CZ300526B6 - Lécivo obsahující jednoretezcovou protilátku, která se specificky váže na epitop prítomný v C-koncovém úseku p53, nebo nukleovou kyselinu kódující takovou protilátku - Google Patents

Abstract

Rešení se týká jednoretezcových protilátek proti proteinu p53, které mohou být exprimovány v nádorových bunkách a mohou tak opravit vazbu DNA in vitro a funkci transkripcního aktivátoru in vivo. Týká se také nukleových kyselin kódujících tyto molekuly, vektoru, které je obsahují a jejich použití. Konkrétne se týká farmaceutické kompozice pro lécení rakovinných onemocnení, ve kterých je zapojen mutovaný protein p53, která obsahuje jednoretezcovou protilátku, která se specificky váže na epitop prítomný v C-koncovém úseku p53 mezi zbytky 320 a 393, nebo obsahuje nukleovou kyselinu, která kóduje takovou jednoretezcovou protilátku.

Description

(57) Anotace:

Řešení se týká jed no řetězcových protilátek proti proteinu p53, které mohou být exprimovány v nádorových buňkách a mohou tak opravit vazbu DNA i n vitro afunkci t ran skřípěn ího aktivátoru in vivo. Týká se také nukleových kyselin kódujících tyto molekuly, vektoru, které je obsahují ajejich použití. Konkrétně se týká farmaceutické kompozice pro léčení rakovinných onemocnění, ve kterých je zapojen mutovaný protein p53, která obsahuje jednořetězcovou protilátku, která se specificky váže na epitop přítomný v C-koncovém úseku p53 mezi zbytky 320 a 393, nebo obsahuje nukleovou kyselinu, která kóduje takovou jednořetězcovou protilátku.

Léčivo obsahující jed no řetězcovou protilátku, která se specificky váže na epitop přítomný v C-koncovém úseku p53, nebo nukleovou kyselinu kódující takovou protilátku

Oblast techniky

Předložený vynález se týká obnovy transaktivační aktivity p53-dependentní v buňkách, které mají mutovaný protein p53, zbavený funkce nebo se sníženou funkcí transkripčního faktoru. Vynález se týká použití jednořetězcových protilátek schopných specificky vázat mutovaný pro10 tein p53. Týká se také nových molekul schopných specificky a účinně vázat proteiny p53 a molekul umožňujících mimo jiné obnovu aktivity p53 nádorových buněk, stejně jako nukleových kyselin kódujících tyto molekuly a vektory je obsahující. Konkrétně se vynález týká farmaceutické kompozice pro léčení rakovinných onemocnění ve kterých je zapojen mutovaný protein p53, která obsahuje jednořetězcovou protilátku, která se specificky váže na epitop přítomný v C-kon15 covém úseku p53 mezi zbytky 320 a 393, nebo obsahuje nukleovou kyselinu, která kóduje takovou jednořetězcovou protilátku.

Dosavadní stav techniky

Divoký protein p53 působí při regulaci buněčného cyklu a při udržování neporušenosti genomu buňky. Tento protein, jehož základní funkce je být aktivátorem transkripce určitých genů, je schopný procesem, ne ještě dobře definovaným, blokovat buňku ve fázi G1 buněčného cyklu za současného objevení se mutace v průběhu replikace genomu a spustit určitý počet metod opravy

DNA, V případě špatné funkce tohoto procesu opravy nebo v případě objevení se tak velkého počtu zjevných mutací, než aby byly opraveny, je tento protein schopen indukovat fenomén programované buněčné smrti, nazvané apoptosa. Tímto způsobem protein p53 působí jako supresor nádoru za vyloučení odlišných nenormálních buněk nebo buněk, jejichž genom byl poškozen.

Tato základní funkce p53 závisí na funkci transkripčního faktoru totiž na jiných vhodných schopnostech rozpoznávat specifické sekvence na úrovni genom i cké DNA a spustit systém transkripce. Protein p53 zahrnuje 393 aminokyselin, které tvoří 5 funkčních oblastí:

- oblast aktivátoru transkripce tvořená nukleovými kyselinami 1 až 73 schopná vázat určité faktory základního systému transkripce jako je protein TPB. Tato oblast je také místem určitého počtu posttranslaěních modifikací. Je také místem interakcí počtu proteinů p53 s počtem jiných proteinů, zejména s buněčným proteinem mdm2 nebo proteinem EBNA5 viru Epstein-Barrovc (EBV), schopnými blokovat funkci divokého proteinu. Tato oblast je tvořena sekvencemi amino40 kyselin řečenými PĚST schopnými proteolytické degradace.

- vazebná oblast DNA, umístěná mezi aminokyselinami 73 a 315. Konformace této centrální oblasti p53 řídí rozpoznání specifických sekvencí DNA proteinu p53. Tato oblast je místem dvou různých typů uvádějících funkci divokého proteinu:

(i) interakce s proteiny blokujícími funkci p53 jako je například antigen 'velké T' viru SV40 nebo virové proteiny E6 viru HPV16 a HPV18 schopné vyvolat degradaci ubikvitinovým systémem. Tato posledně zmíněná interakce se může tvořit jen v přítomnosti buněčného proteinu E6ap (enzym E3 ubikvitinové kaskády).

(ii) přesné mutace, které uděluji funkci p53 a funkci p53, jehož quasicelek je umístěn v této oblasti.

- signál nukleární lokalizace tvořený aminokyselinami 315 až 325 nepostradatelný pro správ55 né vyslání proteinu do části, kde protein bude vykonávat svou základní funkci.

-1 CZ 300526 B6

- oblast oligomerace tvořená aminokyselinami 325 až 355. Tato oblast 325 až 355 tvoří strukturu typu: skládaný list β (326-334)-ohyb (335-336)-a helix (337-355). Změny funkcí umístěných v této oblasti jsou zejména způsobeny interakcí divokého proteinu s různými mutovanými formami, které mohou vést k různým vlivům na funkci divokého proteinu.

oblast regulace tvořená aminokyselinami 365 až 393, která je místem určitého počtu posttranslačních modifikací (glykosylace, fosforylace, fixace RNA ...), které modulují funkcí proteinu p53 pozitivně nebo negativně. Tato oblast hraje velmi důležitou roli v modulaci aktivity divokého io proteinu.

Funkce proteinu p53 může být porušena různými způsoby.

- blokací jeho funkce určitým počtem faktorů jako je například antigen 'velké T' víru SV40, 15 protein EBNA5 viru Epstein-Baarové nebo buněčný protein mdm2.

- destabilizací proteinu zvýšením jeho citlivosti k proteolyse, zejména interakcí s proteinem E6 lidského papilomaviru HPV16aHPV18, který upřednostňuje vstup p53 do ubikvitinového cyklu. V tom případě interakce mezi těmito dvěma proteiny může být uskutečněna jen předběž20 nou fixací buněčného proteinu, proteinu E6ap, jehož místo fixace je nedostatečně známé, přesnou mutací na úrovni genu p53

- delecí jedné nebo dvou alel p53.

Tyto dvě posledně zmíněné modifikace jsou pozorovány v 50 % různých typů rakovin. V tomto ohledu mutace genu proteinu p53 v rakovinových buňkách zasahují velmi velkou část genu, který kóduje tento protein a mají za následek různé modifikace funkcí tohoto proteinu. Lze s určitostí poznamenat, že tyto mutace jsou z velké části lokalizovány v centrální části proteinu p53, o které se ví, že je to kontaktní oblast se specifickými genomickými sekvencemi proteinu p53. To vysvětluje, proč většina mutantů proteinu p53 má jako základní vlastnost nefixovat se více na sekvence DNA, které rozpozná divoký protein a nemůže více vykonávat svou úlohu transkripčního faktoru. Jinak se zdá, že určití mutanti mají získané nové funkce takové, jako je aktivace určitých genů na transkripční úrovni.

