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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Wiederherstellung
einer p53-abhängigen
Transaktivierungsaktivität
in Zellen, die ein mutiertes p53-Protein
aufweisen, in denen seine Funktion als Transkriptionsfaktor fehlt
oder verringert ist. Insbesondere basiert das erfindungsgemäße Verfahren
auf der Verwendung einkettiger Antikörper, die in der Lage sind,
spezifisch an das mutierte p53-Protein zu binden. Sie betrifft auch neue
Moleküle,
die p53-Proteine spezifisch und wirksam binden können und die es außerdem gestatten,
eine p53-Aktivität
in Tumorzellen wiederherzustellen, sowie die Nukleinsäuren, die
für diese
Moleküle
codieren, und die Vektoren, die sie enthalten. Dieses Verfahren
und die erfindungsgemäßen Moleküle sind
in vitro oder ex vivo dazu verwendbar, den Wirkmechanismus von p53
und seinen mutierten Formen zu untersuchen oder die p53-Proteine
zu reinigen. Sie bieten auch In-vivo-Verwendungen, insbesondere
bei therapeutischen Ansätzen zur
Wiederherstellung der p53 Aktivität in pathologischen Zusammenhängen, wie
insbesondere bei Krebserkrankungen.
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Das
Wildtyp-p53-Protein ist an der Regulation des Zellzyklus und an
der Aufrechterhaltung der Integrität des Genoms der Zelle beteiligt.
Dieses Protein, dessen Hauptfunktion die eines Aktivators der Transkription
bestimmter Gene ist, kann aufgrund eines bisher noch nicht gut definierten
Prozesses die Zelle in der G1-Phase
des Zellzyklus blockieren, wenn Mutationen im Verlauf der Replikation
des Genoms auftreten, und eine gewisse Anzahl an DNA-Reparaturprozessen
einleiten. Außerdem
kann dieses Protein im Falle einer schlechten Funktion dieser Reparaturprozesse
oder im Falle des Auftretens von Mutationsereignissen, die zu zahlreich
sind, als dass sie behoben werden könnten, das als Apoptose bezeichnete
Phänomen
des programmierten Zelltodes verursachen. Auf diese Weise wirkt
das p53-Protein
als Tumorsuppressor, indem es die Zellen beseitigt, die anomal differenziert
sind oder deren Genom beschädigt
worden ist.
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Diese
hauptsächliche
Funktion von p53 hängt
von seiner Transkriptionsfaktorfunktion oder, anders gesagt, von
seiner doppelten Fähigkeit
ab, spezifische Sequenzen auf Ebene der genomischen DNA zu erkennen
und die allgemeine Transkriptionsmaschinerie zu rekrutieren.
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Das
p53-Protein umfasst 393 Aminosäuren,
die 5 funktionelle Domänen
definieren:
- – die Transkriptionsaktivatordomäne, die
aus den Aminosäuren
1 bis 73 besteht und bestimmte Faktoren der allgemeinen Transkriptionsmaschinerie
binden kann, wie das Protein TBP. Diese Domäne ist auch die Stelle einer
gewissen Anzahl an posttranslationalen Modifikationen. Sie ist auch
die Stelle für
zahlreiche Wechselwirkungen des p53-Proteins mit vielen anderen
Proteinen und insbesondere mit dem zellulären Protein mdm2 oder dem EBNA5-Protein
des Epstein-Barr-Virus (EBV), die in der Lage sind, die Funktion des
Wildtyp-Proteins zu blockieren. Außerdem besitzt diese Domäne so genannte
PEST-Aminosäuresequenzen
für die
Empfänglichkeit
für proteolytischen
Abbau.
- – die
DNA-Bindungsdomäne,
die sich zwischen den Aminosäuren
73 und 315 befindet. Die Konformation dieser zentralen Domäne von p53
reguliert die Erkennung von DNA-Sequenzen, die für das p53-Protein spezifisch
sind. Diese Domäne
ist die Stelle von zwei Typen von Veränderungen, welche die Funktion
des Wildtyp-Proteins beeinflussen:
(i) die Wechselwirkung mit
Proteinen, welche die Funktion von p53 blockieren, wie das "große T"-Antigen des SV40-Virus
oder die viralen E6-Proteine der Viren HPV16 und HPV18, die seinen
Abbau durch das Ubiquitin-System
hervorrufen können.
Diese letztere Wechselwirkung kann nur in Anwesenheit des zellulären Proteins
E6ap (Enzym E3 der Ubiquitinierungskaskade) erfolgen.
(ii)
Punkt-Mutationen, welche die Funktion von p53 beeinflussen und fast
vollständig
in dieser Region lokalisiert sind.
- – das
Kernlokalisationssignal, das aus den Aminosäuren 315 bis 325 besteht und
für die
richtige Sortierung des Proteins in das Kompartiment, in dem es
seine Hauptfunktion ausübt,
unerlässlich
ist.
- – die
Oligomerisierungsdomäne,
die aus den Aminosäuren
325 bis 355 besteht. Diese Region 325 bis 355 bildet eine Struktur
des Typs: β-Faltblatt-(326–334)-Turn-(335–336)-α-Helix-(337–355). Die
in dieser Region lokalisierten Funktionensveränderungen sind im Wesentlichen
auf eine Wechselwirkung des Wildtyp-Proteins mit den verschiedenen mutierten
Formen zurückzuführen, die
zu variablen Wirkungen auf die Funktion des Wildtyp-Proteins führen können.
- – die
Regulationsdomäne,
die aus den Aminosäuren
365 bis 393 besteht und die Stelle für eine bestimmte Anzahl an
posttranslationalen Modifikationen (Glycosylierungen, Phosphorylierungen,
RNA-Anlagerung usw.) ist, welche die Funktion des p53-Proteins in
positiver oder negativer Weise modulieren. Diese Domäne spielt
eine äußerst wichtige
Rolle bei der Modulation der Aktivität des Wildtyp-Proteins.
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Die
Funktionsweise des p53-Proteins kann auf mehrerlei Weise gestört werden.
- – Blockierung
seiner Funktion durch eine bestimmten Anzahl an Faktoren, wie zum
Beispiel das "große T"-Antigen des SV40-Virus,
das EBNA5-Protein des Epstein-Barr-Virus oder das zelluläre Protein
mdm2.
- – Destabilisierung
des Proteins durch Erhöhung
seiner Empfindlichkeit gegenüber
Proteolyse, insbesondere durch Wechselwirkung mit dem Protein E6
der menschlichen Papillomviren HPV16 und HPV18, welche den Eintritt
des p53-Protein in den Ubiquitinierungszyklus begünstigen.
In diesem Fall kann die Wechselwirkung zwischen diesen zwei Proteinen
nur durch vorherige Anlagerung eines zellulären Proteins, des E6ap-Proteins, dessen
Bindungsstelle wenig bekannt ist, erfolgen.
- – Punkt-Mutationen
auf Ebene des p53-Gens.
- – Deletion
von einem oder beiden p53-Allelen.
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Die
letzten beiden Typen der Modifikation findet man bei etwa 50% der
unterschiedlichen Krebsarten. In dieser Hinsicht betreffen die Mutationen
des p53-Gens, die in Krebszellen angetroffen wurden, einen sehr großen Teil
des Gens, das für
dieses Protein codiert, und ergeben variable Modifikationen der
Funktionsweise dieses Proteins. Es soll jedoch darauf hingewiesen
werden, dass diese Mutationen in ihrer großen Mehrzahl im zentralen Abschnitt
des p53-Proteins lokalisiert sind, von dem bekannt ist, dass es
sich um die Kontaktregion mit den genomischen Sequenzen handelt,
die für
das p53-Protein spezifisch sind. Dies erklärt, warum ein hauptsächliches
Merkmal von einem Großteil
der Mutanten des p53-Proteins ist, dass sie nicht mehr an die DNA-Sequenzen
binden können,
die das Wildtyp-Protein
erkennt, und infolgedessen nicht mehr ihre Rolle als Transkriptionsfaktor
ausüben
können.
Außerdem
scheinen bestimmte Mutanten neue Funktionen erworben zu haben, wie
die Aktivierung bestimmter Gene auf transkriptioneller Ebene.
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Derzeit
wird die Gesamtheit dieser Modifikationen in drei Kategorien eingeteilt:
- – die
so genannten schwachen Mutanten, deren Produkt ein nicht-funktionelles
Protein ist, das im Fall einer Mutation in nur einem der zwei Allele
keine Wirkung auf die Funktionsweise des Wildtyp-Proteins hat, das von
dem anderen Allel codiert wird. Die hauptsächlichen Vertreter für diese
Kategorie sind die Mutanten H273 und W248, wobei letztere für das Li-Fraumeni-Syndrom
der familiären
Hypersensitivität
für Krebsleiden
spezifisch ist.
