CZ308897A3

CZ308897A3 - Virové vektory a jejich použití pro léčení hyperprofilerativních nemocí, zejména restenosy

Info

Publication number: CZ308897A3
Application number: CZ973088A
Authority: CZ
Inventors: Didiar Branellec; Kenneth Walsh; Jeffrey M. Isner; Patrice Denefle
Original assignee: Case Western Reserve University
Priority date: 1995-03-31
Filing date: 1996-03-28
Publication date: 1998-03-18
Also published as: OA10516A; AP1011A; EP0817791A4; FR2732357A1; HUP9801767A3; AU5531596A; CA2216878A1; JPH11503314A; BR9608449A; AP9701117A0; USRE37933E1; US5851521A; HUP9801767A2; FR2732357B1; EP0817791A1; CN1190402A; SK132797A3; AU701345B2; SI9620059A; WO1996030385A1

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nové, zvlášť účinné, metody léčení patologií spojených s hyperproliferativními onemocněními prostředky genové terapie. Způsob podle předkládaného vynálezu sestává, konkrétněji, ve specifickém blokování proliferace buněk vaskulárního hladkého svalstva (vasculár smooth-muscle cells - VSMC) pomocí in vivo přenosu genu gax. Způsob podle předkládaného vynálezu je velmi účinně upraven pro léčení postangioplastických restenos pomocí přeexprimování gax genu ve vaskulární stěně. Podle předkládaného vynálezu lze gax gen přenášet pomocí virových vektoru. Tyto vektory jsou s výhodou adenov.i rové vektory.

Dosavadní stav techniky

Byly izolovány různé geny, které jsou spojeny s blokováním buněčného oddělení. Tím dojde k tomu, že gas (růst-blokování specifický: gas 1 až 6) a gadd (růst-blokování a vyvolatelný DNA poškozením: gadd34, gadd45 a gaddl53) geny jsou silně exprimovány ve kv.iscentn.ich buňkách, to znamená v buňkách, které jsou blokovány v GO fázi buněčného cyklu (Schneider a kol., Cell 1988, 54: 787-793; Del Sat a kol., Cell 1992, 12:

3514-3521; Cowled a kol., Exp. Cell. Res. 1994, 211: 197-202; Brancolini a Schneider, J. Cell. Biol. 1994, 124: 743-7.56; Zhan a kol., Mol. Cell. Biol. 1993, .13: 4242-4250; Jackman a kol., Cancer Res. 54: 5656-5662, 1994). V souladu s těmito zjištěními o genové expresi, mikroinjekce gas-1 proteinu blokuje syntézu DNA (Del Sat a kol., Cell, 1992, 70: 595-607). Naopak přidání růstového faktoru jako je PDGF (platelet-derived growth factor - růstový faktor odvozený z destiček) nebo fetální telecí sérum snižuje expresi těchto genu u in vitro modelů (Coccia a kol. Mol. Cell. Biol. 1992, 12: 3514-3521) . O této specií i tě exprese ve vztahu k stavu proliferace buňky se také jeví, že má svůj protějšek in vivo. Takto je gen gas-1 silně exprimován v děloze u myší po vyjmutí vaječníků (Ferrero a Cairo, Cell. Biol. Int. 1993, 17,

857-862). U téhož zvířecího modelu vedlo léčení estrogeny k buněčné proliferaci, která je umístěna v děloze, a projevuje se zvýšením exprese proto-onkogenu c-myc a snížením exprese genu gas-1. Podobně u hepatitického modelu proliferace/regenerace je exprese genu gas-6 silně omezena po dobu čtyř hodin po částečné heptatektomii, tj. v době přenosu z GQ na Gl; tato exprese se vrátí k normálu, pravděpodobně jakmile bylo jednou iniciováno dělení hepatocytů (Ferrero a kol, J. Cell. Physiol. 1994, 158: 263-269).

Podstata vynálezu

Předkladatel vynálezu se zajímal o nový gen, tj. gen gax (růst-blokování specifický homeobox) a prokázal, že tento gen má vlastnosti, které jsou zejména výhodné pro použití v genové terapii hyperproiiferativních nemocí, zejména restenosy. Gax gen byl původně zjištěn v cDNA knihovně připravené z krysí aorty. Kóduje protein o 303 aminokyselinách. Jeho sekvence byla charakterizována a jeho cDNA byla klonována (Gorski a kol. Mol. Cell. Biol. 1993, 6, 3722-3733)-. Gax gen má určité vlastnosti, které jsou podobné těm u genů gas a gadd, protože se také zdá, že reguluje přenos G0/G1 v buněčném cyklu. Stejným způsobem je hladina gax mRNA snížena u krysích VSMC desetkrát po dvou hodinách po vystavení PDGF (Gorski a kol. Mol. Cell. Biol. 1993, 6, 3722-3733). Exprese gax genu je proto potlačena během VSMC mitogenní odpovědí.

Jednou z výhod způsobu podle předkládaného vynálezu je principiálně specifita exprese gax genu. Takto, u dospělých ·· ·· krys, je gax gen hlavně exprimován v kardiovaskulárním (aorta a srdce) systému. Na druhou stranu při demonstrování přítomnosti gax mRNA v játrech, mozku, žaludku nebo kosterních svalech selhal northern blott. Post-angioplasticná restenose je lokalizovaná hyperproliferativní nemoc., která se rozvíjí po nechirurgické intervenci v oblasti atherosklerotické skvrny. Díky tomu vede léčení otheroskierot.lckých lézá angi opi ast i i často (až 50 % případů v určitě studii) k restenose, po které následuje mechanické poškození arteriální stěny. Klíčovou událostí tohoto mechanismu je proliferace a migrace buněk vaskulárního hladkého svalstva (VSMC) z tunice media směrem do tunice intima-, zejména z důvodu nepřítomnosti chránění a/nebo zpětné vazby endothelíálnich buněk v tunica intima. Schopnost selektivně exprimovat antiproliferativní gen podle předkládaného vynálezu ve VSMC buňkách je velmi podstatnou výhodou.

Další výhodou způsobu podle předkládaného vynálezu je skutečnost, že gax gen patří do skupiny homeotických genu. Tyto geny kódují transkripční faktory, které obsahují sekvence (nebo homeodomény), které rozpoznávají kokrétní oblasti DNA (nebo homeoboxu) (review; Gehring a kol. Cell, 788: 211-223, 1994). Homeodoména krysího gax proteinu je obsažena mezi aminokyselinami 185 a 245. Zajímavé je, že homeotické geny, které byly do současné doby identifikovány jsou zahrnuty v kontrole buněčné proliferace/rustu během embryogeneze, a tak posilují terapeutický potenciál způsobu podle předkládaného vynálezu (review: Lawrence a Morata Cell 78: 181-198, 1994; Krumlauf, Cell 78: 191-201, 1994).

