujise et al. 2000; J. Biol. Chem. 275:39458-39465)、本発明者らはPCNAがMcl−1に結合し得るかどうかを調べた。Mcl−1は成功裏に免疫沈降され得たが、PCNAと、Mcl−1、または他のBcl−2ホモログ、例えばアポトーシス促進性タンパク質BaxまたはBidとの間に物理的な会合は全く検出されなかった。
これとは対照的に、同じPCNA免疫共沈降プロトコールを使用して、プロカスパーゼ−8(図7A)、プロカスパーゼ−10(図7B)、プロカスパーゼ−3(図7C)およびプロカスパーゼ−9(図7D)を特異的mAbを使用して検出することができた。さらに、相互作用が、ウェスタンブロット分析のための抗プロカスパーゼIPおよび抗PCNAを使用した相互免疫沈降実験を使用して確認された。さらに、好中球に対して実施された抗PCNAおよび抗プロカスパーゼを用いての二重免疫標識からの結果は、PCNAがプロカスパーゼ−8、−10、−3および−9と同じ場所に局在し得ることを強く示唆する。おそらく、細胞質PCNA−プロカスパーゼの相互作用がその活性化を防ぐのだろう。
その仮説は、全てのアポプトソーム成分、すなわち、以前に記載されたような(McStay et al. 2008; Cell Death Differ. 15:322-331)プロカスパーゼ−9およびアポトーシスプロテアーゼ活性化因子−1(Apaf−1)を含む好中球細胞質を使用して、in vitroアッセイにおいてプロカスパーゼ−9切断を評価することによって試験した。外来性の精製したチトクロムcおよびdATPは、カスパーゼ−9のウェスタンブロット分析によって証明されるように、時間依存的にプロカスパーゼ−9切断(37kDa)をトリガーした(図7E)。しかしながら、精製したPCNAを混合物に加えた場合、プロカスパーゼ−9切断は遅延し、持続的なプロカスパーゼ−9(47kDa)および37kDaフラグメントの検出の消滅がなされ、従って、精製したPCNAはプロカスパーゼ−9の活性化を損なうことを実証する。同じ濃度(100mM)で試験したオボアルブミンはプロカスパーゼ−9の活性化に影響を及ぼさず、そしてコントロールとして作用した。カスパーゼ−9活性化を次に、PCNAまたはドメイン間接続ループ突然変異体を過剰発現するPL985細胞において調べた。DMFへの曝露から6日後、カスパーゼ−9活性は非分化細胞とは異なり上昇した。このカスパーゼ−9活性は、加齢した好中球の生理学的なアポトーシスに対応し得る。特に、この分化により誘導されたカスパーゼ−9活性化は、コントロールPLB985よりもPLB985−PCNAにおいて有意により低く、従って、PCNAの抗アポトーシス効果を確認する。これに対し、分化により誘導されるアポトーシスに対する防御効果は、突然変異体PCNAを発現するPLB985においては全く観察されなかった(図7F)。
合わせると、これらの所見は、ドメイン間接続ループがPCNA−プロカスパーゼ−9相互作用に関与することを強く示唆する。
実施例9:PCNAから誘導されたペプチドは、好中球のアポトーシスを増強し得る
PCNAの3次元構造を分析し、そしてタンパク質の表面において曝露される領域を同定した。PCNAのこれらの曝露された領域から誘導されたペプチドを合成した。これらのペプチドの配列は以下である:
−APNQEKVSDYEMKLM(配列番号2)
−MKLMDLDVEQLGIPEQEYS(配列番号3)
−KDGVKF(配列番号4)
−SQTSNVDKEEEAV(配列番号5)
−MSADVPL(配列番号6)
−YYLAPKIEDEEGS(配列番号7)。
PCNAの3次元構造を分析し、そしてタンパク質の表面において曝露される領域を同定した。PCNAのこれらの曝露された領域から誘導されたペプチドを合成した。これらのペプチドの配列は以下である:
−APNQEKVSDYEMKLM(配列番号2)
−MKLMDLDVEQLGIPEQEYS(配列番号3)
−KDGVKF(配列番号4)
−SQTSNVDKEEEAV(配列番号5)
−MSADVPL(配列番号6)
−YYLAPKIEDEEGS(配列番号7)。
細胞へのこれらのペプチドの侵入を容易にするために、タグをペプチドに融合させた。2つの異なるタグを使用した:HIV−1Tatポリペプチドから誘導されたTatタグ(YGRKKRRQRRR、配列番号27)をペプチドのN末端に融合するか、またはRYIRSタグ(配列番号8)をペプチドのC末端に融合させた(表I参照)。
