JPH11503314A

JPH11503314A - ウイルスベクターおよび過増殖性疾患、特に再発性狭窄症を治療するための該ベクターの使用

Info

Publication number: JPH11503314A
Application number: JP8529747A
Authority: JP
Inventors: ディディエールブラネール; ケニスウォルシュ; ジェフリーエムイスナー; パトリスデネフル
Original assignee: ケースウェスターンリザーヴユニヴァーシティ
Priority date: 1995-03-31
Filing date: 1996-03-28
Publication date: 1999-03-26
Also published as: FR2732357B1; MX9707549A; US5851521A; OA10516A; AP9701117A0; EP0817791A4; SK132797A3; USRE37933E1; EP0817791A1; SI9620059A; CZ308897A3; FR2732357A1; WO1996030385A1; CN1190402A; BR9608449A; HUP9801767A2; CA2216878A1; AP1011A; AU5531596A; KR19980703454A

Abstract

(57)【要約】本発明はタンパク質GAX またはこのタンパク質の変異体の全部または一部をコードする少なくとも一つの挿入された遺伝子を含む欠損組換えウイルス、及び、特に血管形成後の再狭窄を治療するための、それらの治療上の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ウイルスベクターおよび過増殖性疾患、特に再発性狭窄症を治療するための該ベクターの使用本発明は、遺伝子療法によって、過増殖性疾患に関連する病理的状態を治療するための、新規かつ著しく効果的な方法に関する。この本発明の方法は、より特定的には、gax 遺伝子のインビボ転移による、血管平滑筋細胞(VSMC)の増殖を、特異的に遮断することからなる。この本発明の方法は、該血管壁内で、該gax 遺伝子を過度に発現させることによる、血管形成術後の再発性狭窄症の治療に対して極めて適した方法である。本発明によれば、該gax 遺伝子はウイルスベクターによって移入できる。これらベクターは、好ましくはアデノウイルスベクターである。結合して細胞分裂を阻止する、種々の遺伝子が単離されている。かくして、gas (成長−阻害特異的: gas 1-6)およびgadd(DNA損傷−誘発性: gadd34、gadd45およびgadd153)遺伝子は、静止期細胞、即ち該細胞サイクルのGO期に遮断される細胞において強く発現される(シュナイダー(Schneider)等，Cell，1988，54:787-7 93; デルサル(Del Sal)等，Cell，1992，12: 3514-3521;コウルド(Cowled)等，E xp．Cell Res.，1994，211:197-202; ブランコリニ＆シュナイダー(Brancolini and Schneider)，J．Cell Biol.，1994，124: 743-756;ツァン(Zhan)等，Mol．C ell Biol.，1993，13: 4242-4250;ジャックマン(Jackman)等，Cancer Res.，199 4，54: 5656-5662)。該gas-1 タンパクの微量注入は、DNA の合成を遮断する(デルサル(Del Sal)等，Cell，1992，70- 595-607)が、このことは遺伝子発現に関するこれらの上記発見と一致する。逆に、増殖因子、例えばPDGF（血小板由来の増殖因子）または子牛血清の添加は、インビトロモデルにおけるこれら遺伝子の発現を減少する（コクシア(Coccia)等，Mol．Cell Biol.，1992，12: 3514-3521 ）。細胞増殖状態と関連した、この発現の特異性は、インビボでもその等価物をもつものと思われる。従って、該gas-1 遺伝子は、卵巣摘出術に伴ってラットの子宮内で強く発現される(フェレロ＆カイロ(Ferrero and Cairo)，Cell Biol．Int.，1993，17: 857-862)。これと同一の動物モデルにおいて、エストロゲンによる治療は、子宮内での、プロトオンコジーンc-myc の発現の増大および該gas-1 遺伝子の発現における減少により反映される、細胞増殖をもたらす。同様に、増殖／再生の肝モデルでは、該gas-6 遺伝子の発現は、部分的肝切除術の４時間後に、即ちG0からG1への転移期に著しく減少し、この発現は、多分該肝細胞の分裂が一旦開始してしまえば、正常に戻るであろう（フェレロ(Ferrero)等，J．Cell Physiol.，1994，158: 263-269）。本出願人は、新規な遺伝子、即ちgax(増殖阻止−特異的ホメオボックス)遺伝子に興味をもち、この遺伝子が過増殖性疾患、特に再発性狭窄症の遺伝子療法で使用するのに特に有利な諸特性をもつことを今や明らかにした。このgax 遺伝子は、最初ラットの大動脈から調製されたcDNAライブラリー中で同定された。これは303 個のアミノ酸をもつタンパクをコードする。その配列は、すでに特徴付けされており、またそのcDNAはクローニングされている(ゴルスキー(Gorski)等，M ol．Cell Biol.，1993，6: 3722-3733)。このgax 遺伝子は、上記のgas およびg add遺伝子の特性と類似する諸特性を有する。というのは、該細胞サイクルにおける該G0/G1 転移を調節するものと考えられるからである。同様に、gax mRNAのレベルは、PDGFに暴露した２時間後に、ラットVSMCs における10倍の減少を示す (ゴルスキー(Gorski)等，Mol．Cell Biol.，1993，6: 3722-3733)。従って、該g ax 遺伝子の発現は、VSMCマイトジェン応答中は、阻止される。本発明の方法の利点の一つは、主として該gax 遺伝子の発現の特異性にある。かくして、成熟したラットでは、該gax 遺伝子は主として心血管（大動脈および心臓）系内で発現される。他方、ノーザンブロット法は、肝臓、脳、胃または骨格筋内でのgax mRNAの存在を明らかにすることはできなかった。血管形成術後の再発性狭窄症は、局所的な過増殖性疾患の一つであって、じゅく状硬化症性プラークをもつ領域での、非−外科的侵襲後に発現する。