- – die
dominant-negativen Mutanten, deren Produkt ein nicht-funktionelles
Protein ist, das im Fall einer Mutation von nur einem der zwei Allele
und durch Wechselwirkung mit dem Wildtyp-Protein die Funktionsweise dieses
Proteins durch Bildung inaktiver gemischter Oligomere blockieren
kann, die nicht mehr an die DNA-Sequenzen binden können, die
für das
Wildtyp Protein spezifisch sind. Der hauptsächliche Vertreter dieser Kategorie
ist die Mutante G281.
- – die
dominant-onkogenen Mutanten, deren Produkt ein Protein ist, das
einerseits wie die Mutanten der vorhergehenden Kategorie die Funktion
des Wildtyp-Proteins
blockieren kann und andererseits durch schlecht verstandene Mechanismen
die Tumorentwicklung fördern
kann, was somit einen Funktionsgewinn darstellt. Der hauptsächliche
Vertreter dieser Kategorie ist die Mutante H175.
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Angesichts
seiner Antitumor- und apoptotischen Eigenschaften und seiner Implikation
bei vielen Pathologien des hyperproliferativen Typs hat man das
Wildtyp-p53-Gen bei gen- und zelltherapeutischen Ansätzen verwendet.
Es ist insbesondere vorgeschlagen worden, bestimmte hyperproliferative
Pathologien und insbesondere Krebserkrankungen mittels In-vivo-Verabreichung
des Wildtyp-p53-Gens durch Widerherstellung der Funktionen von p53
zu behandeln. Die Verabreichung kann vorzugsweise durch virale,
insbesondere adenovirale (
WO94/24297 )
oder retrovirale (
WO94/06910 ),
Vektoren durchgeführt
werden. So wurde demonstriert, dass durch das Einbringen einer Nukleinsäure, die
für das
Wildtyp-p53-Protein codiert, eine normale Regulation des Zellwachstums
teilweise wiederhergestellt werden kann (Roth et al., Nature Medicine
2 (1996) 985). Alternative Strategien, die auf dem Einsatz chimerer
Moleküle
basieren, die Eigenschaften des p53-Typs besitzen, sind ebenfalls entwickelt
worden (
PCT/FR96/01111 ).
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Ein
anderer Ansatz zur Wiederherstellung der Funktionen des Wildtyp-p53-Proteins
basiert auf einer Reversion der endogenen mutierten Proteine in
Richtung zu einem Wildtyp-Phänotyp,
d. h. welcher die Tumorsuppressor- und die apoptotischen Eigenschaften
des Wildtyp-p53 aufweist. Dieser Ansatz ergibt sich aus dem Nachweis,
dass die Funktionsverluste von p53-Mutanten auf eine Konformationsänderung
des Proteins zurückzuführen sind,
die durch die Mutation(en) verursacht wird. In dieser Hinsicht zeigt
die Anmeldung
WO94/12202 ,
dass ein bestimmter monoklonaler Antikörper, der als pAb421 bezeichnet
wird und gegen das Protein p53 gerichtet ist, bei einer bestimmten
Klasse von Mutanten, die häufig
bei menschlichen Krebserkrankungen angetroffen wird, die Funktion
der In-vitro-Bindung an DNA wiederherstellen kann. Die Verwendung dieses
Typs der Verbindung weist jedoch bedeutende Nachteile auf, die insbesondere
mit der benötigten
erhöhten
Menge an Antikörper
(und somit mit den damit einhergehenden Problemen der Produktion/Reinigung) und
mit ihrem schwachen Eindringvermögen
in die Zellen zusammenhängen.
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Die
vorliegende Anmeldung beschreibt einen leistungsfähigeren
Ansatz zur Wiederherstellung der Wildtypeigenschaften einer Mutante
des p53-Proteins. Die vorliegende Anmeldung beschreibt insbesondere die
Konstruktion von Liganden, die für
das p53-Protein besonders spezifisch sind und die vorteilhafte Eigenschaften
für die
Wiederherstellung der Wildtyp-p53-Funktionen
haben. Genauer gesagt, beschreibt die vorliegende Anmeldung die
Konstruktion einkettiger Antikörper
(ScFv), die für
das Protein p53 spezifisch sind, und insbesondere das Molekül 11D3.
Die vorliegende Anmeldung zeigt außerdem, dass die ScFv p53 erkennen können, innerhalb
einer Tumorzelle effizient exprimiert werden können und einen Teil der Transaktivierungsfunktion
einer bestimmten Klasse von p53-Mutanten reaktivieren können.
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Verglichen
mit den Verfahren des Standes der Technik liefert dieses Molekül bedeutende
Vorteile und insbesondere die Möglichkeit,
dass es in situ in einer Tumorzelle in großen Mengen exprimiert werden
kann. Die nachstehend dargestellten Ergebnisse sind umso unerwarteter,
als zwischen einem herkömmlichen
Antikörper
und einem ScFv häufig
Verluste in der Affinität
beobachtet wurden. Außerdem
hat die Anmelderin gezeigt, dass es möglich ist, ScFv in den richtigen
intrazellulären
Kompartimenten zu exprimieren, wodurch eine optimale biologische
Aktivität
erhalten werden kann.
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Das
Dokument
WO96/30512 betrifft
ein konditionelles Expressionssystem, das bispezifische chimere Moleküle nutzt,
die (A) eine erste Domäne
enthalten, die in der Lage ist, selektiv eine definierte DNA-Sequenz zu
binden, und (B) eine zweite Detektor-Domäne, die spezifisch einen Transaktivator
oder einen Transaktivator-Komplex binden kann, wobei diese zweite
Domäne
ein gegen p53 gerichtetes ScFv sein kann. Die Wiederherstellung
der Transaktivatorfunktionen des p53-Proteins mit einer Konstruktion,
die nur ein ScFv oder eine Sequenz, die für ein ScFv codiert, und kein
Element A enthält,
ist in diesem Dokument nicht beschrieben.
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Das
Dokument Cancer Research, Bd. 55, 15. Aug. 1995, S. 3490–3494, lehrt,
dass der monoklonale Antikörper
mAb PA421 die Transkriptionsaktivierungsfunktion bestimmter mutierter
Formen von p53 wiederherstellen kann, jedoch liefert dieses Dokument
keinerlei Information über
die Eigenschaften möglicher ScFv-Derivate
dieses monoklonalen Antikörpers.
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Eine
erste Aufgabe der Erfindung liegt folglich in einem Verfahren zur
Wiederherstellung einer p53-abhängigen Transaktivierungsaktivität in Zellen,
die ein mutiertes p53-Protein aufweisen, umfassend das Einbringen
eines einkettigen Antikörpers,
der das mutierte p53-Protein spezifisch binden kann, in die besagte
Zelle. Vorteilhafterweise umfasst das erfindungsgemäße Verfahren
das Einbringen einer Nukleinsäure,
die eine Sequenz umfasst, die für
den einkettigen Antikörper
codiert, unter der Kontrolle eines in der Zelle funktionellen Promotors
in die Zelle. Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung
eines einkettigen Antikörpers, der
ein mutiertes p53-Protein spezifisch binden kann, zur Modifikation
der Konformation des besagten Proteins. Die Erfindung betrifft auch
die Verwendung eines einkettigen Antikörpers, der spezifisch ein mutiertes p53-Protein
binden kann, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung,
die zur Behandlung hyperproliferativer Störungen bestimmt ist, an denen
ein mutiertes p53-Protein beteiligt ist, sowie die Verwendung einer
Nukleinsäure,
die für
einen einkettigen Antikörper
codiert, der spezifisch an ein mutiertes p53-Protein binden kann,
zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die für die Behandlung
hyperproliferativer Störungen
bestimmt ist, an denen ein mutiertes p53-Protein beteiligt ist.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
basiert folglich teilweise auf der Konstruktion, der Vektorisierung und
dem Einbringen von einkettigen Antikörpern, die ein mutiertes p53-Protein
spezifisch binden können,
in Zellen. Die einkettigen Antikörper
(ScFv) bestehen im Wesentlichen aus einer VH-Region, die über einen
Arm mit einer VL-Region verbunden ist. Der Konstruktion von ScFv
und die Nukleinsäuresequenzen,
die für
solche modifizierten Antikörper
codieren, sind zum Beispiel im Patent
US4,946,778 oder
in den Anmeldungen
WO 94/02610 und
WO 94/29446 beschrieben.
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Die
vorliegende Anmeldung beschreibt insbesondere die Herstellung einer
Bank von Hybridomen, die gegen p53 gerichtete Antikörper produziert,
und die Konstruktion der entsprechendem ScFv ausgehend von dieser
Bank. Sie beschreibt auch die Klonierung der entsprechenden Nukleinsäuren in
Expressionsvektoren und ihren Transfer in Zellen. Sie zeigt auch,
dass dieser Transfer eine wirksame Widerherstellung der DNA-Bindungsaktivität von p53-Mutanten
sowie ihrer Transaktivatoraktivität in vivo ermöglicht.
