CZ145599A3 - Způsob obnovení translační aktivity závislé na p53 v buňkách, jednořetězcové protilátky proti p53 a DNA, které je kódují, jejich použití a prostředky, které je obsahují - Google Patents

Způsob obnovení translační aktivity závislé na p53 v buňkách, jednořetězcové protilátky proti p53 a DNA, které je kódují, jejich použití a prostředky, které je obsahují Download PDF

Info

Publication number
CZ145599A3
CZ145599A3 CZ991455A CZ145599A CZ145599A3 CZ 145599 A3 CZ145599 A3 CZ 145599A3 CZ 991455 A CZ991455 A CZ 991455A CZ 145599 A CZ145599 A CZ 145599A CZ 145599 A3 CZ145599 A3 CZ 145599A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
protein
mutated
vector
nucleic acid
cell
Prior art date
Application number
CZ991455A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ300526B6 (cs
Inventor
Laurent Bracco
Laurent Debussche
Original Assignee
Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone-Poulenc Rorer S. A. filed Critical Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Publication of CZ145599A3 publication Critical patent/CZ145599A3/cs
Publication of CZ300526B6 publication Critical patent/CZ300526B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4746—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used p53
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Způsob obnovení translační aktivity závislé na p53 v buňkách, jednořetězcové protilátky proti p53 a DNA, které je kódují, jejich použití a prostředky, které je obsahují
4.
Oblast techniky
Předložený vynález se týká postupu obnovy transaktivační aktivity p53-dependentní v buňkách, které mají mutovaný protein p53, zbavený funkce nebo se sníženou funkcí transkripčního faktoru. Postup podle vynálezu se týká použití jednořetězcových protilátek schopných specificky vázat mutovaný protein p53. Týká se také nových molekul schopných specificky a účinně vázat proteiny p53 a molekul umožňujících mimo jiné obnovu aktivity p53 nádorových buněk, stejně jako nukleových kyselin kódujících tyto molekuly a vektory je obsahující. Tato metoda a molekuly podle vynálezu jsou použité in vitro nebo ex vivo pro studium mechanizmu účinku p53 a jeho mutovaných forem nebo pro purifikaci proteinů p53. Představují také použití in vivo, zejména v terapeutických přístupech obnovení aktivity p53 v patologických souvislostech takových, jako jsou zejména rakoviny.
Dosavadní stav techniky
Divoký protein p53 působí při regulaci buněčného cyklu a při udržování neporušenosti genomu buňky. Tento protein, jehož základní funkce je být aktivátorem transkripce určitých genů, je schopný procesem, ne ještě dobře definovaným, blokovat buňku ve fázi G1 buněčného cyklu za současného objevení se mutace v průběhu replikace genomu a spustit určitý počet metod opravy DNA. V případě špatné funkce tohoto procesu opravy nebo v případě objevení se tak velkého počtu zjevných mutací, než aby byly opraveny, je tento protein schopen indukovat fenomen programované buněčné smrti, nazvané • fc ··· · • fc · apoptosa. Tímto způsobem protein p53 působí jako supresor nádoru za vyloučení odlišných nenormálních buněk nebo buněk, jejichž genom byl poškozen.
Tato základní funkce p53 závisí na funkci transkripčního faktoru totiž, na jiných vhodných schopnostech rozpoznávat specifické sekvence na úrovni genomické DNA a spustit systém transkripce.
Protein p53 zahrnuje 393 aminokyselin, které tvoří 5 funkčních oblastí:
oblast aktivátoru transkripce tvořená nukleovými kyselinami 1 až 73 schopná vázat určité faktory základního systému transkripce jako je protein TPB. Tato oblast je také místem určitého počtu posttranslačních modifikací. Je také místem interakcí počtu proteinů p53 s počtem jiných proteinů, zejména s buněčným proteinem mdm.2 nebo proteinem EBNA5 viru Epstein-Barrové (EBV), schopnými blokovat funkci divokého proteinu. Tato oblast je tvořena sekvencemi aminokyselin řečenými PĚST schopnými proteolytické degradace.
- vazebná oblast DNA, umístěná mezi aminokyselinami 73 a 315. Konformace této centrální oblasti p53 řídí rozpoznání specifických sekvencí DNA proteinu p53. Tato oblast je místem dvou různých typů udějících funkci divokého proteinu:
(i) interakce s proteiny blokujícími funkci p53 jako je například antigen 'velké T' viru SV40 nebo virové proteiny E6 viru HPV16 a HPV18 schopné vyvolat degradaci ubikvitinovým systémem. Tato posledně zmíněná interakce se může tvořit jen v přítomnosti buněčného proteinu E6ap (enzym E3 ubikvitinové kaskády).
(ii) přesné mutace, které udělují funkci p53 a funkci p53, jehož quasicelek je umístěn v této oblasti,.
- signál nukleární lokalizace tvořený aminokyselinami 315 až 325 nepostradatelný pro správné vyslání proteinu do • · · · · · • · • · · · • 9 9 9 • · 9 ·
999 999 ·
» · · · částí, kde protein bude vykonávat svou základní funkci.
oblast olígomerace tvořená aminokyselinami 325 až 355. Tato oblast 325 až 355 tvoří strukturu typu: skládaný list β (326-334)-ohyb (335-336)-a helix (337-355). Změny funkcí umístěných v této oblasti jsou zejména způsobeny interakcí divokého proteinu s různými mutovanými formami, které mohou vést k různým vlivům na funkci divokého proteinu.
- oblast regulace tvořená aminokyselinami 365 až 393, která je místem určitého počtu posttranslačních modifikací (glykosylace, fosforylace, fixace RNA ...), které modulují funkci proteinu p53 pozitivně nebo negativně. Tato oblast hraje velmi důležitou roli v modulaci aktivity divokého proteinu.
Funkce proteinu p53 může být porušena různými způsoby.
- blokací jeho funkce určitým počtem faktorů jako je například antigen 'velké T' viru SV40, protein EBNA5 viru Epstein-Baarové nebo buněčný protein mdm2.
- destabilizací proteinu zvýšením jeho citlivosti k proteolyse, zejména interakcí s proteinem E6 lidského papilomaviru HPV16 a HPV18, který upřednostňuje vstup p53 do ubikvitinového cyklu. V tom případě interakce mezi těmito dvěma proteiny může být uskutečněna jen předběžnou fixací buněčného proteinu, proteinu E6ap, jehož místo fixace je nedostatečně známé.
- přesnou mutací na úrovni genu p53
- delecí jedné nebo dvou alel p53.
Tyto dvě posledně zmíněné modifikace jsou pozorovány v 50% různých typů rakovin. V tomto ohledu mutace genu proteinu p53 v rakovinových buňkách zasahují velmi velkou část genu, který kóduje tento protein a mají za následek různé modifikace funkcí tohoto proteinu. Lze s určitostí ft · • ft ftftftft • ft · • ftftft • ftftft ftftft ····· • ftftft • ft · • ftft · ft · · · poznamenat, že tyto mutace jsou z velké části lokalizovány v centrální části proteinu p53, o které se ví, že je to kontaktní oblast se specifickými genomickými sekvencemi proteinu p53. To vysvětluje, proč většina mutantů proteinu p53 má jako základní vlastnost nefixovat se více na sekvence DNA, které rozpozná divoký protein, a nemůže více vykonávat svou úlohu transkripčního faktoru. Jinak se zdá, že určití mutanti mejí získané nové funkce takové, jako je aktivace určitých genů na transkripční úrovni.
Tyto modifikace jsou. rozděleny do třech skupin:
- mutace řečené slabé, jejichž produkt je nefunkční protein, který v případě mutace na jedné ze dvou alel nemá vliv na funkci divokého proteinu kódovaný jinou alelou. Hlavními zástupci této skupiny jsou mutanti H273 a W2-48, posledně jmenovaný je specifický rodinnému syndromu Li-Fraumeni hypersenzibility k rakovinovým účinkům.
dominantně negativní mutace, jejichž produkt je nefunkční protein, který v případě mutace na jedné ze dvou alel a interakcí s divokým proteinem je schopný blokovat funkci tohoto proteinu tvorbou směsí neaktivních oligomerů, které se nemohou více fixovat na sekvenci specifické DNA
I divokého proteinu. Hlavní zástupce této skupiny je mutant G281.
dominantně onkogenní mutace, jejichž produkt je protein, který je schopný částečně blokovat funkci divokého proteinu jako mutanti předchozí skupiny a kromě toho podporovat nedostatečně známými mechanizmy tumorální vývoj, vyjadřující také zisk funkce. Hlavní zástupce této skupiny je mutant H175.
Po zhodnocení antitumorálních a apoptických vlastností a jeho zahrnutí do počtu patologií hyperproliferativního typu byl gen divokého p53 použit v přístupech genové a buněčné terapie. Zejména byl navržen pro ošetření různých ·· ···· hyperproliferativních patologií, zejména rakovin, podáváním in vivo genu divokého proteinu p53, opravením funkcí p53. Podávání může být provedeno především pomocí virových vektorů, zejména adenovirových (WO94/24297) nebo retrovirových (W094/06910). Bylo pozorováno, že vložení nukleové kyseliny kódující divoký protein p53 umožňuje opravit zejména normální regulaci buněčného růstu (Roth et al., Nátuře Medicine 2 (1996) 985). Byly také vyvinuty alternativní postupy založené na použití chimérických molekul, které mají vlastnosti typu p53 (PCT/FR96/01111) .
