BRPI0707948A2 - inibição baseado em peptìdeo da interação capcna em cáncer - Google Patents

Abstract

INIBIçãO BASEADA EM PEPTìDEO DA INTERAçãO caPCNA EM CáNCER. Peptideos derivados da isoforma específica de câncer de antígeno nuclear de proliferação celular (caPCNA, também conhecido como csPCNA) ou a partir de proteínas interagindo com nmPCNA interferem com a interação proteína-proteína intracelular, dessa forma causando uma redução no potencial proliferativo do câncer. Esses peptideos servem como composições terapêuticas para reduzir a proliferação de células cancerigenas e também aumento dos métodos quimioterapêuticos existentes.

Description

"INIBIÇÃO BASEADA EM PEPTÍDEO DA INTERAÇÃO caPCNA EM CÂNCER"

INVENTORES: Robert J. Hickey e Linda H. Malkas

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica prioridade ao EUA1 Ser. No. 60/743.313. depositado em 17de Fevereiro de 2006.

CAMPO TÉCNICO

Esta revelação relaciona-se a composições terapêuticas baseadas em peptídeo emétodos para seletivamente objetivar componentes celulares e processos envolvidos naproliferação de câncer.

ANTECEDENTE

Antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) desempenha um papel importanteno processo de replicação de DNA1 reparo, recombinação cromossomal, controle do pontode checagem no ciclo celular e outras atividades proliferativas celulares. Em conjunção comuma proteína adaptadora, fato de replicação C (FRC)1 PCNA forma um grampo móvel que éo ponto de ancoragem para DNA polimerases delta e epsilon. Isoformas diferentes de antí-geno nuclear de proliferação celular (PCNA) que mostra ambos, pontos acídicos e básicos(pl) têm sido demonstrados. Análises de PCNA por eletroforese em gel poliacrilamida bi-dimensional (2D-PAGE) de ambas, células de mama malignas e não malignas (referido co-mo PCNA não maligno ou nmPCNA) e tecidos revelaram a presença de uma forma acídicade PCNA somente em células malignas (referida como PCNA específico de câncer oucsPCNA ou caPCNA). Esta diferença no ponto isoelétrico entre essas duas formas dePCNA, parece resultar de uma alteração na habilidade das células malignas, para pós-traducionalmente modificar o polipeptídeo PCNA e não é devido a uma mudança genéticadentro do gene PCNA.

Trabalho estrutural examinando a estrutura do polipeptídeo PCNA para definir as di-ferenças estruturais entre caPCNA e isoforma de célula não maligna de PCNA revelaramuma região da proteína caPCNA que é unicamente exposta somente na célula de câncer.Um anticorpo foi desenvolvido para uma região da isoforma específica de câncer de PCNAque é altamente seletiva para a isoforma PCNA expressa exclusivamente em células decâncer.

Antígeno nuclear proliferante de célula (PCNA) é uma proteína nuclear de 29 kDa esua expressão nas células durante as fases S e G2 do ciclo celular, faz a proteína um bommarcador de proliferação celular. Tem sido também mostrado partilhar em muitas vias mole-culares responsáveis para a vida e morte da célula. Seu aparecimento periódico na fasenuclear S sugeriu um envolvimento na replicação de DNA. PCNA foi mais tarde identificadocomo um fator acessório da DNA polimerase em células mamíferas e um fator essencialpara replicação de SV40 DNA in vitro. Em adição ao funcionante como uma proteína degrampo móvel de DNA e um fator acessório da DNA polimerase nas células mamíferas,PCNA interage com um número de outras proteínas envolvidas na transcrição, pontos dechecagem do ciclo celular, remodelação de cromatina, recombinação, apoptose, e outrasformas de reparar DNA. Além de ser diverso em ação, parceiros de ligação de muitos PC-NAs são ligadas por suas contribuições para a precisa herança das funções celulares porcada nova geração de células. PCNA pode atuar como uma molécula principal que coorde-na o processamento do cromossomo.

PCNA é também conhecido interagir com outros fatores tipo FEN-1, DNA ligase, eDNA metil transferase. Adicionalmente, PCNA foi também mostrado serem um componenteessencial nos múltiplos caminhos de reparo do DNA. Interações com proteínas do tipo dereconhecimento incompatível, Msh2, e a excisão de nucleotídeo da endonuclease de reparo,XPG, têm implicado PCNA em processos distintos da síntese de DNA. Interações com múl-tiplos parceiros geralmente contam com os mecanismos que permitem o PCNA seletivamen-te interagir em uma forma ordenada e energeticamente favorável.

O uso de peptídeos sintéticos curtos para a geração de anticorpos policlonais emonoclonais têm sido utilizados com considerável sucesso. Peptídeos são conhecidos servircomo quimioatraentes, neurológicos potentes e toxinas respiratórias, e hormônios. Os peptí-deos têm também sido utilizados como alvos de afinidade e padrões para estudos bioquími-cos, e têm provido uma base para entender características e a natureza específica de inte-rações proteína-proteína discreta. Em adição, peptídeos hormônios exercem potentes efei-tos fisiológicos, e em alguns casos o hormônio ativo é ou um peptídeo que está contido den-tro de uma proteína maior ou é processado e liberado de uma proteína precursora antes deexercer ser efeito fisiológico.

Peptídeos em sido utilizados romper interações proteína-proteína, por agir comocompetidores altamente específicos dessas interações. Estudos bioquímicos empregandoreagentes peptídeos avançados, o uso de peptídeos como fármacos terapêuticos capazesde romper as funções celulares que requerem interações proteína-proteína. Então, proces-sos celulares específicos tal como apoptose e progressão do ciclo celular, que são depen-dentes de discretas interações proteína-proteína, podem ser inibidos se essas interaçõesproteína-proteína são seletivamente interrompido. A replicação de DNA genômico sendodependente das interações proteína-proteína é também susceptível a inibição induzida porpeptídeo dessas interações de proteína.

Síntese de DNA in vivo é um processo altamente regulado que depende de uma mi-ríade de reações bioquímicas mediadas por uma série complexa de interações proteína-proteína. Divisão de célula é dependente do processo sintético de DNA, e crescimento decélula cancerígena é substancialmente sensível a qualquer agente que interrompe a regula-ção e/ou atividade da maquinaria de DNA sintético responsável por copiar o DNA genômicoda célula cancerígena. Em adição, foi demonstrado que uma característica de câncer demama está na indução da instabilidade genômica, como células transformadas desenvolvemum fenótipo metastático altamente agressivo. Instabilidade genômica aumenta através deuma série de mudanças na maquinaria do DNA celular sintético que altera a fidelidade coma qual o DNA é sintetizado.

Estudos utilizando os 26 aminoácidos carbóxi-terminal da proteína p21cip, (que éconhecido interagir com a proteína PCNA), demonstraram a habilidade deste peptídeo eminterromper o processo proliferativo celular. Este fragmento peptídico de p21 potencialmenterompe um ou mais processos celulares utilizando PCNA e presumivelmente interferem cominterações proteína-proteína críticas que participam no processo de DNA sintético bem co-mo a regulação de outros pontos de checagem do ciclo controles e a indução de apoptose.

Estudos utilizando este fragmento peptídico de p21 têm demonstrado a habilidadedo peptídeo p21 na ativação de uma via apoptótica não associada à caspase. Similarmente,estudos envolvendo um fragmento peptídico de 39 aminoácidos da proteína p21 parcialmen-te inibiu a replicação de DNA in vivo, e sugere que este fragmento de peptídeo de p21 podeestabilizar a interação da proteína PCNA-p21 levando a diminuição da atividade sintética de

DNA dentro da célula.

Um peptídeo sintético correspondendo a resíduos 65-79 da seqüência de classe IIHLA pode inibir a progressão do ciclo celular em uma forma que é similar àquela induzidapor rapamicina. Este estudo indica que peptídeos outros que aqueles derivados das proteí-nas regulatórias do ciclo celular têm a habilidade de modular a progressão através do ciclocelular.

Em adição, métodos químicos computacionais estão sendo utilizados para modelarregiões específicas da molécula de PCNA que podem interagir com outras proteínas celula-res envolvidas no controle do ponto de checagem do ciclo celular e síntese de DNA. Regi-ões do complexo ciclina-CDK podem servir como padrão para identificar sítios para inter-romper pontos de checagem do ciclo celular controles chaves que são essenciais para aproliferação celular.

Uso de peptídeos sintéticos para inibir a proliferação celular e o processo de seleti-vãmente objetivar a proteína PCNA específica para câncer para mediar a inibição da prolife-ração celular é necessária para tratar câncer. Fármacos peptidomiméticos que interagemcom um sítio antigênico ou sítio alvo em caPCNA para interromper interações proteína-caPCNA específicas que são únicas para a célula de câncer são desejadas. Peptídeos deri-vados de epítopos específicos de caPCNA, aqui revelados, significantemente aumentaramos efeitos citotóxicos dos regimes quimioterapêuticos tradicionais específicos e consequen-temente matam células cancerosas em uma maneira altamente seletiva.