Předkládaný vynález se tak týká poškozeného rekombinantního viru, který obsahuje přinejmenším jeden vložený gen kódující celý nebo část GAX proteinu nebo variantu tohoto proteinu. Vynález se také týká použití takových virů pro léčeni hyperproli ferativních patologií.

·> ·

Ve virech podle předkládaného vynálezu muže být vložený gen fragmentem komplementární DNA (cDNA) nebo genomické DNA (gDNA) nebo hybridní konstrukt sestávající, například, z cDNA, do které byl vložen jeden nebo více intronú. Gen také obsahuje syntetické nebo polosyntetické sekvence,.Jak již bylo uvedeno, gen muže být gen kódující celý nebo část GAX proteinu nebo to muže být variant tohoto proteinu. V předkládaném vynálezu označuje pojem variant jakýkoliv mutant, fragment nebo peptid, který má přinejmenším jednu biologickou vlastnost GAX, stejně jako jakýkoliv homolog GAX, který byl získán z jiných zdrojů. Tyto fragmenty a varianty lze získat jakoukoliv technikou známou odborníkům, zejména genetickými a/nebo chemickými a/nebo enzymatickými modifikacemi nebo hybridizací nebo expresním klonováním, umožňující, aby byly varianty vybrány podle jejich biologické aktivity. Genetické modifikace zahrnují supresi, deleci, mutaci atd.

V předkládaném vynálezu je vložený gen, s výhodou, gen ..kódující celý nebo část krysího GAX proteinu nebo jeho lidského homologu. Ještě výhodněji se jedná o CDNA nebo gDNA.

Obecně vložený gen také obsahuje sekvence, které umožňují, aby byl exprimován v infikovaných buňkách. Tyto sekvence mohou být sekvencemi, které jsou přirozeně odpovědné za expresi daného genu, pokud jsou tyto sekvence schopné funkce v infikované buňce. Sekvence také mohou být různého původu (odpovědné za expresi různých proteinů nebo dokonce syntetických proteinů). Zejména to mohou být sekvence eukaryotních nebo virových genu nebo odvozené sekvence, které stimulují nebo potlačují transkripci genu specifickým nebo nespecifickým způsobem a vyvolatelným nebo nevyvolátelným způsobem. Jako příklad se může jednat o promotorovou sekvenci, která je odvozena z genomu buňky, kterou je žádoucí infikovat nebo z genu viru, zejména promotoru adenovirové E1A a MLP genu, CMV nebo LTR-RSV promotoru atd. Eukaryotní promotory, které lze také uvést, jsou všudypřítomné promotory (HPRT, • · vimentin, aktin, tubulin, atd.), promotory přechodného vlákna (desmin, neurofilamenty, keratin, GFAP, atd.), promotory terapeutického genu (typ MDR, CFTR, faktor VIII, atd.) tkáň-specifické promotory (aktin promotor v buňkách hladkých svalu), promotory, které jsou, s výhodou aktivovány v dělicích se buňkách, nebo jiné promotory, které reagují na stimuly (receptory steroldního hormonu, receptory retinové kyseliny, atd.) Navíc, tyto expresní sekvence lze modifikovat přidáním aktivujících sekvencí, regulačních sekvencí, atd. Jinak, pokud vložený gen neobsahuje jakékoliv exprimované sekvence, lze jej vložit do genomu poškozeného viru v protisměru takové sekvence.

Navíc, vložený gen obecně zahnuje, ve směru kódující sekvence, signální sekvenci, která mé směruje syntetizovaný polypeptid do vylučovacích cest cílové buňky. I když tato .signální sekvence může být přirozená GAX signální sekvence, muže to také být jiná funkční signální sekvence (například genu pro thymidin kinasu) nebo umělá signální sekvence.

Viry podle předkládaného vynálezu jsou poškozené viry, a proto nejsou schopné autonomní replikace v cílové buňce. Obecně, gen defektních viru, které se používají podle předkládaného vynálezu neobsahuje přinejmenším sekvence, které jsou nutné pro replikaci daného viru v infikované buňce. Tyto oblasti lze buď vyjmout (celé .nebo část), vyřadit z funkce nebo je lze nahradit jinými sekvencemi, zejména vloženým genem. S výhodou si poškozený virus uchovává sekvence svého genomu, které jsou nezbytné pro zakapsidování virových částic.

Virus podle předkládaného vynálezu je odvozen od adenovirů, adenosouvisejícího viru (AAV) nebo od retroviru. Podle jednoho preferovaného provedení je virus adenovirus.

Existují různé serotypy adenovirů, jejichž struktura a vlastnosti se poněkud liší. Z těchto serotypu jsou podle předkládaného vynálezu k použití preferovány typ 2 nebo typ 5 lidského adenovirů (Ad 2 nebo Ad 5) nebo adenoviry zvířecího • · ·· ·

původů (viz přihláška WO94/26914). Adenoviry zvířecího původu, které lze použít podle předkládaného vynálezu jsou adenoviry psí, hovězí (Mávl, Beard a kol., Virology 75 (1990) 81), vepřové, z paviánů nebo jiných opic (SAV). S výhodou je adenovirus zvířecího původu psí adenovirus, ještě výhodněji CAV2 adenovirus [Manhattan nebo A26/61 kmen (ATCC VR-800), například]. S výhodou se podle předkládaného vynálezu používají adenoviry lidské, psí nebo směs obou.

S výhodou zahrnují poškozeně viry podle předkládaného vynálezu ITR, kapsidačni sekvenci a nukleovou kyselinu. Ještě zajímavější je v genomu adenovi.ru podle předkládaného vynálezu, že přinejmenším oblast El je nefunkční. Virový gen lze upravit tak, že je nefunkční, jakoukoliv technikou známou odborníkům, zejména úplným odstraněním, nahrazením, Částečnou deleci nebo přidáním jedné nebo více bází k uvažovanému genu (genům). Takových úprav lze dosáhnout in vitro (na izolované DNA) nebo in sítu, například použitím technik genetické manipulace nebo působením mutagenních činidel. Další oblasti lze také modifikovat, zejména oblast E3 (WO95/02697), oblast E2 (WO94/28938), oblast E4 (WO94/28152, WO94/12649 a WO95/02697) a oblast L5 (WO95/02697). Podle preferovaného provedení obsahuje adenovirus podle předkládaného vynálezu deleci oblastí El a E4 . Podle dalšího preferovaného provedení obsahuje deleci v oblasti El, do které byla vložena oblast E4 a sekvence kódující GAX (srov. FR94 13355). Ve virech podle předkládaného vynálezu delece v oblasti El sahá přes nukleotidy 455 až 3329 v sekvenci Ad5 adenovíru.

