WO2000050451A2

WO2000050451A2 - An der entwicklung des nervensystems beteiligtes protein (tp)

Info

Publication number: WO2000050451A2
Application number: PCT/DE2000/000583
Authority: WO
Inventors: Annemarie Poustka; Johannes Coy
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts
Priority date: 1999-02-26
Filing date: 2000-02-28
Publication date: 2000-08-31
Also published as: EP1165607A2; DE19908423A1; WO2000050451A3; AU3801800A

Abstract

Beschrieben werden ein Protein (TP) und dazu verwandte Proteine, die an der Entwicklung des Nervensystems, insbesondere des ZNS, beteiligt sind und gewebe- und entwicklungsspezifisch exprimiert werden, sowie diese Proteine codierende DNA-Sequenzen. Beschrieben werden ferner gegen diese Proteine gerichtete Antikörper oder Fragmente davon, sowie gegen die Expression dieser Proteine gerichtete Antisense-RNA bzw. Ribozyme. Schliesslich werden Arzneimittel und Diagnoseverfahren beschrieben, bei denen die vorstehenden Verbindungen zur Anwendung kommen. Ausserdem wird ein nicht-menschliches Säugetier beschrieben, dessen für TP codierendes Gen verändert ist.

Description

An der Entwicklung des Nervensystems beteiligtes Protein (TP)

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein (T-Protein) und dazu verwandte Proteine, die an der Entwicklung des Nervensystems beteiligt sind und gewebe- und entwicklungsspezifisch exprimiert werden, die nachstehend beschriebenen Varianten dieser Proteine sowie diese Proteine codierende DNA-Sequenzen. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner gegen diese Proteine gerichtete Antikörper oder Fragmente davon, sowie gegen die Expression dieser Proteine gerichtete Antisense-RNAs bzw. Ribozyme. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung Arzneimittel und Diagnoseverfahren, bei denen die vorstehenden Verbindungen zur Anwendung kommen .

Mutationen in Genen, die eine Rolle bei der Bildung und Aufrechterhaltung des Nervensystems spielen, sind von größter wissen- und wirtschaftlicher Bedeutung, da Erkrankungen am Nervensystem, insbesondere ZNS, sehr häufig vorkommen, oft durch einen schweren, zum Teil tödlichen Krankheitsverlauf gekennzeichnet sind und bisher nur sehr begrenzt therapierbar sind. Mit dem Anstieg der Lebenserwartung ist eine drastische Zunahme von neurologischen und psychischen Erkrankungen verbunden. Diese verursachen eine starke Einschränkung der Lebensqualität der betroffenen Personen sowie erhebliche Kosten sowohl für den Betroffenen als auch für die Gesellschaft.

Die Isolierung und Analyse für das Nervensystem spezifischer Gene bietet eine gute Möglichkeit, Erkrankungen, wie z.B. Schizophrenie, Alzheimer, Autismus, manische Depression und mentale Retardierungen untersuchen und schließlich auch behandeln zu können.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, Mittel bereitzustellen, mit denen Störungen bei der Entwicklung und Funktion des Nervensystems diagnostiziert und gegebenenfalls therapiert werden können.

Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine DNA-Sequenz, die ein Protein codiert, das an der Entwicklung und Funktion des Nervensystems, insbesondere des ZNS, beteiligt ist und gewebe- und entwicklungsspezifisch exprimiert wird, wobei die DNA-Sequenz folgende DNA-Sequenzen umfaßt:

(a) die DNA-Sequenz von Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5, Fig. 6, Fig. 7 oder Fig. 8 ;

(b) die DNA-Sequenz von Fig. 9 oder Fig. 10;

(c) die DNA-Sequenz von Fig. 11;

(d) die DNA-Sequenz von Fig. 12 oder Fig. 13;

(e) die DNA-Sequenz von Fig. 14 oder Fig. 15,

(f) die DNA-Sequenz von Fig. 16,

(g) die DNA-Sequenz von Fig. 17 oder 18, (h) die DNA-Sequenz von Fig. 19,

(i) eine mit (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f ) , (g) oder (h) hybridisierende DNA-Sequenz;

(j) Varianten, Derivate, Vorläufer oder Fragmente der DNA-Sequenz von (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f), (g) , (h) oder (i) ; oder

(k) eine DNA-Sequenz, die sich von der DNA-Sequenz von (a), (b) , (c), (d) , (e), (f), (g) , (h) , (i) oder (j) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet .

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Isolierung einer humanen DNA-Sequenz (Gen "T" oder T-Gen genannt; siehe die Figuren 1-8, das das Protein TP codiert), wobei sich herausstellte, daß das von dieser DNA-Sequenz codierte Protein im Nervensystem benötigt wird. Dabei ist die Expression des dieses Protein codierenden Gens im Nervensystem erhöht. Die Sequenzanalyse ergab, daß es sich hierbei um ein neues Gen handelt. Darüber hinaus konnten weitere Gene isoliert werden, die Homologien zu diesem Gen aufweisen (murines Gen "T", Figuren 9 und 10; humanes Gen "T2", Figur 16; humanes Gen "T3", Figuren 17 und 18; murines Gen T2 , Figuren 12 und 13; murines Gen T3 , Fig. 19) . Das T-Gen, T2-Gen und T3-Gen stellen, wie nachfolgend bezeichnet, Mitglieder der T- (Gen) -Familie dar und stammen bevorzugt aus Vertebraten, wie Mensch, Maus oder Ratte. Defekte in diesen Genen führen zu Einschränkungen der Funktionen des Nervensystems, insbesondere des ZNS. Desweiteren üben diese Gene eine wichtige Funktion bei der Kontrolle des Zellwachstums aus und Veränderungen in diesen Genen bzw. deren Expression führen zu Fehlern in der Kontrolle des Zellwachs- tums, beispielsweise auch zur Tumorbildung, insbesondere des Neuroblastoms . Von dieser Krebserkrankungen sind fast ausschließlich kleinere Kinder bis ca. 8 Jahre betroffen. In 25 bis 30 Prozent der Fälle treten die ersten Anzeichen bereits innerhalb der ersten 12 Lebensmonate auf. Beim Neuroblastom entarten sehr junge Zellen des autonomen Nervensystems. Da diese Nerven an der Rückseite des Bauchraums und des Brustkorbes entlanglaufen, treten die meisten Neuroblastome im Bauch-, Becken-, Brust- oder Halsbereich auf. Mehr als die Hälfte der Erkrankungen gehen vom Nebennierenmark aus, welches auch von Nervenzellen gebildet wird. Zeichen, die beim Kleinkind auf ein Neuroblastom hinweisen können, sind Knoten, Schwellungen, Knochenschmerzen, Hinken, Müdigkeit, Fieber, Blässe, Schwitzen, hartnäckiger Husten, Blutergüsse ums Auge. Vom Arzt diagnostiziert werden kann ein Neuroblastom durch Blut-, Urin- und Ultraschalluntersuchungen sowie durch Entnahme von Biop- sien aus dem Tumor und eine Knochenmarksuntersuchung. Ist der genaue Sitz der Geschwulst diagnostiziert, wird sie operativ entfernt. Problematisch ist die frühe Bildung von Metastasen. Durch die Isolation und Analyse des T-Gens ist es nun möglich, neuartige Diagnose- und Therapiemaßnahmen für das Neuroblastom zu entwickeln. Hierdurch wird es dann möglich, eine frühzeitige Diagnose der Krebserkrankung durchzuführen und Therapieformen zu etablieren, die verbesserte Heilungschancen verheißen.

Desweiteren führen Mutationen in Genen der T-Gen-Familie zu Entwicklungs- und Differenzierungsstörungen des Nervensystems, insbesondere des Gehirns. Dies führt in vielen Fällen zu geistigen Erkrankungen, z.B. mentalen Retardierungen oder Alzheimer. Das T-Gen übt auch eine wichtige Rolle bei der Verschaltung einzelner Gehirnareale, z.B. Vorder- und Mittelhirn, aus. Mutationen in diesem Gen führen in einigen Fällen zu schizophrenen Erkrankungen oder Autismussyndromen. Mit Hilfe der humanen und murinen Gene können wichtige, prinzipielle Rückschlüsse auf die Entstehung des Nervensystems und insbesondere des Gehirns gezogen werden. Hierbei bieten sich gute Ansatzpunkte für die Erforschung krankhafter Veränderungen des Nervensystems und insbesondere des Gehirns .

Mit Hilfe der genomischen Sequenzen können Patienten auf mögliche Mutationen hin einfacher untersucht werden. Die genomischen Sequenzen des T-Gens sind besonders dann von Vorteil, wenn wenig (Tumor) material für die Analyse zur Verfügung steht. Hierdurch ist es beispielsweise möglich, schon kleinste Tumoren auf Mutationen in diesem Gen zu untersuchen. Weiterhin eröffnet es die Möglichkeit, eine Therapie (insbesondere Be- strahlungs- und/oder Chemotherapie) auf ihren Erfolg hin zu überprüfen, da im Blut zirkulierende Tumorzellen mit genomischen Primern, die spezifisch für die genomische DNA sind, durch eine PCR-Reaktion detektiert werden können.

Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "hybridisieren" bezieht sich auf konventionelle Hybridisierungsbedin- gungen, vorzugsweise auf Hybridisierungsbedingungen, bei denen als Lösung 5xSSPE, 1% SDS, lxDenhardts-Lösung verwendet wird und die Hybridisierungstemperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C liegen. Nach der Hybridisierung wird vorzugsweise zuerst mit 2xSSC, 1% SDS und danach mit 0 , 2xSSC bei Temperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C gewaschen (zur Definition von SSPE,SSC und Denhardts-Lösung siehe Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)). Besonders bevorzugt sind stringente Hybridisierungsbedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al . , supra, beschrieben sind. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Begriffe "Varianten" oder "Fragment" umfassen DNA-Sequenzen, die sich gegenüber den in den Figuren angegebenen Sequenzen durch Dele- tion(en), Insertion(en) , Austausch(e) und/oder andere im Stand der Technik bekannte Modifikationen unterscheiden bzw. ein Fragment des ursprünglichen Nucleinsäuremoleküls umfassen, wobei das durch diese DNA-Sequenzen codierte Protein bzw. Peptid noch die vorstehend erwähnten Eigenschaften aufweist. Es zählen deshalb funktioneile Äquivalente, Derivate, Vorläufer (bioprecursors) dazu. Unter Derivaten sind beispielsweise Mutationsderivate (erzeugt durch z.B. Deletionen oder Inser- tionen) , Fusionen, Allelvarianten, Muteine und Spleißvarianten zu verstehen. Zwei ausgesuchte Beispiele von solchen Spleißvarianten sind in den Fig. 14 und 15 gezeigt. Verfahren zur Erzeugung der vorstehenden Änderungen in der Nucleinsäurese- quenz sind dem Fachmann bekannt und in Standardwerken der Molekularbiologie beschrieben, beispielsweise in Sambrook et al . , supra. Der Fachmann ist auch in der Lage, zu bestimmen, ob ein von einer so veränderten Nucleinsäuresequenz codiertes Protein noch über die vorstehend erwähnten Eigenschaften verfügt .

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine DNA-Sequenz, die ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz von Fig. 1, Fig. 9, Fig. 11, Fig. 12, Fig. 13, Fig. 14, Fig. 15, Fig. 16, Fig. 17, Fig. 18 oder Fig. 19 umfaßt, wobei das Protein die vorstehend definierte biologische Aktivität hat.

Durch die Erniedrigung oder Hemmung der Expression der vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen, kann die Synthese der von diesen codierten Proteine, beispielsweise des T-Proteins, verringert oder eliminiert werden, was beispielsweise bei bestimmten Krankheitszuständen wünschenswert ist. Daher betrifft eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Antisense-RNA, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie zu den vorstehenden DΝA-Sequenzen komplementär ist und die Synthese des von diesen DΝA-Sequenzen codierten Proteins verringern oder hemmen kann und ein Ribozym, das dadurch gekennzeichnet, daß es zu einem Teil der vorstehenden DNA-Sequenzen und an die von diesen DNA-Sequenzen transkribierte RNA spezifisch binden und diese spalten kann, wodurch die Synthese des von diesen DΝA-Sequenzen codierten Proteins verringert oder gehemmt wird. Vorzugsweise sind diese Antisense-RNAs und Ribozyme zu einer codierenden Region der mRNA komplementär. Der Fachmann ist in der Lage, ausgehend von den offenbarten DΝA-Sequenzen, geeignete Antisense-RNAs herzustellen und anzuwenden. Geeignete Vorgehensweisen sind beispielsweise in EB- Bl 0 223 399 oder EP-AI 0 458 beschrieben. Ribozyme sind RNA- Enzyme und bestehen aus einem einzelnen RNA-Strang . Diese können andere RNAs intermolekular spalten, beispielsweise die von den erfindungsgemäßen DΝA-Sequenzen transkribierten mRNAs . Diese Ribozyme müssen prinzipiell über zwei Domänen verfügen, (1) eine katalytische Domäne und, (2) eine Domäne, die zu der Ziel-RNA komplementär ist und an diese binden kann, was die Voraussetzung für eine Spaltung der Ziel-RNA ist. Ausgehend von in der Literatur beschriebenen Vorgehensweisen ist es inzwischen möglich, spezifische Ribozyme zu konstruieren, die eine gewünschte RNA an einer bestimmten, vorgewählten Stelle schneiden (siehe beispielsweise Tanner et al . , in: Antisense Research and Applications, CRC Press, Inc. (1993), 415-426).

Die erfindungsgemäßen DΝA-Sequenzen bzw. die die vorstehend beschriebenen Antisense-RNAs oder Ribozyme codierenden DΝAs können auch in einen Vektor bzw. Expressionsvektor inseriert werden. Somit umfaßt die vorliegende Erfindung auch diese DΝA- Sequenzen enthaltende Vektoren bzw. Expressionsvektoren. Die Bezeichnung "Vektor" bezieht sich auf ein Plasmid (z.B. pUC18, pBR322, pBlueScript) , auf ein Virus oder ein anderes geeignetes Vehikel. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße DΝA-Molekül im Vektor mit regulatorischen Elementen funktionell verknüpft, die dessen Expression in prokaryontischen oder eukaryontisehen Wirtszellen erlauben. Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen Replika- tionsursprung und spezifische Gene, die die phänotypische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den regulatorischen Elementen für die Expression in Prokaryonten, beispielsweise E.coli, zählen der lac-, trp-Promotor oder T7- Promotor, und für die Expression in Eukaryonten der AOXl- oder GALl-Promotor in Hefe, und der CMV- , SV40-, RVS-40-Promotor, CMV- oder SV40-Enhancer für die Expression in tierischen Zellen. Weitere Beispiele für geeignete Promotoren sind der Me- tallothionein I- und der Polyhedrin-Promotor . In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Vektor den Promotor des humanen T-Gens oder eines Orthologen des T-Gens . Zu geeigneten Expressionsvektoren für E.coli zählen beispielsweise pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8, wobei letzterer bevorzugt ist. Zu den für die Expression in Hefe geeigneten Vektoren zählen pYlOO und Ycpadl , für die Expression in Säugerzellen pMSXND, pKCR, pEFBOS , cDM8 und pCEV4. Zu den erfindungsgemäßen Expressionsvektoren zählen auch von Baculovirus abgeleitete Vektoren für die Expression in Insektenzellen, beispielsweise pAcSGHisNT-A.

Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und geeignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al . , supra, beschrieben sind. Die erfindungs- gemäßen DNA-Sequenzen können auch in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid codierenden DNA inseriert werden, sodaß die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen beispielsweise in Form eines Fusionsproteins exprimiert werden können. Bevorzugt sind diese anderen DNAs Reportersequenzen, die ein Reportermolekül codieren, das ein detektierbares Protein umfaßt, z.B. einen Farbstoff, eine Antibiotikaresistenz , ß-Ga- lactosidase oder eine durch spektropshotometrische, spektro- fluorometrische, luminescente oder radioaktive Assays nachweisbare Substanz.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend be- schriebenen Vektoren enthaltende Wirtszellen. Zu diesen Wirtszellen zählen Bakterien (beispielsweise die E. coli-Stämme HB101, DH1, xl776, JM101, JM109, BL21 und SG13009), Pilze, z.B. Hefen, vorzugsweise S. cerevisiae, Pflanzenzellen, Insektenzellen, vorzugsweise sf9-Zellen, und Tierzellen, vorzugsweise Vertebraten- oder Säugerzellen. Bevorzugte Säugerzellen sind CHO-, VERO-, BHK- , HeLa- , COS-, MDCK, 293- und WI38-Zel- len. Verfahren zur Transformation dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt .

Anhand von geeigneten Primersequenzen können die zu den erfindungsgemäßen Sequenzen gehörigen Gene amplifiziert werden. Zur Amplifikation der Gene T2 und T3 eignen sich insbesondere die in Fig. 20 angegebenen Primersequenzen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner von den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen codierte Proteine sowie Verfahren zur Herstellung der von den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen codierten Proteine. Dem Fachmann sind Bedingungen bekannt, transformierte bzw. transfizierte Wirtszellen zu kultivieren. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt die Kultivierung der vorstehend beschriebenen Wirtszellen unter Bedingungen, die die Expression des Proteins (bzw. Fusionsproteins) erlauben (vorzugsweise stabile Expression) , und die Gewinnung des Proteins aus der Kultur oder aus den Wirtszellen. Geeignete Reinigungsverfahren (beispielsweise präparative Chromatographie, Affinitätschromatographie, beispielsweise Immunoaffinität- schromatographie, HPLC etc.) sind allgemein bekannt.

Die erfindungsgemäßen Proteine weisen bevorzugt die in den Fig. 1, Fig. 9, Fig. 11, Fig. 12, Fig. 13, Fig. 14, Fig. 15, Fig. 16, Fig. 17, Fig. 18 oder Fig. 19 gezeigten Aminosäuresequenzen auf bzw. stellen Fusionen, Fragmente, Derivate oder Vorläufer (bioprecursors) davon dar, wobei die vorstehend erwähnten Eigenschaften im Sinne funktioneller Äquivalente erhalten bleiben. Hinsichtlich der Definitionen dieser Begriffe wird auf die jeweiligen vorstehenden Ausführungen verwiesen. Unter Derivaten sind insbesondere solche veränderten Proteine bzw. Peptide zu verstehen, die sich von den in den Figuren gezeigten Sequenzen durch konservative Aminosäuren- austauche unterscheiden oder solche nichtkonservativen Aminosäureaustausche enthalten, die die Funktion der T-Proteine nicht wesentlich verändern.

Von den Erfindern wurden folgende Aminosäurenmotive identifiziert, die sich dazu eignen bisher unbekannte Proteine, die zu der Familie der erfindungsgemäßen T-/T2-/T3-Familie und einer Protein-Superfamilie aus Porenmembranproteinen und Filament- bindenden Proteinen gehören, zu identifizieren. Motiv 1:

(A,T) (I,P,V) (L,T) (G,A,Q) (L, V) XXX (L, V) Motiv 2 : IYTDWAN Motiv 3 :

AXXXXXXXXXGXXXXXXAXXXXXXXXXXXXXXXXXXQ Motiv 4 :

SXXXXDX ( 12 , 20 ) KX ( 17 , 22 ) AXXXXXXXXL Motiv 5 :

IYTDWANXXLX (K, R) Motiv 6 :

KX ( 18 , 21 ) AXXXXXXXXLX ( 15 , 24 ) S Motiv 7 : NX ( 3 , 11 ) SXXXAXXXXXXXL

Erläuterung: X bedeutet jede Aminosäure

(A,T) bedeutet Aminosäure A oder T an dieser

Stelle

X(2,4) bedeutet zwei bis vier X's an dieser

Stelle

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft Antikörper gegen die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Proteine oder ein Fragment davon. Diese Antikörper können monoclonale, polyclonale oder synthetische Antikörper sein oder Fragmente davon. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "Fragment" alle Teile des monoclonalen Antikörpers (z.B. Fab- , Fv- oder "single chain Fv" -Fragmente) , welche die gleiche Epitopspezifität wie der vollständige Antikörper aufweisen. Die Herstellung solcher Fragmente ist dem Fachmann bekannt .

Vorzugsweise handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Antikörpern um monoclonale Antikörper. Die erfindungsgemäßen Antikörper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei das von den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen codierte Protein oder ein synthetisches Fragment davon als Immunogen dienen. Verfahren zur Gewinnung monoclonaler Antikörper sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise als ersten Schritt die Herstellung von polyclonalen Antikörpern unter Verwendung der erfindungsgemäßen Proteine oder Fragmente davon (beispielsweise synthetische Peptide) als Immunogen zur Immunisierung geeigneter Tiere, beispielsweise Kaninchen oder Hühner, und die Gewinnung der polyclonalen Antikörper aus dem Serum bzw. Eigelb.

Dann werden beispielsweise Zeil-Hybride aus Antikörper produzierenden Zellen und Knochenmark-Tumorzeilen hergestellt und cloniert. Anschließend wird ein Clon selektioniert , der einen Antikörper produziert, der für das verwendete Antigen spezifisch ist. Dieser Antikörper wird dann hergestellt. Beispiele von Zellen, die Antikörper produzieren, sind Milzzellen, Lymphknotenzellen, B-Lymphozyten etc.. Beispiele von Tieren, die zu diesem Zweck immunisiert werden können, sind Mäuse, Ratten, Pferde, Ziegen und Kaninchen. Die Myelomzellen lassen sich aus Mäusen, Ratten, Menschen oder anderen Quellen erhalten. Die Zellfusion kann man beispielsweise durch das allgemein bekannte Verfahren von Köhler und Milstein durchführen. Die durch Zellfusion erhaltenen Hybridome werden mittels dem Antigen nach dem Enzym-Antikörper-Verfahren oder nach einem ähnlichen Verfahren abgesucht. Clone werden beispielsweise mit dem Grenz-Verdünnungsverfahren erhalten. Die erhaltenen Clone werden beispielsweise BALB/c-Mäusen intraperitoneal implantiert, nach 10 bis 14 Tagen wird der Ascites der Maus entnommen, und der monoclonale Antikörper durch bekannte Verfahren (beispielsweise Ammoniumsulfatfraktionierung, PEG-Fraktionie- rung, Ionenaustauschchromatographie, Gelchromatographie oder Affinitätschromatographie) gereinigt .

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der genannte monoclonale Antikörper ein aus einem Tier (z.B. Maus) stammender Antikörper, ein humanisierter Antikörper oder ein chimärer Antikörper oder ein Fragment davon. Chimäre, menschlichen Antikörper ähnelnde oder humanisierte Antikörper besitzen eine herabgesetzte potentielle Antigenität, jedoch ist ihre Affinität gegenüber dem Ziel nicht herabgesetzt. Die Herstellung von Chimären und humanisierten Antikörpern bzw. von den menschlichen Antikörpern ähnelnden Antikörpern wurde ausführlich beschrieben (siehe beispielsweise Queen et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989), 10029, und Verhoeyan et al . , Science 239 (1988), 1534). Humanisierte Immunglobuline weisen variable Grundgerüstbereiche auf, die im wesentlichen von einem humanen Immunglobulin stammen (mit der Bezeichnung Akzeptor-Immunglobulin) und die Komplementär!tat der determinierenden Bereiche, die im wesentlichen von einem nicht-menschlichen Immunglobulin (z.B. von der Maus) stammen (mit der Bezeichnung Donor-Immunglobulin) . Die (der) konstante (n) Be- reich(e) stammt/stammen, falls vorhanden, auch im wesentlichen von einem menschlichen Immunglobulin. Bei der Verabreichung an menschliche Patienten bieten humanisierte (sowie die menschlichen) Antikörper eine Reihe von Vorteilen gegenüber Antikörpern von Mäusen oder anderen Spezies: (a) das menschliche Immunsystem sollte das Grundgerüst oder den konstanten Bereich des humanisierten Antikörpers nicht als fremd erkennen und daher sollte die Antikörper-Antwort gegen einen solchen injizierten Antikörper geringer ausfallen als gegen einen vollständig fremden Maus-Antikörper oder einen partiell fremden Chimären Antikörper; (b) da der Effektorbereich des humanisierten Antikörpers menschlich ist, dürfte er mit anderen Teilen des menschlichen Immunsystems besser interagieren, und (c) injizierte humanisierte Antikörper weisen eine Halbwertszeit auf, die im wesentlichen zu der von natürlich vorkommenden menschlichen Antikörpern äquivalent ist, was es erlaubt, kleinere und weniger häufige Dosen im Vergleich zu Antikörpern anderer Spezies zu verabreichen.

Die erfindungsgemäßen Antikörper können beispielsweise zur Immunpräzipitation der vorstehend diskutierten Proteine, zur Isolierung verwandter Proteine aus cDNA-Expressionsbanken oder zu den nachstehend offenbarten Zwecken (Diagnose/Therapie) verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Hybridom, das den vorstehend beschriebenen monoclonalen Antikörper erzeugt.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Antikörper gegen die einzeln aufgeführten Peptide der Gene T2 und T3 (vgl. Fig. 20).

Es wurde herausgefunden, daß das nachstehende Peptid speziell für die Generierung von Antikörpern gegen das Protein T verwendet werden kann. Die Aminosäuresequenz des geeigneten Pep- tids lautet:

EKGEDPETRRMRTVKNIAD

Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, Störungen der Entwicklung und Funktion des Nervensystems auf genetischer Ebene zu untersuchen. Hierzu zählen unter anderem neurologische und psychiatrische Erkrankungen (u.a. Alzheimer, Morbus Parkinson, Schizophrenie, Manisch-depressive Erkrankungen, Autismus, mentale Retardierung), Verletzungen des Nervensystems, bei angeborenen Schädigungen des Nervensystems oder bei degenerativen Erkrankungen des Nervensystems. Desweiteren ermöglicht die Erfindung die Behandlung von Krebs, u.a von Tumoren des Nervensystems, wie Neuroblastom, Astrozytom, Glioblastom, Medulloblastom. Diese Diagnose kann nicht nur postnatal, son- dern bereits pränatal erfolgen. Mit einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz bzw. davon abgeleiteten Sonden oder Primern kann in Säugern, insbesondere dem Menschen, festgestellt werden, ob sie ein Gen enthalten, das das erfindungsgemäße Protein codiert und/oder exprimiert bzw. ob dieses Gen zu einer mutierten Form des Proteins führt, die nicht länger biologisch aktiv ist. Dazu kann der Fachmann übliche Verfahren, wie Reverse Transkription, PCR, LCR, Hybridisierung und Sequenzierung durchführen. Auch die erfindungsgemäßen Antikörper eignen sich für die Diagnostik, d.h. beispielsweise zum Nachweis des Vorhandensein und/oder der Konzentration des erfindungsgemäßen Proteins, einer verkürzten oder verlängerten Form des Proteins etc., in einer Probe. Die Antikörper können beispielsweise in Immunoassays in Flüssigphase oder an einen festen Träger gebunden werden. Dabei können die Antikörper auf verschiedene Art und Weise markiert sein. Geeignete Marker und Markierungsverfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Beispiele für Immu- nassays sind ELISA und RIA.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Diagnoseverfahren zum Nachweis einer gestörten Expression des erfindungsgemäßen Proteins oder zum Nachweis einer veränderten Form dieses Proteins, bei dem man eine Probe mit den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder dem erfindungsgemäßen Antikörper oder Fragment davon in Berührung bringt und sodann besipiels- weise direkt oder indirekt bestimmt, ob sich die Konzentration des Proteins und/oder seine Aminosäuresequenz im Vergleich zu einer aus einem gesunden Patienten gewonnenen Protein unterscheiden.

Die vorliegende Erfindung erlaubt auch die Durchführung therapeutischer Maßnahmen bei den vorstehend diskutierten Störungen, d.h. die vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen, Antisense-RNAs , Ribozyme und Antikörper können auch zur Herstellung eines Arzneimittels, beispielsweise zur Kontrolle der Expression des erfindungsgemäßen Proteins oder zum Austausch einer mutierten Form des Gens gegen eine funktionel- le Form verwendet werden und somit auch zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prävention oder der Behandlung von Erkrankungen des Nervensystems, insbesondere Tumorerkrankungen des ZNS. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Protein in Säugern, insbesondere den Menschen, durch übliche Maßnahmen eingebracht werden. Hierzu kann es günstig sein, das Protein an ein vom jeweiligen Körper nicht als fremd angesehenes Protein, z.B. Transferrin oder Rinderserumalbumin (BSA) zu koppeln. Auch kann eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz, Antisense-RNA oder Ribozym in Säuger, insbesondere den Menschen, eingebracht und exprimiert werden. Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper kann die Expression des erfindungsgemäßen Proteins (TP) bzw. der verwandten Proteine kontrolliert und reguliert werden.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Arzneimittel, das die vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen, Antisense-RNA, das Ribozym, den Expressionsvektor, das erfindungsgemäße Protein oder den Antikörper bzw. das Fragment davon enthält. Dieses Arzneimittel enthält gegebenenfalls zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Νetzmittel, sterile Lösungen etc. Die Verabreichung der Arzneimittel kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle, intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, intraven- trikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem Stadium der Erkrankung, der Art der Verabreichung etc .. Vorzugsweise werden die vorstehend beschriebenen Nucleinsäuren in einen für die Gentherapie geeigneten Vektor inseriert und, beispielsweise unter Kontrolle eines gewebespezifischen Vektors in die Zellen eingeschleust. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der die vorstehend beschriebenen Nucleinsäuren enthaltende Vektor ein Virus, beispielsweise ein Adenovirus, Vaccinia-Virus oder Adenovirus. Besonders bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Für Zwecke der Gentherapie können die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Liposomen oder Lipoplexe (Mannino et al . , Biotechniques 6 (1988), 682).

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung einen diagnostischen Kit zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Diagnoseverfahrens, der eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz oder den vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Antikörper oder ein Fragment davon enthält. Je nach Ausgestaltung des diagnostischen Kits können die DNA-Sequenz bzw. der Antikörper oder das Fragment davon immobilisiert sein.

Sequenzen der T-Gene können auf Nylonmembranen oder Glasträger aufgebracht werden und mit komplexen cDNA-Proben aus Tumoren und zugehörigen Normalgeweben, oder krankem und zugehörigen gesundem Gewebe hybridisiert werden. Hierdurch ist die (vollautomatisierte) Erfassung der Expresssion dieser Gene möglich. Die hierzu verwendeten Sequenzen können z.B. die gesamte cDNA- Sequenz oder kurze Sequenzabschnitte z.B. 10-15 bp-Oligomere (siehe u.a. Fig. 20) sein. Nach Determination der Expression der T-Gene kann dann die Therapie, unter anderem die Krebstherapie gezielt der nach der jeweiligen individuellen Situation des Patienten ausgewählt oder angepasst werden. Gene, deren veränderte Expression bereits jetzt Einfluß nehmen auf die Behandlung des Patienten ist z.B. das N-Myc Gen beim Neuroblastom. Durch die Erfassung der Expression der T-Gene kann somit die Bandlung sehr schnell und effizient den jeweiligen Erfordernisssen angepaßt werden und trägt somit wesentlich zur verbesserten Therapie bei .

