JPH04505607A - 骨誘導タンパク - Google Patents
骨誘導タンパクInfo
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- JPH04505607A JPH04505607A JP1504762A JP50476289A JPH04505607A JP H04505607 A JPH04505607 A JP H04505607A JP 1504762 A JP1504762 A JP 1504762A JP 50476289 A JP50476289 A JP 50476289A JP H04505607 A JPH04505607 A JP H04505607A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、タンパク化学および骨形成に関する。さらに詳細には1本発明は、骨
成長を誘導するタンパク、移植、および該タンパクを含む薬剤組成物、そのよう
な組成物を用いて骨成長を促進する方法、骨髄始原細胞を刺激して骨髄細胞に分
裂分化させる方法、および、骨発生および/または骨吸収の機能傷害/機能不全
に関連した病気(例えば、骨粗髭症)の処置方法に関する。
背景技術
生体系と接触して置かれたときに、新しい骨の形成を刺激することのできる物質
を骨が含んでいるという事は周知であれ、これを精製しようとする試みがなされ
てきた。”骨形態形底タンパク”(BMP)は、尿素または塩酸グアニジンを用
いて鉱物質除去骨から抽出され、 Uristの米国特許Nα4.294.75
3および4.455.256に従って再沈澱されている。その後、Uristは
、この粗タンパク混合物をイオン交換によって精製すると、 pH4,8でカル
ボキシメチルセルロース樹脂(CMC)に吸680−685およびProc N
atl Acad 5cience (USA) (1984) 81:371
−375において、 Uristは、 BMPが17.500ダルトンおよび1
8、500ダルトンの分子量を有することを報告している。llr istのヨ
ーロッパ特許出願公開No、0212474においては、 4,000−7゜0
00ダルトンのBMPフラグメントが、 BMPの制限加水分解によって得られ
ることが述べられている。米国特許Nα4.608.199には30.000−
32.000ダルトンの骨誘導性タンパクが述べられている。そのタンパクは水
溶性でコンカナバリンA (Con A)に対して親和力がないと述べられてい
る。
NO88100205には4つのタンパク(BMP−1,BMP−2クラスエ。
BMP−2クラスII、 BIJP−3と命名されている)が報告されており、
それらのタンパクはそれ自身によってまたは他のファクターとの組合せにより骨
形成活性を有すると主張されている。
これらタンパクの各々に対して配列が与えられ、それらは本発明の骨形成タンパ
クの配列(後述)に対して相同性を示さない。
5eyedinおよびThomasの米国特許Nα4.434.094は、骨発
生を刺激する。骨誘導性タンパクの部分精製(カオトロピック試薬を用いた抽出
、陰イオンと陽イオン交換カラムでの分画。
およびCMCに吸着されたフラクションからpH4,8における活性回収につい
て報告している。この新しいタンパクフラクションは、”骨形成ファクター”(
叶)と命名され、約30.000ダルトンを下まわる分子量を有すると特徴づけ
られた。
本出願人による米国特許Nα4.774.332には、米国特許Nα4゜434
、094に開示されたのと類似の方法により均一に精製された2つのタンパクに
ついて述べられている。これら2つのタンパクは、約150−200mMのNa
C1グラジェントによりCMCから溶出された。これら2つのタンパクは、もと
もと、軟骨誘導ファクター(CIF)AおよびCIF Bと呼ばれていた。その
後、 CIFAは、それまでに同定されており形質転換成長因子−β(TGF−
β)と呼ばれているタンパクと同一であることがわかった。
CIF Bは、 TGF−βの新規な形であることがわかり、今ではTGF−β
2として知られている。
本出願人による米国特許Nα4.627.982は米国特許4.434.094
のCMC結合フラクション中に存在する次のような部分精製した骨誘導ファクタ
ーに関係する。上記部分精製前誘導ファクターはCIF AおよびC1l’ B
の大部分が溶出されたものより低いNaC1グラジエント (つまり、約150
mM NaCl未満)の一部において溶出される。本発明は、そのフラクション
の活性成分の同定に関する。このことについては、特許が出願されたときには、
骨誘導活性が単一タンパクによるものであるのか。
あるいは、複数のタンパクが協力的に作用するのかが知られていなかった。骨′
誘導活性の原因となるタンパクの同定は。
次のような原因により難しかった。つまりフラクション中に多くのタンパク (
数百あると見積られていた)が存在すること、骨誘導活性についてのインビトロ
における確定的なアッセイが行われていなかったこと、およびフラクション中の
他のタンパクから活性タンパクを単離するのが一般に難しいこと、のような原因
により困難であった。実際、骨誘導タンパクを次のような精製レベルでCMC結
合フラクションから得るために1種々のタンパク分画法を試みたが、出願人は、
約3年の努力を要した。上記精製レベルとは、このタンパクが配列決定可能であ
り、かつ粗フラクション中に見出される活性の原因であると同定され得るレベル
である。
以下で詳しく論じるように、上記フラクションの骨誘導活性は、ドデシル硫酸ナ
トリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SO3−PAGB)分析で測定した
ときに約20.000−28.000ダルトン(グリコジル化された状態)の可
変的な分子量(明らかに、グリコジル化のバリエーションによる)を有する糖タ
ンパク成分によることがわかってきた。活性成分のアミノ酸配列は、それが、以
前に報告されたどのような配列とも異なる配列を有するタンパクにより構成され
ることを示す。
発明の開示
本発明は、@乳類のインビボにおいて骨形成を誘導する実質的に純粋なポリペプ
チドに関する。
それゆえ1本発明の1つの局面は1次のa、b、c、 dおよびeでなる群から
選択される内部配列を有する。実質的に純粋な骨形成活性を有するポリペプチド
;およびそれらと実質的に同等であり、そして実質的に相同である実質的に純粋
なポリペプチドである。
(以下余白)
a ) −Lys −Tyr −As n−Lys −I 1e−Lys−5e
r−Arq−Gly−I 1e−Lys −Ala −As n−Thr−Ph
e−Lys −Lys−Leu −Hls −As n−Leu−5er−Ph
e−Leu−Tyr−Leu−Asp−Hj−s−Asn−Ala−Leu−G
lu−;b) −Leu−His−Asn−Leu−5er−Phe−Leu−
Tyr−Leu−Mp−His−As n−Al a−Leu−Glu−5er
−Va 1−Pro−Leu−Asn−Leu−Pro−Glu −;c )
−5er−Leu−Arg−Val −I 1e−His −Leu−Gln−
Phe−As n−As n −11e −Thr−5er−Z 1e−Thr
−As p−Asp−Thr−Phe−Cys −Lys −Al a −;d
) −AL a−As n−As p−Thr−5er−Tyr−工1e−A
rg−Asp−Arg−工1e−Gl u−Glu−工1 e−Arg−Leu
−Glu−Gly−As n−Pro−Va l−Z le−;el −Gly
−Asn−Pro−Val−Ile−Leu−Gly−Lys−His−Pro
−Asn−5Ia r −P he −I l e −C’/S −Leu−L
’/S −Mq−Leu −P rO−X le −G IY−S@ 秩|Ty
r −;
および/または次のカルボキシ末端配列−kxg−Leu−Pro−X 1 e
−Gly−5er−Tyr−X 1e−A5P−(CooH)。
本発明の他の局面は1次のアミノ酸配列を有する実質的に純粋な骨形成活性ポリ
ペプチド:およびそれらと実質的に同等でありかつ実質的に相同なポリペプチド
である。
(以下余白)
Asn−Leu−5er−Phe−Leu−Tyr−Lau−Asp−His−
Asn−Ala−Leu−GLu−5er−Val−Pro−Leu−Asn−
Leu−Pro−Glu−5er−Leu−Arg−VaL−11e−His−
Leu−Gln−Phe−Asn−Asn−11e−Thr−5er41e−T