Jiný přístup pro opravení funkcí divokého proteinu p53 je založen na reverzi mutovaných endogenních proteinů skrz divoký fenotyp totiž fenotyp, který má vlastnosti supresoru tumoru a apoptické vlastnosti divokého p53. Tento přístup vyplývá z poznatku, že ztráty funkčnosti mutantů p53 jsou způsobeny konformační změnou proteinu indukovanou mutací či. mutacemi. V tomto ohledu přihláška vynálezu WO94/12202 ukazuje, že monoklonální protilátka, zejména označená jako pAb421 řízená proti proteinu p53 je schopná opravit určité třídě mutantů často přítomných v lidských rakovinách vazebné funkce DNA in vitro. Použití tohoto typu kompozic představuje zatím nepříjemné hledisko spojené zejména se zvýšeným množstvím nezbytné protilátky (a tedy spojené s problémy produkce/purifikace) a s jejich slabou intracelulární penetrací.
Podstata vynálezu
Předložený vynález popisuje přístup pro opravu divokých vlasností mútantu proteinu p53. Předložený vynález popisuje zejména konstrukci ligandů specifických zejména proteinu p53, které mají výhodné vlastnosti pro obnovu funkcí divokého proteinu p53. Předložený vynález zejména popisuje konstrukci jednořetězcové protilátky (ScFv) specifické proteinu p53, ·« ···· ·· · zejména molekule 11D3. Předložený vynález ukazuje mimo jiné, že ScFv jsou schopné rozpoznat p53, jsou schopné být účinně exprimovány ve středu tumorální ' buňky a jsou schopné reaktivovat část transaktivační funkce určité třídy mutantů proteinu p53.
Vzhledem k metodám vedlejších oborů tato molekula má významné výhody, zejména možnost být exprimována in šitu v tumorální buňce ve významném množství. Výsledky, které jsou uvedeny dále jsou tím spíše neočekávané, že ztráta účinnosti byla často pozorována mezi klasickou protilátkou a ScFv. Mimoto předkladatel ukázal, že je možné exprimovat ScFv ve vhodných intracelulárních kompartmentech, umožňující získat optimální biologickou aktivitu.
První předmět vynálezu spočívá tedy v metodě pro obnovení transaktivační aktivity p53-dependentní mutovaného proteinu přítomného v buňce zahrnující vložení jednořetězcové protilátky schopné specificky vázat mutovaný protein p53 do výše uvedené buňky. Postup podle vynálezu výhodně zahrnuje vložení nukleové kyseliny obsahující sekvenci kódující výše uvedenou jednořetězcovou protilátku do buňky pod řízení promotoru funkčního v buňce. Jiné hledisko vynálezu se týká použití jednořetězcové protilátky schopné specificky vázat mutovaný protein p53 pro modifikaci konformace výše uvedeného proteinu. Předložený - vynález ' se také týká použití jednořetězcových protilátek schopných specificky vázat mutovaný protein p53 pro přípravu farmaceutické kompozice určené k léčení hyperproliferativních poruch, ve kterých je zahrnut mutovaný protein p53, stejně jako použití nukleové kyseliny kódující jednořetězcovou protilátku schopnou specificky vázat mutovaný protein p53 pro přípravu farmaceutické kompozice určené pro léčení hyperproliferativních chorob, ve kterých je zahrnut mutovaný protein p53.
Postup podle vynálezu se tedy týká konstrukce, • · ···· • · • ·« · • fc vektorizace a vložení jednořetězcové protilátky schopné specificky vázat mutovaný protein p53 do buněk. Jednořetězcové protilátky (ScFv) jsou tvořeny zejména oblastí VH ramenem spojenou s oblastí VL. Konstrukce ScFv a sekvence nukleových kyselin kódující takovéto modifikované protilátky byly popsány například v US4,946,778 nebo v W094/02610, WO94/29446 zahrnutých do literatury.
Předložený vynález popisuje zejména tvorbu hybridové banky produkující protilátky řízené proti p53 a konstrukci z této banky odpovídající ScFv. Popisuje také klonování odpovídajících nukleových kyselin v expresních ’ vektorech a jejich přenos do buňky. Ukazuje také, že tento přenos umožňuje,in vivo účinně opravit aktivitu vázání DNA mutantu proteinu p53 stejně jako jejich třansaktivační aktivitu.
Postup podle vynálezu uvádí ScFv schopné specificky vázat epitop přítomný- v oblasti C-konce proteinu p53, který nese oblast oligomerizace a oblast regulace. V tomto ohledu předložený vynález popisuje také test umožňující selekci ScFv majících tyto vlastnosti technikou ELISA.
ScFv použité v postupu podle vynálezu jsou schponé specificky vázat epitop přítomný v oblasti C-konce proteinu p53 obsažený mezi rezidui 320-393. V tomto ohledu předložený vynález popisuje příklad konstrukce a exprese ScFv ScFv421 sekvence SEQ ID n°l a 11D3 sekvence SEQ ID n°2.
Postup podle vynálezu je všeobecně aplikovatelný na mutované proteiny p53, které ztratily částečně nebo úplně schopnost vázat DNA a postup podle vynálezu umožňuje opravit tuto schopnost. Postup podle vynálezu je aplikovatelný na mutované proteiny p53, které ztratily částečně nebo úplně funkci transkripčního faktoru proteinu p53 a umožňuje opravit tuto funkci. Stupeň obnovy může být úplný' nebo částečný. Výhodně je dostačující, aby bylo umožněno mutantu vykonávat funkci supresoru tumoru blokováním buněčného cyklu nebo/a ·· 4
4444 • 4 ·· · · • : ; ; í · · · · · • 4 4 4 4 4444 4 ·44 444 indukcí apoptózy. Postup podle vynálezu umožňuje tedy opravit alespoň částečně aktivitu supresoru tumoru v buňkách majících mutované endogenní proteiny p53 zbavené této aktivity. Výhodně se jedná o mutované proteiny přítomné v nádorové buňce. Jak je již naznačeno, v nádorové buňce byly uplatněny různé mutované formy proteinu p53. Například se mohou uvést proteiny p53H273, p53W248 a p53G281. Dále uvedené příklady ukazují zejména, že postup podle vynálezu umožňuje modifikovat konformaci a biologické vlastnosti těchto mutantů in vitro a in vivo. Tyto příklady zejména ukazují, že ScFv 421 a 11D3 jsou schopné opravit mutantům 273 a 248 jejich schopnost specificky vázat DNA a indukovat transaktivaci proteinu p53-dependentní.
Postup podle vynálezu může být uskutečněn in vitro, ex vivo nebo in vivo. V postupu in vitro nebo ex vivo molekuly podle vynálezu mohou umožnit například studii mechanizmu účinku proteinu p53 a jeho mutovaných forem. Mimoto molekuly podle vynálezu mohou být použity pro detekci nebo purifikaci proteinů p53, například vazbou na nosič, uvedením do kontaktu s roztokem obsahujícím proteiny p53, případně následovaným objevením vytvořených komplexů nebo elucí. V případě in vivo zejména u člověka mohou tyto molekuly umožnit v patologických souvislostech takových, jako jsou hyperproliferativní choroby, ve kterých je pozorován nedostatek aktivity proteinu p53 opravu této funkce. V tomto ohledu se. postup může použít ve spojení s dalšími přístupy naznačenými dále (vložení genu divokého proteinu p53) nebo také ve spojení s chemoterapií (WO96/22101) . V případě in vivo postup a molekuly podle vynálezu jsou vždy použitelné u zvířat, například pro určení úrovně exprese ScFv a pro určení možnosti přístupu pro lidskou terapii.
Buňka, která obsahuje mutovaný protein.p53 je výhodně savčí nádorovou buňkou. V tomto ohledu se mohou uvést zejména buňky rakoviny plic (zejména ne malých buněk), tračníku,
BB ···· ·· • · · · • · · · ··· BBB
ΒΒΒΒ jater, mozku, hlavy a krku, všeobecněji se může uvést každá rakovina, ve které je pozorována mutovaná forma proteinu p53. Výhodně se jedná o lidské nádorové buňky, ve kterých jsou pozorováni mutanti p53H273, p53W248 nebo/a p53G281 (plíce, tračník, mozek, hlava a krk, játra) . Aplikovatelnost postupu podle vynálezu na jednotlivou buňku může být snadno určena podle následující metodologie: buňka je nejdříve charakterizovaná pro přítomnost mutovaného proteinu p53. Tento protein je potom charakterizován pro určení povahy mutace. Jedná-li se o známou mutaci, zejména o mutaci uvedenou dále, buňka může být považována za vhodnou pro ošetření postupem podle vynálezu. Jedná-li se o mutaci neoznačenou, jsou možné různé přístupy. Mutovaný protein může být nejdříve izolovaný (nebo uměle syntetizovaný) a testovaný tak, jak je popsáno v příkladech pro své chování in vitro nebo in vivo v přítomnosti ScFv. To umožňuje identifikovat vhodnou, ScFv pro opravu nedostatečných funkcí tohoto proteinu. Jiný přístup spočívá v přímém testování ScFv na buněčné kultuře pro určení biologického účinku ScFv.
Pro uvedení postupu podle vynálezu je ScFv výhodně vložena do buňky in vitro, ex vivo nebo in vivo ve formě vektoru nesoucího nukleovou kyselinu kódující uvedenou ScFv pod řízení promotoru funkčního v uvedené buňce.
