JPH05507411A - 哺乳動物によるｂｍｐ―２ファミリーの発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳動物によるＢＭＰ−２フアミリーの発現産業上の利用分野 本発明は、哺乳動物細胞における骨形態形成蛋白（ＢＭＰ）−２フアミリーをコ ードしているＤＮＡを発現する改良法に関するものである。

関連技術の説明 骨の喪失に関連する疾患は、西洋社会の主要な公衆衛生上の問題を呈している。

骨粗髭症のみをとってみても来世紀初期には二千万人のアメリカ人が冒される可 能性がある。故に、骨の喪失を妨げ健康な新しい骨の形成を刺激する因子または 治療的可能性のある物質を同定することについて広く興味が持たれている。

骨は、まずこれを破壊（骨破壊的再吸収）し次いで再建（骨形成）するという細 胞事象により成人の生存中絶えず再建される、複雑な、それでいて高度に統制さ れた結合組織である。この再建過楔は、骨格全体にわたる、即ち皮質骨及び海綿 骨の両者において別個のまとまりで起こる。近年、マウスの骨髄細胞が副甲状腺 ホルモン関連蛋白またはビタミンＤの存在下で刺激され骨破壊を招くという事が 報告された。アカッ等、エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｆｎｏｌｏｇｙ）第 １２５巻２０−２７頁（１９８９）：タカハシ等、エンドクリノロジー（Ｅｎｄ ｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）第１２３巻２６００−２６０２頁（１９８８）及びタカ ハシ等、エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）第１２３巻１５０ ４−１５１０頁（１９８８）を参照されたい。

骨形成を刺激することが知られている現在入手可能な治療物質は弗化物、ニスト ロジエン、代謝産物、及びビタミンＤである。弗化物は明らかに海綿骨の量を増 加させるが、新しく形成された骨の質、幾らかの患者に観察される副作用、を椎 骨折の頻度に及ぼす有益な影響があるか否か、そしてその後の股関節骨折の傾向 を伴う皮質骨の脆さの増大をもたらすか否かについて疑問が残る。

別の試みは、再吸収を促進（副甲状腺ホルモン）し次いで再吸収を妨げる（カル シトニン）薬物を使用することである。提唱された（しがし確認されている訳で はない）このような連続的治療法の一つは、骨代謝単位をホスファートの経口投 与によって活性化し次いでジスルフィドまたはカルシトニンのいずれかにより再 吸収を阻害する、干渉療法である。

過去数年間に、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞成 長因子、血小板由来成長因子、インシュリン様成長因子１及びβ２マクログロブ リンを含む、骨形成を刺激する幾つかの因子が骨中に同定された。

骨マトリックス中に貯蔵される他の蛋白もまた骨形成にとって重要であり得る。

脱塩した骨をラットの筋肉または皮下組織中に注射すると、軟骨形成を含む連鎖 的事象が起こった。ウリスト、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第１５０巻８９３ 頁（１９６５）。１９６０年代以降、この活性を同定し特性決定するための幾つ かの研究が試みられ、係る活性を精製するための検定が提供された。レディ及び ハギンズ、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ イエンシズＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）第６ ９巻１６０１−１６０５頁（１９７２）；サンバス及びレディ、プロシーディン グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズＵＳＡ　（Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ）第７８巻７５９９−７６０３頁（ １９８１）。

この検定は、オステオゲニン、２２Ｋｄの蛋白［サンバス等、プロシーディング ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズＵＳＡ（Ｐｒ。

ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）第８４巻７１０９頁（１９８７）； リュイテン等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉ。

１、Ｃｈｅｍ、）第２６４巻１３３７７−１３３８０頁（１９８９）］及び骨誘 導因子と呼ばれる糖蛋白［ベンツ等、ジャーナル・オブ・セルラー・バイオロジ ー（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）第１０７巻１６２ａ頁（１９８９）］を含む幾 つかの新規な蛋白を充分な量および純度で骨から精製してアミノ酸配列情報を得 るための基礎としての役割を担った。ワング等、プロシーディングズ・オブ・ザ ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ 　！、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）第８５巻９４８４−９４８８頁（１９８８） をも参照されたい。アミノ酸配列データに基づき、配列の類似性によりＴＧＦ− βに関連している幾つかの蛋白をコードしているクローンを、牛及びヒトの試料 から単離した。ウォツネイ等、サイｚンス（Ｓ　ｃ　ｉ　ｅ　ｎ　ｃ　ｅ）第２ ４２巻１５２８−１５３４頁（１９８８）：１９８８年１月１４日公開のｐｃＴ 　ＷＯ３８１００２０５号：　１９８９年１０月３１日登録の米国４８７７８６ ４号。これら後半の蛋白は、ＢＭＰ−２Ａ　（ＢＭＰ−２としても知られる）、 ＢＭＰ−２８（ＢＭＰ−４としても知られる）、及びＢＭＰ−３を含んでいた。

オステオゲニンがらトリプシンにより生じたペプチドの配列はＢＭＰ−３として 報告された配列と合致する。

ＴＧＦ−β超遺伝子ファミリーは、ＴＧＦ−βの五つの別個の型［スポーン及び ロバーツ、ペプチド・グロース・ファクターズ・アンド・ゼア・レセブターズ（ Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｒｅｃ ｅｐｔｏｒｓＬスポーン及びロバーツ編（スプリンガーーフェアラーク：ベルリ ン、１９９０）４１９−４７２頁］、並びに分化因子ｖｇｌ　［ウイークス及び メルトン、セル（Ｃｅｌｌ）第５１巻８６１−８６７頁（１９８７）］及びＤＰ Ｐ−Ｃポリペプチド［バジェット等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第３２５巻８ １−８４頁（１９８７）］、アクティビン及びインヒビンポルモン［メイジン等 、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第３１８巻６５９−６６３頁（１９８５）：メイ ジン等、グロース・ファクターズ（Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ）第１巻７７ −８８頁（１９８７川、ミュラー擬態阻害物質、ＭＩＳ　［サイト等、セル（Ｃ ｅｌｌ）第４５巻６８５−６９８頁（１９８６）］　、ＢＭＰ、及び発達的に調 節される蛋白Ｖｇｒ−１［リオンズ等、ブロンーディングズ・オブ・ザ・ナショ ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃ ａｄＳｃ　ｉ−ＵＳＡ）第８６巻４５５４−４５５８頁）１９８９）］を含んで いる。

サブセットＢＭＰ−２Ａ及びＢＭＰ−２８はＤＰＰ−Ｃに対する配列の点でおよ そ７５％の相同性があり、この蛋白に対する哺乳動物の等個物を表わしている可 能性がある。

ＴＧＦ−β超遺伝子ファミリーの蛋白は、疎水性信号配列、長い且つ相対的に保 存性の低い数百のアミノ酸から成るＮ末端プロ領域、開裂サイト（通常多塩基の ）、及び、より短い且つより高度な保存性のＣ末端領域、を含む、より大きな前 駆体ポリペプチド鎖によりコードされる、ジスルフィドで結合したホモまたはへ テロニ量体である。このＣ末端領域はプロセシングを受けた成熟蛋白に対応し、 特徴的なシスティンモチーフを有する、即ち既知の全ファミリー成員の中でＴＧ Ｆ−βの９個のンステイン残基のうち７個を保存する、およそ１００個のアミノ 酸を含んでいる。ファミリー成員内で成熟及びプロ領域の間の開裂サイトの位置 は異なるものの、全ての蛋白のＣ末端は同一の位置にあり、Ｃｙｓ−Ｘ−Ｃｙｓ −Ｘ配列で終わっているが、ＴＧＦ−βの共通のＣ末端Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ −５ｅｒとは全ての場合で異なっている。スポーン及びロバーツ、１９９０、上 記。

ＴＧＦ−βのプロ領域は成熟ＴＧＦ−β二量体と非共有結合的に結合しており［ ウェイクツイールド等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）第２６３巻７６４６−７６５４頁（１９８８）；ウェイ クツイールド等、グロース・ファクターズ（Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ）第 １巻２０３−２１８頁（１９８９）］　、このプロ領域は、ＴＧＦ−β及びアク ティビンの両方の活性成熟二量体の適正な折り畳み及び分泌に必要であることが 判明している［グレイ及びメイジン、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）第２４７巻 １３２８−１３３０巻（１９９０）］。ＴＧＦ−βの成熟及びプロ領域間の結合 は、成熟二量体の生物活性を遮蔽し、その結果不活性潜在型を形成させる。プロ 領域の存在はアクティビンまたはインヒビンの生物活性に影響しないことから、 潜在性はＴＧＦ−β超遺伝子ファミリーに恒常的なものではない。

ＴＧＦ−β超遺伝子ファミリー由来の蛋白の生物学に一様な特徴は、発達過程を 調節する能力である。ＴＧＦ−β超遺伝子ファミリー中の全ての蛋白のインビボ における骨形成に関して、ＢＭＰ及びＴＧＦ−βは最も主要な役割を演する。

組み替えＴＧＦ−β１がクローニングされ［プリンク等、ネイチャー（Ｎａｔｕ ｒｅ）第３１６巻７０１−７０５頁（１９８５）Ｌチャイニーズハムスターの卵 巣細胞において発現された［ジエントリー等、モレキュラー・アンド・セルラー ・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）第７巻３４１８−３４２７頁 （１９８７）］。さらに、組み替えヒトＴＧＦ−β２［ドウマーチン等、ＥＭＢ Ｏジャーナル（ＥＭＢＯＪ、）第６巻３６７３頁（１９８７）］、並びにヒト及 びブタのＴＧＦ−β３［プリンク等、ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢＯＪ。

）第７巻３７３７−３７４３頁（１９８８）；テン・ディジュヶ等、プロシーデ ィングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズＵＳＡ（Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　＋、　ＬＪＳＡ）第８５巻４７ １５頁（１９８８）］がクローニングされた。ＣＯ８細胞における成熟ＴＧＦ− β１蛋白の発現レベルは、ＴＧＦ−β１前駆体のプロ領域に位置するセリン残基 をシスティン残基に置換することにより増大する。プラナ−等、ジャーナル・オ ブ・バイオロジカル。

ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）第２６４巻１３６６０−１３６６４ 頁（］、、９８９）］。