hr−Agp−Asp−Thr−Asn−5er−Phe−工1e−Cys−L
eu−Lys−Arg−Lau−Pro−工1e−Gly−5er−Tyr−1
1e−Asp−(COOH) 。
本発明の他の局面はインビボで骨形成または骨髄細胞形成を誘導するための組成
物であり、該組成物は、(80種もしくはそれ以上の、効果的な量の上述の骨形
成活性ポリペプチド。
および(C)薬学上に受容可能なキャリアと組合わせた(b)効果的な量のTG
F−β、を含有する。
本発明の他の局面は、所望の部位においてインビボで骨形成を誘導する方法であ
り、該方法は、哺乳類の上記の部位において、上述の組成物を移植することを包
含する。
本発明のさらに他の局面は、生きている哺乳類において骨髄細胞生成を誘導する
方法であり、該方法は、上述のポリペプチド1種以上を効果的な量で哺乳類に全
身投与することを包含する。
本発明の他の局面は、不十分な骨形成および/または所望されない骨吸収によっ
て特徴付けられる状況において個体を処置する方法であり、該方法は、上述のポ
リペプチドの1種もしくはそれ以上を効果的な量で個体に全身投与することを包
含する。
本発明のさらに他の局面は、造血系の癌において、生きている哺乳類を処置する
方法(該方法において、哺乳類は腫瘍性造血細胞を殺すために照射を受ける)で
あって、該方法は。
次の工程を包含する:造血幹細胞の分裂を抑制するために充分な量のTGP−β
を照射前に哺乳類全身投与すること、および造血幹細胞の分裂を刺激するために
上述のポリペプチドの1種もしくはそれ以上を効果的な量で照射した後に、哺乳
類に全身投与することを包含する。
本発明の他の局面は、鉱物質除去骨から、実質的に純粋な骨形成活性タンパク組
成物を単離する方法であって、該方法は次の工程を包含する:
(a)非線維性タンパクを可溶化するカオトロピック性(解離性)抽出剤を用い
て鉱物質除去骨を抽出する工程;(b)上記(a)工程で得られる抽出物をゲル
濾過にかけ1分子量約2.000−36.000ダルトンのタンパクを含むフラ
クションを回収する工程;
(C)上記(b)工程で得られるフラクションを、変成条件下において、pH約
4.5〜5.5においてカルボキシメチルセルロース陽イオン交換体に吸着させ
ること;
(d)約10mM〜約150mMの塩化ナトリウムグラジェントで、陽イオン交
換体からフラクションを溶出させること;(e)上記(社)工程で得られる溶出
液をCan A架橋カラムに吸着させること:
(f)上記(e)工程のカラムから結合したタンパクを溶出させること:
(g)上記(f)工程で得られる溶出液をヘパリン−セファロースカラムに吸着
させること;
(5)上記((至)工程のカラムから結合したタンパクを溶出させること;およ
び
(i)上記(社)工程の溶出液を、トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系を用い
てRP−HPLCカラムのクロマトグラフィーにかけ。
約42−45%アセトニトリルでカラムから溶出したフラクションとして、実質
的に純粋な骨形成活性タンパク組成物を回収すること。
本発明のさらなる局面は1組換え物質(つまり1組換えDNA。
組換えベクター、および組換え細胞または微生物)、および本発明の骨形成タン
パクを調整する方法である。
図面の簡単な説明
図面において:
第1図は、鉱物質が除去されたウシの骨から骨形成タンパクを単離するのに使用
する方法のフローチャートである。
第2図は、実施例(C)項のゲル濾過フラクションのゲル濾過フラクションの光
学密度(280nmでの吸光度)を示すグラフである。
第3図は、実施例(D)項の予備イオン交換クロマトグラフィーで得た溶出フラ
クションの光学密度(280nmでの吸光度)を示すグラフである。
第4図は、実施例(E)項の架橋したCon Aクロマトグラフィ一工程で得た
溶出フラクションの光学密度(280nmでの吸光度)を示すグラフである。
lE5図ハ、 実施例(F)項のヘパリン−セファロースクロマトグラフィ一工
程で得た溶出フラクションの光学密度(280nmでの吸光度)を示すグラフで
ある。で得たグラジェントフラクションの(230nmにおける吸光度)第6図
は、実施例(G)項のCl8−RP−HPLCクロマトグラフイ一工程で得たグ
ラジェントフラクションの光学密度(230nmでの吸光度)を示すグラフであ
る。
第7図は9本発明の骨形成活性単離物のアミノ酸配列決定の結果および全配列に
おける配列決定されたフラグメントの位置を示す表である。
第8図は、実施例(H)項において述べられている精製された骨形成タンパクの
5O3−PAGE分析のオートラジオグラフィーの写真である。 (レーンAお
よびCはグリコジル化されたタンパクを示し;レーンBおよびDは、酵素的に脱
グリコジル化されたタンパクを示す。)
第9図は、実施例(I、3およびI、4)項において述べられたアッセイの結果
を示す棒グラフである。
第10図は、実施例(J、 1)項において述べられたアッセイの結果を示す棒
グラフである。
第11図は、実施例(J、3)項において述べられたテストの結果を示す棒グラ
フである。
ヒト、サル、ウシ環よびラット由来の骨誘導タンパクは。
異種個体内の移植片において軟骨内性骨を生成する能力について非極特異的であ
るということが示されている(Sampath。
観点から、ここで述べられているウシタンパクが哺乳類の種間において高度に保
存されてきたということが信じられている。つまり、異なった哺乳類種(ここで
は1種アナログと呼ばれる)由来の対応する骨誘導タンパクは、ウシタンパクと
は異なる。実質的に相同なアミノ酸配列を有する。上記実質的に相同なアミノ酸
配列とは、たとえ相違があったとしても。
それは、1つもしくはそれ以上のアミノ酸残基の付加、欠失。
あるいは置換であり、および/または、骨形成を誘導する分子の非極特異的能力
に影響を及ぼさないような類似のグリコジル化パターンである。これに関連して
、 「実質的に同等な」および「実質的に相同な」という用語は9種または調製
方法に関係なく、実施例で述べたウシの骨形成タンパクと同一のアミノ酸配列を
有するタンパク;および類似であるが異なったアミノ酸配列を有するタンパク(
この違いは非種特異的軟骨内性骨誘導活性を妨げるような影響を及ぼさない)を
意味する。そのような”実質的に相同な”タンパクのアミノ酸配列は1通常、こ
こで述べるウシの配列に少なくとも50%相同であり、さらに通常、少なくとも
80%相同であり、そして好ましくは少なくとも90%相同である。したがって
、そのようなタンパクは、異なる哺乳類起源の骨から誘導され得、あるいは1組
換えIINAの手法を用いて合成され得る。その用語は。
当該技術分野で知られている次のような方法により変化した天然タンパクの変異
体またはアナログを含み得る。例えば。
不適当なジスルフィド結合を避けるために中性(荷電していない)アミノ酸の活
性に必須ではないシスティンを置換すること:タンパクの残基のアスパラギンが
結合したグリコジル化部位を置換もしくは欠失させてグリコジル化パターンを変
えること:活性には不必要なメチオニンを置換することにより、該分子の酸化性
を低下させること、1つもしくはそれ以上の残基を化学修飾すること;あるいは
、側鎖糖を除去または変質させること。天然源から精製によって調製されるタン
パク源は、好適には、入手が容易であるという点から、ブタもしくはウシの長骨
である。
(以下余白)
骨から骨形成タンパクを単離する方法は次の通りである。
まず、骨を機械的にまたは研磨技術を用いてきれいにし、断片にし、洗浄を行な
う。洗浄には1例えば希釈した酸の水溶液(低温が望ましい)が用いられる。次
に1種々の形で存在するリン酸カルシウム類を除去することによって鉱物質が除
去される。これは通常1強酸により抽出することにより行われる。これらの方法
は、当該技術分野において周知であり。
例えば、米国特許Nα4.434.094に開示されている。得られた調製物(
鉱物質除去骨)は、天然源から得られ、請求の範囲に記載の骨形成タンパクを調
製する際の出発物質である。
最初の抽出は、鉱物質除去骨から非線維質タンパク (例えば、非コラーゲン)
を除去する目的で行なわれる。これは。
塩酸グアニジン(少なくとも約4M)、尿素(8M)および塩、またはドデシル
硫酸ナトリウム(少なくとも約1容量%)。
または当該技術分野で知られているような他のカオトロピック解または変性しや
すい度合を減少させるために、抽出は。
好ましくは低温で行う。必要に応じてプロテアーゼインヒビターが抽出剤に添加
され得る。媒体のpHは1選択した抽出剤に依存する。一般に抽出プロセスには