Tyto modifikace jsou rozděleny do třech skupin:

mutace řečené slabé, jejichž produkt je nefunkční protein, který v případě mutace na jedné ze dvou alel nemá vliv na funkci divokého proteinu kódovaný jinou alelou. Hlavními zástupci této skupiny jsou mutanti H273 a W248, posledně jmenovaný je specifický rodinnému syndromu Li-Fraumeni hypersenzibility k rakovinovým účinkům.

dominantně negativní mutace, jejichž produkt je nefunkční protein, který v případě mutace na jedné ze dvou alel a interakcí s divokým proteinem je schopný blokovat funkci tohoto proteinu tvorbou směsí neaktivních oligomerů, které se nemohou více fixovat na sekvenci specifické DNA divokého proteinu. Hlavní zástupce této skupiny je mutant G281.

dominantně onkogenní mutace, jejichž produkt je protein, který je schopný částečně blokovat funkci divokého proteinu jako mutanti předchozí skupiny a kromě toho podporovat nedosta50 tečně známými mechanizmy tumorální vývoj, vyjadřující také zisk funkce. Hlavní zástupce této skupiny je mutant H175.

Po zhodnocení antitumorálních a apoptických vlastností a jeho zahrnutí do počtu patologií hyperproliferativního typu byl gen divokého p53 použit v přístupech genové a buněčné terapie. Zejmé55 na byl navržen pro ošetření různých hyperproliferativních patologií, zejména rakovin, podáváním

-2 CZ 300526 B6 in vivo genu divokého proteinu p53, opravením funkcí p53. Podávání může být provedeno především pomocí virových vektorů, zejména adeno viro výeh (WO 94/24297) nebo retrovirových (WO 94/06910). Bylo pozorováno, že vložení nukleové kyseliny kódující divoký protein p53 umožňuje opravit zejména normální regulaci buněčného růstu (Roth et al., Nátuře Medicine 2 (1996) 985). Byly také vyvinuty alternativní postupy založené na použití chimérických molekul, které mají vlastnosti typu p53 (PCT/FR96/01111).

Jiný přístup pro opravení funkcí divokého proteinu p53 je založen na re verzi mutovaných endogenních proteinů skrz divoký fenotyp totiž fenotyp, který má vlastnosti supresoru tumoru a apoptické vlastnosti divokého p53. Tento přístup vyplývá z poznatku, že ztráty funkčnosti mutantů p53 jsou způsobeny konformační změnou proteinu indukovanou mutací ěi mutacemi. V tomto ohledu přihláška vynálezu WO 94/12202 ukazuje, že monoklonální protilátka, zejména označená jako pAb421 řízená proti proteinu p53 je schopná opravit určité třídě mutantů často přítomných v lidských rakovinách vazebné funkce DNA in vitro. Použití tohoto typu kompozic představuje zatím nepříjemné hledisko spojené zejména se zvýšeným množstvím nezbytné protilátky (a tedy spojené s problémy produkce/purifikace) a s jejich slabou intraeelulární penetrací.

Podstata vynálezu

Předložený vynález popisuje přístup pro opravu divokých vlastností mutantů proteinu p53. Předložený vynález popisuje zejména konstrukci ligandů specifických zejména proteinu p53, které mají výhodné vlastnosti pro obnovu funkcí divokého proteinu p53. Předložený vynález zejména popisuje konstrukci jednořetězcové protilátky (ScFv) specifické proteinu p53, zejména molekule 11D3. Předložený vynález ukazuje mimo jiné, že ScFv jsou schopné rozpoznat p53, jsou schopné být účinně exprimovány ve středu tumorální buňky ajsou schopné reaktivovat část transaktivační funkce určité třídy mutantů proteinu p53.

Vzhledem k metodám vedlejších oborů tato molekula má významné výhody, zejména možnost být exprimována in šitu v tumorální buňce ve významném množství. Výsledky, které jsou uvedeny dále jsou tím spíše neočekávané, že ztráta účinnosti byla často pozorována mezi klasickou protilátkou a ScFv. Mimoto předkladatel ukázal, že je možné exprimovat ScFv ve vhodných intracelulárních kompartmentech, umožňující získat optimální biologickou aktivitu.

Vynález se týká metody pro obnovení transaktivační aktivity p53-dependentní imitovaného proteinu přítomného v buňce zahrnující vložení jednořetězcové protilátky schopné specificky vázat mutovaný protein p53 do výše uvedené buňky. Postup podle vynálezu výhodně zahrnuje vložení nukleové kyseliny obsahující sekvenci kódující výše uvedenou jednořetězcovou protilátku do buňky pod řízení promotoru funkčního v buňce. Jiné hledisko vynálezu se týká použití jednořetězcové protilátky schopné specificky vázat mutovaný protein p53 pro modifikaci konformace výše uvedeného proteinu. Předložený vynález se také týká použití jednořetězcových protilátek schopných specificky vázat mutovaný protein p53 pro přípravu farmaceutické kompozice určené k léčení hyperproliferativních poruch, ve kterých je zahrnut mutovaný protein p53, stejně jako použití nukleové kyseliny kódující jednořetězcovou protilátku schopnou specificky vázat mutovaný protein p53 pro přípravu farmaceutické kompozice určené pro léčení hyperproliferativních chorob, ve kterých je zahrnut mutovaný protein p53.

Postup podle vynálezu se tedy týká konstrukce, vektor izace a vložení jednořetězcové protilátky schopné specificky vázat mutovaný protein p53 do buněk. Jednořetězcové protilátky (ScFv) jsou tvořeny zejména oblastí VH ramenem spojenou s oblastí VL. Konstrukce ScFv a sekvence nukleových kyselin kódující takovéto modifikované protilátky byly popsány například v US 4 946 778 nebo v WO 94/02 610, WO 94/29 446 zahrnutých do literatuiy.

Předložený vynález popisuje zejména tvorbu hybridové banky produkující protilátky řízené proti p53 a konstrukci z této banky odpovídající ScFv. Popisuje také klonování odpovídajících nukleo-3 CZ 300526 B6 vých kyselin v expresních vektorech a jejich přenos do buňky. Ukazuje také, že tento přenos umožňuje in vivo účinně opravit aktivitu vázání DNA mutantů proteinu p53 stejně jako jejich transaktivační aktivitu.

Postup popsaný v předložené přihlášce uvádí ScFv schopné specificky vázat epitop přítomný v oblasti C-konce proteinu p53, který nese oblast oligomerizace a oblast regulace. V tomto ohledu předložený vynález popisuje také test umožňující selekci ScFv majících tyto vlastnosti technikou ELISA.

io ScFv použité v postupu popsaném v přihlášce jsou schopné specificky vázat epitop přítomný v oblasti C-konce proteinu p53 obsažený mezi rezidui 320-393. V tomto ohledu předložený vynález popisuje příklad konstrukce a exprese ScFv ScFv421 sekvence SEQ ID n°l a 11D3 sekvence SEQ ID n°2.

Postup popsaný v přihlášce je všeobecně aplikovatelný na mutované proteiny p53, které ztratily částečně nebo úplně schopnost vázat DNA a postup podle vynálezu umožňuje opravit tuto schopnost. Postup podle vynálezu je aplikovatelný na mutované proteiny p53, které ztratily částečně nebo úplně funkci transkripčního faktoru proteinu p53 a umožňuje opravit tuto funkci. Stupeň obnovy může být úplný nebo částečný. Výhodně je dostačující, aby bylo umožněno mutantů vykonávat funkci supresoru tumoru blokováním buněčného cyklu nebo/a indukci apoptózy. Popsaný postup umožňuje tedy opravit alespoň částečně aktivitu supresoru tumoru v buňkách majících mutované endogenní proteiny p53 zbavené této aktivity. Výhodně se jedná o mutované proteiny přítomné v nádorové buňce. Jak je již naznačeno, v nádorové buňce byly uplatněny různé mutované formy proteinu p53. Například se mohou uvést proteiny p53H273, p53W248 a p53G281. Dále uvedené příklady ukazují zejména, že postup umožňuje modifikovat kon formaci a biologické vlastnosti těchto mutantů in vitro a in vivo. Tyto příklady zejména ukazují, že ScFv 421 a 11D3 jsou schopné opravit mutantům 273 a 248 jejich schopnost specificky vázat DNA a indukovat transaktivaci proteinu p53-dependentní.