つｔッネイ等（上記）により、ＢＭＰ−２Ａ及びＢＭＰ−３が、ザルのｃｏｓ− １細胞及びチャイニーズハムスター卵巣細胞において組み替え技術により産生さ れた。しかしながらＢＭＰ−２Ａ及び−２８のｃＤＮＡの発現レベルはこのＤＮ Ａが増幅されない場合相対的に低いものである。ジヒドロ葉酸塩還元酵素のメソ トレキサート選択を用いて高複製数に増幅することにより、ＣＨＯ細胞において 、より高いレベルのＢＭＰ−２Ａ蛋白の発現が得られた。ワンプ等、プロシーデ ィングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズＵＳＡ　（ Ｐｒｏｅ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）第８７巻２２２０−２２２ ４頁（１９９０）。

ＢＭＰの骨形成活性の確認及びその商業的生産は、組み替え的発現手段により有 用な量の活性物質を産生させる能力、及びこれらを活性型で精製する方法の開発 に依存している。軟骨内性骨の形成をうまく再構成する能力は、候補因子の骨形 成性を判断する基準である。ＢＭＰ−２Ａ１ＢＭＰ−３、及び非関連分子ＢＭＰ −１の生物活性は、軟骨の形成のみをもたらすＣＯ８細胞中で発現される材料を 用いるインブラントモデルにおいて最初評価された。ウォツネイ等、上記。より 最近になって、ＣＨＯ細胞において発現される部分的に精製されたＢＭＰ−２Ａ が軟骨及び骨の形成を誘導するためには、少なくとも６００　ｎ　ｇ／インブラ ントの用量が必要であることが示された。ワンプ等、１９９０、上記。ＢＭＰ− ２Ｂ及びＢＭＰ−３の骨形成活性は確立されなかった。

本発明の一つの目的は、その骨形成活性を試験するに充分な量の精製されたＢＭ Ｐ−２１３を提供し、これを商業的規模で生産することである。

別の目的は、ＤＮＡを増幅することなく哺乳動物細胞におけるＢＭＰ−２ＤＮＡ の発現レベルを改善することである。

さらに別の目的は、かつて用いられたレベルと同等の増幅レベルにおいて、かつ て達成されたよりも高いＢＭＰ−２蛋白の産生を達成することである。

これらのそして他の目的は、分子生物学の分野における通常の知識を有する者に とって明白であろう。

発明の要約 このように本発明は、その上流がＢＭＰ−２以外の哺乳動物蛋白の前駆体部分を コードしているＤＮＡである、成熟ＢＭＰ−２をコードしているＤＮＡからなる ＤＮＡ構築物を提供する。好ましくは該前駆体部分は、ＢＭＰ−２前駆体のＮ末 端から成熟ＢＭＰ−２の最初のシスティン残基に至る領域におけるＢＭＰ−２の 天然の前駆体部分に対して少なくとも２５％のアミノ酸配列の一致がある。

別の態様において、本発明は上記ＤＮＡ構築物を含む発現ベクター及び係るベク ターにより形質転換された宿主を提供する。

ＢＭＰ−２をコードしているＤＮＡを哺乳動物細胞中で発現する方法において、 本発明はさらに、上記ベクターにより形質転換された宿主を宿主として使用する ことからなる改善を提供する。

さらに本発明は、上記発現ベクターによりトランスフェクトされた哺乳動物宿主 細胞（ここでこの細胞は該ベクターのＤＮＡ構築物を発現することができる）を 培養することによりＢＭＰ−２を生産する方法、及びその細胞から成熟ＢＭＰ− ２を回収する方法を提供する。好ましくは、この回収は宿主細胞の培地から行な う（この場合、該発現ベクターは、成ＱＢＭＰ−２の培地への分泌をもたらす、 前駆体もしくはＢＭＰ−２に天然の、または前駆体もしくはＢＭＰ−２に対しヘ テロローガスな信号配列を含む）。

この方法の結果、哺乳動物細胞において、産生されるべきＢＭＰ−２に天然のＢ ＭＰ−２前駆体部分を用いて達成されるレベルを劇的に改善するＢＭＰ−２ＤＮ Ａの発現レベルが得られる。

図面の簡単な説明 図１はＢＭＰ−２Ａ及びＢＭＰ−２Ｂのアミノ酸配列を示す図であって、配列の 一致する領域を表示しである。前駆体部分と成熟部分の間の結合部を２本の腕の 付いた縦線によって示しである。

図２はＢＭＰ−２Ａの前駆体部分及びＢＭＰ−２Ｂの成熟部分のキメラの完全な アミノ酸配列を示す図である。

図３Ａは発現プラスミドｐＲＫ５．ｂｍｐ２／４−１．１を示す図であり、図３ ＢはＢＭＰ−２Ａ／２Ｂハイブリツド挿入物の結合領域を示す図である。ＢＭＰ −２Ａ及びＢＭＰ−２Ｂの整合部分を、同一の残基を箱で囲むことにより示しで ある。ＢＭＰ−２Ａ及びＢＭＰ−２Ｂの融合の結果束じたコード化配列に、交叉 点を示しつつ陰影を付す。矢印付きの下線を付した配列は、精製組み替えＢＭＰ −２Ｂのエドマン減成によって確認された配列を表わす。

図４は、天然Ｂ　Ｍ　Ｐ　−２Ａ分子（第１列）、キメラＢＭＰ−２Ａ／２Ｂ分 子（第２列）、天然のＢＭＰ−２Ｂ分子（第３列）、対照のｐＲＫ５プラスミド （第４列）のいずれかをコードしているＤＮＡ、またはプラスミドをコードして いないＤＮＡ　（第５列）による、ヒト胎児腎臓セルライントランスフェクショ ンからの上清の５ＤＳ−ＰＡＧＥ還元ゲルの蛍光写真を示す図である。

図５は、示された量の成熟組み替えＢＭＰ−２ＢまたはＴＧＦ−βを用いて再構 成された、ラットにおける脱塩青粉（ＤＢＰ）またはグアニジン−ＨＣｌ−抽出 ＤＢＰのインブラント（１２日目において収穫）のカルシウム含量（図５Ａ）及 びアルカリホスファターゼ含量（図５Ｂ）を示す図である。二つの用量について 表わされた無地及び斜線を引いた棒は二回実施の結果である。

好ましい態様の説明 定義 本明細書中使用される語ｒＢＭＰ−２Ｊは、任意の種から誘導されるタイプ２の 骨形態形成蛋白のファミリーを意味する。本明細書中のＢＭＰ−２という表示は 、その配列が図１に示される、ウオツネイ等（上記）及びＷＯ３８１００２０５ （上記）により述べられたＢＭＰ−２Ａ及びＢＭＰ−２Ｂ　（かつてＢＭＰ−４ と呼ばれた）を含む、任意の現在同定されている型の一つ、並びに将来同定され るＢＭＰ−２種の表示であると理解される。ｒＢＭＰ−２Ｊという語はさらに、 その成熟配列が、ＤＰＰ−Ｃを包含する成熟ＢＭＰ−２の配列と少なくとも約７ ５％相同的である、任意の既知のＢＭＰ−２配列から誘導されるポリペプチドを 包含する。ＢＭＰ−２フアミリーの成員は、Ｎ末端付近の高度な相同性領域を共 有する、より大きな前駆体としてコードされているように思われる。

本明細書中使用される「前駆体部分」とは、成熟蛋白を持たないプレプロドメイ ンまたはプロドメインのいずれかを表わすプレプロ−哺乳動物蛋白から誘導され るポリペプチド配列を意味する。このような前駆体部分を有する哺乳動物蛋白の 候補は、典型的には、二塩基性アミノ酸開裂サイトが後に続く、Ｎ末端における 信号配列、及び別の二塩基性アミノ酸開裂サイトが後に続くプロ領域、及び該蛋 白の成熟領域を含む、より大きな前駆体としてコードされている蛋白である。

したがって、前駆体部分は、その哺乳動物蛋白の成熟Ｎ末端に対するＮ末端であ り、その蛋白の分泌のための信号配列を含み得る部分である。好ましくは、その 前駆体部分が誘導される哺乳動物蛋白は、上記のようにＴＧＦ−β超遺伝子ファ ミリーの一員である。好適な前駆体部分の例は、インシュリン、リラキシン、イ ンヒビン、アクティビン、及びＴＧＦ〜βの場合のように、信号配列に続いて開 裂後に成熟蛋白と共有結合または非共有結合により再結合するポリペプチド領域 を表わす配列のあるものである。

ｒＢＭＰ−２前駆体のＮ末端からＢＭＰ−２の成熟領域における最初のシスティ ン残基までのＢＭＰ−２の天然の前駆体部分に対する少なくとも２５％のアミノ 酸配列の一致」という表現は、発現されるＢＭＰ〜２　ＤＮＡの関連部分に対し てこの最小の配列一致を共有する前駆体部分を意味する。この配列一致は、図工 に示される全アミノ酸配列からＢＭＰ−２Ａ及びＢＭＰ−２Ｂについて容易に算 出することができる。例えば、ＢＭＰ−２Ａは、ＢＭＰ−２Ｂ前駆体のＮ末端か らＢＭＰ−２Ｂ分子の成熟領域における最初のシスティン残基までのＢＭＰ−２ Ｂの天然の前駆体部分に対して５５％のアミノ酸配列の一致があり、そしてこの 逆もまた真である。カエルの卵母細胞において発現される両生類の遺伝子ｖｇ１ の産物に関連する蛋白ｖｇｒの前駆体［リオンズ等、プロシーディングズ・オス ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オス・サイエンシスＵＳＡ　（Ｐｒｏ−ｃ、Ｎ ａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　ＵＳＡ）第８６巻４５５４−４５５８頁 （１９８９）］は、ＢＭＰ−２Ｂの関連部分と２５％の相同性を共有する。ショ ウジヨウバエ属からの蛋白デカペンタブレシック遺伝子複合体、ＤＰＰ−Ｃ［パ ジェット等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第３２５巻８１−８４頁（１９８７） ］は、ＢＭＰ−２Ａ及びＢＭＰ−２Ｂの関連部分とそれぞれ２７％及び２８％の アミノ酸配列の一致を有する。本発明中量も好ましいのは成熟ＢＭＰ−２Ｂを分 泌するための前駆体部分としてのＢＭＰ−２Ａプレプロドメインの使用である。