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Genauer
gesagt, setzt das erfindungsgemäße Verfahren
ScFv ein, die in der Lage sind, spezifisch an ein Epitop in der
C-terminalen Region von p53 zu binden, das die Oligomerisierungsdomäne und die
Regulationsdomäne
trägt.
In dieser Hinsicht beschreibt die vorliegende Anmeldung auch einen
Test, mit dem ScFv mit dieser Eigenschaft mithilfe der ELISA-Technik
selektiert werden können.
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Noch
stärker
bevorzugt, sind die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt ScFv
in der Lage, spezifisch an ein Epitop in der C-terminalen Region
von p53 zwischen den Resten 320–393
zu binden. In dieser Hinsicht beschreibt die Anmeldung als bestimmtes
Beispiel die Konstruktion und Expression des ScFv ScFv421 der Sequenz
SEQ ID NR: 1 und von 11D3 der Sequenz SEQ ID NR: 2.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist allgemein auf mutierte p53-Proteine anwendbar, welche die Fähigkeit,
an DNA zu binden, ganz oder teilweise verloren haben, und das erfindungsgemäße Verfahren
ermöglicht
es, diese Fähigkeit
wiederherzustellen. Genauer gesagt, ist das erfindungsgemäße Verfahren
auf die mutierten p53-Proteine
anwendbar, welche die Transkriptionsfaktorfunktion von p53 ganz
oder teilweise verloren haben, und es ermöglicht die Wiederherstellung
dieser Funktion. Der Grad der Wiederherstellung kann vollständig oder
teilweise sein. Vorteilhafterweise ist er ausreichend, dass die
Mutante eine Tumorsuppressorfunktion durch Blockierung des Zellzyklus
und/oder durch Induktion der Apoptose ausüben kann. Das erfindungsgemäße Verfahren
ermöglicht
es folglich, eine Tumorsuppressoraktivität in den Zellen, die endogene
mutierte p53-Proteine aufweisen und denen diese Aktivität fehlt,
zumindest teilweise wiederherzustellen. Vorteilhafterweise handelt
es sich um mutierte Proteine, die in Tumorzellen vorliegen. Wie
vorstehend angegeben, wurden verschiedene mutierte Formen des p53-Proteins in Tumorzellen
nachgewiesen. Man kann beispielsweise die Proteine p53H273, p53W248
und p53G281 nennen. Die nachstehend gegebenen Beispiele zeigen insbesondere,
dass durch das erfindungsgemäße Verfahren
die Konformation und die biologischen Eigenschaften dieser Mutanten
in vitro und in vivo modifiziert werden können. Insbesondere zeigen diese
Beispiele, dass die ScFv 421 und 11D3 in der Lage sind, bei den
Mutanten 273 und 248 die Fähigkeit
zur spezifischen Bindung an DNA wiederherzustellen und die p53-abhängige Transaktivierung
zu induzieren.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
kann in vitro, ex vivo oder in vivo durchgeführt werden. In vitro oder ex
vivo lässt
sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
und den erfindungsgemäßen Molekülen zum
Beispiel der Wirkmechanismus von p53 und seinen mutierten Formen
untersuchen. Außerdem
können
die erfindungsgemäßen Moleküle zum Nachweis
oder zur Reinigung von p53-Proteinen
verwendet werden, zum Beispiel durch Koppeln an einen Träger, In-Kontakt-Bringen
mit einer Lösung,
die p53-Proteine enthält,
gegebenenfalls gefolgt von Sichtbarmachen der gebildeten Komplexe
oder von Elution. In vivo können
sie es, insbesondere bei Menschen, ermögichen, in pathologischen Kontexten,
wie hyperproliferativen Störungen,
bei denen ein Mangel an p53-Aktivität beobachtet wird, diese Funktion
wiederherzustellen. In dieser Hinsicht kann es in Verbindung mit
anderen vorstehend erwähnten
Ansätzen
(Einbringen eines Wildtyp-p53-Gens) oder auch in Verbindung mit
einer Chemotherapie (
WO96/22101 )
eingesetzt werden. Ebenfalls in vivo können das erfindungsgemäße Verfahren
und die erfindungsgemäßen Moleküle beim
Tier eingesetzt werden, zum Beispiel um die Expressionsspiegel der
ScFv zu bestimmen und die Möglichkeit
eines humantherapeutischen Ansatzes zu untersuchen.
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Vorteilhafterweise
ist die Zelle, die ein mutiertes p53-Protein aufweist, eine Säuger-Tumorzelle.
In dieser Hinsicht kann man ganz besonders die Zellen von (insbesondere
nicht-kleinzelligem) Lungen-, Colon-, Leber-, Gehirn-, Kopf- und
Halskrebserkrankungen und, allgemeiner gesagt, jeden Krebs nennen,
bei dem eine mutierte Form des p53-Proteins beobachtet wird. Vorteilhafterweise
handelt es sich um eine menschliche Tumorzelle, in der eine p53H273-,
p53W248- und/oder p53G281-Mutante beobachtet wird (Lunge, Colon,
Gehirn, Kopf und Hals, Leber). Die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens
auf eine bestimmte Zelle kann mit der folgenden Methodik leicht
festgestellt werden: Die Zelle wird zuallererst hinsichtlich der
Anwesenheit eines mutierten p53-Proteins charakterisiert. Dieses
Protein wird anschließend
charakterisiert, um die Art der Mutation zu bestimmen. Wenn es sich
um eine bekannte und insbesondere um eine vorstehend verzeichnete
Mutation handelt, kann die Zelle als empfänglich für eine Behandlung durch das
erfindungsgemäße Verfahren
betrachtet werden. Wenn es sich um eine nicht aufgeführte Mutation
handelt, sind verschiedene Ansätze
möglich.
Zuerst kann das mutierte Protein isoliert (oder künstlich
synthetisiert) und in vitro und in vivo auf sein Verhalten in Anwesenheit
von ScFv getestet werden, wie in den Beispielen beschrieben. Dies
gestattet eine Identifikation des ScFv, der für die Wiederherstellung der
mangelhaften Funktionen dieses Proteins geeignet ist. Ein anderer
Ansatz besteht in dem direkten Testen der ScFv an einer Kultur von
Zellen zur Bestimmung der biologischen Wirksamkeit der ScFv.
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Zur
Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird der ScFv vorteilhafterweise in vitro, ex vivo oder in vivo
in die Zelle in Form eines Vektors eingeführt, der eine Nukleinsäure, die
für diesen
ScFv codiert, unter der Kontrolle eines Promotors trägt, der
in dieser Zelle funktionell ist.
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Der
Promotor wird vorteilhafterweise aus den Promotoren ausgewählt, die
in Säugerzellen,
vorzugsweise menschlichen Zellen, funktionell sind. Vorzugsweise
handelt es sich um einen Promotor, der die Expression einer Nukleinsäure in einer
hyperproliferativen Zelle (Krebs, Restenose usw.) ermöglicht.
In dieser Hinsicht können
verschiedene Promotoren verwendet werden. Es kann sich zum Beispiel
um den eigenen Promotor des p53-Gens handeln. Es kann sich auch
um Regionen unterschiedlichen Ursprungs handeln (die für die Expression
anderer Proteine verantwortlich oder sogar synthetisch sind). Es
kann sich somit um jeden Promotor oder jede abgeleitete Sequenz
handeln, welche die Transkription eines Gens auf spezifische oder
unspezifische, induzierbare oder nicht-induzierbare, starke oder
schwache Weise stimuliert oder unterdrückt. Man kann insbesondere
die Promotorsequenzen eukaryotischer oder viraler Gene nennen. Es
kann sich zum Beispiel um Promotorsequenzen handeln, die aus dem
Genom der Zielzelle stammen. Unter den eukaryotischen Promotoren
kann man insbesondere die ubiquitären Promotoren (Promotor der
HPRT-, PGK-, α-Aktin-, Tubulin-Gene
usw.), Promotoren der Intermediärfilamente
(Promotor der GFAP-, Desmin-, Vimentin-, Neurofilament-, Keratin-Gene
usw.), Promotoren therapeutischer Gene (zum Beispiel der Promotor
der MDR-, CFTR-, Faktor VIII-, ApoAI-Gene usw.), gewebespezifische
Promotoren (Promotor des Gens für
Pyruvatkinase, Villin, für
das intestinale fettsäurebindene
Protein, für α-Aktin aus
glatter Muskulatur usw.) oder auch Promotoren, die auf einen Stimulus
reagieren (Steroidhormonrezeptor, Retinsäurerezeptor usw.) nennen. Ebenso
kann es sich um Promotorsequenzen handeln, die aus dem Genom eines
Virus stammen, wie zum Beispiel die Promotoren der Adenovirus-Gene
E1A und MLP, des frühen
CMV-Promotors oder auch des LTR-Promotors von RSV usw. Außerdem können diese
Promotorregionen durch Hinzufügung
von Aktivierungs-, Regulationssequenzen oder von Sequenzen, die
eine gewebespezifische oder mehrheitliche Expression ermöglichen,
modifiziert werden.