Postup popsaný v předložené přihlášce může být uskutečněn in vitro, ex vivo nebo in vivo. V postupu in vitro nebo ex vivo molekuly podle vynálezu mohou umožnit například studii mechanizmu účinku proteinu p53 a jeho mutovaných forem. Mimoto molekuly podle vynálezu mohou být použity pro detekci nebo purifíkaci proteinů p53, například vazbou na nosič, uvedením do kontaktu s roztokem obsahujícím proteiny p53, případně následovaným objevením vytvo35 řených komplexů nebo elucí. V případě in vivo zejména u člověka mohou tyto molekuly umožnit v patologických souvislostech takových, jako jsou hyperproliferativní choroby, ve kterých je pozorován nedostatek aktivity proteinu p53 opravu této funkce. V tomto ohledu se postup může použít ve spojení s dalšími přístupy naznačenými dále (vložení genu divokého proteinu p53) nebo také ve spojení s chemoterapií (WO 96/22 101). V případě in vivo postup a molekuly podle vynálezu jsou vždy použitelné u zvířat, například pro určení úrovně exprese ScFv a pro určení možnosti přístupu pro lidskou terapii.

Buňka, která obsahuje mutovaný protein p53 je výhodně savčí nádorovou buňkou. V tomto ohledu se mohou uvést zejména buňky rakoviny plic (zejména ne malých buněk), tračníku, jater, mozku, hlavy a krku, všeobecněji se může uvést každá rakovina, ve které je pozorována imitovaná forma proteinu p53. Výhodně sejednáo lidské nádorové buňky, ve kterých jsou pozorováni mutanti p53H273, p53W248 nebo/a p53G281 (plíce, tračník, mozek, hlava a krk, játra). Aplikovatelnost popsaného postupu na jednotlivou buňku může být snadno určena podle následující metodologie: buňka je nejdříve charakterizovaná pro přítomnost imitovaného proteinu p53. Tento protein je potom charakterizován pro určení povahy mutace. Jedná-li se o známou mutaci, zejména o mutaci uvedenou dále, buňka může být považována za vhodnou pro ošetření postupem podle vynálezu. Jedná-li se o mutaci neoznačenou, jsou možné různé přístupy. Mutovaný protein může být nejdříve izolovaný (nebo uměle syntetizovaný) a testovaný tak, jak je popsáno v příkladech pro své chování in vitro nebo in vivo v přítomnosti ScFv. To umožňuje identifikovat vhod-4CZ 300526 B6 nou ScFv pro opravu nedostatečných funkcí tohoto proteinu. Jiný přístup spočívá v přímém testování ScFv na buněčné kultuře pro určení biologického účinku ScFv.

Pro aplikaci popsaného postupuje ScFv výhodně vložena do buňky in vitro, ex vivo nebo in vivo ve formě vektoru nesoucího nukleovou kyselinu kódující uvedenou ScFv pod řízení promotoru funkčního v uvedené buňce.

Promotor je výhodně vybrán mezi promotory účinnými v savčích buňkách, přednostně v lidských. Výhodněji se jedná o promotor umožňující expresi sekvence nukleových kyselin v hyper10 proliferativní buňce (rakovina, restenosa, atd.). V tomto ohledu mohou být použity různé promotory. Může se jednat například o vlastní promotor genu proteinu p53. Může se jednat také o sekvence různého původu (sekvence odpovědné za expresi jiných genů nebo stejných syntetických). Může se také jednat o každý promotor nebo odvozenou sekvenci stimulující nebo potlačující transkripci genu specifickým způsobem nebo nespecifickým, indukovatelně nebo neinduko15 vatelně, silně nebo slabě. Mohou se zejména uvést sekvence promotoru eukaryotních genů nebo genů virových. Například se může jednat o sekvence promotorů vzešlých z genomu cílové buňky. Mezi promotory eukaryontů se mohou použít zejména ubikvitinové promotory (promotor genů HPRT, PGK, α-aktinu, tubulinu, DHFR atd.) promotorů středních fílament (promotor genů GFAP, desmin vimentin, neurofilamenty, keratin atd.) promotorů terapeutických genů (například promotory genů MDR, CFTR, faktor VIII, ApoAI atd.) promotory specifických tkání (promotor genu pyruvát—kinasy, vil inu, vazebný střevní protein mastných kyselin, α-aktin hladkého svalstva atd.), promotory buněk specifického typu buněčného dělení jako jsou rakovinové buňky nebo také promotory odpovídající stimulům (receptor steroidních hormonů, receptor kyseliny retinové atd.). Stejně tak se může jednat o sekvence promotorů pocházející z genomu virů takových, jako jsou například promotory genů E1A a MLP adenovirů, raný promotor CMV nebo také promotor LTR RSA atd. Mimoto tyto oblasti promotorů mohou být modifikovány adicí aktivačních sekvencí, regulačních nebo sekvencí umožňujících expresi tkáňově specifickou nebo majoritní.

Jak je již naznačeno, předložený vynález se týká také nových molekul, které mají zejména výhodné vazebné a reverzní vlastnosti mutovaného proteinu p53. Předložený vynález přesněji popisuje konstrukci, vektorizaci a přenos ScFv (11D3, 421) do buněk. Nukleová a peptidová sekvence těchto ScFv je naznačena SEQ ID n°l a 2. Enzymy, které často zejména výhodně ukazují schopnost těchto molekul (i) specificky vázat mutované proteiny p53 v oblasti C-konce, (ii) vrátit mutovaným proteinům schopnost vázat DNA a (iii) vrátit těmto proteinům schopnost transkripční aktivity. Příklady mimo jiné ukazují, že tyto molekuly jsou správně exprimované v nádorových buňkách, což umožňuje jejich výhodné použití v souvislosti s hyperproliferativními chorobami. Jinak tyto vlastnosti ScFv mohou být podle vynálezu zlepšeny. Zejména je známo, že afinita ScFv je ovlivněna oblastmi CDR (podtrženo na sekvenci) a může být zvýšena rutinním zásahem mutageneze/selekce. Mutageneze na protilátkách byla například popsána Marksem et al.

(Bio/Technology, 10,779-783, 1992) a Winterem G. a Milsteinem C. (Nátuře, 349, 293-299, 1991). Technologie popsané v odkazech mohou být aplikovány na přípravu variant ScFv majících modifikovanou aktivitu podle vynálezu. Potom může být provedena selekce za podmínek popsaných v příkladech.

Předložený vynález se tedy týká molekuly 11D3, jejíž peptidová sekvence je vyjádřená SEQ ID n°2, stejně jako každé varianty vyjadřující modifikací v oblastech CDR zachovávající schopnost vázat protein p53. Modifikace může být provedena deleci, substitucí nebo inzercí jednoho nebo více reziduí v oblastech CDR. Modifikace se výhodně týká méně než 10 reziduí.

Předložený vynález má také za předmět každou nukleovou kyselinu kódující ScFv 11D3 nebo variantu takovou, jaká je již popsána.

Nukleová kyselina podle vynálezu může být ribonukleová kyselina (RNA) nebo deoxyribonukleová kyselina (DNA). Výhodně se jedná o komplementární DNA (cDNA). Může být původu lidského, zvířecího, virového, syntetického nebo semisyntetického. Může být získána různými

-5 CZ 300526 B6 způsoby, zejména chemickou syntézou za použití sekvencí uvedených v přihlášce vynálezu například lze uvést syntetizér nukleových kyselin. Může být také získána tříděním bank prostřednictvím specifických sond zejména takových, jaké jsou popsány v předloženém vynálezu. Mohou být také získány směsnými technikami, zahrnujícími chemickou modifikaci (elongaci, deleci, substituci atd.) vytříděných sekvencí z banky. Všeobecně nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být připraveny podle každé odborníky známé techniky (viz zejména technologie popsané v US 4 946 778 a WO 94/02 610 zahrnutých v přítomných odkazech). Klasický postup konstrukce nukleových kyselin kódujících ScFv je následující: cDNA kódující oblasti VHaVL jsou získány od hybridomu produkující vybranou protilátku anti-p53. Proto úplné RNA hybridomu jsou extrahovány a podrobeny reakci inverzní transkripce za použití random hexamerů jako nástrojů. Použití tohoto typu nástroje umožňuje vyhnout se použití specifických nástrojů imunoglobulinů. Získané klony cDNA mají dostatečnou délku pro klonování oblastí V. Když představují velmi slabou frakci přítomných úplných cDNA může být provedena předběžná reakce amplifíkace pro dostatečnou produkci DNA pro klonování. Proto cDNA kódující oblasti VH a VL jsou amplifikovány odděleně. Použité nástroje jsou oligonukleotidy hybridující na úrovni opačných konců různých oblasti každého řetězce (H a L). Potom je purifikován produkt amplifikace používající specifické nástroje těžkých řetězců a produkt amplifikace používající specifické nástroje lehkých řetězců. Po purifikaci cDNA kódující oblasti VH a VL jsou protilátky sestaveny do jediného řetězce prostřednictvím nukleotidového ramene (L). Nukleotidové rameno bylo konstruováno takovým způsobem, že jeden z konců se váže na 3'konec cDNA kódující oblast VH a druhý na 5'konec cDNA kódující oblast VL. Sekvence ramene kóduje peptid (G4S)3. Spojená sekvence, okolo 700 pb, obsahuje ve formě fragmentu Ncol-Notl svázané VH-L-VL, jejichž sekvence jsou vyjádřeny například SEQ ID n°l a 2.