Promotor je výhodně vybrán mezi promotory účinými v savčích buňkách, přednostně v lidských. Výhodněji se jedná o promotor umožňující expresi sekvence nukleových kyselin v hyperproliferativní buňce (rakovina, restenosa, atd.). V tomto ohledu mohou být použity různé promotory. Může se jednat například o vlastní promotor genu proteinu p53. Může se jednat také o sekvence různého původu (sekvence odpovědné za expresi jiných genů nebo stejných syntetických). Může se také jednat o každý promotor nebo odvozenou sekvenci stimulující nebo potlačující transkripci genu specifickým způsobem nebo nespecifickým, indukovatelné nebo ·· ···· ·· · • · · · · · • · · · · · • ··· · ···· ······ ···· ·» ·· · ·· ·· • · · · • · · · ··· ··· • · ·· ·· neindukovatelně, silně nebo' slabě. Mohou se zejména uvést sekvence promotoru eukaryotních genů nebo genů virových. Například se může jednat o sekvence promotorů vzešlých z genomu cílové buňky. Mezi promotory eukaryontů se mohou použít zejména ubikvitinové promotory (promotor genů HPRT, PGK, α-aktinu, tubulinu, DHFR atd.) promotorů středních filament (promotor genů GFAP, desmin vimentin, neurofilamenty, keratin atd.) promotorů terapeutických genů (například promotory genů MDR, CFTR, faktor VIII, ApoAI atd.) promotory specifických tkání (promotor genu pyruvát-kinasy, vilinu, vazebný střevní protein mastných kyselin, a-aktin hladkého svalstna atd.), promotory buněk specifického typu buněčného dělení jako jsou rakovinové buňky nebo také promotory odpovídající stimulům (receptor steroidních hormonů, receptor kyseliny retinové atd.). Stejně tak se může jednat o sekvence promotorů pocházející z genomu virů takových, jako jsou například promotory genů E1A a MLP adenovirů, raný promotor CMV nebo také promotor LTR RSA atd. Mimoto tyto oblasti promotorů mohou být modifikovány adicí aktivačních sekvencí, regulačních nebo sekvencí umožňujících expresi tkáňově.specifickou nebo majoritní.
Jak je již naznačeno, předložený vynález se týká také nových molekul, které mají zejména výhodné vazebné a reverzní vlastnosti mutovaného, proteinu p53. Předložený vynález přesněji popisuje konstrukci, vektorizaci 'a přenos ScFv (11D3, 421) do buněk. Nukleová a peptidová sekvence těchto ScFv je naznačena SEQ ID n°l a 2. Enzymy, které často zejména výhodně ukazují schopnost těchto molekul (i) specificky vázat mutované proteiny p53 v oblasti C-konce, (ii) vrátit mutovaným proteinům schopnost vázat DNA a (iii) vrátit těmto proteinům schopnost transkripční aktivity. Příklady mimo jiné ukazují, že tyto molekuly jsou správně exprimované v nádorových buňkách, což umožňuje jejich výhodné použití v souvislosti s hyperproliferativními chorobami. Jinak tyto vlastnosti ScFv mohou být podle vynálezu zlepšeny. Zejména je ···♦ • ·
«· · • · · · • · · · · • · · · «··· ·
9 · · ·· ·· • · · · • 9 9 ·
známo, že afinita ScFv je ovlivněna oblastmi CDR (podtrženo na sekvenci) a může být zvýšena rutinním zásahem mutageneze/selekce. Mutageneze na protilátkách byla například popsána Marksem et al. (Bio/Technology, 10,779-783, 1992) a
Winterem G.a Milsteinem C. (Nátuře, 349, 293_299, 1991).
Technologie popsané v odkazech mohou být aplikovány na přípravu variant. ScFv majících modifikovanou aktivitu podle vynálezu. Potom může být provedena selekce za podmínek popsaných v příkladech.
Předložený vynález se tedy týká molekuly 11D3, jejíž peptidová sekvence je vyjádřená SEQ ID n°2, stejně jako každé varianty vyjadřující modifikaci v oblastech CDR zachovávající schopnost vázat protein p53. Modifikace může být provedena delecí, substitucí nebo inzercí jednoho nebo více reziduí v oblastech CDR. Modifikace se výhodně týká méně než 10 reziduí.
Předložený vynález má také za předmět každou nukleovou kyselinu kódující ScFv 11D3 nebo variantu takovou, jaká je již popsána.
Nuklěová kyselina podle vynálezu může být ribonukleová kyselina (RNA) nebo deoxyribonukleová kyselina (DNA). Výhodně se jedná o komplementární DNA (cDNA). Může být původu lidského, zvířecího, virového, syntetického nebo semisyntetického. Může být získána různými způsoby zejména chemickou syntézou za použití sekvencí uvedenených v přihlášce vynálezu například lze uvést syntetizér nukleových. kyselin. Může být také získána tříděním bank prostřednictvím specifických sond zejména takových, jaké jsou popsány v předloženém vynálezu. Mohou být také získány směsnými technikami, zahrnujícími chemickou modifikaci (elongaci, deleci, substituci atd.) vytříděných sekvencí z banky. Všeobecně nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být připraveny podle každé odborníky známé techniky (viz zejména technologie popsané v US4,946,778 a W094/02610 zahrnutých v
»0 »000
0« 0 • » · «
0 0 0
0 0 0 0000 ·
0 0 0 00 0
0 0000 0· přítomných odkazech). Klasický postup konstrukce nukieových kyselin kódujících ScFv je .následující: cDNA kódující oblasti VH a VL jsou získány dd hybridomu produkující vybranou protilátku anti-p53. Proto úplné RNA hybridomu jsou extrahovány a podrobeny reakci inverzní transkripce za použití random hexamerů jako nástrojů. Použití tohoto typu nástroje umožňuje vyhnout se použití specifických nástrojů imunoglobulinu. Získané klony cDNA mají dostatečnou délku pro klonování oblastí V. Když představují velmi slabou frakci přítomných úplných cDNA může být provedena předběžná reakce amplifikace pro dostatečnou produkci DNA pro klonování. Proto cDNA kódující oblasti VH a VL jsou amplifikovány odděleně. Použité nástroje jsou oligonukleotidy hybridující na úrovni opačných konců různých oblastí každého řetězce (Ha L). Potom je purifikován produkt amplifikace používající specifické nástroje těžkých řetězců a produkt amplifikace používající specifické nástroje lehkých řetězců. Po puřifikaci cDNA kódující oblasti VH a VL jsou protilátky sestaveny do jediného řetězce prostřednictvím nukleotidového ramene (L) . Nukleotidové rameno bylo konstruováno takovým způsobem, že jeden z konců se váže na 3'konec cDNA kódující oblast VH a druhý na 5'konec cDNA kódující oblast VL. Sekvence ramene kóduje peptid (G4S)3. Spojená sekvence, okolo 700 pb, obsahuje ve formě fragmentu Ncol-Notl svázané VH-L-VL, jejichž sekvence jsou vyjádřeny například SEQ ID n°l a 2.
Nukleová kyselina podle vynálezu je přednostně cDNA nebo RNA.
Nukleová . kyselina podle vynálezu je výhodně vybrána mezi (a) celkem nebo částí sekvence SEQ ID n°2 nebo jejím komplementárním vláknem, (b) každou sekvencí hybridující se sekvencemi (a) a kódující ScFv schopnou specificky vázat protein p53
4 ·· ř • · · ř · · 1 t · · 4 přednostně na úrovni oblasti C-konce, (c) variantami (a) a (b) vyplývající z degenerace genetického kódu..
Předložený vynález se týká také každé kazety exprese obsahující nukleovou kyselinu takovou, jaká je již definována, promotor umožňující expresi a signál terminace transkripce.
V postupu podle vynálezu kyselina je výhodně vložena do buněk prostřednictvím podávacího vektoru, který umožňuje zvýšit (i) účinek buněčné penetrace, (ii) cílení nebo/a (iii) extra a intracelulární stabilitu.
Ve způsobu provedení zejména upřednostňovaném předloženým vynálezem nukleová kyselina je zahrnuta do vektoru, který může být původu chemického (lipozom, nanočástice, peptidový komplex, lipidy nebo kationické polymery atd.), virového původu (retrovirus, adenovirus, virus herpes, AAV, virus neštovic atd.) nebo plazmidové.
Použití virových vektorů. vyplývá z přirozených vlastností transfekce viru. Je také možné použít adenovirus, virus hěrpes, retrovirus a virus adeno-associated. Tyto vektory se jeví zejména výkonné v transfekcí. Zejména se jedná o schopnost adenoviru a retroviru infikovat nádorové buňky, když tvoří vektory vybrané v rámci předloženého vynálezu. V tomto ohledu v upřednostňovaném způsobu provedení předloženého vynálezu nukleová kyselina je vložena ve formě retrovirového vektoru, totiž defektního rekombinantního retroviru, jehož genom obsahuje nukleovou kyselinu kódující ScFv takovou, jaká je již definována. V jiném upřednostňovaném způsobu provedení předloženého vynálezu nukleová kyselina je vložena ve formě adenovirového vektoru, totiž defektního rekombinantního adenoviru, jehož genom obsahuje nukleovou kyselinu kódující ScFv takovou, jaká je • · toto·· • to f *· ·· • · · ··« #··« • · ···· ·> · to · • · to ty · ···· · ··· ·6· to · · w · to · · • •toto ·· toto I ·· ·· již definována.