Die Isolierung und Charakterisierung des menschlichen erfindungsgemäßen Gens und insbesondere der Maushomologe davon erlauben darüberhinaus die Etablierung eines Tiermodells, was für das weitere Studium von Erkrankungen des Nervensytems und von Krebserkrankungen auf molekularer Ebene sehr wertvoll ist. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ferner ein nicht-menschliches Säugetier, dessen T-Gen bzw. T2- oder T3- Gen verändert ist, z.B. durch Insertion einer heterologen Sequenz, insbesondere einer Selektionsmarkersequenz .

Der Ausdruck "nicht-menschliches Säugetier" umfaßt jegliches Säugetier, dessen T-Gen bzw. T2- oder T3-Gen verändert sein kann. Beispiele solcher Säugetiere sind Maus, Ratte, Kaninchen, Pferd, Rind, Schaf, Ziege, Affe, Schwein, Hund und Katze, wobei Maus bevorzugt ist.

Der Ausdruck "T-Gen bzw. T2- oder T3-Gen, das verändert ist" bedeutet, daß in dem im nicht-menschlichen Säugetier natürlich vorkommenden entsprechenden Gen durch Standardmethoden eine Veränderung der Genstruktur oder der Gensequenz durchgeführt wird. Dies kann unter anderem durch die Einführung einer Dele- tion von ca. 1-2 kb, an dessen Stelle eine heterologe Sequenz, z.B. ein Konstrukt zur Vermittlung von Antibiotika-Resistenz (z.B. eine "neo-Kassette"), eingeführt wird, erreicht werden. Desweiteren können heterologe Sequenzen in das T-Gen eingeführt werden, die es erlauben, in vivo zeit- und gewebespezifische Deletionen durchzuführen. Weiterhin können heterologe Sequenzen in das T-Gen eingeführt werden, die es erlauben, die Expression des T-Gens in vivo zu verfolgen. Dies kann unter anderem durch die Insertion einer für das GFP (green fluo- rescent protein) -Protein codierenden Sequenz innrerhalb eines Exons oder als eigenständiges Exon durchgeführt werden. Diese Methoden sind allgemein in Schwartzberg et al . , Proc. Natl . Acad. Sei. USA, Vol. 87, S. 3210-3214, 1990 beschrieben, worauf hier Bezug genommen wird.

Insbesondere kann die Veränderung wie nachfolgend beschrieben durch geführt werden. Figur 9 repäsentiert einen Teil der cDNA-Sequenz des T-Gens der Maus. Die Abbildung 10 zeigt eine Intronsequenz des T-Gens der Maus, die von zwei Exons flankiert wird. Diese murinen Sequenzen können nun zur gezielten Veränderung des Maus T-Gens verwendet werden. So kann man z.B. die Spleiß-Sequenzen des Introns deletieren oder so verändern, dass das T-Gen nicht mehr korrekt gespleißt wird. Desweitern kann durch Einbau einer Spleißakzeptorsequenz eines anderen Exons des Maus T-Gens in die Intronsequenz eine Sequenz in dieses Intron inseriert werden, die als Exon erkannt wird und an die davor liegenden Exons des T-Gens herangespleißt wird. Diese inserierte Sequenz kann z.B. ein Exon sein, das das EGFP-Protein (EnhancedGreenFluorescentProtein) kodiert. Hierdurch wird aus dem ursprünglichen Maus T-Gen ein Fusionsprotein, das das EGFP-Protein beinhaltet. Hierdurch kann bevorzugt eine Maus generiert werden, die es erlaubt, die Expression des T-Gens in vivo zu verfolgen. Die inserierte Sequenz kann am Ende so gestaltet sein (z.B PolyA-Signal , Spleißsignale usw. ) , daß keine weiteren Exons des T-Gens an das inserierte Exon herangespleißt werden oder das heranspleißte Exons nicht mehr translatiert werden. Hierdurch entsteht eine Dele- tion des Maus T-Proteins am C-terminalen Ende oder ein vorzeitiger Abbruch des Leserahmens und eine (zumindest teilweise) Inaktitivierung der Proteinfunktion des Maus T-Gens kann erreicht werden. Desweiteren können auch solche Sequenzen als neue Exonsequenzen inseriert werden, die eine mRNA-Sequenz ergeben, bei der am 3 ' -Ende diese neue mRNA-Sequenz lokalisiert ist. Durch geeignete Sequenzen ist dann eine Veränderung der Stabilität der mRNA oder eine veränderte Lokalisation in der Zelle zu erreichen. Die damit einhergenden Phänotype der so veränderten Mäuse können dann wichtige Rückschlüsse auf die Funktion des T-Gens ergeben. Diese Mäuse können dann auch zum Auffinden neuer Wirkstoffe verwendet werden, die den Funktionsverlust des T-Gens kompensieren.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Sequenz von Fig. 13 zur Herstellung einer Knock-out-Maus eingesetzt. Figur 13 beschreibt eine Maussequenz des Gens T2. Das Ausschalten des Maus T2-Gens kann hierbei auf unterschiedliche Wege erreicht werden. So kann man z.B. die Spleiß-Sequenz (GT) unterstrichen in Figur 13) deletieren oder so verändern, dass das T2-Gen nicht merh korrekt gespleißt wird. Desweiteren kann durch Einbau einer Spleißakzeptorsequenz eines anderen Exons des Maus T2-Gens in die anschließende Intronsequenz eine Sequenz in dieses Intron inseriert werden, die als Exon erkannt wird und an die davor liegenden Exons des T2-Gens herangespleißt werden. Dieses inserierte Exon kann z.B. ein Exon sein, das das EGFP-Protein kodiert. Hierdurch wird aus dem ursprünglichen Maus T2-Gen ein Fusionsprotein, das am C-Termi- nus das EGFP-Protein trägt. Hierdurch kann eine Maus generiert werden, die es erlaubt, die Expression des T2-Gens in vivo zu verfolgen. Die inserierte Sequenz kann am Ende so gestaltet sein (z.B PolyA-Signal usw.), dass keine weiteren Exons von dem T2-Gen an das inserierte Exon herangespleißt werden. Hierdurch entsteht eine Deletion des Maus T2-Proteins am C-termi- nalen Ende und eine (zumindest teilweise) Inaktitivierung der Proteinfunktion des Maus T2-Gens kann erreicht werden. Des- weiteren können auch solche Sequenzen als neue Exonsequenzen inseriert werden, die eine mRNA-Sequenz ergeben, bei der am 3 ' -Ende diese neue mRNA-Sequenz lokalisiert ist. Durch geeignete Sequenzen ist dann eine Veränderung der Stabilität der mRNA oder eine veränderte Lokalisation in der Zelle zu erreichen. Die damit einhergenden Phänotypen der so veränderten Mäuse können dann wichtige Rückschlüsse auf die Funktion des T2-Gens ergeben. Diese Mäuse können dann auch zum Auffinden neuer Wirkstoffe verwendet werden, die den Funktionsverlust des T-Gens kompensieren. Desweiteren kann ein Säugetier generiert werden, das eine Veränderung des T3-Gens aufweist. Die Sequenz in Fig. 19 repä- sentiert einen Teil des murinen cDNA-Sequenz des T3 Gens. Durch Deletionen oder Insertionen können gezielte Veränderungen am T3-Gen der Maus erreicht werden. Die inserierte Sequenz kann z.B. ein Exon sein, das das EGFP-Protein kodiert. Hierdurch wird aus dem ursprünglichen Maus T3-Gen ein Fusionsprotein, das am C-Terminus das EGFP-Protein trägt. Hierdurch kann eine Maus generiert werden, die es erlaubt, die Expression des T3-Gens in vivo zu verfolgen. Die inserierte Sequenz kann am Ende so gestaltet sein (z.B PolyA-Signal usw.), dass keine weiteren Exons von dem T3-Gen an das inserierte Exon herangespleißt werden. Hierdurch entsteht eine Deletion des Maus T3-Proteins am C-terminalen Ende und eine (zumindest teilweise) Inaktitivierung der Proteinfunktion des Maus T3- Gens kann erreicht werden. Desweiteren können auch solche Sequenzen als neue Exonsequenzen inseriert werden, die eine mRNA-Sequenz ergeben, bei der am 3 ' -Ende diese neue mRNA-Sequenz lokalisiert ist. Durch geeignete Sequenzen ist dann eine Veränderung der Stabilität der mRNA oder eine veränderte Lokalisation in der Zelle zu erreichen. Die damit einhergenden Phänotype der so veränderten Mäuse können dann wichtige Rückschlüsse auf die Funktion des T3-Gens ergeben. Diese Mäuse können dann auch zum Auffinden neuer Wirkstoffe verwendet werden, die den Funktionsverlust des T3-Gens kompensieren.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Zellen, die aus dem vorstehenden nicht-menschlichen Säugetier erhalten werden. Diese Zellen können in jeglicher Form vorliegen, z.B. in einer Primär- oder Langzeit-Kultur.

Ein erfindungsgemäßes nicht-menschliches Säugetier kann durch übliche Verfahren bereitgestellt werden. Günstig ist ein Verfahren, das folgende Schritte umfaßt: (a) Herstellung eines DNA-Fragments, insbesondere eines Vektors, enthaltend ein verändertes T-, T2- oder T3-Gen, wobei das Gen durch Insertion einer heterologen Sequenz, insbesondere eines selektierbaren Markers, verändert worden ist;

(b) Präparation embryonaler Stammzellen aus einem nicht-menschlichen Säuger (bevorzugt Maus) ;

(c) Transformation der embryonalen Stammzellen von Schritt (b) mit dem DNA-Fragment von Schritt (a) , wobei das T-Gen in den embryonalen Stammzellen durch homologe Rekombination mit dem DNA-Fragment von (a) verändert wird,

(d) Kultivieren der Zellen von Schritt (c;

(e) Selektion der kultivierten Zellen von Schritt (d) auf das Vorhandensein der heterologen Sequenz, insbesondere des selektierbaren Markers,

(f) Erzeugen chimerer nicht-menschlicher Säuger aus den Zellen von Schritt (e) durch Injektion dieser Zellen in Säuger-Blastozysten (bevorzugt Maus-Blastozysten) , Übertragen der Blastozysten in pseudo-schwangere weibliche Säuger (bevorzugt Maus) und Analyse der erhaltenen Nachkommen auf eine Veränderung des T-Gens .

In Schritt (c) wird der Mechanismus der homologen Rekombination (vgl. R.M. Torres, R. Kühn, Laboratory Protocols for Conditional Gene Targeting, Oxford University Press, 1997) ausgenutzt, um embryonale Stammzellen zu transfizieren. Die homologe Rekombination zwischen den in einem Chromosom vorhandenen DNA-Sequenzen und neuen, hinzugefügten clonierten DNA- Sequenzen ermöglicht das Einfügen eines klonierten Gens in das Genom einer lebenden Zelle anstelle des ursprünglichen Gens. Mit dieser Methode können bei Verwendung embryonaler Keimzellen via Chimären Tiere erhalten werden, die für das gewünschte Gen oder den gewünschten Genteil oder die gewünschte Mutation homozygot sind.

Der Ausdruck "embryonale Stammzellen" betrifft jegliche embryonalen Stammzellen eines nicht-menschlichen Säugetiers, die sich zur Mutierung des T-Gens eignen. Vorzugsweise sind die embryonalen Stammzellen von der Maus, insbesondere die Zellen E14/1 oder 129/SV.

Der Ausdruck "Vektor" umfaßt jeglichen Vektor, der durch Rekombination mit der DNA von embryonalen Stammzellen eine Veränderung des T-, T2- oder T3-Gens ermöglicht. Vorzugsweise weist der Vektor einen Marker auf, mit dem auf vorhandene Stammzellen selektioniert werden kann, in denen die gewünschte Rekombination erfolgt ist. Ein solcher Marker ist z.B. die loxP/tk neo-Cassette, die mit Hilfe des Cre/loxP-Systems wieder aus dem Genom entfernt werden kann.

Desweiteren kennt der Fachmann Bedingungen und Materialien, um die Schritte (a)-(f) durchzuführen.

Mit der vorliegenden Erfindung wird ein nicht-menschliches Säugetier bereitgestellt, dessen T-, T2- oder T3-Gen verändert ist. Diese Veränderung kann ein Ausschalten der Genexpression- regulierenden Funktion sein. Mit einem solchen Säugetier bzw. Zellen daraus kann selektiv die Genexpression-kontrollierende Funktion des TP-Proteins untersucht werden. Ferner ist es hiermit möglich, Substanzen, Arzneimittel und Therapieansätze zu finden, mit denen selektiv auf die kontrollierde Funktion eingewirkt werden kann. Daher liefert die vorliegende Erfindung eine Basis, um auf die verschiedensten Erkrankungen ein- zuwirken. Solche Erkrankungen sind z.B. Einschränkungen der ZNS-Funktionen, die bis zu mentalen Retardierungen reichen oder die Induktion von Krebs durch Fehler bei der Kontolle der Zeilproliferation.

Von den Erfindern wurde bei der Sequenzanalyse herausgefunden, daß das T2-Gen in der kodierenden Region der cDNA-Sequenz CGG- Trinukleotide enthält, die als methylierungssensitiv bekannt sind. Das T2-Gen besitzt also im kodierenden Bereich (N-termi- naler Bereich des Proteins, der keine Homologie zu Protein T oder Protein T3 aufweist) eine methylierungssensitive und instabile Sequenz, die zum Ausfall des Gens mit einhergender mentaler Retardierung und nicht kontrolliertem Zellwachstum, wie Krebs, führt.

Alle drei Gene der T-Familie spielen eine große Rolle bei Tumoren. Das T-Gen ist bei vielen Tumoren von genomischen Rearrangierungen betroffen. So sind z.B. beim Neuroblastom genomische Veränderungen in der DNA von Tumoren im Vergleich zur DNA des dazugehörigen gesunden Gewebes feststellbar. Desweiteren ist die Expression des T-Gens z.B. in Tumoren des Gehirns verändert. So läßt sich unter anderem bei Glioblasto- men in fortgeschrittenen Stadien eine stark veränderte Expression feststellen. In Meningiomen sind auch tumorspezische Veränderungen der Expression des T-Gens und des Auftretens des T-Proteins nachweisbar.

Das T2-Gen ist bei vielen Tumorerkrankungen auch von genomischen Rearrangierungen betroffen und eine veränderte Expression ist in Tumoren nachzuweisen. So lassen sich z.B. bei Melanomen und bei Lungentumoren genomische Rearrangierungen des T2-Gens feststellen. Expressionsunterschiede sind z.B. auch in Gliomen, Glioblastomen, Astrozytomen und PNETs (Primitive Neuro-Ektodermale Tumoren) nachweisbar. Das T3-Gen ist auch bei vielen Tumoren von genomischen Rearrangierungen und Expressionsveränderungen betroffen. So lassen sich z.B. bei Coloncarcinomen Rearrangierungen nachweisen. Expressionsunterschiede sind unter anderem in Gliomen, Glioblastomen, Astrozytomen und PNETs (Primitive Neuro-Ekto- dermale Tumoren) feststellbar.

