MXPA98008427A - Metodos de transferencia de genes in vivo para curacion de lesiones - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método in vivo para enfocarse hacia ADN especifico y transferirlo a células de reparación de mamiferos. El ADN transferido puede incluir ADN que codifica una proteina terapéutica de interés. La invención se basa en el descubrimiento que las células de reparación de mamiferos proliferan y migran hacia un sitio de lesión donde recogen ADN y lo expresan activamente. La invención se refiere ademas a composiciones farmacéuticas que pueden emplearse en la práctica de la invención para transferir el ADN de interés. Tales composiciones incluyen cualquier matriz adecuada en combinación con el ADN de interés.

Description

MÉTODOS DE TRANSFERENCIA DE GENES I VIVO PARA CURACIÓN DE LESIONES 1. INTRODUCCIÓN La presente invención se refiere a un método in viva novedoso para la presentación y transferencia directa de ADN que codifica una prateína terapéutica de interés en células de reparación de mamífero. El método incluye la implantación de una matriz que contiene el ADN de interés (conocida aquí como una "matriz activada por genes") en un sitio de lesión reciente. Las células de reparación que se originan normalmente en tejido viable que rodea la herida prolif ran y igran en la matriz activada por genes, donde encuentran, recogen y expresan el ADN. Las células de reparación transfectadas actúan por consiguiente como bioreactores in situ (localizados dentro del sitio de la lesión) qif.& producen agentes (ARN codificado por ADN, proteínas, etc.) que curan la herida. La invención se refiere ademáis a composiciones farmacéuticas que pueden emplearse en la práctica de la invención para transferir el ADN de interés. Tales compo iciones incluyen matrices adecuadas de este tipo en combinación con el ADN de interé . 2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 2.1 CURACIÓN DE HERIDA Las terapias actualmente disponibles para la curación de heridas incluyen la administración de proteínas terapéuticas. Tales proteínas terapéuticas pueden incluir factores regulatorios involucrados an el proceso normal de curación co o por ejemplo hormonas sistémicas, citocinas, factores de crecimiento y otras proteínas que regulan la proliferación y diferenciación de las células. Los factores de crecimiento, citocinas y hormonas que tienen dicha capacidad de curación de herida incluyen, por ejemplo, la superfa ilia de proteínas de factor Beta de crecimiento transformante ÍTGF-Beta) ÍCO , D.A., 1995, Cell Biology International, 19.357-371) el factor de crecimiento de fibroblasto ácido <FBF> (Slavin, J., 1995, Cell Biolsgy International, 19:431-444), el factor de estimulación de colonia de macrófagos (M-CBF) y agentes ragulatorios de calcio camo, por ejemplo, la hormona paratiroidea ÍPTH). Varios problemas se relacionan con el uso de proteínas terapéuticas, es decir, c i to i ñas, en terapias de curación de herida. Primero, la purificación y/o producción recombinante de proteínas terapéuticas es frecuentemente un proceso costoso y que requiere de tiempo. A pesar de los mejores esfuerzas, sin embargo, preparaciones purificadas de protaina son frecuentemente inestables hacienda que su almacenamiento y uso sea difícil, y ia inestabilidad de las proteínas puede provocar reacciones inflamatorias inesperadas (en productos de descompo ición de proteína) que son tóxicas para el huésped. Segundo, la administración sistémica de proteínas terapéuticas, es decir, citocinas, puede relacionarse con efectos colaterales indeseados severos en tejido na dañado. Debido a la administración insuficiente a células y tejidos específicos en el cuerpo, se requiere de la administración de dosis elevadas de proteína para asegurar que cantidades suficientes de prateína alcancen el tejido blanco apropiada. Debido a la vida media corta en el cuerpo por la degradación proteolítica, las proteínas deben administrarse repetidamente lo que puede provocar una reacción inmune contra las proteínas terapéuticas. La circulación de dosis altas de proteínas terapéuticas es frecuentemente tóxica debido a los efectos pleiotrópicos de la proteína administrada, y puede provocar afectos colaterales severas. T& asra ^ la administración ex?gena de proteínas reco binantes es ineficiente. Se realizaron intentos para limitar la administración de niveles altos de proteínas a través de la inmovilización de proteína terapéutica en el sitio blanco. Sin embargo, este enfoque terapéutico complica la readministración de la proteína para dosi ica i n repetida. Cuarto, para varias proteínas como, por ejemplo, receptores de membrana, factores de transcripción y prateína de enlace intracelular, la actividad biológica depende de la expresión correcta y de la local izaci?n en la célula. En el caso de muchas proteínas, la localización celular correcta ocurre conforme la proteína es modificada postran lac ianalmente dentro de las células. Por consiguiente, dichas proteínas no pueden administrarse de manera exógena de tal manera que estén absorbidas y ubicadas adecuadamente dentro de la célula. Co o la demuestran estos problemas, las terapias actuales con proteínas recombinantes para la curación de heridas son deficientes debido a que no presentan un método racional de administración de proteínas exógenas. Estas proteínas, es decir, c: i toe iñas, se producen norm lmente en su si io de acción en cantidades fisiológicas y se administran eficientemente a receptores de señalización en la superficie celular. 2.2 TERAPIA GENÉTICA La terapia genética fue concebida originalmente como una terapia de reemplazo de genes específicos para la corrección de defectos hereditarios para suministrar genes terapéuticos funcion Imente activos en células blanco. Esfuerzos iniciales hacia una terapia genética somática se basaron en medios indi ectos de introducción de genes en tejidos, se conoce como terapia genética ex vivo, por ejemplo, se remueven células blanco del cuerpo, dichas células blanco son transfectadas o infectadas con vectores que llevan genes recombi antes, y son reimplantadas en el cuerpo ("transferencia de células autólogas"). Varias técnicas de transfección estátn actualmente disponibles y empleadas para transferir el ADN in vitra en células? la inclusión de precipi ación de fosfato de calcio-ADN, transfección DEAE- Dextrano, electroporación, transferencia de ADN mediada por lipaso a o bien transducción con vectores virales recombinantes. Dichos protocolos de tratamiento activa ha sido propuesto para transferir ADN en varios tipos de células diferentes incluyendo células epiteleales {Patente Norteamericana 4,868,116; Margan and Mulligan W087/00201; Morgan et al., 1987, Science 237Í 1476-1479? Morgan and Mui ligan, Patente Norteamericana No. 4,980,286), células endoteliales (W089/05345) , hepatocitos (14089/07136? Wolff et al., 1987, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:3344-3348? Ledley et al., 1987 Prac . Nati. Acad. Sci. 84:5335-5339; Wilson and Mulligan, W089/07136; Wilson et al., 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. 87:8437-8441) fibroblastos (Palmer et al, 1987, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:1055-1059: Anson et al., 1987, Mol. Biol. Med. 4:11-20: Rosenberg et al., 1988, Science 242: 1575-1578: Naughton & Naughfcon, Patente Norteame icana 4,963,489), linfocitos (Anderson et al., Patente Norteamericana No. 5,399,346; Blaese, R.M. et al., 1995, Science 270:475-480) y células precursoras hem topoyéticas ÍLi , B. et al. 1989, Prac. Nati. Acad. Sci. USA 86:8892- 8896; Anderson et al., Patente Norteamericana No. 5 , 399 , 346 ) . Recientemente se ha intentado la transferencia directa in vivo de genes con formulaciones de ADN atrapado en lipasomas (Ledley et al., 1987, J. Pediatrics 110:1); o bien en proteoliposomas que contienen proteínas de receptor de envoltura vira (Nicolau et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 80:1068); y ADN acoplado con un complejo vehículo de pol i 1 ísina-gl icoproteina. Además, se emplearon "disparadores de genes" para suministrar genes en células (Patente Australiana Na. 9068389). Se ha especulado que el ADN desnudo, o bien, ADN asociado con liposoma, puede formularse en soluciones con vehículos líquidos para inyección en los espacios intersticiales para transferencias de ADN en células (Felgner, W090/ 11092). Tal vez uno de los problemas principales relacionados con las terapias genéticas actuales, tanto ex vivo como in vivo, es la incapacidad de transferir eficientemente el ADN en una población de células blanco y lograr un alto nivel de extensión del producto de gen in vivo. Vectores virales se consideran como el sistema más eficiente, y se ha empleado vectores viral defectuosos para replicación recombinantes para transducir (es decir, infectar) células tanto ex vivo como in vivo. Tales vectores han incluido vectores retrovi rale , adenovirus y vectores virales asociados con adenovirus y herpes. Mientras son altamente eficientes para transferir genes, las desventajas principales relacionadas con el uso de vectores virales incluyen la incapacidad de muchos vectores virales para infectar células que no se dividen; problemas relacionados con utagénesis insercional; reacciones inflamatorias al virus y producción potencial de virus auxiliar, y a producción y transmisión de virus dañino a otros pacientes humanos. Además de la baja eficiencia de la mayoría de los tipos celulares para recoger y expresar ADN extraño, muchas poblaciones de células enfocadas se encuentran en numeras tan bajos en el cuerpo que la eficiencia de presentación ds ADN a los tipos específicos de células blanco es aún más disminuido. Actual ente no existen ningún protocolo ni método para incrementar la eficiencia con la cual se enfoca el ADN hacia la población de células blanco. 3. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método novedoso para enfocar específicamente y transferir ADN en células de reparación de mamífero involucradas en la curación de heridas con el objeto de expresar productos terapéuticos en el sitio de la herida. El método de la invención incluye la administración de una matriz activada por gen en un sitio de lesión fresca en el cuerpo. En este entorno, las células de reparación se ubican en el sitio de la herida, donde se vuelven transfectadas y producen eventual ente agentes codificados por ADN (ARN, proteínas, etc.) que incrementan la curación de herida. La invención se basa, en parte, en el descubrimiento que células de reparación, activas en el proceso de curación de lesiones, proliferan y migran del tejido aledaño hacia el área de la herida e infiltran la matriz activada por gen. La matriz actúa como andamio que promueve el crecimiento celular y, a su vez, la transferencia de genes, a través de ia acumulación local de células de reparación cerca del ADN. Mientras se encuentra en la matriz, las células de reparación son sorprendentemente eficientes para recoger el ADN y expresarlo co o productos de translación, es decir, proteínas, o bien productos de transcripción, es decir, antisentido y riboso as. Las células de reparación transfectadas sirven después coma biareactares locales amplificando la produa c i ón del producto de gen in vivo. Mientras se puede emplear cualquier número de secuencias de ADN en el método, secuencias de ADN preferidas son las secuencias q>?s codifican los productos de translación (es decir, proteínas) o bien productos de transcripción (es decir, antisentido o ribaso as) que (a) promueven la reparación de tejido; o bien (b) pueden interrumpir el prsceso de enfermedades (permitiendo así una curación normal de tejido).