従って、じゅく状硬化症の病巣の血管形成術による治療は、該動脈壁に対する機械的な創傷形成に伴って、極めて高頻度での（幾つかの研究では、症例の50％までの）再発性狭窄症をもたらす。このメカニズムにおける重要な事象は、特に内膜の内皮細胞により行われる、保護および／またはフィードバックの欠如による、中膜の該血管平滑筋細胞 (VSMC)の、該内膜に向かう増殖および移動である。該VSMC細胞内での、本発明による、選択的に抗−増殖性遺伝子を発現する能力は、極めて大きな利点を表している。本発明の方法のもう一つの利点は、該gax 遺伝子がホメオ遺伝子群に属するという事実にある。これらの遺伝子は、転写因子をコードし、該因子は、該DNA の特定領域を認識する共通配列（またはホメオドメイン）を含む(概説：ゲーリング(Gehring)等，Cell，1994，78: 211-223)。該ラットgax タンパクの該ホメオドメインは、185 〜245 の範囲内のアミノ酸を含有する。興味あることに、これまでに同定されたホメオ遺伝子は、胚形成中の細胞分化／成長の調節に関与しており、従ってこのことは本発明の方法の治療上の可能性を高めている（概説：ローレンス＆モラタ(Lawrence and Morata)，Cell，1994，78: 181-189; クラムラーフ(Krumlauf)，Cell，1994，78: 191-201)。従って、本発明はまず、該GAX タンパクあるいはこのタンパクの変異体の全体またはその一部をコードする、少なくとも１種の挿入された遺伝子を含有する、欠陥をもつ組み換えウイルスに関する。本発明は、また過増殖性の病理的状態の治療における、かかるウイルスの利用にも関連する。本発明のウイルスにおいて、該挿人された遺伝子は、ゲノムDNA(gDNA)の相補D NA(cDNA)または、例えば１以上のイントロンが挿入されているcDNAからなるハイブリッド構築物であり得る。該遺伝子は、また合成または半合成配列からなることもできる。上に示したように、この遺伝子は、GAX タンパク、またはこのタンパクの変異体の全体または一部をコードする遺伝子であり得る。本発明で使用する意味の範囲内で、用語「変異体」とは、任意の変異体、フラグメントまたはペプチドを意味し、これは少なくとも一つのGAX の、並びに他の種から得られるGA X の任意の同族体の生物学的特徴を有する。これらのフラグメントおよび変異体は、当業者には公知の任意の方法によって、特に遺伝子的および／または化学的および／または酵素的な修飾、あるいはまた生物学的活性に従って変異体を選別可能なものとする、ハイブリダイゼーションまたは発現クローニングによって得ることができる。該遺伝子的な修飾は、サプレッション、欠失、変異等を包含する。本発明で使用する意味の範囲内において、該挿入された遺伝子は、好ましくはラットGAX タンパクまたはそのヒト同族体の全部または一部をコードする遺伝子である。より好ましくは、該挿入された遺伝子はcDNAまたはgDNAである。一般的に、該挿入された遺伝子は、また感染細胞内で発現できる配列をも含有する。これらの配列は、これらが該感染細胞内で機能できる場合には、当然のこととして該遺伝子の発現を司る配列であり得る。この配列は、異なる起源の配列（種々のタンパクの発現の原因となるものまたは合成タンパクを発現するもの）であってもよい。特に、該配列は、真核細胞またはウイルス遺伝子の配列、あるいは特異的または非−特異的様式で、および誘導性または非−誘導性の様式で、遺伝子の転写を刺激もしくは抑制する誘導配列であり得る。一例として、これらは感染させようとする細胞のゲノム由来の、あるいはウイルス遺伝子由来のプロモータ配列、特にアデノウイルスEIA およびMLP 遺伝子のプロモータ、該CMV またはLTR-RSV プロモータ等を含むことができる。同様に例示できる真核細胞のプロモータは、また偏在性プロモータ（HPRT、ビメンチン、アクチン、チューブリン等）、中間フィラメントプロモータ（デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、GFAP等）、治療遺伝子プロモータ(MDR型、CFRT、ファクタVIII)、組織特異的プロモータ（平滑筋細胞中のアクチンプロモータ）、細胞の分化中に選択的に活性化されるプロモータ、あるいは刺激に対して応答するその他のプロモータ（ステロイドホルモンレセプタ、レチノイン酸レセプタ等）である。更に、これらの発現配列は、活性化配列、調節配列等を付加することにより修飾することができる。また、該挿入された遺伝子が、如何なる発現配列をも含まない場合、これはこのような配列の下流側において、該欠陥ウイルスのゲノムに挿入することができる。更に、該挿入遺伝子は、一般的に該コード配列の上流側に、シグナル配列を含み、該シグナル配列は該合成されたポリペプチドをターゲット細胞の分泌路に誘導する。このシグナル配列は天然のGAX シグナル配列であり得るが、これは任意の他の機能性シグナル配列（例えば、チミジンキナーゼに対する遺伝子のシグナル配列）または人工的なシグナル配列であってもよい。本発明によるウイルスは欠陥をもつものであり、即ち該ターゲット細胞内で自律的に複製できないものである。一般的に、本発明の範囲内で使用される該欠陥ウイルスは、従って少なくとも該感染細胞内での、該ウイルスの複製に必要な配列に欠けている。これらの領域は、（完全にまたは部分的に）排除されるか、非 −機能性とされるか、あるいは他の配列、特に該挿入された遺伝子で置換することができる。好ましくは、このような情況にも拘らず、該欠陥ウイルスは、該ウイルス粒子を包膜するのに必要な、そのゲノムの配列を保持している。本発明によるウイルスは、アデノウイルス、アデノ−関連ウイルス(AAV)またはレトロウイルス由来のものであり得る。一つの好ましい態様によれば、該ウイルスはアデノウイルスである。アデノウイルスの種々の血清型が存在しており、その構造および特性は幾分変動する。これらの血清型の中で、本発明の範囲内で好ましく使用できるものは、タイプ２またはタイプ５ヒトアデノウイルス(Ad 2 またはAd 5)もしくは動物起源のアデノウイルス（特許出願WO94/26914を参照のこと）である。本発明の範囲内で使用することができ、かつ例示することのできる、動物起源のこれらアデノウイルスは、イヌ、ウシ、マウス(例えば、Mavl; ベアード(Beard)等，Virology ，1990，75:81)、ヒツジ、ブタ、鳥類または他のサル(例えば、SAV)由来のアデノウイルスである。