RESUMOPeptídeos derivados de regiões específicas ou domínios de proteínas PCNA não-malignos (nmPCNA) ou proteínas de interagindo com (caPCNA ou csPCNA) específicasinterferem com a interação de proteínas celulares com a proteína PCNA in vivo. Seqüênciasaminoácidas específicas representando fragmento peptídicos de a proteína caPCNA inter-romper a atividade regulatória do PCNA e subseqüentemente inibem o crescimento da célu-la de câncer através da interrupção do funcionamento dos processos celulares que reque-rem PCNA1 incluindo replicação de DNA1 reparo, recombinação cromossomal, e ponto dechecagem do ciclo celular controle.

Um método de seletivamente inibir a interação in vivo de uma isoforma específicade câncer de antígeno nuclear de proliferação celular (caPCNA) com uma proteína intracelu-lar é uma célula maligna, o método inclui os passos de:

(a)prover um agente que seletivamente interrompe a interação do caPCNA com aproteína intracelular;

(b) administrar o agente tal que o agente contata uma população de células cance-rosas in vivo; e

(c) inibir a interação de caPCNA com a proteína intracelular.

O agente pode ser ou um peptídeo, peptidomimético, molécula pequena ou umacombinação dos mesmos. Em uma modalidade, o agente é um peptídeo que inclui uma se-qüência aminoácida LGIPEQEY. Em outra modalidade, o agente é um peptidomimético queinterage com a molécula de caPCNA em um sítio alvo compreendendo uma seqüência ami-noácida LGIPEQEY.

Em uma modalidade, o agente é um peptídeo que ainda inclui uma seqüência tag("marcador"). A seqüência tag podem incluir seqüência aminoácida RYIRS. Qualquer se-qüência de translocação é adequada para uso aqui.

Em uma modalidade, o agente é administrado intravenosamente. Em uma modali-dade, o agente é formulado em um sistema de distribuição terapêutico selecionado de umgrupo que inclui lipossomo, micropartícula, e nanopartícula.

Em uma modalidade, o agente interrompe a interação de caPCNA com uma proteí-na intracelular que está envolvida em um processo celular selecionado de um grupo queinclui síntese de DNA, reparo de DNA, recombinação, transcrição, ponto de checagem dociclo celular controle, e apoptose.

Em uma modalidade, o agente é uma molécula de peptídeo cuja seqüência amino-ácida é derivada de um sítio antigênico em caPCNA. Em outra modalidade, o agente é umamolécula peptídomimética cuja estrutura molecular corresponde a um sítio antigênico nocaPCNA. Em outra modalidade, o agente é uma molécula peptídica cuja seqüência aminoá-cida é derivada de um sítio de ligação da proteína em caPCNA.

Em uma modalidade, o agente é uma molécula peptidomimética cuja estrutura mo-Iecular corresponde a uma proteína, sítio de ligação em caPCNA.

Em uma modalidade, o agente é uma molécula pequena que compete com um sítiode ligação em caPCNA, em que o sítio de ligação é capaz de interagir com a proteína intra-celular.

Um método de seletivamente inibir a interação in vivo de uma isoforma específicade câncer do antígeno nuclear de proliferação celular (caPCNA) com uma proteína intracelu-lar em uma célula maligna, o método inclui os passos de:

(a)prover um agente que seletivamente interrompe a interação do caPCNA com aproteína intracelular, em que o agente é um peptídeo ou um peptidomimético, cuja seqüên-cia aminoácida ou estrutura molecular é derivada de um sítio de ligação caPCNA na proteí-na intracelular que interage com o caPCNA;

(b) administrar o agente tal que o agente contata uma população de células cance-rosas in vivo; e

(c) inibir a interação de caPCNA com a proteína intracelular.

Um método de redução da proliferação celular in vivo das células malignas que ex-pressam uma isoforma específica de câncer do antígeno nuclear de proliferação celular(caPCNA), o método inclui os passos de:

(a) prover um agente que interrompe seletivamente a interação do caPCNA comuma proteína intracelular;

(b) administrar o agente tal que o agente contata uma população de células cance-rosas in vivo; e

(c) reduzir a proliferação celular de células malignas.

Um método de aumentar a terapia de câncer para cânceres que expressam umaisoforma específica de câncer de antígeno nuclear de proliferação celular (caPCNA), o mé-todo inclui os passos de:

(a)prover um agente que seletivamente interrompe a interação do caPCNA comuma proteína intracelular;

(b) prover um agente quimioterápico para cânceres;

(c) administrar o agente e o agente quimioterápico tal que pelo menos uma porçãodos agentes contata uma população de células cancerosas in vivo; e

(d) aumento da terapia de câncer, em que um número aumentado de células decâncer são mortas comparadas ao número de células de câncer mortas por quimioterapiasozinha.

Um método de identificar um agente candidato que seletivamente inibe interação invivo de uma isoforma específica de câncer do antígeno nuclear de proliferação celular(caPCNA) com uma proteína intracelular em uma célula maligna, o método inclui os passos de:(a) prover um agente;

(b) prover um peptídeo derivado de caPCNA;

(c) identificar um agente que se liga ao peptídeo derivado de caPCNA; e

(d) determinar o agente como o agente candidato, se o agente candidato inibe a in-teração do caPCNA com a proteína intracelular.

Metodologias de desenho de fármaco racional pode também ser implementada pa-ra obter inibidores específicos de interação celular caPCNA baseada na informação estrutu-ral ou seqüencial de um peptídeo derivado de caPCNA, por exemplo, um peptídeo que temuma seqüência aminoácida LGIPEQEY. Em uma modalidade, o agente é um fragmentopeptídico derivado de uma proteína intracelular. Em uma modalidade, a proteína intracelularé conhecida por interagir com caPCNA.

Uma composição terapêutica para reduzir proliferação celular in vivo de células ma-lignas que expressam uma isoforma específica de câncer de antígeno nuclear de prolifera-ção celular (caPCNA), a composição inclui uma molécula peptídica que tem uma seqüênciaaminoácida LGIPEQEY ou uma estrutura funcionalmente equivalente do mesmo ou um pep-tidomimético do mesmo, em que a molécula peptídica é derivada da seqüência aminoácidade caPCNA. Em uma modalidade, a molécula peptídica ainda inclui um domínio peptídicoque facilita a captação peptídica através das células.

Uma composição Iipossomo para reduzir proliferação celular in vivo de células ma-lignas que expressam uma isoforma específica de câncer de antígeno nuclear de prolifera-ção celular (caPCNA), a composição inclui uma molécula peptídica compreendendo umaseqüência aminoácida LGIPEQEY ou uma estrutura funcionalmente equivalente do mesmoou um peptidomimético do mesmo, em que a molécula de peptídeo é derivada da seqüênciaaminoácida de caPCNA.

Uma célula recombinante que expressa um peptídeo derivado de caPCNA, em queo peptídeo seletivamente interrompe a interação proteína-proteína em células de câncer. Emuma modalidade, o peptídeo derivado de caPCNA inclui uma seqüência aminoácida LGI-PEQEY.

Um peptídeo sintético que inclui uma seqüência aminoácida LGIPEQEY e uma se-qüência de translocação peptídica.

Uma composição terapêutica para redução da proliferação celular de células malig-nas que expressam uma isoforma específica de câncer do antígeno nuclear de proliferaçãocelular (caPCNA) incluindo a molécula peptídica tendo uma seqüência aminoácidaLGIPEQEY. A molécula peptídica é permeável a célula, inclui uma seqüência de transloca-ção peptídica. O peptídeo é resistente a protease.

Agentes quimioterápicos adequados que são utilizados ao junto com os inibidoresde peptídeos incluindo doxorubicina, paclitaxel, docetaxel, cisplatina, datrexato, gemcitabina,ou vinorelbina ou uma combinação dos mesmos.

Outros inibidores de peptídeos derivados de PCNA adequados incluemVEQLGIPEQEY, LGIPEQEYSCWK, LGIPEQEYSCWKMPSG, EQLGIPEQEY, QLGIPE-QEY1 LGIPEQEYSCWKMPS, LGIPEQEYSCWKMP, LGIPEQEYSCWKM, LGIPE-QEYSCW1 LGIPEQEYSCV, LGIPEQEYSC, LGIPEQEYS e combinações de aminoácidosde terminação NH2 e COOH adicionais que ladeiam LGIPEQBY.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

FIG. 1 mostra análise de citometria de fluxo de experimentos de transfecção da se-qüência de peptídeo alvo caPCNA com células de câncer de mama.

FIG. 2 mostra uma análise 2D-PAGE de frações da coluna de afinidade XPG-GSTpara PCNA.

FIG. 3 mostra a proteína de fusão SPG-GST especificamente imunoprecipitadoscaPCNA. Alíquotas de trinta Mg de extrato de célula MCF7 foram tratadas como descrito notexto. O anticorpo PC10 utilizado para visualizar PCNA na análise de Western blot foi utili-zada em uma diluição de 1:1000.

FIG. 4 mostra resultado de um método de ELISA para a detecção de caPCNA.