Poškozené rekombinantní adenoviry podle předkládaného vynálezu lze připravit jakoukoliv technikou známou odborníkům (Levrero a kol., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Zejména se připravují homologní rekombinací mezi. adenovirem a plasmidem, který nese, kromě jiného, požadovanou sekvenci DNA. Homologní rekombinace je vyvolána po kotransfekci daného ad.enoviru a plasmidu do vhodné buněčné linie.Použitá buněčná linie by měla, s výhodou (i) být transformovatelná uvedenými prvky a (ii) obsahovat sekvence, které -jsou komplementární k části genomu poškozeného adenoviru, s výhodou v integrované formě, aby se zabránilo riziku rekombinace. Příklady buněčných linií je buněčná linie 293 lidské embryonální ledviny (Graham a kol., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), která obsahuje, zejména, integrovanou do svého genomu, levorukou část genomu Ad5 adenoviru (1.2 %) nebo buněčné linie, které jsou komplementární k funkcím El a E4 jak bylo popsáno, zejména, v přihláškách č. WG94/26914 a WO95(02697.

Následně jsou rozmnožené aďenoviry standardními molekulárně biologickými získány a čištěny technikami jak je ilustrováno v příkladech.

Adenosouv.i sej ící viry (AAV) jsou DNA viry relativně menší velikosti, které se integrují, stabilně a místně specifickým způsobem, do genomu infikovaných buněk. Jsou schopné infikovat širokou škálu buněk aniž by ovlivnily buněčný růst, morfologii nebo diferenciaci. Navíc., se zdá, že nejsou zahrnuty do lidských patologií. Genom charakterizován. Zahrnuje

AAV byl přibližně klonován sekvenován a 4700 bází a obsahuje oblast převráceného terminálního opakováni (inverted terminál repeat - ITR) o délce přibližně 145 bází na každém konci, která slouží jako výchozí bod replikace viru. Zbytek genomu je rozdělen do dvou .nezbytných oblastí, které nesou kapsidační funkce: levoruká část genomu, která obsahuje rep gen zahrnutý v replikaci viru a expresi virového genu; a pravorukou část genomu, která obsahuje cap gen kódující kapsidový protein viru.

Použití vektorů odvozených od AAV pro přenos genů in vitro a in vivo bylo popsáno v literatuře (viz, zejména, WO 91/18088;

WO 93/09239; US 4,797,368., US5, 139, 941, EP 488 528). Tyto přihlášky popisují různé konstrukty odvozené od AAV, ve kterých jsou rep a/nebo cap geny odstraněny a nahrazeny • ·· · požadovaným genem, a použití těchto konstruktů pro přenos požadovaného genu in vitro (do kultivovaných buněk) nebo in vivo (přímo do organismu). Poškozené rekombinantní AAV podle předkládaného vynálezu lze připravit kotransfekcí plasmidu obsahujícího požadovanou nukleokyselinovou sekvenci, která je obklopena dvěma AAV oblastmi převráceného terminálního opakování (ITR) a plasmidu nesoucího AAV kapsidační geny (rep a cap geny), do buněčné linie, která je infikována lidským pomocným virem (například adenovirus). AAV rekombinanty, které tak byly vyrobeny, byly čištěny standardními technikami. Vynález proto také popisuje AAV odvozený rekombinantní virus jehož genem obsahuje sekvenci kódující GAX, která je obklopena AAV ITR. Vynález se také týká plasmidu obsahujícího sekvenci kódující GAX, která je obklopena dvěma ITR z AAV. Takový plasmid lze použit tak jak je pro přenos GAX sekvence s plasmidem, tam kde je to vhodné, který je zahrnut do 1 iposomální ho vektoru (pseudovirus).

Konstrukce rekombinantních retrovirových vektorů byla rozsáhle zpracována v literatuře: viz, zejména EP 453242, EP 178220, Bernstein a kol, Gent. Eng. 7 (1985) 235; .McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, atd. Zejména jsou retroviry integrační viry, které infikují dělící se buňky. Retrovirový genom zahrnuje hlavně dvě LTR, kapsidační sekvenci a tři kódující oblasti (gag, pol a env; . U rekombinantních vektorů odvozených od retroviru jsou geny gag, pol a env .obecně odstraněny, celé nebo částečně a nahrazeny požadovanou heterologní nukleokyselinovou sekvencí. Tyto vektory lze konstruovat z různých typů retroviru jako jsou, zejména, MoMuLV (murine Moloney .'leukaemia virus také označovaný jako MoMLV), MSV (murine Moloney sarcoma virus), HaSV (Harvey sarcoma virus), SNV (spleen neerosis virus), RSV (Rous sarcoma virus) nebo jiný přátelský virus.

Obecně, aby byly zkonstruovány rekombinantní retroviry obsahující sekvenci kódující GAX podle předkládaného vynálezu, · 9

9 9 je konstruován plasmid, který obsahuje, zejména, LTR, kapsidační sekvenci a kódující sekvenci, která je pak použita pro transfekci toho, co je nazýváno enkapsidační buněčná linie, která je schopna doplňovat retrovirové funkce, které chybí u plasmidu. Obecně jsou enkapsidační buněčné linie schopné exprimovat geny gag, pol a env. Takové enkapsidační buněčné linie byly popsány v dosavadním stavu techniky, zejména buněčná linie PA317 (US 4,861,719), buněčná linie PsiCRIP (WO 90/02806) a buněčná linie GP+envAm-12 (WO 89/07150). Navíc, rekombinantní retroviry mohou obsahovat modifikace v LTR pro potlačení .transkripční aktivity stejně jako enkapsidační sekvence, které zahrnují část gag genu (Bender a kol., J. Virol. 61 (1987) 1693). Rekombinantní retroviry, které byly vyrobeny, byly následně čištěny běžnými Technikami.

Použití poškozených rekombinantních adenovirú pro léčení restenosy je velmi výhodné. Adenoviry mají vysokou infekční kapacitu pro proliferující buňky vaskulárního hladkého svalstva. To .umožňuje použít relativně malá množství aktivní složky (rekombinantního adenovi.ru) , která tak vedou k účinnému a velmi rychlému působení v léčených místech. Adenoviry podle předkládaného vynálezu jsou také schopny exprimovat velkými rychlostmi vložený gax gen, což vede k velmi účinnému terapeutickému působení. Navíc díky jejich episomální povaze, setrvávají adenoviry podle předkládaného vynálezu v proliferujících buňkách po omezenou dobu, a tak mají přechodný vliv, který je vynikajícím způsobem upraven pro žádaný terapeutický efekt.

Předkládaný vynález se také týká farmaceutického prostředku, který obsahuje jeden nebo více poškozených rekombinantních viru, které již byly popsány. Takové prostředky mohou být v takové podobě, která je vhodná pro plánovaný způsob jejich podávání povrchovou, orální, parenterální, intranasální,

intravenózní, intramuskulární, subkutánní, intraokulární atd. cestou.

výhodou obsahuje prostředek podle předkládaného vynálezu excipienty, které jsou farmaceuticky přijatelné pro injikovatelné prostředky, zejména pro injekce do buněčné stěny. Tyto excipienty jsou, zejména, sterilní, isotoňické roztoky solí (hydrogen nebo dihydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, draselný, vápenatý nebo hořečnatý, atd. nebo směsi takových solí), nebo suché, zejména lyofilizované prostředky, které se rekonstituují přidáním sterilizované vody nebo fyziologického roztoku na injikovatelné roztoky. Excipient také muže být hydrogel, který se připravuje z jakéhokoliv biokompatϊbilniho nebo ne jedovatého (homo nebo hetero) polymeru. Takové polymery byly popsány, například., v přihlášce WO 93/08845. Některé z nich, jako zejména ty z ethylenoxidu nebo propylenoxidu jsou komerčně dostupné.