ペプチドを好中球細胞に加え、そして細胞アポトーシスに対するその効果を、ホスファチジルセリン外面化を測定することによって分析した。ホスファチジルセリンを蛍光色素に結合させたアネキシンVを使用して染色し、フローサイトメトリーによるアポトーシスを受けた好中球の検出を可能とした。アネキシンVで染色された好中球はホスファチジルセリンを発現し、そしてマクロファージによって認識および食作用を受ける。さらに、7AADインターカレート剤を用いての2回目の染色を使用して、後期アポトーシスを示し、初期アポトーシスと後期アポトーシスとの間の区別を可能とした。
結果を以下の表IIからVIに示す。
200μMの濃度で加えられた場合、配列番号12の配列のペプチド(ペプチド4)はアネキシンV染色の増加を誘導し、そして好中球のアポトーシスを増強するようであった(表II)。興味深いことに、このペプチドはPCNAのp21相互作用部位に対応する。このペプチドのアポトーシス促進活性は、後期アポトーシスで特に明瞭であった(表IV)。
さらに、PCNAタンパク質の同じ部分に対応するが異なるタグを有する、配列番号11の配列のペプチド(ペプチド3)もまた、500μMの濃度で加えられた場合、アネキシンV染色の増加を誘導した(表V)。
従って、ペプチド3および4は好中球に対してアポトーシス促進活性を示し、そしてそれらを炎症疾病の処置のために使用することができることが実証された。
さらに、ペプチド8は、好中球に対して有意な抗アポトーシス活性を示すことが判明した。PCNAカルボキシ末端に位置しそして好中球生存をトリガーするこのペプチドは、抗アポトーシスタンパク質を安定化させる、PCNA模倣体として作用し得る。この活性は、好中球減少症(周期性または先天性好中球減少症)に観察されるような過剰な好中球アポトーシスの場合に有用であり得る。特に、これらの好中球減少症は、好中球におけるPCNA足場を安定化させる化合物であるG−CSFによって処置される(図3/7に示すように)。G−CSF処置を除いて、これらの好中球減少症に対する他の処置はなく、そして高いレベルの好中球アポトーシスを減少させるように探索される可能性ある分子機序はない。従って、その結合部位がPCNAカルボキシ末端である特異的なPCNAパートナーと干渉することによって好中球アポトーシスを減少させることは、有望な治療戦略を構成する。
実施例10:結果の考察
好中球の寿命のアポトーシスによる調節は、宿主防御エフェクター細胞としてのその機能と、これらの有害な可能性のある細胞の安全なターンオーバーとの間の微細なバランスを提供する。好中球のアポトーシスは炎症の消退に必須であり、そして遅延したアポトーシスおよび損なわれた好中球のクリアランスは、事実、慢性炎症の特徴である。それ故、好中球は注意深く編成された寿命を有し、これは、連続的なステップと重要な制御点を有する予め確立された細胞内「時計」の存在を必要とするが、これは依然として決められていない。
好中球の寿命のアポトーシスによる調節は、宿主防御エフェクター細胞としてのその機能と、これらの有害な可能性のある細胞の安全なターンオーバーとの間の微細なバランスを提供する。好中球のアポトーシスは炎症の消退に必須であり、そして遅延したアポトーシスおよび損なわれた好中球のクリアランスは、事実、慢性炎症の特徴である。それ故、好中球は注意深く編成された寿命を有し、これは、連続的なステップと重要な制御点を有する予め確立された細胞内「時計」の存在を必要とするが、これは依然として決められていない。
本明細書において、本発明者らは、DNA複製および修復に関与している周知の核タンパク質であり、増殖中の細胞のみにおいて生か死かの決定に関与する中心分子の1つとして考えられるPCNAは、好中球生存の主要なレギュレーターの全ての特徴を示すことを見出した。実際に、本発明者らは、循環中の成熟好中球は上昇した量のPCNAを含んでいるが、そのPCNA含量はその生存状態の関数として変化したことを観察した。アポトーシスを受ける好中球においては、カスケードをシグナリングするトリガーが外因性(死レセプター)または内因性経路(ミトコンドリア)を通して進行しようと関係なく、PCNAはプロテアソームにより媒介される分解を受けた。これに対して、PCNAレベルは、好中球の生存を延長する因子、例えばG−CSFまたはIFN−gによって安定に維持される。