La invención supera las limitaciones de los procedi ientos actualmente e pleados para la curación de herida que incluyen la administración de proteínas terapéuticas. Priípero, el ADN, es a la vez estable y no tóxico, puede administrarse con seguridad en dosis elevadas in vivo. Segundo, na se requiere de administración repetida, aún cuando dicha administración repetida es posible. Las células que recogen y expresan el ADN proporcionan un suministro de producto de gen en el sitio de la lesión. Tercero, la invención puede practicarse de tai manera que se adapta a los requerimieptos temporales de dosificación. Por ejemplo, el ADN puede presentarse en vectores que se integran en el genoma de la célula blanco. En este casa, todas las células fijas contendrán y expresarán el ADN transferido actuando de esta forma como una fuente continua para el agente terapéutico. En contraste, se pueden emplear sistemas de no integración donde el ADN no se integra en el genoma y el gen no pasa a las células fijas. En tal caso, cuando termina el proceso de curación de herida y ya no se necesita el producto de gen, no se expresa el producto de gen. La invención se demuestra por medio de ejemplos que muestran que genes pueden ser transferidos y expresados de manera reproducible en varios tejidos blandos y duros lesionados, i ivo. Específicamente, se muestra que el método de la presente invención supera los problemas relacionados con los protocolos actualmente disponibles de la terapia genética.

El método de la presente invención ofrece una transferencia de genes a un número adecuado de células de reparación para lograr efectos funcionales, es decir, en ausencia de cualquier otra identificación celular o de blanco por parte del médico. Métodos in vivo de terapias genéticas requieren una cierta forma de di reccisnamienta que muy frecuentemente no funciona. En el método de la invención, el di receianamiento no es un problema. Por analogía, el ADN actúa de manera muy similar a una "carnada" en una "trampa": las células de reparación encuentran el ADN que ha prsliferada y liberado después en la matriz activada por genes. Estas células, a su vez, tiepen una capacidad sorprendente para recoger el ADN y expresarlo camo agente terapéutico. En una modalidad de la invención, el método de la presente invención puede emplearse como sistema de administración de fármaco a través de la transferencia de ADN en células de reparación de mamífero para el propósito de estimular una reparación de tejido blando y duro y regeneración tisular. Las células de reparación serán las células que llegan normalmente al área de la lesión a tratar. Por consiguiente, no existe ninguna dificultad asociada con la obtención de células blanco adecuadas a las cuales se debe de aplicar las composiciones terapéu icas. Todo lo que se requiere es la implantación de una matriz activada por genes en el sitio de la lesión. La naturaleza de este entarno biológico es tal que las células de reparación apropiadas recogerán activamente y expresarán el ADN en ausencia de cualquier di reccianamienta adicional a identificación celular por parte del médico. En atra modalidad, el método de la presente invención, e pleando matrices tanto biológicas como sintéticas, puede emplearse para transferir el ADN en células de reparación en mamíferos para estimular la regeneración esqueletal. En una modalidad adicional, el método de la presente invención, empleando matrices tanto biológicas como sintéticas, puede emplearse para transferir el ADN en células de mamífero para estimular reparación de ligamento y tendón. El método de la invención pueda ser empleado adicionalmente, empleando matrices tanto biológicas camo sintéticas, para transferir ADN en células de reparación de mamífero para estimular la reparación de músculo esqueletal y/o reparar vasos sanguíneos. En ADN a emplear en la práctica de la presente-; invención puede incluir cualquier ADN que codifica productos de translación (es decir, proteínas) o bien productos de transcripción (es decir, antisentido o ribazimas) que promueven la reparación tisular o bien que puedan interrumpir un proceso de enfermedad. Por ejemplo, el ADN puede comprender genes que codifican proteínas terapéuticamente útiles coma par ejemplo factores ds crecimiento, citocinas, hormonas, etc. A icion l ente, el ADN puede codificar moléculas de anti sentido o ribazimas que pueden inhibir la translación de mARN que codifican proteínas que inhiben la curación de lesiones a bien que inducen inflamación. El ADN que codifica el producto terapéutico de interés está asociado con una matriz o bien impregnado dentro de una matriz para formar una matriz activada por genes. Una vez preparada, la matriz activada por genes se coloca en el mamífero en el sitio de una lesión. La invención se demuestra a través de ejemplos, donde se demuestra la eficiencia de ia transferencia in vivo y expresión de genes en tejidos sometidos a reparación y regeneracion. 3.1 DEFINICIONES Camo se emplea aquí, los siguientes términos tendrán los significados indicados a continuación. Una matriz activada por ganes (8AM) se define aquí como cualquier material de matriz que contiene ADN que codifica un agente terapéutico de interés. Por ejemplo, matrices activadas por genes se colocan dentro de sitios en lesiones en el cuerpo de un huésped mamífero para realizar la curación de la lesión.