Při léčení patologií, které souvisejí s hyperproliferativnimi nemocemi, lze poškozeně rekombinantní adenoviry podle předkládaného vynálezu podávat různými cestami, zejména injekčně. S výhodou, jsou při léčení restenosy adenoviry podle předkládaného vynálezu podávány přímo do stěny krevní cévy pomocí angiop1astického balónku, který je pokryt hydrofilním filmem (například hydrogelem), který je nasycený adenoviry, nebo pomoci jiného katetru obsahujícího infuzní komůrku pro roztok adenoviru, kterou pak lze aplikovat přesně do místa léčení a umožňuje adenovirúm místní a účinné uvolnění v místě léčené buňky. Tento způsob podávání s výhodou umožňuje infikovat velké množství (až 9,6 1) buněk tunica media, které tvoří preferovaný cíl pro léčení restenosy, zatímco standardní způsoby podávání (například intravenózní injekce) neumožňují, aby byly buňky infikovány v takovém rozsahu.

Způsob léčení podle předkládaného vynálezu s výhodou sestává z podávání prostředku, který obsahuje hydrogel nasycený ·· ···· rekombinantními adenoviry, do léčeného místa. Hydroge1 múze být umístěn přímo na povrch léčené tkáně, například během chirurgického zákroku. S výhodou je hydroge1 podáván na léčené místo pomocí katetru, například balónkového katetru, zejména pří angioplastii. Zejména výhodným způsobem je když je nasycený hydroge.; dodáván na léčené místo pomocí balónkového katetru.

Dávky viru, které se používají do injekcí lze upravit podle podmínek, zejména podle použitého způsobu podávání a žádaného trvání léčení. Obecně, jsou rekombinantní viry podle předkládaného vynálezu podávány ve formě dávek 10^; až 10 ^; pfu/ml. V případě AAV a adenovírú lze použít dávky .10' až 10 pfu/ml. Pojem pfu (jednotka tvorby destiček) odpovídá infekční síle suspenze virionú a je stanovován infikováním vhodné buněčné kultury a měřením, obecně po 48 hodinách, počtu destiček infikovaných buněk.. Techniky stanovení pfu titru virového roztoku jsou dobře dokumentovány v literatuře.

Předkládaný vynález nabízí nový a velmi účinný prostředek léčení nebo prevence patologií, které souvisejí s hyperproliferativními nemocemi jako je restenosa.

Dále lze toto léčení použít na lidech stejně jako na jakýchkoliv zvířatech jako jsou ovce, hovězí dobytek, domácí zvířata (psi, kočky, atd.), koně, ryby, atd.

Předkládaný vynález je úplněji popsán v následujících příkladech, které jsou pouze ilustrativní a nijak neomezující.

Popis obrázku

Obrázek 1 : Zobrazení plasmidu pCOl.

Obrázek 2 : Zobrazení plasmidu pXL-CMV-Gax^HA.

Obrázek 3 : Jaderné umístění GAX-HA proteinu ve VSMC transfekovaných pXL-CMV-Gax^!\

Obrázek 3A : VSMC transfekované s vektorem pCGN (chybí GAX insert).

Obrázek 3B : VSMC transf ekované s vektorem pXL-CMV-Gax™’.

Obrázek 4 : Jaderné umístění GAX-HA proteinu ve VSMC trans fekovaných Ad-CMV-Gax.

Obrázek 5 : Vliv Ad-CMV-GAX na proliferaci VSMC (t = 24 hodin)

- VSMC jsou sčítány po 24 hodinách. po působení Ad-CMV-Gax (1000 pfu/buňka) nebo kontrolním adenovirem (Ad-RSV-3Gal, 1000 pfu/buňka) . Buněčný růst je blokován (0,5 %

FCS) nebo stimulován (FCS 20 %).

Obrázek 6 : Vliv Ad-CMV-GAX na proliferaci VSMC (t = 48 hodin)

- VSMC jsou sčítány po 48 hodinách po působení Ad-CMV-Gax (1000 pfu/buňka) nebo kontrolním adenovirem (Ad-RSV-PGal, 1000 pfu/buňka). Buněčný růst je blokován (0,5 %

FCS) nebo stimulován (FCS 20 %).

Obrázek 7 : Vliv Ad-CMV-GAX na životnost VSMC, které jsou inkubovány v přítomnosti fetálního telecího séra (FCS 2.0 %).

- experimentální podmínky, srov. obrázek 6.

Obrázek	7A	: buňky,	které	nejsou léčeny adenovirem
Obrázek	7.B	: buňky,	které	jsou	léčeny Ad-RSV-fGal
Obrázek	7C	: buňky,	které	jsou	léčeny Ad-CMV-Gax
Obr á ze k 8		Vliv Ad-CMV-	Gax	a Ad-RSV-3Ga1 na krysí

karotidovou artérii po působeni balónkového katetru. Obrázek 8A : měření povrchové oblasti v intima Obrázek 8B : měření poměru intima ku media Obrázek 8C : měření luminálního zúžení.

Obrázek 9 : Arteriální průřez kontrolních a léčených cév Obrázek 9A : kontrolní cévy léčené Ad-RSV-0Gal Obrázek 9B : cévy léčené Ad-CMV-Gax.

• · • · · · ·· ·· φ · · ·

Příklady provedení vynálezu

Obecné molekulárně biologické techniky

Standardní metody používané v molekulární biologii, jako jsou preparativní extrakce plasmidové DNA, centrifugace plasmidové DNA v gradientu chloridu česného, elektroforéza na -agarosovém nebo akrylamidovém gelu, čištění fragmentu DNA elektroelucí, extrakcí proteinů fenolem nebo směsí fenol/chloroform, srážením DNA v solném médiu pomocí ethanolu nebo izopropanolu, převedení do Eschericia coli, atd., ..., jsou odborníkům dobře známy a jsou rozsáhlým způsobem popsány v literatuře (Maniatis T., a kol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Gold Spring Harbor, N. Y., 1982; Ausubel F. M., a kol. .(editoři), Current Protocols in Molecular Biology., John Wiley & Sons, New York, 1987].

Plasmidy typů pBR322 a puC a fágy série Ml 3 byl získány komerčně (Bethes.da Research Laboratories) ,

Pro ligace se DNA fragmenty oddělují podle velikosti e'l ektroforet icky na agarosovém nebo akrylamidovém gelu, extrahují fenolem nebo směsí fenol/chloroform, srážejí ethanolem a pak inkubují v přítomnosti T4 DNA ligasy (Biolabs) podle doporučení dodavatele.