さらに、LPS誘導肺炎症のマウスモデルにおいて、炎症消退中にBALFから単離されたアポトーシス前の好中球におけるPCNAレベルは、骨髄から精製された完全に生存した好中球におけるものよりもはるかに低く、好中球PCNAレベルは、炎症中にその生存状態に応じて変化するという考えを支持する。特に、少なくともヒト好中球におけるPCNA含量のモデュレーションは転写後事象のみに関与するようである。なぜなら、PCNAmRNA発現の変化が、サイトカインにより誘導された好中球の生存中または生理学的アポトーシス中には検出されなかったからである。同様に、PCNA遺伝子誘導が、in vivoにおいてG−CSFで処理したドナーから単離された好中球で起こるとは報告されていない。本明細書において、G−CSFで処理したドナーから単離された好中球は、好中球生存におけるその主要な役割を保ちつつ、延長した生存と、しかしまた高いPCNA含量を示した。PCNAが好中球生存にとって不可欠であるかどうかは、PCNAノックアウト動物が現在ないために探索することはできない。
数多くの研究によると、PCNAは、数多くの異なるタンパク質に結合する顕著なアダプター分子として核において機能する。実際に、幾人かの著者が、多くの細胞核プロセス(DNA複製、ヌクレオチド切断修復、複製後ミスマッチ修復およびアポトーシスなど)のためのコミュニケーションセンターとして、DNA分子に沿った移動プラットフォームである、トリマーPCNAのための中心的な役割を確立した。
好中球のような循環していない細胞では、PCNA抗アポトーシス活性は、核機能に全く理論的に関与しない機序を介して進行すべきである。そして実際に、本研究で明らかになった1つの顕著な特徴は、好中球細胞質におけるPCNAの排他的な局在であり、そして本発明者らは、後の好中球成熟の段階におけるその核から細胞質への再局在化を記述した。核から細胞質への輸送またはPCNAを細胞質区画内に留めておく隔離機序のいずれかにおける根底にある機序は依然として解読されていない。本発明者らは、初生好中球において、PCNAがプロカスパーゼ−8、プロカスパーゼ−10、プロカスパーゼ−9、プロカスパーゼ−3と構成的に会合し、おそらく、その活性化を防ぐために細胞質内にそれらを隔離していることを明瞭に実証した。PCNAによるプロカスパーゼ−9の隔離は、アポトーシスを阻害する非常に効率的な方法であることが分かる。しかしながら、他の細胞質タンパク質との会合が、好中球におけるPCNAの抗アポトーシス効果を媒介し得ることを除外できない。
増殖中の細胞においては、PCNAは、強力なCDK阻害剤として初めて同定された、腫瘍サプレッサータンパク質p21によって密接に制御される。構造的研究は、p21がポリメラーゼ結合にとって必要である表面領域を直接的に遮断することを示した。生化学的研究は、p21が他のPCNAパートナーに対する効果的な競合物質であることを示すことによって、その概念を広げた。実際に、カルボキシp21ペプチド(PCNA配列上の残基120〜132)のような、PCNAドメイン間接続ループに結合するための共通配列を有する合成ペプチドは、細胞周期を通した進行を停止し、そして増殖中の細胞にトランスフェクションされた場合にアポトーシスを誘導する。本明細書において、本発明者らはカルボキシp21が好中球アポトーシスおよび同時にPCNA分解を直接的にトリガーすることを示した;それはまた好中球の生存を延長するG−CSFの能力も損ない、従って、PCNAは好中球におけるG−CSF抗アポトーシス効果にとって絶対に不可欠であることを明らかに証明した。
これらの観察はまた、合成CDK阻害剤であるロスコビチンが、好中球アポトーシスをトリガーし、そして結果として、in vivoにおける炎症消退を促進するという報告と一致する。従って、これらの著者は、これまで細胞周期調節に制限されていたCDK活性が、好中球のような非増殖細胞においてもアポトーシスを制御し得るという証拠を提供した。ロスコビチンはまた肺感染の後の炎症の消退および加速した回復を向上させることが示されている。さらに、いくつかの細胞周期タンパク質が好中球分化中にダウンレギュレーションされるが、成熟好中球は高いレベルのCDK2およびCDK阻害剤p27を発現した。実際に、炎症中に、好中球は、増殖中の細胞においてアポトーシスと分裂促進進行の制御との間の連関として作用する、アポトーシスタンパク質阻害剤(IAP)ファミリーメンバーであるサバイビンをアップレギュレーションすることができる。従って、PCNA以外の細胞周期調節タンパク質が、同様に好中球の寿命の制御に関与し得る。