発明を実施するための様式 本明細書中に開示されるベクターおよび方法は、広範囲の哺乳動物宿主セルライ ンにおける発現のための使用に好適である。

一般に、例えば大腸菌のような原核生物の菌株が、目的とするベクターのクロー ニング、増幅、または保存に好ましい。ベクターＤＮＡはある種の原核生物から 容易に入手できるｏ　Ｅ、ｃｏｌ　１Ｋ１２菌株ＭＭ２９４　（ＡＴＣＣＮｏ、 ３１４４６）はこの目的にとって特に有用であり、Ｅ、ｃｏｌｉＢ及びＥ、ｃｏ ｌｉＸ１７７６　（ＡＴＣＣＮｏ、３１５３７）もまた同様である。一般に、１ ノブリコン及び宿主細胞と両立し得る種から誘導された対照配列を含むプラスミ ドベクターが、これら原核生物宿主と共に使用される。このベクターは通常、複 製サイト並びに形質転換された細胞における表現型による選択を提供可能にする 標識配列を有する。例えば大腸菌は、典型的には大腸菌菌株から誘導されるプラ スミドｐＢＲ３２２を用いて形質転換される［例えばポリバー等、ジーン（Ｇ　 ｅ　ｎ　ｅ）第２巻９５頁（１９７７）を参照されたい］。ｐＢＲ３２２はアン ピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、よって形質転換された細胞を 同定する容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２プラスミド、または他の微生物系 プラスミドまたはファージは、その微生物が選択マーカー遺伝子の発現に使用す ることのできるプロモーターを含むか、または含むよう修飾されなければならな い。

哺乳動物から誘導される細胞の培養は、組織培養法を用いた発現宿主として有用 である［ティシュ−・カルチ＋　−（Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ）、アカデ ミツク・プレス、クルーズ及びバタージン編（１９７３）］。このような有用な 宿主セルラインの例は、ＳＶ４０配列により形質転換されたサル腎臓ＣＶＩライ ン（ＣＯ３−７、ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５１）；ヒト胎児腎臓ライン［２９３、 グラハム等、ジャーナル・オス・ジェネラル・パイロロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　 Ｖｊｒｏｌ、）第３６巻５９頁（１９７７）］　：赤ん坊ハムスター腎臓細胞（ ＢＨＫ。

ＡＴＣＣＣＣＬ　１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞［Ｃｆ−［０，ウア ラウブ及びチェイシン、プロシーディングズ・オス・ザ・ナショナル・アカデミ −・オス・サイエンシスＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　Ｉ、Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、 ＵＳＡ）第７７巻４２１６頁（１，９８０）ｌマウスセルトリ細胞［ＴＭ４、マ ザー、バイオロジー・オス・リプロダクション（Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐｒｏｄ、）第 ２３巻２４３−２５１頁（１９８０）］　；サル％ｌ臓細胞（Ｃｖ■、ＡＴＣＣ ＣＣＬ　７０）ニアフリカミトリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣＲ Ｌ−１５８７）：ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣＣＣＬ　２）：イヌ腎 臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ　３４）；バッファローラット肝臓細胞（Ｂ ＲＬ３ＡＳＡＴＣＣＣＲＬ　１４４２）；ヒ）肺細胞（Ｗ１３８、　ＡＴＣＣＣ ＣＬ　７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ　Ｇ２、ｆ（Ｂ　８０６５）；７ウス乳房 腫瘍細胞（ＭＭＴＯ６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）：ラット肝癌細胞［ＨＴ Ｃ，Ｍｌ、５４、バウマン等、ジャーナル・オス・セルラー・バイオロジー（Ｊ 、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）第８５巻１−８頁（１９８０）］　：及びＴＲＩ細胞 ［マザー等、アナシス・オス・ザ・ニューヨーク・アカデミ−・オス・サイエン シス（Ａｎｎａｌｓ　Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）第３８３巻４４−６８頁（ １９８２）］を包含する。本発明において最も好ましい哺乳動物宿主はＣＨＯお よび２９３セルラインである。

このような細胞のための発現ベクターは通常、転写、ＲＮＡプロセシング、また は翻訳のいずれかの調節に関与し得る、真核生物遺伝子の５゛及び３°末端にお ける特異的配列である、調節領域を含む。殆どの真核生物遺伝子の３゛末端には 、ｍＲＮＡのポリアデニル化付加のためのプロセシングの信号を送るＡＡＴＡＡ Ａ配列がある。

したがってこのベクターは典型的には、発現されるべき遺伝子の正面に位置する プロモーター、ポリアデニル化サイト、及び転写ターミネータ−配列を含み、こ れらはすべて本明細書中により詳細に述べられている。本ベクターは所望により 複製起点をも含む。さらにこのベクターは、プロモーターの後に、所望にょるス プライス単位の正面に位置する転写開始サイトを含み得るが、このスプライス単 位はコード化遺伝子の前に位置している。

好適な哺乳動物の発現ベクターの例はＥＰ３０７２４７号；２６０１４８号：３ ０９２３７号；及び３０７２４８号に見いだされる。

哺乳動物細胞での使用のための、発現ベクター上の調節機能は、しばしばウィル ス材料により提供される。例えば一般に用いられるプロモーターは、ポリオーマ 、アデノウィルス２、レトロウィルス、サイトメガロウィルス、及びサルウィル ス４０　（ＳＶ４０）のゲノムから誘導される。他のプロモーターはヘテロロー ガスな供給源からのもの、例えばベータアクチンプロモーターである。ＳＶ４０ ウィルスの初期及び後期プロモーターは、この両者がウィルスから、ＳＶ４０ウ ィルスの復製起点をも含むフラグメントとして容易に得られるため、特に有用で ある「フィアズ等、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）第２７３巻１１３頁（１９７８ ）］。ウィルスの複製起点に位置するＨｉｎｄｌｌ！サイトからＢｇｌＩサイト に至るおよそ２５０ｂｐの配列が含まれるならば、より小さなまたはより大きな ＳＶ４０フラグメントもまた使用できる。ヒトのサイトメガロウィルスの即時初 期プロモーターは簡便にはＨｔｎｄＩＩＩ制限フラグメントとして得られる。ブ リーナラエイ等、ジー：／（Ｇｅｎｅ）第１８巻３５５−３６０頁（１９８２） 、所望の遺伝子配列に通常付随するプロモーターまたは調節配列は、係る調節配 列が宿主縮約系に適合し得るならば、これを利用することも可能であり、またし ばしば望ましいことでもある。

所望のヘテロローガスなポリペプチドをコードしているＤＮＡの、より高等な真 核生物による転写は、ベクター中にエンハンサ−配列を挿入することにより増強 する。このエンハンサ−は通常的１０ないし３００ｂｐの、ＤＮＡのシス挙動要 素であって、プロモーターに働いてその転写−開始活性を増強する。エンハンサ −は相対的に方向及び位置に非依存性であり、転写単位に対する５°［レイミン ズ等、プロシーディングズ・オス・ザ・ナショナル・アカデミ−・オス・サイエ ンシスＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）第７８巻 ９９３頁（１９８１）及び３°［ラスキー等、モレキュラー・アンド・セルラー ・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅｌ　１．Ｂｔｏ、）第３巻１１０８頁（１９８３ ）］が、イントロン内部［バネルジ等、セル（Ｃｅｌｌ）第３３巻７２９頁（１ ９８３）］並びにコード化配列自身の内部に［オスポーン等、モレキュラー・ア ンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ　１．　Ｃｅ　ｌ　１．　Ｂ　ｉｏ、　） 第４巻１２９３頁（１９８４）］見いだされている。しかしながら、好ましくは このエンハンサ−要素は、本発明のためにはプロモーター配列の上流に位置する 。多くのエンハンサ−配列が現在哺乳動物の遺伝子から知られている（グロビン 、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロティン、及びインシュリン）。し かしながら典型的には真核生物細胞のウィルス由来のエンハンサ−を使用する。

例としては、複製起点の後ろ側のＳＶ４０エンハンサ−（ｂｐｌｏｏ−２７０） 　、サイトメガロウィルスの初期プロモーターエンハンサ−１複製起点の後ろ側 のポリオーマエンハンサ−１及びアデノウィルスエンハンサ−が包含される。一 つの好ましいエンハンサ−はＳＶ４０エンハンサ−領域である。

哺乳動物宿主細胞に使用される発現ベクターは、さらにポリアデニル化サイトを 含む。ポリアデニル化領域の例は、例えばＳＶ４０　（初期及び後期）またはＨ ＢＶのようなウィルスから誘導されるものである。

複製起点は、ＳＶ４０または他のウィルス（例えばポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ 、ＢＰＶ）供給源から誘導できる細胞外起点を含むようベクターを組み立てるこ とにより提供されるか、または宿主細胞によって提供されるか、いずれかである 。ベクターが宿生細胞の染色体中に統合されるならば、しばしば後者で充分であ る。

発現ベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を適当に含み得る。選択 遺伝子は、該ベクターにより形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要な 蛋白をコードしている。哺乳動物細胞のための適当な選択マーカーの例は、ジヒ ドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）　、またはネオマイ シンを包含する。このような選択マーカーが哺乳動物の宿主細胞中にうまく移動 すると、形質転換された哺乳動物宿主細胞は選択的条件の下に置かれた場合生存 することができる。

選択の様式には、二つの広（使用される別個の範躊がある。第一の範鴎は細胞の 代謝及び添加された培地に独立して増殖する能力を欠く突然変異セルラインの使 用に基づいている。二つの例がＣＨＯＤＨＦＲ細胞及びマウスＬＴＫ細胞である 。これらの細胞はチミジンまたはヒボキサンチンのような栄養素の添加無しに増 殖する能力を欠く。これらの細胞は完全なヌクレオチド合成経路に必要な成る遺 伝子を欠くため、欠けているヌクレオチドを添加培地に供給しなければ生存する ことができない。培地の補完に代わる方法は、無傷のＤ　ＨＦ　ＲまたはＴＫ遺 伝子を各々の遺伝子を欠く細胞中に導入し、これによりそれらの成長要件を変え ることである。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子によって形質転換されなかった個々の 細胞は、非添加培地中で生存することができないであろう。したがって、これら の細胞の直接選択は、添加栄養素の不在下における細胞増殖を必要とする。