5’ prodloužené konce lze při používání vyplnit Klenowovým fragmentem E. coli DNA polymerasy Ί (Biolabs) podle údajů výrobce. 3’ prodlouženě konce jsou zničeny v přítomnosti T4 DNA polymerasy (Biolabs), která se používá podle doporučení výrobce. 5' prodloužené konce jsou zničeny opatrným působením SI nukleasy.

In vitro místně specifickou mutagenezi pomocí syntetických oligonukleotidu lze provést způsobem vyvinutým Taylorem a kol.

[Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] použitím soupravy distribuované firmou Amersham.

·· ·· · · * • 4 · · • · ·4· • * · • 4 ··

* · • · ··· • 4 ·« ····

Enzymatické zmnožení DNA fragmentů pomocí techniky označované jako PCR [polymerase-catalyzed chain reaction polymerasou katalyzovaná řetězová reakce, Saiki R.K. a kol., Science 230 (1985) 1350-1354; Mu11is K. B, a Faloona F. A.,

Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] se provádí pomocí DNA tepelného cykléru (Perkin Elmer Getus) podle doporučení výrobce.

Nukleotidové sekvence se stanovují metodou podle Sangera a kol. [Proč. Nati. Acad. Sci, USA, 74, (1977) 5463-5467] pomoci soupravy dodávané firmou Amersham.

Příklad 1: konstrukce vektoru pXh-CMV-Gax'’ nesoucího gen kódující krysí gax protein pod kontrolou CMV promotoru.

Tento příklad popisuje konstrukci vektoru, který obsahuje cDNA kódující gax protein (krysí) a adenovirové sekvence, které umožňují rekombinaci. K N-konci gax proteinu (Field a kol., Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165, 1988) byl přidán epitop chřipkového viru haemagglutinin (epitop HAT), zahrnující 18 aminokyselin.. Takové přidání epitopu umožňuje sledovat expresi gax,.zejména imunofluorescenčními technikami, použitím protilátek proti HA1 epitopu. Kromě své citlivosti tato metoda zároveň umožňuje vyloučit, jak in vivo tak .in vitro, šum pozadí, který odpovídá expresi endogenních gax proteinu.

1.1. Konstrukce plasmidu pCGl

A - Konstrukce plasmidu pCE

EcoRl/Xbal fragment odpovídájicí levorukému konci genomu adenoviru Ad5 byl nejprve klonován mezi EcoR a Xba místy vektoru pIC19H. Tím byl generován plasmid pCA. Plasmid pCA pak byl přestřižen Hinfl a jeho 5' prodloužené konce byly vyplněny Kl.enowovým fragmentem E. coli DNA polymerasy I; vše pak bylo přestřiženo EcoR. Fragment plasmidu pGA, který byl takto generován a který obsahuje levoruký konec genomu adenoviru Ad5, pak byl klonován mezi EcoRI a Smál místy vektoru pIC20H (Marsh a kol., Gene 32 (1984) 481). Tím byl generován plasmid

pCB. Plasmid pCB byl pak přestřižen EcoRI a jeho 5^Jprodloužené konce byly vyplněny Klenowcvým fragmentem E. coli DNA polymerasy I; vše pak bylo přestřiženo BamHT. Fragment plasmidu pCB, který byl takto generován a který obsahuje levoruký konec genomu adenoviru Ad5, pak byl klonován mezi Nrul a BglII místy vektoru p],C20H. Tím byl generován plasmid pCE jehož výhodná charakteristika spočívá v prvních 382 párech bází adenoviru Ad5, které následuje mnohonásobné klonovací místo.

B - Konstrukce plasmidu pCD'

Sau3A (3346)/Sstl (3645) a Sstl (3645)/Narl (5519) fragmenty z genomu adenoviru AdS byl nejprve spolu 1igovány a klonovány . mezi C.lal a BamHI místy vektoru pIC20H, čímž byl generován plasmid pPY53. Sal1/Taqí fragment z plasmidu pPY53 (připraveného z dam- pozadí), obsahující část genomu adenoviru Ad5 mezi místy Sau3A (3346) a Taql (5.207) pak byl klonován mezi Sall a Clal místy vektoru pIC20H, čímž byl generován plasmid pCA’. Taql (5207)/Narl (5519) fragment genomu Ad5 adenoviru, připraveného z dam- pozadí, a Sall-Taql fragment z .plasmidu pCA’ pak byly spolu 1igovány a klonovány mezi Sall a Narl místy vektoru plC20H. Tím byl generován plasmid pCC' . Narl (5519)/Nrul (6316) fragment genomu adenoviru Ad5, připraveného z dam- pozadí, a Sall/Narl fragment z plasmidu pCC' .pak byly spolu ligovány a klonovány mezi Sall a Nrul místy vektoru pIC.20H. Tím byl generován plasmid pCD'.

C - Konstrukce plasmidu pCOl

Částečným odbouráváním plasmidu pCD' pomocí Xhol a pak úplným odbouráváním pomocí Sall byl generován fragment, který obsahoval sekvenci adenoviru Ad5 od místa Sau3A (3446) až k místu Nrul (6316). Tento fragment byl klonován do Sall místa plasmidu pCE. Tím byl generován plasmid pCOl (obrázek 1), který obsahoval levorukou část adenoviru Ad5 až do místa Hinfl (382), mnohonásobného klonovacího místa a Sau3A (3446)/Nrul (6316) fragmentu adenoviru Ad5.

• ·

1.2 Konstrukce vektoru pXL-CMV-Gax (srov. obrázek 2)

Gax cDNA byl klonován mezi Xbal a BamHI místy vektrou pCGN (Tanaka a Herr, Cell 60: 375-386, 1990). Výsledný vektor, pCGN-Gax, obsahoval promotorovou a enhancerovou -sekvenci cytomegaloviru (CMV) (-522, +72; Boshart a kol., Cell, 41: 521-530, 1985), hlavní sekvenci herpes simplex virus thymidin kiňasy, včetně AUG inicializačního kodonu, stejně jako prvních třech aminokyselin ( + 55, +1.04; Rusconi a Yamamoto, EMBO J. , 6: 1309-1315, 1987), sekvenci kódující HA1 epitop [Y Ρ Y D V P D Y A S L G G P (sekvence id. č. 1)], krysí gax cDNA a, nakonec, polyadenylační sekvenci králičího β-globinového genu (Pábo a kol., Cell, 35: 445-453, 1983).

Vektor pCGN-Gax pak byl přestřižen XmnI a S.fil a vzniklý fragment obsahující promotor, cDNA a polyadenylační sekvenci, byl pc úpravě podle Klenowa vložen do EcoRV místa .člunkového vektoru pCOl, který obsahoval adenovirové sekvence nutné pro rekombinaci. Plasmid, který byl získán byl označen pXh-CMV-Gax (srov. obrázek 2).