Una célula de reparación se define aquí como cualquier célula que es estimulada para que igre y prolifere en respuesta a una lesión tisular. Las células de reparación son un componente ás¡ la respuesta de curación de lesiones. Tales células incluyen fibroblastos, células endateliales capilares, pericitos capilares, células inflamatorias mononuclea es, células inflama orias segmentadas y células de tejido de granulación. Un sitio de herid se define como cualquier ubicación en el huésped que surge de un daño tisular traumático, o bien alternativamente, de un daño tisular inducido por proce imientos quirúrgicos o bien resultantes de procedimientos quirúrgicos. 4. DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1A: Modela de Osteotomía Femoral de No unión Fibrosa. Se creo una osteotomía de 5 m de manera quirúrgica en fémures de ratas Sprague—Dawley de sexo masculino adultas. Los espacios mostrados aquí son representativos del grupo de control entero, con huéspedes de mamífero que reciben o bien una osteotomía sola (n=3) , una osteotomía más una esponja de colágeno (n=10) o/y osteotomía más una esponja de colágeno que contiene un ADN de plásmido de control (gen marcador) (n-23). Una película de rayos x simple que muestra un fémur de rata de control inmediatamente después de la intervención quirúrgica. El hueco fue estabilizado por un fi ador externo que consistía de una placa y 4 clavos. La incisión cutánea fue cerrada par media de grapas metálicas. Figura IB: Una película de rayos ? simple que muestra una osteotomía de fémur de rata de control 9 semanas después de la intervención quirúrgica. Los márgenes quirúrgicos redondeados (flechas) se lleven a una formación ósea reactiva y son consistentes con ia apariencia radiográfica clásica de fractura de na unión. Figura 1C: Una sección de histología de tejido de hueco 3 semanas después de la intervención quirúrgica que muestra la proliferación de fibroblastos de reparación y de capilares integrados en una matriz edematosa extracelular. Se encuentra también presente un infiltrado inflamatorio focal de linfoci os y macrófagos. Figura ID: Sección de histología de un hueco de control de 9 semanas que muestra tejido fibroso denso. lcm=20 µm (C y D) . Figura 2: Diagrama esquemático del constructo pBAMi que codifica BMP-4 de ratón. La posición del promotor de CMV, secuencia de codificación de BMP-4, ep i topos de HA, y señal de pol iadeni lación de hormona de crecimiento bovina se i lus ran. Figura 3A. Expresión de BMP-4 por fib oblas os de reparación. Se detectó la expresión de BMP-4 codificado por plásmido en tejidos envueltos en parafina, desmineral izados, fijados can Bauins, empleando el anticuerpo anti-HA y método de inmunsperó ido 4 semanas después del implante de una matriz activada por gen que contiene ADN de plásmido pGAMl . Las flechas indican ejemplos de tinción positiva (rojo-café) de citoplasma de fibroblasto (micrografía en la parte izquierda superior). Estas células fueron identificadas como fibroblastos en base a la morfología de huso, crecimiento en fascículo, e inmunatinción positiva para procolágena de tipo I (no ilustrado). Seccionas en serie incubadas con suero prein unes de conejo o sin el primer anticuerpo fueron nega ivas. Se obtuvieron también resultados negativos con controles operados de manera ficticia (esponja de colágena sola) incubados con el anticuerpo anti-HA.ll (micrografía en la parte superior derecha). Se observó de manera consistente una tinción positiva falsa de «tacr?fagos, asteoplastos, y astesblastos en secciones da control incubadas con el anticuerpo HA.11. Se muestra una isla de hueso recién formado 3 semanas después de la transferencia de pGAMl en la micrografía en la parte inferior, a la izquierda. El hueso nuevo se relaciona con la formación de tejido de granulación. Una vista con alta ampliación de hueso recién fsrmido se muestra en la micrografía en la p=srte inferior, a la derecha. Flechas indican presuntos ostesb 1 astss en la superficie de trabéculas de hueso nuevo. Se tiñeron tejidos de hueco empleando hematoxilina y eosina {micrografía superior) o bien con el método tricromático de Gomori (los tejidos ricos en colágena tienen una apariencia verde ^ micragrafias inferiores). Icm = 20 mm {micrografías superiores) . Figura 3B. Radiografía de películas simple de animal (23 semanas después de la operación). En la radiografía de película simple (izquierdo), la flecha indica la posición aproximada del hueco de osteotomía que se encuentra relleno con tejido radiodenso. Obsérvese que el fijador externo ha sido removida. Como se indica por medio del patrón veteado, se está llevando a cabo una remodelación ósea. Las puntas de flechas indican defectos en hueso adyacente al hueco (una consecuencia de la colocación de clavo). Los dos sitios de clavo distales presentaron curación completa en este momento (no ilustrado). La fotografía montada entera (derecha) presenta una sección de tejido teñido de manera tricromática según Gomori del hueco del animal ilustrado (después del sacrificio). Flechas apuntan hacia el hueco que está ahora recubierto por un hueso cortical bien integrado. Defectos circulares en el espacio de la médula (cualquier espacio del hueso) resultan de la colocación de clavos de fijación más interna. La interrupción tisular en el fondo de la micrografía es un artefacto de manejo de muestra. Figura 4A. Diagrama esquemático del constructo p6AM2 que codifica PTH1-34 humana. La posición de una repetición terminal larga corriente arriba que impulsa la expresión de PTHÍ-34 (flecha), la secuencia de codificación de PTH1—34, el promotor SV40 que impulsa la expresi?n de neo (flecha), la secuencia de codificación de neo, secuencias pBR, y la repetición terminal larga corriente abajo se ilustran. Figura 4B. La transferencia y expresión de gen PTH1—34 impulsa la formación de hueso nuevo in vivo. Una radiografía de película simple que muestra nuevo fuente óseo de un hueco de osteotomía de 5 mm 9 semanas después del i plante en un animal que recibió una matriz activada por gen que contenía ADN de plásmido pGAM2. Las flechas indican tejido radiadensa en el hueco. Los resultados mostrados aquí son representativos de experimentos con un animal adicional. Figura 5. Formación de hueso nuevo in vivo a través de un SAM de dos plásmidos. (parte superior) radiografía de película simple que muestra nuevo puente óseo de un hueco de 5mm 4 semanas después del implante en un animal que recibió una matriz activada por gen que contenía ADN de plásmido de pGAMl más pGAM2. Las flechas indican tejido radiodensa en el hueco (se confirmó histológicamente que era hueso), (parte inferior) radiografía de película simple del hueco ilustrado en la foto de arriba después de la remoción (5 semanas antes; total de 17 semanas después de la intervenci n quirúrgica) del fijador externo. Las flechas indican la ubicación del hueco que se encuentra relleno con tejido radiodenso excepto en el caso de una banda de tejido submi ñera 1 izado cerca del margen quirúrgico próximo. Como se indica por medio del patrón veteado, se está llevando a cabo una respuesta extensa de re odelación. Los resultados mostrados aquí son representa ivos de experimentos con un animal adicional. Figura 6. Transferencia de gen mediada por adenovirus en células de reparación/regeneración de hueso in v i vo . El implante UltraFiber ( r) fue sumergido durante 6 min. en una solución del virus de AdCMVlacZ (10,000,000,000- 100,000,000,000 unidades formadoras de placa o bien PFU/ l ) y después implantada en el sitio de osteotomía. Se dejó que el defecto sanara durante 3 semanas durante dicho tiempo se moni toreó el avance de la respuesta de curación de lesió mediante un examen radiográfico semanal. A las 3 semanas, se estimó que el 40 del defecto estaba lleno de tejido calloso. El huésped mamífero fue sacrificada y se fi aran los tejidos en fijación de Bouins después fueron desmineralizados durante 7 días empleando soluciones estándares de ácido fórmico. Se tomaron fotomicrografí s de cortes transvers les de hueso nuevo ícalls) que se formó en el sitio de la osteotomía 3 semanas después de la intervención quirúrgica. Panel en la parte superior izquierda: obsérvese la tinción a i toplásmica Beta—gal positivas (roja) de células de tejido calloso del implante de adenovirus UltraFiber (mr). Este resultado indica que receptores de superficie celular que medían la infección, y por consiguiente la transmisión viral, son expresados por células de callo (al menos una población) durante este proceso de curación de la fractura. Panel en la parte izquierda superior: control negativo de corte en serie teñido con el vehículo del anticuerpo Beta-gal más cacktel de anticuerpos LgS de conejo no especifico. Panel en la parte inferior: obsérvese la tinción nuclear Beta—gal positiva (roja) de condracitas en el sitio de osteotomía llenado con UltraFiber ( r) y AdRSVntlacZ. Este resultado demuestra la especificidad exquisita del anticuerpo apti— Beta— al, y demuestra de manera conclusiva la expresión del producto de gen marcador en el hueco de osteotomía. Figura 7. La transferencia da gen de plásmido pGAM2 para reparar fibroblastos resul a en un nuevo crecimiento óseo en el modelo de osteotomía de rata. Radiografía de película simple que muestra nuevo fuente óseo de un hueco de 5m 6 semanas después del implante en un animal que recibió una matriz activada por gen que contenía ADN de plásmido pGAMÍ más pSAM2. Las flachas indican tejido radiodenso en el hueco (se confirmó histológicamente que era hueso). 5. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método in vivo para la presentación y trapsferenc ia de ADN en células de reparación de mamífero con el propósito de eKprssa. r agentes terapéuticos. El método de la presente invención incluye la implantación o bien colocación de matrices activadas por gep en un sitio de herida reciente. La curación de las heridas es habi tualmenta una secuencia e tereotipada , coordinada de eventos que incluye (a) interrupción de tejido y pérdida de arquitectura tisular normal; (b) necrosis celular y hemorragia; hemsstasis (formación de coágulos); (c) infiltración de células inflamatorias segmentadas y manonucieares con congestión vascular y edema tisular; (d) disolución del coágulo así co o células y tejidos dañados por células mananucleares ( sacrófagos) (e) formación de tejido de granulación (fibroplasia y angiagénesis ) . Esta secuencia de eventos celulares se ha observado en lesiones de todos los tejidos y órganos generadas en un gran número de tejidos de mamíferos (Gailet et al., 1994, Curr. Opin. Cell. Biol. 6:717-725). Por consiguiente, la secuencia celular arriba descrita es un aspecta universal de la reparación de todos las tejidos de amí feros. La invención se basa en el descub imiento que las células de reparación involucradas sn el proceso de curación de lesiones prsliferan y igran naturalmente hacia el sitio del daño tisular e infiltran la matriz activada por gen. Sorprendentemente, estas células de reparación, que son normalmente difíciles de transfecta r ef iciente ente, ya sea in vitro o in vivo, son extremadamente eficientes para absorber y expresar ADN cuando el proceso de curación de lesión las activa para que proliferen. Aprovechando esta característica, los métodos de la presente invención son diseñados para transferir eficientemente una o varias moléculas de ADN que codifican agentes terapéuticos hacia las células de reparación proliferantes. Los métodos incluyen la administración de una matriz activada por gen que contiene ADN que codifica productos de translación (es decir, proteínas terapéuticas) o bien productos de transcripción (es decir, antisentido o ribosimas) dentro de un huésped mamífero en el sitio de una herida. La herida puede surgir de daño tisular traumático, o bien alternativamente, de daño tisular ys. sea inducido por procedimientos quirúrgicas o bien resultantes de procedimientos quirúrgicos. Conforme las células de reparación proliferantes igran en una matriz activada por gen y hacen contacto con ella, recogen y expresan el ADN de interés amplificando asi la cantidad del agente terapéutico, proteína o ARN. Las células de reparación transfectadas sirven de esta forma coro bioreactores locales que p vadmzeex agentes terapéuticos que influencian el entorno de reparación local. Por ejemplo, factores de crecimiento o bien citocinas producidas por as células de reparación transfectadas se unirán y estimularán células efectores blanco que expresan receptores superficiales cognados de células, estimulando y amplificando así la cascada de eventos fisiológicos normalmente asociados con el proceso de curación de lesiones. Al ernat ivamente, las células de reparación pueden absorber y expresar ADN que codifica proteínas que inhiben la actividad de antagonistas del proceso de c rac ión de lesiones. El ADN puede también codificar moléculas de ARN de ribozima a antisentids que pueden emplearse para inhibir- la mARNs que codifican proteínas inflamatorias o bian otros factores que inhiben la curación de heridas o provocan una fibrosis excesiva. La matriz activada por gen de la invención puede ser transferida al paciente empleando varias técnicas. Por ejemplo, cuando estimulan la curación y regeneración de heridas, las matrices son transferidas directamente al sitio de la lesión, es decir, el hueso fracturado, el tejido conectivo dañado, etc. Para su uso en la reparación de la piel, las matrices se aplican tópicamente. Para su uso en la regeneración de órganos, las matrices se colocan de manera qui úr ica en una lesión en el órgano. Puesto que el método de la presente invención se basa en la migración y proliferación natural de células de reparación en un sitio de lesión, e infil ración en la matriz activada por gen ubicada en el sitio de la lesión, seguido por la absorción de ADN, entiende que las matrices deben ser transferidas en un sitio en el cuerpo donde se ha inducido el proceso de curación de la lesión. Una caracte ística particularmente importante de la presente invención es que el praceso de reparación puede ser manipulado para resultar ya sea en la formación de tejido de icatrización y/o regeneración de tejido. Por ejemplo, la sobreexpresión de las proteínas terapéuticas en el sitio de la herida puede resultar en la regeneración del tejido dañado sin formación de tejido de cicatrización. En dichos casos, por ejemplo, en el caso de la reparación ds hueso, dicha regeneración es deseable porque ei tejido de cicatrización no está diseñado óptimamente para soportar una función mecánica normal. Alternativamente, alrededor de una sutura puede ser deseable formar tejido de cicatrización para mantener inherentemente junto tejido débil. Por consiguiente, los métodos de la invención pueden emplearse para estimular la curación de lesiones ya sea con o sin la formación de tejido de cicatrización según el tipo y nivel de prateina terapéu i a estresada. La transferen ia directa de ADN de plásmida de una matriz hacia una célula de reparación de mamífero, mediante la estimulación del proceso de curación de herida, ofrece muchas ventajas, primero, la facilidad de producción y purificación de constructos de ADN se compara de manera favorable con el costo del método tradicional de producción de proteínas. Segundo, las matrices pueden actuar como andamios estructurales que, en sí mismos, promueven el crecimiento celular y la proliferación. Así, facilitan el direcciapamienta de células de reparación para transferencia de genes. Tercero, la transferencia directa de genes puede ser un método provechoso de administración de fármacos para moléculas que están sometidas normalmente a un procesamiento biasintético complejo o bien para receptores que daban colocarse adecuadamente en la membrana celular. Estos tipos de moléculas no funcionan si se administran de manera exógepa a la célula. La presente invención se refiere también a composiciones farmacéuticas que comprenden matrices que contienen ADN para su. uso en la curación de heridas. Las composiciones de la invención están generalmente formadas por material de matriz biacampat ible o bien compatible con su hueso, que contiene ADN que codifica una proteína terapéutica de interés. La invención supera las indicaciones específicamente asociadas con terapias actuales con proteínas recombinantes para aplicaciones en curación de lesiones. Primero, la transferencia directa de genes es una estrategia racional que permite a las células transfectadas (a) hacer cantidades fisiológicas de proteína terapéutica, modificada de manera *?5 especifica para tejido y contexto, y (b) suministrar esta proteípa al receptor de señalización de superficie celular apropiada bajo las ci cunstancias apropiadas. Por razones descritas arriba, la administración exógena de tales moléculas es asociada con problemas de administración y de dosificación importante. Segundo, la administración repetida, si bien es posible, no se requiere con la tecnología de matriz activada por genes: la absorción de células de ADN puede ser controlada precisamente con tecnologías bien establecidas de administración por liberación prolongada, o bien, alternativamente, la integración de ADN transfectado puede relacionarse con la expresión a largo plazo de proteína recombinante. El método de la presente invención puede aplicarse de manera universal a lesionas que involucran muchas células, tejidos y órganos diferentes; las células de reparación de tejido de granulación (Gailet et al., 1994, Curr. Opin. Cell. Bioi . 6:717-725) están "enfocadas" cuando se emplaa el método de la invención. La invención se demuestra aquí en tres modelos animales (perro, rata y conejo) y cinco tejidos (hueso, tendón, ligamento, vaso sanguíneo y músculo esqueletal), empleando tres genes marcadores (Beta- alactssida=a , luciferasa y fosfatasa alcalina) tres sistemas promotores (CMV, RSV, LTR y SV40) , dos tipos de matrices (biológica y sintética). En todos los casos, las células de reparación que migraron a la matriz activada por genes fueron transfectadas exitosamente. Particularmente, se demostró un resultado funcional (crecimiento óseo) después de la transferencia de genes a fibroblastos de reparación de un canstructo de plásmids que codifica ya sea BMP— , que actúa como un conmutador de transducción de señal para diferenciación y crecimiento de osteoblasto (Wazney, 1992, Mol. Reprod. Dev. 32:160-167; Reddi, 1994, Curr. Opin. Benet. Deve. 4:737-744) o bien PTH1-34, que recluta células osteoprsgeni toras (Orisff, et al, 1992, Endocr inology 131:1603-1611; Dempster et al, 1995 Endocrin Rev. 4:247-250). 5.1 LA MATRIZ ACTIVADA POR GEN Cualquier material de matriz biocompatible que contiena ADN que codifica un agente terapéutico de interés, como por ejempla producto de traslación, es decir, prateína terapéutica, o bien productos de transc ipción, es decir, antisentido o ribasima, puede formularse y emplearse de conformidad con la presente invención. Las matrices activadas por ganes de la presente invención pueden ser derivadas de cualquier material biacampa ible. Tales materiales puedan incluir, sin limitarse a ellos, materiales biodegradables o bien no b iodegradables formulados en andamias que soportan fijación y crecimiento celular, polvos o geles. Se pueden derivar matrices de polímeros sintéticas o bien proteínas que ocurren n tural ente co o por ejemplo colágena, otras proteínas de matriz extracelulares, o bien otras macromoléc las estructurales. El ADN incorporado en la matriz puede codificar cualesquiera de varias proteínas terapéuticas según el uso terapéutica prevista. Tales prateínas pueden incluir factores de crecimiento, citosina, hormonas o cualquier proteína de otro tipo capaz de resular el crecimiento, la diferenciación o bien la función fisiológica de la célula. El ADN puede también codificar moléculas de ribos i a o antisentido i^ e inhiben la traslación de las proteínas que inhiben la reparación de lesiones y/o inducen inflamación. El ADN transferido puede na estar integrado en el genoma de la célula blanco; de hecho, el uso de ADN no integrante an la matriz activada por genes es la modalidad preferida de la presente invención. De esta forma, cuando termina el proceso de curación de le ión y ya no se requiera el producto da genes, no se expresa el producto de gen. Equipos terapéuticos que contienen una matriz bisca patible y ADN forman otro aspecto de la invención. En algunos casos, los aquipas contienen matrices activadas por gepas prefor adas permitiendo así al médico administrar directamente la matriz dentro del cuerpo. Alternati amente, dosis pueden contener los componentes necesarias para la formación de una matriz activada por genes. En tales casos, el médico puede combinar los componentes para formar las matrices activadas por genes que pueden después emplearse terapéuticamente mediante colocación en el cuerpo . En una modalidad de la invención, las matrices pueden emplearse para revestir dispositivos quirúrgicos co o por ejemplo materiales de sutura o bien implantes. En otra modalidad de la presente invención, las matrices activadas por genes incluyan esponjas, tubos, vendas, componentes liof i 1 izados, geles, parches, a bien polvos y cojines telfa listos para emplearse. 5.1.1 LOS MATERIALES DE LA MATRIZ En un aspecto de la presente invención, se preparan composiciones en donde ei ADN que codifica el agente terapéutico de interés se relaciona con una matriz o bien se encuentra impregnado dentro de dicha matriz para formar una matriz activada por genes. Las composiciones de matriz funcionan íi) para faciliar el crecimiento de células de reparación (direccionamiento); y (ii) para contener el ADN (administración). Una vez preparada la matriz activada por genes, dicha matriz se almacena para uso futuro o bien se coloca inmediatamente en el sitio de la lesión. El tipo de matriz que puede emplearse en las compo iciones, dispositivos y métodos de la presente invención es virtualmente limitado y puede incluir matrices tanto biológicas como sintéticas. La matriz tendrá todas las ^Q características comúnmente asociadas con la "bioco patibilidad" en la medida en que tiene una forma que i no produce una reacción adversa, alérgica o bien de otro tipo cuando se administra a un huésped mamífero. Tales matrices pueden formarse de materiales tanto naturales co o sintéticos. Las matrices pueden ser no biadegradablas en casos en los cuales se desea dejar estructuras permanentes en el cuerpo; o bien se pueden elaborar de material degradable cuando la expresión de la proteina terapéutica se requiere solamente durante un corto período de tiempo. Las matrices pueden to ar la forma de esponjas, implantes, tubos, co ines taifa, vendas, cojines, componentes liof i 1 izados, geles, parches, pslvas a bien nanopar ículas.