第二の範喝は優位選択であって、これは突然変異セルラインの使用を必要としな い選択図式を意味する。この方法は、典型的には宿主細胞の増殖を阻止する薬物 を使用する。新規な遺伝子を有する細胞は、薬物耐性を有する蛋白を発現し、選 択下に生き残るであろう。優位選択に使用される薬物の例は、ネオマイシン［サ ザン及びバーブ、ジャーナル・オス・モレキュラー・アンド・アプライド・ジェ ネティクス（Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、）第１巻３２７頁（１９ ８２）］、マイコフェノール酸［ミュリガン及びバーブ、サイエンス（Ｓｃｉｅ ｎｃｅ）第２０９巻１４２２頁（１９８０）］、またはハイグロマイシン［サグ デン等、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ　１．　Ｃｅ　 Ｉ　Ｉ。

Ｂｉｏｌ、）第５巻４１０−４１３頁（１９８５）］を包含する。上に挙げた三 つの例は、真核生物の調節の下で、適当な薬物、即ち各々ネオマイシン（Ｇ４１ ８またはゲネティシン）、ｘｇｐｔ（マイコフェノール酸）またはハイグロマイ シンに対する耐性を運搬するための微生物遺伝子を用いる。

本発明方法を用いる一時的にトランスフェクトされた細胞培養により、極めて大 量のポリペプチドが産生される。また、安定な形質転換体は、天然のプロＢＭＰ −２配列による形質転換体より高いレベルのＢＭＰ−２を産生ずると予想される 。さらに、本発明方法は、細胞が二次的なコード化配列をコードしている別のベ クターにより同時にトランスフェクトされる場合、生産レベルをさらに向上させ ると予想される。一つの二次的コード化配列は、外部から調節されるパラメータ 、例えばメソトレキサート（ＭＴＸ）による影響を受けるジヒドロ葉酸還元酵素 （ＤＨＦＲ）を包含し、よってこのＭＴＸ濃度を調節することにより発現の調節 が可能となる。

使用され得る典型的な方法論 所望のコード化及び調節配列を含む好適なベクターの組み立ては、標準的組み替 え技術を使用する。単離したプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを開裂させ、 調整し、そして再うイゲーンヨンして所望のプラスミドを形成させる。

平滑末端が必要ならば、開裂させたＤＮＡ調製物をＤＮＡポリメラーゼＩ　（フ レノウフラグメント）またはＴ４ＤＮＡポリメラーゼで３７℃で３０分間処理し 、フェノール−クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈澱させる。３′突出末 端をいずれかの酵素の３°から５゛へのエキソヌクレオリティック作用により除 去し、そして５゛突出末端を、該フラグメントの末端に達するまで相補的ヌクレ オチドを組み合わせた５°から３′へのポリメラーゼ作用により平滑化する。

開裂させたフラグメントのサイズによる分離は、ゲラデル等、ヌクレイツク・ア シス・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）第８巻４０５７頁（ １９８０）により記載された６％ポリアクリルアミドゲルを用いて実施できる。

組み立てられたプラスミドにおける正しい配列を確認する分析のため、ライゲー ション混合物を典型的には大腸菌に１２菌株２９４　（Ａ、ＴＣＣ３１４４６） または他の適当な大腸菌菌株の形質転換に使用し、良好な形質転換体を適宜アン ビンリンまたはテトラサイクリン耐性により選択する。この形質転換体からプラ スミドを調製し、制限地図作成及び／またはメリック等、ヌクレイツク・アシス ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）第９巻３０９頁（１９８ １）の方法もしくはマクサム等、メソッズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ 、Ｅｎｚｙｍ、）第６５巻４９９頁（１９８０）の方法によるＤＮＡ配列決定に よっ゛Ｃ分析する。

この配列の増幅が望まれるならば、Ｄ　ＨＰ　Ｒ−蛋白コード化ＤＮＡ配列を哺 乳動物細胞の宿主中に導入し、安定なトランスフェクト体を培地中で選択する。

この宿主細胞培養を、ＤＨＦＲ活性の競合的阻害物質であるメソトレキサートお よそ２００−５００ｎＭの濃度の存在下で増殖させる。無論、有効な濃度範囲は ＤＨＦＲ遺伝子の性格及び宿主の性質に高度に依存する。明確に言って、普遍的 に定められた上限及び下限は確認することができない。Ｄ　ＨＦ　Ｒを阻害する 好適な濃度の他の葉酸類似体または他の化合物もまた使用することができる。し かしながらＭＴＸ自身が簡便であり容易に入手でき且つ有効である。

実施例及び請求項を単純化するため、頻繁に現われる方法を簡略な段落によって 言及する。

［トランスフェクション」とは、コード化配列が実際に発現されるか否かに拘ら ず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。例えばＣａＰＯ＜及び 電気穿孔のように、当業者には数多くのトランスフェクション方法が知られてい る。良好なトランスフェクションは一般に、宿主細胞内にこのベクターの作用の 何らかの徴候が存在する場合に認識される。

「形質転換」とは、ＤＮＡを生物中に導入し、その結果該ＤＮＡが染色体外要素 として、または染色体への統合により、複製可能となることを意味する。使用さ れる宿主細胞に応じて、形質転換は係る細胞にとって適当な標準的技術を用いて 行なわれる。Ｓ、　Ｎ、コーエン、プロシーデイングズ・オス・ザ・ナショナル ・アカデミ−・オス・サイエンシスＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　］、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）第６９巻２１１０頁（１９７２）；マンデル等、ジャーナル ・オス・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）第５３巻１５ ４頁（１９７０）：及びより近年においてはりルジエストローム等、ジーン（Ｇ ｅｎｅ）第４０巻２４１−２４６頁（１９８５）により記載された塩化カルシウ ムを使用するカルシウム処理が、原核生物または実質的な細胞壁障壁を含む池の 細胞に対して一般的に用いられる。このような細胞壁の無い哺乳動物細胞に対し ては、グラハム及びパン・デル・ニブ、パイロロジー（Ｖｔｒｏｌｏｇｙ）第５ ２巻４５６ｉ５７頁（１９７８）の燐酸カルシウム沈澱法が好ましい。補乳動物 細胞宿主系の形質転換の一般的態様は、アクセル［米国特許第４３９９２１６号 （１９８３年８月１６日登録）］によって記述されている。酵母中への形質転換 は典型的にはパン・ソーリンアン等、ジャーナル・オス・バクテリオロジ−（Ｊ 、Ｂａｃｔ、）第１３０巻９４６頁（１９７７）及びシャオ等、プロシーディン グズ・オス・ザ・ナショナル・アカデミ−・オス・サイエンシスＵＳＡ　（Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）第７６巻３８２９頁（１９７９） の方法に従って実施する。しかしながら、核注入またはプロトプラスト融合のよ うな、細胞中にＤＮＡを導入する他の方法もまた使用することができる。

「操作可能に連結した」とは、その要素の正常な機能が実行されるような並列を 意味する。即ち、対照配列に対して「操作可能に連結した」コード化配列とは、 該コード化配列がこれらの配列の制御の下に発現されることができ、且つ連結し ているＤＮＡは隣接しており、また分泌リーダーの場合は隣接し且つ読み取り相 にある、配置を意味する。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡ は、もしこれがポリペプチドの分泌に参加するプレ蛋白として発現されるならば 、そのポリペプチドのためのＤＮＡと操作可能に連結しており；プロモーターま たはエンハンサ−は、もしこれがコード化配列の転写を行なうならば、その配列 と操作可能に連結しており：または、リポゾーム結合サイトは、もしこれが翻訳 を促進するような位置にあれば、コード化配列と操作可能に連結している。連結 は簡便な制限サイトにおけるライゲーションにより達成される。そのようなサイ トが存在しない場合は、常法に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたは リンカ−を使用する。

「対照配列」とは、ある特定の宿主生物中で、操作可能に連結したコード化配列 を発現するのに必要なりＮＡ配列を意味する。原核生物に適当な対照配列は例え ばプロモーター、所望によりオペレーター配列、リボゾーム結合サイト、そして 恐らくはまだあまり配列の良くわかっていない他のものが包含される。真核生物 はプロモーター、ポリアデニル化信号、及びエンハンサ−を利用することがわか っている。

「発現系」とは、操作可能な連結で結びついた所望のコード化配列と対照配列と を含むＤＮＡ配列であって、その結果これらの配列により形質転換された宿主が コード化された蛋白を産生ずることができるようなりＮＡ配列を意味する。形質 転換を実施するためにこの発現系はベクター上に含まれていることもあるが、し かしながら関連するＤＮＡがしかる後宿主染色体中に統合されることもあり得る 。

本明細書中使用される「細胞」、「セルライン」、及び「細胞培養」は、互換性 を持って使用され、且つこれらの呼称は全て子孫を包含する。したがって「形質 転換体」または「形質転換された細胞」は、移動の回数に拘らず最初の形質転換 体及びそれから誘導された培養を包含する。さらに、全ての子孫は、故意のまた は偶然の突然変異のため、ＤＮＡ含量において正確に同一でないことがあること も理解される。元の形質転換された細胞において、スクリーニングされたのと同 じ機能を有する突然変異子孫が含まれる。明確な表示を意図する場合、これはそ の含量から明らかとなるであろう。

「プラスミド」は、その前及び／または後に大文字及び／または数字を伴う小文 字ｐによって表記される。本明細書における出発プラスミドは市販品を入手でき るか、限定されることなく一般に入手できるか、または入手できるこのようなプ ラスミドから、公開されている手法に従って組み立てることができる。さらに、 他の同等のプラスミドは当分野において既知であり、当業者には明らかであろう 。

ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡの特異的ヌクレオチド配列においてのみ働く酵素 を用いたＤＮＡの酵素的開裂を意味する。係る酵素は制限酵素と呼ばれ、各々が 特異的な配列は制限サイトと呼ばれる。本明細書中で用いられる様々な制限酵素 は市販品を入手することができ、その酵素の供給者が確立したそれらの反応条件 、補助因子、及びその他の要件を使用する。一般に制限酵素は、各制限酵素の元 来得られた微生物を表わす大文字とこれに続く他の文字、続いて特定の酵素を示 す数字から成る略語によって表記される。一般に、プラスミドまたはＤＮＡフラ グメント約１μｇは緩衝溶液約２０μｌ中の酵素的１−２単位と共に使用される 。特定の制限酵素に対する適当な緩衝液及び基質の量は製造者により特定されて いる。３７℃で約１時間のインキュベーションが通常用いられるが、供給者の指 示に従って変わり得る。インキュベーシヨンの後蛋白をフェノール及びクロロホ ルムによる抽出によって除去し、消化された核酸をエタノールを用いた沈澱によ って水性画分から回収する。適当ならば、制限酵素による消化に続いて、別のＤ ＮＡフラグメントが制限サイトに挿入されることを妨げる、ＤＮＡフラグメント の二つの端の「環化」または閉鎖した輪の形成を防ぐため、末端５゛燐酸塩の細 菌性アルカリホスファターゼ介在加水分解を行なう。別途記載の無い限りプラス ミドの消化の後に５゛末端脱燐酸化を行なうことはない。脱燐酸化の手法及び試 薬は常法通りである［マニアティス等、モレキュラー・クローニングニア・ラボ ラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ＋Ａ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）にューヨーク：コールド・スプリング・ハーバ− ・ラボラトリ−１１９８２）１３３−１３４頁］。