FIG. 5 mostra os resultados de um ELISA em que o anticorpo caPCNA (caPCNA) éligado à placa e sendo utilizado para capturar o caPCNA isolado. Os poços são lavados eentão incubados com anticorpo de cabra anti-PCNA (C20) que reconhece o C-terminal de20 aminoácidos de PCNA. O anticorpo C20 ligado é visualizado com uma fosfatase alcalinaconjugada ao anticorpo IgG anti-cabra, e complexo de anticorpo ligado é visualizado comfosfato de p-nitrofenol, e quantificado por espectrofotometria. Os experimentos de competi-ção mostrados neste estudo envolve a incubação simultânea do ca(cs)PCNA com quanti-dades aumentadas do fragmento peptídico antigênico de caPCNA (referido como B1 ou opeptídeo PCNA aa126-133) neste ensaio. Redução na ligação do caPCNA na célula inteiraem presença de concentrações aumentadas do peptídeo B1 são mostradas, e demonstra-ram que o ensaio de ELISA é específico para reconhecimento do epítopo caPCNA definidopor essa seqüência peptídica.

FIG. 6 mostra a especificidade da seqüência peptídica como o epítopo reconhecidopelo anticorpo caPCNA.

FIG. 7 ilustra a interação do domínio de interação XPG-PCNA. O ensaio de ELISAdescrito aqui foi utilizado para avaliar se o peptídeo B1 (PCNA aa126-133) pode interagirdiretamente com XPG no domínio de interação PCNA-XPG definido.

FIG. 8 mostra que csPCNA especificamente se liga ao extrato nuclear celularXPG.MCF7 foi preparado, dialisado em tampão de baixo sal e carregado em uma colunaXPG-GST agarose pré-equilibrada em condições de tampão de baixo sal. A coluna foi lava-da com 6 volumes de coluna de pré-equilibração de tampão. O fluxo de coluna através &frações de lavagem foram coletadas como 1 fração. A coluna foi eluída utilizado condiçõesde tampão & sal. (A) 2D-PAGE Western blot utilizado o anticorpo PC10 das frações de colu-na de agarose XPS-GST. O anticorpo PC10 foi utilizado em uma diluição de 1:1000 na aná-lise de Western. (B) análise de 1D-PAGE Western utilizando anticorpos PC10 e csPCNAabde frações de coluna de agarose XPG-GST. Anticorpos PC10 e csPCNAab foram utilizadosem uma diluição de 1:1000 na análise de Western. M denota o marcador.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Métodos e composições revelados aqui se relacionam aos peptídeos (por exemplo,p21, XPG1 Cdk2) derivados de proteína interagindo com caPCNA, peptidomiméticos, análo-gos funcionais das mesmas e pequenas moléculas que seletivamente interrompem as fun-ções celulares vitais nas células cancerosas. Existem pelo menos dois modos de açõesdesses peptídeos. Por exemplo, peptídeos derivados de caPCNA ou competem com caPC-NA para ligar às proteínas interagindo com caPCNA ou alternativamente liga a um sítio naproteína interagindo com caPCNA que interrompe a interação. Peptídeos derivados de pro-teína interagindo com caPCNA competem por seu sítio de ligação correspondente nocaPCNA e assim previne as proteínas de interação caPCNA de ligar ao caPCNA.

Peptídeos específicos derivados da seqüência de proteína caPCNA têm a habilida-de de bloquear a ligação de várias proteínas celulares que participam em ou na replicaçãode DNA, reparo, controle do ciclo celular, apoptose, transcrição, ou recombinação cromos-somai nas células de câncer. A ligação do caPCNA à essas proteínas celulares é interrom-pida quando o peptídeo é deixado competir com essas proteínas para seu sítio de ligaçãode ocorrência natural no PCNA. Por interromper a interação de ocorrência natural entrePCNA e as proteínas que ligam a ou interage com PCNA, funções celulares normais querecrutam PCNA são interrompidas. Esta interrupção da maquinaria celular vital fazem ospeptídeos derivados de caPCNA citotóxicos por eles mesmos ou em combinação com ou-tras moléculas, tal como, por exemplo, fármacos quimioterapêuticos de câncer. Esses peptí-deos, ou sozinhos ou em combinação com outros agentes de terapia de câncer são quimio-terapêuticos de câncer úteis ou aumentadores do efeito farmacodinâmico dos quimiotera-pêuticos anti-câncer específicos. Essas moléculas peptídicas derivadas de PCNA são tam-bém úteis como inibidores de processos celulares específicos permitindo novas percepçõesmecanísticas e métodos terapêuticos para regular funções celulares específicas em ambas,células normais e de câncer que envolvem PCNA.

Em geral, inibidores de peptídeos são baseados sob o conceito que interações pro-teína-proteína interrompidas levarão as interrupções nos processos celulares mediados poressas interações de proteínas. Entretanto, esses inibidores de peptídeos não levam emconsideração a necessidade de identificar uma seqüência aminoácida "específica para cân-cer" que é somente disponível na célula cancerosa, mas não na célula não cancerosa devi-do a seqüência aminoácida sendo "oculta" na célula não cancerosa devido a uma variedadede meios tais como modificação pós-traducional, mudança conformacional protéica, ligaçãoa uma proteína que é super-expressa na célula cancerosa, ou a perda do parceiro de liga-ção em uma célula cancerosa. Dessa forma a natureza específica do câncer das seqüênciasalvo identificadas aqui é específica nas interações proteína-proteína interrompidas nas célu-las de câncer.

Fragmentos de peptídeos derivados a partir de proteína de Antígeno Nuclear deProliferação Celular (PCNA) são identificados aqui que têm a habilidade de agir, em conjun-ção com agentes de danos de DNA (por exemplo, doxorubicina), para aumentar os efeitosterapêuticos de tais agentes para tratar uma variedade de células cancerosas. Esses peptí-deos são derivados da seqüência aminoácida dentro de PCNA, por exemplo, compreenden-do aminoácidos 126-133. Esta seqüência parece ser unicamente exposta em células decâncer, mas não células não câncer. Por prevenção das proteínas de ligação de PCNA, in-cluindo XPG, a partir da ligação diretamente de caPCNA em células de câncer os efeitos defármacos quimioterápicos incluindo agentes de danos ao DNA são aumentados. A citotoxici-dade intrínseca da seqüência peptídica foi determinada por incubação de células adequadasou com o peptídeo como um agente único ou em combinação com fármacos citotóxicos talcomo doxorubicina. Culturas de células de leucemia U937 crescendo espontaneamente emmeio de cultura tossular foram utilizadas. Uma proteína mediada por Iipossoma transferetécnica foi utilizada em que o peptídeo caPCNA (126-133) e doxorubicina foram encapsula-das em Iipossomas e adicionados às culturas celulares a 10 μΜ. Utilizando a linhagem celu-lar de Ieucemina U937, os resultados indicaram que o peptídeo tem uma citotoxicidade in-trínseca, enquanto a incubação das células U937 com este peptídeo e uma variação deconcentrações de doxorubicina aumentaram a citotoxicidade da doxorubicina por aproxima-damente 3 vezes. Esta abordagem produziu mais de 50% de morte nas células cultivadasdentro de 24 horas que foi peptídeo/fármaco específico, e não devido a citotoxicidade medi-ada por lipossomo.

Como um controle positivo, essas células de leucemia também incubadas por vá-rias horas (ou 4 ou 24 horas) com um peptídeo derivado a partir da proteína p21 waf, e co-mo um controle negativo, um peptídeo derivado da proteína miosina de levedura. Os resul-tados indicaram que o peptídeo p21 foi muito citotóxico (>60% de morte) mesmo em ausên-cia de doxorubicina, enquanto o peptídeo derivado de PCNA (aminoácidos 126-133) matouaproximadamente 20% das células de leucemia. Morte celular vs. dano celular foi avaliadopor citometria de fluxo utilizando corante iodeto de propídeo e anexina V.

Esses estudos indicaram que o peptídeo correspondendo aos aminoácidos 126-133dentro da seqüência PCNA, tem uma atividade quimioterapêutica anti-câncer. Em adição, osdados indicaram que seqüências peptídeos adicionais dentro ou da proteína PCNA, ouqualquer de seus parceiros de ligação, pode similarmente interferir com os processos celula-res específicos que regulam a proliferação celular e influencia a sobrevivência celular. Pep-tídeos das regiões de contato entre PCNA e proteínas com as quais o PCNA interage sãocapazes de interromper processos celulares críticos. Por exemplo, peptídeos adicionais apartir dos sítios de interação de 3 outras proteínas conhecidas para ligar ao PCNA (isto é,Fen 1, p21, HDAC1), pode ser designado ter um papel inibitório nos processos críticos celu-lares tal como replicação de DNA e controle do ponto de checagem do ciclo celular. Essespeptídeos têm um efeito específico no câncer que diferencialmente inibe a proliferação decélula cancerosa, enquanto tem pouco efeito na divisão de célula normal. Esta diferença noefeito depende, pelo menos em parte, nas diferenças dentro do sítio de interação entrecaPCNA e seus parceiros Iigantes se tornando estruturalmente alterado - uma mudançaconformacional induzida por diferenças nas modificações pós-traducionais entre células ma-lignas e não malignas). Como uma estratégia terapêutica, alterações na forma física dospeptídeos, por exemplo, mudança na ocorrência natural da forma L-aminoácida para umaforma alternada, (por exemplo, mudando para a D-aminoácida, ou alterando a ligação peptí-dica entre aminoácidos individuais de forma que reduza degradação não específica por pro-teólise), é um método útil para prolongar a meia vida do peptídeo, quando esses peptídeosmodificados são utilizados terapeuticamente.