Durch die Isolierung und genaue Analyse des T-Gens wurde von den Erfindern nun entdeckt, dass das T-Protein eine gewisse Verwandtschaft zu Proteinen aufweist, die ganz unterschiedliche Funktionen in der Zelle ausüben. Die Sequenzanalyse dieser Proteine ergab, dass die Gene, die diese Proteine kodieren, wohl auf ein gemeinsames oder ähnliche Vorläufergene zurückzuführen sind. In diese Proteinsuperfamile gehören Proteine wie das POM121-Protein (Hallberg et al . , J. Cell Biol . 122, S. 513-522, 1993) . Es ist eines von zwei bekannten Kernporenmem- branproteinen bei Vertebraten. Desweiteren gehört in diese Familie das CLIP-170-Protein, das Vesikel und andere Organellen innerhalb der Zelle an Microtubuli bindet (Pierre et al . , Cell 70, S. 887-900, 1992) Die unerwartete Entdeckung, dass Gene, die so unterschiedliche Aufgaben innerhalb der Zelle ausüben, zu einer gemeinsamen Protein-Superfamilie gehören, ist äußerst überraschend und bei erstem Anschein sogar widersprüchlich. Analysiert man aber die Funktionen der einzelen Gene, so lassen sich zwei Hauptfuntionen dieser Proteine ableiten. Das CLIP-170-Protein bindet an Microtubuli, die neu isolierten T-Proteine und das POM121-Protein sind im Kernporenkomplex lokalisiert. Aufgrund der Eigenschaften dieser Proteine wird von den Erfindern vorgeschlagen, diese Proteinsuperfamilie als POMIC-Proteinsuperfamilie zu bezeichnen. POMIC soll dabei für Poren- und/oder Microtubuli-bindendes Protein stehen. Im Rahmen der Isolierung und Analyse des T- Gens konnten zwei Paraloge des T-Gens isoliert werden, die oben näher beschriebenen T2- und T3-Gene. Die Familie der T- Proteine steht evolutionär und funktionell gesehen zwischen dem CLIP (cytoplasmic linker protein-170) und dem POM121- Protein. Diese Zwischenstellung wird auch durch die Sequenz- analyse und die putative Proteinstruktur untermauert. Das Kernporenmembranprotein POM121 besitzt keine ausgeprägte Coiled-Coil-Struktur, das CLIP-170-Protein dagegen zeigt zwischen dem N- und C-Terminus eine sehr ausgeprägte Coiled- Coil-Struktur (vgl. Fig. 29). Bei der Familie der T-Proteine sind Coiled-Coil-Strukuren vorhanden, die aber deutlich weniger ausgeprägt sind als bei CLIP-170. Eine ähnliche Zwischenstellung nimmt die Familie der T-Proteine in Hinsicht auf das Vorkommen von hydrophoben Domänen ein. Das Protein POM121 besitzt eine hydrophobe Domäne am N-Terminus, die in die Kernmembran eingelagert wird und das Protein in der Kernpore positioniert. Das CLIP-170-Protein besitzt keine ausgeprägte hydrophobe Domäne. Das T-Protein und das T3-Protein besitzen dagegen eine hydrophobe Domäne mit drei hydrophoben Teilbereichen (vgl. Fig. 30) . Der Austausch des N-Terminus im T2- Protein im Vergleich zu der evolutionären Grundform führte zum Verlust dieser ausgeprägten hydrophoben Domäne. Allen drei T- Proteinen dagegen gemeinsam ist der sehr ähnliche Aufbau des C-Terminus. Das T3-Protein ist dem T-Protein innerhalb der T- Proteinfamilie am ähnlichsten. Doch auch das T3-Protein hat im Laufe der Evolution eine Veränderung erfahren. Durch Insertion von ca. 400 Aminosäuren wurde der N-Terminus im Vergleich zum T-Protein verändert. Diese Insertion führte zu einer weiteren Coiled-Coil-Struktur im Vergleich zum ansonsten sehr ähnlichen T-Protein. Das T-Protein und das T3-Protein führen in der kernmembranlokalisierten Form Funktionen aus, die dem des POM121 ähneln. Interessanterweise kam es aber im Laufe der Evolution zu dem Verlust eines Teils des C-Terminus im POM121- Protein. Im Vergleich zum POM121-Protein haben die T-Proteine einen längeren C-Terminus . Durch diesen längeren C-Terminus sind vielerlei Wechselwirkungen mit anderen Proteinen möglich. Erwähnenswert ist hierbei auch, dass im T-Protein eine Leucin- Zipper-Struktur entdeckt wurde, die Wechselwirkungen mit anderen Protein erleichtert. Die Familie der T-Proteine spielt eine wichtige Rolle bei der Vermittlung von Interaktionen zwischen Zellorganellen und Filamenten, u.a. Mikrotubuli . Mikrotubuli spielen z.B. in Nervenzellen eine große Rolle; bei Axonen z.B. zeigen die Plus-Enden der Mikrotubuli vom Zeil- körper weg, während die Mikrotubuli bei Dendriten beide Orientierungen aufweisen. Diese Zellpolarität ist von großer Wichtigkeit für das Funktionieren einer Zelle oder Lebewesens. Desweiteren eröffnen Mikrotubuli einen effizienten Organellentransport und sie sind von essentieller Bedeutung für die generelle Organisation von Membranstrukturen in einer Zelle. Die T-Proteine üben eine wichtige Mittlerfunktion zwischen Membranstrukuren und Mikrotubuli aus. Das T-Gen und das T3-Gen üben insbesondere als Membranprotein in der Kernpore ihre Funktion aus, während das T2-Protein insbesondere als zytpo- plasmatisches Protein wirkt.

Anhand der Befunde der Erfinder sind das T-Gen und das T3-Gen Teil des Kernporenkomplexes. Kernporenkomplexe (Nuclear pore complexes - NPCs) sind extrem komplizierte Strukturen, die den bidirektionalen Transport von Makromolekülen zwischen dem Kern und dem Zytoplasma vermitteln. Der Kernporenkomplex ist in die Kernhülle (Nuclear envelope) eingebettet und umschließt einen zentralen Kanal mit bisher erst ungenügend definierter Struktur. An beiden Seiten des zentralen Kernporenkomplexes sind periphere Strukturen, kurze zytoplasmatische Filamente und ein korbähnliches Gebilde angeheftet. Diese korbähnliche Struktur interagiert mit Molekülen, die durch den Kernporenkomplex gelangen. Der Mechanismus des Auf aus des Kernporenkomplexes ist bisher erst kaum verstanden. Desweiteren wurden bisher bei Beobachtungen von Zellen, die eine Mitose durchlaufen, festgestellt, dass die Kernhülle gezielt aufgelöst wird und deren Komponenten, einschließlich der Kernporenproteine, innerhalb des mitotischen Zytoplasmas verteilt werden. Am Ende der Mitose werden alle diese Komponenten wiederverwendet, um die Kernhüllen der Tochterzellen zu bilden. Durch die detai- lierte Analyse des Gens T haben die Erfinder herausgefunden, dass die N-terminale Hälfte des Proteins T schwache Homologie zu dem Porenmembranprotein POM121 hat. Die Homologie erstreckt sich über den gesamten Bereich des POM121-Proteins und weist eine Identität von ca. 18% auf Proteinebene auf, so daß die diesen Proteine zugrundeliegenden DNAs selbst unter wenig stringenten Bedingungen nicht miteinander hybridisieren sollten. Dem erfindungsgemäßen Protein T kommt in Hinsicht auf das Entstehen und den Aufbau der Kernpore eine ganz fundamentale Rolle zu. Bei der detailierten Analyse des Proteins konnte eine lipophile Domäne am N-Terminus des T-Proteins festgestellt werden. Diese Sequenz hat aber keine Homologie zu der lipophilen Sequenz des POM121-Proteins . Vor der lipophilen Domäne im T-Protein befindet sich noch ein kurzer Abschnitt von Aminosäuren, die möglicherweise als Signalsequenz dienen. Um festzustellen, ob diese putative Signalsequenz und die lipophile Domäne in vivo an der Einlagerung in die Kernmembran beteiligt sind, wurden verschiedene Konstrukte des T-Gens hergestellt. Hierbei wurden verschiedene Teile des N-Terminus des T-Proteins mit dem EnhancedGreenFluorescentProtein (EGFP) fusioniert. Das EGFP wurde dabei an den C-Terminus des T- Proteins fusioniert. Das Fusionsprotein, das den unveränderten N-Terminus des T-Proteins (putative Signalsequenz mit lipophi- ler Membrandomäne) beinhaltete, wurde tatsächlich in die Kernmembran eingelagert. Das Fusionskonstrukt, bei dem die putative Signalsequenz und die lipophile Domäne fehlt, wurde dagegen nicht in die Kernmembran eingelagert und reicherte sich im Zytoplasma an. Dies zeigte, dass der N-Terminus des T- Proteins notwendig ist und ausreicht, um zu einer Lokalisation innerhalb der Kernmembran zu führen. Um zu zeigen, dass das T- Protein tatsächlich in der Kernmembran lokalisiert ist, wurden Antikörper gegen eine Peptidsequenz des T-Proteins generiert. Mit diesen Antikörpern wurden immunhisotchemische Untersuchungen an Geweben von Mensch, Maus und Ratte durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass der Antikörper ein Protein detektiert, das in der Kernmembran loaklisiert ist. Da es mit Hilfe eines Lichtmikroskopes schwierig ist zu unterscheiden, ob das Protein in der Kernmembran oder dem Kern selber lokalisiert ist, wurden mit Hilfe der hochauflösenden Methode der Elektronenmikroskopie weitere Analysen durchgeführt. Hierdurch ist es möglich gewesen eindeutig zu zeigen, dass das T-Protein in der Kernmembran lokalisiert ist. Als Nachweisreaktion wurde hierbei ein Zweitantikörper verwendet, an dem das Enzym Rettichpe- rodixase gekoppelt war und der zu einer Farbreaktion führte (DAB) . Der gebildete Farbstoff ist auf den elektronenmikroskopischen Aufnahmen nur auf der zytoplasmatischen Seite der Kernmembran zu sehen. Dies deutet darauf hin, dass der Antikörper ein Epitop des T-Proteins erkennt, das von der zytoplasmatischen Seite aus für den Antikörper zugänglich ist. Die Analyse der immunhistochemisehen Schnitte zeigte ferner, dass der Antikörper sehr spezifisch Neurone erkennt (vgl. Fig. 24) . Die Ergebnisse der Analyse der Expression auf Proteinebene mit Hilfe des Antikörpers stehen sehr gut in Einklang mit den Ergebnissen der Analyse der RNA-Expression . Bei den RNA-in situ-Analysen wurde das Mausortholog des T-Gens verwendet. Mit Hilfe der humanen T-Gen-cDΝA-Klone wurden hierfür zunächst murine cDΝA-Kone des Mausorthologs isoliert und sequenziert. Die Sequenzanalyse bestätigte, dass es sich bei den isolierten cDΝA-Klonen um das Mausortholog handelte. Ein solcher muriner cDΝA-Klon des T-Gens wurde dann für die RΝA-in situ Hybridisierung eingesetzt (vgl. Figs . 25, 26, 27, 28). Mit Hilfe dieser Technik war dann eine Expressionsanalyse des T-Gens der Maus möglich. Die genaue Analyse des räumlich-zeitlichen Expressionsverlaufes zeigte, dass das T-Gen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung, Bildung und Aufrechterhaltung des Nervensystems bei Vertebraten spielt. Während der frühen Mausembryogenese am Tag 9,5 post coneeptionem (pc = post coneeptionem) ist noch keine Expression zu erkennen. Am Tag 10,5 pc ist eine Expression im ventralen Mesencephalon und im Telencephalon nachweisbar. In diesem Stadium liegt auch eine starke Expression im Bereich der Verbindung des Mesencephalons und des Telencephalons (forbrain-midbrain) vor. Am Tag 11,5 pc ist eine Expression des T-Gens im Telencephalon, im ventralen Mesencephalon und im Myelencephalon feststellbar. Am Tag 12.5 pc ist eine Expression in Neuronen der Mantelzone des sich entwickelnden Gehirns und in den Kernen der peripheren Nerven sichtbar. Desweiteren liegt eine Expression im Myelencephalon, Rückenmark, und Spinalganglien vor. Eine geringe Expression ist im Mesencephalon und Telencephalon detektierbar . Keine Expression ist z.B. in proliferierenden Neuronen in der sub- ventrikulären Schicht oder in migrierenden Neuronen der ^λ In- termediate' -Zone nachweisbar. Am Tag 14.5 pc ist auch eine Expression in mesenchymalen Geweben, z.B. um die Wirbelsäule oder im Bereich von sich entwickelnden Knochen, sichtbar. Am Tag 16.5 pc ist eine starke Expression in allen Teilen des Gehirns und des peripheren Nervensystems (z.B. Spinalganglien und Nervenfasern des Schwanzes) feststellbar. Deweiteren ist eine Expression in sich differenzierenden Neuronen der Mantelzone des Telencephalons zu detektieren. Weiterhin ist auch eine Expression in Neuronen des Rückenmarks und der Spinal- ganglien feststellbar. Bei der Entwicklung des Gehirns nach der Geburt ist vor allem eine Expression im Riechkolben (ol- factory bulb) , im cerebralen Cortex und im sich entwickelnden Hippocampus nachzuweisen. Eine geringe Expression ist dagegen im Coliculus und dem sich entwickelnden Cerebellum feststellbar. Im vollständig entwickelten Gehirn liegt ein ähnliches Expressionsmuster vor.

Um herauszufinden, wo das T-Gen bzw. T2- oder T3-Gen exprimiert werden, wurden Northern Blots (vgl. Fig. 23) durchgeführt. Das T-Gen wird vorwiegend im Gehirn, kaum oder überhaupt nicht in Herz, Lunge, Plazenta, Leber, Skelettmuskel, Niere oder Pankreas (unabhängig von adultem oder fötalem Gewebe) exprimiert. Das T2-Gen dagegen wird so gut wie nicht im Gehirn exprimiert, sondern stark in Herz (adult und fötal) , adulter Leber, adultem Skelettmuskel und adulter Niere. Das T3-Gen wird in allen getesteten Geweben (adultes und fötales Herz, Gehirn, Leber, Niere; Plazenta, adulter Skelettmuskel, adulter Pankreas), außer in fötaler Lunge, exprimiert.