炎症における可能性ある細胞標的としてみなされていた好中球に関する殆どの研究は、その移動および流入を遮断するように試みた。しかしながら、ターゲティングし得る好中球生物学の別の局面は、しばしば過小評価されているけれども、好中球生存のモデュレーションである。この後者の点では、好中球の生存/死を制御する特異的で密接に調節された分子機序の徹底的な解明が、効率的および効果的に介入するために必要とされる。本明細書において報告された結果は特筆すべきであるが、これはPCNAが好中球生存の糸を引っ張る細胞質プラットフォームとして作用するという実証だけによるものではなく、また、炎症または好中球減少症の観点から好中球およびその細胞内経路について考える新たな方法を白日の下にさらしたことによるものでもある。
実施例11:CDK2またはGADD45siRNAは、アポトーシスに対してDMF分化PLB985を感作した
CDK2およびGADD45は、増殖細胞におけるPCNAの核パートナーであると記載されている。本発明者らは、CDK2およびGADD45の両方が好中球細胞質内に存在し、siRNA技術を使用したCDK2およびGADD45タンパク質のレベルの減少が、好中球に分化したPLB985細胞を感作し、アポトーシスに対して好中球に分化したPLB985細胞を増強したことを示した。
CDK2およびGADD45は、増殖細胞におけるPCNAの核パートナーであると記載されている。本発明者らは、CDK2およびGADD45の両方が好中球細胞質内に存在し、siRNA技術を使用したCDK2およびGADD45タンパク質のレベルの減少が、好中球に分化したPLB985細胞を感作し、アポトーシスに対して好中球に分化したPLB985細胞を増強したことを示した。
特に、siRNA手順を、DMF処理から3日後および4日後に、5日目のアポトーシス率の分析前に実施した。この時点で、DMFにより分化したPLB985細胞において全てのPCNAは細胞質にあった。CDK2またはGADD45siRNAの効果はCD11b発現に対して全く観察されず、従って、それは分化過程に影響を及ぼさなかったことを示唆する。混ぜたsiRNAではなく、CDK2またはGADD45siRNAが、ミトコンドリア脱分極によって評価したところ、PLB985細胞が分化後に受ける構成的アポトーシスを僅かにしかし有意に増強した(図8)。
これらのデータは、PCNAパートナー、すなわちCDK2およびGADD45αとの干渉が、好中球アポトーシスをトリガーし得るという新たな所見を確認する。
実施例12:顆粒球分化中の核から細胞質への再局在化は、成熟好中球におけるPCNAの抗アポトーシス活性に必須である
「好中球様細胞」と考えられるジメチルホルムアミド(DMF)により分化したPLB985細胞を使用して、PCNA抗アポトーシス活性に対するPCNA排出のモデュレーションの影響を研究した。PCNAの核隔離が成熟好中球においてそのPCNA抗アポトーシス活性に影響を及ぼすかどうかを調べるために、PLB985細胞を、SV40−NLS−PCNAと称される核PCNA突然変異体を用いて安定にトランスフェクションし;実際に、以前に記載のように、PCNAとSV40NLSの融合によりその排他的な核局在が得られる。従って、本発明者らは、以前に野生型PCNAについて記載したように、SV40−NLS−PCNAが、分化したPLB985細胞において抗アポトーシス効果を有するかどうかを研究した。予期した通り、核へと侵入する増加した能力を示すSV40−NLS−PCNA突然変異体の過剰発現は、PCNA免疫標識後の直接的な蛍光によって証明されたように、未分化のPLB985細胞において増加したPCNA核局在をもたらした。同様に、損なわれた核から細胞質への再局在が、PLB985−PCNAと比較して増加した核蛍光によって証明されたように、DMFにより分化したPLB985−SV40NLS−PCNAにおいて観察された。核免疫蛍光の定量は、PLB985−PCNAと比較してPLB985−SV40NLS−PCNAにおいて観察された有意な増加を確認した。しかしながら、PCNAの核から細胞質への再局在化におけるこの欠陥にも関わらず、DMF処理後のCD11b発現における有意な差異は、PLB985−SV40NLS−PCNAとPLB985−PCNAとの間に全く観察されなかった。