Příklad 2: demonstrace proliferaěně inhibičních vlastností plasmidu pXL-CMV-gax-HA.

Tento příklad popisuje postupy, které lze použít pro demonstraci kvality homologních rekombinačnich vektoru (srov. příklad 1), v ohledu exprese (detekce gax proteinu a HA epitopu) a v ohledu aktivity (vliv na proliferaci).

Buňky vaskulárního hladkého svalstva (vascular smooth-muscle cells - VSMC) byly kultivovány enzymatickým odbouráváním NZW králičí aorty způsobem upraveným podle Chamley a kol. (Cell Tissue Res. 177: 503-522 19.77). Stručně řečeno, po vyjmutí byla aorta inkubována při 37 °C po dobu 45 minut v přítomnosti kolagenasy (kolagenasa II, Cooper Biomedical). Druhé odbourávání se pak provádělo po dobu dvou hodin v přítomnosti kolagenasy a elastasy (Biosys), čímž byla získána buněčná • · * · · · • ····· · · suspenze.. Buňky byly udržovány v přítomnosti 20 fetálního telecího séra a použity pro všechny testy (srov. .dále). Ve všech těchto experimentech byly buňky hladkého svalstva charakterizovány imunoznačením pomocí anti-aSM aktin protilátky (F-3777, Sigma).

Pro Ověření kvality expresních vektoru (srov. Přiklad 1), byly přítomnost a umístění gax proteinu monitorovány u každého konstruktu úmunof luor.escencí. Aby bylo možně toto sledování provést, buňky hladkého svalstva nebo 3T3 buňky byly transf okovány plasmidy pXL-CMV-Gax‘^;' a pCGNgax v přítomnosti .směsi DOSPA/DOPE (Lipofectamine, Gibco BRL ) . Buňky byly inkubovány v přítomnosti komplexu DNA/liposom v médiu neobsahujícím fetální telecí sérum po dobu 4 až 8 hodin (optimální trvání: 8 hodin pro SMC). Po inkubaci po dobu 24 hodin v přítomnosti fetálního telecího séra byly buňky kultivovány na mikroskopické destičce (Titertek), při sledování imunofluorescence, po dobu dalších 24 hodin. Buňky pak byly fixovány v přítomnosti 4 f paraformaldehydu a následně permabilizovány přídavkem 0, 1 1 tritonu. Po nasyceni buněk v přítomnosti hovězího sérum albuminu (BSA, Sigma) , byla přidána pro úspěšné provedení pokusu anti-HA protilátka (12CA5, Bo.ehringer Mannheim) a. pak protilátka konjugované s fluoresceinem.

Imunofluorescenční pokusy provedené současně na ΝΪΗ3Τ3 buňkách a na primární kultuře králičích VSMC prokázaly, že jak plasmid pCGNgax t.ak člunkový plasmid pXL-CMV-Gax^i:/' skutečně kódují protein, který je umístěn v jádře (srov. obrázek 3A: kontrolní plasmid; 3B: plasmid pXL-CMV-Gax^H'^A) . Navíc bylo možné po extrakci jaderných proteinu z buněk transfokovaných pXL-CMV-Gax^:: prokázat, pomocí western blottu, protein, který je detekován protilátkou proti HA epitopu.

Pak byl zjišťován vliv uvedených vektorů na proliferaci buňky. Aby bylo možné toto stanovení provést byla použita • · · · · • · nepřímá metoda, která je založena na měření tvorby kolonie. Stručně řečeno, NIH3T3 myší embryonální buňky byly použity k provedení testu vzniku kolonie upraveným způsobem podle Schweighoffer a kol. (Mol. Cell. Biol. 1993, 13: 39-43).

Stručně řečeno, buňky jsou kotransfekovány s pLasmidem, který nese gen resistence na neomycin a s přebytkem požadovaného vektoru (pCGNgax nebo pXT,-CMV-Gax^: } . Po selekci v G418 byly kolonie obarveny roztokem karb.olf uchsinu (Diagnos t i ca, Merck) a spočítány. Výsledky representativního experimentu, které jsou uvedeny v tabulce 1, demonstrují snížení počtu kolonií v případě buněk transfokovaných pCGNgax.

Tabulka 1

Podmínky transfekce 3T3 buněk	Počet kolonií po selekci v G4.18
pCGN (5 μα) + pSV2neo (1 pg) (§)	183 + 28 (*)
pCGNgax (5 pg) + pSV2neo (1 pg)	93 + 11

(§) pCGN kontrolní vektor: nepřítomnost gax insertu {*) p < 0,01

Příklad 3: Konstrukce rekombinantního adenovirů Ad-CMVgax

Vektor pXL-CMV-Gax^HA, připravený podle příkladu 1, byl následně linearizován a kotransfekován, pro rekombinaci, s poškozeným adenovirovým vektorem do pomocných buněk (buněčná linie 293), které dodávají funkce kódované oblastmi adenovirů El (E1A a E1B).

Adenovirus Ad-CMVgax byl získán prostředky in vivo homologní rekombinace mezi adenovirem Ad.RSVpgal (Stratford Perricaudet a kol., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626) a vektorem pXL-CMV-Gax podle následujícího postupu: vektor pXL-CMV-Gax, linearizovaný s enzymem Xmnl, a adenovirus Ad.RSVPgal, linearizovaný s Clal, byly kotransfekovány do buněčné linie 293 v přítomnosti fosforečnanu vápenatého, aby mohla

probíhat homologní rekombinace. Rekombinantní adenoviry, které byly tímto způsobem generovány, byly vybrány destičkovým čištěním. Po izolaci byl rekombinantní adenovirus zmnožen v buněčné linii 293, což vede ke kapalině nad kulturou, která obsahuje nevyčištěné rekombinantní poškozené adenoviry, které mají titr 10 pfu/ml.

Virové částice byly čištěny odstřecfováním v gradientu chloridu česného podle známých pstupu (viz, zejména Graham a kol., Virologie 52 (1973) 456). Adenovirus Ad-CMVgax byl uchováván při -*80 °C ve 20 V (hmot.) glyeerolu.

Příklad 4: demonstrace proliferačhě inhibičních vlastností a deno v i ru Ad-CMVgax.

Tento příklad popisuje postupy, které lze použít pro demonstraci kvality rekombinantního adenoviru, v ohledu produkce gax proteinu a v ohledu biologické aktivity (vliv na buněčnou proliferaci).

Králičí aorta byla inkubována v přítomnosti adenoviru Ad-CMVgaxHA a kontrolního adenoviru (ad-RSVpGal: rekombinantní adenovirus exprimující β-ga1aktosidasu za kontroly RSV promotoru), který je naředěn v médiu (DMEM, 0,5 » FCS)· Po jedné hodině při 37 °C ve vlhké atmosféře bylo médium obsahující roztok adenoviru odsáto a nahrazeno novým médiem (DMEM, 0,5 FCS) na dobu 18 až 24 hodin. Pak bylo přidáno médium bohatě na FCS (konečná koncentrace FCS: 20 ), aby se stimulovala proliferace buněk a buňky byly po 24 hodinách a po 48 hodinách spočítány.