Durch die Entdeckung des T-Gens und der detailierten Analyse dieses Gens mit all den daraus gewonnenen Informationen wurden die Grundlagen geschaffen, völlig neuartige Arzneimittel und Arznei ittelwirkstoffklassen zu entwickeln. Der bidirektionale Transport von Molekülen durch die Kernmembran ist von entscheidender Bedeutung für die Funktion einer jeden eukary- ontischen Zelle. Die Information, die in Form von DNA (Chromosomen) im Kern gespeichert ist, wird transkribiert in RNA, die Information allerdings wird erst im Zytoplasma in Protein übersetzt ( translatiert) . Gelangt die trankribierte Information (mRNA) nicht in das Zytoplasma, so geht die Information verloren und es kann zu dramatischen Störungen innerhalb der Zelle kommen. Dieser Transprot ist aber keine Einbanhnstraße; es ist genauso wichtig, dass bestimmte Stoffe und Proteine in den Kern gelangen, damit die Zellfunktion aufrechterhalten werden kann. Gelangt z.B. ein Transkriptionsfaktor, der ja - wie auch die anderen Proteine im Zytoplasma gebildet wird - nicht in den Zellkern, so kann dieser nicht die Transkription der anderen Gene auslösen. Damit sind dann oft dramatische Störungen des Zellgeschehens, bis hin zum Absterben der Zelle oder des Organsimus, verbunden. Dies macht deutlich, dass Kernporenproteine eine äußerst wichtige Funktion innerhalb der Zelle ausüben. Die Analyse des T-Gens hat nun gezeigt, dass das T-Protein auch in die Kernmembran eingelagert wird. Interessanterweise ist das T-Protein aber fast doppelt so groß wie das POM121-Protein, d.h. es besitzt eine sehr viel größere Bindungskapazität als das POM121-Protein. Das T-Protein ist daher sehr gut geeignet, mögliche Bindungspartner zu isolieren, die sich an das T-Protein, im besonderen den C-Terminus des T-Proteins anlagern.

Die gewebespezifische Expression des T-Gens zeigt auf eindrucksvolle Weise, dass Kernporenproteine (insbesondere Kern- porenmembranproteine) nicht wie 'housekeeping' -Gene in allen Zellen und zu allen Zeiten exprimiert werden müssen. Die vorwiegende Expression des T-Gens im Nervensystem zeigt, dass das T-Protein im Nervensytem eine sehr spezifische Funktion wahrnimmt. Die vorwiegende Expression des T-Gens im Nervensytem kann nun für die Entwicklung von neuen Arzneimitteln und neuer Arzneimittelwirkstoffklassen genutzt werden. Mit Hilfe des T-Proteins können nun neue Stoffe isoliert werden, die den bidirektionalen Transport in Kernporen des Nervensytems gezielt beeinflussen. Die Lokalisation des T-Proteins innerhalb der Kernmembran ist dabei von großem Vorteil. Mit Hilfe von automatisierten Tests können chemische Verbindungen getestet werden. Viele Pharmafirmen besitzen geeignete Screeningverfah- ren, bei denen mehr als 200.000 Chemikalien getestet werden können. Hierzu können z.B. Reporterassays (z.B. GFP-Fusions- proteine, farbige Stoffe, usw.) verwendet werden, die den erfolgreichen Transport eines Moleküls in den Kern oder in das Zytoplasma anzeigen. Hierdurch können dann neue Wirkstoffe isoliert werden, die den Transport von Molekülen in Kernporen, insbesondere deren des Nervensytems , gezielt beeinflussen.

Die Identifizierung und Analyse von Wechselwirkungen zwischen den erfindungsgemäßen T-Proteinen (T-, T2-, T3-Protein) bzw. Peptiden oder Fragmenten davon und möglichen Bindungspartnern, die Wirkstoffe im oben genannten Sinn darstellen können, kann beispielsweise mit dem "Yeast Two-Hybrid-System" (Fields, Nature 340, S. 245-247 (1989)) geschehen. Dieses System basiert auf der Entdeckung, daß zelluläre Transkriptionsaktivatoren, wie z.B. GAL4 oder lexA aus Hefe, in zwei unabhängige Funktionsdomänen zerlegt werden können. Beide Domänen sind normalerweise Bestandteil eines Proteins im Zellkern der Hefezelle, welches an bestimmte aktivierende Sequenzen verschiedener Zielgene bindet und deren Transkription reguliert. Dabei bindet die eine Domäne, die DNA-Bindungsdomäne (BD) , spezifisch an eine bestimmte DNA-ZielSequenz (upstream acti- vating sequence) in der Nähe des Zielgenpromotors. Die andere Domäne, die Aktivierungsdomäne (AD) , erhöht die Transkriptionsrate des Zielgens durch Wechselwirkung mit dem Trans- kriptionsinitiationskomplex, der am Promotor des Zielgens gebunden ist. Im "Yeast Two-Hybrid-System" wird diese Struktur von Transkriptionsfaktoren in veränderter Form ausgenutzt. Die DNA-Bindungsdomäne (BD) von GAL4 oder lexA wird dort als Fusionsprotein mit einem "Köderprotein oder -peptid" (hier: T- , T2- oder T3-Protein/Peptid) in Hefezellen exprimiert. Dieses Fusionsprotein besitzt außerdem ein Kernlokalisierungssignal , durch welches es in den Zellkern der Hefe transportiert wird. Das Köder-Fusionsprotein bindet dort an eine Zielsequenz (UAS) , die sich in dem verwendeten Hefestamm in der Nähe der Promotoren von zwei Reportergenen (z.B. auxotropher Marker (HIS3) und enzymatischer Marker (lacZ)) befindet. Dadurch entsteht eine Konstellation, in der das Köderprotein oder - peptid in direkter räumlicher Nähe des Reportergenpromotors exponiert wird. In derselben Hefezelle wird nun zusätzlich ein zweites Fusionsprotein exprimiert. Dieses besteht aus der Aktivierungsdomäne (AD) von GAL4 oder lexA und einem Beuteprotein -oder peptid. Es besitzt ebenfalls ein Kernlokalisierungssignal. Das Beute-Fusionsprotein wird also auch in der Zellkern der Hefe transportiert. Falls nun das Beuteprotein und das an der UAS exponierte Köderprotein eine physikalische Wechselwirkung miteinander eingehen, dann erhöht sich die statistische Wahrscheinlichkeit, daß die Aktivierungsdomäne sich in der Nähe des Reportergenpromotors aufhält. Dadurch kommt es zu einer Steigerung der Transkription der Reportergene, deren Ausmaß proportional zur Stärke der Wechselwirkung zwischen Köder- und Beuteprotein ist. Dabei kommen als Beuteproteine z.B. eine cDNA-Bibliothek oder auch eine kombinatorische Peptidbibliothek in Frage.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren, um Inhibitoren oder Enhancer der erfindungsgemäßen T-Protein- familie zu identifizieren. Dazu werden die Nukleinsäuresequen- zen oder Teile dieser Sequenzen, die Teil des T-Gens oder dessen Paraloge oder Orthologe sind, in geeignete Vektoren inseriert und für die Transfizierung oder Transformierung von Zellen, Geweben oder Organismen verwendet. Diese veränderten Zellen, Gewebe oder Organismen werden dann zur Identifizierung von Inhibitoren oder Enhancern des T-Proteins oder dessen paralogen oder orthologen Proteine (z.B. T2 und T3 ) oder Proteinen, die mit diesen Proteinen in direkter oder indirekter Wechselwirkung treten, eingesetzt. Die durch diesen Ansatz identifizierten Inhibitoren oder Enhancer können für pharmazeutische Wirkstoffe oder Medikamente oder zu deren Herstellung eingesetzt werden und für die Behandlung von Erkrankungen wie Krebs, neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen und Verletzungen des Nervensystems angewendet werden. Bei Verletzungen des Nervensystems, bei angeborenen Schädigungen des Nervensystems oder bei degenerativen Erkrankungen des Nervensystems können durch diese Behandlung unter anderem gezielt die neuronale Regeneration gefördert oder die Verschaltung einzelner Nervenbereiche verbessert werden (Anwendung u.a. Alzheimer, Morbus Parkinson, Schizophrenie, Manisch-Depressive Erkrankungen, Autismus, mentale Retardierung) . Die vorliegende Erfindung eröffnet die Möglichkeit zu testen, welche Stoffe oder Therapeutika geeignet sind, die Wirkung des T-Proteins oder der Familie der T-Proteine zu verstärken oder zu verringern. Insbesondere können die veränderten Kernporeneigenschaften, die durch die Proteine T und T3 beeinflußt werden, durch geeignete Screeningverfahren erfaßt werden. Hierzu zählen die z.B. Visualisierung des bidirektionalen Transportes durch die Kernpore oder die Detektion einer veränderten Transkription von zellulären oder Reportergenen. Desweiteren können Stoffe oder Therapeutika identifiziert werden, die die Wirkung von Proteinen hemmen oder fördern, die direkt oder indirekt an der Wirkung des T-Proteins oder der Familie der T-Proteine beteiligt sind. Stoffe oder Therapeutika, die in oben genannten Screeningverfahren eine Verstärkung oder Verminderung der Wirkung des T-Proteins (oder T2 oder T3 ) zeigen, können eingesetzt werden, um zu determieren, ob die Verstärkung oder die Verminderung der Wirkung des T-Proteins zu therapeutisch wünschenswerten Efekten führt. Hierzu zählt vor allem die Inhibition des Wachstums oder der Ausbreitung von Tumorzellen oder die Förderung der neuronalen Regeneration z.B. nach Verletzungen der Nerven (u.a. Querschnittslähmung und Schädel- Hirntraumata) . Die identifizierten Stoffe können dann als Medikamente oder für die Herstellung dieser Medikamente eingesetzt werden. Durch diese Medikamente ist es dann möglich, die Ausbreitung der krankheitsinduzierenden Zellen zu inhibieren oder zu blockieren, und damit insgesamt die Krankheit einzudämmen oder zu heilen. Eine wichtige Anwendung dieser Medi- kamante ist u.a. die Verhinderung des Wachstums und der Ausbreitung von Tumorzellen. Ergänzend hierzu kommen die identi- fizerten Wirkstoffe als Medikamente in Einsatz, die das Wachstums von bestimmten Zellen gezielt anregen. Hierdurch ist es dann möglich, Zellen oder Strukturen des Nervensystems, die durch eine Verletzung oder durch degenerative Prozesse geschädigt sind, wiederherzustellen. Das T-Protein (oder T2 oder T3 ) kann auch in solchen Screeningverfahren eingesetzt werden, die es erlauben, nicht nur die veränderten Kernporeneigenschaften erfassen sondern auch vor- oder nachgeschaltete oder parallele Signalkaskaden zu identifizieren. Hierdurch ist es möglich z.B. Tyrosinkinasen ödere Tyrosinphosphatasen zu identifizieren, die Proteine regulieren, die wiederum direkt oder indirekt die Wirkung des T-Proteins (oder T2 oder T3 ) beeinflussen. Hierdurch können geeignete Ziele für die positive Beeinflussung des Zellgeschehens erkannt und charakterisiert werden. Weiterhin kommt dem T-Protein, obwohl es als Kernporenprotein vorkommt, eine wichtige Bedeutung bei der Interaktionen und Wechselwirkungen mit Filamenten der Zelle z.B. Mikrotubuli und Aktin bei. Diese Wechselwirkungen können nun untersucht werden, z.B. durch Fusionsproteine des T-Proteins mit dem EGFP-Protein. Zellen, die mit Konstrukten für solche Fusions-Reporter-Proteine stabil oder transient transformiert oder transfiziert wurden, können mit Stoffen oder Pharmazeuti- ka inkubiert werden um Stoffe die identifizieren, die die Wechselwirkung des T-Proteins mit Filamenten wie den Aktinfi- lamenten oder den Mikrotubuli verstärken oder verringern. Hierdurch können Wirkstoffe isoiert werden, die unter anderem das Wachstum von Nervenzellen oder die Hemmung des Wachstums von Tumorzellen positiv beeinflussen. Als Methode zur Identifizierung solcher möglicher Wirkstoffe ist beispielsweise die Immunpräzipitation zu nennen. Hiermit können Proteine isoliert werden, die an die T-Protein-Familie binden. Mit diesen Proteinen können dann weitere Immunpräzipitationen durchgeführt werden, um wieder neue Proteine zu isolieren, die dann nicht mehr direkt mit dem T-Protein interagieren.

Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindund ein Verfahren zur Identifizierung von weiteren Proteinen, die bei der Entwicklung und Funktion des Nervensystems eine Rolle spielen und/oder ein Kernporenprotein sind, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: (a) Herstellen eines Antikörpers gegen ein Protein der T-Familie (T-, T2- oder T3-Protein) ,

(b) Kontaktieren eines Zellextrakts mit dem Antikörper und Identifizieren des Antikörper/Protein-Komplexes ,

(c) Analysieren des Komplexes, um ein Protein zu identifizieren, das an das Protein des Komplexes gebunden hat und kein Antikörper ist, und

(d) ggf. Wiederholen der Schritte (a) bis (c) , um weitere Proteine dieser Funktion zu identifizieren.

Die Erfindung wird weiter anhand der Figuren beschrieben, welche zeigen:

Figur 1: humane cDNA-Sequenz (Gen T) und abgeleitete Aminosäuresequenz

Figur 2: humane genomische DNA-Sequenz (Gen T)

Figur 3 : humane genomische DNA-Sequenz (Gen T)

Figur 4: humane genomische DNA-Sequenz (Gen T)

Figur 5: humane genomische DNA-Sequenz (Gen T)

Figur 6: humane genomische DNA-Sequenz (Gen T)

Figur 7: humane genomische DNA-Sequenz (Gen T)

Figur 8: humane genomische DNA-Sequenz (Gen T) Figur 9: partielle murine cDNA-Sequenz (Gen T) und abgeleitete Aminosäuresequenz

Figur 10: partielle murine genomische DNA-Sequenz (Gen T)

Figur 11: partielle humane cDNA-Sequenz (Gen T2 ) und abgeleitete Aminosäuresequenz

Figur 12: partielle murine cDNA-Sequenz (Gen T2 ) und abgeleitete Aminosäuresequenz

Figur 13: partielle murine cDNA-Sequenz (Gen T2 ) und abgeleitete Aminosäuresequenz

Figur 14: Spleißvariante des humanen T-Gens mit abgeleiteter Aminosäuresequenz

Figur 15: Spleißvariante des humanen T-Gens mit abgeleiteter Aminosäuresequenz

Fig. 16: partielle humane cDNA-Sequenz (Gen T2 ) mit abgeleiteter Aminosäuresequenz

Fig. 17: partielle humane cDNA-Sequenz (Gen T3 ; Protein-Isoform 1) mit abgeleiteter Aminosäuresequenz

Fig. 18: partielle humane cDNA-Sequenz (Gen T3 ; Protein-Isoform 2) mit abgeleiteter Aminosäuresequenz Fig. 19: partielle murine cDNA-Sequenz mit abgeleiteter Aminosäuresequenz (Gen T3 )

Fig. 20: Oligonukleotide und Peptide (T-Gen)

Fig. 21: Sequenzvergleich innerhalb der T-Familie

Fig. 22: Proteinalignment von POM121-Protein und T-Protein

Fig. 23: Northern Blot Analyse

Fig. 24: Immunhistochemische Untersuchungen und elektronenmikroskopische Aufnahmen

Fig. 25: In-situ Hybridisierung mit embryonaler RNA

Fig. 26: In-situ Hybridisierung mit RNA aus Gehirn

Fig. 27: In-situ Hybridisierung mit RNA aus fötalem Gehirn

Fig. 28: In-situ Hybridisierung mit RNA aus Nervengeweben der Maus

Fig. 29: Vergleich der Coiled-Coil-Regionen zwischen CLIP-Protein, T-Protein und POM121

Fig. 30: Hydrophobizitätsblots für POM 121, T-Protein und T3 -Protein Folgende Clone wurden gemäß Budapester Vertrag bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) , Mascheroder Weg 1b, Braunschweig, am 18. August 1998 hinterlegt :

Clon JFC277 (DSM12371); humane cDNA; repräsentiert die humane cDNA-Sequenz von Bp 1218-3690

Clon JFC405 (DSM12372); humane cDNA; repräsentiert die humane cDNA-Sequenz von Bp 1-1891

Clon JFC601 (DSM12373); murine cDNA; repräsentiert die murine cDNA-Sequenz von Bp 225-3026

Clon JFC950 (DSM12374); humaner genomischer Clon; repräsentiert humane genomische Sequenz

Clon JFC955 (DSM12375); humaner genomischer Clon; repräsentiert humane genomische Sequenz; beinhaltet Start der cDNA-Sequenz

Clon JFC N2112 (DSM12376) ; humaner genomischer Clon; wurde vollständig sequenziert. Die Sequenz ist in Fig. 2 gezeigt und enthält die Sequenz von Bp 1756-4228 der humanen cDNA- Sequenz .