Además, se pueden diseñar matrices para permitir la liberación prolongada del ADN durante largos períodos de iempo. La invención del material de matriz será diferente de conformidad con las circunstancias particulares y el sitio de la herida a tratar. Matrices tales como las descritas en la patente norteamericana no. 5,270,300, que se incorpora aquí por referencia, pueden emplearse. Características físicas y químicas como por ejemplo biocampat ib 11 idad , biadegradabí 1 idad, resistencia, rigidez, propiedad de interfaz y apariencia cosmética pueden to arse en consideración a la hora de escoger una matriz, co o la saben 50 bien los expertos en la materia. Matrices apropiadas adminstrarán la molécula de ADN y actuarán también co o un andamio in situ a través del cual pueden igrar las células de reparación de mamíferos. Cuando las matrices deben de mantenerse durante largos períodos de tiempo, se pueden emplear matrices no bisdegradables, cama por ejemplo hidroxiapatita sinterizada, biovidria, aluminatas, otros materiales de biocerámica y materiales metálicos, par icularmente titanio. Un sistema de administración adecuado basado en cerámica es el descrito en la Patente norteamericana no. 4,596,574, que se incorpora aquí por referencia. Las biocerá icas, pueden ser alteradas en cuanto a su composición, como en calcio—alumin o— fosfato; y puedan ser procesadas para modificar características físicas y químicas particulares, co o por ejemplo tamaño de poro, tamaño de partícula, forma de partícula, y biadegradabi 1 idad. Se pueden también emplear matrices poliméricas, incluyendo polímeros de éster acrílico y pal ímeros de ácido láctico, según se presenta en las patentes norteamericanas nos. 4,521,909 y 4,563,489, respecti amente, que se incorporan aquí por referencias. Ejemplos particulares de polímeros útiles son ios ortoésteres, anhídridos, prop i len-cocu aratos, o bien un polímero de uno o varios onómeras de ácido gama— hidro?icarbo?í lico, por ejemplo, ácido gama-hidro?iáurico (ácido glicólico) y/o ácido gam a-hidraxipropiónico (ácido lác ico) . Un aspecto particularmente importante de la presenta invención es su uso en relación con implantes ortopédicos a interfaces y articulaciones artificiales, incluyendo los implantes en sí y partes funcionales de un implante, como por ejemplo tornillos, clavos quirúrgicos, etc. En modalidades preferidas, se contempla que la superficie metálica o bien las superficies metálicas de un implanta o da una parte del mismo, co o por ejemplo superficie de titanio, estarán revestidas con un material que tisne afinidad para los ácidos nucleicos, con mayor preferencia hi roxi lapatit , y después el metal revestido estará revestido adiciapal epte con el gen o bien ácido nucleico que se desea transferir. Los grupos químicos disponibles del material de absorción, como por ejemplo hidra?iapati t , pueden ser fácilmente manipulados para controlar su afinidad para los ácidos nucleicos, co o la saben los expertos en la materia. En modalidades preferidas, se contempla que es probable que una matriz biodegradable sea más útil. Una matriz biodegradable se define generalmente como una matriz que puede ser reabsorbida en el cuerpo. Matrices b iodegradables potenciales para su. uso en relaci n con las composiciones, dispositivos y métodos de esta invención incluyen, por ejemplo, sulfato de calcio, trifosfato de calcio, hidroxiapatita , ácido pol láctico, pol ianhídridos, matrices de proteínas purificadas, y composiciones de matriz extracelular se ipu i f icadas definidas químicamente y biodegradables. Otros polímeros biodegradables y biocampatibles que pueden emplearse son bien conocidos en la técnica e incluyen, a título de ejemplos y no para limitar al presente invención, poliésteres co o par eje pla psl igl ic l idos, palilác idos y polímeros de ácido pol i lacticpol igl icol ico ("PLGA") (Langer y Falkman, 1976, Nature 263:797-800); poliéteres cama por ejemplo pol icapralactona ("PCL"); pol ianhidr idos; cianaacri latos de poiialquila como por ejemplo cianoacrilato de n—butilo y cianoacrilato de isopropilo; pal iacr i lamida; pol i (ortoésters) ; pol i fosf genos; pol ipépt idos; poliuretanos; y mezclas de estos polímeros. Se entiende que virtualmente cualquier polímero conocido a que será desarrollado más adelante adecuado para ia liberación sostenida o controlada de ácidos nucleicos puede emplearse en la presente invención. En modalidades pref sr idas, el polímera biodegradabie biocamp ible es un copolímero de ácido gl icol ico y ácido láctico ("PLCA") que tiene una proporción entre las unidades de ácido láctico, unidades de ácido gl ic l ico que se ubica entre aprox imadamente 100/0 y aproximadamente 25/75. El pesa molecular promedio ("MW" ) de polímero se ubicará típicamente dentro de un rango de aproximadamente 6,000 a 700,000 y de preferencia de aproximadamente 30,000 a 120,000 de conformidad con lo determinado por cromatografía de permeación de geles empleando poliestireno disponible comercia Imente de peso molecular estándar, y tendrá una viscosidad intrínseca dentro de un rango de O.5 a 10.5. La duración del periodo de administración continua a liberación controlada de ácidos nucleicos de la matriz de conformidad con la presente invención dependerá en gran medida del punto molecular promedio del polímero y de la relación en la composición entre el ácido láctico y el ácido glicóiico. En términos generales, una proporción más elevada entre el ácido láctico y el ácido glicólico, como por ejemplo 54/25, proporcionará un período más largo de liberación controlada o sostenida de los ácidos nucleicos, mientras que una proporción más baja entre el ácido láctico y el ácido gl icol ico proporcionará una liberación más rápida de los ácidos nucleicos. De pref renc ia. ^ la relación entre el á ido láctico y el ácido glicólico es 50/50. La longitud del período de liberación sostenida o controlada depenerá también del peso molecular promedio del polímero. Generalmente, un polímero de peso molecular pramedio mas elevado proporcionará un período mayor de liberación controlada o sostenida. En el caso de la preparación, por ejemplo, de matrices que proporcionan una liberación controlada o sostenida durante aproximadamente 3 meses, cuando la relación en cuanto a composición eptre el ácido láctico y el ácido gl icol ico es 1O0/0, el peso molecular promedio preferible del polímero se ubica dentro del un rango de aproximadamente 7,000 a 25,000; cuando la relación entre el ácido láctico y al ácido glicólico es de 90/10, el peso molecular promedio preferible del polímera se encuentra dentro de un rango de 6,000 a 30,000; y cuando ía relación entre el ácido láctico y el ácido glicóiico es 80/20, el pesa molecular promedio preferible del polímero se encuentra dentro de un rango de aproximadamente 12,000 a 30,000. Otro tipo de bio aterial que puede emplearse es la pequeña submucosa intestinal (SIS). El material de injerto de SIS puede prepararse a partir de un segmento del yeyuno de cerdos adultos. El aislamiento de muestra de tejida puede llevarse a cabo empleando técnicas rutinarias de cultivo tisular camo por ejempo las técnicas presentadas en Badybafc et ai., 1989, J. Surg. Res. 47:74-80. Se prepara el material de SIS mediante la remoción de tejido mesentépco, inversión del segmento, seguido por la remoción de la mucosa y de la submucosa superficial mediante una técnica de abrasión mecánica. Después de devolver el segmento su orientación original, se enjuagan la serosa y las capas de músculos y se almacenan para uso posterior.