約4時間から1日のオーダーの時間がかかる。
抽出後、抽出剤を適当な手段(例えば、水に対する透析)で除去する。必要に応
じて限外濾過による濃縮が先に行われ得る。調節された電気泳動、あるいは分子
ふるい、あるいは当該技術分野で知られている他のいかなる方法によってもまた
。塩を除去することができる。また、タンパクの変性を最小限にするためにこの
工程の間、低温を維持するのが望ましい。あるいは、抽出剤であるカオトロピッ
ク試薬の除去を必要とせず、その溶液を9例えば限外濾過で濃縮することだけを
必要とする。
抽出物cカオトロピック試薬中に溶解しているかまたは再溶解している)を限外
濾過にかけ、約20.000−36.000ダルトンの範囲の分子量のフラクシ
ョンを得る。ゲルのサイズ分類は標準的方法で行われ、好ましくは室温(10℃
−25℃)でセファクリルS−200カラムを用いて行われる。
その後、サイズ分類されフラクションは、6M尿素のような非イオン性カオトロ
ピック試薬の存在下で、約pH4,5〜5.2゜好ましくは約pH4,8で、
CMCを用いたイオン交換クロマトグラフィーにかけられる。他の陽イオン交換
体も使用され得。
それには、ポリアクリルアミドおよび架橋デキストランから誘導されたものが含
まれる。しかし、セルロース陽イオン交換体が好ましい。もちろん、どのような
イオン交換法の場合とも同じように、カラムにかける前にその溶液中には競合イ
オンがないようにしなければならない。その因子はカラムに吸着し、約10−一
約150mMの範囲で上昇する塩濃度グラジェントで溶出される。このフラクシ
ョンを便宜上”CMB−1”と命名する。
CMB−1を凍結乾燥し、乾燥CMB−1を水溶性デオキシコール酸ナトリウム
(DO[’)、 pH8,0,中に溶解させる。この溶液を。
平衡化した樹脂架Jtfj[”onAカラムでアフィニティークロマトグラフィ
ーにかける。ConA結合物質をDOC水溶液(置換糖類を含む)で樹脂から溶
出させる。このフラクションを便宜上”CAB−1’と命名する。
CAB−1ハ、ヘパリン−セファロースバッファー、6M尿素。
0、I M NaC1,50mM Trjs−H[’]、 pH7,2,で平衡
化したGH−25カラムで脱塩することにより、ヘパリン−セファロースクロマ
トグラフィーにおいて再平衡化される。その脱塩フラクションを、ヘパリン−セ
ファロースカラム中にかける。洗浄後。
結合した物質を0.5M NaC1の塩濃度の同じバッファーを用いて、カラム
から溶出させる。得られた溶出液を2便宜上”)ISB−1”と命名する。
HSB−1を希釈し、pH2に調整した後、 Cl8−RP−HPLCカラムに
かける。結合したタンパクは、0.1%TFA水溶液中に90%のアセトニトリ
ルを含む溶液でなる溶媒(溶媒B)を用いてカラムからグラジェント溶出された
。本発明の骨形成タンパクは、約47−50%の溶媒B (42−45%アセト
ニトリル)で溶出する。
C18クロマトグラフィーによって溶出したタンパクを、クロラミンT法によっ
てヨウ化した。5O3−PAGEおよびオートラジオグラフィーによるフラクシ
ョンの分析により、骨形成りンバクを含む20.000〜28.000ダルトン
の幅広い主バンドが示される。タンパクの”斑点(smea r i ng)″
は主として1分子がグリコジル化により不均質化した結果であるか、もしくはお
そらく、翻訳後の種々の修飾またはタンパク分解の結果であると考えられる。酵
素によるまたは化学的な脱グリコジル化の後、タンパクを5O3−PAGEによ
る分析にかけると、約9600ダルトンの単一バンドが得られる。ジチオスレイ
トールを用いた脱グリコジル化タンパクの還元は、その移動に影響を及ぼさない
。
グリコジル化タンパクの最初のアミノ酸配列分析によって。
そのタンパクN末端部分中に次の内部配列(internal 5equenc
e)を有することがわかったニ
ーLys −Tyr−As n−Lys −I le−Lys−5er−Arg
−Gly−I le −Lys −Ala −As n−Thr−Phe−Ly
s −Lys−Leu−His −As n−Leu−5er−Phe−X−T
yr−Thr−Asp−His−Asn−ALa−Leu−Glu−上の配列に
おける最初のアミノ酸(Lys)は、N末端に最も近い。まず、Xと命名された
残基について得たシグナルの性質からは、この残基を同定することができなかっ
た。繰り返し配列決定を行うこと、そして、エンドプロテイナーゼLys−C(
Lys残基の位置でタンパクを分解する酵素)による分解物およびエンドプロテ
イナーゼGlu−C(GLU残基の位置でタンパクを分解する酵素)による分解
物の配列決定を行うことにより。
次のことが明らかになった。
上記配列にはN末端であるAla残基が先行すること、Xと命名した残基はLe
uであること、2番目のThr残基(上記配列では26番目の残基)は間違いで
あり、実際にはこの残基はLeu残基であること、そして、単離物は約106個
のアミノ酸のタンパクでなるということが明らかとなった。第7図には。
これらの配列分析の結果が示されている。記号”Cll0”は糖置換基を示す。
記号”CO叶”はカルボキシル基を表し、そしてカルボキシ末端を示す。第1の
カラム(左側)には上述のN末端フラグメントの配列分析が記載されている。2
番目、4番目および6番目のカラムには単離物の主要な3種のLys−Cフラグ
メントの配列が記載されている。
第7図で示されるフラグメントの位置付けにおいては9種々のフラグメントを明
らかにオーバーラツプさせることに基づいている。この位置付けに基づいた最も
信頼度の高いタンパク配列は1次の通りである:
Asn−Leu−5er−Phe−Leu−Tyr−Leu−Asp−His−
Asn−Ala−Leu−Glu−5er−Val−Pro−Leu−Asn−
Leu−Pro−Glu−5er−Leu−Arg−Val−11e−His−
Leu−Gln−Phe−Asn−Asn−11e−Thr−5er−41e−
Thr−Asp−Asp−Thr−Phe−Cys−Lys−Ala−Asn−
Asp−Thr−5er−Tyr−11e−Arg−Asp−Arg−11e−
Glu−Glu−ILe−Arg−Leu−Glu−Gly−Asn−Pro−
Val−11e−Leu−Gly−Lys−His−Pro−Asn−5er−
Phe−ILe−Cys−Leu−Lys−Arg−Leu−Pro−11e−
GLy−5er−Tyr−11e−Asp−(COOH)。
この配列は9分析技術の性質上、m定的なものではないということが理解される
。従って、上記配列は全く正確であるとは言えないかもしれない。その配列は、
タンパクについて遺伝子を同定し、その遺伝子を配列決定し、そして、そこから
アミノ酸配列を演鐸することによって確証され得る。
単離した脱グリコジル化タンパクのアミノ酸組成分析は。
過ギ酸酸化を伴い、もしくは伴わずに行われる(過ギ酸酸化によりシスティン酸
残基が検出され得る)。これらの分析の結果を次に示す。
過ギ酸酸化なし 過ギ酸酸化あり
Phe 3 3
Lys 7 6
Met O0
Cys NO2
合計 8383(863)
I AspおよびAsn の両者を含む。
2 GluおよびGin の両者を含む。
NO=検出されない。
33つのTyr残基を含む。
※5DS−PAGEにより測定された分子量約9600に基づくタンパクのアミ
ノ酸組成を決定するために、タンパクを0.1%フェノールを含む6N HCl
中にて110℃で24時間加水分解した。Cys残基の存在を調べるために、加
水分解に先立って行った。ベックマン6300アナライザーを用い、ニンヒドリ
ン検出によりアミノ酸を検出した。分析技術の精度を考慮するとこれらの組成は
近似にすぎないということが理解されるべきである。さらに、 5OS−PAG
Eにより決定された分子量はアミノ酸配列分析から推定された分子量と一致して
おらず、その推定値よりも実質上低いことが明らかである。
本発明は、天然に存在している他の分子を実質的に含まない、実質的に純粋な形
の骨形成タンパクを提供する。このことに関連して、′″実質的に純粋な”とい
う用語は、約30重量%未満の汚染タンパク、好ましくは約10%未満の汚染タ
ンパク、最も好ましくは約5重量%未滴の汚染タンパクを含む組成物を意味する
。”実質的に純粋な”という用語は、骨形成タンパクが自然界で関連しているタ
ンパクに関して使用され。
骨形成タンパクが非タンパク球の薬剤キャリアーもしくは賦形剤、あるいはタン
パク様の薬剤キャリアーもしくは賦形剤と混合されるような組成物を排除するこ