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Wie
vorstehend angegeben, beschreibt die vorliegende Anmeldung auch
neue Moleküle,
die besonders vorteilhafte Eigenschaften der Bindung an und der
Reversion mutierter p53-Proteine besitzen. Die Erfindung beschreibt,
genauer gesagt, die Konstruktion, Vektorisierung und den Transfer
spezifischer ScFv (11D3 und 421) in Zellen. Die Nukleinsäuresequenz
und die Peptidsequenz dieser ScFv sind in SEQ ID NR: 1 und 2 angegeben.
Die folgenden Beispiele zeigen die besonders vorteilhafte Fähigkeit
dieser Moleküle,
(i) spezifisch an mutierte p53-Proteine in der C-terminalen Region
zu binden, (ii) diesen mutierten Proteinen die Fähigkeit zur Bindung an DNA
zu verleihen und (iii) diesen Proteinen die Fähigkeit zur Aktivierung der
Transkription zu verleihen. Die Beispiele zeigen außerdem,
dass diese Moleküle
in Tumorzellen korrekt exprimiert werden, was ihre vorteilhafte
Verwendung im Zusammenhang mit hyperproliferativen Störungen ermöglicht.
Außerdem
können
die Eigenschaften der erfindungsgemäßen ScFv auch verbessert werden.
Insbesondere ist bekannt, dass die Affinität von ScFv durch die CDR-Regionen
(in der Sequenz unterstrichen) beeinflusst wird und durch routinemäßige Mutagenese-/-Selektionsexperimente
verbessert werden kann. So wurde die Mutagenese an Antikörpern zum
Beispiel von Marks et al. (Bio/Technologie, 10, 779–783, 1992)
und von Winter G. und Milstein C. (Nature, 349, 293–299, 1991)
beschrieben. Die in diesen Bezugsstellen beschriebenen Technologien
können
auf die Herstellung von Varianten der erfindungsgemäßen ScFv
mit einer modifizierten Affinität
angewendet werden. Die Selektion kann anschließend unter den in den Beispielen
beschriebenen Bedingungen durchgeführt werden.
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Gegenstand
der Erfindung ist folglich außerdem
das Molekül
11D3, dessen Peptidsequenz in SEQ ID NR: 2 dargestellt ist, sowie
jede Variante, die eine Modifikation in den CDR-Regionen aufweist,
welche die Fähigkeit
zur Bindung an p53-Proteine beibehält. Die Modifikation kann aus
einer Deletion, einer Substitution oder einer Insertion von einer
oder mehreren Resten in den CDR-Regionen bestehen. Vorteilhafterweise
erstreckt sich die Modifikation auf weniger als 10 Reste.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist auch jede Nukleinsäure, die
für ScFv
11D3 oder eine Variante, wie oben definiert, codiert.
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Die
erfindungsgemäße Nukleinsäure kann
eine Ribonukleinsäure
(RNA) oder eine Desoxyribonukleinsäure (DNA) sein. Vorteilhafterweise
handelt es sich um eine komplementäre DNA (cDNA). Sie kann menschlichen,
tierischen, viralen, synthetischen oder halbsynthe tischen Ursprungs
sein. Sie kann auf unterschiedliche Weisen und insbesondere durch
chemische Synthese unter Verwendung der in der Anmeldung dargestellten
Sequenzen und zum Beispiel eines Nukleinsäuresynthesegerätes erhalten
werden. Sie kann auch durch Screening von Banken mithilfe spezifischer
Sonden, insbesondere den in der Anmeldung beschriebenen, erhalten
werden. Sie kann auch durch gemischte Techniken, einschließlich chemischer
Modifikation (Elongation, Deletion, Substitution usw.) der mittels
Screening aus den Banken erhaltenen Sequenzen erhalten werden. Allgemein
gesagt, können
die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren gemäß jeder
Technik hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt ist (siehe
insbesondere die in den Patenten
US4,946,778 und
WO94/02610 beschriebenen
Technologien). Eine herkömmliche
Strategie zur Konstruktion von Nukleinsäuren, die für ein ScFv codieren, ist Folgende:
Die für
die VH- und VL-Regionen codierenden cDNAs werden aus dem Hybridom
erhalten, das den gewählten
Anti-p53-Antikörper produziert.
Dazu werden die Gesamt-RNAs des Hybridoms extrahiert und einer reversen
Transkriptionsreaktion unter Verwendung zufallsgemäßer Hexamere
als Primer unterworfen. Durch die Verwendung dieses Primertyps kann
man die Verwendung immunoglobulinspezifischer Primer vermeiden.
Die erhaltenen cDNA-Klone
sind von einer ausreichenden Länge
zur Klonierung der V-Regionen. Wenn sie einen zu kleinen Anteil
der vorhandenen Gesamt-cDNAs darstellen, kann eine vorherige Amplifikationsreaktion
durchgeführt
werden, um ausreichend DNA für
die Klonierung zu produzieren. Dazu werden die cDNAs, die für die VH-
und VL-Regionen codieren, getrennt amplifiziert. Die eingesetzten
Primer sind Oligonukleotide, die an die gegenüberliegenden Enden der variablen
Regionen jeder Kette (H und L) hybridisieren. Das Amplifikationsprodukt
unter Verwendung von Primern, die für die schweren Ketten spezifisch
sind, und das Amplifikationsprodukt unter Verwendung von Primern,
die für
die leichten Ketten spezifisch sind, werden anschließend gereinigt.
Nach der Reinigung werden die cDNAs, die für die VH- und VL-Regionen des Antikörpers codieren,
mithilfe eines Nukleotid-Arms (L) zu einer einzigen Kette verbunden. Der
Nukleotid-Arm wurde derart konstruiert, dass eines der Enden an
das 3'-Ende der
cDNA, die für
die VH-Region codiert,
und das andere Ende an das 5'-Ende
der cDNA, die für
die VL-Region codiert, bindet. Die Sequenz des Arms codiert für das Peptid
(G4S)3. Die zusammengebaute Sequenz von ungefähr 700 bp enthält in Form
eines NcoI/NotI-Fragments die Abfolge VH-L-VL, deren Sequenzen zum
Beispiel in den SEQ ID NR: 1 und 2 dargestellt sind.
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Vorzugsweise
ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure ein
cDNA oder eine RNA.
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Die
erfindungsgemäße Nukleinsäure wird
vorteilhafterweise ausgewählt
aus:
- (a) der gesamten oder einem Teil der Sequenz
SEQ ID NR: 2 oder ihrem komplementären Strang,
- (b) jeder Sequenz, die mit den Sequenzen (a) hybridisiert und
für einen
ScFv codiert, der spezifisch, vorzugsweise in der C-terminalen Region,
an das p53-Protein binden kann,
- (c) den Varianten von (a) und (b), die sich durch die Degeneration
des genetischen Codes ergeben.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch jede Expressionskassette, die
eine Nukleinsäure,
wie vorstehend definiert, einem Promotor, der ihre Expression ermöglicht,
und ein Transkriptionsterminationssignal umfasst.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
wird die Säure
vorteilhafterweise in die Zellen mithilfe eines Verabreichungsvektors
eingeführt,
welcher (i) die Effizienz des Eindringens in die Zelle, (ii) die
Zielsteuerung und/oder (iii) die extra- und die intrazelluläre Stabilität verbessern
kann.
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Bei
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure in einen Vektor eingebracht,
der chemischen (Liposom, Nanopartikel, Peptidkomplex, kationische
Lipide oder Polymere usw.), viralen (Retrovirus, Adenovirus, Herpesvirus,
AAV, Vacciniavirus usw.) Ursprungs sein oder von einem Plasmid abstammen
kann.
-
Die
Verwendung viraler Vektoren basiert auf den natürlichen Transfektionseigenschaften
der Viren. Es ist somit möglich,
zum Beispiel Adenoviren, Herpesviren, Retroviren und adenoassoziierte
Viren zu verwenden. Diese Vektoren haben sich als besonders leistungsfähig auf
der Ebene der Transfektion erwiesen. Insbesondere macht sie die
Fähigkeit
der Adenoviren und der Retroviren zur Infektion von Tumorzellen
zu den Vektoren der Wahl im Umfang der Erfindung. In dieser Hinsicht
wird bei einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung die Nukleinsäure
in Form eines retroviralen Vektors eingeführt, d. h. in Form eines defektiven
rekombinanten Retrovirus, dessen Genom eine Nukleinsäure umfasst,
die für
ein ScFv codiert, wie vorstehend definiert. Bei einer anderen bevorzugten
Ausführungsform
der Erfindung wird die Nukleinsäure
in Form eines adenoviralen Vektors eingeführt, d. h. in Form eines defektiven
rekombinanten Adenovirus, dessen Genom eine Nukleinsäure umfasst,
die für
ein ScFv codiert, wie vorstehend definiert.