Nukleová kyselina podle vynálezu je přednostně cDNA nebo RNA,

Nukleová kyselina podle vynálezu je výhodně vybrána mezi:

(a) celkem nebo části sekvence SEQ ID n°2 nebo jejím komplementárním vláknem, (b) každou sekvenci hybridující se sekvencemi (a) a kódující ScFv schopnou specificky vázat protein p53 přednostně na úrovni oblasti C-konce, (c) variantami (a) a (b) vyplývající z degenerace genetického kódu.

Předložený vynález se týká také každé kazety exprese obsahující nukleovou kyselinu takovou, jaká je již definována, promotor umožňující expresi a signál terminace transkripce.

V postupu podle vynálezu kyselina je výhodně vložena do buněk prostřednictvím podávacího vektoru, který umožňuje zvýšit (i) účinek buněčné penetrace, (ii) cílení nebo/a (iii) extra a intracelulámí stabilitu.

Ve způsobu provedení zejména upřednostňovaném předloženým vynálezem nukleová kyselina je zahrnuta do vektoru, který může být původu chemického (lipozom, nanočástice, peptidový komplex, lipidy nebo kationické polymery atd.), virového původu (retrovirus, adenovirus, virus herpes, AAV, virus neštovic atd.) nebo plazmidové.

Použití virových vektorů vyplývá z přirozených vlastností transfekce viru. Je také možné použít adenovirus, virus herpes, retrovirus a virus adeno-associated. Tyto vektory se jeví zejména výkonné v transfekci. Zejména se jedná o schopnost adenovirů a retrovirů infikovat nádorové buňky, když tvoří vektory vybrané v rámci předloženého vynálezu. V tomto ohledu v upřednostňovaném způsobu provedení předloženého vynálezu nukleová kyselina je vložena ve formě retrovirového vektoru, totiž defektního rekombinantního retrovirů, jehož genom obsahuje nukleovou kyselinu kódující ScFv takovou, jaká je již definována. V jiném upřednostňovaném způsobu provedení předloženého vynálezu nukleová kyselina je vložena ve formě adenovirového vektoru,

-6CZ 300526 B6 totiž defektního rekombinantního adenovirů, jehož genom obsahuje nukíeovou kyselinu kódující ScFv takovou, jaká je již definována.

Vektor podle předloženého vynálezu může také být nevirový činitel schopný zprostředkovat pře5 nos a expresi nukleových kyselin do eukaryontní buňky. Chemické nebo biochemické vektory představují zajímavou alternativu přírodním virům zejména z důvodu pohodlnosti, bezpečnosti a také nepřítomnosti teoretické limity týkající se velikosti přenášené DNA. Tyto syntetické vektory mají dvě základní funkce: zkompaktnit nukíeovou kyselinu pro transfekci a podpořit její buněčnou fixaci stejně jako její přechod přes plazmidovou membránu, případně přes dvě nukleár10 ní membrány. Pro zmírnění polyanionické povahy nukleových kyselin nevirové vektory mají všechny náboje polykat ion ické. V upřednostňovaném způsobu provedení předloženého vynálezu je vektor chemický nebo biochemický.

Předložený vynález se týká také každé kompozice obsahující alespoň nukíeovou kyselinu tako15 vou, jaká je již definována.

Týká se také každé kompozice obsahující alespoň vektor takový, jaký je již definován.

Týká se také každé kompozice obsahující alespoň ScFv takovou, jaká je již definována.

Týká se také kompozic obsahujících nukíeovou kyselinu nebo vektor takové, jaké jsou již definovány a nukíeovou kyselinu nebo vektor kódující divoký p53 pro současně kombinované použití nebo pro použití rozložení v čase.

Z důvodu jejich antiproliferativních vlastností farmaceutické kompozice podle vynálezu jsou všechny přizpůsobeny pro léčení hyperproliferativních chorob takových, jako je zejména rakovina a restenosa. Předložený vynález předkládá také metodu zvláště účinnou pro destrukci buněk zejména hyperproliferativních buněk.

Může být použit in vitro nebo ex vivo. V tom případě spočívá zejména v inkubaci buněk v přítomnosti jedné nebo více nukleových kyselin (nebo vektoru, kazety nebo přímo ScFv). Mohou být použity dávky od 0,01 až 1000 pg vektoru pro 10⁶ buněk nebo MOI od 0,1 až 1000 pro virový vektor.

In vivo spočívá v podávání aktivního množství vektoru (nebo kazety) podle vynálezu organizmu přednostně přímo na úrovni místa ošetření (zejména nádor). V tomto ohledu má vynález za předmět metodu destrukce hyperproliferativních buněk zahrnující zkontaktování uvedené buňky nebo jejich částí s nukíeovou kyselinou takovou, jaká je již definována. Pro použití in vivo nukleová kyselina nebo vektor použité v předloženém vynálezu může být formulována z pohledu podávání a to z pohledu topikálního, orálního, parenterálního, intranasálního, intravenózního, intramuskulámího, podkožního, intaokulámího podávání atd. Nukleová kyselina nebo vektor je zejména použit v injektovatelné formě. Může to být směs každého farmaceutického vehikula vhodného pro injektovatelnou formulaci, zejména pro injekci přímo do místa ošetření. Může se jednat zejména o sterilní izotonické roztoky nebo suché kompozice zejména lyofilizované, které po přidání podle potřeby sterilní vody nebo fyziologického séra umožňují injektovatelnou formu. Přímá injekce do nádoru pacienta je zajímavá, protože umožňuje soustředit terapeutický účinek přímo v poškozené tkáni. Dávky nukleových kyselin použité pro injekci mohou být přizpůsobeny různým parametrům, zejména funkci genu, vektoru, použitého způsobu podávání, patologii nebo také délce léčení. Výhodně podávané dávky in vivo obsahují mezi 10⁶ a 10¹⁰ pfu/ml pro virový vektor takový, jako je adenovirus. Může být také použito opakované podávání.

V případě in vivo postup a molekuly podle vynálezu mohou být použity pro studii mechanizmu účinku p53 a pro určení potenciálu ScFv na zvířecích modelech.

-7CZ 300526 B6

Předložený vynález je výhodně použit in vivo pro destrukci buněk v hyperproliferaci (tzn, v nenormální proliferaci). Je také aplikovatelný pro destrukci nádorových buněk nebo buněk hladkého svalstva vaskulámí stěny (restenosa). Je přizpůsoben zejména pro léčení rakovin, ve kterých je pozorován mutant p53. Například se mohou uvést adenokarcinomy tračníku, rakoviny štítné žlázy, karcinomy plic, myel o idn í leukémie, rakoviny prsu, rakoviny plic, žaludeční rakoviny, rakoviny jícnu, lymfomy B, rakoviny ovarií, rakoviny močového měchýře, glioblastomy, hepatokarcinomy, rakoviny kostí, kůže, pankreasu nebo také rakoviny ledvin, prostaty, rakoviny jícnu, rakoviny hrtanu, hlavy a krku, HP V pozitivní rakoviny genitálií, rakoviny nosohltanu EBV pozitivní, rakoviny, ve kterých je superexprimovaný buněčný protein mdm2 atd.