Am 2. Februar 1999 wurde folgender Clon gemäß Budapester Vertrag bei der DSMZ hinterlegt:

Clon JFC-BN27 (DSM 12659); enthält die Sequenz von Bp 4370-8690 der humanen cDNA-Sequenz

Am 19. Februar 1999 wurde folgender Clon gemäß Budapester Vertrag bei der DSMZ hinterlegt:

Clon JFC-BN20 (DSM 12698); enthält die Sequenz von Bp 2025-6280 der humanen cDNA-Sequenz Am 1. Februar 2000 wurde folgender Clon gemäß Budapester Vertrag bei der DSMZ hinterlegt:

cDNA-Klon pL70 (DSM13270); repräsentiert wesentliche Teile des Gens T3.

Die in den Fig. 2-8 gezeigten Sequenzen entstammen den Klonen JFC955 (DSM 12375) und JFC950 (DSM 12374) . Die in Fig. 1 gezeigte Sequenz stammt aus den Clonen JFC277 (DSM 12371), JFC405 (DSM 12372) und JFC-BN27 (DSM 12659) und JFC-BN20 (DSM 12698) . Die in Fig. 9 gezeigte Sequenz stammt aus dem Clon JFC610 (DSM12373) .

Die Erfindung wird weiter anhand des nachfolgenden Ausführungsbeispiels beschrieben.

BEISPIELE

Hinsichtlich der verwendeten Methoden wird auch auf Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. (Molecular cloning; a laboratory manual ; second edition; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) und Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, 1994-1998) hingewiesen, wobei die nachfolgend erwähnten Techniken, insbesondere Präparation von DNA bzw. RNA oder Νorthern-Blot dem Fachmann hinreichend bekannt sind und beherrscht werden.

Bevor die Durchführung der Experimente im einzelnen beschrieben wird, soll im nächsten Abschnitt erst einmal die Arbeitsstrategie erläutert werden. Auf der Suche nach Genen, die im mutierten Zustand Erkrankungen des ZNS (z.B. neurodegenerative Erkrankungen, mentale Retardierungen, Tumorerkrankungen des ZNS) auslösen, wurden aus einer humanen fötalen Gehirn-cDNA-Bibliothek (Fa. Strata- gene, Heidelberg) 23 cDNA-Klone isoliert. Eine humane fötale Gehirn-cDNA-Bibliothek wurde als Ausgangsmaterial verwendet, da davon ausgegangen wurde, daß in einer fötalen Gehirn-cDNA- Bibliothek Gene, die in der Entwicklung des ZNS und insbesondere des Gehirns eine Rolle spielen, vorhanden sind. Da aber auch sogenannte Haushaltsgene (Gene, die in den meisten Geweben exprimiert werden) im ZNS exprimiert werden, wurde nun getestet, ob die ausgewählten cDNA-Klone von Genen stammen, die eine ZNS-spezifische Expression aufweisen. Hierzu wurden die in den einzelnen cDNA-Klonen enthaltenen cDNA-Stücke ('Inserts') isoliert und für die Hybridisierung mit Northernblots verwendet. Die verwendeten Northernblots beinhalteten polyA-RNA aus verschiedenen menschlichen Geweben (z.B. Gehirn, Skelettmuskel, Leber und Niere) und verschiedenen Entwicklungsstadien (fötale und adulte Gewebe) . Da, wie oben erwähnt, im fötalen Gehirn nicht nur gehirnspezifische Gene exprimiert werden, wurde die Hybrdisierung mit den Northernblots dazu verwendet, cDNA-Klone zu identifizieren, die vor allem im Gehirn exprimiert werden und weniger in anderen Geweben. Durch diese differentielle Analyse konnte ein cDNA-Klon identifiziert werden, der ein gehirnspezifisches Expressionsmuster aufweist. Unter Verwendung dieses cDNA-Klons konnte durch wiederholtes Hybridisieren der fötalen cDNA-Bibliothek die gesamte mRNA-Sequenz für das darin codierte neue Protein isoliert und entschlüsselt werden (Gen T mit darin codiertem Protein TP) .

BEISPIEL 1: Identifizierung der T-Gene 1. Titration der cDNA-Bibliotheken

Um eine effektive Infektion zu gewährleisten, war es zunächst notwendig, in einer Übernachtkultur phagenkompetente Bakterien herzustellen. Die in dem Medium enthaltenen Magnesium-Ionen induzieren den Maltose-Rezeptor der Bakterien, an dem der Phage bindet, um das Bakterium zu infizieren.

Durchführung :

50 μl E. coli XLl-Blue in 50 ml LB-Medium ansetzen, wobei dem Medium MgS0₄ in einer Konzentration von 10 mM zugesetzt wird. Bei 30°C und 220 rpm über Nacht inkubieren. Abzentrifugieren der Bakterien bei 4°C und 1000 xg für 10 min. In 25 ml 10 mM MgS0₄ resuspendieren. Die so erzeugten phagenkompetenten Bakterien waren bei 4°C bis zu einer Woche lagerfähig.

2. Ausplattieren der cDNA-Bibliotheken

Zum Ausplattieren der Bibliothek mußten Baltimore Biological Lab. (BBL) -Agarplatten, und BBL-Top-Agarose vorbereitet werden. Die Phagen (humane bzw. murine cDNA-Bibliothek, Fa. Stratagene) wurden, um nach dem Ausplattieren Einzelplaques zu erhalten, mit SM-Medium 1:10³ und 1:10⁴ verdünnt.

Durchführung :

Für den BBL-Agar (pH 7,2) werden 10 g BBL-Trypticase, 5 g NaCl, und 10 g Select Agar eingewogen und auf 1 1 mit H₂0 aufgefüllt. Der Agar wird durch Autoklavieren gelöst. Nach Abkühlen auf ca. 60°C die Platten gießen. Die Platten werden vor Gebrauch auf 37°C vorgewärmt, um ein vorzeitiges Erstarren der Top-Agarose zu vermeiden. Die BBL-Top-Agarose (pH 7,2) wurde mit 10 g BBL-Trypticase, 5 g NaCl, 6,5 g Agarose und 10 ml IM MgS0₄-Lösung auf 1 1 H₂0 angesetzt. Durch Autoklavieren lösen und im Wasserbad auf 41°C bereitstellen. 15 μl wie vorstehend angeben verdünnte Phagenlösung und 250 μl der kompetenten XL-1 Bakterien in ein 15 ml Falcontube geben. 20 min. bei Raumtemperatur inkubieren. 10 ml BBL-Top Agarose zugeben, schwenken und auf die angewärmte Agarplatte geben. Nach ca. 20 min ist die Top-Agarose-Schicht fest, und die Platten können mit der Agarseite nach oben gestapelt werden. Die Inkubation erfolgt über Nacht bei 37°C. Die Platten sind nach abgelaufener Inkubationszeit bei 4°C lagerbar oder können direkt zum Transfer der Phagenplaques verwendet werden. Zur Lagerung die Platten diese zusammen mit einem chloroformgetränkten Tuch in Plastiksäcken gut verschließen. Das Chloroform verhindert das Wachstum von kälteliebenden Bakterien und Pilzen.

3. In vivo Exeision

Die verwendeten cDNA-Banken (humane und murine fötale Gehirn- cDNA-Bibliothek; Fa. Stratagene, Heidelberg) waren in dem Vektor λ-ZAPII kloniert. Hierdurch bestand die Möglichkeit, die Subklonierung des Phageninserts in einen Plasmid-Vektor zu umgehen. Dieses Protokoll erlaubt es auf einfache Weise, cDNA, die sich als Insert im λ-ZAPII-Vektor befindet, durch einen in vivo Ansatz in ein Insert zu überführen, das sich nun im Plasmid Blueskript SK(-) befindet. Das Prinzip dieses Ansatzes liegt darin, daß durch einen Helferphagen Informationen für Proteine eingebracht werden, die eine DNA-Amplifikation nur in dem Bereich des Phagengenoms erlauben, die die genetische Information für das Plasmid mit cDNA-Insert besitzen. Es wurde weitgehend nach dem Protokoll des Herstellers (Stratagene) verfahren.

Insbesondere wurde so ausplattiert, daß Einzel-Phagenplaques auf der Platte waren. Mit diesen Einzelplaques wurde dann das in-vivo Exe i s i onspro t okol 1 durchgeführt. Aus den Bakterienklonen wurde die Plasmid-DNA und deren Plasmid- Inserts isoliert und anschließend mit Northern Blots hydridisiert . Die Auswahl der weiter zu untersuchenden Klone beruhte auf dem Expressionsmuster bei den Northern Blots.

Durchführung :

100 μl eines Einzel-Phagen λ-ZAPII-Klones mit 200 μl XL1- Bakterien und 2 μl Helferphagen (im Stratagene-Kit enthalten) versetzen. 15 min. bei 37°C und 80 rpm schütteln, wobei die spezifische Anlagerung beider Phagentypen an das Wirtsbakte- rium stattfindet. 3 ml LB-Medium zugeben. 2 h bei 37°C und 200 rpm inkubieren. Während dieser Zeit findet die DNA-Replikation des im 1-ZAPII-Vektors enthaltenen Plasmides, dessen Zirkularisierung, sowie die Verpackung in Hüllproteine und Ausschleusung aus dem Bakterium statt. Auf 70°C für 20 min. erhitzen. Im Anschluß 15 min. bei 4000g zentrifugieren. Dies tötet die noch verbliebenen Bakterien ab und trennt deren Bruchstücke von den in der Phagenhülle vorhandenen Plasmiden ab, die sich im Überstand befinden. 1 μl davon zu 200 μl SOLR- Wirtszellen geben, 15 min. bei 37°C inkubieren. 100 μl auf LB/Amp-Platten ausplattieren. Über Nacht bei 37°C lagern. Die nun gewachsenen Bakterienklone enthalten das Plasmid mit dem entsprechenden cDNA-Insert. Es wurde jeweils eine Mini-Prep- DNA-Präparation durchgeführt.

4. "random primed" DNA-Markierung

Die radioaktive Markierung der doppelsträngigen Insert-DNA des cDNA-Klons wurde für die weitere Isolation von überlappenden cDNA-Klonen wie folgt durchgeführt.

Durchführung :

Für einen typischen Markierungsansatz 100 ng DNA in einem Volumen von 12 μl H₂0 lösen. 10 minütiges Erhitzen auf 95°C bewirkt die Denaturierung der DNA in Einzelstränge. Ansatz auf Eis lagern, um eine Reassoziation der beiden komplementären DNA-Stränge zu verhindern. Den Reaktionsansatz durch 4 μl OLB (Oligo-labelling-buffer, 1 μl Klenow (1U) sowie 2 , 5 μl a-³²P- dCTP und 2,5 l a-³²P-dATP komplettieren. Über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Während dieser Zeit findet die Bildung des Komplementärstranges, ausgehend von den an einen Einzelstrang angelagerten Hexanucleotiden, durch das Klenow- Fragment der E. coli DNA-Polymerase I statt. Die radioaktive Markierung der DNA erfolgt durch den Einbau des a-³²P-dCTP und des a-³²P-dATP.

5. Abtrennen von nicht-eingebauten radioaktiven Nucleotiden

Die Abtrennung der nichteingebauten Nucleotide erfolgte mit Hilfe einer selbst gefertigten Sephadex G-50 Säule. Das Au f t r ennung s p r i n z i p der Säule beruht auf der Ausschlußchromatographie. Die kleineren nichteingebauten Nucleotide passen in kleine Poren des Säulenmaterials, während die DNA von diesen ausgeschlossen bleibt. Das Volumen, in dem sich die Nucleotide bewegen können ist daher größer als das Volumen, das der DNA zur Verfügung steht. Trägt man nun ein Gemisch aus DNA und Nucleotiden auf die Säule, so läuft die DNA schneller als die Nucleotide durch die Säule. Dies erlaubt die Abtrennung der nichteingebauten Nucleotide.

Durchführung :

Eine Pasteurpipette wurde mit einem kleinen Glaskügelchen verschlossen. Auffüllen der Pasteurpipette mit in Wasser gelöstem Sephadex G-50 ("Fine") bis sich das Füllmaterial 5 cm unter der Oberkante der Pasteurpipette befindet. 2x Spülen der Säule mit TE . Auftragen des obigen radioaktiven Markierungsansatzes. Zugabe von 320 μl TE. Die Lösung, die durch die Säule gelaufen ist, verwerfen. Eppendorf-Tube unter die Säule stellen. Zugabe von 350 μl TE. Auffangen der durch die Säule gelaufenen radioaktiven Lösung.

6. Plaαue-"blot"

Der Plaque-"Blot" wurde für die Analyse der cDNA-Bibliothek vorgenommen, um die in Phagenklonen befindliche cDNA der Hybridisierung zugänglich zu machen.

Durchführung :

Eine beschriftete, markierte Hybond-N-Membran luftblasenfrei für 1 min auf die Platte mit den Phagenplaques legen. Das Markierungsmuster wurde übertragen. 10 min auf mit Denaturierungslösung (0,5 M NaOH; 1,5 M NaCl) getränktes Whatmanpapier legen, die Plaque-Seite nach oben. 10 min. in 50 mM Phosphatpuffer neutralisieren. Mit einem Phosphatpuffergetränkten Kleenex-Tuch werden die verbleibenden Reste des Bakterienrasens mit leichtem Druck abgewischt. Die Filter werden bei Raumtemperatur zum Trocknen ausgelegt. Anschließend wurden die Filter 1 h bei 90°C gebacken. 7. Hvbridisierunσ

Die Hybridisierung beruht auf der Bindung komplementärer, einzels trängiger Nucleinsäuren. Dazu wurde die zu untersuchende DNA auf einer Membran immobilisiert und mit einer radioaktiv markierten Sonde hybridisiert. Die komplementäre Bindung bleibt auch nach dem Abwaschen der unspezifisch adhärenten Sonden erhalten und kann autoradiographisch sichtbar gemacht werden. Bei der Hybridsierung wurden einzelsträngige Moleküle unter Salz- und Temperaturbedingungen inkubiert, die die Bildung von basengepaarten doppel s t rängen begünstigen. Einen entscheidenden Faktor bei der Assoziations- und der Dissoziationski- netik stellen die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basen-paaren G-C und A-T dar. Die Hybridisierungsreaktion wird durch Veränderungen der Temperatur und der Salz- und Probenkonzentration beeinflußt.