好ましくは、動物起源のアデノウイルスは、イヌのアデノウイルス、より好ましくはCAV2アデノウイルス[例えば、マンハッタン(Manhattan) またはA26/61株(ATCC VR-800)]である。好ましくは、本発明の範囲内においてはヒト、イヌまたは混合起源のアデノウイルスを使用する。好ましくは、本発明の欠陥アデノウイルスは、該ITRs、包膜配列および対象とする核酸を含む。より一層好ましくは、本発明のアデノウイルスの該ゲノムにおいて、少なくとも該E1領域は非−機能性である。考察中の該ウイルス遺伝子は、当業者には周知の任意の技術、特に完全除去、部分的欠失または考察中の遺伝子への、１以上の塩基の付加によって、非−機能性のものとすることができる。このような修飾は、例えば遺伝子操作技術を利用して、あるいは変異誘発剤で処理することにより、インビトロ（単離したDNA 上）であるいはその場で達成することができる。他の領域、特にE3領域(WO95/02697)、E2領域(WO94/28938)、E4領域 (WO94/28152 、WO94/12649およびWO95/02697)およびL5領域(WO95/02697)を修飾することもできる。好ましい態様によれば、本発明のアデノウイルスは該E1およびE4領域における欠失を含む。もう一つの好ましい態様によれば、該アデノウイルスは、該E4領域および該GAX をコードする配列が挿入されている、該E1領域における欠失を含む（FR94 13355を参照）。本発明のウイルスにおいては、該E1領域における欠失は、好ましくはAd5 アデノウイルスの配列中のヌクレオチド455 〜3329に拡がっている。本発明によるこの欠陥組み換えアデノウイルスは、当業者には公知の任意の技術によって調製できる（レブレロ(Levrero)等，Gene，1991，101: 195; EP 185 ，573;グラハム(Graham)，EMBO J.，1984，3: 2917）。特に、これらは、アデノウイルスと、特に興味のある該DNA 配列を担持するプラスミドとの間の相同組み換えによって調製できる。該相同組み換えは、該アデノウイルスとプラスミドとの、適当な細胞系への同時トランスフェクションに従って実施される。使用される該細胞系は、好ましくは(i)該エレメントにより形質転換可能なものであり、かつ(ii)好ましくは組み換えられた形状で、該欠陥をもつアデノウイルスのゲノムの一部を補充することのできる配列を含んでいて、組み換えの危険性を排除すべきである。列挙できる細胞系の例は、ヒト胚腎細胞系 293(グラハム(Graham) 等，J．Gen．Virol.，1977，36: 59)(これは特にそのゲノムに組み込まれた、Ad 5 アデノウイルス(12%)の該ゲノムの左側部分を含む)あるいは例えば、特に特許出願WO 94/26914 およびWO 95/02697 に記載されているような、該E1およびE4機能を補充することのできる細胞系である。引き続き、増殖した該アデノウイルスを回収し、実施例に例示するような、標準的分子生物学的技術を利用して精製する。該アデノ−関連ウイルス(AAV)は、安定かつサイト−特異的な様式で、感染した細胞のゲノムに組み込まれた、比較的サイズの小さなDNA ウイルスである。これらは、細胞増殖、形態学、または分化に対して、如何なる作用も誘発することなしに、広範囲の細胞を感染することができる。その上、これらはヒトの病理には関与するものとは考えられない。このAAV ゲノムは、クローニング、配列決定および特徴付けされている。これは、約4700個の塩基を含み、各末端において、該ウイルスの複製起点として機能する、約145 個の塩基を含む逆方向末端反復 (ITR)領域を含む。該ゲノムの残部は、２つの基本的領域に分割され、これらは包膜機能を有する。即ち、該ゲノムの左半分は、ウイルスの複製および該ウイルス遺伝子の発現に関与するrep 遺伝子を含み、また該ゲノムの右半分は該ウイルスのカプシドタンパクをコードするキャップ(cap)遺伝子を含む。インビトロおよびインビボにて遺伝子を転写するための、該AAVs由来のベクターの使用は、文献に記載されている（特に、WO 91/18088 、WO 93/09239 、米国特許第4,797,368 号、同第5,139,941 号、EP 488,528号を参照のこと）。これらの出願は、種々のAAV-由来の構築物を記載しており、該構築物において、該rep および／またはcap 遺伝子は欠失しており、また対象とする遺伝子により置換されている。またこれら構築物は、インビトロ（培養細胞内への転移）またはインビボ（生物への直接的な転移）での、該対象とする遺伝子の転移のために使用される。本発明による該欠陥をもつ組み換えAAVsは、２つの逆方向末端反復(ITR) 領域と隣接した対象とする核酸配列を含有するプラスミドと、該AAV 包膜遺伝子 (repおよびcap 遺伝子)を担持するプラスミドとを、ヒトヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）で感染した細胞系内に、同時にトランスフェクションすることにより調製される。生成した該AAV 組み換え体を、次に標準的な技術で精製する。従って、本発明はまた、AAV-由来の組み換えウイルスにも関連し、ここで該ウイルスのゲノムは、該AAV ITRsと隣接する、GAX をコードする配列を包含する。本発明は、またAAV 由来の２つのITRsと隣接する、GAX をコードする配列を包含するプラスミドにも関連する。このようなプラスミドは、これにより該GA X 配列を転写するために、そのまま利用することができ、適当な場合にはリポソームベクター（擬似−ウイルス）内に組み込まれる。組み換えレトロウイルスベクターの構築は、文献に広く記載されており、特に EP 453,242、EP 178,220、バーンシュタイン(Bernstein)等，Genet．Eng.，1985 7: 235; マッコーミック(McCormick)，BioTechnology，1985，3: 689等を参照できる。特に、該レトロウイルスは、分裂細胞に感染する、組み込みウイルスである。該レトロウイルスゲノムは、主として２つのLTRs、包膜配列および３つのコード領域(gag、pol およびenv)を含む。これらのレトロウイルス由来の組み換えベクターにおいて、該gag 、pol およびenv 遺伝子は、一般的に完全にまたは部分的に除去され、かつ対象とする異種核酸配列で置換される。