とを意図するものではない。本発明はまた4部分的にグリコジル化された。ある
いは全く脱グリコジル化された形の新しい骨形成タンパクを提供する(それら
の両者とも”脱グリコジル化された”と表現される)。”骨形成”という用語は
、単独でまたは補因子と組み合わせて新しい骨形成を誘導し得る能力を意味する
。
骨形成活性についての分析は以下の実施例で述べる。
本発明の骨形成タンパクのさらに詳しい特徴付けは、当該技術分野の既知の方法
を用いて行われ得る。それにより、その等電点電気泳動パターン、等電点、プロ
テアーゼあるいは他の化学薬品(例えば、酸または塩基)による分解のしやすさ
の度合、そして他の物質(例えば、その他のレクチン類)への親和力などが測定
され得る。
(以下余白)
上記のアミノ酸配列に基づいて、決定されたアミノ酸配列の一部またはすべてに
対するコドンを含むオリゴヌクレオチドプローブを調製し、骨形成タンパクをコ
ードする遺伝子および骨形成活性をもつ関連タンパクをコードする実質的に相同
な遺伝子のための[]NAライブラリーをスクリーニングするために使用する。
上記相同な遺伝子は、@乳類または動物の他の種(例えば、鳥類)由来であり得
、または関連する遺伝子の集団(fami13’)の他の成員でもあり得る。核
酸ハイブリダイゼーションによるスクリーニングと同様にオリゴヌクレチドプロ
ーブやDNAライブラリーを調製する為の基本的戦略は。
当業者にはよく知られている。例えば、 DNAクローニング(DNACLON
ING) ; Vol、l(D、M、Glover ed、1985);核酸ハ
イブリダイゼーション (NUCLEICACID )IYB旧旧ZATION
) (B、 D、Hames andS、J、Higginseds、 198
5) ;オリゴヌクレオチド合成((lLIGONLICLEOTIDE SY
NTHBSIS)(M、J、Gate ed、1984); T、Maniat
is。
E、F、 Fr1sch & J、 Sambrook、分子クローニング(M
OLECULARCLONING)二実験用マニュアル(A [、ABORAT
[lRY MANIIAL) (1982>を参照のこと。
まず、 DNAライブラリーを調製する。同定したタンパクがウシのものなので
、まずウシライブラリーをプローブし、完全な長さのクローンを見つけ、そして
この完全な長さのウシのクローンを用いて他の哺乳類種のライブラリーをプロー
ブすることにより他の種の骨形成タンパク遺伝子(そして、従って、アミノ酸配
列)を同定することが論理的である。そのライブラリーはゲノムDNAライブラ
リーから構成され得る。ウシおよびヒトゲノムライブラリーは当該技術分野にお
いて知られている。例えば、 Lavnら、細胞(Cell) (1978)1
5:1157−1174を参照のこと。また、 DNAライブラリーは逆転写に
よってポリ−A RNA (mRNA)フラクションから調製されたcDNAか
ら構成され得る。例えば、米国特許第4.446.235号;4.440.85
9号;4、433.140号;4.431.740号;4.370.417号;
4.363.877号を参照のこと。mRNAは、該ファクターを発現する適当
な細胞系または組織から単離される。骨形成に関係する細胞(例、骨芽細胞)か
らのライブラリー、あるいは骨腫瘍(例、骨肉腫系)からのライブラリーは、お
そらく骨形成タンパク核酸のためのプローブ源である。そのような細胞系の代表
例は、ヒト羊膜系WISH(ATCC[:[:L25)、ヒト骨肉腫系TE−8
5(ATCCCRL1547)とMG63(ATCCCRL1427)、ヒト前
立腺癌系PC−3(ATCCCRL1435)。
ラット骨肉腫系11MR−106(ATCCCRL16f31)、およびマウス
骨肉腫系D [INN (叶Jital Ghanata、 アラバマ医科大学
(Universityof Alabama Medical 5chool
)から入手できる)であり、 cDNA(またはゲノムDNA)はライブラリー
構成のための適当なベクター中にクローニングされる。好ましいベクターはバク
テリオファージベクターである (例えば、ファージλ)。適当なライブラリー
の構築は、当該分野の技術の範囲内である。
一度ライブラリーが構築されると、このライブラリーをプローブするためにオリ
ゴヌクレオチドが調製され、そして必要な骨形成タンパク遺伝子を単離するため
に使用される。オリゴヌクレオチドは適当な方法によって合成され得る。この選
択された特定のヌクレオチド配列は、上記骨形成タンパクの既知のアミノ酸配列
を、コードするコドンに一致するように選択される。遺伝子コードは冗長なので
、可能なヌクレオチド配列(これはタンパクの特別領域をコードする)のすべて
、あるいは合理的な数をカバーするために数種のオリゴヌクレオチドを合成する
ことがしばしば必要とされ得る。このように、プローブに基づく領域を選択する
際に、その領域はコドンが高度に変質(degenerate) シているアミ
ノ酸を含まないことが1通常好ましい。しかしながら、哺乳類では稀な。
これからライブラリーが調製されるコドンを含むプローブを調製することは必要
でない。ある場合においては、当業者はかなり長い、そして/または、アミノ酸
配列(この配列は。
対応する核酸配列中において、特にこの長さおよび/または冗長領域が上記タン
パクに非常に特徴的である場合には、かなりの程度の冗長性を有し得る)の領域
を包含するプローブを調製することが望ましい。完全な遺伝子あるいはゲノムの
実質的な部分をカバーするプローブもまた適当であり得るが。
それは予想される相同の程度に依存する。そのような場合は。
例えば、ウシの骨形成タンパクのc DNAが対応するヒトの骨形成タンパクの
ためのヒト遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために使われる場合である
。また、単一ハイブリダイゼーションの実験において遺伝子の異なったそれぞれ
の領域に2つのプローブ(またはプローブのセット)、を使用することも望まし
い。自動オリゴヌクレオチド合成により比較的直線伸長されたプローブの大群の
調製物が得られた。使用されたプローブの正確な長さは重要でないが、一般的に
、約14〜約20塩基対のプローブが通常効果的であることが技術的に認められ
ている。約25〜約60塩基対という、さらに長いプローブもまた使用され得る
。
上記選択されたオリゴヌクレオチドプローブは、標準方法により、放射性ヌクレ
オチドまたはビオチンのようなマーカーを用いて標識される。その後、標識され
たプローブのセットをスクリーニング工程に使用する。尚、このスクリーニング
工程は、単一ストランドブローブに、標準方法に従って。
ライブラリーから単離した5sDNAに対してハイブリダイゼーションさせるこ
とから成る。ストリンジェントなまたは許容的なハイブリダイゼーション条件は
適当であり得るが、これはプローブの長さ、プローブがライブラリーと同じ種か
ら誘導されているか否か、または進化的に近い種から誘導されているかまたは遠
い種から誘導されているかなどの種々のファクターに依存する。適当な条件の選
択は、当該分野の技術の範囲内である。一般的には、核酸ハイブリダイゼーショ
ン(NUCLEICACID )lYBRrDIZATION)、前出、を参照
のこと。基本的な必要条件は、ハイブリダイゼーション条件が9選択的なハイブ
リダイゼーションが生じるように充分にストリンジェントであること;即ち、ハ
イブリダイゼーションは、非特異的に結合するのではなく、充分な程度の核酸相
同(例えば。
少なくとも約75%)によるのである。スクリーニングされたライブラリー由来
のクローンがポジティブハイブリダイゼーションによって固定された場合は、そ
れは、制限酵素分析やDNAシークエンシング法(特定のライブラリーインサー
トが骨形成タンパクのための遺伝子を含む)によって確認できる。
もしくは、骨形成タンパクのためのDNAコード配列は、タンパクのアミノ酸配
列に対するコドンを含有する重複オリゴヌクレオチドから合成して調製できる。
そのようなオリゴヌクレオチドは標準方法によって調製され、完全なコード配列
中に組み立てられる。例えば、 Edge、 Nature(1981)292
ニア56;Nmbairら、5cience(1984)223:1299;J
ayら、、J Biol Chem(1984) 259 :6311を参照の
こと。
したがって、上述の技術の1つ以上を用いて骨形成ポリペプチドをコードする組
換えポリヌクレオチドを調製し、単離し得る。ここで使用する“組換えポリヌク