Vektor podle předloženého vynálezu může také být nevirový činitel schopný zprostředkovat přenos a expresi nukleových kyselin do eukaryontní buňky. Chemické nebo biochemické vektory představují zajímavou alternativu přírodním virům zejména z důvodu pohodlnosti, bezpečnosti a také nepřítomnosti teoretické limity týkající se velikosti přenášené DNA. Tyto syntetické vektory mají dvě základní funkce: zkompaktnit nukleovou kyselinu pro transfekci a podpořit její buněčnou fixaci stejně jako její přechod přes plazmidovou membránu, případně přes dvě nukleární membrány..
Pro zmírnění polyanionické povahy nukleových kyselin nevirové vektory mají všechny náboje polykationické. V upřednostňovaném způsobu provedení předloženého vynálezu je vektor chemický nebo biochemický.
Předložený vynález se týká také každé kompozice obsahující alespoň nukleovou kyselinu takovou, jaká je již definována.
Týká se také každé kompozice obsahující alespoň vektor takový, jaký je již definován.
Týká se také každé kompozice obsahující alespoň ScFv takovou, jaká je již definována..
Týká se také kompozic obsahujících nukleovou kyselinu nebo vektor takové, jaké jsou již definovány a nukleovou kyselinu nebo vektor kódující divoký p53 pro současně kombinované použití nebo pro použití rozložení v čase.
Z důvodu jejich antiproliferativních vlastností farmaceutické kompozice podle vynálezu jsou všechny přizpůsobeny pro léčení hyperproliferativních chorob takových, jako je zejména rakovina a restenosa. Předložený vynález předkládá také metodu zvláště účinnou pro destrukci buněk zejména hyperproliferativních buněk.
• 9 ···· ·· f 99 ·· » * · · · I ···· • · · · · · · · · · • · · Φ ······ * · · ·»· ·*··»· · · *9*9·* · · ♦ 9 9 ·'·
Může být použit in vitro nebo ex vivo. V tom případě spočívá zejména v inkubaci buněk v přítomnosti jedné nebo více nukleových kyselin (nebo vektoru, kazety nebo přímo ScFv). Mohou být použity dávky od 0,01 až 1000 pg'vektoru pro 106 buněk nebo MOI od 0,1 až 1000 pro virový vektor.
In vivo spočívá v podávání aktivního množství vektoru (nebo kazety) podle vynálezu organizmu přednostně přímo na úrovni místa ošetření (zejména nádor). V tomto ohledu má vynález za předmět metodu destrukce hyperprolíferativních buněk zahrnující zkontaktování uvedené buňky nebo jejich částí s nukleovou kyselinou takovou, jaká je již definována. Pro použití in vivo nukleová kyselina nebo vektor použité v předloženém vynálezu může být formulována z pohledu podávání a to z pohledu .topikálního, orálního, parenterálního, intranasálního, intravenózního, intramuskulárního, podkožního, intaokulárního podávání atd. Nukleová kyselina nebo vektor je zejména použit v injektovatelné formě. Může to být směs každého farmaceutického vehikula vhodného pro injektovatelnou formulaci, zejména pro injekci přímo do místa ošetření. Může se jednat zejména o sterilní izotonické roztoky nebo suché kompozice zejména lyofilizované, které po přidání podle potřeby sterilní vody nebo fyziologického séra umožňují injektovatelnou formu. Přímá injekce do nádoru pacienta je zajímavá, protože umožňuje soustředit terapeutický účinek přímo v poškozené tkáni. Dávky nukleových kyselin použité pro injekci mohou být přizpůsobeny různým parametrům, zejména funkci genu, vektoru, použitého způsobu podávání, patologii nebo také délce léčení. Výhodně podávané dávky invivo obsahují mezi 10® a 1010 pfu/ml pro virový vektor takový, jako je adenovirus. Může být také použito opakované podávání.
V případě in vivo postup a molekuly podle vynálezu mohou být použity pro studii mechanizmu účinku p53 a pro určení potenciálu ScFv na zvířecích modelech.
.··. t • · « ·
9 999
ÍÍ 9 9 ·· ··«·
Předložený vynález je výhodně použit in vivo pro destrukci buněk v hyperproliferaci (tzn. v nenormální proliferaci). Je také aplikovatelný pro destrukci nádorových buněk nebo buněk hladkého svalstva vaskulární stěny (restenosa). Je přizpůsoben zejména pro léčení rakovin, ve kterých je pozorován mutant p53. Například se mohou uvést adenokarcinomy tračníku, rakoviny štítné žlázy, karcinomy plic, myeloidní leukémie, rakoviny prsu, rakoviny plic, žaludeční rakoviny, rakoviny jícnu, lymfomy B, rakoviny ovárií, rakoviny močového měchýře, glioblastomy, hepatokarcinomy, rakoviny kostí, kůže, pankreasunebo také rakoviny ledvin, prostaty, rakoviny jícnu, rakoviny hrtanu, hlavy a krku, HPV pozitivní rakoviny genitálií, rakoviny nosohltanu EBV pozitivní, rakoviny, ve kterých je superexprimovaný buněčný protein mdm2 atd.
Následující obrázky a příklady blíže ilustrují vynález, aniž by však v jakémkoliv směru omezovaly jeho rozsah.
Legenda k obrázkům
Obrázek 1: Strategie výběru protilátky
Obrázek 2: Prokázání schopnosti protilátek indukovat zpoždění za p53
Obrázek 3: Prokázání schopnosti protilátek indukovat zpoždění za p53H273
Obrázek 4: Prokázání spojení ScFv s divokým p53 metodou ELISA. Plná kolečka: IgG 11D3 (na počátku 1 μg/ml); prázdná kolečka: IgG 421 (na počátku 1 gg/ml); čtverečky:
polyklonální biotinylované sérum (na počátku 1 pg/ml); plné trojúhelníky:ScFv llD3-myc (1/2); prázdné trojúhelníky: (1/2); kosočtverce: ScFv (anti-CD3, 1/2).
to· ·>·· • · · “ to ···· to ··· ··· to « · · to · · to
Oto.*··· ·· · < · ··
Obrázek 5: Prokázání zpoždění vyvolané ScFv.
Obrázek 6: Obnovení DNA vazebné aktivity k mutantům p53.
Obrázek 7: Exprese ScFv421 v buňkách H1299.
Obrázek 8: Obnova transkripční aktivity mutantu H273 v linii H358.
Obrázek 9: Obnova transkripční aktivity endogenního mutantu H273 v linii HT29.
Příklady
Příklad lř Získání a třídění protilátek 11D3
Tento příklad popisuje přípravu, získání a selekci monoklonálních protilátek specificky řízených proti proteinu p53 schopných aktivovat DNA vazebnou funkci mutované formy DNA.
1.1 Získání proteinů použitých za imunizace myší a třídění hybridomů
Divoký protein p53 a různé proteiny p53 H273, p53 W248, p53 . G281 odpovídající mutacím divokého p53 často vyskytujícího se v nádorových buňkách byly produkovány v hmyzích buňkách Spodoptera frugiperda Sf9 infikovaných rekombinantním bakulovirem a purifikovány . afinitou na agarosovém gelu, na kterém byla vázána - polyklonální protilátka PAb421 (Leveillard et al., EMBO J. 15, 1615-1623 (1996)). Proteiny odpovídající fragmentům 1-320 a 73-320 divokého proteinu p53 byly produkovány také v hmyzích buňkách • Φ · ·· ·Φ « · * » · * Λ · · · · tf · Φ Φ · · ♦ » • · « · » ΦΦΦ» * ΦΦ® ΦΦ®
Φ ο φ tí » · e · »·»·«· »·» · * · > *
Spodoptera - frugiperda Sf9 infikovaných rekombinantním bakulovirem za dodržení podmínek daných firmou Invitrogen. Komplementární DNA vložené do plazmidu pro přenos pBlueBacIII byly vytvořeny klasickými technikami rekombinantní DNA popsané například v práci Sambrook et al., (Samrook, Fritsch & Maniatis: Molecular cloning, a laboratory manual, druhé vydání, 1989, Ed. Cold Spring Harbor Laboratory).
1.2 Získání a třídění hybridomů
Myši byly imunizovány ekvimolární směsí třech již popsaných mutovaných proteinů p53 a hybridomy byly získány za dodržení protokolu popsaného v práci Harlow at Lané (Harlow & lané: Antibodies, a laboratory manual, 1988, Ed. Cold Spring Harbor Laboratory). Výběr hybridomů produkujících monoklonální . látky řízené proti již popsaným mutovaným proteinům' p53 byl proveden metodou štěpení protilátek produkovaných v kultivačním médiu hybridomů v jamkách plaku s 96 jamkami z PVC, ve kterých bylo předem imobilizováno množství 1 mikrogramu ekvimolární směsi třech již popsaných mutovaných proteinů p53 za dodrženíní protokolu popsaného v práci Harlow at Lané (Harlow & lané: Antibodies, a laboratory manual, 1988, Ed. Cold Spring Harbor Laboratory). Toto první třídění umožnilo vybrat 317 pozitivních hybridomů. Po dvou týdnech amplifikace hybridomů supernatanty amplifikovaných hybridomů byly v první etapě znovu určeny štěpící metodou (metoda 1) již zmíněných protilátek potom tříděny za použití tří identických třídících metod na zmíněném základu bez toho, aby povaha imobilizovaných proteinů byla rozdílná: V jamkách byl imobilizovaný buď (metoda 2) purifikovaný divoký protein p53 nebo (metoda 3) proteinový extrakt buněk Sf9 produkujících fragment 1-320 divokého p53 nebo (metoda 4) proteinový extrakt buněk Sf9 produkující fragment 73-393 divokého p53. Proteinové extrakty byly. získány lysou • * ·· · · ·· ·.