Otro ejemplo particular de un material adecuado es la colágena fibrosa que puede liofilisarse después de extracción y purificación parcial a partir de tejido, y después esterilizarse. Se pueden también preparar matrices a partir de colágena de tendón o colágena dérmica, que sa puede obtener de varias fuentes comercia les como par ejemplo Sigma and Collagen Corporation. Se pueden también perparar matrices de colágena según lo descrito en las patentes norteameric as no. 4,394,370 y 4,975,527, que se incorporan aquí por referencia. Además, se pueden emplear reticuladas elaboradas a partir de colágena y gi icosami o lcano (GAG) como lo descrito en Y nnas & Burke, patente norteamericana na. 4,505,266, en la pré.ci; í s. de la presente invención. La matriz de colágena/GAG puede servir efecti vamente camo sopor e o bien estructura de "andamio" en donde pueden migrar las células de reparación. Se puede también emplear co o material de matriz una matriz de colágena, como por ejempla la descrita en Bell, patente norteamericana no. 4,485,097. Los varios materiales colagenasos pueden también encontrarse an forma de colágena mi erali ada. Por ejemplo, el material de implante de colágena fibrosa llamada Ul traFiber (mr ) , que se pueda obtener en Norian Corp., (1025 Terra Bella Ave., Mountain View, CA, 94043) puede e plearse para la formación de matrices. La patente norteamericana no. 5,231,169, que se 56 incorpora aqui por referencia, describe la preparación de colágena mineralizada a través de la formación de mineral de fosfato de calcio bajo agitación lava in situ en presencia de fibrilas de colágena dispersas. Tal formulación puede emplearse en el contexto del suministro de un segmento de un segmento de ácido nucleico a un sitio de tejida óseo. Se puede emplear colágena mineralizada, por ejempla, co o parte de un equipo terapéutico de matriz activada por genes para la reparación de fractura. Se hcn identificado al menos 20 formas diferentes da colágena y cada una de estas colágenas puede emplearse en la práctica de la invención. Por ejemplo, se puede purificar colágena a partir de cartílago hialino, que se aisla de articulaciones diatradiales o bien placas de crecimiento. La colágena de tipo II purificada a partir de cartílago hialino se encuentra comercia imente disponible y puede adquirirse, por ejemplo, en Sigma Chemical Company, St. Louis. La colágena de tipo I proveniente de tendón de cola de rata puede adquirirse, por ejemplo, en Collagen Corporation. Se puede emplear también cualquier forma de colágena recom inante, que se puede obtener a par i de una célula huésped recamb in nte que expres colágena, incluyendo levadura bacteriana, células de mamífero y células de insectos. Cuando se emplea colágena como material da matriz, puede ser provechoso remover lo que se conoce como el "talopéptido" , que se ub ica. al final de la molécula de colágena y del cual se sabe que induce una respuesta inflamatoria. La colágena empleada en la presente invención puede, si se desea, complementarse con minerales adicionales como por ejemplo calcio, por ejemplo en forma de fosfato de calcio. Tanta la colágena de tipo nativa como recombipante puede ser complementada mediante la mezcla, absorción, a bien asociación de otro tipo con minerales adicionales de esta forma. 5.1.2 EL ADN Los presentes métodos y composiciones pueden emplear varios tipos diferentes de moléculas de ADN. Las molécula de ADN pueden incluir ADN genómico, cADNs , ADN de hebra única, ADN de hebra doble, ADN de hebra triple, ol igonucleótidos y Z-ADN. Las moléculas de ADN pueden codificar varios factores que promueven la curación de las lesiones, incluyendo ARNs y proteínas extracelulares , de superficie celular, e intracelulares . Ejemplos de proteína extracelulares incluyen factores da creci i anto, citpcinas, proteína terapéu ica, hormonas, y fragmentos de péptido de hormona, inhibidores de citscina, factores de crecimiento y de diferenciación de péptidos, interieucinas, qui iocinas, interferones, factores de estimulación de colonias así como factores angiogénicos. 58 Ejemplos de tales proteínas incluyen, sin limitarse a ellos, la superfamilia de molécula TGF-beta, incluyendo las 5 isafar as de TGF-bata y proteínas morfogénicas óseas (BMP), proteínas de enlace latente de TGF-beta LTBP; factor de crecimiento de queratinocito ÍKGF) ; factor de crecimiento de hepatacita (HGF); factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF); factor de crecimiento de tipo insulina (IGF); los factores de crecimiento de fibroblasta básicas (FGF—1, FGF- 2, etc.), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); el Factor VIII y el Factor IX; eritropoyetina (EPO); activador de plasminógeno tisular (TPA); activinas e inhibinas. Hormonas que pueden emplearse en la práctica de la pressnte invención incluyen hormona de crecimiento (GH) y hormona paratiroidea (PTH). Ejemplos de proteínas extracelulares incluyen también las proteínas de matriz extracelulares como por ejempla calágena, laminina, y f ibronect i n . Ejemplos de proteína de superficie celular incluyen la familia de moléculas de adhesión celular (por ejemplo, las integrinas, selectinas, miembros de la familia Ig como por ejemplo N—CAM y Ll, y caderinas); receptores de señalización de ci ocina tales como los receptores de TGF-beta de tipo I y de tipo II y el receptor de FGF; y los co-receptores de señalización como por ejemplo betaglicano y sindecano. Ejemplos de ARNs intracelulares y proteínas incluyen la familia de quinasas de transducción ds señales, proteínas ci toesqueletales camo por ejemplo taima y vinculina, proteínas de enlace de citacina como por ejemplo la familia de prsteínas de enlace latente de TGF-beta, y proteínas nucleares us actúan en trans como por ejemplo factores de transcripción y factores de realce. Las moléculas de ADN pueden también codificar proteínas que bloquean procesas patológicos, permitiendo así que el proceso natural de curación de lesianes se desarrolle sin obstáculos. Ejemplos de factores de blaque incluyen ribosi ñas que destruyen la función de APN y ADNs que, por ejemplo, codifican inhibidores tisulares de enzima que destruyen la integridad de los te idos, por ejemplo, inhibidores de etaloproteinasas asociadas can ia artritis. Uno puede obtener el segmento de ADN codificando la proteína de interés empleando varia técnicas de biología molecular generalmente conocida por parte de los expertos en la materia. Por ejemplo, se puede tamizar bibiiotecas genómicas o cADN empleando iniciadores o bien sondas can secuencias basadas en las secuencias conocidas de nucleótidas. Se puede también emplear una reacción en cadena de palimerasa (PCR) para generar el fragmento de ADN que codifica la prateína de interés. Al erna ivamente, el fragmento de ADN puede obtenerse a partir de una fuente comercial. Genes con secuencias que varían de las descritas en la literatura están también abarcados por la invención en la medida en que el gen alterado o modificado sigue codificando una proteína que funciona para estimular la curación ds lesiones de manera directa o indirecta. Estas secuencias incluyen las causadas por mutaciones de punto, las secuencias debidas a degeneraciones del código genético o variantes alélicas que ocurren naturalmente, y modificaciones adicionales introducidas por manipulación genética, es decir, por la mano del hombre. Técnicas para introducir cambios en las secuencias de nucleótidos diseñadas para alterar las propiedades funcionales de las proteínas o psiipéptidos codificados son bien conocidas en la técnica. Tales modificaciones incluyen la remoción, inseción o sustitución de bases que resultan en cambios en la secuencia de aminoácidos. Se pueden realizar cambios para incrementar la actividad de una proteína codificada, para incrementar su estabilidad biológica o vida media, para cambiar su patrón de gl icosi lación, para proporcionar sensibilidad a ia temperatura o bien para alterar el patrón de expresión de la proteína y similar. Todas estas modificaciones a las secuencias de nucleótidas e.t§p abarcadas por esta invención. El ADN que codifica los productos de translación o transcripción de intarés puede ser manipulado racsmbinantementa ap v rios sistemas de vector que proporcionan la repl icación de ADN a gran escala para la preparación de matrices activadas por genes. Estos vectores pueden ser diseñados para que contengan los elementos necesarios para dirigir la trapscipción y/o translación de la secuencia de ADN recogida por las células de reparación en la herida in vivo. Vectores que pueden emplearse incluyen, pero sin limitarse a ello, los vectores derivados de ADN de bacteriófago reco binante ADN de plásmido o bien AE'N de cós ido. Por ejemplo, vectores de plásmids como por ejemplo pBR322, pUC 19/18, pUC 118, 119 y la serie M12 mp de vectores puede emplearse. Vectores bacteriófagos pueden inclur lambda gtlO, lambda gtíl, lambda gtl8-23, lambda ZAP/R y las series EMBL de vectores bacteriófagos. Vectores cós idss que pueden emplearse incluyen, sin limitarse a ellos, pJB8, pCV Í03, pCV 107, pCV IOS, pTM, pMCS, pNNL , pHSG274, COS202, C0S203, pWE!5, pWE16 y la serie de vectores caromide 9. Los vectores que permiten la transcripción in vitro de ARN, coma por ejemplo los vectores SP6 pueden también emplearse para producir grandes cantidades de ARN que puede ser incorporado en las matrices. Alternativamente, vectores de virus recomb mantés incluyendo. sin limitarse a ellos, ios derivados de virus tales como virus de herpes, retrovirus, virus de va.cc i nia, adenovirus, virus asociados con adeno o bien virus de papiloma bovina pueden ser manipulados.

Mientras sa pueden emplear vectores integrantes, sistemas no integrantes, que no transmiten al praducta genética a células fijas durante muchas generaciones sa prefieren para la curación de heridas. De esta forma, el producto de genes es expresado en el proceso de curación de herida, y conforma el gen es diluido en generaciones subsecuentes, disminuya también la cantidad expresada de producto de genes. Métodos bien conocidos por parte de exper os en la materia pueden emplearse para construir vectores de expresión que contienen la secuencia de codificación de proteínas opera ivamente asociada con señales de control apropiadas de transc ipción/translación. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro asi como técnicas sintéticas. Véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambroak, et al., 1992, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Clonación Molecular, Un Manual de Laboratorio), Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. y Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Bialogy, (Protocolos Actuales en Biología Molecular), Greene Publishing Associates %/. Wiley ?ntersc ience, N.Y. Las genes que codifican las proteínas de interés pueden asociarse opera ivamente con varios elementos pra stores/realzadores diferentes. Los elementos de expresión de estos vectores pueden variar en cuanto a su fuerza y especificidades. Según el sistema huésped/vector empleado, se puede emplear cualesquiera de varios elementos adecuados de transmisión y translación. El promotor puede tener la forma de promotor naturalmente asociado con el gen de interés. Alternati vamente, el ADN puede estar posiciapado bajo el control da tjin promotor raco binante o bien heter?loga, es decir, un promotor no normalmente asociado con este gen. Por ejemplo, elementos promotores/ ea l zadores específicos para tejido pueden emplearse para regular la expresión del ADN transferido en tipos específicos de células. Ejemplos de regiones de control de transcripción que presentan especif icidad tisular descrita y que pueden emplearse, incluyen, sin limitarse a ellas: región de control de gen de elastasa I que es activa en células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDsnald, 1987, Hepatology 7:42S-51S); región de control de gen de insulina que es activa an células Beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); región de control de gen de inmuno lobulina que es activa en células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Ada s et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1.436-1 44); región de control de gen de albúmina que es activa an el hígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel . 1:268-276); región de control de gen de alfa-fetoproteína que es activa en el hígada (Kru la?f et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); región de control de gen de alfa- 1-ant itr ipisina que es activa en ei hígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devei. 1:161-171); región de control del gen de beta-glabina que es activa en células mieloide (Magram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cali 46:89-94); región de control de gen de proteína básica de miel ina que es activa en células de ol igodendroci tos en el cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); región de control de gen de cadena ligera—2 de miasina que es activa en músculo esqueletal (Shani , 1985, Nature 314:283-286); y región de control de gen de hormona de liberación ganadotrópica que es activa en el hipstáiamo (Masan et al., 1986, Science 234:1372-1378). Se pueden emplear promotores aislados a partir del genoma de virus que crecen en células de mamíferos, (por ejemplo, RSV, virus 7.5 de vaccinia, SV40, HSV, adenovirus MLP , y promotores LTR y CMV MMTV) , asi como promates producidos por ADN recombinante o biep técnicas sintéticas. En algunos casos, los elementos promotores pueden ser promotores cons i u i os o bien induc ibles y pueden emplearse ba o las condiciones apropiadas para dirigir una espresión regulada o de alto nivel del gen de interés. La expresión de genes bajo el control de promotores constitutivos no requiere de la presencia de un sustrato específico para inducir la expresión de genes y ocurr i rá bajo todas las condiciones de crecimiento celular. En contraste, la expresión de genes controlada por promotores inducibles responda a la presencia o ausencia de un agente de inducción. Sa requieren también de señales de iniciación específica para una translación suficiente de secuencias de codificación de protaína insertada. Estas señalas incluyen el cadón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. En casos en los cuales la secuencia de codificación entera, incluyendo el cadón de inserción y secuencias adyacentes están insertadas en los vectores de expresión apropiados, puede no requerirse de señales adicionales de control de translación. Sin embargo, en casos en los cuales solamente se inserta una parte de la secuencia de codificación, se deben proveer señales de control de translación exógenas, incluyendo el codón de iniciación ATG. Además, el codón de iniciación debe estar en fase con el cuadro de lectura de las secuencias de codificación de prsteína para asegurar la translación del inserto entero. Estas señales exógenas de control de translación y codones de iniciación pueden ^er de varios orígenes, tanto naturales coma sintéticos. La eficiencia y control de la expresión puede i p lament rse mediante la inclusión de secuencias de atenuación de transcripción, elementos incrementadores, etc.