Následující obrázky a příklady blíže ilustrují vynález, aniž by však v jakémkoliv směru omezovaly jeho rozsah.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1: Strategie výběru protilátky

Obrázek 2: Prokázání schopnosti protilátek indukovat zpoždění za p53

Obrázek 3: Prokázání schopnosti protilátek indukovat zpoždění za p53H273

Obrázek 4: Prokázání spojení ScFv s divokým p53 metodou ELISA. Plná kolečka: IgG 11D3 (na počátku 1 pg/ml); prázdná kolečka: IgG 421 (na počátku 1 pg/ml); čtverečky: polyklonální bíoti25 nylované sérum (na počátku 1 pg/ml); plné trojúhelníky:ScFv llD3-myc (1/2); prázdné trojúhelníky: (1/2); kosočtverce: ScFv (anti-CD3, 1/2).

Obrázek 5: Prokázání zpoždění vyvolané ScFv.

Obrázek 6: Obnovení DNA vazebné aktivity k mutantům p53.

Obrázek 7: Exprese ScFv421 v buňkách H1299.

Obrázek 8: Obnova transkripční aktivity mutantu H273 v linii H358.

Obrázek 9: Obnova transkripční aktivity endogenního mutantu H273 v linii HT29.

Příklady provedení vynálezu 40

Příklad 1: Získání a třídění protilátek 11D3

Tento příklad popisuje přípravu, získání a selekci monoklonálních protilátek specificky řízených 45 proti proteinu p53 schopných aktivovat DNA vazebnou funkci mutované formy DNA.

1.1 Získáni proteinů použitých za imunizace myší a třídění hybridomů

Divoký protein p53 a různé proteiny p53 H273, p53 W248, p53 G281 odpovídající mutacím 50 divokého p53 často vyskytujícího se v nádorových buňkách byly produkovány v hmyzích buňkách Spodoptera frugiperda Sf9 infikovaných rekombinantním bakulovirem a purifikovány afinitou na agarosovém gelu, na kterém byla vázána polyklonální protilátka PAb421 (Leveillard et al., EMBO J. 15, 1615-1623 (1996)). Proteiny odpovídající fragmentům 1-320 a 73-320 divokého proteinu p53 byly produkovány také v hmyzích buňkách Spodoptera jrugiperda Sf9 infikovaných rekombinantním bakulovirem za dodržení podmínek daných firmou lnvitrogen.

-8CZ 300526 B6

Komplementární DNA vložené do plazmídu pro přenos pBlueBacIII byly vytvořeny klasickými technikami rekombinantní DNA popsané například v práci Sambrook et al., (Samrook, Fritsch & Maniatis: Molecular cloning, a laboratory manual, druhé vydání, 1989, Ed, Cold Spring Harbor Laboratory).

1.2 Získání a třídění hybridomů

Myši byly imunizovány ekvimolámí směsí třech již popsaných mutovaných proteinů p53 a hybridomy byly získány za dodržení protokolu popsaného v práci Harlow at Lané (Harlow & lané: Antibodies, a laboratory manual, 1988, Ed. Cold Spring Harbor Laboratory). Výběr hybridomů produkujících monoklonální látky řízené proti již popsaným mutovaným proteinům p53 byl proveden metodou štěpení protilátek produkovaných v kultivačním médiu hybridomů v jamkách plaku s 96 jamkami z PVC, ve kterých bylo předem imobilizováno množství 1 mikrogramu ekvimolámí směsi třech již popsaných mutovaných proteinů p53 za dodržení protokolu popsaného v práci Harlow at Lané (Harlow & lané: Antibodies, a laboratory manual, 1988, Ed, Cold Spring Harbor Laboratory). Toto první třídění umožnilo vybrat 317 pozitivních hybridomů. Po dvou týdnech amplifikace hybridomů supematanty amplifikovaných hybridomů byly v první etapě znovu určeny štěpící metodou (metoda 1) již zmíněných protilátek potom tříděny za použití tří identických třídicích metod na zmíněném základu bez toho, aby povaha imobilizovaných proteinů byla rozdílná: V jamkách byl i mobilizovaný buď (metoda 2) purifikovaný divoký protein p53, nebo (metoda 3) proteinový extrakt buněk Sf9 produkujících fragment 1-320 divokého p53 nebo (metoda 4) proteinový extrakt buněk Sf9 produkující fragment 73-393 divokého p53. Proteinové extrakty byly získány lysou zmrazením/rozmrazením buněk Sf9 ve fosfátovém pufru a potom odstředěním buněčných zlomků. Ze 317 supematantů amplifikovaných hybridomů jen 162 odpovídá metodě 1. Zbylých 155 je pozitivních v metodě 2, mezi těmito (skupina A) je 33 negativních v metodách 3 a 4, 115 (skupina B) je pozitivních v metodě 3 a negativních v metodě 4 a konečně 7 (skupina C) je pozitivních ve dvou metodách. Supernatant skupiny B odpovídá supematantům, které obsahují protilátky, jejichž epitop se situuje v prvních 73 aminokyselin proteinu p53. 77 supematantů této skupiny se jeví jako negativní v metodě 2, když byly preinkubovány s peptidem (1 mg/ml) odpovídajícím sekvenci 40 prvních aminokyselin proteinu p53. Isotyp protilátek skupiny A, 38 protilátek skupiny B, které zůstaly po eliminaci 77 již zmíněných protilátek a protilátky skupiny C nám umožnily eliminovat IgM. Tyto výsledky jsou uvedeny na Obrázku 1.

Potom bylo testováno 42 protilátek pro jejich schopnost indukovat super posun na komplexu p53/DNA. Protilátky po purifikaci na proteinu A/Sepharosa byly kvantifikovány. Zpožďovací pokusy na gelu byly provedeny za inkubace 30 ng proteinu p53 divokého typu purifikovaného se sondou DNA značenou 32P reprezentující sekvenci specifické fixace proteinu p53. Potom bylo přidáno 300 ng různých protilátek. Komplexy byly rozděleny na akrylamidovém gelu.

Výsledky uvedené na Obrázku 2 ukazují, že 27 z těchto protilátek by mohlo být schopno indukovat super posun. Mezi těmito 27 bylo testováno 19 protilátek za substituce mutantu His273 divokým proteinem p53 ve stejném pokusu na gelu (Obrázek 3). Těchto 19 protilátek dalo pozitivní výsledek. Protilátky n°29 představují jasnější zpoždění než ostatní. Tyto protilátky byly označeny jako 11D3 a použity v následujících protokolech.

Příklad 2: Získání ScFv 421 a D3M

ScFv byly získány od hybridomů klasickými technikami molekulární biologie založené na PCR pomocí specificky upravených nástrojů v oblastech VH a VL, ScFv odvozený od protilátky 11D3 byl označen jako D3M. Jeho sekvence je vyjádřena na SEQ ID n°2. Sekvence ScFv421 je vyjádřena na SEQ ID n° 1.

-9CZ 300526 B6

Příklad 3: Konstrukce expresního vektoru ScFv

Tento příklad popisuje konstrukci vektorů použitelných pro přenos nukleových kyselin předloženého vynálezu in vitro a in vivo,

3,1 Konstrukce plazmidových vektorů

Pro konstrukci plazmidových vektorů byly použity 2 typy vektorů.

- Vektor pSV2 popsaný v DNA Cloning, A practical approarch Vol.2, D.M. Glover (Ed) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985. Tento vektor je expresním vektorem eukaryontů. Nukleové kyseliny kódující ScFv byly vloženy do tohoto vektoru ve formě fragmentů Hpal-EcoRV. Byly tak umístěny pod kontrolu promotoru zesilovače transkripce viru SV40. Všechny konstrukce popsané v příkladu 2 byly vloženy do tohoto vektoru, aby byly testovány v různých systémech in vitro a in vivo.

- Vektor pCDNA3 (Invitrogen). Jedná se o eukaryontní expresní vektor eukaryontní exprese. Sekvence nukleových kyselin kódující ScFv předloženého vynálezu jsou umístěny v tomto vek20 toru pod řízení raného promotoru CM V. Všechny konstrukce popsané v příkladu 2 byly vloženy do tohoto vektoru ve formě fragmentu Hind III / Not I.