Durchführung :

Zunächst die DNA-Filter in Hybridisierungslösung (0,5 M NaPi

(pH 7,2); 7% SDS; 0,2% BSA; 0,2% PEG 6000; 0,05% Polyvinylpyrrolidon 360000; 0,05% Ficoll 70000; 0,5% Dextransulfat) mit 0,1 ml/cm² bei 65°C prähybridisieren. Dazu die Filter in einer Kunststoffbox in einem Schüttelwasserbad für die Dauer von mindestens 1 h bei 65°C inkubieren. Die Prähybridisierungslösung verwerfen. Die radioaktiv markierte Probe (s. oben 4. und 5.) mit 0,5 ml/cπr Hybridisierungslösung

(65°C) auf die Filter geben. Die Aktivität der Probe sollte 50 cpm, gemessen im Abstand von 40 cm, nicht unterschreiten. Die Hybridisierung erfolgt über Nacht bei 65°C (humane cDNA- Bibliothek) oder 55°C (Interspezieshybridisierungen Mensch- Maus und zur Isolation der homologen Gene) . Die Filter zweimal 30 min mit etwa 500 ml Waschpuffer im Schüttelbad bei 65°C

(55°C) waschen. Daran anschließend wurde eine Autoradiographie durchgeführt . 8. Autoradiographie

Die Filter wurden in Frischhaltefolie verpackt. Die Autoradiographie erfolgte bei -80°C in einer Röntgenkassette, die eine Verstärkerfolie aus Calciumwolframat enthielt. Die Exponierung dauerte je nach Stärke des Signals 30 min bis einige Tage.

Mit Hilfe der oben genannten Techniken konnte die komplette mRNA, die für das Protein des Gens T codiert, isoliert werden. Desweiteren konnte unter der Verwendung von cDΝA-Klonen dieses neu isolierten Gens T zwei weitere Gene (T2 und T3 ) isoliert werden, die mit diesem Gen ausgeprägte Homologien aufweisen. Hierzu wurden wieder die oben erwähnten Techniken verwendet. Zur Isolation der verwandten Gene T2 und T3 wurde die Hybridisierungstemperatur auf 55°C erniedrigt.

BEISPIEL 2: Northern Blot

Die 'multiple tissue Northern blots' wurden von der Firma CLONTECH (Palo Alto, Kalifornien, USA) gekauft und nach den Anweisungen des Herstellers angewendet. Die jeweiligen DNA- Proben der Gene T, T2 und T3 wurden radioaktiv markiert und mit den Northern hybridisiert. Für die Analyse des Expressionsmusters auf Northern-Blot-Ebene wurde für das T-Gen die Sequenz von bp 1-4200 der Fig. 1 verwendet. Für das Gen T3 wurde die Sequenz von bp 1310-4870 der Fig. 17 für die Hybridisierung verwendet. Für das Gen T2 wurde die Sequenz von bp 3120-4230 der Fig. 16. Zur radioaktiven Markierung doppelsträngiger DNA wurde die "random priming" Methode verwendet .

a) Random Priming:

Für einen typischen Markierungsansatz 100 ng DNA in einem Volumen von 12 μl lösen. 10 inütiges Erhitzen auf 95°C bewirkt die Denaturierung der DNA in Einzelstränge. Ansatz auf Eis lagern, um eine Reassoziation der beiden komplementären DNA-Stränge zu verhindern. Den Reaktionsansatz durch 4 μl OLB, 1 μl Klenow (1U) sowie 2 , 5 μl a-³²P- dCTP und 2 , 5 μl a-³²P- dATP komplettieren. Über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Während dieser Zeit findet die Bildung des KomplementärStranges, ausgehend von den an einen Einzelstrang angelagerten Hexanucleotiden, durch das Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase I statt. Die radioaktive Markierung der DNA erfolgt durch den Einbau des a-³²P-dCTP und des a-³²P- dATP.

Die Abtrennung der nichteingebauten Nucleotide erfolgte mit Hilfe einer selbst gefertigten Sephadex G-50 Säule. Das Au f t r ennung sp r i n z i p der Säule beruht auf der Ausschlußchromatographie. Die kleineren nichteingebauten Nucleotide passen in kleine Poren des Säulenmaterials, während die DNA von diesen ausgeschlossen bleibt. Das Volumen, in dem sich die Nucleotide bewegen können ist daher größer als das Volumen, das der DNA zur Verfügung steht. Trägt man nun ein Gemisch aus DNA und Nucleotiden auf die Säule, so läuft die DNA schneller als die Nucleotide durch die Säule. Dies erlaubt die Abtrennung der nichteingebauten Nucleotide. Dazu wird eine Pasteurpipette mit einem kleinen Glaskügelchen verschlossen. Auffüllen der Pasteurpipette mit in Wasser gelöstem Sephadex G-50 ("Fine") bis sich das Füllmaterial 5 cm unter der Oberkante der Pasteurpipette befindet. 2x Spülen der Säule mit TE. Auftragen des radioaktiven Markierungsansatzes. Zugabe von 320 μl TE. Die Lösung, die durch die Säule gelaufen ist, verwerfen. Eppendorf-Tube unter die Säule stellen. Zugabe von 350 μl TE. Auffangen der durch die Säule gelaufenen radioaktiven Lösung.

b) Hvbridisisieruncr:

Die Hybridisierung der Northern Blots erfolgte wie nachfolgend beschrieben. Zunächst wurden die Northern blots in 10 ml Hybridisierungslösung (350 ml 20%iges SDS, 500 ml IM Phosphatpuffer, pH 7,2; 150 ml dest. Wasser) bei 65°C prähybridisiert. Dazu die wurden Northern blots in einer Glasröhre in einem Hybridisierungs-Rollofen für die Dauer von

6 h bei 65°C inkubiert.

Die Prähybridisierungslösung wurde verworfen. Die radioaktiv markierte Probe wurde mit 10 ml Hybridisierungslösung (65°C) auf die Filter gegeben.

Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 65°C. Die Filter wurden dann zweimal 30 min mit etwa 500 ml Waschpuffer (80 ml

IM Phosphatpuffer, pH 7,2; 100 ml 20% iges SDS, 1820 ml dest.

Wasser) im Schüttelbad bei 65°C gewaschen.

c) Autoradiographie:

Die Filter wurden in Kunststoffolie eingeschweißt. Die Autoradiographie erfolgte bei -80°C in einer Röntgenkassette, die eine Verstärkerfolie aus Calciumwolframat enthielt. Die Exponierung dauerte je nach Stärke des Signals 1-4 Tage.

Die Ergebnisse der durchgeführten Northern Blots sind in Fig. 23 gezeigt.

BEISPIEL 3: RNA in situ Hybridisierung

Embryos in verschiedenen Entwicklungstadien wurden aus schwangeren NMRI-Mäusen isoliert. Die Embryonen und andere Gewebeproben wurden über Nacht mit 4% Paraformaldehyd in PBS bei 4°C fixiert. 10 μm Gefrierschnitte der Embryos wurden auf mit 3-Aminopropyltriethoxysilane beschichteten Objektträgern transferiert. Sinnstrang ("Sense")- und Gegenstrang ( "Antisense" ) -Proben wurden durch in vi tro Transkription mit a-³⁵S-UTP, mit einer spezifischen Aktivität von >10⁹ Zerfälle pro Minute/μg, hergestellt. Hierzu wurde der linearisierte Maus-T-Gen cDNA-Klon aus Fig. 9 mit T7- oder Sp6-RNA- Polymerase transkribiert. Die Probenlänge wurde durch alkalische Lyse auf 150-200 Nucleotide reduziert. Die Objektträger wurden in einer Lösung, die 50% Formamid, 10% Dextransulfat, 0,3 M NaCL, 10 mM Tris, 10 mM Natriumphosphat pH 6.8, 20 mM Dithiothreitol , 0,2% Denhardt ' s Lösung, 0,1 Triton X-100, 0,1 mg/ml Escherichia coli RNA und 0,1 mM nichtradioaktives a-S-UTP enthielt, bei 54°C vorhybridisiert. Für die Hybridisierung wurde die ³⁵S-markierte Probe (8 x 10⁴ Zerfälle pro Minute pro ml) zum Hybridisierungsmix zugegeben und die Hybridisierung dann für 16 h bei 54°C in einer feuchten Kammer fortgesetzt. Die Objektträger wurden dann in der Hybridisierungslösung für 2 h gewaschen. Die verbliebene nichthybridisierte RNA-Probe wurde dann mit RNase A verdaut. Die Objektträger wurden dann 30 min bei 37°C mit 2x SSC, 0,1% SDS und 30 min mit 0 , lx SSC, 0,1% SDS gewaschen. Anschließend wurden die Objektträger mit ansteigenden Ethanol- Konzentrationen dehydriert. Die Objektträger wurden dann mit Ilford K5 Autoradiografieemulsion bedeckt. Nach 1-2 Wochen Exposition bei 4°C wurden die Objektträger in Kodak Dl9b- Entwickler inkubiert und dann mit Giemsa gefärbt. Die Schnitte wurden in Dunkel- und Hellfeld Ausleuchtung mit einem Zeiss SV8-Stereomikroskop und einem Axiophot Mikroskop analysiert und mit einem Agfa Ortho-Schwarz-Weiß-Film fotografiert.

Die Ergebnisse der RNA in-situ Hybridisierung sind in den Figs . 25, 26, 27 und 28 gezeigt.

Fig. 25: Expression des Maus T-Gens während der Mausembryogenese . Hellfeld- (a,c,e,g) und Dunkelfeldbilder (b, d, f, h) von Horizontal- (a,b) und Sagittalschnitten (c-h) durch einen 10,5 (a,b), 12,5 (c,d), 14,5 (e,f) und 16,5 (g,h) dpc Embryo (dpc = days post coneeptionem) , die mit einer Antisense-Riboprobe des Maus-T-Gens hybridisiert wurden, dec = Decidua, g = Darm, he = Herz, lab = Labyrinth, li = Leber, me = Myelcephalon, sc = Rückenmark, sga = Spinalganglien, sb = Zahnknospe, te = Telencephalon. Balken = 1 mm

Fig. 26: Expression des Maus-T-Gens im postnatalen Gehirn. Hellfeld- (a,d) und Dunkel feldbilder (b,c,e,f) von Horizontalschnitten durch einen 1 wpn (weeks post natalis) und 6 wpn Kopf, die mit einer T-Gen Antisense (b,e) und Senseprobe (c,f) hybridisiert wurden, ce = Cerebellum, cor = Cortex, cos = Colliculuε, ey = Auge, hi = Hippocampus, ne Nasalepithelium, ob = Riechkolben. Balken = 1 mm

Fig. 27: Stärkere Vergrößerung des 10,5 dcp Embryos von Fig. 25 a,b. Die Pfeile zeigen auf einen Bereich von geringer Expression in den Somiten (Pfeile in b) . Eine starke Expression ist in der Region zwischen Mesencephalon und Telencephalon ( "Forbrain-Midbrain-Junction" ) zu erkennen. Aod = Aorta dorsalis, me = Mesencephalon, sc = Rückenmark, te = Telencephalon. Balken = 100

Fig. 28: Expression des T-Gens während der Entwicklung des Nervensystems. Expression des T-Gens in Neuronen der Mantelzone des sich entwickelnden Gehirns und in Nuclei von peripheren Nerven (Pfeil in b) . In proliferierenden Neuronen in der subventrikulären Schicht oder in migrierenden Neuronen der Intermediate-Zone (c,d) ist keine Expression sichtbar. Am Tag 16,5 dcp ist eine starke Expression in sich differenzierenden Neuronen der Mantelzone des Telencephalons sichtbar (e,d) . Weiterhin ist eine Expression in Neuronen des Rückenmarks und der Spinalganglien sichtbar (g,h) . Desweiteren ist eine geringe Expression in einer einzelnen Schicht unter der Haut sichtbar (g,h). iz = Intermediatzone, mz = Mantelzone, sc = Rückenmark, sga = Spinalganglien, sk = Haut, svl = Subventricularschicht , vn = Ventrikel. Balken = 100 μm.

BEISPIEL 4: Herstellung von Antikörpern

Mit einen synthetisch hergestellten Peptid der Sequenz "EKGEDPETRRMRTVKNIAD " werden Tiere zur Erzeugung von Antikörpern gegen das T-Protein wie folgt immunisiert:

Immunisierunqsprotokoll für polyklonale Antikörper im

Kaninchen

Pro Immunisierung werden 600 μg gereinigtes KLH-gekoppeltes

Peptid in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund 's Adjuvans eingesetzt.

Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund ' s Adjuvans) Tag 14: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund' s Adjuvans; icFA)

Tag 28 3. Immunisierung (icFA) Tag 56 4. Immunisierung (icFA) Tag 80 Ausbluten

Das Serum des Kaninchens wird im Immunoblot getestet. Hierzu wird das zur Immunisierung eingesetzte Peptid einer SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys . Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al . , Virus Genes 8, (1994), 215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wird das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist das Serum des Kaninchens (1:10000 in PBS) . Nach mehreren Waschschritten mit PBS wird das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist ein mit alkalischer Phospha- tase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen-IgG- Antikörper (Dianova) (1:5000) in PBS. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C folgen mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36μM 5' Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat , 400μM Nitroblau-tetrazolium, lOOmM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar werden .

Es zeigt sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können.

Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn Pro Immunisierung werden 100 μg gereinigtes KLH-gekoppeltes Peptid in 0,8 ml PBS und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund 's Adjuvans eingesetzt. Tag 0. 1. Immunisierung (komplettes Freund' s Adjuvans)

Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund' s Adjuvans; icFA)

Tag 50: 3. Immunisierung (icFA)

Aus Eigelb werden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es werden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen.

Immunisierunqsprotokoll für monoklonale Antikörper der Maus Pro Immunisierung werden 250 μg gereinigtes KLH-gekoppeltes Peptid in 0,25 ml PBS und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund' s Adjuvans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung ist das Peptid in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.

Tag 0. 1. Immunisierung (komplettes Freund ' s Adjuvans)

Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund' s Adjuvans; icFA)

Tag 56: 3. Immunisierung (icFA)

Tag 84: 4. Immunisierung (PBS) Tag 87 : Fusion

Überstände von Hybridomen werden im Western Blot getestet. Erfindungsgemäße, monoklonale Antikörper werden nachgewiesen.

BEISPIEL 5: Immunhistochemische Untersuchungen

Mit einem wie oben hergestellten äffinitätsgereinigten polyklonalen Kaninchenantikörper gegen das T-Protein (nachfolgend Erstantikörper genannt) wurden die in Fig. 24 gezeigten immunhistochemisehen Untersuchungen gemacht. Mausgehirn wurde entnommen und wie folgt behandelt.

l.Tag

Schnittdicke 6-10 μm, übliche Fixierung auf Objektträgern,

Aufbewahrung bis etwa 2 Monate in -80°C Schnitte am Abend vorher rausnehmen und über Nacht bei RT trocknen lassen

Objektträger in PBS spülen, abkippen, nochmal spülen, danach

10 min in PBS stehen lassen, Objektträger herausnehmen und um das Gewebe herum die

Flüssigkeit mit einem Tuch abwischen.

Mit PAP-PEN (Eiweiß-Glycerin; Fa. Dako) einkreisen, daß keine

Flüssigkeit mehr herauslaufen kann.

100 μl Peroxidase Blocking Solution (Fa. Dako, Hamburg) zugeben, 20 min inkubieren

Objektträger in PBS spülen, abkippen, nochmals spülen, danach

10 min in PBS stehen lassen.

Objektträger herausnehmen und um das Gewebe herum die

Flüssigkeit mit einem Tuch abwischen. Normal- (Schaf ) -Serum mit PBS 1:10 verdünnen (z.B. Schaf Dako

X0503, Fa. Dako Hamburg), 100 μl hiervon zugeben und 20 min inkubieren

Objektträger in PBS spülen, abkippen, nochmal spülen, danach

Flüssigkeit mit einem Tuch abwischen.