これらのベクターは、種々の型のレトロウイルス、例えば特にMoMuLV（マウスモロニー(Moloney) 白血病ウイルス；MoMLV とも呼ばれる）、MSV(マウスモロニー(Moloney)肉腫ウイルス)、HaSV（ハーベイ(Harvey)肉腫ウイルス）、SNV(脾壊死ウイルス)、RSV( ラウス(Rous)肉腫ウイルス)またはその他のフレンド(Friend)ウイルスから構築できる。一般的に、本発明による、GAX をコードする配列を含有する組み換えレトロウイルスを構築するためには、特に該LTRs、包膜配列および該コード配列を含むプラスミドを構築し、次いで包膜細胞系と呼ばれるものをトランスフェクションするのに利用する。ここで、該細胞系は、トランスフェクションの際に、該プラスミドに欠乏するレトロウイルス機能を供給することができる。一般的に、この包膜細胞系は、このようにgag 、pol およびenv 遺伝子を発現することができる。このような包膜細胞系、特に細胞系PA317(米国特許第4,861,719 号)、PsiCRIP 細胞系(WO90/02806)およびGP+envAm-12 細胞系(WO89/07150)は、公知技術に記載されている。更に、これらの組み換えレトロウイルスは、転写活性抑制のための LTRs並びに該gag 遺伝子の一部を含む広範な包膜配列内での修飾を含むことができる(ベンダー(Bender)等，J．Virol.，1987，61: 1639)。製造された組み換えレトロウイルスは、次に標準的な技術により精製される。再発性狭窄症の治療のために、欠陥をもつ組み換えアデノウイルスを使用することは、極めて有利である。かくして、アデノウイルスは増殖中の血管平滑筋細胞に感染する高い能力をもつ。このことは、該活性成分（組み換えアデノウイルス）を比較的小量で使用することを可能とし、かつまた治療すべきサイト上での効果的かつ極めて迅速な作用をもたらす。本発明のアデノウイルスは、また高濃度で該導入されたgax 遺伝子を発現することができ、結果として極めて効果的な治療作用を与える。更に、そのエピソーム特性のために、本発明のアデノウイルスは、該増殖細胞内に、限られた時間内存続するに過ぎず、結果として該所定の治療効果にとって全く適した一時的な効果を有する。本発明は、また１種以上の欠陥をもつ組み換えウイルス、例えば上記のような組み換えウイルスを含む薬理組成物にも関する。このような組成物は、局所、経口、非経口、経鼻、静脈内、筋肉内、皮下、眼内等の種々の経路で投与するという観点で処方できる。好ましくは、本発明の組成物は、注射可能な処方、特に血管壁内に注入するために、製薬上許容された賦形剤を含む。これらの賦形剤は、特に滅菌された、等張性の塩溶液（燐酸一ナトリウムまたは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウムまたはマグネシウム等またはかかる塩の混合物）、あるいは必要な場合に滅菌水または生理塩水の添加によって注射可能な溶液を得ることのできる、乾燥された、特に凍結乾燥された組成物であり得る。この賦形剤は、またヒドロゲルであり得、該ヒドロゲルは任意の生体適合性または非−細胞毒性（ホモまたはヘテロ）ポリマーから調製される。このようなポリマーは、例えば特許出願WO93/08845に記載されている。その幾つか、例えば特にエチレンおよび／またはプロピレンオキサイドから得られるものが市販品として入手できる。過増殖性疾患と関連した病理的状態を治療するための該組成物の使用においては、本発明による該欠陥をもつ組み換えアデノウイルスは、種々の方法、特に注射により投与することができる。好ましくは、該再発性狭窄症状の治療のためには、本発明のアデノウイルスは、直接血管壁に投与される。この直接的投与は、該アデノウイルスで飽和された、親水性フィルム（例えば、ヒドロゲル）で被覆されている血管形成術用のバルーンによって、あるいは該アデノウイルス溶液の注入チャンバーを含む任意の他のカテーテルによって実施でき、かくして正確な方法で処置すべきサイトに適用でき、かつ該アデノウイルスを局所的かつ効率的に、治療すべき細胞のレベルで解放することを可能とする。この投与法は、再発性狭窄症の治療にとって好ましいターゲットを構成する、該中膜の細胞を高い割合（9.6%まで）で感染することを、有利に可能とし、一方で投与の標準的な方法（例えば、静脈内投与）は、これら細胞を、任意の非常に有意の程度に、感染させることを可能としない。本発明の治療方法は、有利には組み換えアデノウイルスで飽和されたヒドロゲルを含有する組成物を、治療すべきサイトに導入する工程からなる。該ヒドロゲルは、例えば外科的侵襲中に、治療すべき組織の表面に、直接堆積し得る。有利には、該ヒドロゲルは、カテーテル、例えばバルーンカテーテルによって、特に血管形成時点において、該治療すべきサイトに導入する。特に有利な方法においては、該飽和ヒドロゲルは、バルーンカテーテルによって、該治療すべきサイトに導入される。該注入のために使用されるウイルスの投与量は、種々のパラメータ、特に使用した投与モード、および所定の治療期間に従って調節できる。一般的には、本発明による組み換えウイルスは、10⁴〜10¹⁴pfu/mlの範囲の投与量として処方されかつ投与される。AAVsおよびアデノウイルスお場合には、10⁴〜10¹⁵pfu/mlなる投与量を使用できる。用語「 pfu(プラーク形成単位)」とは、ビリオンの懸濁液の感染力に対応し、また適当な細胞培養物を感染させ、一般的には48時間後に感染された細胞のプラーク数を測定することにより決定される。ウイルス溶液の該pf u力価を測定するための技術は、文献に十分に記載されている。本発明は、新規かつ非常に効率的な、過増殖性疾患、例えば再発性狭窄症と関連した病理的状態を治療し、もしくは予防するための手段を提供する。更に、この治療は任意の動物、例えばヒツジ、ウシ、飼い馴らされた動物（イヌ、ネコ等）、ウマ、魚等と同様に、ヒトにも関連付けることができる。本発明は、例示的なものであって、本発明を制限するものではない、以下に与えられる実施例を使用して、より完全に説明される。図面の説明図１：プラスミドｐＣＯ１の図示。図２：プラスミドｐＸＬ−ＣＭＶ−Ｇａｘ^HAの図示。図３：ｐＸＬ−ＣＭＶ−Ｇａｘ^HAでトランスフェクトしたＶＳＭＣのＧＡＸ −ＨＡタンパク質の核の位置。図３Ａ：ベクターｐＣＧＮでトランスフェクトしたＶＳＭＣ（ＧＡＸ挿入断片がない）。図３Ｂ：ベクターｐＸＬ−ＣＭＶ−Ｇａｘ^HAでトランスフェクトしたＶＳＭＣ。図４：Ａｄ−ＣＭＶ−Ｇａｘで処理したＶＳＭＣのＧＡＸ−ＨＡタンパク質の核の位置。図５：ＶＳＭＣの増殖に関するＡｄ−ＣＭＶ−Ｇａｘの影響(ｔ＝２４時間) 。 − Ａｄ−ＣＭＶ−Ｇａｘ（１０００ｐｆｕ／細胞）又は対照アデノウイルス（Ａｄ−ＲＳＶ−βＧａｌ、１０００ｐｆｕ／細胞）で処理した２４時間後にＶＳＭＣを計数する。細胞増殖を阻止（0.5％ＦＣＳ）又は刺激(ＦＣＳ２０％)する。図６：ＶＳＭＣの増殖に関するＡｄ−ＣＭＶ−Ｇａｘの影響(ｔ＝４８時間) 。 − Ａｄ−ＣＭＶ−Ｇａｘ（１０００ｐｆｕ／細胞）又は対照アデノウイルス（ＡＤ−ＲＳＶ−βＧａｌ、１０００ｐｆｕ／細胞）で処理した４８時間後にＶＳＭＣを計数する。細胞増殖を阻止（0.5％ＦＣＳ）又は刺激(ＦＣＳ２０％)する。図７：ウシ胎児血清（ＦＣＳ２０％）の存在下にインキュベートされるＶＳＭＣの生存度に関するＡｄ−ＣＭＶ−Ｇａｘの影響。 − 実験条件、図６参照。図７Ａ：アデノウイルスで処理されない細胞。図７Ｂ：Ａｄ−ＲＳＶ−βＧａｌで処理される細胞。図７Ｃ：Ａｄ−ＣＭＶ−Ｇａｘで処理される細胞。図８：バルーンカテーテルによる損傷後のラット頸動脈に関するＡｄ−ＣＭＶ−Ｇａｘ及びＡｄ−ＲＳＶ−βＧａｌの影響。図８Ａ：内膜表面積の測定。図８Ｂ：内膜／培養液の比率の測定。図８Ｃ：管腔狭窄の測定。図９：対照及び処理血管の動脈断面。図９Ａ：Ａｄ−ＲＳＶ−βＧａｌ処理対照血管。図９Ｂ：Ａｄ−ＣＭＶ−Ｇａｘ処理血管。一般的な分子生物学的手法分子生物学において用いられる標準法、例えば、プラスミドＤＮＡの分取用抽出、塩化セシウム勾配でのプラスミドＤＮＡの遠心分離、アガロース又はアクリルアミドゲルによる電気泳動、電気溶出によるＤＮＡ断片の精製、フェノール又はフェノール／クロロホルムによるタンパク質の抽出、エタノール又はイソプロパノールを用いる塩類培養液中でのＤＡＮの沈殿、大腸菌中での形質転換等は、当業者に周知であり、文献に詳細に記載されている[Maniatis T.ら，“Molecu lar Cloning，A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク，1982; Ausubel F.M.ら，(eds)，“Cur rent Protocols in Molecular Biology”，John Wiley & Sons，ニューヨーク， 1987]。ｐＢＲ３２２及びｐＵＣタイプのプラスミド及びＭ１３系のファージは、市販のものを入手した(Bethesda Research Laboratories)。連結反応の場合には、ＤＮＡ断片が、アガロース又はアクリルアミドゲルの電気泳動でサイズに応じて分離され、フェノール又はフェノール／クロロホルム混合液で抽出され、エタノールで沈殿し、次に、製造業者の推奨に従ってＴ４ＤＮＡリガーゼ(Biolabs)の存在下にインキュベートされる。５′突出端は、製造業者の説明書に従ってE．coli ＤＮＡポリメラーゼＩ(Bio labs)のクレノウフラグメントを用いて挿入される。３′突出端は、製造業者の推奨に従って用いられるＴ４ＤＮＡポリメラーゼ(Biolabs)の存在下に破壊される。５′突出端は、Ｓ１ヌクレアーゼで注意して処理されることにより破壊される。合成オリゴデオキシヌクレオチドを用いる試験管内部位特異的突然変異誘発は、Amershamから販売されたキットを用いてTaylorら[Nucleic Acids Res．13（19 85）8749-8764]によって開発された方法に従って行われる。ＰＣＲ[ Polymerase-catalyzed chain reaction，Saiki R.K．ら，Science 2 30 （1985）1350-1354; Mullis K.B．& Faloona F.A.，Meth．Enzym. 155（1987 ）335-350]と呼ばれる手法によるＤＮＡ断片の酵素による増幅は、製造業者の説明書に従ってＤＮＡサーマルサイクラー(Perkin Elmer Cetus)を用いて行われる。ヌクレオチド配列は、Amershamから販売されたキットを用いてSangerら[Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，74（1977）5463-5467]によって開発された方法によって確認される。実施例１：ＣＭＢプロモーターの制御下にラットｇａｘタンパク質をコード化する遺伝子を担持するベクターｐＸＬ−ＣＭＶ−Ｇａｘ^HAの構築本実施例は、ｇａｘタンパク質をコード化するｃＤＮＡ（種：ラット）及び組換えが起こることを可能にするアデノウイルス配列を含むベクターの構築を記載するものである。１８個のアミノ酸を含むインフルエンザウイルス血球凝集素のエピトープ（エピトープＨＡ１）は、ｇａｘタンパク質(Fieldら，Mol.Cell．Bi ol．8:2159-2165，1988)のＮ末端に付加される。このようにしてエピトープを付加すると、ｇａｘ発現が、特に、ＨＡ１エピトープに対向する抗体を用いる免疫蛍光法によって行われることを可能にする。その感受性のほかに、本方法は同時に内因性ｇａｘタンパク質の発現に対応するバックグラウンドノイズを生体外及び生体内の双方で除去することを可能にする。 1.１．プラスミドｐＣＯ１の構築Ａ−プラスミドｐＣＥの構築Ａｄ５アデノウイルスゲノムの左端に対応するＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片を、まず、ベクターｐＩＣ１９ＨのＥｃｏＲとＸｂａ部位間にクローン化した。これによりプラスミドｐＣＡが作成される。次に、プラスミドｐＣＡをＨｉｎｆＩで切断し、その５′突出端にE．coli ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて挿入した。次に、ＥｃｏＲＩで切断した。次に、このように作成されＡｄ５アデノウイルスゲノムの左端を含むプラスミドｐＣＡの断片を、ベクターｐＩＣ２０Ｈ(Marshら，Gene 32（1984）481)のＥｃｏＲＩとＳｍａＩ部位間にクローン化した。これによりプラスミドｐＣＢが作成される。次に、プラスミドｐＣＢをＥｃｏＲＩで切断し、その５′突出端にE．coli ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて挿入した。次に、ＢａｍＨＩで切断した。次に、このように作成されＡｄ５アデノウイルスゲノムの左端を含むプラスミドｐＣＢの断片を、ベクターｐＩＣ２０ＨのＮｒｕＩとＢｇｌＩＩ部位間にクローン化した。これによりプラスミドｐＣＥが作成され、その有利な特性はＡｄ５アデノウイルスの最初の３８２塩基対に続いて多重クローニング部位をもつことである。