• · · a · » • ♦ · · · · • · · « · ···· » + ·£··· •a·· · ·· * zmrazením/rozmrazením buněk Sf9 ve fosfátovém pufru a potom odstředěním buněčných zlomků. Ze 317 supernatantů amplifikovaných hybridomů jen 162 odpovídá metodě 1. Zbylých 155 je pozitivních v metodě 2, mezi těmito (skupina A) je 33 negativních v metodách 3fa 4, 115 (skupina B) je pozitivních v metodě 3 a negativních v metodě 4 a konečně 7 (skupina C) je pozitivních ve dvou metodách. Supernatant skupiny B odpovídá supernatantům, které obsahují protilátky, jejichž epitop se situuje v prvních 73 aminokyselin proteinu p53. 77 supernatantů této skupiny se jeví jako negativní v metodě 2, když byly preinkubovány s peptidem (1 mg/ml) odpovídajícím sekvenci 40 prvních aminokyselin proteinu p53. Isotyp protilátek skupiny A, 38 protilátek skupiny B, které zůstaly po eliminaci 77 již zmíněných protilátek a protilátky skupiny C nám umožnily eliminovat IgM. Tyto výsledky jsou uvedeny na Obrázku 1.
Potom bylo testováno 42 protilátek pro jejich schopnost indukovat super posun na komplexu p53/DNA. Prptolátky po purifikací na proteinu A/Sepharosa byly kvantifikovány. Zpožďovací pokusy na gelu byly provedeny za inkubace 30 ng proteinu p53 divokého typu purif i.kovaného se sondou DNA značenou 32P reprezentující sekvenci specifické fixace proteinu p53. Potom bylo přidáno 300 ng různých protilátek. Komplexy byly rozděleny na akrylamidovém gelu.
Výsledky uvedené na-Obrázku 2 ukazují, že 27 z těchto protilátek by mohlo být schopno indukovat super posun. Mezi těmito 27 bylo testováno 19 protilátek za substituce mutantu His273 divokým proteinem p53 ve stejném pokusu na gelu (Obrázek 3) . Těchto 19 protilátek dalo pozitivní výsledek. Protilátky n°29 představují jasnější zpoždění než ostatní. Tyto protilátky byly označeny jako 11D3 a použity v následujících protokolech.
• ftft ft • ftft ♦ • ftft ftftft © « ftft ·· ·· * ·* β ···
999 9 ·· 9
9999 « • ·
Příklad 2: Získání ScFv 421 a D3M
ScFv byly získány od hybridomů klasickými technikami molekulární biologie založené na PCR upravených nástrojů v oblastech VH a VL, protilátky 11D3 byl označen jako D3M.
vyjádřena na SEQ ID n°2. Sekvence ScFv421 je vyjádřena na SEQ ID n°l.
pomocí specificky ScFv odvozený od
Jeho sekvence je
Příklad 3: Konstrukce expresního vektoru ScFv
Tento příklad popisuje konstrukci vektorů použitelných pro přenos nukleových kyselin předloženého vynálezu in vitro a in vivo.
3.1 Konstrukce plazmidových vektorů
Pro konstrukci plazmidových vektorů byly použity 2 typy vektorů.
- Vektor pSV2 popsaný v DNA Cloning, A practical approarch Vol·.2, D.M. Glover ’ (Ed) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985. Tento vektor je expresním vektorem eukaryontů. Nukleové kyseliny kódující ScFv byly vloženy do tohoto vektoru ve formě fragmentů Hpal-EcoRV. Byly tak umístěny pod kontrolu promotoru zesilovače transkripce viru SV40.. Všechny konstrukce popsané v příkladu 2 byly vloženy do tohoto vektoru, aby byly testovány v různých systémech in vitro a in vivo.
- Vektor pCDNA3 (Invitrogen). Jedná se o eukaryontní expresní vektor eukaryontní exprese. Sekvence nukleových kyselin kódující ScFv předloženého vynálezu jsou umístěny v ······ ·« · flfl ·» • fl · · ·· » flflfl « fl flflfl· flflflfl fl fl a · ········· fl·fl
Φ » * fl fl · · · «· · · fl fl flfl fl flfl flfl tomto vektoru pod řízení raného promotoru CMV. Všechny konstrukce popsané v příkladu 2 byly vloženy do tohoto vektoru ve formě fragmentu Hind III / Not I.
3.2 Konstrukce virových vektorů
Podle charakteristického způsobu provedení předložený vynález spočívá v konstrukci a použití virových vektorů umožňujících přenos a expresi in vivo nukleových kyselin takových, jaké jsou již definovány.
Jedná se zejména o adenoviry, různé serotypy, jejichž struktura a vlastnosti se poněkud mění, a které byly charakterizovány. Mezi těmito . serotypy se upřednostňuje použití v rámci předloženého vynálezu lidských adenovirů typu 2 nebo 5 (Ad 2 nebo Ad 5) nebo adenovirů zvířecího původu (viz přihláška vynálezu WO94/26914). Mezi adenoviry zvířecího původu, které jsou použitelné v rámci předloženého vynálezu se mohou uvést adenoviry psího, hovězího, myšího původu (například: Mávl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovčího, prasečího, ptačího nebo také opičího původu (například: SAV). Z adenovirů zvířecího původu jsou zejména upřednostňovány adenoviry psí, zejména adenovirus CAV2 (například: kmen manhattan nebo A26/61 (ATCC VR-800)). V rámci předloženého vynálezu se zejména používá adenovirus lidského nebo psího původu nebo jejich směs.
Defektní adenovirus podle předloženého vynálezu obsahuje ITR, sekvenci umožňující enkapsidaci a nukleovou kyselinu podle vynálezu. V genomu adenovirů vynálezu alespoň oblast El není funkční. Uvažovaný virový gen může být zbaven funkčnosti všemi odborníky známými technikami, zejména úplnou supresí, substitucí, částečnou delecí nebo adicí jedné nebo více párů basí v uvažovaném nebo . uvažovaných' genech. Tyto modifikace mohou být získány in vitro (na izolované DNA) nebo • * · ·· φ fcfcfc · fc * · • fc · ♦ · · fcfcfc* fc fc <···<» fcfcfcfc • fclfc fc · fc fc fc * fcfcfc fcfcfc • fcfc fcfc fc « fc • •fcfcfcfc fcfc fc fcfc fcfc oblast . E3 WO94/12649, Podle podle (WO95/02697), WO95/02697, in šitu například prostřednictvím technik genového oboru nebo také působením mutagenních činidel. Mohou být také modifikovány jiné oblasti genomu, zejména
E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152,
WO96/22378) a L5 (WO95/02697). upřednostňovaného způsobu provedení adenovirus předloženého vynálezu obsahuje deleci v oblastech El a E4. Podle jiného způsobu realizace obsahuje deleci v oblasti El na úrovni, ve které jsou vloženy oblast E4 a sekvence nukleových kyselin vynálezu (viz FR94 13355). Ve virech podle vynálezu delece v oblasti El se rozprostírá především od nukleotidu 455 po 3329 v sekvenci adenoviru Ad5.
Rekombinantní defektní adenovirus podle vynálezu může být připraven všemi odborníky známými technikami (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573, Graham, EKBO J. 3 (1984) 2917). Může být připraven zejména obecnou rekombinací mezi adenovirem a plazmidem, který nese mimo jiné nárokovanou sekvenci DNA. Obecná rekombinace se provádí po společné transfekci výše uvedených adenoviru a plazmidu v přizpůsobené buněčné linii. Použitá buněčná linie musí přednostně (i) být transformovatelná uvedenými elementy a (ií) obsahovat sekvence schopné doplnit část genomu defektního adenoviru přednostně v integrované formě proto, aby se zamezilo .nebezpečí rekombinace. Jako příklad buněčné linií se může uvést lidská ledvinová embryonální linie 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), která obsahuje zejména včleněnou ve svém genomu levou část genomu adenoviru Ad5 (12%) nebo se mohou uvést linie schopné doplnit funkce El a E4 takové, jaké jsou zejména popsány v přihláškách vynálezu n°W0 94/26914, WO95/02697 a WO96/22378.
Adenovirý, které se rozmnožily, byly získány a purifikovány podle klasických technik molekulární, biologie, jak je naznačeno v příkladech.
Co se týče adeno-ássociated viru (AAV), jedná se ·ο fc · e · * · .· A » · · > · ·
virus DNA velikosti relativně malé, který se začleňuje do genomu buněk, který infikuje stabilně a stereospecificky. Tyto viry jsou schopné infikovat široké spektrum buněk bez toho, aby byl vyvolán účinek na růst, morfologii nebo diferenciaci buněk. Nezdá se, že jsou zahrnuty do patologií u lidí. Genom viru AAV byl klonován, sekvenován a charakterizován. Obsahuje okolo 4700 basí a obsahuje na každém konci oblast obrácené repetice (ITR) se 145 basemi, které jsou počátkem replikace pro virus. Zbytek genomu je rozdělen na dvě oblasti nesoucí zejména funkce enkapsidace: levou část genomu, která obsahuje gen rep zahrnutý do virové replikace a exprese virových genů, .pravou část genomu, která obsahuje gen cap kódující kapsidové proteiny viru.