所定のＤＮＡフラグメントの制限消化物からの「回収」または「単離」とは、電 気泳動によるポリアクリルアミドまたはアガロースゲル上の該消化物の分離、既 知の分子量を有するマーカーＤＮＡフラグメントの移動度に対する目的フラグメ ントの移動度の比較による、目的フラグメントの同定、所望フラグメントを含む ゲル切片の除去、及びそのゲルのＤＮＡからの分離を意味する。この手法は一般 に知られている。例えば、Ｒ，ローン等、ヌクレイツク・アンス・リサーチ（Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）第９巻６１０３−６１１４頁（１９８１ ）、及びＤ　ボッデル等、ヌクレイツク・アンス・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　 Ａｃｊｄｓ　Ｒｅｓ、）第８巻４０５７頁（１９８０）を参照されたい。

［ライゲーションＪとは、二つの二本鎖核酸フラグメントの間にホスホジエステ ル結合を形成させる過程を意味する［Ｔ、マニアティス等、１９８２、上記１４ ６頁］。別途規定の無い限り、ライゲーションは既知の緩衝液及び条件を用いて 、はぼ当モル量のライゲーションされるべきＤＮＡフラグメント０．５μｇにつ き１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）によって達成することができ る。

形質転換体からのＤＮＡの「調製」とは、プラスミドＤＮＡを微生物培養から単 離することを意味する。別途規定の無い限り、マニアティス等、１９８２、上記 、９０頁のアルカリ性／ＳＤＳ法が使用できる。

「オリゴヌクレオチド」は、既知の方法［例えば１９８８年５月４日公開のＥＰ 特許公開第２６６０３２号に記載されるような固相技術を用いたホスホトリエス テル、ホスファイト、もしくはホスホアミダイト化学、または、フレーラー等、 ヌクレイツク・アンス・リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）第１４巻 ５３９９−５４０７頁（１９８６）に記載されるようなデオキシヌクレオシドＨ −ホスホナート中間体を経る］により化学的に合成される短い長さの一本鎖また は一本鎖ポリデオキシヌクレオチドである。次いでこれらをポリアクリルアミド ゲル上で精製する。

以下の実施例は、本発明の実施のために現在知られている個別的態様を説明する ことを意図するものであるが、本発明はこれに限定されるものと解釈されるべき ではない。

実施例Ｉ ＢＭＰ−２Ａ及びＢＭＰ−２８のｃＤＮＡを、標準的クローニング技術［サムプ ルツク等、モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ） 第二板（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク、１９ ８９）］を用いるヒトヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブ［ ウォツネイ等、上記］を使用してラムダｇｔ　１０において組み立てられたヒト 胎盤ｃＤＮＡライブラリーからクローニングした［ウルリッヒ等、ネイチャー（ Ｎａｔｕｒｅ）第３１３巻７５６−７６１頁）１９８５）］。使用したプローブ は以下の通りである（ここでイニシエーターＡＴＧは下線を付してあり、左から 右への方向が５°から３°への方向である）：ＢＭＰ−２Ａプローブ ＣＧＡＣＣΔＴＧＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＴＴＣＴＡＧＣＧＴ ＴＧＣＴＧＣＴＴＣＣＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＧＣＧ　（５’ 末端用） ＡＡＴＧＡＡＡＡＧＧＴＴＧＴＡＴＴＡＡＡＧＡＡＣＴＡＴＣＡＧＧＡＣＡＴＧ ＧＴＴＧＴＧＧＡＧＧＧＴＴＧＴＧＧＧＴＧＴＣＧＣ（３’末端用）ＢＭＰ−２ Ｂプローブ ＡＴＧＡＴＴＣＣＴＧＧＴＡＡＣＣＧＡＡＴＧＣＴＧＡＴＧＧＴＣＧＴＴＴＴＡ ＴＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＣＣＴＧＣＴＡＧＧＡＧＧＣＧＣＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴ ＡＧＴＴＴＧ　（５’末端用） ＣＡＧＧＡＧＡＴＧＧＴＡＧＴＡＧＡＧＧＧＡＴＧＴＧＧＧＴＧＣＣＧＣＴＧＡ ＧＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＣＣＴＴＧＡＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧ　（３’末端用）Ｂ ＭＰ−３に対するクローンは上と同様の方法を用いたところヒト胎盤ｃＤＮＡラ イブラリー中には見いだされなかった。ヒトヌクレオチド配列に基づくオリゴヌ クレオチドプライマー［ウォツネイ等、上記］を用いるＲＮＡのポリメラーゼ連 鎖反応増幅［ミュリス等、コールド・スプリング・ハーバ−・シンポジア・オン ・クラオンティタテイブ・バイオロジー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ　Ｓｙｍｐ、Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、）第５１巻２６３−２７３頁（１９８６ ）］により、幾つかのセルラインをＢＭＰ−３ＲＮＡの発現についてスクリーニ ングした。一つの陽性セルライン、Ｎ］−Ｈ６９ヒト小細胞肺癌［ガヅダー等、 キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）第４０巻３５０２−３５０７ 頁（１９８０）］が同定された。ｃＤＮＡライブラリーをｍＲＮＡから調製し、 標準的技術（サムプルツク等、上記）を用いてオリゴヌクレオチドプローブでス クリーニングした。プローブの配列は以下の通りである（ここで左から右への方 向が５゛から３′への方向である）：ＡＧＴＧＴＣＣＣＧＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣ ＧＧＧＡＧＣＣＧＡＣＧＣＧＣＣＧＣＧＣＧＧＧＴＡＣＣＴＡＧＣＣ（５°末端 用）ＴＡＣＣＣＴＡＡＣＡ、ＴＧＡＣＡＧＴＡＧＡＧＴＣＴＴＧＣＧＣＴＴＧＣ ＡＧＡＴＡＡＣＣＴＧＧＣＡＡＡＧＡ　（３’末端用）ＢＭＰ−２Ａ、ＢＭＰ〜 ２Ｂ、及びＢＭＰ−３１白についての陽性のラムダｇｔ１．０クローンを同定し 、これらのクローンを配列決定した。ＢＭＰ−２Ａ及びＢＭＰ−２Ｂ蛋白の全長 をコードしている配列決定されたクローンを５ａｌｌで消化した。発現ベクター ｐＲＫ５　［８９年３月１５日公開のＥＰ３０７２４７号］ちまた５ａｌＩで消 化し、ゲルから単離した大きなフラグメントを各ＢＭＰをコードしているｃＤＮ Ａｓａ　Ｉ　Ｉ消化物とライゲーションして、各々ＢＭＰ−２Ａ及びＢＭＰ−２ Ｂに対する発現プラスミドｐＲＫ５．ｂｍｐ２ａ及びｐＲＫ５゜ｂｍｐ２ｂを作 り出した。

ＢＭＰ−３蛋白の全長をコードしている配列決定されたクローンをＥｃｏＲＩで 消化した。ｐＲＫ５もまたＥｃｏＲＩで消化し、ゲルから単離した大きなフラグ メントを、ＢＭＰ−３をコードしているｃＤＮＡＥｃｏＲＩ消化物とライゲーシ ョンして発現プラスミドｐＲＫ５．ｂｍｐ３を作り出した。

ヒト胎児腎臓セルライン（２９３）［グラハム等、上記］を１０％牛脂児血清（ ＦＣＳ）を含有するＦ１２　：ＤＭＥＭ　ｃｉ　：　１）培地（ジブコ）中、５ Ｑｍｍの平板上で融合性となるまで増殖させ、燐酸カルシウム法［ゴーマン、Ｄ ＮＡクローニング（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）第１Ｉ巻（Ｄ、グローバー１り１ ４３−１９０頁（ＩＲＬ、オフスフオード、１９８５）コにより、三つのＢＭＰ 発現プラスミドのうちの一つを用いてトランスフェクトした。より詳細には、三 つのＢＭＰプラスミドＤＮＡのうちの一つ５−１０ｇｇをＶＡ　ＲＮＡ遺伝子（ テイマパーヤ等、セル（Ｃｅｌｌ）第３１巻５４３頁（１９８２））をコードし ているＤＮＡ１８ｇと混合し、０．２５Ｍ　ＣａＣｌｚ２５０／ｚｌに溶解した 。ここに２５０μ＋の５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，３５）　、２８０ｍＭ 　ＮａＣｌ、１　、　５　ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｐ　Ｏ＜を加え（ポルテックスで攪 拌しながら滴下する）、２５℃で５−１０分間沈澱を形成させた。次に懸濁させ た沈澱を細胞に加え、インキュベーター中で４−５時間落ち着かせた。次いで培 地を吸引除去し、細胞層をＦ１２　＋ＤＭＥＭ　（１：　１）５ｍｌで洗浄し、 燐酸塩緩衝化食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中２０％のグリセロール領　５ｍｌを３０秒 間で加えた。１０％牛脂児血清を含有するＦ１２　：ＤＭＥＭ　（１：　１）計 ５ｍｌを加え、吸引除去し、再び満たした。２４ないし４８時間後に１０％牛脂 児血清培地をシスティン及びメチオニンを除いた血清不含Ｆ１２：ＤＭＥＭ（１ ・１）と交換した。この細胞を、２００μＣｉ／ｍ１の３５３−システィン及び ２００μＣｉ／ｍｌの３５８−メチオニンの存在下で５％ＣＯＺ中３７℃で２時 間インキュベートした。次いで細胞層をＰＢＳで洗浄し、システィン及びメチオ ニンを含有するＦ１２　：　ＤＭＥＭ　（１：　１）を加え、細胞を５−７時間 インキュベートさせた。次に順化培地を集め、凍結乾燥により５倍に濃縮し、エ ンハンス（商標）（二ニー・イングランド・ヌクレアー）ゲルシンチレーション 液に浸漬した１５％ＳＤＳゲルにロードし、乾燥し、そして−８０℃で１２時間 フィルムに暴露した。順化培地の代謝性標識は、アクティビンまたはＴＧＦ−β ｃＤＮＡを含む類似ベクターのトランスフェクションと比較して低い、検出し得 るレベルの発現を示した。