Peptídeos derivados caPCNA e peptidomiméticos representam uma nova terceirageração dos agentes terapêuticos anti-câncer com isso esses peptídeos seletivamente atu-am como competidores dos componentes que utilizam PCNA na célula cancerosa. Os alvosmoleculares representados por seqüências de peptídeos aminoácidas são expressas pre-dominantemente nas células cancerosas. Dessa forma, os peptídeos revelados aqui repre-sentam um avanço significante sob a corrente segunda geração terapêutica em que a se-gunda geração terapêutica corrente objetiva uma via específica que pode ser negativamenteou positivamente regulada ou expressa na célula cancerosa. No caso dos agentes da se-gunda geração, essas vias celulares são também ativas nas células não cancerosas e mo-dulação de passos específicos dentro dessas vias por esses fármacos da segunda geraçãoou peptídeos ou agentes não podem significantemente discriminar entre células cancerosase células não cancerosas.

As seqüências peptídicas reveladas aqui objetivam uma região da proteína caPC-NA que é provavelmente para ser unicamente não aberta em células cancerosas, e essespeptídeos consequentemente reagem com um anticorpo caPCNA seletivo. Então, os peptí-deos revelados aqui são designados para seletivamente alvos de células malignas por virtu-de de sua habilidade em competir com caPCNA para regular a atividade de proteínas espe-cíficas interagindo com as seqüências aminoácidas dentro do PCNA que estão envolvidasem pelo menos um dos seguintes processos celulares: replicação de DNA, reparo, recombi-nação, transcrição, controle do ponto de checagem do ciclo celular, e apoptose.

Os peptídeos revelados aqui são sintetizados utilizando procedimentos de síntesede peptídeo padrão e equipamentos ou podem ser obtidos comercialmente (por exemplo,United Biochemical Research Co., Seattle, WA). Um peptídeo derivados de caPCNA queinclui aminoácidos 126-133 da molécula PCNA humana (LGIPEQEY) seguida por uma se-qüência do receptor de insulina (RYIRS) para facilitar a captação do peptídeo em célulasseletivamente inibe células cancerosas in vitro. Captação deste peptídeo foi iniciada por in-cubação deste peptídeo com as células cancerosas em presença de dimetil sulfóxido(DMSO) em ou salina tamponada com fosfato (PBS) ou meio de cultura contendo 0,2-2% deDMSO, sem soro por cerca de 4-24 horas. Captação deste peptídeo foi também eficiente-mente mediada por encapsulamento do peptídeo em uma formulação Iipossomal e subse-qüente incubação com as células cancerosas a 37°C por cerca de 4-24 horas. Este peptídeotambém aumenta os efeitos citotóxicos dos agentes quimioterápicos tal como doxorubicina.

O termo "agente" como aqui utilizado inclui ácidos nucléicos, proteínas, fragmentosde proteínas, peptídeos, peptídeos sintéticos, peptidomiméticos, análogos dos mesmos,pequenas moléculas, inibidores, e qualquer molécula química, orgânica ou bioorgânica ca-paz de afetar interação proteína-proteína ou um processo celular.

O termo "peptídeos derivados de caPCNA" e "peptídeos derivados de PCNA" signi-fica peptídeos, seqüências de peptídeo modificada com substituições aminoácidas ou aná-logos aminoácidos ou deleções aminoácidas comparadas a uma região correspondente emPCNA, e peptidomiméticos que correspondem a uma região particular em PCNA. Os peptí-deos derivados de PCNA podem variar de cerca de 5-50 aminoácidos em comprimento decerca de 5-20 aminoácidos em comprimento ou cerca de 5-10 aminoácidos em comprimen-to. Os peptídeos derivados de PCNA podem também incluir tags de purificação tal como his-tag, epítopos FLAG, tag RYIRS, e seqüências que promovem a translocação através demembranas celulares. Os peptídeos derivados de PCNA podem também ser modificadospara afetar sua lipofilicidade para aumentar a distribuição do peptídeo em células cancero-sas. Os peptídeos podem ser sinstetizados ("peptídeos sintéticos") ou podem também serproduzidos através de técnicas recombinantes ("peptídeo recombinante"). Esses peptídeospodem também ser construídos para aumentar sua estabilidade in vivo sem significantemen-te aumentar sua eficácia em inibir as interações caPCNA-proteína. Mutações incluindo in-serções, deleções, substituições, modificações aminoácidas que substancialmente não afe-tam a atividade inibitória dos peptídeos revelados aqui são também inclusos. Peptídeos queconsistem essencialmente da seqüência 126-133 LGIPEQEY podem incluir outras seqüên-cias específicas ou não específicas.

Um "derivado peptídeo" significa uma molécula tendo uma seqüência aminoácidade uma região de PCNA ou de um homólogo PCNA, mas adicionalmente tendo pelo menosuma modificação química de um ou mais de seus grupos laterais aminoácidos, átomos a-carbono, grupo aminoterminal, ou grupo ácido carboxílico terminal. Uma modificação quími-ca incluir adição de frações químicas, criando novas ligações, e removendo frações quími-cas. Modificações nos grupos laterais aminoácidos incluem acilação de lisina, grupos a-amino, N-alquilação de arginina, histidina, ou lisina, alquilação de grupos ácidos carboxílicosglutâmicos ou aspárticos, e deamidação de glutamina ou asparagina. Modificações do ami-no terminal incluem o des-amino, N-alquil inferior, N-di-alquil inferior, e modificações N-acil.Modificações do grupo carbóxi terminal inclui as modificações amida, alquil amida inferior,dialquil amida, e alquil éster inferior. Um alquil inferior é um alquil C1-C4. Além disso, um oumais grupos laterais, ou grupos terminais, podem ser protegidos por grupos protetores co-nhecidos por um versado ordinariamente na técnica protéica. O carbono α de um aminoáci-do pode ser mono- ou di-metilado.

Os peptídeos derivados de PCNA podem também serem fusionados ou de outraforma ligados por um receptor de superfície celular que está presente em células cancero-sas. Por exemplo, o receptor de transferrina humana (hTfR), um marcador para proliferaçãocelular é utilizado como um alvo para terapêuticos e é expresso pelo menos 100 vezes maisem oral, fígado, pancreáticos, próstata, e outros cânceres (Lee et al, (2001) "Receptor medi-ated uptake of peptides that bind the human transferrin receptor" Eur. J. Biochem., 268:2004-2012). Peptídeos, HAIYPRH e THRPPMWSPVWP se liga especificamente a hTfR eesses peptídeos foram capazes de direcionar macromoléculas associadas ao hTfR (Lee,acima). Esses peptídeos se ligam aos sítios que não se sobrepõem com o Iigante nativo, Tf,e são úteis in vivo para alvos macromoleculares para a via endocítica nas células hTfR posi-tivas (Lee, acima). Tais peptídeos podem também ser utilizados para direcionar peptídeosderivados de PCNA para aumentar a distribuição do peptídeo e também para adicionalmen-te aumentar a distribuição específica.

Exemplos de peptídeos permeáveis a célula adequados ou domínios peptídicos pa-ra ligar ou fundir peptídeos derivados de caPCNA incluem, por exemplo, peptídeos polibási-cos pequenos derivados de domínios de transdução de certas proteínas, tal como a terceirahélice de Antennapedia (Antp) homeodomínio, uma seqüência RYIRS tag, Penetratin(RQIKIWFQNRRMKWKK), Tat (GRKKRRQRRRPPQ), Transportan (GWTLNSAGYLLG-KINKALAALAKKIL), VP22 (DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD), peptídeosanfipáticos (secundário e primário), MAP (KLALKLALKALKAALKLA), KALA(WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA), ppTG20 (GLFRALLRLLRSLWRLLLRA), Tri-mer (VRLPPP), P1 (MGLGHLLVLAAALQGAWSQPKKKRKV), MPG(GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV), Pep-1 (KETWWETWWTEWSQPKKKRKV),hCT (LGTYTQSFNKFHTFPQTAIGVGAP), e outros.

Quimioterapia específica para cânceres inclui paclitaxel, docetaxel, cisplatina, meto-trexato, ciclofosfamida, 5-flúor uridina, Leucovorina, Irinotecan, Paclitaxel, Carboplatina, do-xorubicina, fluoruracil carboplatina, edatrexato, gemcitabina, ou vinorelbina ou uma combi-nação dos mesmos.

Os peptídeos revelados aqui são também adequados para pacientes com câncersubmetidos a radioterapia e qualquer outras formas de terapia de câncer. Os inibidores depeptídeos revelados aqui são adequados aumentados agentes que podem ser administra-dos, ou antes, de, durante, e após administração de uma terapia de câncer particular, porexemplo, quimioterapia ou radioterapia.