Adam s de las secuencias de ADN que codifican proteínas terapéuticas de interés, el alcance de la presente invención incluye el uso de moléculas de ADN de antisentido o ribozimas que pueden ser transferidas en la célula de reparación de mamífero. Tales moléculas de antisentido y ribazi as pueden emplearse para inhibir la translación de ARN que codifica proteínas de genes que inhiben un proceso de enfermedad o bien ei proceso de curación de lesión permitiendo así que se lleve a cabo la reparación del tejido. La expresión de moléculas ded ARN de antisentido actuará para blsquear directamente ia translación de tnARN enlazándose a mARN blanco y evitando la translación de proteína. La expresión de ribozimas, que son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar la disociación específica de ARN puede también emplearse para bloquear la translación de proteína. El mecanismo de acc i ón de las ribozimas incluye la hibridación específica de secuencias de la molécula de ribozima con ARN blanco complementario, seguido por una disociación endonu.cleol í t ic . Dentro del alcance de la invención se manipulan moléculas de ribozi>t.a con motivo de cabeza de martillo que catalizan específica y eficientemente la disociación endonucleal í ica de secuencias de ARN. Se pueden generar moléculas de ARN mediante la transcripción de secuencias de ADN que codifican la molécula de ARN. Dentro del alcance de la presente invención se pueden emplear también múltiples genes, combinados en un constructo genético único bajo ei control de uno o varios promotores, o bien preparados co o constructos separados del mismo tipo o bien de tipos difarentes. Así, se puede emplear una combinación casi infinita de diferentes genes y constructos genéticos. Ciertas combinaciones de genes pueden ser diseñadas o bien su uso puede re istrar de otra en el logro de efectos sinergéticos sobre la estimulación y regeneración de células, todas y cada una de estas combinaciones se encuentran dentro del alcance de la presente invención. De hecho, se han descrita muchos efectos sinergéticos en la literatura científica de tal manera que una persona con ciertos conocimientos en la materia podría fácilmente identifica combinaciones de genes propablemanta sinergét icas, o bien hasta combinaciones de genes y proteínas. 5.1.3. PREPARACIÓN DE LAS MATRICES ACTIVADAS POR. GENES En modalidades preferidas, una matriz o material de implante entra an contacto can al ADN que codifica un producto terapéutica de interés mediante la inmersión del material de matriz en una solución madre de ADN recombí nante. La cantidad de ADN, y la cantidad de tiempo de contacto requerido para la incorporación del ADN en la matriz, dependerá del tipo de matriz empleado "y una persona con ciertos conocimientos en la materia podrá determinarlos fácilmente sin experimentos extensivos. Alternativamente, el ADN puede estar encapsulada dentro de una matriz de polímeros sintéticos como por ejemplo polímeros de bloques de ácido pol iactic-poi igl icol ico (véase Langer y Fslkman, 1976 Na ture, 263:797-800 que se incorpora aquí por referencia). Otra vez, estos parámetros pueden ser fácilmente determinados por parta de una persona can ciertos conocimientos en la materia sin experimentos extensivos. Por ejemplo, la cantidad de un constructo de ADN que es aplicada a la matriz será determinada considerando varios factores biológicos y médicos. Se toma en consideración el gen particular, la matriz, el sitio de la herida, la edad del huésped mamífero, sexo y dieta así camo factores clínicos adicionales que pueden afectar la curación de la herida como por ejemplo ios niveles séricos de varios factores y hormonas . En modalidades adicionales de la invención, se pueden liofilizar juntas composiciones de matrices biológicas y sintéticas y ADN con el objeto de formar un polvo farma u ico seco. La matriz ac ivada por yenes pueden ser rehidratadas antes de su implantación en el cuerpo, o bien al ternati amente, la matriz asociada por genes pueda ser rehidratada naturalmente cuando se coloca en el cuerpo.

En algunos casos, dispositivos mé icos como par ejemplo implantes, suturas, curaciones de herida, etc. pueden estar revestidos con las composiciones de ácidos nucleicos de la invención empleando técnicas convencionales de reves imiento bien conocidas. Tales métodos incluyen, a título de ejemplo pero no limitativo, la inmersión del dispositiva en la composición de ácido nucleico, la aplicación con cepillo de composición de ácidos nucleicos sobre el dispositivo y/o el rociado del dispositivo con las composiciones de ácidos nucleicos en aerosol. El dispositivo es después secado, ya sea a temperatura ambiente o bien con la ayuda de un horno de secado, opcional ente bajo presión reducida. Un método preferido para el recubrimiento de suturas se ofrece en los e emplos . En el caso de suturas revestidas con una matriz polimérica que contiene ADN de plásmido, los solicitantes han descubierto que la aplicación de una composición de revestimiento que contiene un total de aproximadamente .Ol a 10 mg de ADN de plásmido y de preferencia de aproximadamente l 5 mg de ADN de plásmido, sobre una sutura de 70 cm de longitud empleando ap oximadamente 5 a 100, de preferencia aproximadamente 5 a 50, y con mayor preferencia aproximadamente 15 a 30 aplicaciones de reves imiento proporciona un revest imienta uniforme y terapéut icamente efectivo.

En una modalidad particularmente preferida, la invención ofrece suturas revestidas, espe ialmente suturas revestidas con una matriz poiimé ica que contiene ácidos nucleicos que codifican proteínas terapéuticas que estimulan la curación de lesiones in vivo. Suturas que pueden ser revestidas de conformidad con las métodos y composiciones de la presente invención incluyen cualquier sutura de origen natural o sintético. Materiales típicos de sutura incluyen, a título de ejemp lo y no de limitación, seda, algodón, lino, psliolefinas como por ejemplo polietileno y polipropileno, paliésteres como por ejemplo tereftalata de pol ieti laño, homopolímeros y copolímeros de steres de ácido hidraxicarbsxí 1 ico, colágena (simple o cromada), cuerda de tripa de gato (simple o cromada), y sustitutos de sutura como por ejemplo cianaacri latos. Las suturas puede tener cualquier forma conveniente co o por ejemplo trensas o porciones, y pueden tener un amplio rango de tamaños como se emplea habi tuanmente en la técnica. Las ventajas de suturas revestidas, especialmente suturas revestidas con una matriz polimérica que contiene ácidos nucleicos que codifican proteínas terapéu icas que estimulan la curación de herida abarcan virtualmente todo el mbito del uso quirúrgico en seres humanos y animales. 5.2 USOS DE LA MATRIZ ACTIVADA POR GENES La invención puede aplicarse a un amplio rango de situaciones de curación de heridas en la medicina humana.

Estas situaciones incluyen, sin limitarse a ellos, reparación de huesos, reparación de tendón, y reparación de ligamento, reparación de vaso sanguíneo, reparación de músculo esqueletal, y reparación de ia piel. Por ejemplo, mediante el uso de una tecnología de matriz activada por genes, los factores de crecimiento de citacina producidos por células de reparación transfectadas influencian otras células en la herida, a través del enlace de receptores de señalización superficiales de la célula, estimulando y amplificando así la cascada de eventos fisiológicos normalmente asociados con el proceso de curac i ón de herida.

El resultado final es el incremento de la reparación y regeneración tisular. El método de la presente invención es también útil cuando el objeto químico es bloquear un proceso de enfermedad, permitiendo así la curac i ón natural de tejido, o bien cuanto el objetivo es reemplazar una función de proteína genéticamente defectuosa. Las lesiones pueden surgir de daña traumática o bien al ernativamente o bien de daño traumático o bien alternativamente, de daño a los tejidos inducidos por un procedimiento qu i rúrg ico o bien resultantes de un procedimiento quirúrgico. La matriz activada por genes de la presente invención puede ser transferida al paciente usando varias técnicas. Por ejemplo, se pueden transferir matrices di ecta ente al sitio de la herida por la mano del médico, ya sea coma implante terapéutico o bien como dispositivo revestido (por ejemplo, sutura, implante revestido, etc.).