Použití vektorů odvozených od AAV pro přenos genů in vitro a in vivo bylo popsáno v literatuře (viz zejména WO 91/18088, WO 93/09239, US 4,797,368, US5,139, 941, EP 488
528) . Tyto přihlášky vynálezů popisují různé konstrukce odvozené od AAV, ve kterých gen rep nebo/a cap jsou deletovány a nahrazeny genem zájmu a popisují ,jejich použití pro přenos in vitro (na buněčné kultuře) nebo in vivo (přímo, v organizmu) uvedeného genu zájmu. Defektní rekombinantní AAV podle vynálezů může být připraven společnou transfekcí v buněčné linii infikované pomocným lidským virem (například adenovirem) plazmidů, který obsahuje sekvenci nukleových kyselin vynálezu zájmu lemovaným dvěma oblastmi obrácené, repetice (ITR) AAV, a plazmidů, který nese gen enkapsidace (gen. rep a cap) AAV. Použitelná buněčná linie je například linie 293. Rekombinantní produkty AAV jsou pak purifikovány klasickými technikami.
Co se týče viru herpes a retrovirů, konstrukce rekombinantních vektorů byla široce popsána v literatuře: viz zejména Břeakfield et al., New Bioiogist 3 (1991) 203, EP
453242, EP178220, Bernstein et al., Genet. Eng. 7 (1985) 235, McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689 atd. Retroviry jsou fc» » · fcfcfc fcfcfc
Λ · * * · · · · · · * fc· « fcfc fcfc fcfc fc fc t fc · • fcfc fcfc fcfc»· fcfc fcfc fcfc *' fc •
zejména integrativní viry, selektivně infikující buňky při buněčném dělení. Tvoří tak vektory zájmu pro rakovinové aplikace. Genom retroviru zahrnuje zejména dvě LTR, sekvenci enkapsidace a tři kódované oblasti (gag, pol a env) . V rekombinantních vektorech odvozených od retroviru geny gag, pol a env jsou všeobecně deletovány úplně nebo částečně a nahrazeny sekvencí heterologní nukleové kyseliny zájmu. Tyto vektory mohou být odvozeny od různých typů retroviru takových jako zejména MoMuLV (murine moloney leukemia virus, také označovaný jako MoMLV), MSV (murine moloney sarcoma virus), HaSV (harvey sarcoma virus), SNV (spleen necrosis virus), RSV (rouš sarcoma virus) nebo také Friendův virus.
Aby se vytvořily rekombinantní retroviry podle vynálezu obsahující sekvenci nukleových kyselin podle vynálezu, plazmid obsahující zejména LTR, byla vytvořena sekvence enkapsidace a výše uvedená sekvence nukleových kyselin a potom použita pro transfekci buněčné linie řečené enkapsidační, schopné nést v trans retrovirální funkce se sníženou schopností v plazmidu. Všeobecně, enkapsidační linie jsou schopny exprimovat geny gag, pol a env. Takovéto enkapsidační linie byly popsány ve vedlejších oborech, zejména linie PA317 (US4,861,719) , linie PsiCRIP (WO90/02806) a linie GP+envAm-12 (W089/07150). Rekombinantní retroviry mohou zahrnovat ' modifikace na úrovni LTR pro potlačení transkripční aktivity, stejně jako studované enkapsidační sekvence obsahující část genu gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639. Produkované rekombinantní retroviry jsou pak purifikovány klasickými technikami.
Pro uvedení předloženého vynálezu je zejména výhodné použít rekombinantní defektní adenovirus nebo retrovirus. Tyto vektory mají vskutku zajímavé vlastnosti zejména pro přenos sebevražedných genů do nádorových buněk.
·♦ · • * Β • · « · * ·
• 119
11111 -Λ
9 · • β €
3.3 Chemické vektory
Mezi vyvinutými syntetickými vektory se přednostně používají v rámci předloženého vynálezu kationické polymery polylysinového typu, (LRLK)n, (LKKL)n, polyethylenimin a DEAE-dextran nebo také kationické lipidy nebo lipofektanty. Tyto vektory mají schopnost kondenzace DNA a podporují její vázání s buněčnou membránou. Mezi těmito posledně jmenovanými vektory se mohou uvést lipopolyaminy . (lipofectamin, transfektam atd.), různé kationické lipidy nebo neutrální lipidy (DOTMA, DOGS, DOPE atd.), stejně .jako . peptidy nukleárního původu. Mimoto pojem cílové transfekce byl vyvinut prostřednictvím receptoru, který využívá principu kondenzace DNA díky kationickému polymeru s řízením fixace komplexu k membráně díky chemické vazbě mezi kationickým polymerem a ligandem membránového receptoru přítomného na povrchu buňky, která se chce štěpovat. Byly popsány cílové receptory k transferinu, k inzulínu a receptor asialoglykoproteinů hepatocytů. Příprava farmaceutické kompozice podle předloženého vynálezu používající chemický vektor je provedena podle všech odborníky známých technik, všeobecně jednoduchým zkontaktováním různých látek.
Příklad 4: ScFv rozpoznává p53
Spojení ScFv bylo ověřeno testem ELISA.
tag myc byl fúzován s molekulami scFv, aby byla umožněna jejich detekce. ScFv421, 11D3 (D3M) a ScFv kontrola (anti-CD3) byly, vytvořeny od periplazmy bakterií exprimující tyto různé ScFv.
Plaky ELISA byly inkubovány pomocí purifikovaného p53 s různými ředěními IgG 11D3, IgG 421, polyklonálním « · · ♦ · 4 ♦ * 9 9 « 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • · « 9 · ·»·· 4 999 999
9 9 9 9 9 9 9
9999 99 φ » C 99 99 biotynilovaným anti-p53, SCFv 11D3, ScFv 421 a ScFv anti-CD3.
Dva IgG jsou potom detekovány sekundárními protilátkami anti IgG spřáhnutou s alkalickou fosfatasou. Biotynilované sérum je detekováno extravidinem spřaženým s alkalickou fosfatasou. ScFv jsou detekovány protilátkou 9E10 anti-myc, potom protilátkou IgG spojenou s alkalickou fosfatasou. Kolorimetrické dávkování aktivity alkalické fosfatasy je uvedeno na Obrázku 4, který naznačuje, že dva purifikované IgG, polyklonální sérum a ScFv 421 a 11D3 rozpoznávají p53, zatímco ScFv anti-CD3 je neaktivní.
Příklad 5: ScFv jsou schopné indukovat supershift divokého £53
Schopnost ScFv aktivovat funkci vazebné DNA divokého proteinu p53 byla testována pokusy zpoždění na gelu.
Duplex DNA představující místo specifické fixace proteinu p53 byl označen 32P, potom inkubován s purifikovaným divokým p53 a různými purifikovanými protilátkami nebo ScFv produkovanými v bakteriální periplazmě. Komplexy byly rozděleny elektroforeticky na akrylamidovém gelu.
Získané výsledky jsou uvedy na Obrázku 5.
Komplex DNA/p53 byl pozorován v linii Basal. Protilátky HR231, pAb421 a 11D3 jsou schopné indukovat dostatečné zpoždění (supershift) a zvýšit množství komplexu DNA/p53.
ScFv 421 a D3M jsou také schopné indukovat supershift zatímco kontrolní ScFv anti-ras (Y28) ho neindikuje. ScFv421 na rozdíl od ScFv D3M indukuje zvýšení- množství komplexu p53/DNA.
• · ft · · * ft · · ftft 9 ftft ft ♦ · ft ftftft ftftftft ft ftftft ftftft·· · ftft· ftftft • •••ftft · · ««•ft ftft ftft « ftft ftft ···· ft·
Příklad 6: ScFv jsou schopné opravit funkci vazebné DNA k mutantu proteinu p53
Analogicky byly testovány ScFv pro svou schopnost opravit neaktivní funkci vazebné DNA mutantu Trp248. Získané výsledky jsou uvedeny na Obrázku 6.
Výsledky ukazují, že dva ScFv indukují objevení zpožděného pruhu odpovídajícího komplexu p53/DNA.
Příklad 7: ScFv jsou správně exprimovány v nádorových buňkách
Exprese ScFv byla ověřena přechodnou transfekcí expresního vektoru (promotor SV40) v nádorových buňkách H1299. Nukleové kyseliny byly podávány ve formě plazmidového vektoru typu pSV2 (příklad 3) v přítomnosti kationického lipidu, lipofektamu.
Získané výsledky jsou uvedeny na Obrázku 7. Western blotem na úplém extraktu lze pozorovat majoritní pruh, který migruje skrz 30 kD, který odpovídá očekávané velikosti a potvrzuje, že molekuly jsou exprimovány na významné úrovni v nádorových buňkách.
Příklad 8: ScFv jsou schopné částečně opravit transkripční funkci mutantů His273
Účinek těchto ScFv uprostřed nádorových buněk na nedostatečnou transaktivační funkci mutovaných forem proteinu p53 byl měřen následujícím způsobem:
Přechodné transfekce byly provedeny v liniích H358 nebo
H1299 (obě dvě deletované pro p53) nebo v linii HT29 (obsahující mutant p53 His 273). Tyto transfekce vkládají •00000 0 00 ·· 0 0 * ♦ 0 · 0 0 »000 » 0 0 0 0 ·00» • 000 9 0 0 0 0 0 «00 0 0 0
0·0«0« 0 0
000 0 0» 00 0 00 «0 vektory exprese pro p53 divokého typu nebo mutantů H273 nebo Hisl75', pro dva ScFv a transportní plazmid obsahující gen CAT (chloramfenicolacetyltransferasa) pod řízení promotoru p53-dependentní. Aktivita CAT měřená 48 hodin po transfekci je odrazem funkce transaktivátoru proteinu p53.
Výsledky uvedené na Obrázku. 8 naznačují, že v linii H358 jsou schopné dvě ScFv znovu aktivovat významným způsobem transkripční aktivitu mutantu His273. Uvdené výsledky byly získány v linii H1299.