ＢＭＰ−２Ａ％ＢＭＰ−２Ｂ、またはＢＭＰ−３によりトランスフェクトされた 細胞からの順化培地を以下のようにヘパリン−セファロースクロマトグラフィー により部分精製した。５ｍｌのヘパリン−セファロースＣＬ６Ｂ　（ファルマシ ア）カラムを最初４Ｍ尿素、２０ｍＭ）リスＣＩ　（ｐＨ７）で平衡化した。次 いで４Ｍ尿素、２０ｍＭトリスＣ１（ｐＨ７）中の順化培地をこのカラムにロー ドした。ロードした後、４Ｍ尿素、２０ｍＭ）リスＣＩ　（ｐＨ７）中の０．０ ．　１．０５及び２．ＯＭのＮａＣｌで画分を段階的に溶出した。各段階の両分 の骨形成活性をサンバス及びレディ（上記）の方法によりインビボで評価した。

ＢＭＰ−２Ａ及びＢＭＰ−２Ｂの両者は容易に立証し得る活性を有していたが、 ＢＭＰ−３の活性は立証がより困難であった。全てのトランスフェクションが生 物学的に活性な物質をもたらした訳ではない。これらのデータは、ＢＭＰ−３の 発現レベルは、天然の前駆体を用いるＢＭＰ−２Ａ及びＢＭＰ−２Ｂの発現レベ ルより実質上低いことを示唆している。

次に、成熟ＢＭＰ−２Ｂの生成及び分泌における前駆体領域の役割を調べた。

スプライスされてＢＭＰ−２８のＣ末端成熟成長因子となるＢＭＰ−２ＡのＮ末 端プロドメインをコードしているＤＮＡ　（その配列を図２に示すンを含む発現 プラスミドを組み立てた。このハイブリッドＢＭＰ−２Ａ／２Ｂ構築物は、ＢＭ Ｐ−２Ａ由来の残基１−２６８及びＢＭＰ−２Ｂの残基２７７−４０９から成る ４００のアミノ酸から成る蛋白をコードしている。このハイブリッドは、Ｂａ１ ｒサイトからＨｉｎｄＩ　ｒ　Ｉサイトまでの領域を除去し、これをＢＭＰ−２ Ｂプラスミド（ｐＲＫ５．ｂｍｐ２ｂ）由来の対応するＢａ１ｌからＨｉｎｄｌ 　Ｉ　Ｉフラグメントに置き換えることによって、ＢＭＰ−２Ａプラスミド（ｐ ＲＫ５．ｂｍｐ２ａ）から組み立てた。

得られた発現プラスミド（ｐＲＫ５．ｂｍｐ２／４　１．１と呼称）を図３八に 示す。ヌクレオチドの配列決定により、ウオツネイ等（上記）により報告された ものと比較してＢＭＰ−２Ａ配列に二つの相違が示された：即ちＡＴＧ出発コド ンに関して塩基２６１のＡがＧに置換されていること（これはサイレントである ）、そして塩基５７０におけるＡからＴへの置換の結果残基１９０のＴｈｒがＡ ｒｇとなっていることである（図１及び２の配列は１９０位に新たに発見された 相違を反映していない）。２Ａ／２Ｂ挿入配列を図３Ｂに示す。このプラスミド により形質転換された大腸菌ＭＭ２９４細胞（Ｅ、ｃｏｌ　１ＭＭ２９４／ｐＲ Ｋ５．ｂｍｐ２／４−１．１）は１９９０年５月２３日にＡＴＣＣ受理番号６８ ３３０の下でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクンヨンに寄託した。

ｐＲ，に５．ｂｍｐ２／４−ｉ、１、並びに比較目的のためのｐＲＫ５．ｂｍｐ ２ａ及びｐＲＫ５．ｂｍｐ２ｂを使用して上記と同じ方法により２９３細胞をト ランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞を３５３標識メチオニン及びシ スティン各２５０μＣｉ／ｍｌで４時間標識する外は上記と同じ方法を用いて代 謝的に標識した。次いでこれらを上記の方法を用いて１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲ ル（還元）に適用した。図４は、ＢＭＰ−２Ａ　（第１列）、ＢＭＰ−２Ａ／２ Ｂ（第２列）　、ＢＭＰ−２Ｂ　（第３列）、対照のｐＲＫ５プラスミド（第４ 列）のいずれかでトランスフェクトされた、またはプラスミド無しく第５列）の ２９３細胞からの、この順化培地（５ａｌｌ列）のゲル（還元）を−８０℃で１ ２時間露出した蛍光写真である。

ハイブリッドについては、それぞれプロ及び成熟型に対応する３６ｋＤ及び２３ ｋＤに強いバンドが見いだされた。ＢＭＰ−２Ａ全長の構築物は主として３６ｋ Ｄバンドのプロ型と少量の１８ｋＤ成熟型を発現したが、一方ＢＭＰ−２８全長 の構築物に関しては、少量の２３ＫＤ成熟バンドが見いだされるのみであった。

このようにＢＭＰ−２Ｂ成成熟態量をコードするＤＮＡの発現が天然のプロドメ インによる発現に比して極めて増強されることが観察された。

生物学的に活性な組み替えＢＭＰ−２Ｂホモニ量体を、ｐＲＫ５．ｂｍｐ２／４ −１．．１及びＶＡ　ＲＮＡ遺伝子をコードしているＤＮＡ　（ティマバーヤ等 、上記）で一時的にトランスフェクトした２９３培養（１５０ｍｍの皿）からの 順化培地３−１０リツトルから、皿当り２８μｇのｐＲＫ５．ｂｍｐ２／４−１ ゜１及び８μｇのＶＡ遺伝子を使用する外は上記のようにして精製した。グリセ ロールショックの１時間後、培地を血清不含培地［５μｇ／ｍｌヒトトランスフ ェリン、１０μｇ／ｍ！インシュリン、及び所望により１０μｇ／ｍ１表皮成長 因子を添加したＦｌ、２　：ＤＭＥＭ　（１：　１．）（マザー、バイオロジー ・オス・リブロダクシタン（Ｂｊｏｌ、Ｒｅｐｒｏｄ、）第２３巻２４３頁（１ ９８０）］　（各平板中２０ｍ１の培地）に交換した。細胞を２４時間インキュ ベートし、培地を収穫し、次いで新たな培地を加えた。細胞を再び２４時間イン キュベートし、培地を収穫し新たな培地を加えた。そしてこのサイクルを２４． ４８、及び７２時間の合計三つの収穫について再度反復した。

順化培地の銀染色５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルの強度により評価したところ、この収穫 条件の下では、ＢＭＰ−２Ｂは培地中に約２００ｎｇ／ｍ＋までを蓄積し、一方 バツクグラウンドの蛋白レベルは比較的低いままであった。蛋白は以下のように 精製した：３０ｍ１のヘパリン−セファロースＣＬ６Ｂカラム（ファルマシア） を最初に４Ｍ尿素、２０ｍＭトリスＣ１（ＤＨ７）で平衡化した。次いで４Ｍ尿 素、２０ｍＭトリスＣ１（ｐＨ７）に入れた順化培地をこのカラムにロードした 。

４Ｍ尿素中の０ないしＱ、５Ｍ　ＮａＣｌ、２０ｍＭトリスＣ１（ｐＨ７）の勾 配５００ｍ１を用いて画分を溶出した。１個の主要な蛋白バンドがプールされた 両分の５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に出現し、これは純度７０−８０％と評価された 。

プールされた両分をアミコン・セントリフン１０濃縮機で約１０倍に濃縮し、次 いで４Ｍ尿素、２０ｍＭトリス（ｐＨ７）で約１０倍に希釈した。希釈した物質 を１ｍｌのファルマシア　モノ−Ｑ　ＨＲ５１５カラムにロードし、４Ｍ尿素中 ０ないし０．３Ｍ　ＮａＣ１勾配（３０ｍｌ）、２０ｍＭトリス　（ｐＨ７）ｉ ：より溶出した。ピークの画分をプールし、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより約り５％純 度であることを測定した。プールした両分を０．１Ｍ酢酸で透析し、凍結乾燥し 、そして０．１Ｍ酢酸１ｍｌに再溶解した。

モノＱカラム溶出液の純度が不滴足なものと判断された場合はさらにＨＰＬＣ精 製工程を実施した。この工程は、モノＱカラムからのプールされた画分をビダッ クＣ４ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（１００ｘ２．１ｍｍ）に直接ロードすることを含 む。このＨＰＬＣカラムはＯないし４０％Ｎ−プロパツール、０．１ないし０゜ ０６％トリフルオロ酢酸の勾配３０ｍ１で溶出した。このプールされた第三工程 からの物質は、ＳＤＳゲル電気泳動により純度およそ９５％と判断された。この 物質を上記のように凍結乾燥し再溶解した。精製された成熟ＢＭＰ−２Ｂの最終 的収量を定量的アミノ酸分析によって測定した。三つの工程による調製により１ ０１１ｇ／ｌ（順化培地）が得られ、またはＳＤＳゲル分析に基づいた通算収率 はおよそ５％であった。

精製された成熟ＢＭＰ−２ＢのＮ末端アミノ酸配列決定により、ＢＭＰｉＡ／２ Ｂの残基２８５から始まる単一のアミノ末端配列が示された（ＢＭＰ−２Ｂの残 基２９４）。配列データを１８サイクルの間集め、これは図３Ｂにおいて下線を 付した配列と正確に合致した。重要性の低いその他の配列は観察されなかった。