Ｂ−プラスミドｐＣＤ′の構築Ａｄ５アデノウイルスのゲノムからのＳａｕ３Ａ（３３４６）／ＳｓｔＩ（３６４５）とＳｓｔＩ（３６４５）／ＮａｒＩ（５５１９）断片を、まず、一緒に結合すると共にベクターｐＩＣ２０ＨのＣｌａＩとＢａｍＨＩ部位間にクローン化してプラスミドｐＰＹ５３を作成した。次に、Ｓａｕ３Ａ（３３４６）とＴａｑＩ（５２０７）部位間にＡｄ５アデノウイルスゲノムの一部を含むプラスミドｐＰＹ５３からのＳａｌＩ／ＴａｑＩ断片（ダムバックグラウンドから調製した）を、ベクターｐＩＣ２０ＨのＳａｌＩとＣｌａＩ部位間にクローン化してプラスミドｐＣＡ′を作成した。次に、ダムバックグラウンドから調製したＡｄ５アデノウイルスゲノムのＴａｑＩ（５２０７）／ＮａｒＩ（５５１９）断片とプラスミドｐＣＡ′からのＳａｌＩ−ＴａｑＩ断片を一緒に結合し、ベクターｐＩＣ２０ＨのＳａｌＩとＮａｒＩ部位間にクローン化した。これによりプラスミドｐＣＣ′が作成される。次に、ダムバックグラウンドから調製したＡｄ５アデノウイルスゲノムのＮａｒＩ（５５１９）／ＮｒｕＩ（６３１６）断片とプラスミドｐＣＣ′のＳａｌＩ／ＮａｒＩ断片を一緒に結合し、ベクターｐＩＣ２０ＲのＳａｌＩとＮｒｕＩ部位間にクローン化した。これによりプラスミドｐＣＤ′ が作成される。Ｃ−プラスミドｐＣ０１の構築プラスミドｐＣＤ′をＸｈｏＩで部分的に消化し、次にＳａｌＩで完全に消化するとＳａｕ３Ａ（３４４６）部位からＮｒｕＩ（６３１６）部位までのＡｄ５アデノウイルス配列を含む制限断片が作成される。この断片をプラスミドｐＣＥのＳａｌＩ部位にクローン化した。これによりプラスミドｐＣＯ１（図１）が作成され、ＨｉｎｆＩ（３８２）部位までのＡｄ５アデノウイルスの左側部分、多重クローニング部位及びＡｄ５アデノウイルスのＳａｕ３Ａ（３４４６）／ＮｒｕＩ（６３１６）断片を含む。 1.２．ベクターｐＸＬ−ＣＭＶ−Ｇａｘ^HA（図２参照）の構築ＧａｘｃＤＮＡを、ベクターｐＣＧＮ(Tanaka & Harr，Cell 60:375-386，199 0)のＸｂａＩとＢａｍＨＩ部位間にクローン化した。得られたベクター、ｐＧＣＮ−Ｇａｘは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーター及びエンハンサー配列（−５２２、＋７２；Boshart ら，Cell，41:521-530，1985）を含み、ＡＵＧ開始コドン及び最初の３個のアミノ酸を含む単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼのリーダー配列（＋５５、＋１０４；Rusconi & Yamamoto，EMBO J .，6:1309-1315，1987）、ＨＡ１エピトープをコード化する配列[YPYDVPDYASLGG P(配列番号１)]、ラットｇａｘｃＤＮＡ、最後にウサギβ−グロビン遺伝子のポリアデニル化配列(Paeboら，Cell，35:445-453，1983)を含む。次に、ベクターｐＣＧＮ−ＧａｘをＸｍｎＩとＳｆｉＩで切断し、プロモーター、ｃＤＮＡ及びポリアデニル化配列を含む得られた断片をクレノウで処理した後、組換えに必要とされるアデノウイルス配列を含むシャトルベクターｐＣｏ１のＥｃｏＲＶ部位に導入した。得られたプラスミドを、ｐＸＬ−ＣＭＶ−Ｇａｘ^HA と称した（図２参照）。実施例２：プラスミドpXL-CMV-gax-HAの増殖抑制特性の実証この実施例は発現（gax タンパク質及びHAエピトープの検出）及び活性（細胞増殖に対する効果）に関する相同組換えベクター（実施例１を参照のこと）の性質をin vitroで一時に、また同時に実証するのに使用し得る操作を記載する。血管平滑筋細胞(VSMC)を、Chamley ら(Cell Tissue Res．177:503-522 1977) から採用した方法を使用してNZW ウサギ大動脈を酵素で消化することにより培養する。簡単に言えば、一旦除去した、ウサギ大動脈をコラゲナーゼ(コラゲナーゼII、Cooper Biomedical)の存在下で37℃で45分間インキュベートする。次いで第二の消化をコラゲナーゼ及びエラスターゼ(Biosys)の存在下で約２時間行い、それにより細胞懸濁液を生じる。細胞を20％のウシ胎児血清の存在下で維持し、 10回の継代の前に全ての試験（以下を参照のこと）について使用する。全てのこれらの実験において、平滑筋細胞を抗αSMアクチン抗体(F-3777 、Sigma)により免疫標識により特性決定する。発現ベクター（実施例１を参照のこと）の性質を確かめるために、gax タンパク質の存在及び位置を夫々の構築物について免疫蛍光により監視する。これを行うために、平滑筋細胞または3T3 細胞をDOSPA/DOPE混合物(リポフェクタミン、G ibco BRL)の存在下でプラスミドpXL-CMV-Gax^HA及びpCGNgax でトランスフェクトする。細胞を、ウシ胎児血清を欠いている培地中で４〜８時間（SMC について最適の期間：８時間）にわたってＤＮＡ／リポソーム複合体の存在下でインキュベートする。ウシ胎児血清の存在下で24時間インキュベートした後、細胞を顕微鏡スライド(Titertek)の上で更に24時間にわたって免疫蛍光を見ながら培養する。次いで細胞を４％のパラホルムアルデヒドの存在下で固定し、続いて0.1 ％のトリトンを添加することにより透過性にする。細胞をウシ血清アルブミン(BSA、Si gma)の存在下で飽和した後、抗HA抗体(12CA5、Boehringer Mannheim)そして次にフルオレセイン結合抗体を連続して添加する。 N1H3T3細胞及びウサギVSMCの一次培養物について同時に行った免疫蛍光実験は、プラスミドpCGNgax 及び“シャトル”プラスミドpXL-CMV-Gax^HAの両方が核中に配置されるタンパク質を実際にコードすることを実証する（図3A: 対照プラスミド；3B: プラスミドpXL-CMV-Gax^HAを参照のこと）。更に、pXL-CMV-Gax^HAでトランスフェクトされた細胞からの核タンパク質の抽出後に、本発明者らはウェスタンブロッティングによりHAエピトープに対し誘導された抗体で検出されるタンパク質を実証することができた。次いで細胞増殖に関する上記ベクターの効果を確かめた。これを行うために、コロニー形成を測定することに基く間接方法を使用した。簡単に言えば、NIH3T3 マウス胚細胞を使用して、Schweighoffer ら(Mol.Cell.Biol．1993，13:39-43) から採用された方法を使用するコロニー形成試験を行った。簡単に言えば、ネオマイシンに対する耐性に関する遺伝子を有するプラスミド及び過剰の関係するベクター(pCGNgaxまたはpXL-CMV-Gax^HA)で細胞を同時トランスフェクトする。