これらのデータは、PCNA核保持は、CD11b発現によって評価したところ顆粒球分化を阻害しなかったことを示唆する(図9A)。本発明者らは次に、この核SV40NLS−PCNA突然変異体が、好中球に分化したPLB985においてその抗アポトーシス活性を依然として媒介し得るかどうかを研究した。直接的にBakに結合してミトコンドリア脱分極をトリガーする真菌毒素であるグリオトキシンを使用してアポトーシスをミトコンドリア経路を介してトリガーした。本発明者らは、野生型PCNAを過剰発現するPLB985細胞は、Dioc6標識(図9B)およびDNAフラグメンテーション(図9C)後に測定したミトコンドリア脱分極によって判定したところ、コントロールプラスミドでトランスフェクションされたPLB985と比較して、グリオトキシンにより誘導されるアポトーシスに対して防御されたことを確認した。予測されたように、核SV40−NLS−PCNA突然変異体を発現するPLB985は抗アポトーシス活性を示すことができず、従って、成熟好中球におけるその抗アポトーシス活性に対するPCNA細胞質細胞内局在の不可欠な役割を実証する。
「好中球様細胞」と考えられるジメチルホルムアミド(DMF)により分化したPLB985細胞を使用して、PCNA抗アポトーシス活性に対するPCNA排出のモデュレーションの影響を研究した。PCNAの核隔離が成熟好中球においてそのPCNA抗アポトーシス活性に影響を及ぼすかどうかを調べるために、PLB985細胞を、SV40−NLS−PCNAと称される核PCNA突然変異体を用いて安定にトランスフェクションし;実際に、以前に記載のように、PCNAとSV40NLSの融合によりその排他的な核局在が得られる。従って、本発明者らは、以前に野生型PCNAについて記載したように、SV40−NLS−PCNAが、分化したPLB985細胞において抗アポトーシス効果を有するかどうかを研究した。予期した通り、核へと侵入する増加した能力を示すSV40−NLS−PCNA突然変異体の過剰発現は、PCNA免疫標識後の直接的な蛍光によって証明されたように、未分化のPLB985細胞において増加したPCNA核局在をもたらした。同様に、損なわれた核から細胞質への再局在が、PLB985−PCNAと比較して増加した核蛍光によって証明されたように、DMFにより分化したPLB985−SV40NLS−PCNAにおいて観察された。核免疫蛍光の定量は、PLB985−PCNAと比較してPLB985−SV40NLS−PCNAにおいて観察された有意な増加を確認した。しかしながら、PCNAの核から細胞質への再局在化におけるこの欠陥にも関わらず、DMF処理後のCD11b発現における有意な差異は、PLB985−SV40NLS−PCNAとPLB985−PCNAとの間に全く観察されなかった。これらのデータは、PCNA核保持は、CD11b発現によって評価したところ顆粒球分化を阻害しなかったことを示唆する(図9A)。本発明者らは次に、この核SV40NLS−PCNA突然変異体が、好中球に分化したPLB985においてその抗アポトーシス活性を依然として媒介し得るかどうかを研究した。直接的にBakに結合してミトコンドリア脱分極をトリガーする真菌毒素であるグリオトキシンを使用してアポトーシスをミトコンドリア経路を介してトリガーした。本発明者らは、野生型PCNAを過剰発現するPLB985細胞は、Dioc6標識(図9B)およびDNAフラグメンテーション(図9C)後に測定したミトコンドリア脱分極によって判定したところ、コントロールプラスミドでトランスフェクションされたPLB985と比較して、グリオトキシンにより誘導されるアポトーシスに対して防御されたことを確認した。予測されたように、核SV40−NLS−PCNA突然変異体を発現するPLB985は抗アポトーシス活性を示すことができず、従って、成熟好中球におけるその抗アポトーシス活性に対するPCNA細胞質細胞内局在の不可欠な役割を実証する。
Claims (15)
- 炎症過程を含む疾病の処置において使用するための、増殖細胞核抗原(PCNA)と、PCNAと結合しやすい少なくとも1つのポリペプチドとの間の相互作用を阻害する化合物。
- 前記化合物が、PCNAのドメイン間接続ループにおけるPCNAとPCNAに結合しやすい少なくとも1つのポリペプチドとの間の相互作用を阻害する、請求項1記載の使用のための化合物。