トランスフェクトされた上清のＳＤＳゲル中に観察される顕著な３６Ｋｄのバン ドは、ＰＶＤＶ膜に移した後のアミノ末端配列決定によりプロ領域であると同定 された。残基２３及び２４の間の信号配列の開裂（、、、ＬＬＧＧＡＡＧ　＠Ｌ ＶＰＥＬＧＲＲＫＦＡＡＡ）は、フォノ・ヘイジュヌ、ヌクレイツク・アシス・ リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）第１４４巻６８３−６９０頁（１ ９８６）の重量マトリックス法による予想の通りであった。近傍のＲＲＫ配列で の開裂は観察されなかった。

ＳＤＳゲル電気泳動上での見かけの分子量が還元剤の不在下における３３Ｋｄか ら還元剤の存在下における２３Ｋｄに減少したことで示されるように、組み替え ＢＭＰ−２Ｂはジスルフィド結合で連結した二量体である。ＢＭＰ−２８はＮ− グリコジル化に対する二つの一致サイトを有する。

ＨＰＬＣ精製した組み替えＢＭＰ−２Ｂを、ＴＧＦ−β及び対照と共にレディ及 びサンバス（上記）の骨形成検定において試験した。この検定においてう、ソト の中に植え込んだインブラントは、脱ミネラル化骨粉２５ｍｇ、または、０．０ ゜５．２．０、もしくは６．０μｇの精製組み替えＢＭＰ−２Ｂまたは１μｇの 組み替え成熟ヒトＴＧＦ−β１　（１９８９年１２月１２日登録の米国特許第４ ８８６７４７号）と共に再構成したグアニジン−ＨＣｌ−抽出ＤＢＰ２５ｍｇま たはであった。このインブラントを１２日口の収穫し、カルシウム含量（図５Ａ ）を原子吸収分光光度法により測定し、アルカリフォスファターゼ含量（図５Ｂ ）をｐ−ニトロフェニルホスファートの加水分解により測定した。０．５及び２ ．０用量のＢＭＰ−２Ｂの二つの実験を行ない、図５に無地及び斜線入りの棒で 表示した。

カルシウム含量の著明な増加（幾らかのＢＭＰを含有するＤＢＰにさえ優る）が 用量２μｇのＢＭＰ−２Ｂについて見られ、一方０．５μｇ用量はアルカリホス ファターゼを増加させるに充分であった。１２日口の収穫の後、グアニジン−Ｈ Ｃｌ−抽出ＤＢＰのインブラントを単独で、または精製組み替えＢＭＰ−２Ｂ１ μｇで再構成して固定し、脱灰せずにマウントした。３ミクロンの切片を切り、 ヘマトキンリン及びエオシンで染色した。これらの染色された切片を顕微鏡で調 べると、カルシウム沈着の存在によって表わされる大量の骨の形成がＢＭＰ−２ Ｂで再構成されたインブラント中に示された。媒質のみを用いて再構成されたイ ンブラントは骨を形成しなかった。

上記のように調製されたＢＭＰ−３成熟領域を伴うＢＭＰ−２Ａプロドメインの 構築物（ｐＲＫ５．ｂｍｐ２ａの小さなりａｌｌからＨｉｎｄｌ［までのフラグ メントをｐＲＫ５．ｂｍｐ３からの対応するＢａ　Ｉ　ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　 Ｉフラグメントに置き換えることによる）を、上記のように２９３細胞中にトラ ンスフェクトした。この場合、発現レベルはＢＭＰ−２Ａ及びＢＭＰ−３につい ての天然のプロ配列の発現レベルと同楔度であった。この実験は、ＢＭＰ−２Ａ プロドメインはＢＭＰファミリー全体の全ての成員の発現レベルを改善する訳で はなく、ＢＭＰ−２フアミリーをコードしているＤＮＡの発現の増強に有効であ ることを示している。

ヘテロローガスな前駆体領域が生物活性二量体の分泌を改善する能力は、ＢＭＰ −２Ｂ成熟成長因子配列に対するＢＭＰ−２Ａ前駆体領域の優先性を反映するも のであるのかも知れない。この事は、ＢＭＰ−２フアミリーにおける生物学的に 活性な成熟二量体型の適正な発現及び折り畳みにおいて、この前駆体領域が重要 であることを確かに表わしている。

材料の寄託 以下の培養をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（１２３０１バー クローン・ドライブ、ロックビル、ＭＤ、ＵＳＡ）（Ａ、ＴＣＣ）に寄託した： 菌株　ＡＴＣＣ寄託番号　寄託日 ＭＭ２９４／ｐｌ？に５．　ｂａ＋ｐ２／４−１．１　６８３３０　１９９０年 ５月２３日この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペ スト条約及びそれに基づく規則（ブダペスト条約）の規定の下になされた。これ は生存可能な培養を寄託の日から３０年間維持することを保証するものである。

この生物は、ブダペスト条約の約定の下でＡＴＣＣにより入手できるようにされ 、且つ、関連する米国特許の登録時に、またはいずれが先であれ任意の米国また は外国特許出願が一般に公開された時に、その培養の子孫の永久且つ無制限の入 手可能性を保証し、そして、米国特許及び商標局局長が３５ＵＳＣ且１２２及び これに従う局長規則（８８６０Ｇ６３８に特に関連する３７ＣＦＲ５１，１４を 含む）に従って資格を付与すると決定した者に対する該子孫の入手可能性を保証 するジェネンテク・Ｉｎｃ、及びＡＴＣＣ間の合意に従属する。

欧州特許のめられる指示に関しては、寄託された微生物の試料は、欧州特許付与 の旨の公告まで、または該出願が拒絶されまたは取り下げられまたは取り下げら れたとみなされるまで、試料を要求する者により指名された専門家に係る試料を 交付することによってのみ、利用可能とされる（ＥＰＣ規則２８　（４））。

本出願の譲受人は、もしこの培養が適当な条件下で培養された場合に死滅または 失われまたは破壊されることがあれば、通告時に速やかに同一の培養の生存試料 と交換する事を了承した。寄託された菌株の利用可能性は、任意の政府当局によ りその特許法に従って付与された権利に違反して本発明を実施する許可とみなさ れるべきではない。

先に記された明細書は当業者にとって本発明を実施できるに充分であると考えら れる。寄託された実体は本発明の一態様の一つの例示を意図するものであり、機 能的に等価な任意の構築物が本発明の範囲内にあるのであるから、本発明は寄託 された構築物によりその範囲を限定されるべきではない。本明細書中の材料の寄 託は、ここに含まれる記述が本発明の最良の態様を包含するいかなる態様の実施 をも可能とするには不十分であるということの是認を構成する訳ではなく、また 、それの表わす特定の例示に請求項の範囲を限定すると解されるべきでもない。

実際には、本明細書中に示されそして表現されている事に加えて本発明の様々な 修飾が、先の記述から当業者には明らかとなり、且つ付随する請求項の範囲内に 含まれることになろう。

配列表 （１）　一般的情報 （ｉ）　特許出願人：ジェネンテク、インコーポレイテッド（ｉｉ）　発明の名 称：１１ｉ乳動物によるＢＭＰ−２フアミリーの発現（ｉｉｉ）　配列の数：１ ２ （ｆｖ）　連絡先： （Ａ）　名宛人：ジエネンテク、インコーポレイテッド（Ｂ）　通り：ポイント ・サン・ブルーノ・ブールバード４６０番（Ｃ）　市：サウス・サン・フランシ スコ（Ｄ）　州：カリフォルニア （Ｅ）　国：アメリカ合衆国 （Ｆ）　ＺＩＰ：９４０８０ （ｖ）　コンピューター解読書式 （Ａ）　媒体型＝５２５インチ、３６０Ｋｂフロツピーデイスク（Ｂ）　コンピ ューター：ＩＢＭＰＣ適合（Ｃ）　オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯ８ ／ＭＳ−ＤＯ５（Ｄ）　ソフトウェア：　Ｐａｔｉｎ　（ジエネンテク）（ｖｆ ）　本出願のデータ； （Ａ）　出願番号：　ＰＣＴ／ＵＳ　９１１０３５４０（Ｂ）　出願日：１９９ １年５月２０日（Ｃ）　分類： （ｖｉｉ）　優先権主張出願のデータ：（Ａ）　出願番号：Ｕ、Ｓ　Ｓｅｒ、　 Ｎｏ、０７１５２８．３００（Ｂ）　出願日：１９９０年５月２４日（ｖｉｆｉ ）　弁理士／代理人情報 （Ａ）　氏名・ハサク、　ジャネット　イー。

（Ｂ）　登録番号：２８．６１６ （Ｃ）　参照／整理番号　６２３ （ｉｘ）　電話連絡先情報。

（Ａ）　電話番号・４１５／２２６−１８９６（Ｂ）　ファックス番号＋４１５ ／９５２−９８８１（Ｃ）　テレックス：　９１０／３７１−７１６８（２）　 配列番号１の情報； （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ：６８　塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）　配列：配列番号１： （２）　配列番号２の情報： （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ二６０　塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）　配列：配列番号２゜ ＡＡＴＧＡ＾＾ＡＧＯｒＴＧτ入Ｔτ入入Ａ　ＧＡＡＣＴＡＴ（ＪＧ　ＧｋＣＡ ＴＧＧＴＴＧ　ＴＣＧＡＧＧＧｉＧ　５０（２）　配列番号３の情報・ （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さニア８　塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）　配列・配列番号３： （２）　配列番号４の情報： （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ二６３　塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）　配列：配列番号４： （２）　配列番号５の情報： （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ：５０　塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）　トポロジー、直鎖状 （ｘｌ）　配列　配列番号５ニ ー　ｘｃｔａｒｃｃｃｃｃ　Ａｃｃｃｘｃｃｃｅｃ　ＧＧＡＧＣＣＧｋＣＧ　Ｃ ＧＣＣＧＣＧＣＧＧ　ＧＴｋＣＣＴＡＧＣＣ’　５０（２）　配列番号６の情報 （１）　配列の特徴 （Ａ）　長さ　５０　塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）　トポロジー・直鎖状 （ｘｌ）　配列、配列番号６： ＴＡＣＣＣＴＡＡＣＡ　ＴＧＡＣＡＧＴ入ＧＡ　ＩＪＣＴＴＧ（：ＣｃＴ　ＴＧ ＣｋＧｋＴｋｋＣ３ＣｊｌＡＡＧＡ　５０（２）　配列番号７の情報： （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ；２０アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｃ）　トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）　配列：配列番号７： １、＊ｕ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｏ１ｙ＾ｌａ　Ａｌａ　Ｏｌｙ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　 Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｊｌｑｇ　Ａｒｇ　−ユ　５　１０　ユ５ Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｌｍ　Ａ１ｍ（２）　配列番号８の情報： （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ・３９６アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｃ）　トポロジー、直鎖状 （Ｘｌ）　配列：配列番号８： Ｍｅｔ　Ｖａｌ　八ｌａ　ＯＬｙ　Ｔｈｒ　入ｒｇ　Ｃｙｍ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　 Ａｌａ　Ｌａｕ　１．＊ｕ　Ｌｓｕ　Ｐｒｏ　Ｇ１ｎ１　Ｓ　１０　１５ ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｃ１ｙ　Ｇｌｙ＾１ａ＾ｌａ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｖ龜 Ｉ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　ＧＩＹ　Ａｒ９人ｘｑ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｌａ 　ＪＬｌａ　入１ａ　５ｅｒ　Ｓａｔ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｓａｔ　ｊａ ｒ　Ｇｉｎ　Ｐｒ。