G418 中の選択の期間後に、コロニーをカルボールフクシン（ジアグノスチカ(Diーagno stica),Merck）の溶液で染色し、カウントする。表１に示される、代表的な実験の結果はpCGNgax でトランスフェクトされた細胞の場合のコロニーの数の減少を実証する。実施例３：組換えアデノウイルスAd-CMVgax の構築実施例１で調製された、ベクターpXL-CMV-Gax^HAを続いて直線状にし、組換えのために、ヘルパー細胞(細胞系293)（これはアデノウイルスE1（E1A 及びE1B）領域によりコードされた機能をトランスで供給する）に欠損アデノウイルスベクターで同時トランスフェクトした。アデノウイルスAd-CMVgax を下記のプロトコルに従ってアデノウイルスAd.RSV βgal(Stratford Perricaudetら，J.Clin.Invest 90（1992）626)及びベクターp XL-CMV-Gax^HAの間のin vivo 相同組換えにより得た。酵素XmnIで直線状にされたベクターpXL-CMV-Gax^HA及びClaIで直線状にされたアデノウイルスAd.RSVβgalをリン酸カルシウムの存在下で細胞系293 に同時トランスフェクトして相同組換えを起こらせた。このようにして生じた組換えアデノウイルスをプラーク精製により選択した。単離後に、組換えアデノウイルスを細胞系293 中で増幅して、約10¹⁰ pfu/mlの力価を有する未精製の組換え欠損アデノウイルスを含む培養上澄みを得る。ウイルス粒子を既知技術（特に、Grahamら，Virology 52（1973）456を参照のこと）に従って塩化セシウム勾配で遠心分離により精製する。アデノウイルスAd -CMVgax を20％のグリセロール中で-80 ℃で貯蔵する。実施例４：アデノウイルスAd-CMVgax の増殖抑制特性の実証この実施例はgax タンパク質生産及び生物活性（細胞増殖に対する効果）に関する組換えアデノウイルスの性質を一時に、また同時に実証するのに使用し得る実験操作を記載する。ウサギ大動脈VSMCをアデノウイルスAd-CMVgaxHA 及び対照アデノウイルス(ad- RSV βGal：RSV プロモーターの制御下でβ−ガラクトシダーゼを発現する組換えアデノウイルス)の存在下でインキュベートし、これを培地(DMEM 、0.5 ％のF CS)中で希釈する。湿った雰囲気中で37℃で約１時間後に、アデノウイルス溶液を含む培地を吸引して除き、18時間から24時間までの期間にわたって培地(DMEM 、0.5 ％のFCS)により交換する。次いでFCS に富む培地（FCS の最終濃度：20％）を添加して細胞増殖を刺激し、細胞を24時間そして48時間後にカウントする。加えて、アデノウイルス溶液を添加した後24時間で、VSMCによるgax タンパク質の発現を実施例２に記載した技術、即ち、免疫蛍光による核標識（タンパク質の局在化）そしてまたウェスタンブロッティングにより監視する。組換えアデノウイルスにより生産されたタンパク質はHAエピトープを認識する抗体により有効に検出され、pCGNgax またはpXL-CMV-Gax^HAでトランスフェクトされるVSMCの核中で検出されるgax タンパク質と同じ電気泳動移動度を有する。図４はAd-CMVga x HAの存在下でインキュベートされるVSMC中のGax タンパク質の位置を示す。図４に示される、代表的な実験の結果は、Ad-CMVgax HAウイルスの添加後の細胞の数の著しい低下を示す。一方、細胞の数のこの減少は同じ濃度(M.0.I．1000 )で使用した対照アデノウイルスによる処理後に観察されない。本発明者らは、平行して、免疫蛍光により、この高い感染多重度がβ-galマーカー遺伝子(抗E.c oliβ-gal抗体、モノサン(Monosan)の使用）またはgax タンパク質（抗HA抗体の使用、実施例２を参照のこと）をウサギVSMC集団の90％より多い中で発現させることを証明した。 ad-RSV- βgal ウイルスの添加は、ウシ胎児血清(20 ％)の存在下で24時間培養した後の弱い細胞静止作用（約13％）と関連している。同じ実験条件下で、Ad -CMVgax HAによる処理は細胞の数の57％減少をもたらす（図５を参照のこと）。 Ad-CMVgax HAウイルスの生物活性は培養の48時間後に非常に明らかに強調され、細胞死滅と一層関連し得る（図６及び７を参照のこと）。こうして、Ad-CMVgax HAにより引き起こされる増殖のブロッキングは、24時間の期間にわたる培養後に検出し得る細胞の数の顕著な減少と関連している（図５を参照のこと）。重要なことに、Ad-CMVgax HAのこの作用は高濃度(20 ％)のFCS で刺激される細胞中で観察されるが、FCS の減少される細胞(0.5％)では観察されない（図６を参照のこと）。それ故、この実施例は、gax タンパク質をコードする組換えアデノウイルスが細胞（これらはそれらのサイクルのG0期でブロックされる）の生存度に有意な作用を有しないで細胞分裂を有効にブロックし得ることを実証する。培養中のVSMCの生存度に関するAd-CMVgax HAアデノウイルスの作用がまた図７により示される。ＤＮＡの合成に関するAd-CMVgax HAの抑制特性をブロモデオキシウリジン(Brd U)-とり込み実験により確認する。簡単に言えば、アデノウイルスを添加した後2 4時間で、VSMCをFCS（10 〜20％）及びBrdU(10μM)（これはＤＮＡ合成期にチミンに代えて細胞にとり込まれ、特定の抗体で検出し得る）の存在下でインキュベートする。BrdUとり込みをフローサイトメトリーにより定量する。同じフローサイトメトリー方法がAd-CMVgax HA処理されたウサギVSMCによりそれらの細胞サイクル中になされた進行を視覚化するのに使用し得る。Ad-CMVgax HAによる処理はG0/G1 期中の細胞サイクルの阻止により伴われる。実施例５：アデノウイルス-gaxを使用する血管内膜肥厚のin vivo 抑制この実施例は血管病理学のモデルにおける組換えアデノウイルスの効力を示す。使用した動脈病変のモデルはラット頚動脈の表皮剥脱にある(Clowsら，Lab Inー verst 49（1983）327-333)。このモデルにおいて、VSMCは逆分化し、増殖し、移動して、外傷の２週間以内に動脈を部分的に閉塞し得る新内膜を形成する。 SDラットをペントバルビタール(45mg/kg)の腹腔内注射により麻酔した。