3.2 Konstrukce virových vektorů

Podle charakteristického způsobu provedení předložený vynález spočívá v konstrukci a použití virových vektorů umožňujících přenos a expresi in vivo nukleových kyselin takových, jaké jsou již definovány.

Jedná se zejména o adenoviry, různé se roty py, jejichž struktura a vlastnosti se poněkud mění, a které byly charakterizovány. Mezi těmito serotypy se upřednostňuje použití v rámci předloženého vynálezu lidských adenovirů typu 2 nebo 5 (Ad 2 nebo Ad 5) nebo adenovirů zvířecího původu (viz přihláška vynálezu WO 94/26 914). Mezi adenoviry zvířecího původu, které jsou použitelné v rámci předloženého vynálezu se mohou uvést adenoviry psího, hovězího, myšího původu (například: Mávl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovčího, prasečího, ptačího nebo také opičího původu (například: SAV). Z adenovirů zvířecího původu jsou zejména upřednostňovány adenoviry psí, zejména adenovirus CAV2 (například: kmen manhattan nebo A26/61 (ATCC VR-800)). V rámci předloženého vynálezu se zejména používá adenovirus lidského nebo psího původu nebo jej ich směs.

Defektní adenovirus podle předloženého vynálezu obsahuje ITR, sekvenci umožňující enkapsidaci a nukleovou kyselinu podle vynálezu. V genomu adenovirů vynálezu alespoň oblast El není funkční. Uvažovaný virový gen může být zbaven funkčnosti všemi odborníky známými technikami, zejména úplnou supresi, substitucí, částečnou delecí nebo adicí jedné nebo více párů bází v uvažovaném nebo uvažovaných genech. Tyto modifikace mohou být získány in vitro (na izolované DNA) nebo in sítu například prostřednictvím technik genového oboru nebo také působením mutagenních činidel. Mohou být také modifikovány jiné oblasti genomu, zejména oblast E3 (WO 95/02 697), E2 (WO 94/28 938), E4 (WO 94/28 152, WO 94/12 649, WO 95/02 697, WO 96/22 378) a L5 (WO 95/02 697). Podle upřednostňovaného způsobu provedení adenovirus podle předloženého vynálezu obsahuje deleci v oblastech El a E4. Podle jiného způsobu realizace obsahuje deleci v oblasti El na úrovni, ve které jsou vloženy oblast E4 a sekvence nukleových kyselin vynálezu (viz FR 94 13355). Ve virech podle vynálezu deleee v oblasti El se rozprostírá především od nukleotidu 455 po 3329 v sekvenci adenovirů Ad5.

- 10CZ 300526 B6

Rekombinantní defektní adenovirus podle vynálezu může být připraven všemi odborníky známými technikami (Levrero et ak, Gene 101 (1991) 195, EP 185 573, Graham, EKBO J. 3 (1984) 2917). Může být připraven zejména obecnou rekombinací mezi adenovirem a plazmidem, který nese mimo jiné nárokovanou sekvenci DNA. Obecná rekombinace se provádí po společné trans5 fekci výše uvedených adenovirů a plazmídu v přizpůsobené buněčné linii. Použitá buněčná linie musí přednostně (i) být transformovatelná uvedenými elementy a (ii) obsahovat sekvence schopné doplnit část genomu defektního adenovirů přednostně v integrované formě proto, aby se zamezilo nebezpečí rekombinace. Jako příklad buněčné linie se může uvést lidská ledvinová embryonální linie 293 (Graham et al., J. Gen. Vírok 36 (1977) 59), která obsahuje zejména včleněnou ve io svém genomu levou část genomu adenovirů Ad5 (12%) nebo se mohou uvést linie schopné doplnit funkce El a E4 takové, jaké jsou zejména popsány v přihláškách vynálezu

WO 94/26 914, WO 95/02 697 a WO 96/22 378.

Adenoviry, které se rozmnožily, byly získány a purifikovány podle klasických technik moleku15 lární biologie, jak je naznačeno v příkladech.

Co se týče adeno-associated viru (AAV), jedná se o virus DNA velikosti relativně malé, který se začleňuje do genomu buněk, který infikuje stabilně a stereospecificky. Tyto viry jsou schopné infikovat široké spektrum buněk bez toho, aby byl vyvolán účinek na růst, morfologii nebo dife20 renciaci buněk. Nezdá se, že jsou zahrnuty do patologii u lidí. Genom viru AAV byl klonován, sekvenován a charakterizován. Obsahuje okolo 4700 bází a obsahuje na každém konci oblast obrácené repetice (ITR) se 145 bázemi, které jsou počátkem replikace pro virus. Zbytek genomu je rozdělen na dvě oblasti nesoucí zejména funkce enkapsidace: levou část genomu, která obsahuje gen rep zahrnutý do virové replikace a exprese virových genů, pravou část genomu, která obsahuje gen cap kódující kapsidové proteiny viru.

Použití vektorů odvozených od AAV pro přenos genů in vitro a in vivo bylo popsáno v literatuře (viz zejména WO 91/18 088, WO 93/09 239, US 4 797 368, US 5 139 941, EP 488 528). Tyto přihlášky vynálezů popisují různé konstrukce odvozené od AAV, ve kterých gen rep nebo/a cap jsou deletovány a nahrazeny genem zájmu a popisují jejich použití pro přenos in vitro (na buněčné kultuře) nebo in vivo (přímo v organizmu) uvedeného genu zájmu. Defektní rekombinantní AAV podle vynálezu může být připraven společnou transfekcí v buněčné linii infikované pomocným lidským virem (například adenovirem) plazmídu, který obsahuje sekvenci nukleových kyselin vynálezu zájmu lemovaným dvěma oblastmi obrácené repetice (ITR) AAV, a plazmídu, kteiý nese gen enkapsidace (gen rep a cap) AAV. Použitelná buněčná linie je například linie 293. Rekombinantní produkty AAV jsou pak purifikovány klasickými technikami.

Co se týče viru herpes a retrovirů, konstrukce rekombinantních vektorů byla široce popsána v literatuře: viz zejména Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203, EP 453 242, EP 178 220,

Bemstein et al., Genet, Eng. 7 (1985) 235, McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689 atd. Retroviry jsou zejména integrativní viry, selektivně infikující buňky při buněčném dělení. Tvoří tak vektory zájmu pro rakovinové aplikace. Genom retrovirů zahrnuje zejména dvě LTR, sekvenci enkapsidace a tri kódované oblasti (gag, pol a env). V rekombinantních vektorech odvozených od retrovirů geny gag, pol a env jsou všeobecně deletovány úplně nebo částečně a nahrazeny sek45 věnci heterologní nukleové kyseliny zájmu. Tyto vektory mohou být odvozeny od různých typů retrovirů takových jako zejména MoMuLV („murine moloney leukemia virus“, také označovaný jako MoMLV), MS V („murine moloney sarcoma virus“), HaSV („harvey sarcoma virus“), SNV („spleen necrosis virus“), RSV („rouš sarcoma virus“) nebo také Friendův virus.

Aby se vytvořily rekombinantní retroviry podle vynálezu obsahující sekvenci nukleových kyselin podle vynálezu, plazmid obsahující zejména LTR, byla vytvořena sekvence enkapsidace a výše uvedená sekvence nukleových kyselin a potom použita pro transfekci buněčné linie řečené enkapsidační, schopné nést v trans retrovirální funkce se sníženou schopností v plazmídu. Všeobecně, enkapsidacní linie jsou schopny exprimovat geny gag, pol a env. Takovéto enkapsidační linie byly popsány ve vedlejších oborech, zejména linie PA317 (US 4 861 719), linie PsiCRIP (WO 90/02 806) a linie GP+envAm-12 (WO 89/07 150). Rekombinantní retroviry mohou zahrnovat modifikace na úrovni LTR pro potlačení transkripční aktivity, stejně jako studované enkapsidační sekvence obsahující část genu gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639. Produkované rekombinantní retroviry jsou pak purifikovány klasickými technikami.