- 前記化合物がペプチドである、請求項1または2記載の使用のための化合物。
- 前記化合物が、
a)配列番号3または23からなるアミノ酸配列;
b)タグに融合した配列番号3または23からなるアミノ酸配列;
c)配列番号11、配列番号12または配列番号24からなるアミノ酸配列;
d)(a)〜(c)のいずれか1つの配列に相同であり、(a)〜(c)のいずれか1つの前記配列と少なくとも80%の同一性を提示する、配列;および
e)(a)〜(c)のいずれか1つの配列の少なくとも6つ連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列
を含むペプチドである、請求項1〜3のいずれかに記載の使用のための化合物。 - 炎症過程を含む疾病が、好中性細胞によって媒介される、請求項1〜4のいずれか記載の使用のための化合物。
- 炎症過程を含む疾病が、心虚血、細菌性心内膜炎、化膿性心膜炎、結節性多発動脈炎、川崎病、白血球破壊性血管炎、顕微鏡的多発血管炎、細菌性血管腫症、成人呼吸促迫症候群、嚢胞性線維症、気管支肺炎、潰瘍、クローン病、火傷、急性痛風、偽痛風、感染性関節炎、血清反応陰性脊椎関節炎、リウマチ様多発性関節炎、若年性関節炎、骨関節炎および移植片拒絶からなる群より選択される、請求項1〜5のいずれかに記載の使用のための化合物。
- 前記化合物が、好中性細胞のアポトーシスを誘導する、請求項1〜6のいずれか記載の使用のための化合物。
- 好中球減少症の処置における使用のための、PCNAのカルボキシ末端領域またはその少なくとも6つ連続したアミノ酸のフラグメントを含むペプチドであって、前記のPCNAのカルボキシ末端領域は、配列番号1のアミノ酸249〜261からなる、前記ペプチド。
- 前記ペプチドが、
a)配列番号7からなるアミノ酸配列;
b)タグに融合した配列番号7からなるアミノ酸配列;
c)配列番号16または配列番号17からなるアミノ酸配列;
d)(a)〜(c)のいずれか1つの配列に相同であり、そして(a)〜(c)のいずれか1つの前記配列と少なくとも80%の同一性を提示する、配列;および
e)(a)〜(c)のいずれか1つの配列の少なくとも6つ連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列
を含む、請求項8記載のペプチド。 - 前記ペプチドが、好中性細胞のアポトーシスを防ぐ、請求項8または9記載のペプチド。
- a)配列番号3または7からなるアミノ酸配列;
b)タグに融合した配列番号3または7からなるアミノ酸配列;
c)配列番号11、配列番号12、配列番号16または配列番号17からなるアミノ酸配列;
d)(a)〜(c)のいずれか1つの配列に相同であり、そして(a)〜(c)のいずれか1つの前記配列と少なくとも80%の同一性を提示する、配列;および
e)(a)〜(c)のいずれか1つの配列の少なくとも6つ連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチド。 - 請求項11に定義したようなペプチドおよび1つ以上の生理学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
- a)候補化合物を、PCNAおよびPCNAと結合しやすい少なくとも1つのポリペプチドと接触させる工程、
b)候補化合物の存在下および非存在下において、PCNAと結合しやすい前記の少なくとも1つのポリペプチドに結合したPCNAの量を比較する工程;および
c)PCNAに結合しやすい前記の少なくとも1つのポリペプチドに結合したPCNAの量が、前記候補化合物の非存在下よりも前記候補化合物の存在下の方が低いならば、前記候補化合物を選択する工程
を含む、好中球減少症または炎症過程を含む疾病の処置において使用するための化合物の同定のための方法。 - PCNAに結合しやすいタンパク質が、p21、配列番号23のペプチド、配列番号11のペプチド、配列番号12のペプチド、および配列番号16のペプチドの群から選択される、請求項11記載の方法。
- 炎症過程を含む疾病または好中球減少症の処置のための薬物についてスクリーニングするためのターゲットとしてのPCNAのin vitroにおける使用。
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