Stejně tak v linii HT29 jsou schopné dvě ScFv zvýšit transkripční aktivitu mutantu endogenního His273 (Obrázek 9).
·· ··»· • · · · * · · · 9 · • * · · · · · · · · • · « · ·····.· fcfc· fc·· ♦ ·····' · · • •••fcfc · · · ·· ··
SEKVENCE
SEQ ID n’l: Nukleotidová a peptidová sekvence 421
1/1
CAG GTG CAG CTG CAG CAG TCT GGG GCA GAG
gin val 31/11 gin leu gin gin ser giy ala glu
CTC GTG AGG TCA GGG GCC TCA GTC AAG TTG
leu val 61/21 arg ser giy ala ser val lys leu
TCC TGC ACA GCT TCT GGC TTC AAC ATT AAA
ser cys 91/31 thr ala ser gly phe asn ile lys
GAC TAC TAT ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG
asp tyr 121/41 tyr met hys trp val lys gin arg
CCT GAA CAG GGC CTG GAG TGG ATT GGA TGG
pro glu 151/51 gin giy leu glu trp ile giy trp
ATT GAT CCT GAG AAT GGT GAT ACT GAA TAT
ile asp 181/61 pro glu asp giy asp thr glu tyr
GCC CCG AAG. TTC CAG GGC AAG GCC ACT ATG
ala pro 211/71 lys phe gin gly lys ala thr met
ACT GCA GAC ACA TCC TCC AAT ACA GCC TAC
thr ala 241/81 asp thr ser ser asn thr ala tyr
CTG CAG CTC AGC AGC CTG GCA TCT GAG GAC
leu gin 271/91 leu ser ser leu ala ser glu asp
ACT GCC GTC TAT TAT TGT AAT TTT TAC GGG
thr ala val tyr tyr cys asn phe tyr giy
301/101 φ
φφφφ φ
φφφφ φφ · φφ φφ · • · · φ φφφ φφφφ φφφφ φ φφφφφφ φφφ φφφ φφφ φ φ φ φ φ · φ φ φ
GAT GCT TTG GAC TAT TGG GGC CAA GGG ACC
asp ala 331/111 leu asp tyr trp giy gin giy thr
ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT
thr val 361/121 thr val ser ser giy giy gly giy
TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA
ser gly 391/131 gly giy giy ser gly giy giy giy
TCG GAT GTT TTG ATG ACC CAA ACT CCA CTC
ser asp 421/141 val leu met thr gin thr pro leu
ACT TTG TCG GTT ACC ATT GGA CAA CCA GCC
thr leu 451/151 ser val thr ile giy gin pro ala
TCC ATC TCT TGC AAG TCA AGT CAG AGC CTC
ser ile 481/161 ser cys lys ser ser gin ser leu
TTG GAT AGT GAT GGA AAG ACA TAT TTG AAT
leu asp 511/171 ser asp giy lys thr tyr leu asn
TGG TTG TTA CAG AGG CCA GGC CAG TCT CCA
trp leu 541/181 leu gin arg pro giy gin ser pro
AAG CGC CTA ATC TAT CTG GTG TCT AAA CTG
lys arg 571/191 leu ile tyr leu val ser lys leu
GAC TCT GGA GTC CCT GAC AGG TTC ACT GGC
asp ser 601/201 giy val pro asp arg phe thr giy
AGT GGA TCA GGG ACA GAT TTC ACA CTG AAA
ser gly 631/211 ser giy thr asp phe thr leu lys
ATC AAC AGA GTG GAG GCT GAG GAT TTG GGA
ile asn arg val glu ala glu asp leu giy
• to ··♦· to* · to to* « • to · · to · t « · ···> toto toto ♦ to • toto· · • ·· · • ♦♦ « • ··· to·· to ·· to ·· ··
661/221
GTT TAT TAT TGC • TGG CAA GGT ACA CAT TCT
val tyr tyr cys trp gin giy thr his ser
691/231
CCG CTC ACG TTC AGT GCT GGC ACC AAG CTG
pro leu thr phe gly ala giy thr lys leu
721/241 GAA ATC AAA glu ile lys
SEQ ID n°2: Nukleotidová a peptidová sekvence D3M
1/1
CAG GTC AAG CTG CAG GAG TCA GGG GCA GAA
gin val 31/11 lys leu gin glu ser giy ala glu
. CTT GTG AGG TCA GGG GCC TCA ' GTC AAT TTG
leu val 61/21 arg ser giy ala ser val asn leu
TCC TGC ACA GCT TCT GGC TTC AAC ATT AAA
ser cys 91/31 thr ala ser giy phe asn ile lys
GAC TAC TAT ATG CAC TGG GTG AAA CAG AGG
asp......tyr, 121/41 tyr met his trp val lys gin arg
CCT GAA GAG GGC CTG GAG TGG ATT GGA TAT
pro glu 151/51 glu gly leu glu trp ile gly tyr
ATT GAT CCT GAG AGT GGT GAA ACT GAA TAT
ile asp 181/61 pro glu ser gly glu thr glu Jtyr
GCC CCG AAC TTC CAG GGC AAG GCC ACT GTG
ala pro asn phe gin £iy lys ala thr val
211/71
ACT GCA GAC ACA TCC TCC AAC ACA GCC TAC ·· ··«· ·· · ·· ·· ·· < · · · ···· to · · tototo · ·· · • · · · · ···· · ··· to·· ··· ··· · · • •toto ·· toto « toto ··
thr ala 241/81 asp thr ser ser asn thr ala tyr
CTG CAC CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC
leu his 271/91 leu ser ser leu thr ser glu asp
ACA ACC GTC TAT TAC TGT AAT GCA GTC ATC
thr thr 301/101 val tyr tyr cys asn ala. val ile
TAC TAT GAA TAC GAC GGC TAT GCT TTG GAC
tyr tyr glu tyr asp gly tyr ala leu asp
331/111
TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC
tyr trp giy gin gly thr thr val thr val
361/121
TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGG TGA GGT
ser ser giy gly gly giy ser gly giy gly
391/131
GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATT GAG
gly ser giy giy giy giy ser asp ile glu
421/141
CTC ACC CAG TCT CCA TCT TCC CTG GCT GTG
leu thr gin ser pro ser ser leu ala val
451/151
TCA GCA GGA GAG AAG GTC GCT ATG AGC TGC
ser ala giy glu lys val ala met ser cys
481/161
AAA TCC AGT CAG AGT CTG TTC AAC AGT AGA
iys ser ser gin ser leu £he asn ser arg
511/171
ACC CGA AAG AAT TAC TTG GCT TGG TAT CAG
thr arg .iys asn tyr leu ala trp tyr gin
541/181
CAG AAA CCA GGG CAG TCT CCT AAA GTG CTG
gin lys pro giy gin ser pro lys val leu
571/191 ·· · ·· ·· • ft · ftftft ···· • · ···· ···· • · · · · ···· ft ftftft ftftft • · · · · · · · ······ · · · · · · ·
ATC TAC TGG GCA TCC ACT AGG GAA TCT GGA
ile tyr tr£ ala ser thr ar9 glu ser giy
601/201
GTC CCT GAT CGC TTC ACA GGC AGT GAA TGT
val pro asp arg phe thr giy ser giy ser
631/211
GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT
gly thr asp phe thr leu thr ile ser ser
661/221
GTG CAG GCT GAA GAC CTG GCA GTT TAT TAC
val gin ala glu asp leu ala val tyr tyr
691/231
TGC AAG CAA TCT TAT AAT CTA CCG ACG TTC
cys lys gin ser tyr asn leu pro thr phe
721/241
GGC GGG GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA
giy giy giy thr lys leu glu ile lys
/'ί/ΐΤΊΤ-^

Claims (24)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Postup pro opravu v buňkách obsahujících mutovaný protein p53 transaktivační aktivity p53-dependentní zahrnující vložení do uvedené buňky jednořetězcové protilátky schopné specificky vázat mutovaný protein p53.
  2. 2. Postup podle nároku 1 zahrnující vložení nukleové kyseliny obsahující sekvenci kódující uvedenou jednořetězcovou protilátku pod řízení promotoru funkčního v buňce do uvedené buňky.
  3. 3. Postup podle nároků 1 nebo 2 vyznačený t í m, že jednořetězcová protilátka je schopná specificky vázat epitop přítomný v oblasti C--konce proteinu p53 nesoucího oligomerizační a regulační oblast.
  4. 4. Postup podle nároku 3 vyznačený t í m, že jednořetězcová protilátka je schopná specificky vázat epitop přítomný v oblasti C-konce proteinu p53 mezi rezidui 320-393.
  5. 5. Postup podle nároku 3 vyznačený tím, že jednořetězcová protilátka je vybrána mezi ScFv421 sekvence SEQ ID n°l a 11D3 sekvence SEQ ID n°2.
  6. 6. Postup podle nároku 2 vyznačený tím, že nukleová kyselina tvoří část vektoru.
  7. 7. Postup podle nároku 6vyznačený tím, že
    44 444« • 4 4 4 4 4 4 • 4 4 .4 44 4 44 4 • 4 44 4 4 4 44 4 * 4444 4444 · 444 444
    444444 4 4
    4444 44 <4 4 »4 44 vektor je virový vektor.
  8. 8. Postup podle nároku 7 vyznačený tím, že vektor je defektní rekombinantní adenovirus.
  9. 9. Postup podle nároku 7 vyznačený tím, že vektor je defektní rekombinantní retrovirus.