Pro uvedení předloženého vynálezu je zejména výhodné použít rekombinantní defektní adenovirus nebo retrovirus. Tyto vektory mají vskutku zajímavé vlastnosti zejména pro přenos sebevražedných genů do nádorových buněk.

io

3.3 Chemické vektory

Mezi vyvinutými syntetickými vektory se přednostně používají v rámci předloženého vynálezu kationické polymery polylysinového typu, (LKLK)n, (LKKL)n, polyethylenimin a DEAE-dext15 ran nebo také kationické lipidy nebo lipofektanty. Tyto vektory mají schopnost kondenzace DNA a podporují její vázání s buněčnou membránou. Mezi těmito posledně jmenovanými vektory se mohou uvést lipopolyaminy (lipofectamin, transfektam atd.), různé kationické lipidy nebo neutrální lipidy (DOTMA, DOGS, DOPE atd,), stejně jako peptidy nukleárního původu. Mimoto pojem cílové transfekce byl vyvinut prostřednictvím reeeptorů, který využívá principu kondenza20 ce DNA díky kationickému polymeru s řízením fixace komplexu k membráně díky chemické vazbě mezi kationickým polymerem a ligandem membránového reeeptorů přítomného na povrchu buňky, která se chce štěpovat. Byly popsány cílové receptory k transferinu, k inzulínu a receptor asialoglykoproteinů hepatocytů. Příprava farmaceutické kompozice podle předloženého vynálezu používající chemický vektor je provedena podle všech odborníky známých technik, všeobecně jednoduchým zkontaktováním různých látek.

Příklad 4: ScFv rozpoznává p53

Spojení ScFv bylo ověřeno testem ELISA.

tag myc byl fúzován s molekulami scFv, aby byla umožněna jejich detekce. ScFv42I, 1 1D3 (D3M) a ScFv kontrola (anti-CD3) byly vytvořeny od periplazmy bakterií exprimující tyto různé ScFv.

Plaky ELISA byly inkubovány pomocí purifikovaného p53 s různými ředěními IgG 11D3, IgG 421, polyklonálním biotynilovaným anti-p53, SCFv 11D3, ScFv 421 a ScFv anti-CD3.

Dva IgG jsou potom detekovány sekundárními protilátkami anti IgG spřáhnutou s alkalickou fosfatasou. Biotynilované sérum je detekováno extravidinem spřaženým s alkalickou fosfatasou. ScFv jsou detekovány protilátkou 9E10 anti-myc, potom protilátkou IgG spojenou s alkalickou fosfatasou. Kolorimetrické dávkování aktivity alkalické fosfatasy je uvedeno na Obrázku 4, který naznačuje, že dva purifikované IgG, polyklonální sérum a ScFv 421 a 11D3 rozpoznávají p53, zatímco ScFv anti-CD3 je neaktivní.

Příklad 5: ScFv jsou schopné indukovat supershift divokého p53

Schopnost ScFv aktivovat funkci vazebné DNA divokého proteinu p53 byla testována pokusy zpoždění na gelu.

Duplex DNA představující místo specifické fixace proteinu p53 byl označen 32P, potom inkubován s purifi kovaným divokým p53 a různými purifikovanými protilátkami nebo ScFv produkovanými v bakteriální periplazmě. Komplexy byly rozděleny elektroforeticky na akry lam idovém gelu.

-12CZ 300526 B6

Získané výsledky jsou uvedeny na Obrázku 5.

Komplex DNA/p53 byl pozorován v linii „Basal“. Protilátky HR231, pAb421 a 11D3 jsou 5 schopné indukovat dostatečné zpoždění (supershift) a zvýšit množství komplexu DNA/p53.

ScFv 421 a D3M jsou také schopné indukovat supershift zatímco kontrolní ScFv anti-ras (Y28) ho neindikuje. ScFv421 na rozdíl od ScFv D3M indukuje zvýšení množství komplexu p53/DNA.

o

Příklad 6: ScFv jsou schopné opravit funkci vazebné DNA k mutantu proteinu p53

Analogicky byly testovány ScFv pro svou schopnost opravit neaktivní funkci vazebné DNA mutantu Trp248. Získané výsledky jsou uvedeny na Obrázku 6.

Výsledky ukazují, že dva ScFv indukují objevení zpožděného pruhu odpovídajícího komplexu p53/DNA.

Příklad 7: ScFv jsou správně exprimovány v nádorových buňkách

Exprese ScFv byla ověřena přechodnou transfekcí expresního vektoru (promotor SV40) v nádorových buňkách H1299. Nukleové kyseliny byly podávány ve formě plazmidového vektoru typu pSV2 (příklad 3) v přítomnosti kationického lipidu, lipofektamu.

Získané výsledky jsou uvedeny na Obrázku 7. Western blotem na úplném extraktu lze pozorovat majoritní pruh, který migruje skrz 30 kD, který odpovídá očekávané velikosti a potvrzuje, že molekuly jsou exprimovány na významné úrovni v nádorových buňkách.

Příklad 8: ScFv jsou schopné částečné opravit transkripční funkci mutantu His273

Účinek těchto ScFv uprostřed nádorových buněk na nedostatečnou transaktivační funkci mutovaných forem proteinu p53 byl měřen následujícím způsobem:

Přechodné transfekce byly provedeny v liniích H358 nebo H1299 (obě dvě deletované pro p53) nebo v linii HT29 (obsahující mutant p53 His 273). Tyto transfekce vkládají vektory exprese pro p53 divokého typu nebo mutantu H273 nebo His 175, pro dva ScFv a transportní plazmid obsahující gen CAT (chloramfenicolacetyltransferasa) pod řízení promotoru p53-dependentní. Aktivita

CAT měřená 48 hodin po transfekci je odrazem funkce transakt i vátoru proteinu p53.

Výsledky uvedené na Obrázku 8 naznačují, že v linii H358 jsou schopné dvě ScFv znovu aktivovat významným způsobem transkripční aktivitu mutantu His273. Uvedené výsledky byly získány v linii H1299.

Stejně tak v linii HT29 jsou schopné dvě ScFv zvýšit transkripční aktivitu mutantu endogenního His273 (Obrázek 9).

-13 CZ 300526 B6

SEKVENCE

SEQ ID n°l: Nukleotidová a peptidová sekvence 421

1/1

CAG GTG	CAG	CTG	CAG	CAG	TCT	GGG	GCA	GAG
gin val 31/11	gin	leu	gin	gin	ser	giy	ala	glu
CTC GTG	AGG	TCA	GGG	GCC	TCA	GTC	AAG	TTG
leu val 61/21	arg	Ser	gly	ala	ser	val	lys	leu
TCC TGC	ACA	GCT	TCT	GGC	TTC	AAC	ATT	AAA
ser cys 91/31	thr	ala	ser	giy	phe	asn	ile	lys
GAC TAC	TAT	ATG	CAC	TGG	GTG	AAG	CAG	AGG
asp tyr 121/41	tyr	met	hys	trp	val	lys	gin	arg
CCT GAA	CAG	GGC	CTG	GAG	TGG	ATT	GGA	TGG
pro glu 151/51	gin	gly	leu	glu	trp	ile	giy	trp
ATT GAT	CCT	GAG	AAT	GGT	GAT	ACT	GAA	TAT
ile asp 181/61	pro	glu	asp	giy	asp	thr	glu	tyr
GCC CCG	AAG	TTC	CAG	GGC	AAG	GCC	ACT	ATG
ala pro 211/71	lys	phe	gin	gly	lys	ala	thr	met
ACT GCA	GAC	ACA	TCC	TCC	AAT	ACA	GCC	TAC
thr ala 241/81	asp	thr	ser	ser	asn	thr	ala	tyr
CTG CAG	CTC	AGC	AGC	CTG	GCA	TCT	GAG	GAC
leu gin 271/91	leu	ser	ser	leu	ala	ser	glu	asp
ACT GCC	GTC	TAT	TAT	TGT	AAT	TTT	TAC	GGG
thr ala	val	tyr	tyr	cys	asn	phe	tyr	giy