Navíc, 24 hodin po přidání roztoku adenoviru, byla monitorována exprese gax proteinu buňkami VSMC technikou popsanou v příkladu 2, zejména značením jádra prostředky imunofluorescence (lokalizace proteinu) a také western blottem. Protein produkovaný rekombinantním adenovirem je účinně detekován protilátkami, které rozpoznávají HA epitop a • · mají stejnou elektroforetickou mobilitu jako gax protein, který je detekován v jádře VSMC, které byly transfekovány s pCGNgax nebo pXL-CMV-Gax’’'. Obrázek 4 ilustruje umístění Gax proteinu ve VSMC, které byly inkubovány v přítomnosti Ad-CMVgaxHA.

Výsledky representativního experimentu, které jsou uvedeny v na obrázku 4, demonstrují znatelné snížení počtu buněk po přidání Ad-CMVgaxHA viru. Na druhou stranu, toto snížení počtu buněk nebylo pozorováno po působení kontrolního adenoviru použitého ve stejné koncentraci (M.O.I. 1000). Současně jsme pomocí imunofluorescence ověřili, že tato vysoká infekčnost umožňuje jak β-gal značkovému genu (použití anti-E.Coli β-gal protilátky, Monosan) tak gax proteinu (použití anti-HA protilátky, srov. příklad 2), áby byly exprimovány ve více než 90 i populace králičích VSMC,.

Přidání ad-RSV^gal viru je spojeno se slabým cytostatickým efektem (-13 «·) po kultivaci po dobu 24 hodin v přítomnosti fetálního telecího séra (20 %). Za stejných experimentálních podmínek vedlo působení Ad-CMVgaxHA k 57% snížení počtu buněk (srov. obrázek 5) . Biologická aktivita Ad-C-MVgaxHA viru je velmi zřejmá po 48 hodinách kultivace a dokonce může souviset i s buněčnou smrtí (srov. obrázky 6a 7).

Tak je blokování proliferace, která je způsobena Ad-CMVgaxHA, spojeno se znatelným snížením počtu buněk, které lze detekovat po kultivaci po dobu 24 hodin (srov. obrázek 5). Je zajímavé, že tento vliv Ad-CMVgaxHA byl pozorován u buněk, které byly stimulovány vysokou koncentrací FCS (20 %), ale ne u buněk, které byly zbaveny FCS (0,5 I) (srov. obrázek 6) . Tento příklad proto ukazuje, že rekombinantní adenovirus, který kóduje gax protein, muže účinně blokovat buněčné dělení bez jakéhokoliv znatelného vlivu na životnost buněk, které jsou blokovány v G0 fázi jejich cyklu.

Vliv Ad-CMVgaxHA adenoviru na životnost VSMC v kultuře je dále ilustrován obrázkem 7.

Inhibiční vlastnosti Ad-CMVgaxHA na syntézu DNA byly potvrzeny pokusy o začlenění bromdeoxyuridinu (BrdU). Stručně řečeno, po 24 hodinách po přidání adenoviru, byly inkubovány VSMC v přítomnosti FCS (10 % až 20 %) a BrdU (10 uM), který je do buněk začleňován místo thvminu při fázi DNA syntézy a lze jej detekovat specifickými protilátkami. Začlenění BrdU bylo kvantifikováno pomocí průtokové cytometrie.

Tentýž způsob průtokové cytometrie byl použit pro vizualizaci postupu králičích VSMC buněk, upravených Ad-CMVgaxHA, v jejich buněčném cyklu. Působení Ad-CMVgaxHA je spojeno s blokováním buněčného cyklu ve fázi G.0/G1.

Příklad 5: inhibice intimální hyperplasie pomocí adenovlrus-gax in vivo.

Tento příklad ukazuje účinnost rekombinantních adenoviru v modelu vaskulární patologie.

Použitý model arteriální léze je založen na obrušování krysí karotidy (Clows a kol., Lab. Invest. 49 (1983) 327-333). U tohoto modelu, VSMC dediferencují, proliferují a migrují do formy neointimy, která může částečně pohlcovat arterii, do dvou týdnu po poškození.

Sprague-Dawley krysy byly anestetikovány intraperitoneální injekcí pentobarbitalu (45 mg/kg). Následovala vnější karotidová arteriotomie, krysí karotidové arterie byly obnaženy balónkovým katetrem a vystaveny 1.10^ pfu Ad-CMVgaxHA nebo Ad-RSVPGal. Adenovirus byl použit v roztoku obsahujícím 15 i poloxameru 407, který usnadňuje přenos genu adenoviru. Dvacet minut po inkubaci byl roztok viru odebrán a byly odstraněny ligatury, čímž byla obnovena cirkulace. Krysy byly utraceny po dvou týdnech a na řezu léčených cév byly provedeny ·· ·· • · · · • · · · • · · · · ♦ · · kvantitativní morfometrické analýzy. Výsledky jsou uvedeny na obrázcích 8 a 9.

Získané výsledky ukazují, že všech devět Ad-RSVp-Gal transfekovaných karotidových arterií mělo silnou VSMC proliferaci a rozvoj znatelného neointimálního ztluštění. Plocha neointimy byla 0,186 (/-0,02 mm (SEM) s rozsahem 0,10 až 0,28. Luminální patentenee byla příslušně zúžena na 40 + /4 i (rozsah 21 až 63), obrázek 8C, Poměr intima : media byl 1,51 +/- 0,1 (rozsah 0,87 až 2,17). Tyto výsledky byly podobné výsledkům získaným drive u kontrolních cév, na které se působilo fyziologickým roztokem. Na rozdíl od toho, působení Ad-CMVgaxHA znatelně snížilo.patologickou reakci na poškození balónkem. U cév .léčených Ad-CMVgaxHA byla průměrná plocha neo: n ti má lni leze 0, 076 +/- 0,02 mm (rozsah 0 až 0,19), luminální zeslabení bylo sníženo na 17,5 + /- 5 I. Statistická analýza potvrdila, že léčení Ad-CMVgaxHA znatelně inhibuje rozvoj intimálního ztluštění relativně ke kontrolám Ad-RSVp-Gal. Konkrétně, léčení Ad-CMVgaxHA snížilo poměr intima ; media o 69 ·£, intimální plochu o 59 % a luminální zeslabení o 56 i (obrázky 8A a 8B). Znatelný vliv na intimální hyperplasii byl dále zdůrazněn výsledky získanými z průřezů kontrolních (obrázek 9A) nebo léčených (obrázek 9B) zvířat.