  10. 10. Postup podle nároku 7 vyznačený tím, že vektor je defektní rekombinantní AAV.
  11. 11. Postup podle nároku 7 vyznačený tím, že vektor je defektní rekombinantní HSV.
  12. 12. Postup podle nároku 6 vyznačený tím, že vektor je chemický nebo biochemický.
  13. 13. Postup podle nároku 1 nebo 2 vyznačený tím, že mutovaný protein p53 je zbaven supresorové aktivity nádoru.
    '
  14. 14.. Postup podle nároku 13 vyznačený tím, že mutovaný protein p53 je forma přítomná v nádorových buňkách.
  15. 15. Postup podle nároku 14 vyznačený tím, že mutovaný protein p53 je vybrán mezi proteiny p53H273, • Β BBBB • Β · • · • Β • · ·
    BBBB ΒΒ
    Β«
    BBB
    ΒΒ
    Β
    ΒΒ p53W248 a p53G281.
  16. 16. Postup podle nároku 1 nebo 2 vyznačený tím, že buňka obsahující mutovaný protein p53 je nádorová buňka.
  17. 17. Postup podle nároku 16 vyznačený t i m, že nádorová buňka je buňka nádoru plic, tračníku, hlavy a krku, jaterního nádoru a mozku.
  18. 18.
    specificky konformace
    Použití jednořetězcové vázat mutovaný protein uvedeného mutovaného proteinu protilátky p53 pro p53.
    schopné modifikaci
  19. 19. Použití jednořetězcové specificky vázat mutovaný protein farmaceutické kompozice určené hyperproliferativních chorob, ve kterých protein p53.
    protilátky p53 pro pro je zahrnut schopné přípravu léčení mutovaný
  20. 20. Použití nukleové kyseliny kódující jednořetězcovou protilátku schopnou specificky vázat mutovaný protein p53 pro přípravu farmaceutické kompozice určené pro léčení hyperproliferativních chorob, ve kterých je zahrnut mutovaný protein p53.
  21. 21. Molekula 11D3 nebo varianta rozpoznávající. stejný epitop nebo mající zvýšenou afinitu.
    37 • · * • • ··· · ···· • • • « • · ·· ·· · • · · • · · · • 9 9999 · 9 9 9 ·· · 99 99 9 9 9 9 9 9 9 9 999 99 9 • · ·· 99 22. 21. Nukleová kyselina kódující molekulu podle nároku 23. Nukleová kyselina podle nároku 22 v y znač e- n á t í m, že se jedná o cDNA, semisyntetickou. RNA, syntetickou nebo 24 . Nukleová kyselina podle nároku 23 v y znač e-
    n á sekvencí SEQ ID n°2.
  22. 25. Kompozice obsahující nukleovou kyselinu podle nároku 22.
  23. 26. Kompozice obsahující molekulu podle nároku 21.
  24. 27. Farmaceutická kompozice obsahující nukleovou kyselinu' podle nároku 22 a vhodné farmaceutické vehikulum pro léčení hyperprolíferativních chorob.
CZ0145599A 1996-10-29 1997-10-27 Lécivo obsahující jednoretezcovou protilátku, která se specificky váže na epitop prítomný v C-koncovém úseku p53, nebo nukleovou kyselinu kódující takovou protilátku CZ300526B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9613176A FR2755144B1 (fr) 1996-10-29 1996-10-29 Fragments d'anticorps a chaine unique anti-p53 et utilisation
PCT/FR1997/001921 WO1998018825A1 (fr) 1996-10-29 1997-10-27 Fragments d'anticorps a chaine unique anti-p53 et utilisations

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ145599A3 true CZ145599A3 (cs) 1999-08-11
CZ300526B6 CZ300526B6 (cs) 2009-06-10

Family

ID=9497134

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0145599A CZ300526B6 (cs) 1996-10-29 1997-10-27 Lécivo obsahující jednoretezcovou protilátku, která se specificky váže na epitop prítomný v C-koncovém úseku p53, nebo nukleovou kyselinu kódující takovou protilátku

Country Status (21)

Country Link
US (1) US6852509B1 (cs)
EP (1) EP0941252B1 (cs)
JP (1) JP4371178B2 (cs)
KR (1) KR100874789B1 (cs)
AT (1) ATE380198T1 (cs)
AU (1) AU745530B2 (cs)
BR (1) BR9712575A (cs)
CA (1) CA2268865C (cs)
CZ (1) CZ300526B6 (cs)
DE (1) DE69738352T2 (cs)
DK (1) DK0941252T3 (cs)
ES (1) ES2297853T3 (cs)
FR (1) FR2755144B1 (cs)
HU (1) HU226330B1 (cs)
IL (2) IL129476A0 (cs)
NO (1) NO326452B1 (cs)
PT (1) PT941252E (cs)
SI (1) SI0941252T1 (cs)
SK (1) SK286978B6 (cs)
WO (1) WO1998018825A1 (cs)
ZA (1) ZA979738B (cs)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL121041A0 (en) 1997-06-09 1997-11-20 Yeda Res & Dev Immunogenic compositions for induction of anti-tumor immunity
US7199809B1 (en) 1998-10-19 2007-04-03 Symyx Technologies, Inc. Graphic design of combinatorial material libraries
AUPP932199A0 (en) * 1999-03-19 1999-04-15 St Vincent's Hospital Sydney Limited Anti-p53 antibodies
AU769679B2 (en) * 1999-03-19 2004-01-29 St Vincent's Hospital Sydney Limited Anti-p53 antibodies
DE19962583A1 (de) * 1999-12-23 2001-06-28 Mueller Hermelink Hans Konrad Antikörper gegen Plasmazellen
US6630584B1 (en) * 2000-03-16 2003-10-07 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Single chain antibody against mutant p53
CN1909927A (zh) * 2003-12-24 2007-02-07 株式会社洛科摩基因 抑制癌的方法
JPWO2005061007A1 (ja) * 2003-12-24 2007-07-12 学校法人 聖マリアンナ医科大学 癌の抑制方法
GB0420771D0 (en) * 2004-09-17 2004-10-20 Randox Lab Ltd Antibody
DE602006007967D1 (de) * 2005-03-25 2009-09-03 Univ Ramot Gegen das gemeinsame epitop von mutierten p53 gerichtete humane synthetische einzelkettenantikörper und anwendungen davon
WO2007028117A2 (en) * 2005-09-02 2007-03-08 New England Medical Center Hospitals, Inc. P8 as a marker for heart failure
EP3452508A1 (en) * 2016-05-02 2019-03-13 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9224784D0 (en) * 1992-11-26 1993-01-13 Univ Dundee Cellular protein
FR2732348B1 (fr) * 1995-03-31 1997-04-30 Rhone Poulenc Rorer Sa Systeme d'expression conditionnel
FR2736915B1 (fr) 1995-07-19 1997-08-22 Rhone Poulenc Rorer Sa Variants de la proteine p53 et utilisations therapeutiques

Also Published As

Publication number Publication date
EP0941252A1 (fr) 1999-09-15
WO1998018825A1 (fr) 1998-05-07
JP4371178B2 (ja) 2009-11-25
DE69738352D1 (de) 2008-01-17
EP0941252B1 (fr) 2007-12-05
FR2755144B1 (fr) 1998-11-27
DK0941252T3 (da) 2008-03-31
NO991729D0 (no) 1999-04-13
US6852509B1 (en) 2005-02-08
BR9712575A (pt) 1999-10-19
HUP9904199A1 (hu) 2000-04-28
DE69738352T2 (de) 2008-11-13
IL129476A0 (en) 2000-02-29
NO326452B1 (no) 2008-12-08
AU4952097A (en) 1998-05-22
AU745530B2 (en) 2002-03-21
HUP9904199A3 (en) 2000-09-28
KR20000052845A (ko) 2000-08-25
ZA979738B (en) 1998-05-22
KR100874789B1 (ko) 2008-12-18
SK55899A3 (en) 2000-06-12
JP2001502553A (ja) 2001-02-27
FR2755144A1 (fr) 1998-04-30
CA2268865C (fr) 2011-01-04
CA2268865A1 (fr) 1998-05-07
IL129476A (en) 2010-05-17
ATE380198T1 (de) 2007-12-15
SI0941252T1 (sl) 2008-04-30
NO991729L (no) 1999-04-13
HU226330B1 (en) 2008-09-29
SK286978B6 (sk) 2009-08-06
CZ300526B6 (cs) 2009-06-10
PT941252E (pt) 2008-03-07
ES2297853T3 (es) 2008-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH11511980A (ja) Ｍｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性のアンタゴニスト及び癌治療におけるその使用
US6933373B2 (en) P53 protein variants and therapeutic uses thereof
CZ145599A3 (cs) Způsob obnovení translační aktivity závislé na p53 v buňkách, jednořetězcové protilátky proti p53 a DNA, které je kódují, jejich použití a prostředky, které je obsahují
WO1997046680A1 (en) Dna encoding dp. 75 and a process for its use
US6635483B1 (en) Compound and methods of inhibiting or stimulating presenilin 1 and related pharmaceuticals and diagnostic agents
CZ291533B6 (cs) Deriváty proteinu p62, nukleové kyseliny kódující tyto deriváty a farmaceutické kompozice, které je obsahují
JP2004508035A (ja) エンドグリン特異的ポリペプチド、その製造及び使用
MXPA97008877A (en) P62, its variants, the nucleic acid sequences that code them, and its use in anti-cancer gene therapy

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20121027