É para ser entendido que cânceres adequados para tratamento utilizando os peptí-deos revelados aqui incluem, mas não são limitados a, malignidades tais como várias for-mas de glioblastoma, glioma, astrocitoma, meningioma, neuroblastoma, retinoblastoma, me-lanoma, carcinoma de cólon, carcinoma de pulmão, adenocarcinoma, carcinoma cervical,carcinoma ovariano, carcinoma de bexiga, linfoblastoma, leucemia, osterosarcoma, carci-noma de mama, hepatoma, nefroma, carcinoma adrenal, ou carcinoma prostático, carcino-ma esofágico. Se uma célula maligna expressa a isoforma csPCNA, as composições reve-ladas aqui são capazes de interromper a interação da isoforma caPCNA com uma ou maisproteínas.

O termo "peptidomimético" ou "peptídeo mimético" refere-se a um composto quími-co tendo uma cadeia do tipo proteína pequeno (peptídeo) que inclui elementos não peptídi-cos tal como aminoácidos não naturais. Peptidomiméticos são designados e sintetizadoscom o propósito de ligação a proteínas alvos a fim de induzir ou efetuar uma mudança parti-cular. Geralmente, umas funções peptidomiméticas pode mimetizar ou antagonizar intera-ções chaves da estrutura peptídica original que foi designada para mimetizar ou antagoni-zar. Um peptidomimético normalmente não tem características peptídicas clássicas tal comoligações peptídicas enzimaticamente cliváveis. Para uma revisão geral das várias técnicasdisponíveis para desenho e síntese de peptídeos miméticos, ver al-Obeidi et al (1998), "Pep-tide and peptidomimetic libraries. Molecular diversity and drug design" Mol. Biotechnol.;9(3):205-23; e Houben-Weyl: Synthesis of Peptides and Peptidomemetics, Thieme MedicaiPublishers, 4a edição (2003).

Em outra modalidade, peptídeos capazes de interromper interação ca(cs)PCNA in-clui peptídeos de seqüências aminoácidas que incluem cerca de +3 aminoácidos contíguosou não contíguos adicionais na terminação NH2 de LGIPEQEY e cerca de +9 aminoácidoscontíguos ou não contíguos no terminal COOH de LGIPEQEY. Por exemplo, alguns dessespeptídeos incluem seqüências aminoácidas de VEQLGIPEQEY (+3-terminação NH2), LGI-PEQEYSCWK (+5-terminação COOH), LGIPEQEYSCWKMPSG (+9-terminação COOH),EQLGIPEQEY (+2-terminação NH2), QLGIPEQEY (+1-terminação NH2), LGIPE-QEYSCWKMPS (+8- terminação COOH), LGIPEQEYSCWKMP (+7-terminação COOH),LGIPEQEYSCWKM (+6-terminação COOH), LGIPEQEYSCW (+4-terminação COOH),LGIPEQEYSCV (+3-terminação COOH), LGIPEQEYSC (+2-terminação COOH),LGIPEQEYS (+1-terminação COOH) e combinações dos aminoácidos das terminações NH2e COOH adicionais que ladeiam LGIPEQEY. Mutações aminoácidas incluindo substituiçõesque não afetam a especificidade dos peptídeos em gerar anticorpos csPCNA específicosestão dentro do objetivo desta revelação. Um ou mais desses resíduos aminoácidos nospeptídeos podem ser substituídos com um análogo aminoácido ou um aminoácido não natu-ral. Em adição, peptídeos miméticos desenvolvidos baseados nas seqüências dos peptídeosrevelados aqui, podem também ser utilizados para gerar anticorpos para a isoforma csPC-NA.

Dose dos peptídeos derivados de PCNA e outros peptídeos derivados da proteínade interação com PCNA dependem da eficácia dos peptídeos, estabilidade dos peptídeos invivo, modo de administração, natureza do câncer sendo tratado, peso corporal, idade dopaciente e outros fatores que são comumente considerados por um versado na técnica. Porexemplo, dosagem de um fármaco peptídeo derivado de PCNA pode variar de cerca de0,1-10,0 microgramas (mcg)/kg de peso corporal ou de cerca de 0,2-1,0 mcg/kg de pesocorporal ou de cerca de 0,5-5,0 mcg/kg de peso corporal ou de cerca de 10,0-50,0 mcg/kgde peso corporal. Dependendo dos efeitos tóxicos e capacidade de matar o tumor, a dosa-gem por também variar de cerca de 1,0-10,0 mg/kg do peso corporal e de cerca de 0,1-1,0mg/kg de peso corporal.

Administração das composições reveladas aqui pode ser através de qualquer viaconhecida para ser efetiva pelo médico versado na técnica. Administrações periféricas, pa-renterais são adequadas. Administração parenteral é comumente entendida na literaturamédica como a injeção de uma forma de dosagem no corpo por uma seringa estéril. Viasparenterais periféricas incluem vias de administração intravenosa, intramuscular, subcutâ-nea e intraperitoneal. Vias de administração intravenosa, intramuscular e subcutânea dascomposições reveladas aqui são adequadas. Para administração parenteral, os peptídeosrevelados aqui podem ser combinados com salina tamponada com fosfato (PBS) ou qual-quer tampão de classificação farmacêutica livre de pirogênio adequada que encontra padrãoFDA para administração a paciente humano. Como aqui utilizado, "veículo farmaceutica-mente aceitável" inclui qualquer e todos os solvente, ou outro veículo líquido, ferramentas dedispersão ou suspensão, agentes de superfície ativos, agentes isotônicos, agentes espes-santes ou emulsificantes, conservantes e semelhantes, como adaptado para a forma de do-sagem particular desejada. Remington's Pharmaceutical Sciences, 20a Edição, A.R. Genna-ro (Williams e Wilkins, Baltimore, MD, 2000) revela vários veículos utilizados na formulaçãode composições farmacêuticas e técnicas conhecidas para a preparação das mesmas. So-luções ou suspensões das composições descritas aqui podem também incluir um diluenteestéril, tal como água para injeção, solução salina, óleos fixados, polietileno glicóis, glicerina,propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes quelantes, tal como EDTA; tampões,tais como acetatos, citratos ou fosfatos; e agentes para o ajuste de tonicídade, tais comocloreto de sódio ou dextrose. Uma preparação parenteral das composições pode ser confi-nada em ampolas, disponível em seringas ou frascos de dose múltipla feitas de vidro ouplástico, de acordo com a prática padrão no campo. As composições reveladas aqui podemser estocadas como um pó estéril Iiofilizado em frascos contendo para reconstituição e oproduto não reconstituído pode ser estocado a -20°C.

Peptídeos e outras composições reveladas aqui podem ser administrados atravésde quaisquer meios adequados. Por exemplo, as composições peptídicas podem ser diluí-das em salina ou qualquer tampão adequado e administrado diretamente intravenosamente.

Por exemplo, as composições peptídicas podem ser encapsuladas em Iipossomos e admi-nistradas intravenosamente por qualquer método adequado. Por exemplo, as composiçõespeptídicas podem ser distribuídas por um sistema de distribuição de fármaco de liberaçãoestendida conhecido por um versado na técnica. Outros modos de direcionar tumores sãotambém adequados. Por exemplo, publicação do pedido de patente dos EUAUS20050008572 (Prokop et aí) revela métodos e composições relacionados a direciona-mento e terapia de tumor nanoparticular, a revelação do qual é aqui incorporada por refe-rência. Publicação do pedido de patente dos EUA US2003021031 (Huang et aI) revela com-plexos de distribuição de fármaco compreendendo líquido estável para sua produção, a re-velação da qual é aqui incorporada por referência.

EXEMPLO 1

Efeitos citotóxicos de um peptídeo derivado de caPCNA em células de câncer demama

Exponencialmente crescendo as células de câncer de mama foram crescidas emmeio de cultura para 50% de confluências (FIG. 1). O meio foi então trocado e Iipossomasque foram preparados a partir do reagente de transfecção (PJR) foram incubados com ascélulas em meio fresco por um adicional de 24 horas antes de fazer a análise de citometriade fluxo nas células tratadas.

Lipossomos continham ou a região carboxil da proteína p21wafl, e/ou o peptídeo dosítio antigênico caPCNA (LGIPEQEY). Após 24 horas, as células foram coradas com iodetode propídio e anticorpo anexina V fluorescentemente marcado. Células crescendo sauda-velmente foram não permeáveis ao anticorpo como mostrado na esquerda inferior do painelda FIG. 1, enquanto células saudáveis permeabilizadas susceptíveis para o reagente detransfecção, mas ainda crescendo, foram corados com iodeto de propídeo. Células corandocom o anticorpo anexina V indicaram algum nível de dano associado com a indução de célu-las apoptóticas (quadrante direito inferior, FIG. 1), e/ou células que morreram a partir de ouapoptose ou necrose (quadrante direito superior, FIG.1 ).