レオチドという用語は、ゲノム起源、 cDNA起源、半合成起源1合成起源、
のポリヌクレオチドをさして言う。このポリヌクレオチドは。
その起源あるいは操作によって、(1)天然において、またはライブラリーの形
態において関連する核酸のすべてまたは一部と関連せず、(2)天然において連
結しないポリヌクレオチドに連結し、あるいは(3)天然には見られないポリヌ
クレオチドである。
く以下余白)
骨形成タンパクをコードする配列を含む組換えDNA分子は。
どんな適当なベクターにおいてもクローン化され得、それによって、骨形成タン
パクのコード配列を含まないベクターを実質的に含まない組成物(たとえば、他
のライブラリークローン)中に維持される。多数のクローニングベクターが当業
者に知られており、適当なりローニングベクターの選択が問題となる。クローニ
ングのための組換えDNAベクターおよびそれらが形質転換する宿主細胞には次
のものが含まれる。即性細菌>、 pLAFRl(グラム陰性細菌>、 pME
290(E、coliでないグ(酵母)、そしてウシの乳頭腫ウィルス (@乳
類細胞)である。
一般的には、 DNAクローニング(DNA CLONING) : Vol、
I & II 。
前出1分子クローニング(MOLECULARCLONING) : A LA
BORATORY MANUAL、前出
本発明の1つの実施態様において骨形成タンパク遺伝子のためのコード配列は、
プロモーター、リポソーム結合部位(細菌の発現(express 1on)の
ための)、そして必要に応じてオペレーター(ここでは”調節”配列とまとめて
称する)の調節下に置かれるので、骨形成タンパクをコードするDNA配列(こ
こでは”コード配列と称する)は、ベクターによって形質転換された宿主細胞に
おいてRN八に転写される。コードする配列は、シグナルペプチドまたはリーダ
ー配列を含んでいても含まなくてもよい。成熟タンパクの開始点およびシグナル
ペプチドの終結点の決定は、成熟タンパクのN−末端アミノ酸配列から容易に決
定される。また、骨形成タン)<りは。
N−末端で異種アミノ酸配列が発現される融合タン)<りの形で発現され得る。
例えば、米国特許第4.431.739号;第4.425゜437号を参照のこ
と。
組換えベクターは、骨形成タンパクをコードする配列が。
適当な調節配列と共に、ベクター中に位置するように構成され、そして調節配列
に関する骨形成タンパクコード配列の位置および配向は、上記コード配列が上記
調節配列の調節下で転写される(即ち、 DNA分子に付着するRNAポリメラ
ーゼによって)ようにされる。上記調節配列は、上述のクローニングベクターの
ようなベクター中に挿入する前にコード配列に連結され得る。もしくは、上記コ
ード配列は、すでに調節配列および調節配列の下流(downstream)に
適当な制限部位を含む発現ベクター中に直接クローン化され得る。
原核生物および酵母における骨形成タンパクコード配列の発現に対しては、調節
配列はコード配列に対して非相同であり得る。選択された宿主細胞が哺乳類細胞
であれば、調節配列は、骨形成タンパクコード配列に対して非相同または相同で
あり得、そのコード配列はゲノムDNA、 cDNAまたは合成りNAであり得
る。ゲノムのまたはcDNAのコード配列のどちらか−方は酵母で発現され得る
。天然の分子と同様のグリコジル化が要求される場合は、その遺伝子は、酵母か
哺乳類細胞(CO3゜CHD、またはcv−i細胞において、ベクターや従来技
術の中で知られる方法を用いて発現され得る。これについて2選択濃度での最初
のテストは、完全に脱グリコジル化したタンパクが活性でないということを実験
的に示す。この理由として。
グリコジル化に影響することができる真核細胞中の発現は。
組換え法によって活性なタンパクを造るために必須であり得る。
多くの原核細胞発現ベクターは従来技術の中で知られている。例えば、米国特許
第4.440.859号;第4.436.815号;第4゜431、740号;
第4.431.739号;第4.428.941号;第4.425.437号;
第4.418.149号;第4.411.994号:第4.366、246号;
第4.342゜832号を参照のこと。また、英国特許明細書第2.121.0
54号;第2.008.123号;第2.007.675号;欧州特許明細書第
103.395号。酵母の発現ベクターは従来技術において知られている。
例えば、米国特許第4.446.235号;第4.443.539号;第4.4
30゜428号を参照のこと、または欧州特許明細書第103.409号;第1
00、561号;第96.491号を参照のこと。
組換え骨形成タンパクは、上述の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞
を、骨形成タンパクを精製する条件下で増殖することによって生成できる。その
後、骨形成タンパクを宿主細胞から単離し精製する。発現系が増殖培地中に骨形
成タンパクを分泌する場合は、そのタンパクは直接無細胞特表平4−50560
7 (9)
培地から精製できる。組換えタンパクが分泌しない場合は。
それは細胞溶解質から単離される。適当な増殖条件や回収方法の選択は丞該技術
分野の技術の範囲内であるかまたは天然の骨形成タンパクを単離するために使用
する回収方法から明白である。組換えタンパクは9本発明に従って生成された抗
体を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって回収され得る。組換え
骨形成タンパクはグリコジル化されない場合もあり得、それを生成するために使
用する宿主に依存する天然分子と異なるグリコジル化パターンを有することもあ
り得る。上で示した通り、脱グリコジル化タンパクは活性でない場合もあり得る
。しなしから、このことは、上記タンノぐりのシーケンシャルエピトープを認識
する抗体を造るのに有益である。
天然の、脱グルコシル化された。あるいは合成の(組換え)骨形成タンパクのど
れか1つを抗体生成(ポリクローナルとモノクローナルの両方とも)に使用でき
る。”抗体”という用語は、抗原結合フラグメントやキメラ構造物と同様にどん
なイソタイプまたは種の全1gも含むことを意図している。ポリクローナル抗体
が必要な場合は、精製した骨形成タンパクを選択した哺乳類(例えば、マウス、
ウサギ、ヤギ、ウマ等)に免疫するために使用する。その後、免疫された動物由
来の血清を集め、既知の方法に従って処理した。骨形成タンパクに加えて1種々
の抗原に対するポリクローナル抗体を含む組成物は、実質的に次に示すような抗
体を含まずに造ることができる。上記抗体は、骨形成タンパクが結合しているカ
ラムにその組成物を通すことによって作られるが、抗骨形成タンパク抗体ではな
い。洗浄後、骨形成タンパクに対するポリクローナル抗体をカラムから溶出する
。また、モノクローナル抗骨形成タンパク抗体は当業者によって容易に生成でき
る。
ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作る一般的方法論は有名である。
また、永久増殖性のの抗体精製細胞系は。
融合ではなく他の技術(例えば、腫瘍DNAを用いたB 1773球の直接形質
転換またはエプスタイン−バールウィルス(Epstain−Barr vir
us)によるトランスフェクション)によって作製できる。例えば、M、5ch
reierら、ハイブリドーマ技術()IYBRIDOMA TE[:HNIQ
IJBS) (1980) ; Hammerlingら、モノクローナル抗体
とT細胞ハイブリドーマ(MONOCLONAL ANTIBODIES AN
OT−CELL HYBRIDOMAS) (1981) ; Kennett
ら、モノクローナル抗体(MONO[:LONAL ANTIBODIBS)
(1980)。
モノクローナル抗体の生成に対して永久増殖性としたB細胞の源を免疫する際に
、抗原として骨形成タンパク(天然の。
脱グリコジル化した。または合成の)を使用することによって、骨形成タンパク
分子の異なる部位でエピトープを認識するモノクローナル抗体のパネルが得られ
る。タンパクの結合領域中でエピトープを認識する抗体は、抗体とタンパクの競
争アッセイで容易に同定できる。骨形成タンパク上の部位を認識する抗体は1例
えば、細胞溶解質か醗酵培地からのタンパク精製の際に、タンパクの特徴付けの
際に、および免疫学的に関連したタンパクを同定する際に有用である。そのよう
に免疫学的に関連したタンパク(即ち、骨形成タンパクで共通のエピトープを示
す)は本発明の他の局面である。一般に当該技術で知られているように抗骨形成