Erstantikörper in einer Verdünnungen von 1:100 zugeben.

100 μl Erstantikörper zugeben (in PBS) und im Kühlschrank in feuchter Kammer über Nacht inkubieren. Kontrolle: ohne Erstantikörper

2. Tag

Feuchte Kammer aus dem Kühlschrank nehmen und bei RT stehen lassen. Objektträger in PBS spülen, abkippen, nochmal spülen, danach 10 min in PBS stehen lassen, wenn viele Objektträger analysiert werden, zweimal mit PBS waschen.

Objektträger herausnehmen und um das Gewebe herum die Flüssigkeit mit einem Tuch abwischen.

Zweitantikörper 'Antirabbit-Biotinyliert ' 1:100 (Fa. Amersham, Braunschweig) in PBS verdünnen und 100 μl davon zugeben. 45 min in feuchter Kammer bei RT inkubieren. Objektträger in PBS spülen, abkippen, nochmal spülen, danach 10 min in PBS stehen lassen,

Streptavidin-Peroxidase (Streptavidin-horseraddish) (Fa. Amersham, Braunschweig) 1:100 mit PBS verdünnen und 100 μl davon zugeben.

45 min in feuchter Kammer bei RT inkubieren. Objektträger in PBS spülen, abkippen, nochmals spülen, danach 10 min in PBS stehen lassen,

Färben : Pro ml Puffer einen Tropfen Chromogen kurz vor

Benutzung zugeben. Vortexen und dunkel stellen.

100 μl Färbelösung (Fa. Dako, Hamburg) zugeben. Zum Schluß die

Kontrolle färben. Etwa 2 min inkubieren.

Objektträger in Wasser inkubieren. Unter dem Mikroskop anschauen.

1-2 Tropfen Crystal Mount auf Schnitt geben. Falls eine Luftblase vorhanden ist, mit einem Papiertaschentuch absaugen. Der Rest des Objektträgers wird mit HCl-EtOH zur Entfernung der Farbe abgewischt.

Auf Deckgals einen Strich Klebstoff (Eukitt) geben. Deckglas auf Objektträger ohne Erzeugung von Luftblasen andrücken.

Das Enzym am Zweitantikörper führt zu einer Farbstoffbildung (DAB) , wodurch das T-Protein nachgewiesen werden kann.

Fig. 24 (a-d) : lichtmikroskopische Aufnahmen, die zeigen, dass das T-Protein im oder am Kern der Zelle lokalisiert ist. Die elekronenmikrospopsiche Aufnahme in e zeigt, dass das T- Protein nicht im Kern, sondern in der Membran lokalisiert ist. Die Bilder sind in sehr guter Übereinstimmung mit einer Funktion als membranständiges Kernporenprotein. Die Pfeile in e zeigen den gebildeten Farbstoff , der auf der cytoplasmatischen Seite der Kernmembran zu sehen ist.

Claims

Patentansprüche

1. DNA-Sequenz, die ein Protein codiert, das an der Entwicklung des Nervensystems, insbesondere des ZNS, beteiligt ist und gewebe- und entwicklungsspezifisch exprimiert wird, wobei die DNA-Sequenz folgende DNA- Sequenzen umfaßt:

(a) die DNA-Sequenz von Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3,

Fig. 4, Fig. 5, Fig. 6, Fig. 7 oder Fig. 8;

(b) die DNA-Sequenz von Fig. 9 oder Fig. 10;

(c) die DNA-Sequenz von Fig. 11;

(d) die DNA-Sequenz von Fig. 12 oder Fig. 13; (e) die DNA-Sequenz von Fig. 14 oder Fig. 15,

(f) die DNA-Sequenz von Fig. 16,

(g) die DNA-Sequenz von Fig. 17 oder 18, (h) die DNA-Sequenz von Fig. 19,

(j) Fragmente, Varianten, funktioneile Äquivalente, Derivate oder Vorläufer der DNA- Sequenz von (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f ) , (g) , (h) oder (i) ; oder (k) eine DNA-Sequenz, die sich von der DNA-Sequenz von (a), (b), (c) , (d) , (e) , (f ) , (g) , (h) , (i) oder (j) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, die ein Protein bzw. Peptid codiert, das die Aminosäuresequenz von Fig. 1, Fig. 9, Fig. 11, Fig, 12, Fig. 13, Fig. 14, Fig. 15, Fig. 16, Fig. 17, Fig. 18 oder Fig. 19 umfaßt, wobei das Protein bzw. Peptid die in Anspruch 1 definierte biologische Aktivität hat.

3. Antisense-RNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie zu der DΝA-Sequenz von Anspruch 1 oder 2 komplementär ist und die Synthese des von dieser DNA-Sequenz codierten Proteins verringern oder hemmen kann.

Ribozym, dadurch gekennzeichnet, daß es zu der DNA- Sequenz von Anspruch 1 oder 2 komplementär ist und an die von dieser DNA-Sequenz transkribierte RNA spezifisch binden und diese spalten kann, wodurch die Synthese des von dieser DNA-Sequenz codierten Proteins verringert oder gehemmt wird.

5. Expressionsvektor, die DΝA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 enthaltend oder die Antisense-RNA nach Anspruch 3 oder das Ribozym nach Anspruch 4 codierend.

6. Expressionsvektor nach Anspruch 5, wobei dieser zusätzlich den Promotor des humanen T-Gens oder eines Orthologen des T-Gens beinhaltet.

7. Expressionsvektor nach Anspruch 5 oder 6, der das T- , T2- oder T3-Protein oder Fragmente davon in Form eines

Reporterfusionsproteins kodiert.

8. Wirtszelle, die mit dem Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 5-7 transformiert ist.

9. Protein, das von der DΝA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 codiert wird und das an der Entwicklung des Nervensystems beteiligt ist und gewebe- und entwicklungsspezifisch exprimiert wird bzw. Fusionsproteine, Fragmente, Varianten, Derivate oder Vorläufer des Proteins.

10. Protein nach Anspruch 9, wobei dieses eines der folgenden Motive aufweist:

Motiv 1 (A,T) (I,P,V) (L,T) (G,A,Q) (L, V) XXX (L, V) Motiv 2 IYTDWAN Motiv 3 AXXXXXXXXXGXXXXXXAXXXXXXXXXXXXXXXXXXQ Motiv 4 SXXXXDX ( 12 , 20 ) KX ( 17 , 22 ) AXXXXXXXXL Motiv 5 IYTDWANXXLX (K, R) Motiv 6: KX(18,21)AXXXXXXXXLX(15,24)S Motiv 7: NX(3,11)SXXXAXXXXXXXL

mit : X = jede Aminosäure (A,T) = Aminosäure A oder T an dieser Stelle

X(Zahl 1, Zahl 2) = Zahl 1 bis Zahl 2 X's an dieser Stelle

11. Verfahren zur Herstellung des Proteins nach Anspruch 9, das die Züchtung der Wirtszelle nach Anspruch 8 unter geeigneten Bedingungen und die Gewinnung des Proteins aus der Zelle oder dem Zuchtmedium umfaßt.

12. Antikörper, der gegen das Protein nach Anspruch 9 gerichtet ist, oder Fragment davon.

13. Antikörper nach Anspruch 12, wobei dieser durch Immunisierung von Tieren mit einen Peptid mit der Sequenz "EKGEDPETRRMRTVKNIAD" erhalten wird.

14. Verwendung der DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, der Antisense-RNA nach Anspruch 3 , des Ribozyms nach Anspruch 4, des Expressionsvektors nach einem der Ansprüche 5-7, des Proteins nach Anspruch 9 oder des Antikörpers oder des Fragments davon nach Anspruch 12 oder 13 zur Prävention oder Behandlung von Erkrankungen des Nervensystems, insbesondere des ZNS.

15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Erkrankung des Nervensystems eine Tumorerkrankung des ZNS ist.

16. Verwendung nach Anspruch 14, wobei es sich bei der Behandlung von Erkrankungen des Nervensystems um die Förderung der neuronalen Regeneration bei Verletzungen des Nervensystems und bei degenerativen Erkrankungen des

Nervensystems hande11.

17. Verwendung nach Anspruch 14, wobei es sich bei der Behandlung von Erkrankungen des Nervensystems um die Wiederherstellung der neuronalen Verknüpfungen und der Wiederherstellung von angeborenen und erworbenen Fehlfunktionen des Nervensystems handelt.

18. Verwendung nach Anspruch 15 zur Hemmung des Wachstums und der Ausbreitung von Tumorzellen.

19. Diagnoseverfahren zum Nachweis einer gestörten Expression des Proteins nach Anspruch 9 oder zum Nachweis einer veränderten Form dieses Proteins, bei dem man eine Probe mit der DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 oder dem Antikörper oder dem Fragment davon nach Anspruch 12 oder 13 in Berührung bringt und sodann direkt oder indirekt bestimmt, ob sich die Konzentration des Proteins und/oder seine Aminosäuresequenz im Vergleich zu einer aus einem gesunden Patienten gewonnenen Protein unterscheiden.

20. Diagnostischer Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 19, der die DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 und/oder den Antikörper oder das Fragment davon nach Anspruch 12 oder 13 enthält.

21. Nicht-menschliches Säugetier, dessen natürlich vorkommendes T-, T2- oder T3-Gen eine Veränderung der

Genstruktur oder der Gensequenz aufweist.

22. Nicht-menschliches Säugetier, wobei eine Veränderung der Genstruktur des T-, T2- oder T3-Gens in dem Säugetier durch die Einführung einer Deletion, an dessen Stelle eine homologe oder heterologe Sequenz eingeführt wird, erreicht wird.

23. Nicht-menschliches Säugetier, wobei eine Veränderung der Genstruktur des T-, T2-oder T3-Gens durch Insertion einer homologen oder heterologen Sequenz in das in dem Säugetier natürlich vorkommenden entsprechenden Gen erreicht wird.

24. Nicht-menschliches Säugetier nach Anspruch 22 oder 23, wobei die heterologe Sequenz eine Selektionsmarkersequenz ist .

25. Nicht-menschliches Säugetier nach Anspruch 24, wobei die Selektionsmarkersequenz Resistenz gegen Neomycin vermittelt .

26. Verfahren zur Herstellung eines nicht-menschlichen Säugetiers nach einem der Ansprüche 21-25 gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

(a) Herstellung eines DNA-Fragments, insbesondere eines Vektors, enthaltend ein verändertes T-, T2- oder T3-Gen, wobei das T-, T2- oder T3-Gen durch

Insertion einer heterologen Sequenz, insbesondere eines selektierbaren Markers, verändert worden ist;

(b) Präparation embryonaler Stammzellen aus einem nicht-menschlichen Säuger (bevorzugt Maus); (c) Transformation der embryonalen Stammzellen von

Schritt (b) mit dem DNA-Fragment von Schritt (a) , wobei das T-Gen in den embryonalen Stammzellen durch homologe Rekombination mit dem DNA-Fragment von (a) verändert wird, (d) Kultivieren der Zellen von Schritt (c) ,

(f) Erzeugen chimerer nicht-menschlicher Säuger aus den Zellen von Schritt (e) durch Injektion dieser

Zellen in Säuger-Blastocysten (bevorzugt Maus- Blastozyten) , Übertragen der Blastozysten in pseudo-schwangere weibliche Säuger (bevorzugt Maus) und Analyse der erhaltenen Nachkommen auf eine Veränderung des T-, T2- oder T3-Gens.

27. Transgene Zelle oder Gewebe, die bzw. das in der Lage ist, ein T-Protein oder ein Teil des T-Proteins bzw. ein Orthologes davon zu exprimieren.

28. Verwendung des nicht-menschlichen Säugetiers nach einem der Ansprüche 21-25 oder der transgenen Zelle oder des transgenen Gewebes nach Anspruch 27 für die Analyse der

Funktion der T-Gen-Familie.

29. Verwendung des nicht-menschlichen Säugetiers nach einem der Ansprüche 21-25 oder der transgenen Zelle oder des transgenen Gewebes nach Anspruch 27 zur Identifizierung von Inhibitoren und Enhancern der T-Gen-Familie.

30. Vertebratengen sowie funktionelles Äquivalent, Derivat oder ein Bioprecursor davon, wobei diese für ein Protein kodieren, das eine statistisch signifikante

Aminosäuresequenzhomologie zum T-Gen, T2-Gen oder T3-Gen gemäß einer der Figuren Fig. 1, Fig. 9, Fig. 11, Fig, 12, Fig. 13, Fig. 14, Fig. 15, Fig. 16, Fig. 17, Fig. 18 oder Fig. 19 aufweist.

31. T-Gen und dessen Ve r t e br a t e n o r t h o 1 o g e und Vertebratenparaloge, die ein Kernporenprotein kodieren.

32. Vertebratenprotein, das eine Aminosäuresequenz gemäß Fig. 1 aufweist oder eine Aminosäuresequenz, die sich von der

Aminosäuresequenz in Figur 1 in einer oder mehreren Aminosäuren unterscheidet.

33. Vertebraten T-, T2- oder T3-Gen und das darin kodierte Protein, in allen seinen in der Natur vorkommenden allelischen und mutierten Formen.

34. Arzneimittel enthaltend ein Protein gemäß Anspruch 9 oder ein funktionelles Äquivalent, ein Fragment oder einen Bioprecursor davon in Kombination mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger.

35. Verfahren zur Identifizierung von Stoffen, die einen verstärkenden oder hemmenden Einfluß auf die Wirkung von T-Protein, T2-Protein oder T3-Protein haben, mittels

Bestimmung des bidirektionalen Transports durch die Kernporen, - Bestimmung der Bindung an Filamente der Zelle (z.B.

Aktinfilamente und Mikrotubuli) , oder Bestimmung der erhöhten bzw. verringerten Transkription von zellulären oder Reportergenen.

36. Verfahren zur Identifizierung von Stoffen, die einen verstärkenden oder hemmenden Einfluß auf die Wirkung von Proteinen haben, die mit dem T-Protein in direkter oder indirekter Weise funktioneil verbunden sind, oder parallele Signal- oder Funktionswege darstellen, mittels - Bestimmung des bidirektionalen Transports durch die

Kernporen,

Bestimmung der P h o s p h o r y 1 i e r u n g und Dephosphorylierung von Proteinen,

Bestimmung der Bindung des T-Proteins an Filamente der Zelle (z.B. Aktinfilamente und Mikrotubuli), oder

Bestimmung der erhöhten oder verringerten Transkription von zellulären oder Reportergenen.

37. Verfahren nach Anspruch 35 oder 36, wobei die veränderte Transkription mit Reportermolekülen, vorzugsweise dem Auftreten von bestimmten mRNAs oder dem EGFP-Protein, nachgewiesen wird.

38. Verfahren zur Identifizierung von weiteren Proteinen, die bei der Entwicklung und Funktion des Nervensystems eine Rolle spielen und/oder ein Kernporenprotein sind, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:

(a) Herstellen eines Antikörpers gegen ein Protein gemäß Anspruch 9 ,

(b) Kontaktieren eines Zellextrakts mit dem Antikörper und Identifizieren des Antikörper / Pro tein- Komplexes, (c) Analysieren des Komplexes, um ein Protein zu identifizieren, das an das Protein des Komplexes gebunden hat und kein Antikörper ist, und