-
Der
erfindungsgemäße Vektor
kann auch ein nicht-virales
Mittel sein, das den Transfer und die Expression von Nukleinsäuren in
eukaryotischen Zellen fördern
kann. Synthetische oder natürliche
chemische oder biochemische Vektoren stellen eine interessante Alternative
zu den natürlichen
Viren dar, insbesondere aus Gründen
der Bequemlichkeit, der Sicherheit und auch aufgrund des Fehlens
einer theoretischen Grenze im Hinblick auf die Größe der zu
transfizierenden DNA. Diese synthetischen Vektoren haben zwei hauptsächliche
Funktionen, nämlich
das Komprimieren der zu transfizierenden Nukleinsäure und
das Fördern
ihrer Bindung an die Zelle sowie ihrer Passage über die Plasmamembran und gegebenenfalls
die zwei Kernmembranen. Um der polyanionischen Natur von Nukleinsäuren entgegenzuwirken,
besitzen nicht-virale Vektoren sämtlich polykationische
Ladungen. Bei einem besonderen erfindungsgemäßen Verfahren ist der Vektor
ein chemischer oder biochemischer Vektor.
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Die
Erfindung betrifft auch jede Zusammensetzung, die mindestens eine
Nukleinsäure,
wie oben definiert, umfasst.
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Sie
betrifft auch jede Zusammensetzung, die mindestens einen Vektor,
wie oben definiert, umfasst.
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Sie
betrifft auch jede Zusammensetzung, die mindestens ein ScFv, wie
oben definiert, umfasst.
-
Sie
betrifft auch Zusammensetzungen, die eine Nukleinsäure oder
einen Vektor, wie oben definiert, und eine Nukleinsäure oder
einen Vektor, die für
das Wildtyp-p53 codieren, umfassen, für eine kombinierte gleichzeitige
Verwendung oder eine kombinierte Verwendung in einem zeitlichen
Abstand.
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Aufgrund
ihrer antiproliferativen Eigenschaften sind die erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzungen ganz besonders zur Behandlung hyperproliferativer
Störungen,
wie insbesondere Krebserkrankungen und Restenose, geeignet. Die
vorliegende Erfindung stellt somit ein besonders wirksames Verfahren
zur Zerstörung
von Zellen, insbesondere hyperproliferativer Zellen, bereit.
-
Sie
kann in vitro oder ex vivo eingesetzt werden. In diesem Fall besteht
sie im Wesentlichen aus dem Inkubieren der Zellen in Anwesenheit
von einer oder mehreren Nukleinsäuren
(oder einem Vektor oder einer Kassette oder direkt dem ScFv). Dosen
von 0,01 bis 1000 μg
Vektor pro 106 Zellen oder eine MOI von
0,1 bis 1000 können
für einen
viralen Vektor eingesetzt werden.
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In
vivo besteht sie aus dem Verabreichen einer aktiven Menge eines
erfindungsgemäßen Vektors (oder
einer Kassette) an den Organismus, vorzugsweise direkt an der zu
behandelnden Stelle (insbesondere dem Tumor). In dieser Hinsicht
betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Zerstörung hyperproliferativer
Zellen, welches das In-Kontakt-Bringen dieser Zellen oder eines
Teils von ihnen mit einer Nukleinsäure, wie vorstehend definiert,
umfasst. Für
eine In-vivo-Verwendung kann die Nukleinsäure oder der Vektor, die/der
bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, im Hinblick auf Verabreichungen
auf topischem, oralem, parenteralem, intranasalem, intravenösem, intramuskulärem, subkutanem,
intraokularem, transdermalem Weg usw. formuliert werden. Vorzugsweise
wird die Nukleinsäure
oder der Vektor in einer injizierbaren Form verwendet. Sie/er kann
somit mit jedem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel für eine injizierbare
Formulierung, insbesondere für
eine direkte Injektion an der behandelten Stelle, gemischt werden.
Es kann sich insbesondere um sterile, isotonische Lösungen oder
trockene, insbesondere lyophilisierte, Zusammensetzungen handeln,
die je nachdem durch Zugabe von sterilisiertem Wasser oder physiologischem
Serum die Bildung injizierbarer Lösungen gestatten. Eine direkte
Injektion der Nukleinsäure
in den Tumor des Patienten ist interessant, weil sie es ermöglicht,
die therapeutische Wirkung an den betroffenen Geweben zu konzentrieren.
Die verwendeten Nukleinsäuredosen
können
in Abhängigkeit
von verschiedenen Parametern und insbesondere in Abhängigkeit von
dem Gen, dem Vektor, der verwendeten Verabreichungsart, der betreffenden
Pathologie oder auch der gewünschten
Dauer der Behandlung eingestellt werden. Vorteilhafterweise betragen
die in vivo verabreichten Dosen zwischen 106 und
1010 pfu für einen viralen Vektor, wie
ein Adenovirus. Außerdem
können
auch wiederholte Verabreichungen in Betracht gezogen werden.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
und die erfindungsgemäßen Moleküle können ebenfalls
in vivo zur Untersuchung der Wirkmechanismen von p53 und zur Bestimmung
des Potenzials der ScFv an Tiermodellen verwendet werden.
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Die
vorliegende Erfindung wird vorteilhafterweise in vivo zur Zerstörung von
in der Hyperproliferation (d. h. in der anomalen Proliferation)
befindlichen Zellen verwendet. Sie kann somit zur Zerstörung von Tumorzellen
oder glatten Muskelzellen der Gefäßwand (Restenose) angewendet
werden. Sie ist ganz besonders zur Behandlung von Krebserkrankungen
geeignet, bei denen eine Mutante von p53 beobachtet wird. Als Beispiel kann
man Colon-Adenokarzinome, Krebserkrankungen der Schilddrüse, Lungenkarzinome,
myeloische Leukämien,
Kolorektalkrebserkrankungen, Brustkrebserkrankungen, Lungenkrebserkrankungen,
Darmkrebserkrankungen, Ösophaguskrebserkrankungen,
B-Lymphome, Ovarkrebserkrankungen, Blasenkrebserkrankungen, Glioblastome,
Hepatokarzinome, Knochen-, Haut- oder Pankreaskrebserkrankungen
oder auch Nieren- und Prostatakrebserkrankungen, Ösophaguskrebserkrankungen,
Kehlkopf-, Kopf- und Halskrebserkrankungen, anogenitale HPV-positive Krebserkrankungen,
EBV-positive Krebserkrankungen des Nasopharynx, Krebserkrankungen,
bei denen das zelluläre
Protein mdm2 überexprimiert
wird, usw. nennen.
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Die
vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen detaillierter
beschrieben, die als veranschaulichend und nicht als beschränkend angesehen
werden sollten.
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Figurlegenden
-
1:
Strategie des Antikörper-Screening.
-
2:
Nachweis der Fähigkeit
der Antikörper,
die Wanderung von p53 auf einem Gel zu verzögern.
-
3:
Nachweis der Fähigkeit
der Antikörper,
die Wanderung von p53H273 auf einem Gel zu verzögern.
-
4:
Nachweis der Verbindung der ScFv mit Wildtyp-p53 mittels ELISA.
Ausgefüllte
Kreise: IgG 11D3 (1 μg/ml
Ausgangskonz.); leere Kreise: IgG 421 (1 μg/ml Ausgangskonz.); Quadrate:
biotinyliertes polyklonales Serum (1 μg/ml Ausgangskonz.); ausgefüllte Dreiecke:
ScFv 11D3-myc (zu Beginn auf ½ verdünnt); leere
Dreiecke: ScFv 421 myc (zu Beginn auf ½ verdünnt); Rauten: irrelevanter
ScFv (anti-CD3, zu Beginn auf ½ verdünnt).
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5:
Nachweis der durch die ScFv verursachten Gelverzögerungen.
-
6:
Wiederherstellung der DNA-Bindungsaktivität bei Mutanten von p53.
-
7:
Expression von ScFv421 in H1299-Zellen.
-
8:
Wiederherstellung der Transkriptionsaktivität der Mutante H273 in der Zelllinie
H358.
-
9:
Wiederherstellung der Transkriptionsaktivität der Mutante H273, die in
der HT29-Zelllinie endogen ist.