タンパク抗体を固体支持体(例、カラムまたはラテックスビーズ)に固定しく不
動にし)、骨形成タンパクを含む溶液と接触させ、その溶液から分離する。固定
した抗体に結合した骨形成タンパクをその後溶出させる。
(以下余白)
骨形成性組成物
本発明の骨形成性タンパクは、骨が正常に形成されない環境において新規骨形成
を誘発するのに使用しつる。本タンパクは、従って、骨折の可能性を予防的に低
下させ9人工間節の固定を改善し、先天性または外傷誘発による骨欠損を修復さ
せるため、あるいは美容形成外科において使用することができる。本タンパクは
また。骨折修復、外科的に除去された骨の置換、あるいは歯周疾患によって損傷
された骨の修復。
あるいは他の歯または歯槽突起の修復過程におけるように。
骨が正常に形成される場合に骨形成を促進するためにも使用しうる。そのような
用途においては1本タンパクは所望する骨形成部位に、移植などにより局所的に
投与される。
本タンパクはまた。骨形成不全および/あるいは限局性。
部域性または広汎性骨粗しよう症のような望ましくないレベルの骨吸収に関連す
る適応症を治療するため、あるいは慢性および急性骨髄性白血病や他の造血系の
癌のような造血系の機能不全あるいは機能障害の治療において骨髄始原細胞を刺
激するため、あるいは照射後治療において骨髄幹細胞を刺激して分裂および分化
させるために7静脈経路のように全身的に投与してもよい。これに関しては、骨
髄幹細胞の増殖を抑制するため照射前にTGF−βを使用し、照射後かかる細胞
を刺激するため本発明のタンパクを使用してもよい。
骨形成性タンパク組成物の初期試験は、試験した濃度および処方において、非骨
性部位での骨誘発を達成するにはTGF−β活性を有するタンパクを同時投与す
る必要があることを示唆している。TGF−βが骨形成細胞の増殖を誘発し1本
発明の骨形成性タンパクがそれらの細胞の分化を誘発すると考えられる。この点
について、 TGF−β(丁GF−β1. TGF−β2. TGF−β族の他
の成員、あるいはそれらの混合物)は、抗炎症作用。
走化性作用等々のような補助的作用を通して骨誘発の過程を促進すると考えられ
る。そのような作用を示す他の分子も骨誘発の補助因子として有用であろう。該
タンパクは、言うまでもなく、他の濃度あるいは他の処方においても活性である
。
さらに、骨性部位では9作用部位あるいは全身適用において存在する内因性TC
P−βの量が十分であるので、 TGF−βを同時投与する必要はないと考えら
れる。
本発明の骨形成性タンパクは1通常、製薬学的に許容されつる固体または液体担
体と共に骨形成的に有効な量で、所望する作用部位への局所注入または移植用、
あるいは従来の非経口経路による全身投与に製剤される。好ましくは局所投与用
製剤は、所望する作用部位にタンパクを送達することができ、骨および軟骨を発
達させるための構造を提供しつる基質材料を含む。潜在的な基質を生分解性また
は非生分解性であり、かつ化学的または生物学的に定義されている。かかる材料
の例は、硫酸カルシウム、水酸化リン灰石、リン酸三カルシウム、ポリオルトエ
ステル、ポリアクチック−ポリグリコール酸共重合体、コラーゲン、バイオグラ
ス等々である。全身投与製剤は1代表的に、タンパク治療の非経口投与用に一般
に使用される液体賦形剤を含む。
本発明の骨形成性タンパクは、他の分子と結合してその水溶性、半減期を高め、
あるいは骨に結合する能力を増強しつる。たとえば、ポリエチレングリコールに
結合して水溶性を高めたり、ビスホスホネート (たとえば1−ヒドロキシエチ
リデン−1,1−ビスホスホン酸、ジクロロメチレンビスホスホン酸、および3
−アミノ−1−ヒドロキシプロピリデン−1,1−ビスホスホン酸)および螢光
色素(たとえばテトラサイクリン。
カルセイン青、キシレノール橙、カルセイン縁、オよびアリザリンコンブレキソ
ン赤)のような骨結合分子に結合して該タンパクを骨性部位に標的させることが
できる。タンパクへの結合分子として種々の物質が当該技術において周知であり
。
アルデヒド、カルボジイミドやその他の三官能成分が含まれる。
投与する骨形成性タンパクの量は、使用する担体、患者(年令、性別、病歴9種
)9部位、および治療の条件に応じて変動しうる。局所移植の場合には、製剤中
の骨形成性タンパク対担体の重量比は1代表的に約1:5,000〜1:50.
OOOの範囲内である。組成物中の骨形成性タンパク対TGF−βの重量比は通
常10:1〜1:10の範囲内である。移植片は、移植あるいは注射のような従
来の外科手術手法により、患者の体内のあらかじめ定められた部位に装着しつる
。
全身投与については、骨形成性タンパクの量は通常30g/kg体重から1mg
/kg体重の範囲である。TGF−βは、上記の比率で必要に応じて全身投与剤
に添加しつる。さらに、他の治療薬、たとえば骨粗しよう症の場合には、フッ化
物、カルシトニン、ビタミンD代謝産物、および副甲状腺ホルモンのような他の
治療薬と骨形成性タンパクを組合わせることが望ましいと考えられる。該タンパ
クはその作用に関して非極特異的であるので、競技用、愛玩動物、家畜およびヒ
トを含めて哺乳類全般を治療するのに使用しつる。
実施例
下記は1個々のサンプルに適用する際の天然骨形成性タンパクの精製工程ならび
に分離したタンパクの骨形成を例証することを意図している。本発明を限定する
ことは意図されてウシ中足骨を層場から新鮮入手し、氷上運搬した。すべての骨
膜および骨髄を高圧水で骨から洗い落とし、液体窒素冷却グラインダーを用いて
骨を断片に押し砕き、さらに液体窒素冷却粉砕機を用いて粉末状に粉砕した。粉
末化した骨を4℃の脱イオン水<81 /kg)中で20分間4回洗浄した。次
に同容量の4℃の脱イオン水で一晩洗浄した。骨粉末を0.5N HCI(21
1/kg)中4℃で5時間鉱物質除去した。酸をデカントし。
鉱物出除去した骨粉末を、洗浄液がpH>3に達するまで4℃の脱イオン水で数
回洗浄した。余分な水を吸引フィルターで除去した。
鉱物質除去した骨粉束を、4℃で16時間4Mグアニジン−)ICL。
10mM BDTA pH6,8(2j2/kg骨粉末)により抽出した。懸濁
液を吸引ろ過してグアニジン−HCl可溶性分画を回収し、 10,000ダル
トン遮断M (SIOYIOアミコンらせん形カートリッジ)を用いた限外ろ過
により少なくとも5倍に濃縮した。
4Mグアニジン−HClに再溶解したB工程の抽出物を、 4Mグアニジン−H
Cl、 0.02%ナトリウムアジド、および10mM BDTA。
pH6,8中に平衡させたセファクリルS−200カラムで分別した。
この分画を280mmにおける吸光度によりアッセイし、該分画を第2図に示す
ように集めた。第2図中く・・・〉で指示した分画が、最大活性を有する低分子
量(LMW、 10.00〜30.000ダルトン)のンパク分画である。この
分画をプールし、180容の脱イオン水を6回交換して透析し、凍結乾燥した。
凍結乾燥および透析(4℃)以外のすべての操作は室温で行なった。
D、イオン交換クロマトグラフィー
C工程のプール分画を6M尿素、 10mM NaCl、 1mM NEM、
50mM酢酸ナトリウム、 pH4,8に溶解し、 10.00Orpmで5分
間遠心分離した。上清を、同じ緩衝液中で平衡させたCM52 (市販のCMC
)カラムで分別した。同じ緩衝液中10mM〜400mM NaC1勾配および
総容量350m1を用いて27m1/時の流量で、結合タンパクをカラムから溶
出した。10〜150mM NaClで溶出したタンパク (第3図のく・・・
〉を採集し、110容の脱イオン水を6回交換して4日間透析し、凍結乾燥した
。上記のすべての操作は。
透析(4℃)を除いて室温で実施した。
上記のD工程で得た分画を、コンカナバリンA (ConA)−セファロース4
B (Pharmac ia)を用いたアフィニティークロマトグラフィーによ
って骨形成活性成分濃度を高めた。クロマトグラフィー中カラムからのCan
Aの浸出を本質的に最小限に抑えるため、に、P、キャンプベル(Campbe
ll)、口、■、マツクレナン(Mac Lennan)、 J Biok [
:hen (1981) 256: 4626で述べられているようにして樹脂
をグルタルアルデヒドを架橋した。簡単に述べると、樹脂をペレット化しく50
0xg、5分間)、4容の250+nM NaHCOa、 pH8,8で2回洗
浄した。そのあと樹脂を4℃で6〜8時間、同じ緩衝液中に平衡させた。ペレッ
ト化後、室温で1時間、静かに混合しながら、4容の250mM NaHCO:
+。
pH8,8,250mMメチル−(z−D−7ンノビラノシド(α−MM)、