Esses resultados demonstram que células controles tratadas com salina produziramum perfil de fluxo associado com o 1o painel esquerdo superior (FIG. 1). Células tratadascom somente o reagente de transfecção afetaram levemente a condição das células e Ieva-ram a um leve aumento no número de células apoptóticas e necróticas. Células tratadascom o fragmento de peptídeo citotóxico p21 exibiram induziu morte celular (painel direitosuperior, FIG. 1), e células tratadas com o peptídeo caPCNA mostraram uma forte respostacitotóxica e a maioria das células em crescimento foram danificadas e foram no processo dese submeter ou a apoptose ou morte celular. Combinando o peptídeo caPCNA com 100 μΜde doxorubicina resultou em quase 90% de morte celular dentro do período de tempo medi-do. Em adição, aproximadamente 5-7% das células remanescente pareceram estar sofrendoapoptose e foram condenadas a morte. Células tratadas com baixas doses de doxorubicinalevam a um nível significante de morte celular, e combinando o peptídeo caPCNA com estadose de doxorubicina leva a um efeito sinergístico que resultou em morte de quase todas ascélulas que foram analisadas. Em concentrações subletais deste fármaco, exposição dascélulas a um grupo de baixas concentrações do peptídeo signifícantemente aumenta a Ieta-Iidade da doxorubicina.

EXEMPLO 2

Proteína de fusão XPG-GST preferencialmente se liga a caPCNA comparado anmPCNA

Tentativas anteriores de isolar seletivamente e purificar caPCNA foram malsucedi-do. Este problema foi superado por uso de um sistema de proteína de fusão SPG-GST imo-bilizada como uma matriz de afinidade para purificação caPCNA (FIG. 2). Comumente técni-cas utilizadas para purificar PCNA que emprega passos de cromatografia na fosfòcelulose,fenil Sefarose, e matrizes de Q-Sefarose resultado na presença de duas isoformas junto nafração de proteína. Para separar as duas isoformas PCNA, fragmento de proteína de fusãoSPG-GST imobilizado foi incorporado em uma coluna de afinidade contido no esquema puri-ficação (FIG. 3). Por causa das afinidades de ligação diferencial da porção XPG da proteínade fusão para duas isoformas de PCNA, esta metodologia resultou em uma purificação efe-tiva de um caPCNA a partir de nmPCNA. Análise subseqüente de 2D-PAGE através do fluxoe eluente partir da coluna de afinidade (XPG-GST) demonstrou que a isoforma PCNA pre-sente nas células não malignas, (nmPCNA), é encontrada através do fluxo da coluna deafinidade, enquanto a isoforma acídica (caPCNA) foi recuperado em uma fração eluída apartir da coluna (FIG. 2).

Extratos de células MCF7 (linhagem celular de adenocarcinoma de mama humana)foram processados para purificação do sintesoma. Sintesoma derivado de MCF7 foi entãosujeito aos passos de cromatografia em matrizes de fosfocelulose, fenil Sefarose, e Q-Sefarose como descrito em (Malkas, L. e Hickey1 R. (1996) The expression, purification andcharacterization of DNA polymerases involved in papovavirus replication. Em: Methods inEnzymol Vol. 275: Viral Polymerases and Related Proteins1 Acad. Press (1330167). A fraçãoeluída em Q-Sefarose contendo ambas as isoformas nmPCNA e caPCNA foi então carrega-da em uma coluna de afinidade XPG-GST. A coluna foi eluída e ambos, a coluna de fluxo eeluato foram sujeito a análise de 2D-PAGE Western blot utilizando anticorpo PC10. O anti-corpo PC10 foi utilizado em uma diluição de 1:1000 na análise de Western blot.

caPCNA foi especificamente imunoprecipitado de um extrato celular de MCF7 utili-zando proteína de fusão XPG-GST (FIG. 3). Amostras de trinta micrograma de extrato celu-lar de MCF7 foram incubadas com proteína de fusão XPG-GST por duas horas, seguido porincubação com esferas de Glutationa agarose por uma hora para capturar o XPG-GST. Amistura foi então centrifugada para coletar as esferas, e o sobrenadante e o concentrado deesferas de agarose contendo o complexo PCNA XPG-GST foram sujeitos a análise de 2D-PAGE Western blot. Os Western blots foram então provados utilizando anticorpo PC10 co-mercialmente disponível. Como pode ser visto na FIG. 3, XPG-GST foi facilmente capaz dereconhecer e caPCNA precipitado seletivamente a partir do extrato celular de câncer demama MCF7, deixando a isoforma nmPCNA na fração de sobrenadante.

Exemplos 1 descreve o efeito de um peptídeo dericado de caPCNA na citotoxicida-de de células cancerosas. O sítio de peptídeo derivado caPCNA em capCNA serve comoum bloqueio molecular em que qualquer de uma variedade de proteínas chaves adequadas,por exemplo XGP (proteína Xeroderma Pigmentosum G). Essas proteínas interagindo se-vem como chaves que ativa processos celulares específicos tal como reparo de DNA, regu-lação do ponto de checagem do ciclo celular, e semelhantes, quando eles interagem comPCNA. O benefício terapêutico alcançado pela interrupção da ligação dessas proteínas paraPCNA relaciona-se a diferença na estrutura deste sítio de ligação entre o câncer específicoe isoformas celulares normais de PCNA, como demonstrado pela ligação preferencial dofragmento protéico da fusão XPG-GST ap imobilizado ao caPCNA, mas é oculto na isoformanmPCNA. Este sítio de ligação é não disponível ou não acessível quando o peptídeo com-petindo está presente, ou o sítio de ligação tem uma afinidade para a ligação de proteínaque difere entre os tipos de células malignas e não malignas.

Uso das "chaves" ligando ao "bloqueio" caPCNA, isto é, regiões ou domínios ouepítopos dentro das proteínas intracelulares de interação podem também ser utilizadas co-mo potenciais terapêuticos e alvos terapêuticos potenciais. Evidência para a ligação seletivade uma dessas proteínas para este sítio em PCNA é demonstrada na forma de um fragmen-to de proteína XPG fusionado ao produto de gene da glutationa-S-tranferase (isto é, GST)como provido nas FIGS. 2-4. O racional desta metodologia é baseado son a obsevação queum peptidominético (baseado sob o sítio antigênico de caPCNA) é capaz de aumentar amorte celular cancerosa por doxorubicina. Isto provavelmente ocorre ou porque o peptídeocorrespondendo a esta sírio antigênico diretamente compete com caPCNA para as proteí-nas ligando a caPCNA, ou liga a uma ou mais das proteínas específicas interagindo comPCNA1 através deste sítio de ligação (aa 126-133 de caPCNA), antes de sua associaçãocom caPCNA. Em outro cenário, a associação previne o peptídeo de um ou mais dessasproteínas com seu sítio Iigante complementar em caPCNA. Esta competição ou Iigante dife-rencial por sua vez interrompe os processos celulares específicos mediados por esta intera-ção proteína-proteína, por exemplo, a via de reparo de excisão nucleotídica. FIG. 2 demons-tra que a isoforma específica de câncer de PCNA (caPCNA) seletivamente se liga a umacoluna de afinidade preparado por acoplamento do fragmento aminoácido 29 da proteínaXPG a Glutationa-S-transferase, e expressando a proteína de fusão em bactéria. A colunade afinidade se liga a caPCNA sob condições de ligação apropriadas. Extração do caPCNAligado é alcançada por redução da concentração de NaCI no tampão de 300 mM a zero mM.

Este dado demonstra que a interação XPG-PCNA podem ser utilizada para seletivamenteligar a isoforma caPCNA. FIG. 3 provê ainda evidência para a ligação específica de caPCNAao fragmento XPG expresso como parte do produto de fusão XPG-GST. Os dados demons-tram que a proteína XPG-GST são utilizados para seletivamente se ligar e precipitar somen-te a isoforma caPCNA, enquanto permite a isoforma PCNA para permanecer em solução.

Análises subseqüentes, por 2G-PAGE, das proteínas seletivamente ligadas pela proteína defusão XPG-GST imobilizada, seguida por Western blotting com anticorpo seletivo a PCNA,demonstrado que a isoforma específica de câncer de PCNA (acídico) foi especificamenteligada a proteína de fusão XPG-GST imobilizada; enquanto deixando a isoforma nmPCNAnão ligada e um solução. FIG. 4 indica que a proteína de fusão XPG-GST pode ser utilizadocomo reagente primário levando a captura e quantificação de caPCNA presente em extratostissulares. Resultados de ELISA mostram que XPG-GST captura caPCNA a partir de extra-tos celulares, e potencialmente de amostras de soro de paciente, se presente, e permite oeficiente monitoramento de caPCNA expresso por indivíduos com câncer ou indivíduos pas-sando por tratamento para câncer.

Essas proteínas específicas derivadas de ca-PCNA e derivadas da interação decaPCNA e fragmentos de peptídeos são úteis ferramentas para diagnóstico bem como a-gentes terapêuticos valiosos. Em adição, esses fragmentos peptídicos também interrompemo crescimento celular e proliferação da célula cancerosa por interromper as interações prote-ína-proteína com o sítio antigênico em caPCNA, por exemplo, aminoácido 126-133.