Tento příklad demonstruje velmi účinnou aktivitu při zastavování rustu konstruktu Ad-CMVgaxHA in vivo. Tato aktivita je vlemi specifická a nebyla pozorována u kontrolních zvířat.. Presentované výsledky jasně ukazuji terapeutickou aktivitu Ad-CMVgaxHA na vaskulární morfologii a zejména na hyperplasii, která je spojena s postangioplastickou restenosou. Použití viru, jako je adenovirus, pro přenos Gax genu in vivo je zvlášť účinné. Tento způsob je dále výhodný, protože je založen na nahrazení genu. Tento způsob je jedinečný v tom, že spojuje účinnost dopravy a genovou terapii do dvou terapeutickch vlastností: zastavení rustu a ·« ···to to· ·· • ·· ···· · ···· • · ··· · · ·· ··· · ··· ·· ·· ·· ·· ··· ···· ·· · konstitutivní expresi ve vaskuTárním systému. Přenos Gax genu podle předkládaného vynálezu vyvolává specifickou regresi hyperproliferaťivního onemocnění vaskulární cévy a následně tak normalizuje arteriální funkce. Místní přenos Gax genu podle předkládaného vynálezu je také zejména výhodný v tom, že nevadí reendothelizačnímu procesu, který následuje po lézi artěrie. Navíc, kromě přímého vlivu na buněčnou proliferaci a vaskulární morfologii, přenos gax genu podle předkládaného vynálezu může také mít užitečný nepřímý vliv na syntézu extracelulární matrice a na remodelaei. Tyto výsledky ukazují, že přenos Gax genu podle předkládaného vynálezu je výrazný nový pokrok v léčení vaskulárních lézi, které vznikají po angioplastii.

Seznam sekvencí (1) Obecné informace:

(i) Vynálezce:

Jméno: CASE WESTERN RESERVE UNIVERSITY

Ulice:

Město: Cleveland Stát: Ohio

Země: USA

Poštovní kód: 44106 (i) Vynálezce:

Jméno: Branellec, Didier Ulice: 1, Rue Saint-Benoit Město: 94210 La Varenne-Saint Hilaire Stát:

Země: Francie

Poštovní kód:

·· · · · · • · · • · · • · · · · • · • · · (i) Vynálezce:

Jméno: Walsh, Kenneth Ulice: 207 Judy Farm Road Město: Carlisle Stát: Massachusetts Země: USA

Poštovní kód: 01741 (i) Vynálezce:

Jméno: Isner, Jeffrey M.

Ulice: 34 Brenton Road Město: Weston

Stát: Massachusetts Země: USA

Poštovní kód: 02193 (ii) Název vynálezu: Virové vektory a jejich použití pro léčení hyperprofilerativních nemocí, zejména restenosy (iii) Počet sekvencí: 1 (iv) Korespondenční adresa:

(A)	Adresa	.: Rhone-Poulenc	Rorer
(B)	Ulice:	500 Arco1a Rd.	3C43
(C)	Město:	Collegeville
(D)	Stát:	PA
(E)	Země:	USA
(F)	Poštovní kód: 19426

(v) Forma čitelná pro počítač:

(A) Typ média: disketa (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release č. 1.0, Verze č. 1.30 ·· ·· • · · · • · · · • · ··· · • · · (vi) Údaje o současné přihlášce:

(A) Číslo přihlášky: PCT (B) Datum podání:

(C) Klasifikace:

(vii) Údaje o předchozí přihlášce:

(A) Číslo přihlášky: Er 95-04234 (B) Datum podáni: 31. 3. 1995 (viii) Informace o právním zástupci / ..agentovi (A) Jméno: Savifzki, Martin F.

(B) Registrační číslo: 26,699 (C) Číslo reference / označení: ST95022-US (ix) Telekomunikační údaje:

(A) Telefon: (-610)454-3816 (B) Telefax: (610)454-3808 (2) Údaje o sekvenci id. č. 1:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 14 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (C) Vláknitost:

(C) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (v) Typ fragmentu: vnitřní (ix) Popis sekvence: sekvence id. č. 1:

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Gly Gly Pro • · • 4 4 · • 4 4 4

4 4 4 4

4 4

Průmyslová využitelnost

Virové vektory podle předkládaného vynálezu jsou průmyslově využitelné při výrobě léků pro léčeni nyperproiiferativních nemoci, zejména restenosy.

Claims

Poškozený rekombinantní virus obsahující přinejmenším

jeden vložený gen kódující celý nebo část GAX proteinu nebo variantu tohoto proteinu. 2. Virus podle nároku 1, ve kterém v jeho genomu chybí oblasti, které jsou nezbytné pro jeho replikaci v infikované buňce. 3. Virus podle nároku 1 nebo 2, který je adenovirus, s

výhodou typu Ad 5 nebo Ad 2.
4. Virus podle nároku 1 nebo 2, který je adenovirus zvířecího, s výhodou psího, původu.
5. Virus podle jednoho z nároků 1 nebo 2, ve kterém vložený gen kóduje celý nebo část krysího GAX proteinu nebo variantu tohoto proteinu.
6. Virus podle nároku 5, ve kterém vložený gen kóduje krysí GAX protein nebo jeho lidský homolog.

7. Virus podle jednoho z nároků 1 nebo 2, ve kterém vložený gen je cDNA. 8. Virus podle jednoho z nároků 1 nebo 2, ve kterém vložený gen j e gDNA. -9. Virus podle jednoho z nároků 1 nebo 2, ve kterém vložený gen obsahuje sekvence, které mu umožňuj i být exprimován v infikované buňce. 10. Virus podle jednoho z nároků 1 nebo 2, ve kterém vložený

gen obsahuje signální sekvenci, která směruje syntetizovaný polypeptid do sekrecních cest cílové buňky.
11. Adenovirus podle nároku 3, který obsahuje deleci celé nebo části oblasti El.
12. Adenovirus podle nároku 11, který navíc obsahuje deleci celé nebo části oblasti E4 .
13. Virus podle nároku 1 nebo 2, který je adenosouvisející virus (adeno-associated virus - AAV).
14. Virus podle nároku 1 nebo 2, který je retrovirus.

.......„ZMÉNĚNý.USr
15. Použití viru podle jednoho z nároku 1 nebo 2 pro přípravu farmaceutického prostředku, který je určen pro léčení nebo prevenci patologií, které Souvisejí s hyperprolíferativními nemocemi.
16. Použití podle nároku 15, pro přípravu farmaceutického prostředku, který je určen pro léčení restenosy.
17. Farmaceutický prostředek, v v z na č u j ící s e tím, že obsahuje jeden nebo více poškozených rekombinantních viru podle jednoho z nároku í nebe 2.
18. Farmaceutický prostředek podle nároku 17, v y z n ač u j í c í se tím, že je v injikovatelné formě a tím, že obsahuje 10⁴ až IO⁵⁴ pfu adenovi.ru/ml.
19. Farmaceutický prostředek podle nároku 18, vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní adenovirus, který je nasycen do hydrogelu.