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Beispiele
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BEISPIEL 1: Gewinnung und Screening des
Antikörpers
11D3
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Präparation,
Gewinnung und Selektion monoklonaler Antikörper, die spezifisch gegen
das p53-Protein gerichtet und in der Lage sind, die DNA-Bindungsfunktion
der mutierten Formen von p53 zu aktivieren.
-
1.1. Gewinnung von zur Immunisierung von
Mäusen
verwendeten Proteinen und Screening der Hybridome
-
Das
Wildtyp-p53-Protein und verschiedene p53-Proteine, p53 H273, p53 W248 und p53
G281, die Mutationen des Wildtyp-p53 entsprechen, die häufig in
Tumorzellen gefunden werden, wurden in Spodopterafrugiperda-Sf9-Insektzellen,
die mit einem rekombinanten Baculovirus infiziert waren, produziert
und mittels Affinität
an einem Agarosegel, an das der polyklonale Antikörper PAb421
gekoppelt worden war, gereinigt (Leveillard et al., EMBO J. 15,
1615–1623
(1996)). Die Proteine, die den Fragmenten 1–320 und 73–320 des Wildtyp-p53-Proteins
entsprechen, wurden ebenfalls in Spodoptera-frugiperda-Sf9-Insektzellen
produziert, die mit einem rekombinanten Baculovirus gemäß den von
der Firma Invitrogen zur Verfügung
gestellten Anleitungen infiziert worden waren. Die in das Transferplasmid
pBlueBacIII inserierten komplementären DNAs wurden durch herkömmliche
DNA-Rekombinationstechniken erzeugt, wie zum Beispiel von Sambrook
et al. (Sambrook, Fritsch & Maniatis:
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, 1989, Hrsg.
Cold Spring Harbor Laboratory) beschrieben.
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1.2. Gewinnung und Screening der Hybridome
-
Die
Mäuse wurden
mit einem äquimolaren
Gemisch der drei vorstehend beschriebenen mutierten p53-Proteine
immunisiert, und die Hybridome wurden erhalten, indem nach den von
Harlow und Lane (Harlow & Lane:
Antibodies, a laboratory manual, 1988, Hrsg. Cold Spring Harbor
Laboratory) beschriebenen Verfahrensprotokollen vorgegangen wurde.
Die Selektion von Hybridomen, welche die monoklonalen Antikörper produzierten,
die gegen die vorstehend beschriebenen mutierten p53-Proteine gerichtet
waren, erfolgte durch das Einfangen des im Hybridom-Kulturmedium
produzierten Antikörpers
in den Vertiefungen von PVC-Platten mit 96 Vertiefungen, in denen
zuvor eine Menge von 1 Mikrogramm des äquimolaren Gemischs der vorstehend beschriebenen
drei mutierten p53-Proteine immobilisiert worden war, indem nach
den von Harlow und Lane (Harlow & Lane:
Antibodies, a laboratory manual, 1988, Hrsg. Cold Spring Harbor
Laboratory) beschriebenen Verfahrensprotokollen vorgegangen wurde.
Dieses erste Screening ermöglichte
die Selektion von 317 positiven Hybridomen. Nach zweiwöchiger Amplifikation
der Hybridome wurden die Überstände der
amplifizierten Hybridome zunächst
erneut durch das vorstehend erwähnte
Verfahren (Verfahren 1) zum Einfangen von Antikörpern untersucht und dann unter
Verwendung dreier Screening-Verfahren
klassifiziert, deren Prinzip identisch mit dem hier vorstehend erwähnten war,
ausgenommen dass die Art der immobilisierten Proteine anders war:
in den Vertiefungen wurde entweder (Verfahren 2) das gereinigte
Wildtyp-p53-Protein oder (Verfahren 3) ein Proteinextrakt aus Sf9-Zellen,
die das Fragment 1–320
des Wildtyp-p53 produzierten, oder (Verfahren 4) ein Proteinextrakt
aus Sf9-Zellen, die das Fragment 73–393 des Wildtyp-p53 produzierten,
immobilisiert. Die Proteinextrakte wurden durch Lyse der Sf9-Zellen
mittels Einfrieren/Auftauen in einem Phosphatpuffer und anschließende Ultrazentrifugation
des Zelldebris erhalten. Von den 317 amplifizierten Hybridomüberständen reagierten
162 nicht mehr im Verfahren 1. Die restlichen 155 waren immer noch
positiv im Verfahren 2, wobei 33 von diesen (Gruppe A) in den Verfahren
3 und 4 negativ waren, 115 (Gruppe B) im Verfahren 3 positiv und
im Verfahren 4 negativ waren und schließlich 7 (Gruppe C) in diesen
beiden Verfahren positiv waren. Die Überstände der Gruppe B entsprechen Überständen, die
einen Antikörper
enthalten, dessen Epitop in den ersten 73 Aminosäuren von p53 liegt. 77 Überstände dieser
Gruppe erwiesen sich als negativ im Verfahren 2, wenn sie mit dem
Peptid (1 mg/ml) inkubiert wurden, das der Sequenz der ersten 40
Aminosäuren
von p53 entsprach. Eine Isotypisierung der Antikörper der Gruppe A, der 38 Antikörper der
Gruppe B, die nach der Eliminierung der 77 vorstehend Erwähnten verblieben,
und derjenigen der Gruppe C ermöglichte
uns, die IgM zu entfernen. Diese Ergebnisse sind in 1 zusammengefasst.
-
Anschließend wurden
42 Antikörper
auf ihre Fähigkeit
untersucht, einen Supershift an einem p53/DNA-Komplex zu verursachen.
Nach der Reinigung auf Protein A/Sepharose, wurden die Antikörper quantifiziert.
Gelverzögerungsexperimente
wurden durchgeführt,
indem 30 ng gereinigtes Wildtyp-p53-Protein mit einer 32P-markierten
DNA-Sonde inkubiert wurden, die eine spezifische Bindungssequenz
für p53
darstellte. Dann wurden 300 ng der verschiedenen Antikörper zugegeben.
Die Komplexe wurden auf einem Acrylamidgel überprüft.
-
Die
Ergebnisse der 2 zeigen, dass 27 dieser Antikörper in
der Lage waren, einen Supershift zu verursachen. Unter diesen 27
wurden 19 untersucht, wobei die Mutante His273 anstelle des Wildtyp-p53-Proteins im gleichen
Gelverzögerungesxperiment
eingesetzt wurde (3). Diese 19 Antikörper ergaben
sämtlich positive
Ergebnisse. Der Antikörper
Nr. 26 zeigte eine ausgeprägtere
Verzögerung
als die anderen. Dieser Antikörper
wurde als 11D3 bezeichnet und in den folgenden Experimenten verwendet.
-
BEISPIEL 2: Gewinnung der ScFv 421 und
D3M
-
Die
ScFv wurden aus den Hybridomen durch molekularbiologische Standardtechniken
auf Basis von PCR mithilfe degenerierter Primer, die für die VH-
und VL-Regionen spezifisch waren, erhalten. Der von dem Antikörper 11D3
abgeleitete ScFv wurde als D3M bezeichnet. Seine Sequenz ist in
SEQ ID NR: 2 dargestellt. Die Sequenz von ScFv421 ist in SEQ ID
NR: 1 dargestellt.
-
BEISPIEL 3: Konstruktion von Expressionsvektoren
für ScFv
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Konstruktion von Vektoren, die für den In-vitro-
oder In-vivo-Transfer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren verwendet
werden können.
-
3.1. Konstruktion von Plasmidvektoren
-
Zur
Konstruktion von Plasmidvektoren wurden 2 Vektortypen verwendet.
- – Der
in DNA Cloning, A practical approach, Bd. 2, D.M. Glover (Hrsg.)
IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985 beschriebene Vektor pSV2.
Dieser Vektor ist ein eukaryotischer Expressionsvektor. Die für die ScFv codierenden
Nukleinsäuren
wurden in diesen Vektor in Form von HpaI/EcoRV-Fragmenten eingesetzt.
So werden sie unter die Kontrolle des Promotors des SV40-Virus-Enhancers gestellt.
Alle im Beispiel 2 beschriebenen Konstruktionen wurden für den Test
in unterschiedlichen In-vitro- und In-vivo-Untersuchungssystemen
in diesen Vektor eingeführt.
- – Der
Vektor pCDNA3 (Invitrogen). Es handelt sich ebenfalls um einen eukaryotischen
Expressionsvektor. Die Nukleinsäuren,
die für
die erfindungsgemäßen ScFv
codieren, werden in diesem Vektor somit unter die Kontrolle des
frühen
CMV-Promotors gestellt. Alle im Beispiel 2 beschriebenen Konstruktionen
wurden in diesen Vektor in Form eines HindIII/NotI-Fragments eingeführt.