EXEMPLO 3

Desenvolvimento de uma proteína de fusão XPS-GST baseada no ensaio de ELISApara a detecção da caPCNA

Um ensaio de ELISA utilizando a proteína de fusão XPG-GST foi desenvolvida paradetectar a abundância de caPCNA no complexo de misturas protéicas (FIG. 4). Proteína defusão XPS-GST foi ligada aos poços da placa de ELISA, e aumentado quantidades de extra-tos de proteína a partir ou de células MCF7 maligna ou células mamárias MCF10A não ma-lignas foram adicionadas em grupos individuais de poços. Sítios de ligação residual em cadapoço foram bloqueados por incubação com 3% de BSA1 seguido por extensiva lavagem comsalina tamponada. O anticorpo C20 anti-PCNA comercialmente disponível foi utilizado comoo anticorpo primário, e seguindo lavagem com salina tamponada com fosfato, cada poço foiincubado com IgG anti-cabra conjugado a peroxidase de rábano silvestre. Anticorpo secun-dário não especificamente ligado foi removido por lavagem de cada poço com salina tampo-nada com fosfato contendo 0,05% de detergente Tween 20 e cada poço foi incubado comum tampão contendo ABTS [2,2'-Azino-bis [ácido 3-etilbenziazolina-6-sulfônico] por 30 mi-nutos antes de ler a absorbância da solução a 405 nm. Extratos de células MCH10A con-tendo somente nmPCNA produziu um nível baixo de conversão de ABTS para um produtocolorido que saturou em menos que 1 μg/mL de extrato. Em contraste, a reação de ELISAcontendo extrato celular MCF7, contendo ambos, caPCNA e nmPCNA (Bechtel, acima) pro-duziu 3 vezes mais produto colorido na mesma concentração de extrato, e não alcançadosaturação mesmo com 3 vezes mais extrato celular na reação. A diferença na absorbânciaentre as reações contendo MCF10A e extratos celulares MCF7 representam a quantidadede caPCNA presente no extrato celular MCF7.

EXEMPLO 4

Especificidade da interação do peptídeo 126-133 PCNA

FIG. 5 mostra os resultados de um ELISA em que caPCNA está ligada a placa esendo utilizada para capturar a caPCNA isolada. Os poços são lavados e então incubadoscom anticorpo de cabra anti-PCNA (C20) que reconhece os 20 aminoácidos C-terminais dePCNA. Anticorpo C20 ligado é visualizado com uma fosfatase alcalina conjugada com anti-corpo IgG anti-cabra, e complexo anticorpo ligado é visualizado com fosfato de p-nitrofenol,e quantificado por espectrofotometria. Os experimentos de competição mostrados nesteestudo envolvem a incubação simultânea de ca(cs)PCNA com quantidades aumentadas dofragmento de peptídeo antigênico de caPCNA (referido como B1 ou o peptídeo aa126-133PCNA) neste ensaio. Redução na ligação da molécula inteira de caPCNA em presença deconcentrações aumentadas de peptídeo B1 são mostradas, e demonstram que o ensaio deELISA é específico para reconhecimento do epítopo caPCNA definido pela seqüência peptí-dica.

O ensaio descrito na FIG. 5 foi utilizado para testar a especificidade do anticorpocombinando o sítio para o epítopo definido por PCNA aa126-133 (FIG. 6). O ensaio deELISA foi feito como descrito no objetivo 1, entretanto, ou o peptídeo B1 ou uma seqüênciapeptídica (H-Ser-Ala-Cys-Glu-GIn-IIe-Leu-Lys-Asp-Thr-OH) tomada de dentro da proteínamiosina de levedura foi utilizada para competir pelo anticorpo em presença de caPCNA puri-ficada. Como mostrado na FIG. 5, o peptídeo B1 eficientemente compete pelo sítio combi-nante do anticorpo, enquanto o peptídeo de miosina de levedura não relacionado (MAL4)não compete com caPCNA para ligar ao caPCNAab, e não diminui a quantidade de PCNAligada ao caPCNAab imobilizado ligado a placa. Esses dados demonstraram a especificida-de do anticorpo combinando o sítio para o epítopo em caPCNA que é definido pelo peptídeoB1.

O ELISA descrito aqui foi utilizado para monitorar a habilidade de dois peptídeospara interromper a ligação de caPCNA ao anticorpo caPCNA ligado. Um peptídeo (H-Gly-Arg-Lys-Arg-Arg-Gln-Thr-Ser-Met-Thr-Asp-Arg-Tyr-His-Ser-Lys-Arg-Arg-Leu-lle-Phe-Ser-OH) correspondendo aos sítios de interação de proteínas p21cip/waf1 com PCNA foi avalia-do neste ensaio, e é mostrado não ter efeito na ligação de caPCNA para ligar o anticorpocaPCNA neste ensaio de ELISA (FIG. 7). O outro peptídeo (H-Gln-Thr-Gln-Leu-Arg-Ile-Asp-Ser-Phe-Phe-Arg-OH) correspondendo ao sítio de interação XPG-PCNA da proteína XPGefetivamente competiu com a caPCNA purificada para ligar o anticorpo cPCNA, e significan-temente reduziu a geração do substrato colorido no ensaio na proporção direta para a quan-tidade de peptídeo XPG utilizado neste ensaio de competição. O peptídeo XPG não interagesozinho com o anticorpo caPCNA, como ele é não relacionado para o peptídeo antigênico.Dessa forma, o peptídeo XPG interage com seu sítio de ligação de PCNA reconhecido a fimde bloquear a ligação da proteína de PCNA para o anticorpo caPCNA. Isto acontece se oepítopo reconhecido pelo anticorpo foi mascarado por especificamente ligação do peptídeoXPG. Estes dados indicam que ambos, peptídeo caPCNA (aa126-133) e peptídeos que inte-ragem com sítios específicos dentro do PCNA, tal como o peptídeo XPG e outros parceirosde ligação de PCNA conhecidos, podem interromper o reconhecimento de PCNA por seusparceiros de ligação regular e potencialmente interrompem as funções celulares dependen-tes dessas interações proteína-proteína.

EXEMPLO 5

Diferenças funcionais entre as isoformas PCNA parte II: XPG liga especificamenteao csPCNA.

Uma coluna de agarose XPG-GST foi preparada e subseqüentemente resolvida, &núcleo celular de câncer de mama extraído utilizando a coluna. O fluxo da coluna, lavagemda coluna, e condições de eluição foram utilizadas baseadas nas condições de ligação XPG-PCNA. Análises2D-PAGE do fluxo+lavagem e frações de proteína eluente a partir da colunade afinidade (XPG-GST) mostraram que a isoforma básica de PCNA presente nas célulasnão malignas (nmPCNA) foi encontrado no fluxo da coluna de agarose XPG-GST + fraçãolavada, enquanto a isoforma PCNA acídica, csPCNA, foi recuperada na fração de proteínaeluída a partir da coluna (FIG. 8A). Uma análise de 1D-PAGE Western das frações da colu-na XPG-GST foi feita utilizando ambos anticorpos PC10 e csPCNAab (FIG. 8B). Isto mos-trou que csPCNAab somente reconheceu a isoforma PCNA contida na fração eluente dacoluna de agarose XPG-GST sugerindo que XPG preferencialmente se liga a csPCNA sobcondições utilizadas para resolver a coluna, e que as isoformas PCNA têm afinidades dife-rentes para parceiros de ligação de PCNA conhecidos.

Tabela 1: Domínios peptídicos contendo a região de PCNA aa126-133seqüência PCNA111-125

<table>table see original document page 22</column></row><table>

As regiões contendo o domínio 126-133 são mostradas como sublinhadas.Listagem de Seqüência