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８０　Ｂ５　９０ Ｇｌｙ　Ｓｉｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｇｐ　Ｈｌｍ　入ｒｇ　Ｌｅｕ　 Ｇｌｕ　入ｒ９　Ａｌａ　Ａｌａ　ｓａｔ　Ａｚｇ９５　ユ００　ユ０５ Ａｌａ　入ａｎ　丁ｈｒ　Ｖａｎ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　ｕｓ　Ｉｒ１ｓ　 Ｇ１％Ｉ　Ｇ１％ｌ　Ｓｉｒ　Ｌａｕ　Ｏｌｕ　Ｏ１ｕユ１０　ｌユＳ　１２０ Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓａｔ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　 入ｒ９人ｒｇ　Ｐｈ＠　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｇｎ１２５　ユ３０　１３５ τｈｒ　Ａｌａ　Ａｌｎ　５ｅｒ　ＬｙＩＩ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ 　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　入１ｐ　Ｔｈｒ　へｒ９ユ８５　、　１９０　ユ９ ５ Ｌ＊ｕ　Ｖａｌ　Ａｇｎ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　入ユａ　Ｓａｔ　入ｒｇ　Ｔｒｐ　 Ｇｌｕ　ｓ＠ｒ　Ｐｈｓ　Ａｇｐ　Ｖａｌ　丁ｈｒＰｒｏ　入１ａ　Ｖａｉ　Ｍ ｅｔ　入ｒ９　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｒｉｇ　入１ａ　入 ａｎ　Ｈｊｂ＊　ＧｌｙＰｈ＠　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　ＶａＩ　Ａｌａ　Ｈ ｉｓ　Ｌ命ｖ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｅ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　５酊Ｌｙｓ 　入ｒｇ　ＨＬｍ　Ｖａｌ　入ｒｇ　Ｈｌｓ　ｊａｒ　Ａｒｇ　５＠ｒ　ＸＪｕ 　Ｈｌｓ　Ｇｉｎ　Ａｇｐ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓｇｅｒ　Ｔｒｐ　Ｓｓｒ　Ｇｉｎ　 エユｔａ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　丁ｈｒ　Ｐｈ＠　Ｇｌｙ 　１ｌｉｓ　ＡｓｐＧｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　！！ｉｓ　Ｐｒｏ　Ｌｓｕ　）Ｉ ｉｓ　Ｌｙ−人ｒｇｃユｕ　Ｌｙｍ　λｘｑ　Ｇｉｎ　入１ａ　Ｌｙｍ２７５　 ２Ｂ０　２８５ １１ｉｓ　ＬＹ＠　Ｇｉｎ　入ｒｇ　ＬｙＩＩ　Ａｒｇ　Ｌ台ｕ　Ｌｙｓ　Ｓｉ ｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｅ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｐｒ。

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３６５　コア０　３フ５ （２）　配列番号１０の情報： （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ；４００アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｃ）　トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）　配列：配列番号１０： Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　ｓｉｒ　Ｌｙｍ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　 入ｒｇ　Ｌ−ｍｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　テｈｒ　入ｒ９ユ８５　ユ９０　１９５ （２）　配列番号１１の情報： （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ：５６アミノ酸 （Ｂ）　型・アミノ酸 （Ｃ）　トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）　配列・配列番号１１： Ｌｙ−人ｒｇ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　５１１ｘ　 Ｌｓｕ　Ｈｉｓ　Ｇｉｎ　Ａｍｐ　Ｇｌｕ　Ｈｌｓｌ　５　ユ０　ユ５ ｓｅｒ　Ｔｒｐ　ｓａｒ　Ｇｉｎ　１１ｍ　入ｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌ＠ｕ　 Ｖａｌ　丁ｈｒ　Ｐｈｅ　Ｓｌｙ　！Ｉｉｓ　ＡｍｐＧＬｙ　Ｌｙｓ　Ｃ１ｙ　 Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｌｙｅ　ｋｘｑ　（ｉｌｕ　Ｌｙｓ　ｌｒｇ 　Ｇｉｎ　Ａｌａ　ＬｙｓＨ１ｓ　Ｌｙｅ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｅ　Ａｒｇ　 Ｌｅｕ　Ｌｙ８　Ｓｅｒ　Ｓｉｒ　ｅｙ＠Ｓｏ　５５　５６ ２）　配列番号１２の情報： （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ二６０アミノ酸 （Ｂ）　型アミノ酸 （Ｃ）　トポロジー・直鎖状 （ｘｌ）　配列・配列番号１２： ＧｌｙＧ１ｎＨｉｓＶａｌ入ｒｇＸ１＊５＠ｒＡｒｇＳｉｒＬｅｕＩ’ｒｏＧｉ ｎＧユｙ５ｅｒＧユｙ５１０ｉｓ Ａｍｎ　Ａｓｎ　Ａｌａ　ＧＬｎ　Ｌｅｕ　入ｒｇ　Ｐｒｏ　ＸＪｕ　Ｌｅｕ　 Ｖａｌ　丁ｈｘ　Ｐｈａ　Ｇｌｙ　Ｈｉ−λ５ｐＧｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　）Ｉ ｉｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　入ｒｇ　Ａｒｇ　λｒ９　ＡＩＪＩ　 Ｌｙ−人ｒｇ　５ａｒＰｒｏ　Ｌｙｍ　Ｈｌｍ　ＨＬｍ　Ｓｅｔ　Ｇｉｎ　Ａｒ ｇ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｌｙｍ　Ｌｙｓ　入ｓｎ　Ｌｙｍ　Ａｍｎ　ＣｙｓＳｏ　 ５５　６０ ＦＩＧ、　４ ＢＭＰ−２Ｂ　ＴＧＦ−Ｂ μ９／インフ“ランＦ ＦＩＧ、５Ａ ＢＭＰ−２Ｂ　ＴＧＦ−１３ μ９／インフ゛ラント ＦＩＧ、５Ｂ 要約書 ＢＭＰ−２以外の哺乳動物蛋白の前駆体部分をコードしているＤＮＡがその上流 にある、成熟ＢＭＰ−２をコードしているＤＮＡからなるＤＮＡ構築物が提供さ れる。係るＤＮＡ構築物を含む哺乳動物の発現ベクター及び宿主並びに係る構築 物を使用する改良された発現方法もまた提供される。

、、　、、ＰＣＴ／ＩＪｓ　９１／、０３５４０

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．その上流がＢＭＰ−２以外の哺乳動物蛋白の前駆体部分をコードしているＤ ＮＡである、成熟ＢＭＰ−２をコードしているＤＮＡを含むＤＮＡ構築物。
2. ２．該ＢＭＰ−２がヒトＢＭＰ−２である請求項１のＤＮＡ構築物。
3. ３．該ＢＭＰ−２がヒトＢＭＰ−２Ｂである請求項２のＤＮＡ構築物。
4. ４．前駆体部分が信号配列を含む請求項１のＤＮＡ構築物。
5. ５．前駆体部分が、ＢＭＰ−２前駆体のＮ末端からＢＭＰ−２の成熟領域中の最 初のシステイン残基までのＢＭＰ−２の天然の前駆体部分に対して、少なくとも ２５％のアミノ酸配列の一致を有する、請求項１のＤＮＡ構築物。
6. ６．前駆体部分が、異なったＢＭＰ−２に由来する、請求項５のＤＮＡ構築物。
7. ７．成熟ＢＭＰ−２が成熟ＢＭＰ−２Ｂであり、前駆体部分がＢＭＰ−２Ａに由 来する、請求項６のＤＮＡ構築物。
8. ８．ＢＭＰ−２Ａ及ひＢＭＰ−２ＢがヒトＢＭＰである請求項７のＤＮＡ構築物 。
9. ９．請求項１のＤＮＡ構築物を含む発現ベクター。
10. １０．請求項５のＤＮＡ構築物を含む発現ベクター。
11. １１．請求項７のＤＮＡ構築物を含む発現ベクター。
12. １２．ｐＲＫ５．ｂｍｐ２／４−１．１である請求項１１の発現ベクター。
13. １３．請求項９の発現ベクターにより形質転換された哺乳動物宿主。
14. １４．請求項１０の発現ベクターにより形質転換された哺乳動物宿主。
15. １５．請求項１１の発現ベクターにより形質転換された哺乳動物宿主。
16. １６．請求項１２の発現ベクターにより形質転換された哺乳動物宿主。
17. １７．ＡＴＣＣ番号６８３３０として寄託された請求項１２の発現ベクターによ り形質転換された大腸菌宿主。
18. １８．２９３またはチャイニーズハムスター卵巣セルラインである請求項１３の 宿主。
19. １９．哺乳動物細胞においてＢＭＰ−２をコードしているＤＮＡを発現する方法 において、請求項１３の宿主を宿主として使用することからなる改善。
20. ２０．哺乳動物細胞においてＢＭＰ−２をコードしているＤＮＡを発現する方法 において、請求項１４の宿主を宿主として使用することからなる改善。
21. ２１．哺乳動物細胞においてＢＭＰ−２をコードしているＤＮＡを発現する方法 において、請求項１５の宿主を宿主として使用することからなる改善。
22. ２２．哺乳動物細胞においてＢＭＰ−２ＢをコードしているＤＮＡを発現する方 法において、請求項１６の宿主を宿主として使用することからなる改善。