0−03%グルタルアルデヒドを添加して樹脂を架橋させた。樹脂をLM )リ
ス−HCl、 pH7,8中で2回洗浄することにより反応を停止させた。樹脂
は、使用時まで、4℃で0.01%チメロサールを含む同じ緩衝液中で保存した
。
Con Aツクロマトグラフィー用サンプルをpH8,0の1%デオキシコール
酸塩に溶解した。12.000 X g、五分間の遠心分離により、いかなる少
量の沈殿物も除去した。
クロマトグラフィーの前に、架橋した樹脂を最初に〉5カラム容の50mM )
リス、 pH8,0で2次に〉5カラム容の1%デオキシコール酸ナトリウムで
平衡させた。サンプルを充填し。
1%DOCで洗浄することにより非結合分画を収集した。002.。
によって溶出をモニターした。第4図に示すように、1%DOC中0.5Mα−
■で結合物質を溶出した。
Con Aカラムから溶出した結合分画を、 6M尿素、0.1MNaC1,5
0mM )リス−HC1,pH7,2ヘパリン−セファロース緩衝液中に平衡さ
せたGH−25カラム(Pharmacia)でのクロマドナーフィーにより、
再平衡化させた。約80mg (1mg/ml)を25m1大のヘパリン−セフ
ァロースカラム(Pharmacia)に充填した。
カラムからすべての非結合物質を洗い流した。そのあと、第5図に示すように同
じ平衡緩衝液であるが0.5M NaC1を含むものによって結合タンパクを溶
出した。ヘパリン−セファロース結合タンパク約5〜8mgを回収した。
TFAを加えてヘパリン結合分画のpHを5未満に低下させた。
逆相HPLCを用いてヘパリン結合分画の最終精製を実施した。
使用したカラムはビダック(Vydac)TP−pH184,6mmx 25c
mおよび1. OX 25cmであった。溶媒Aは0.1%トリフルオロ酢酸(
TFA)水溶液、媒体BはAの90%アセトニl−IJル溶液であった。
結合タンパクを、1%/分の速度で32〜62%のB溶媒勾配によりカラムから
溶出した。第6図に示すように、骨形成性タンパクは溶媒847〜50%の間で
溶出した。該タンパクのアミノ酸組成物およびアミノ酸配列を標準工程を用いて
決定した。
それらは上述の通りであり、第7図に示されている。
H0脱グリコジル化
グリコペプチダーゼFは、最内N−アセチルグルコサミン残基においてN連結オ
リゴ糖を開裂する。高マンノース、雑種および複合オリゴ糖は該酵素に感受性で
ある。骨形成性タンパクをクロラミンT法によりヨウ素化した。標識タンパクを
、37℃で、 0.1M )リス−〇C1,pH7,4,10mM BDTA中
6.7単位/ m 1のグリコペプチダーゼF (Bochringer Ma
nnheim)により12〜15時間消化した。
グリコジル化および脱グリコジル化の両形態を、標準法に従って調製したドデシ
ル硫酸ナトリウム715%ポリアクリルアミドスラブゲルにより分析した。第8
図はオートラジオグラフの写真である。
上に述べたタンパク組成物の骨誘発活性を次のようにしてin vivoで評価
した。
■、1.骨形成性タンパク組成物の製剤(エゾP命岬
該タンパクを1%TFA、約45%アセトニトリル中24μg/−溶液として使
用した。TGF−β2は、1%TFA、約45%アセトニトリル中30μg/m
l溶液として使用した。
骨形成性タンパク溶液1rId!およびTGF−β溶液1.4rrLlを4℃で
5分間、ビトロゲンコラーゲン含有溶液(Collagen Corp。
rationh、 Pa1o Alto、 CA) 9−と共に攪拌した。微粒
子形態の多孔性水酸化リン灰石/リン酸三カルシウムセラミック(Zimmer
Corp、、 Warsaw、 IN) 243 mgを加え、混合物を4℃
で5分間インキュベートして、そのあと凍結乾燥した。この混合物は6移植片に
充分な材料を提供した。TGF−βを含まない同様の製剤を作製した。
1、 2 移植
1、 1の製剤がラットにおいて軟骨内骨形成を誘発する能力を次のようにして
測定した。凍結乾燥した製剤の一部を約1容の水で水和し、5分間浸漬させ、約
5X5mmの移植用形態に成形した。移植片は、約4μg/移植片の骨形成性タ
ンパクおよび0または約7μg/移植片のTGF−βを含んだ。移植片を、34
〜40日令の雄性SDプラットおいて膿胸部領域のいずれかの側に外科的に装着
した。14日目に外植片を取り出し。
骨形成に関して生化学的に評価した。
I、3 アルカリホスファターゼに関するアッセイ体外移植組織中のアルカリホ
スファターゼ(AP)活性のレベルは骨形成活性の測定値である。アルカリホス
ファターゼ(AP)を測定するため、外植片を小片に切り刻み、10容(1/1
0)の氷冷1.51J NaC1,3mM NaCo3. pH7,5中で均質
化した。次に均質化したサンプルを4℃、 12.00Orpmで50分間遠心
分離し。
上清のアリクウォットを低温蒸留水で1=10に希釈した。ハギンスら(Hag
gins、 et al、)、 Jεxp Med (1961) 114ニア
61の方法を用い、ポリスチレンプレートを使用してアルカリホスファターゼを
評価した。
第9図は、 APアッセイの結果を示す棒グラフである。指示されているように
、 TGF〜βを含まない製剤(a)はアッセイにおいて本質的に不活性であっ
た。一方TGF−βを含む製剤(b)はかなりの活性を示した。体外移植組織の
組織学的検査によりアッセイの結果を確認した。
あらかじめ還元してアルキル化またはトリプシン化した骨形成性タンパク組成物
を使用して同様の試験を実施した。これらの試験は、該タンパクがそれらの処理
によって非活性化されることを示唆している。
細胞を2500細胞/CI!+2の割合でマルチウェルプレートに接種した。H
ams P12培地、10%胎仔ウシ血清中で一晩付着させた後、血清不含有H
ams F12培地中で細胞を種々の量の骨形成性タンパク組成物と共に72時
間インキュベートした。対照は。
骨形成性タンパクを含まない血清不含有Hams F12培地であった。インキ
ュベーション後、細胞をPBSで2回洗浄し、0.1%トリトンで溶解した。ア
リクウォットを取り、p−ニトロフェニルホスフェート(PNPを基質として使
用してAP活性を試験した。第10図はそれらのアッセイの結果を示す。明らか
なように、骨形成性タンパクは、3〜30■/−の濃度で用量依存性の、 AP
活性の有意の上昇を生じさせた。
生検により成体ヒヒ長骨から海綿質を採取した。該骨を切り刻み、細胞外植を3
週間まで継続した。細胞をトリプシン化し、直ちに使用するかまたは再度平板培
養した。再度平板培養した細胞は最初の3継代内に使用した。AP活性に関する
試験を上記J、1工程のようにして実施した。それらの試験の結果は下記の表に
おいて報告される。
骨形成性タンパク濃度 AP比活性
(ng/ mf) (nmPNP/ t−t gタンパク/分)100 6−
OX 10−3
ヒト骨芽細胞系MG−63 bよびラット−次骨芽細胞に関して同様の試験を実
施した。しかしながら、 AP活性の上昇は認められなかった。
J、3.多核細胞(MNC)形成への作用多核細胞は「破骨細胞様」細胞である
。破骨細胞は骨吸収に関与する。破骨細胞の形成阻害は骨吸収を制限すると考え
られる。
正常ヒト提供者からの骨髄単核細胞を、ハイパツク−フィコール(ヒストバック
1077)勾配遠心分離を用いて分離した。
24ウエルプレートにおいて(5X105細胞/ウエル)、単核細胞を、20%
ウマ血清を含むα−MEM中10’細胞/dの割合で培養した。すべての培養物
を37℃で4%C02空気の加湿雰囲気中に維持した。培地の半分を除去し1等
容量の新鮮培地に置換することにより1週1回培養物に栄養補給した。1.25
−ジヒドロキシビタミンD (D3)、 10−’Mの存在下で骨形成性タンパ
ク培養物に添加した。指定された培養期間(通常3週間)後、細胞を5%グルタ
ルアルデヒドで固定し、ライト染色液で染色した。倒立顕微鏡を用いて、3個以
上の核を含む細胞をMMCとして計数した。第11図はこれらの試験の結果を示
すグラフである。明らかなように、骨形成性タンパクは。
試験した濃度で用量に依存するMNC形成の阻害を生じさせた。
(1)25位のLeu−+Asnの置換を除き第7図のアミノ酸1〜30に対応
する配列を持った合成30merポリペプチドに対するポリクローナル抗体およ
び(2)上に述べたように骨から精製した天然タンパクを調整し9次のように特
性付けた。
家兎に完全フロインドアジュバント(CPA)中ポリペプチド500μgを注射
し、その後約3週間の間隔を置いて不完全フロインドアジュバント(ICFA)