301/101

- 14CZ 300526 B6

GAT GCT	TTG	GAC	TAT	TGG	GGC	CAA	GGG	ACC
asp ala 331/111	leu	asp	tyr	trp	giy	gin	giy	thr
ACG GTC	ACC	GTC	TCC	TCA	GGT	GGA	GGC	GGT
thr val 361/121	thr	val	ser	ser	giy	giy	giy	giy
TCA GGC	GGA	GGT	GGC	TCT	GGC	GGT	GGC	GGA
ser gly 391/131	giy	gly	giy	ser	giy	giy	giy	giy
TCG GAT	GTT	TTG	ATG	ACC	CAA	ACT	CCA	CTC
ser asp 421/141	val	leu	met	thr	gin	thr	pro	leu
ACT TTG	TCG	GTT	ACC	ATT	GGA	CAA	CCA	GCC
thr leu 451/151	ser	val	thr	ile	gly	gin	pro	ala
TCC ATC	TCT	TGC	AAG	TCA	AGT	CAG	AGC	CTC
ser ile 481/161	ser	cys	lys	ser	ser	gin	ser	leu
TTG GAT	AGT	GAT	GGA	AAG	ACA	TAT	TTG	AAT
leu asp 511/171	ser	asp	giy	lys	thr	tyr	leu	asn
TGG TTG	TTA	CAG	AGG	CCA	GGC	CAG	TCT	CCA
trp leu 541/181	leu	gin	arg	pro	giy	gin	ser	pro
AAG CGC	CTA	ATC	TAT	CTG	GTG	TCT	AAA	CTG
lys arg 571/191	leu	ile	tyr	leu	val	ser	lys	leu
GAC TCT	GGA	GTC	CCT	GAC	AGG	TTC	ACT	GGC
asp ser 601/201	giy	val	pro	asp	arg	phe	thr	giy
AGT GGA	TCA	GGG	ACA	GAT	TTC	ACA	CTG	AAA
ser gly 631/211	ser	giy	thr	asp	phe	thr	leu	lys
ATC AAC	AGA	GTG	GAG	GCT	GAG	GAT	TTG	GGA
ile asn	arg	val	glu	ala	glu	asp	leu	giy

- 15 CZ 300526 B6

661/221

GTT TAT TAT TGC TGG CAA GGT ACA CAT TCT val tyr tyr cys trp gin gly thr his ser

691/231

CCG CTC ACG TTC AGT GCT GGC ACC AAG CTG pro leu thr phe gly ala gly thr lys leu

721/241

GAA ATC AAA glu ile lys

SEQ ID n°2: Nukleotidová a peptidová sekvence D3M

1/1

CAG GTC	AAG	CTG	CAG	GAG	TCA	GGG	GCA	GAA
gin val 31/11	lys	leu	gin	glu	ser	gly	ala	glu
CTT GTG	AGG	TCA	GGG	GCC	TCA	GTC	AAT	TTG
leu val 61/21	arg	ser	giy	ala	ser	val	asn	leu
TCC TGC	ACA	GCT	TCT	GGC	TTC	AAC	ATT	AAA
ser cys 91/31	thr	ala	ser	gly	phe	asn	ile	lys
GAC TAC	TAT	ATG	CAC	TGG	GTG	AAA	CAG	AGG
asp tyr 121/41	tyr	met	his	trp	val	lys	gin	arg
CCT GAA	GAG	GGC	CTG	GAG	TGG	ATT	GGA	TAT
pro glu 151/51	glu	giy	leu	glu	trp	ile	giy	tyr
ATT GAT	CCT	GAG	AGT	GGT	GAA	ACT	GAA	TAT
ile asp 181/61	pro	glu	ser	giy	glu	thr	glu	tyr
GCC CCG	AAC	TTC	CAG	GGC	AAG	GCC	ACT	GTG
ala pro 211/71	asn	phe	gin	2±X	lys	ala	thr	val
ACT GCA	GAC	ACA	TCC	TCC	AAC	ACA	GCC	TAC

- 16CZ 300526 B6

thr ala	asp	thr	ser	ser	asn	thr	ala	tyr
241/81 CTG CAC	CTC	AGC	AGC	CTG	ACA	TCT	GAG	GAC
leu his	leu	ser	ser	leu	thr	ser	glu	asp
271/91 ACA ACC	GTC	TAT	TAC	TGT	AAT	GCA	GTC	ATC
thr thr	val	tyr	tyr	cys	asn	ala	val	ile
301/101 TAC TAT	GAA	TAC	GAC	GGC	TAT	GCT	i ΙΌ	GAC
tyr tyr	glu	tyr	asp	gly tvr	ala	leu	asp
331/111 TAC TGG	GGC	CAA	GGG	ACC	ACG	GTC	ACC	GTC
tyr trp	giy	gin	giy	thr	thr	val	thr	val
361/121 TCC TCA	GGT	GGA	GGC	GGT	TCA	GGC	TGA	GGT
ser ser	gly	giy	giy	gly	ser	giy	giy	gly
391/131 GGC TCT	GGC	GGT	GGC	GGA	TCG	GAC	ATT	GAG
gly ser	gly	giy	giy	giy	ser	asp	ile	glu
421/141 CTC ACC	CAG	TCT	CCA	TCT	TCC	CTG	GCT	GTG
leu thr	gin	ser	pro	ser	ser	leu	ala	val
451/151 TCA GCA	GGA	GAG	AAG	GTC	GCT	ATG	AGC	TGC
ser ala	giy	glu	lys	val	ala	met	ser	cys
481/161 AM TCC	AGT	CAG	AGT	CTG	TTC	AAC	AGT	AGA
lys ser	ser	gin	ser	leu	phe	asn	ser	arg

511/171

ACC	CGA	AAG	AAT	TAC	TTG	GCT	TGG	TAT	CAG
thr	arg	iys	asn	tyr	leu	ala	trp	tyr	gin
541/181
CAG	AAA	CCA	GGG	CAG	TCT	CCT	AAA	GTG	CTG
gin	lys	pro	giy	gin	ser	pro	lys	val	leu

571/191

Claims (18)

1. 5 PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití jednořetězcové protilátky, která se specificky váže na epitop přítomný v C-koncovém úseku p53 mezi zbytky 320 a 393, pro přípravu farmaceutické kompozice pro léčení rakoío vinných onemocnění, ve kterých je zapojen mutovaný protein p53.
2. 2. Použití podle nároku 1, kdy jednořetězcová protilátka je vybrána z ScFv421, která má sekvenci SEQ ID. No, 1, a 11D
3. 3, která má sekvenci SEQ ID. No. 2.

   15 3. Použití nukieové kyseliny kódující jednořetězcovou protilátku, která se specificky váže na epitop přítomný v C-koncovém úseku p53 mezi zbytky 320 a 393, pro přípravu farmaceutické kompozice pro léčení rakovinných onemocnění, ve kterých je zapojen mutovaný protein p53.
4. 4. Použití podle nároku 3, kdy nukleová kyselina kóduje protilátku vybranou z ScFv421, která

   20 má sekvenci SEQ ID. No. 1, a 11D3, která má sekvenci SEQ ID. No. 2.
5. 5. Použití podle nároku 4, kdy nukleová kysel i na je částí vektoru.
6. 6. Použití podle nároku 5, kdy vektor je virový vektor.
7. 7. Použití podle nároku 6, kdy vektor je defektní rekombinantní adenovirus.
8. 8. Použití podle nároku 6, kdy vektor je defektní rekombinantní retrovirus.

   30
9. 9. Použití podle nároku 6, kdy vektor je defektní rekombinantní AAV.

   - 18 CZ 300526 B6
10. 10. Použití podle nároku 6, kdy vektor je defektní rekombinantní HSV.
11. 11. Použití podle nároků 1 až 10, kdy rakovinné onemocnění je karcinom plic, karcinom tlusté5 ho střeva, karcinom krku a hlavy, karcinom jater nebo karcinom mozku.
12. 12. Použití podle nároků 1 a 3, kdy mutovaný protein p53 je vybrán z proteinů p53H273, p53W248 a p53G281.

    io
13. 13. Molekula 11D3 reprezentovaná sekvencí SEQ ID. No. 2.
14. 14. Nukleová kyselina kódující molekulu podle nároku 13.
15. 15. Nukleová kyselina podle nároku 14 obsahující sekvenci SEQ ID. No. 2.
16. 16. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu podle nároku 15.
17. 17. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje molekulu podle nároku 13.
18. 18. Farmaceutická kompozice pro léčení rakovinného onemocnění, vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu podle nároku 14 a farmaceuticky přijatelný nosič.