外部頸動脈切開後に、ラット頸動脈をバルーンカテーテルで表皮剥脱し、1.10⁹ pfu のAd-CMVgax HAまたはAd-RSV- βGal に露出した。アデノウイルスを、15％のポロキサマー407(これはアデノウイルス遺伝子移入を促進する)を含む溶液中で使用する。20分のインキュベーション後に、ウイルス溶液を抜取り、結紮糸を除去して循環を回復した。ラットを２週間後に犠牲にし、定量的生物形態計測分析を処理した血管の切片断面について行った。結果を図８及び９に示す。得られた結果は、全ての９のAd-RSV- βGal トランスフェクト頸動脈が強いVS MC増殖を有し、かなりの新内膜肥大を発生したことを示す。新内膜の面積は0.10 〜0.28の範囲で0.186 ±0.02 mm²(SEM)であった。それに応じて、管腔開通性(pa tentency)は40±４％（範囲21〜63）だけ狭くされた（図8C）。内膜：中膜比は1 .51±0.1（範囲0.87〜2.17）であった。これらの結果は食塩水処理対照血管中で既に得られた結果と同様である。対照的に、Ad-CMVgax HA処理はバルーン外傷に対する病的応答を著しく減少した。Ad-CMVgax HA処理血管について、新内膜病変の平均面積は0.076 ±0.02 mm²（範囲０〜0.19）であり、管腔狭化は17.5 ±５％に減少された。統計分析は、Ad-CMVgax HA処理がAd-RSV- βGal 対照に対し内膜肥大の発生を有意に抑制することを確かめた。詳しくは、Ad-CMVgax HAによる処理は内膜：中膜比を69％減少し、内膜面積を59％減少し、管腔狭化を56％減少した（図8A及び8B）。内膜肥厚に関する顕著な効果は、対照動物（図9A）または処理動物（図9B）の切片断面で得られた結果により更に強調される。この実施例はAd-CMVgax HA構築物の非常に有効なin vivo 増殖静止活性を実証する。この活性は非常に特異的であり、対照動物では観察されない。示された結果は血管形態、特に、血管形成後の再狭窄と関連する肥厚に関するAd-CMVgax HA の治療活性を明らかに示す。Gax 遺伝子をin vivo で移入するためのアデノウイルスの如きウイルスの使用が特に有効である。この方法は、それが遺伝子交換アプローチに基くので更に有利である。この方法は、それが送出効率及び二つの治療特性：増殖静止及び血管系中の構成的発現を示す治療遺伝子の両方を組み合わせる点で特異である。本発明のGax 遺伝子移入は血管中の異常増殖性疾患の特異的回帰を誘発し、それにより動脈機能を正常化する。また、本発明の局所Gax 遺伝子移入は、それが動脈の病変後の再内皮化プロセスを妨害しない点で特に有利である。更に、細胞増殖及び血管形態に関する直接の影響に加えて、本発明のga x 遺伝子移入はまた細胞外基質の合成及び再モデル化(remodeling)に関する有益な間接の効果を与え得る。これらの結果は、本発明のGax 遺伝子移入が血管形成後の血管病変の治療に強力な新しいアプローチであることを明らかに示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 7/00 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＳ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者イスナージェフリーエムアメリカ合衆国マサチューセッツ州 02193 ウェストンブレントンロード 34 (72)発明者デネフルパトリスフランスエフ−94100 サンモールアベニュードフュジールドシャトーブリアン 45

Claims

【特許請求の範囲】１．GAX タンパク質またはこのタンパク質の変異体の全部または一部をコードする少なくとも一つの挿入された遺伝子を含む欠損組換えウイルス。２．感染された細胞中の複製に必要であるゲノムの領域を欠いていることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のウイルス。３．好ましくはAd5 型またはAd2 型のアデノウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載のウイルス。４．動物、好ましくはイヌ起源のアデノウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載のウイルス。５．挿入された遺伝子がラットGAX タンパク質またはこのタンパク質の変異体の全部または一部をコードすることを特徴とする請求の範囲第１項〜第４項の一項に記載のウイルス。６．挿入された遺伝子がラットGAX タンパク質またはそのヒト同族体をコードすることを特徴とする請求の範囲第５項に記載のウイルス。７．挿入された遺伝子がｃＤＮＡであることを特徴とする請求の範囲第１項〜第６項の一項に記載のウイルス。８．挿入された遺伝子がｇＤＮＡであることを特徴とする請求の範囲第１項〜第６項の一項に記載のウイルス。９．挿入された遺伝子がそれを感染された細胞中で発現させる配列を含むことを特徴とする請求の範囲第１項〜第８項の一項に記載のウイルス。 10．挿入された遺伝子が合成ポリペプチドを標的細胞の分泌経路に誘導するシグナル配列を含むことを特徴とする請求の範囲第１項〜第９項の一項に記載のウイルス。 11．E1領域の全部または一部の欠失を含むことを特徴とする請求の範囲第３項または第４項に記載のアデノウイルス。 12．E4領域の全部または一部の欠失を更に含むことを特徴とする請求の範囲第11 項に記載のアデノウイルス。 13．アデノ関連ウイルス(AAV)であることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載のウイルス。 14．レトロウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載のウイルス。 15．異常増殖性疾患に関連する病気の治療または予防を目的としている医薬組成物を調製するための請求の範囲第１項〜第14項の一項に記載のウイルスの使用。 16．再狭窄の治療を目的としている医薬組成物を調製するための請求の範囲第15 項に記載の使用。 17．請求の範囲第１項〜第14項の一項に記載の一種以上の欠損組換えウイルスを含む医薬組成物。 18．注射可能な形態であること、かつ10⁴〜10¹⁴pfuのアデノウイルス／mlを含むことを特徴とする請求の範囲第17項に記載の医薬組成物。 19．ヒドロゲルに飽和される組換えアデノウイルスを含むことを特徴とする請求の範囲第18項に記載の医薬組成物。