-
3.2. Konstruktion viraler Vektoren
-
Gemäß einer
besonderen Ausführungsform
betrifft die Erfindung die Konstruktion und Verwendung viraler Vektoren,
die den Transfer und die In-vivo-Überexpression
der Nukleinsäuren,
wie vorstehend definiert, ermöglichen.
-
Dabei
handelt es sich, genauer gesagt, um Adenoviren, wobei unterschiedliche
Serotypen charakterisiert wurden, deren Struktur und Eigenschaften
ein wenig variieren. Unter diesen Serotypen ist im Rahmen der vorliegenden
Erfindung die Verwendung der menschlichen Adenoviren des Typs 2
oder 5 (Ad 2 oder Ad 5) oder der Adenoviren tierischen Ursprungs
bevorzugt (siehe die Anmeldung
WO94/26914 ).
Unter den aus Tieren stammenden Adenoviren, die im Rahmen der vorliegenden
Erfindung verwendbar sind, kann man die aus Hund, Rind, Maus (Beispiel:
Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), Schaf, Schwein, Vogel
oder Affe (Beispiel: SAV) stammenden Adenoviren nennen. Vorzugsweise
ist das Adenovirus tierischen Ursprungs ein Hunde-Adenovirus, vorzugsweise
ein Adenovirus CAV2 [zum Beispiel Stamm Manhattan oder A26/61 (ATCC VR-800)].
Vorzugsweise verwendet man im Rahmen der Erfindung Adenoviren aus
Mensch oder Hund oder gemischten Ursprungs.
-
Vorzugsweise
umfassen die erfindungsgemäßen defektiven
Adenoviren die ITR, eine Sequenz, welche die Einkapselung einer
erfindungsgemäßen Nukleinsäure ermöglicht.
Noch stärker
bevorzugt ist im Genom der erfindungsgemäßen Adenoviren mindestens die
Region E1 nicht-funktionell. Das betreffende virale Gen kann durch
jede dem Fachmann bekannte Technik und insbesondere durch vollständige Suppression, Substitution,
teilweise Deletion oder Hinzufügung
von einer oder mehreren Basen in de(m/n) betreffenden Gen(en) nicht-funktionell
gemacht werden. Derartige Modifi kationen können in vitro (an der isolierten
DNA) oder in situ, zum Beispiel mithilfe gentechnologischer Techniken,
oder auch durch Behandlung mit mutagenen Mitteln erhalten werden.
Andere Regionen können
ebenfalls modifiziert werden, insbesondere die Region E3 (
WO95/02697 ), E2 (
WO94/28938 ), E4 (
WO94/28152 ,
WO94/12649 ,
WO95/02697 ,
WO96/22378 ) und L5 (
WO95/02697 ). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das erfindungsgemäße Adenovirus
eine Deletion in den Regionen E1 und E4. Gemäß einer anderen bevorzugten
Ausführungsform
umfasst es eine Deletion in der Region E1, in die die Region E4
und die erfindungsgemäße Nukleinsäure eingesetzt
werden (
WO96/13596 ).
In den erfindungsgemäßen Viren
erstreckt sich die Deletion in der E1-Region vorzugsweise von den
Nukleotiden 455 bis 3329 in der Sequenz des Adenovirus Ad5.
-
Die
erfindungsgemäßen defektiven
rekombinanten Adenoviren können
durch jede dem Fachmann bekannte Technik hergestellt werden (Levrero
et al., Gene 101 (1991) 195,
EP
185 573 ; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Insbesondere können sie
durch homologe Rekombination zwischen einem Adenovirus und einem
Plasmid, das unter anderem die interessierende DNA-Sequenz trägt, hergestellt
werden. Die homologe Rekombination findet nach Co-Transfektion der
Adenoviren und des Plasmids in eine geeignete Zelllinie statt. Die
verwendete Zelllinie sollte vorzugsweise (i) durch die besagten
Elemente transformierbar sein und (ii) die Sequenzen, die den defektiven
Teil des Genoms des Adenovirus komplementieren können, vorzugsweise in integrierter
Form tragen, um Rekombinationsrisiken zu vermeiden. Als Beispiel
für eine
Linie kann man die menschliche embryonale Nierenzelllinie 293 nennen
(Graham et al. J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), die, genauer gesagt,
integriert in ihr Genom den linken Teil des Genoms eines Ad5-Adenovirus
(12%) enthält,
oder Zelllinien, welche die E1- und E4-Funktionen komplementieren können, wie
insbesondere die in den Anmeldungen Nr.
WO94/26914 ,
WO95/02697 und
WO96/22378 beschriebenen.
-
Anschließend werden
die Adenoviren, die sich vermehrt haben, gewonnen und mittels molekularbiologischer
Standardtechniken gereinigt, wie in den Beispielen veranschaulicht.
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Bei
den adenoassoziierten Viren (AAV) handelt es sich um verhältnismäßig kleine
DNA-Viren, die sich in stabiler und stellenspezifischer Weise in
das Genom der Zellen integrieren, die sie infizieren. Sie sind in
der Lage, ein breites Spektrum an Zellen zu infizieren, ohne eine
Wirkung auf das Wachstum, die Morphologie oder die Differenzierung
der Zellen zu verursachen. Außerdem
scheinen sie nicht an Pathologien beim Menschen beteiligt zu sein.
Das Genom der AAV wurde kloniert, sequenziert und charakterisiert.
Es umfasst ungefähr 4700
Basen und enthält
an jedem Ende eine umgekehrte Wiederholungsregion (ITR) von etwa
145 Basen, die als Replikationsursprung für das Virus dient. Der Rest
des Genoms wird in 2 wesentliche Regionen unterteilt, welche die
Einkapselungsfunktionen enthalten: den linken Teil des Genoms, welcher
das rep-Gen enthält, das an
der Virusreplikation und der Expression viraler Gene beteiligt ist;
den rechten Teil des Genoms, welcher das cap-Gen enthält, das
für die
Kapsidproteine des Virus codiert.
-
Die
Verwendung von Vektoren, die von AAV abgeleitet sind, zum In-vitro-
und In-vivo-Transfer von Genen ist in der Literatur beschrieben
(siehe insbesondere
WO 91/18088 ;
WO 93/09239 ;
US 4,797,368 ,
US 5,139,941 ,
EP 488 528 ). Diese Anmeldungen beschreiben
verschiedene, von AAV abgeleitete Konstruktionen, in denen die Gene
rep und/oder cap deletiert und durch ein interessierendes Gen ersetzt
sind, und ihre Verwendung für
den In-vitro- (in Zellen in Kultur) oder In-vivo-Transfer (direkt in einen Organismus)
des interessierenden Gens. Die erfindungsgemäßen defektiven rekombinanten
AAV hergestellt werden, indem in eine Zelllinie, die mit einem menschlichen
Hilfsvirus (zum Beispiel einem Adenovirus) infiziert ist, ein Plasmid,
das eine erfindungsgemäße interessierende
Nukleinsequenz, flankiert von zwei umgekehrten Wiederholungsregionen
(ITR) von AAV, enthält,
und ein Plasmid, welches die Einkapselungsgene (die Gene rep und
cap) des AAV trägt,
cotransfiziert werden. Eine verwendbare Zelllinie ist zum Beispiel
die Linie 293. Die produzierten rekombinanten AAV werden dann durch
herkömmliche
Techniken gereinigt.
-
Hinsichtlich
der Herpesviren und Retroviren ist die Konstruktion rekombinanter
Vektoren in der Literatur reichlich beschrieben: siehe insbesondere
Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203;
EP 453242 ,
EP 178220 , Bernstein et al., Genet.
Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689 usw. Die
Retroviren sind, genauer gesagt, integrative Viren, die selektiv
in der Teilung befindliche Zellen infizieren. Sie stellen folglich
interessante Vektoren für
Krebsanwendungen dar. Das Genom der Retroviren umfasst im Wesentlichen
zwei LTRs, eine Einkapselungssequenz und drei codierende Regionen
(gag, pol und env). In rekombinanten Vektoren, die von Retroviren
stammen, sind die gag-, pol- und env-Gene im Allgemeinen ganz oder teilweise
deletiert und durch eine heterologe Nukleinsäuresequenz von Interesse ersetzt.
Diese Vektoren können
ausgehend von verschiedenen Retrovirus-Typen hergestellt werden,
wie insbesondere MoMuLV ("murine moloney
leukemia virus";
auch als MoMLV bezeichnet), MSV ("murine moloney sarcoma virus"), HaSV ("harvey sarcoma virus"); SNV ("spleen necrosis virus"); RSV ("Rous sarcoma virus") oder auch das Friend-Virus.