Las matrices pueden administrarse tópicamente, ya sea colocadas qui úr icamente en un sitio de tejido normal con el objeto de tratar tejido enfermo a cierta distancia. El proceso de curación de lesiones es una secuencia coordinada de eventos que incluyen, emorragias, formación de coágulos, disolución del coagulo can remoción concurrente da tejido dañado, y depósito de tejido de granulación como material inicial de reparación. El tejido de granulación es una mezcla de fibroblastos y basos sanguíneos capilares. El proceso de curac i ón de herida incluye varias poblaciones celulares incluyendo células endotel iales, películas precursoras, macrófagos y fibroblastos. Las factores de regulación involucrados en la reparación de una lesión son conocidos e incluyen hormonas sistémicas, citocinas, factores de crecimiento, proteínas de matriz extracelulares y otras proteínas que regulan el crecimiento y la di feranc iac ion. Los métodos de tran ferenci de ADN y compo iciones de matriz de la presente invención tendrán un amplio rango de aplicaciones como método de suministro de fármaco para estimular la reparación y regeneración de tejidos en una variedad de tipos diferentes de tejidos. Estas situaciones incluyen, sin limitarse a ellas, reparación de hueso, reparación de piel, repraci?n de tejido conectivo, regeneración de órganos, o bien regulación de la vasculogénesis y/a angiogépesis. El uso de matrices activadas por genes puede también emplearse para tratar pacientes con una capacidad de curación afectada como resultado, por ejemplo, de los efectos de la edad o diabetes. Las matrices pueden también emplearse para el tratamiento de lesiones que sanan lentamente debido a razones naturales como por ejemplo, en pacientas ancianos, y en pacientes que no responden a las terapias existentes cama por ejemplo en los pacientes con lesiones cutáneas crónicas. Una característica importante de la presente invención es que la formación de tejido de cicatrización en el sitio de ia lesión pueda ser regulada mediante el uso selectivo de matrices activadas por genes. La formación de tejido de cicatrización puede ser regulada mediante el control de los niveles de proteína terapéutica e:-presad?. En algunos casos, como por ejemplo en tratamiento de quemaduras o de d ^o al tejido conectivo, es especialmente deseable inhibir la formación de tejido da cicatrización. Los métodos de la presente invención incluyen el injerto o transplante de las matrices que contienen el ADN de interés en el huésped. Proedimientos para transplantar las matrices pueden incluir colocación quirúrgica, o bien i nyecc i ón de las matrices en el huésped. En casos en los cuales se deben de inyectar matrices, las matrices se colocan en una jeringa y se inyectan en un paciente en ei sitio de la lesión. Se pueden hacer inyecciones útiples en el área de la herida. Alternativamente, las matrices pueden colocarse de manera quirúrgica en el sitio de la herida. La cantidad de matrices requeridas para lograr el propósito de la presente invención, es dec i r , la estimulación de la reparación y regeneración de herida varía según el tamaño, la edad y ei peso del huésped. Es u a caracterís ica esencial de la invención que si una matriz activada por ganes es transferida al huésped, ya sea por inyección o intervención quirúrgica, que el daño tisular local es suficiente para inducir el proceso da curación de herida. Es un requisito necesario para la inducción de la migración y proliferación de las células de reparación de mamífero blanco hacia el sitio de la matriz activada por üßpss .. A con inua i n se describen modalidades espe ífi a . 5.3 REGENERACIÓN DE HUESO El hueso tiene una capacidad de regeneración sustancial después de una fractura. La secuencia de reparación de fractura completa pero ordenada incluye he ostasis, disolución de coágulo, crecimiento de tejido de granulación, formación de un callo, y remodelación del callo hasta obtener una estructura optimizada (A.W. Ha . , 1930, J. Bone Joint Surg. 12, 827-844). Células que participan en este proceso incluyen plaquetas, células inflamatorias, fibroblastos, células endotel iales, pericitos, osteoclastos, y progenitoras osteogénicss. Racientemante, se identificaron varios factores de diferenciación y crecimiento de péptido que parecen controlar los eventos celulares asociados con la fora ción y reparación de huesos (Erlebacher, A., et al., 1995, Cell 80, 371-378). Las proteínas morfogénicas óseas (BMPs), por ejemplo, son factores extracelulares solubles que controlan el porvenir de la célula osteogénica: los genes de BMP se expresan normalmente mediante osteoblastos fetales cultivados (Harris, S.E. et al., 1994, J. Bone Min. Res. 9, 389—394) y por osteablastos durante la esqueletogéne i de embriones de ratón (Lysns, .M., et al., 1989, Genes Dev. 3, 1657-1668; Lyons, K.M. at al., 1990, Development 190, 833-844; Jones, M.C. , et al., 1991, Develament 111, 531-542), las proteínas BMP recombinantes inician la diferen iación de células progenitoras de cartílago y hueso (Yamaguchi, A., et al., 3.991, J. Cell Bisl. 113, 681-687; Ahrens, M. , et al., 1993, J. Bone Min. Res. 12, 871-880; Giteiman, S.E., et al., 1994, J. Cell Biol., 126, 1595-1609; Rosen, V. , et al., 1994, J. Cell Biol. 127, 1755—1766) , el suministro de BMPs recombi nte induce una secuencia de formación de hueso similar a la formación de hueso endocombral (Wozney, J.M., 1992, Mol. Reprod. Dev. 32, 160-167; Reddi, A.H., 1994, Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 737-744), y la expresión de gen de BMP-4 es desregulada a temprana hora en el procesa de reparación de fracturas (Nakase, T., et al., 1994, J. Bane Min. Res. 9, 651-659). La proteína asteogénica í, un miembro de una familia de moléculas relacionadas con las BMPs (Ozkaynak, E. , et al., 1990, EMBO J. 9, 2085-2093), puede tener efectos similares in vitra e in vivo (Sampath, T.K. , et al., 1992, J. Bioi. Chem. 267, 20352-20362; Cook, S.D., et ai., (1994) J. bone Joint Surg. 76-A, 827—838). Se ha mostrado también que TGF-beta puede estimular la formación de cartílago y hueso in vivo (Cantrella, M. , et al., 1994, Endocrina Rev. 15, 27-38; Su ner, D.R., et al., 1995, J. Bone Joint Surg. 77A, 1135-1147). Finalmente, la hormona paratiroidea (PTH) es una hormona de 84 aminoácidos que eleva la concentración plasmática en fluido extracelular de Ca++. En tejidos esqueletales, la administra ión inteligente de un fragmento de PTH que posas los reque imientos es ru u les para actividad biológica (aa 1-34) produce un afecto anabólico verdadero: numerosos estudios in vivo a in vitro proporcionan una evidencia clara que la adminis ración de PTH1-34 en animales (incluyendo ratas) resulta an la formación independiente de hueso de alta calidad debido a un efecto inhibitorio combinado sobre los osteaclastos y un efecto eti ulatorio sobre la célula osteogénica (Dempstar, D.W., at al., 1993, Endocrina Rev . 14, 690-709). El péptido PTH1-34 interactúa ci ergéticamente con BMP-4, lo que regula hacia arriba la expresión de receptares de PTH de superficies celulares funcionales en astrablaßtos in vitro (Ahrens, M. , et al., 1993, J. Bane Min. Res. 12, 871-880). Como proteínas recombi antes, factores de crecimiento y diferenciación de péptido, como por ejemplo BMP y TGF-betal representan alternativas terapéuticas promisorias para la reparación de fracturas (Wozney, J.M., 1992, Mol. Reprsd. Dev. 32, 160-167; Reddi, A.H. , 1994, Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 737-744; Centrella, M. , et al., 1994, Endocrine Rev. 15, 27-38; Su ner, D.R., et al., 1995 J . Bone Joint Surg. 77-A, 1135-1147). Sin embargo, se requieren de dosis relativamente la es (cantidades dei orden del microgramo) para estimular una formación significativa de hueso nueva en animales, creando preocupación an el sentido que terapias humanas futuras puedan ser costosas y puedan tener un riesgo incrementado de toxicidad. En una modalidad de la presente invención, se implantan quirúrgicamente matrices activadas por genes en un sitio da osteotomía de 5 m en la rata, un modelo de fractura compleja que no sana en seres humanos. Los presentes inventores han encontrado que la tranferencia de genes hacia células de reparación en el hueco de osteotomía puede lograrse fácilmente. Defectos en el proceso de reparación y regeneración de huesos se asocian con complicaciones significati as en la práctica ortopédica química, por ejemplo, no unión fibrosa después de fractura de hueso, fracasos de interfaz de implante y fracasos de aloinjertos grandes. Muchas fracturas completas están actualmente tratadas empleando autsinjertos, pero esta técnica no es efectiva y se relaciona con co pl icac iones. Naturalmente, cualquier nueva técnica diseñada para estimular la reparación de huesos sería una herramienta valiosa para el tratamiento de fracturas de huesos. Una parte signific ti a de los huesos fracturados sigue siendo tratada ediante enyesado, permitiendo que mecanismos naturales efectúen la reparación de ia lesión. Aún cuando se realizaron progresos en cuanto al tratamiento de las fracturas en años recientes, incluyendo dispositivos mejorados, el desarrollo de nuevos procesos para estimular o bien com lementar los mecanismos de reparación de adhesiones sería un progreso importante en este campo. La presente invención puede emplearse para transferir un gen de crecimiento óseo para promover la reparación de fracturas. Otros aspectos importantes de asta tecnología incluyen el uso de transferencia de genes para tratar pacientes con "huesos débiles", como por ejempls en enfermedades de tipo osteoporssis; para mejorar la curación insuficiente que puede surgir por razones desconocidas, por ejemplo, no unión fibrosa; para promover ia integración de implantes y la función de articulaciones artificales; para estimular la curación de otros te idos esqueletales co o por ejemplo tendón de Aqui les; y como auxiliar para reparar defectos da gran tamaño. Se sabe que el tejido óseo tiene la capacidad de reparación y regeneración y existe una cierta comprensión de la base celular y molecular que sustenta dichos procesos. El inicio de la formación de hueso nuevo incluye la par icipación de células de reparación, su expansión clanal y su di erenciación. Una vez iniciada, i formación de hueso es promovida por varios factores de crecimiento de polipéptido. el hueso recién formado es después mantenida por medio de una serie de factores de crecimiento y diferenciación locales y sisté icos. Varios genes de proteína orfogenét ica ósea han sido clonados (Wozney et al., 1988; Rosen et al. 1989, Connect. Tissue Res., 20:313:319; resumido en Alper, 1994) y este trabajo ha establecido a las BMPs como miembros de la superfamil ia de factor de crecimiento transformante beta (TGF—beta) en base a homologías de secuencia de ADN. La clonación de genes de BMP distintos provocó la designación de genes de BMP individuales y proteínas como por ejemplo BMP-1 hasta al menos BMP-8. Se considera generalmente que las BMPs 2-8 son asteogénicas mientras que la BMP—1 pueden tener un orfógeno más generalizado (Shimell et al., 1991, Cell, 67:469-481). La BMP-3 se conoce también como osteógena (Luyten et al., 1989, J. Biol. Chem., 264:13377-13380) y la BMP-7 se conoce también como 0P-1 (Ozkaynak et al., 1990, EMBO J., 9:2085-2093). Los TSFs y BMPs actúan sobre células a través da interacciones completas, específicas para tejidos con familias de receptores ds superficie de células ÍRoberts %-. Sporn, 1989, M.B. Sporn y A.B. Roberts, Eds., Spr inger-Verlag, Heidelberg, 95 (Parte 1); Aralkar et al., 1991). Se ha mostrado también que factores de crecimiento transformantes (TGFs) tienen una función central en la regulación de la curac i ón tisular afectando la proliferación celular, expresión genética, y síntesis de proteína de matriz {Roberts . Sporn, 1989, M.B. Sporn y A.B. Roberts, Eds., Spr inger-Ver lag , Heidelberg, 95 (Parte 1)). Par ejemplo, TGF—beta! y TGF—beta2 pueden iniciar tanto ia cong agénesis como la o eogéne is (Joyce et al., 1990, J. Cell Biol., 110; 195-2007; Izu i et al., 1992, J. Bone Min. Res., 7:115-11; Jingushi et al., 1992, J. Qrthap. Res., 8:364-371).