<110> Indiana University Research And Technology Corporation

<i20> Inibição baseada em peptídeo de Interação caPCNA em câncer

<130> 29920-201293

<140> PCT/US2 007/062335

<141> 2007-02-16

<150> 60/743,313

<151> 2006-02-17

<160 > 38

<170> Versão em Patente 3.4

<210> ι

<211> 8

<212 > PRT

<213 > artificial

<220>

<223 > sintético

<400> 1

Leu Gly Ile Pro Glu Gln Glu Tyr1 5

<210 > 2

<211> 11

<212> PRT

<i213> artificial

<220>

<223 > sintético

<400> 2

Val Glu Gln Leu Gly Ile Pro Glu Gln Glu Tyr1 5 10

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220 >

<223 > sintético

<400> 3

Leu Gly Ile Pro Glu Gln Glu Tyr Ser Cys Val Val Lys1 5 10

<210> 4<211> 17<212> PRT<213 > Artificial<220>

<223 > sintético

<400> 4

Leu Glv Ile Pro Glu Gln Glu Tyr Ser Cys Val Val Lys Met Pro Ser1 5 10 15

Gly

<210> 5<211> 10<212> PRT<213 > Artificial

<22 0>

<22 3 > sintético

<400> 5

Glu Gln Leu Gly Ile Pro Glu Gln Glu Tyr10

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> sintético

<400> 6

Gln Leu Gly Ile Pro Glu Gln Glu Tyr1 5

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223 > sintético

<400> 7

Leu Gly Ile Pro Glu Gln Glu Tyr Ser Cys Val Val Lys Met Pro Ser15 10 15

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223 > sintético

<400> 8

Leu Glv Ile Pio Glu Gln Glu Tyr Ser Cys Val Val Lys Met Pro15 10 15

<210> 9

<211> 14

<212 > PRT

<213 > Artificial

<220>

<223 > sintético

<400> 9

Leu Gly Ile Pro Glu Gln Glu1 5

Tyr Ser Cys Val Val Lys Met10

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213 > Artificial

<220>

<223 > sintético

<400> 10

Leu Glv Ile Pro Glu Gln Glu Tyr Ser Cys Val Val

1 5 10

<210 > 11

<211> 11

<212> PRT

<213 > Artificial

<220>

<223 > sintético

<400> 11

Leu Gly Ile Pro Glu Gln Glu Tyr Ser Cys Val15 10

<210> 12

<211> 10

<212 > PRT

<213 > Artificial

<220>

<223 > sintético

<400> 12

Leu Gly Ile Pro Glu Gln Glu Tyr Ser Cys1 5 10<210> 13

<211> 9

<212 > PRT

<213 > Artificial

<220>

<223 > sintético

<400> 13

Leu Gly Ile Pro Glu Gln Glu Tyr Ser1 5

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213 > Artificial

<220>

<223> sintético

<400> 14

His Ala Ile Tyr Pro Arg His1 5

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213 > Artificial

<22 O >

<223 > sintético

<400> 15

Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Pro1 5 10

<210> 16

<211> 16

<212 > PRT

<213 > Artificial

<220>

<223 > sintético

<400> 16

Arq Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys1 5 10 15

<210> 17

<211> 13

<212 > PRT

<213 > Artificial

<220>

4<223 > sintético

<400> 17

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln1 5 10

<210 > 18

<211> 27

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223 > sintético

<400> 18

Glv Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu

1 5 10 I5

Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu20 25

<210> 19

<211> 34

<212 > PRT

<213 > Artificial

<220>

<223> sintético<400> 19

Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr1 S 1°

Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro20 25

Val Asp

<210> 20

<211> 18

<212> PRT

<213 > Artificial

<220>

<223 > sintético

<400> 20

Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu

1 5

Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys10 15

Leu Ala<210> 21<211> 30<212 > PRT<213> Artificial<22 0 > < 2 2 3 > sintético

Leu Ala Lvs Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Ala Cys Glu Ala20 25 30

<210> 22

<211> 20

<212> PRT

<213 > Artificial

<220>

<223 > sintético

<400> 22

Glv Leu Phe Arg Ala Leu Leu Arg Leu Leu Arg Ser Leu Trp Arg Leu1 5 10 15

Leu Leu Arg Ala20

<210> 23

<211> 6

<212> PRT

<213 > Artificial

<220>

<223 > sintético

<400> 23

Val Arg Leu Pro Pro Pro1 5

<210> 24<211> 27<212> PRT<213 > Artificial<220 > <223 > sintético<400> 24Met Gly Leu Gly Leu His Leu Leu Val Leu Ala Ala Ala Leu Gln Gly1 5 10 15

Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val20 25

<210> 25

<211> 27

<212> PRT

<213 > Artificial

<220>

<223 > sintético

<400> 25

Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu1 5

Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly10 15

Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val20 25

<210 > 26<211> 21<212> PRT<213 > Artificial<220> <223 > sintético

<400> 26

Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp1 5

Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys10 15

Lys Lys Arg Lys Val20

<210> 27<211> 24<212> PRT<213> Artificial<220> <223 > sintético

<400> 27

Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe1 5

Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gln10 15

Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro20

<210>

28<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223 > sintético

<400> 28

Ser Ala Cys Glu Gln1 5

Ile Leu Lys Asp Thr10

<210> 29

<211> 22

<212 > PRT

<213 > Artificial

<220>

<223 > sintético

<400> 29

Gly Arg Lys Arg Arg Gln Thr Ser Met Thr Asp Arg Tyr His Ser Lys15 10 15

Arg Arg Leu Ile Phe Ser20

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<22 0>

<223 > sintético

<400> 30

Gln Thr Gln Leu Arg Ile Asp Ser Phe Phe Arg15 10

<210> 31

<211> 100

<212> PRT

<213 > Artificial

<220>

<223 > sintético

<400 > 31

Leu Val Phe Glu Ala Pro Asn Gln1 5

Glu Lys Val Ser Asp Tyr Glu Met10 15

Lys Leu Met Asp Leu Asp Val Glu Gln Leu Gly Ile Pro Glu Gln Glu20 25 30Tyr Ser Cys Val Val Lys Met Pro Ser Gly Glu Phe Ala Arg Ile Cys35 40 45

Arg Asp Leu Ser His Ile Gly Asp Ala Val Val Ile Ser Cys Ala Lys50 55 60

Asd Gly Val Lys Phe Ser Ala Ser Gly Glu Leu Gly Asn Gly Asn Ile

65 70 75 80

Lvs Leu Ser Gln Thr Ser Asn Val Asp Lys Glu Glu Glu Ala Val Thr85 90 95

Ile Glu Met Asn100

<210> 32

<211> 15

<212 > PRT

<213 > Artificial

<220>

<223 > sintético

<400> 32

Val Ser Asp Tyr Glu Met Lys Leu Met Asp Leu Asp Val Glu Gln15 io 15

<210 > 33

<211> 18

<2:12 > PRT

<213 > Artificial

<220>

<223 > sintético

<400> 33

Leu Met Asp Leu Asp Val Glu Gln1 5

Leu Gly Ile Pro Glu Gln GlU Tyr10 15

Ser Cys

<210> 34

<211> 12

<212 > PRT

<213> Artificial

<22 0 >

<223> sintético

<400> 34

Asp Val Glu Gln Leu Gly Ile Pro Glu Gln Glu TyrArtificial

<223> sintético

<400> 35

Leu Gly Ile Pro Glu Gln Glu Tyr Ser Cys Val Val Lys Met Pro Ser1 5 10 I5

Gly Glu

<210><211><212><213 >

<22 0 >

<210 > 36

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<22 3 > sintético

<400> 36

Leu Gly Ile Pro Glu Gln Glu Tyr Ser Cys Val Val Lys Met Pro Ser15 10 15

Glv Glu Phe Ala Arg Ile Cys Arg Asp Leu Ser His20 25

<210> 37

<211> 38<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223 > sintético

<400> 37

Leu Gly Ile Pro Glu Gln Glu Tyr Ser Cys Val Val Lys Met Pro Ser15 10 15

Gly Glu Phe Ala Arg Ile Cys Arg Asp Leu Ser His Ile Gly Asp Ala20 25 30

Val Val Ile Ser Cys Ala35

<210><211>

385<212> PRT

<213 > Artificial

<220>

<223 > sintético

<400> 38

Arg Tyr Ile Arg Ser

1 5

Claims (13)

1. Composição terapêutica para redução da proliferação celular de células malignasque expressam uma isoforma específica de câncer de antígeno nuclear de proliferação celu-lar (caPCNA) CARACTERIZADA pelo fato de compreender uma molécula de peptídeo com-preendendo uma seqüência aminoácida LGIPEQEY, em que o peptídeo especificamenteinibe a interação da PCNA com uma ou mais proteínas.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato deque a molécula de peptídeo é uma molécula sintética.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato deque a molécula de peptídeo é permeável a célula.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato deque o peptídeo compreende uma seqüência de translocação.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato deque o peptídeo é resistente a protease.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato decompreender um agente quimioterápico.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato deque o agente quimioterápico é selecionado a partir do grupo consistindo de doxorubicina,paclitaxel, docetaxel, cisplatina, datrexato, gemcitabina, ou vinorelbina ou uma combinaçãodos mesmos.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato decompreender um lipossomo.

9. Uso da composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelofato de seletivamente inibir a interação de uma isoforma específica de câncer do antígenonuclear de proliferação celular (caPCNA) com uma proteína intracelular em uma célula ma-ligna, o uso compreendendo:(a) prover a composição, de acordo com a reivindicação 1, que seletivamente inter-rompe a interação da caPCNA com a proteína intracelular;(b) administração da composição tal que o agente contata uma população de céluIas cancerosas; e(c) inibe a interação da caPCNA com a proteína intracelular.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que acomposição é administrada intravenosamente.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a in-teração do caPCNA com a proteína intracelular está envolvida em um processo celular sele-cionado do grupo consistindo de síntese de DNA, reparo de DNA, recombinação, transcri-ção, controle do ponto de checagem do ciclo celular, e apoptose.

12. Uso de uma composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADOpelo fato de reduzir a proliferação de células malignas que expressam uma isoforma especí-fica de câncer do antígeno nuclear de proliferação celular (caPCNA), o uso compreendendo:(a) prover a composição, de acordo com a reivindicação 1, que seletivamente inter-rompe a interação da caPCNA com a proteína intracelular;(b) administração da composição tal que o agente contata uma população de célu-las cancerosas; e(c) redução da proliferação de células malignas.

13. Uso da composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelofato aumentar a terapia de câncer para cânceres que expressam uma isoforma específicade câncer do antígeno nuclear de proliferação celular (caPCNA), o método compreendendo:(a) prover a composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a composiçãocompreende um agente quimioterápico para cânceres;(b) administração da composição compreendendo o agente quimioterápico tal quepelo menos uma porção dos agentes contata uma população de células cancerosas; e(c) aumento da terapia do câncer por aumentar a morte de células cancerosas oupor reduzir o potencial proliferativo das células de câncer, comparadas ao número de célulascancerosas mortas por quimioterapia sozinha.