中ポリペプチド500μgを追加抗原投与することにより、家兎において1〜3
0merに対する抗血清を惹起した。4回目の追加抗原投与後に抗血清を得。
EL I SAによって測定した時、この抗血清は> 1 : 10,000の
力価を有していた。天然タンパクに対する家兎抗血清は。
CFA中タンパク50μgの初期注射とそれに続< ICFA中タンパク50μ
gの追加抗原投与を用いて同様に惹起した。この抗血清はEL I SAにより
> 1 : 10.000の力価を有していた。
1〜30merに対する抗血清を、精製天然骨形成性タンパク。
脱グリコジル化天然骨形成性タンパク、および粗天然骨形成性タンパク(Con
A結合物質)に関してウェスタンプロット法で試験し、プロッティング後それ
らをすべて0.2%グルタルアルデヒドで固定した。該抗血清は〉1μgで精製
天然骨形成性タンパクを検出し、また脱グリコジル化タンパクおよび粗タンパク
を認識した。天然骨形成性タンパクに対する抗血清は、ウェスタンプロット法に
おいて> 1100nで天然タンパクを認識した。
K、2.モノクローナル抗体の産生
精製天然骨形成タンパクに対するムレインモノクローナル抗体を次のように調整
した。2回の融合から25の陽性ウェルを同定した。雄性Ba1b/cマウスの
群にCFA中精中天製天然骨形成性タンパク10〜20μ
中タンパク10〜20μgを追加抗原投与した。3回目の追加抗原投与後,マウ
スを出血させ,該タンパクに対する血清抗体価をELISAによって測定した。
2動物が> 1 : 40, 000の力価を有することが認められた。それら
には、融合の4日前にタンパク20μgの最終静脈内(IV)注射を行った。
5P210骨髄腫(6M3659B. NIGMS Human Geneti
c Mutant Ce11 Repository,Camden,NJ)と
の融合は,基本的にオイとへルミッシエルとシイギ(Mishell and
Shiigi)編集, W,)1.Freeman and Co.、San
Francisco. 357〜362頁, (1980)のプロトコルに従っ
て実施した。動物からの牌細胞を5:1の比率で5P210と混合した。50%
ポリエチレングリコールを融合誘発物質として使用した。細胞を,20%FC3
(Hyclone Laboratories,Logan,IT)、 2m
M L−グルタミン、2mMピルビン酸ナトリウム、可欠アミノ酸,ペニシリン
およびストレプトマイシンを補充した高グルコース(4.5gz#り含有のDM
EM中で.4×103細胞/ウエルの定住腹腔内細胞と共に106細胞/ウエル
の割合で平板培養した。この工程において,ラリツクら(Larrick, e
t al)、 Proc.Natl,Acad,Sci,USA. (1983
)80: 6376による方法に従い,アミノプテリンをアザセリン(Sign
a)で置換し,さらに融合後1日目にチミジンおよびヒポキサンチンを添加した
。
2回の融合から25の陽性ウェルを同定した。
25全部が1251−標識骨形成性タンパクの免疫沈降反応に関して陽性であり
,25のうち23が該タンパクに対するEl,ISAにおいて陽性であった。ク
ローン化しなかった1ウエル(3 B 2. 17,以前はFO13−3 8
2と称した)から上清は特に陽性であり,ウェスタンプロット法において使用し
た。この試験では,骨形成性タンパク配列のアミノ酸セグメント1〜30。
62〜95および76〜105に対応する合成ペプチドを作製し,各々1〜2μ
gをゲル中の別々のレーンに適用した。プロットを精製抗体50〜100μg/
mlでプローブした。この抗体は≧300ngタンパクならびに脱グリコジル化
タンパクを認識した。
該抗体はまた粗分面(全Can A結合)中のタンパクを検出しC末端ペプチド
(76〜105)を認識するがN末端ペプチド(1〜30)は認識しないことが
認められた。2 C 11.6と命名されたもう1つのクローンは,内部の62
〜95セグメントを認識することが認められた。クローン3B2.17および2
C 11.6を限界希釈によってサブクローニングし,それらが安定でIgG
アイソタイプであることが判明した。これらのクローンはブダペスト条約の規定
に基づいてAmerican Type Cu1ture Co11ectio
n (ATCC)に寄託されている。
2つのクローンによって産生された抗体を骨形成性タンパクの作用を中和あるい
は遮断する能力に関して試験した。ROSあるいはBMS−2細胞を1種々の濃
度の抗体の存在下あるいは不在下で骨形成性タンパク30μg/mlと共に培養
した。これらの細胞系はどちらも. 30ng/mIlの骨形成性タンパクを含
む培地中で培養する時,正常にAPの実質的上昇を示す。3B2。
17からの抗体は,〉10μg/mlの濃度で骨形成性タンパクのこの作用を中
和することが認められた。
本発明に関連する当業者にとっては明白である,上述した本発明の実施方法の修
正は,以下の特許請求の範囲内であることが意図されている。
C/2 丑詳11HPLc (42−45%7t)=l−’)/し>FIG、
1
mMNaCl l−6−1
4′
’7ンS7(ng/ml) OOO,11,01010010M1,25D3
− + + + + +FIG、tl
FIG、 7−1
FIG、 7−2
FIG、 8
ENZ−+ −+
lMl@tP1.−nlAeel、cal、−−N@、Pcr/Usa9101
428ml##al1611″A″−−”’ PCr/1IqFIQ/n4 A
iQ
Claims (17)
- 1.骨形成活性を有し,そして,N末端部位において次のような内部配列を有す る,実質的に純粋なポリペプチド:【配列があります】 および該ポリペプチドと実質的に同等であり実質的に相同である実質的に純粋な ポリペプチド。
- 2.前記内部配列の最初のLysの直前に先行するアミノ酸がAlaであり,該 ポリペプチドのアミ/末端を形成する,請求項1に記載のポリペプチド。
- 3.N末端部位において次のような内部配列を有するポリペプチドであって: 【配列があります】 該ポリペプチドが該配列を有する天然の骨形成活性ポリペプチド,およびそれと 実質的に同等で実質的に相同である脱グリコシル化されたポリペプチドに対して 脱グリコシル化された,ポリペプチド。
- 4.以下のアミノ酸配列を有する,実質的に純粋な骨活性ポリペプチド: 【配列があります】 および該ポリペプチドと実質的に同等で実質的に相同である,実施的に純粋なポ リペプチド。
- 5.以下のアミノ酸配列を有し: 【配列があります】 該ポリペプチドが該配列を有する天然の骨形成活性ポリペプチド,およびそれと 実質的に同等で実質的に相同である脱グリコシル化されたポリペプチドに対して 脱グリコシル化された,ポリペプチド。
- 6.請求項1,2または4に記載の骨形成活性ポリペプチドを有効量含み,骨形 成を誘導および/または骨吸収を防止するための組成物。
- 7.有効量のTGF−βを更に含む,請求項6に記載の組成物。
- 8.生きた哺乳類における所定の部位のインビボでの骨形成を誘導する方法であ って,請求項6または7の組成物を該部位に配置することを含む方法。
- 9.有効量の請求項6または7の組成物を哺乳類に全身投与することを含む,生 きた哺乳類において骨髄細胞生成を誘導する方法。
- 10.有効量の請求項6または7の組成物を哺乳類に全身投与することを含む, 生きた哺乳類においてオステオポローシスを処置する方法。
- 11.腫瘍性造血細胞を殺すために哺乳類に照射することを含み,造血システム の癌のために生きた哺乳類を処置する方法であって,造血幹細胞の分裂を刺激す るために該照射を行った後に,充分な量の請求項6または7の組成物を哺乳類に 全身投与することを含む方法。
- 12.造血幹細胞の分裂を抑制するために前記照射を行う前に,充分な量のTG F−βを哺乳類に全身投与する,請求項11に記載の方法。
- 13.請求項1,2,3,4または5のポリペプチドに結合する抗体。
- 14.請求項1,2,3,4または5のポリペプチドをコードする組換え体ポリ ヌクレオチド。
- 15.請求項14の組換え体ポリヌクレオチドを含み,それによってコードされ たポリペプチドの発現を指示することが可能な組換え体ベクター。
- 16.請求項15の組換え体ベクターを含み,前記ポリペプチドの発現を可能に する組換え体宿主細胞または微生物。
- 17.請求項16の組換え体宿主細胞または微生物を培養することを含む,請求 項1,2,3,4または5のポリペプチドを製造する方法。
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