-
Zur
Konstruktion erfindungsgemäßer rekombinanter
Retroviren, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten, wird ein Plasmid,
das insbesondere die LTRs, die Einkapselungssequenz und die besagte
Nukleinsäure
enthält,
konstruiert und dann zur Transfektion einer so genannten Einkapselungszelllinie
verwendet, welche die auf dem Plasmid fehlenden retroviralen Funktionen
in trans beisteuern kann. Im Allgemeinen können die Einkapselungszelllinien
folglich die gag-, pol- und env-Gene exprimieren. Derartige Einkapselungszelllinien
sind im Stand der Technik beschrieben, insbesondere die Linie PA317
(
US 4,861,719 ); die
Linie PsiCRIP (
WO90/02806 )
und die Linie GP+envAm-12 (
WO89/07150 ).
Außerdem
können
die rekombinanten Retroviren Modifikationen an den LTRs, um die
Transkriptionsaktivität
zu unterdrücken,
sowie vergrößerte Einkapselungssequenzen,
die einen Teil des gag-Gens enthalten, beinhalten (Bender et al.,
J. Virol. 61 (1987) 1639). Die produzierten rekombinanten Retroviren
werden dann mit herkömmlichen
Techniken gereinigt.
-
Zur
Ausführung
der vorliegenden Erfindung ist es ganz besonders vorteilhaft, wenn
ein defektives rekombinantes Adenovirus oder Retrovirus verwendet
wird. Diese Vektoren besitzen tatsächlich besonders interessante
Eigenschaften für
den Transfer von Genen in Tumorzellen.
-
3.3. Chemische Vektoren
-
Unter
den entwickelten synthetischen Vektoren werden im Rahmen der Erfindung
vorzugsweise kationische Polymere des Typs Polylysin, (LKLK)n, (LKKL)n
(
WO95/21931 ), Polyethylenimin
(
WO96/02655 ) und DEAE-Dextran oder auch
kationische Lipide oder Lipofectants verwendet. Sie besitzen die
Eigenschaft, DNA zu kondensieren und ihre Anlagerung an die Zellmembran
zu fördern.
Von diesen Letzteren kann man die Lipopolyamine (Lipofectamin, Transfectam,
WO95/18863 und
WO96/17823 ), verschiedene
kationische oder neutrale Lipide (DOTMA, DOGS, DOPE usw.) sowie
aus dem Kern stammende Peptide (
WO96/25508 )
nennen. Außerdem
ist das Konzept der durch einen Rezeptor vermittelten gerichteten
Transfektion entwickelt worden, wobei das Prinzip der Kondensation
von DNA aufgrund des kationischen Polymers genutzt und gleichzeitig
die Bindung des Komplexes aufgrund einer chemischen Kopplung zwischen
dem kationischen Polymer und dem Liganden eines Membranrezeptors,
der auf der Oberfläche
des Zelltyps vorliegt, den man verändern möchte, an die Membran gesteuert
wird. So ist das Ansteuern des Transferrin-, des Insulinrezeptors
oder des Rezeptors. der Asialoglykoproteine von Hepatozyten beschrieben
worden. Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung unter Verwendung
eines derartigen chemischen Vektors wird mit jeder dem Fachmann
bekannten Technik durchgeführt,
im Allgemeinen durch einfaches In-Kontakt-Bringen der verschiedenen
Komponenten.
-
BEISPIEL 4: Die ScFv erkennen p53
-
Die
Bindung der ScFv an p53 wurde in einem ELISA-Test bestätigt.
-
Ein
myc-Tag wurde an die ScFv fusioniert, um ihren Nachweis zu ermöglichen.
Die ScFv 421 und 11D3 (D3M) und ein Kontroll-ScFv (anti-CD3) wurden
aus den Periplasmen von Bakterien produziert, welche diese verschiedenen
ScFv exprimieren.
-
Mit
gereinigtem p53 beschichtete ELISA-Platten werden mit verschiedenen
Verdünnungen
an 11D3-IgG, 421-IgG,
biotinyliertem polyklonalem Anti-p53-Serum, 11D3-ScFv, 421-ScFv und Anti-CD3-ScFv inkubiert.
-
Die
beiden IgGs werden dann mit einem sekundären anti-IgG-Antikörper sichtbar
gemacht, der an alkalische Phosphatase gekoppelt ist. Das biotinylierte
Serum wird mit Extravidin, das mit alkalischer Phosphatase gekoppelt
ist, sichtbar gemacht. Die ScFv werden mit dem Anti-myc-Antikörper 9E10
und dann mit einem Anti-IgG-Antikörper, der
an alkalische Phosphatase gekoppelt ist, sichtbar gemacht. Ein kolorimetrischer Nachweis
der alkalischen Phosphataseaktivität ist in 4 dargestellt,
die zeigt, dass die zwei gereinigten IgGs, das polyklonale Serum
und die ScFv 421 und 11D3 p53 erkennen, während das anti-CD3-ScFv inaktiv ist.
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BEISPIEL 5: Die ScFv können einen Supershift von Wild-Typ-p53 verursachen
-
Die
Fähigkeit
der ScFv, die DNA-Bindungsfunktion von Wildtyp-p53 zu aktivieren,
wurde durch Gelverzögerungsexperimente
untersucht.
-
Ein
DNA-Duplex, der eine spezifische Bindungsstelle für p53 darstellt,
wurde mit 32P markiert und dann mit dem gereinigten Wildtyp-p53
und verschiedenen gereinigten Antikörpern oder ScFv inkubiert,
die in den bakteriellen Periplasmen produziert worden waren. Die
Komplexe werden durch Acrylamidgelelektrophorese aufgetrennt.
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Die
erhaltenen Ergebnisse sind in 5 dargestellt.
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Der
DNA/p53-Komplex wird auf der "Basal" linie beobachtet.
Die Antikörper
HR231, pAb421 und 11D3 können
eine zusätzliche
Verzögerung
(Supershift) verursachen und die Menge an DNA/p53-Komplex erhöhen.
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Die
ScFv 421 und D3M können
ebenfalls einen Supershift induzieren, während ein Anti-ras-Kontroll-ScFv (Y28) keine
Wirkung hat. Der ScFv 421 induziert im Gegensatz zu dem ScFv D3M
eine Zunahme der Menge des p53/DNA-Komplexes.
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BEISPIEL 6: Die ScFv können bei einer p53-Mutante
eine DNA-Bindungsfunktion wiederherstellen
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Analog
wurden die ScFv hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die DNA-Bindungsfunktion
der inaktiven Mutante Trp248 wiederherzustellen, untersucht. Die
erhaltenen Ergebnisse sind in 6 dargestellt.
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Sie
zeigen, dass die zwei ScFv das Auftreten einer verzögerten Bande
verursachen, die einem p53/DNA-Komplex
entspricht.
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BEISPIEL 7: Die ScFv werden in Tumorzellen
korrekt exprimiert
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Die
Expression der ScFv wurde durch transiente Transfektion von Expressionsvektoren
(SV40-Promotor) in H1299-Tumorzellen bestätigt. Genauer gesagt, wurden
die Nukleinsäuren
in Form eines Plasmidvektors des pSV2-Typs (Beispiel 3) und in Gegenwart eines
kationischen Lipids, Lipofectamin, verabreicht.
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Die
erhaltenen Ergebnisse sind in 7 dargestellt.
Mittels Western-Blot an einem Gesamtextrakt wird eine Hauptbande
beobachtet, die bei etwa 30 kD wandert, was der erwarteten Größe entspricht
und bestätigt,
dass die Moleküle
in den Tumorzellen in signifikanten Spiegeln exprimiert werden.
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BEISPIEL 8: Die ScFv können die Transaktivierungsfunktion
von His273-Mutanten teilweise wiederherstellen
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Die
Funktionsfähigkeit
dieser ScFv innerhalb von Tumorzellen auf die mangelhafte Transaktivierungsfunktion
der mutierten Formen von p53 wurde folgendermaßen gemessen:
Transiente
Transfektionen wurden in den Linien H358 oder H1299 (in beiden Zelllinien
ist p53 deletiert) oder in der Linie HT29 (welche die p53-Mutante
His273 enthält)
durchgeführt.
Durch dies Transfektionen wurden Expressionsvektoren für Wildtyp-p53
oder die Mutanten H273 oder His175, für die zwei ScFv und ein Reporterplasmid
eingebracht, welches das Gen für
CAT (Chloramphenicolacetyltransferase) unter der Kontrolle eines
p53-abhängigen
Promotors enthielt. Die 48 Std. nach der Transfektion gemessene
CAT-Aktivität
spiegelt die Transaktivierungsfunktion von p53 wider.
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Die
Ergebnisse der 8 zeigen, dass in der Linie
H358 die zwei ScFv in der Lage sind, die transkriptionelle Aktivität der His273-Mutante
auf signifikante Weise zu reaktivieren, identische Ergebnisse wurden
in der Linie H1299 erhalten.
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Ebenso
können
die zwei ScFv in der Linie HT29 die transkriptionelle Aktivität der endogenen His273-Mutante erhöhen (
9). SEQUENZEN