Otros factores da crecimiento/hormonas además de TGF y BMP pueden emplearse en ia práctica de la presente invención para i fluenciar la formación de huesa nuevo después de una fractura. Por ejemplo, un factor de crecimiento de fibroblasto inyectado en un sitio de fractura de rata (Jingushi et al., 1990) en dosis múltiples elevadas (1.0 mg/50 mi) resultó en un incremento significativo de tejido de cartílago en el hueco de la fractura, mientras que dosis menos elevadas no tuvieron efecto. Hormonas reguladoras de calcio co o por ejemplo hormona paratiraidea (PTH) pueden también emplearse en un aspecto de la presente invención. La PTH es una hormona de regulación de calcio de 84 aminoácidos cuya función principal es alevar la concentración de Ca++ en el plasma y en el fluido extracelular. Se ha mostrada también que PTH intacta estimula la reabsorción ósea en cultivo de órgano hace más de 30 años, y se sabe que ia hormona incrementa el número y la actividad de asteoblastos. Estudios con hormona nativa y con péptidos sisntéticos han demostrado que el extremo amino de la molécula (aa— í—34) contiene los reque imientos estructur les para la actividad biológica (Tregaear et al., Í973; Her ann—Erlee et al., 1976, Endocrina Research Communications, 3:21-35; Riond, 1993, Clin. Sci., 85:223-228) . En una modalidad de la presente invención, las matrices activadas por genes se implantan quirúrgicamente en el sitio de la fractura ósea. Tales procedimietos quirúrgicos pueden incluir inyección directa de una separación de GAM an el sitio de la fractura, la reparación quirúrgica de una fractura completa, o bien intervención quirúrgica artroscópica . En casos en los cuales se emplean matrices activadas por genes para reparar el hueso fracturado, las células de reparación de mamíferos migrarán y praliferarán naturalmente en el sitio del daño al hueso. Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que la transferencia de genes en células de reparación en la regeneración de tejido en el hueco de osteotomía podía llevarse a cabo fácilmente. Actualmente, las métodos preferidos para lograr la transferencia de genes incluyen generalmente el uso de material de implante de colágena fibrosa involucrado an una solución de ADN poco antes de su colocación en el sitio en el cual uno desea promover el crecimiento óseo o bien el uso de una preparación de ADN de plásmido encapsulado en una matriz sintética co o por ejemplo un copol ímera da bloque de PLGA. Co o los estudios presentados aquí lo muestra, al material de implante facilita la absorción enfocada de constructos de plásmicos exógenos por células en el hueca de osteotomía, lo que ayuda claramente a la regeneración/ reparación del hueso. Los transgenes, después de la absorción celular, dirigen la expresión de polipéptidas recombinantes, como se muestra mediante la expresión in vivo de productos de genes marcadores funcian les. Estudios adicionales se presentan aquí que demuestran que la transferencia de un gen asteotrópico resulta en la expresión celular de una molécula asteatrópica recombinante, dicha expresión es relacionada directamente con la estimulación de formación de hueso nuevo. Específicamente, un vector de tran ferencia de genes que codifica BMP-4 y un vector de transferencia de genes que codifica un fragmento de PTHi— 4 humana, sola y en combinación, estimulará nueva formación ósea. Después de considerar un número relativamente grande de genes candidatos, un vector de transferencia de genes que codifica un fragmento de hormonas paratiroidea humana, hPTHl-34, estimulará la nueva formación ósea en ratas Sprague-Dawley , indicando que el péptido humano puede unirse eficientemente sobre el receptor PTH/PTHrP en la superf ic ie celular de asteoblasts de rata. 5.4 TEJIDOS BLANDOS La presente invención puede emplearse también para estimular el crecimiento o la regeneración de tejidos blandos como por ejemplo ligamento, tendón, cartílago y piel. Daños al tejido conectivo esqueletal provocados por lesiones traumáticas pueden ser tratados usando matrices que contienen ganas que codifican varios factores de crecimiento. El tejido conectivo consiste habi tuai ente de células y matriz extracelular organizada en una arqui ectura de tejida característica. Lesiones tisulares pueden interrumpir esta arquitectura y estimular una respuesta de curación de herida. Los métodos de la presente invención son especialmente bien adecuados para la estimulación del crecimiento y regeneración de tejido caneetiva puesto que es importante que el tejido dañado se regenere sin formación de tejido de cic trización puesto que el tejido de cicatri ación puede interferir con la función mecánica normal del tejido conectivo. Se pueden emple r varios factores de cree imiento para promover la reparación de tejido blando. Estos factores incluyen, sin limitarse a ellos, miembros de la superfamilia de TGF-Beta (por ejemplo, TGF-Beta mismo), que estimula la expresión de genes que codifican proteínas de matriz extracelulares, y otras citocinas como por ejemplo EGF y PDGF. Ejemplos de otros genes que pueden ser empleados incluyen (a) c i tac i ñas tales camo los factores de crecimiento y diferenciación de péptidos, i terleucinas, qu.imio inas, interferones, factores de estimulación de colonias; (b) factores angiogénicos co o por ejemplo FGF y VEGF; (c) proteínas de matrices extracelulares camo por ejemplo colágena, la inina, y fibronectina; id) la familia de moléculas de adhesión celular (por ejemplo, las integrinas, seiectinas, miembros de familias de Ig como por ejemplo N-CAM y Ll, y caderinas); (e) receptores de señalización de citocina de superficie celular como por ejemplo los receptores TGF-Beta de tipo I y de tipo II así camo los receptores FGF; (f) coreceptores de no señalización camo por ejemplo betaglicano y sindecana; (g) la familia de quinasas transductoras de señales; (h) proteínas ci toesqueletales co o por ejemplo talina y vinculina; (i) proteínas que se unen a citocinas como por ejemplo la familia de proteína de enlace latente de TGF-Beta; y {j) proteínas nucleares de acción trans co o por ejemplo factores de transcripción. Una vez formadas, estas matrices pueden colocarse en el mamífero huésped an el área de la herida de tejido conectivo. Las matrices activadas por genes pueden ser inyectadas directamente en el área de daño al tejido conectivo. Alternativamente, técnicas quirúrgicas, como por ejemplo intervención quirúrgica artrascópica , pueden emplearse para suministrar las matrices en el área de la lesión 3l te ido conectivo. 5.5 REGENERACIÓN DE 0BGANOS La presente invención puede también emplearse para estimular la reparación y regeneración de tejida de órgano» Daños a órganos provocados por lesiones traumáticas o bien intervención quirúrgica pueden tratarse mediante el uso de los métodos de la presente invención. En el caso del hígado, el hígado puede estar dañado debido a un consuma excesivo de alcohol o bien debido a infección con varios tipas de agentes infecciosas co o par ejemplo virus de hepatitis. Los ríñones pueden también fallar como resultada de daño provocado por enfermedad renal. Membranas mucasales del esófago, estómago o duodeno pueden csntener ulceraciones provocadas por ácido y pepsina en jugos gástricos. Las ulceraciones pueden también relacionarse con la colonización de las células mucosales gástricas por bacterias Helicobacter pylori. Estos órganos y enfermedades sirven solamente co o ejemplos, los métodos de la invención pueden también emplearse para tratar enfermedades o para estimular la regeneración de órgana en cualquier órgano del cuerpo^ Matrices que contienen ADN que codifica citocinas que estimulan la pro iferación y diferenciación de células, y/o regulan la morfogénesis tisular, puedan trapsplantarse en el sitio del órgano apropiado. Tales fac ores pueden incluir, sin limitarse a ellos, la familia de proteínas de factor de crecimiento transformante, el factor de crecimiento derivado de plaquetas i'PDGF), el factor de crecimiento de tipo insulina fIGF) y el factor de e imi n o de fibroblasto (PDGF). En algunos casos, puede ser útil expresar factores de crecimiento y/o citocinas que estimulan la proliferación de tipos celulares específicos para un órgano dado, por ejemplo, hepatocitos, células renales o cardiacas, etc. Por ejempls, se puede expresar el facbor de crecimiento de hepata itss para estimular el proceso de curación de lesión en al hígado. Para el tratamiento de úlceras resultantes de infección por Hel icobacter , las matrices activadas por genes pueden contener ADN que codifica proteínas antimicrobianas. Las matrices activadas por genes de la presente invención pueden ser implantadas quirúrgicamente en el órgano a tratar. Alternativamente, se puedan emplear procedimientos quirúrgicos laproscópicss para transferir las matrices activadas por genes en el cuerpo . En casos en los cuales el tratamiento responde a una lesión tisular, el proceso natural de curac ión de herida estimularán la migración y proliferación de las células de reparación hacia las matrices transplantadas. Altern tivamente, cuando las matrices activadas por genes son transferidas a órganos que no han sido dañados, par ejemplo, cuando se implantan matrices para expresar proteínas terapéuticas na invol ucradas en la curac ión de heridas, se puede estimular el proceso de curación de heridas mediante la inducción de lesiones ti silla es. 5.6 REGULACIÓN DE l A A GJOG?NESIS La presenta invención puede emplearse también para regular la formación y expansión de vasos sanguíneos, o bien vasculsgénesi s y angisgénesis , respectivamente. Ambos procesos fisiológicos desempeñan una función importante en la curación de heridas y en la regeneración de órganos. ?nicialmente, en el sitio de una herida, se deposita un te ido de granulación que es una mezcla de colágena, matriz y vasos sanguíenos, y proporciona resistencia a la herida durante la reparación tisular. La formación de nuevos vasos sanguíneos incluye ia proliferación, migración e infiltración de células endateliales vasculares y se sabe que es regulado por varios factores de crecimiento de polipéptidos. Se identificaron varios polipéptidos con una actividad de promoción del crecimiento de células endoteliales, incluyendo factores de crecimiento f ibrabkástics ácido y básico (FGF) , factor de crecimiento endatelial vascular (VEGF), y factor de crecimiento derivado placental iPOBF . Para estimular la formación y diseminación de vasos saguíneos, el ADN que codifica dichos factores de crecimiento puede incorporarse en matrices y estas matrices pueden implantarse en el huésped. En algunos casos, puede ser necesario inducir el proceso de curación de leáión a través >Js heridas al tejido. Puede ser deseable inhibir la proliferación de la formación de vasos sanguíneos coma por ejemplo en angiagénesis asociada con el crecimiento de tumores sólidos que dependen de vascularización para su crecimiento. La angiogénesis tumoral puede ser inhibida a través de la transferencia de ADN que codifica inhibidores negativos de la an iagénesis, co o por ejemplo la trombospandina o la angiostatina . En modalidades específicas de la invención, el ADN que codifica por ejemplo la trombospondina o la angiostatina puede incorporarse en una matriz seguido por- la implantación de la matriz en un pacienta en el sitio del tumor. 5.7 REPARACIÓN DE LA PIEL La presente invención puede también emplearse para estimular ei crecimiento y la reparación de te ido cutáneo. En lesiones que involucran dañas a áreas de la piel, y particularmente en el caso de quemaduras masivas, es importante que la piel crezca muy rápidamente con el ob eto de evi ar infecciones, reduc i r pérdida de fluido, y reduci r el área de cicatrices potenciales. El daño a la piel que resulta de quemaduras, perforaciones, cortes y/o abrasiones puede ser tratado empleando las matrices activadas por genes de la presente invención. Trastornos cutáneos camo por ejemplo psoriasis, dermatitis atópica o bien daño cutáneo que surge de infecciones fúngales, bacterianas y virales o bien del tratamiento de cánceres de la piel co o por ejemplo melanoma, pueden también ser tratados usando los métodos de la presente invención. Matrices que contienen ADN que codifica citocinas que estimulan la proliferación y diferenciación de células de la pial, incluyendo células pracusoras básales centrales, quer tinocitas, elanocitos, células de Langerhans y células de Mer el pueden emplearse para tratar daños y trastornos cutáneos. Las matrices activadas por genes tienen dos propósitos, la protección de la herida contra infección y deshidratación y el suministro del ADN para su absorción por células de reparación. Las matrices activadas par genes de la presente invención pueden incluir parchas dérmicas, pisi de cadáver, bendas, gasas, reticulados de colágena como los presentados en la Patente Norteamericana 4,505,266 o bian en la Patente Norteamericana 4,485,097, cre ans o geles tópicos. Antes de la aplicación de las matrices sobre el sitia de la lesión, se puede remover la piel dañada o el tejida desvitalizada. El ADN a incorporar en las matrices puede codificar varios factores de crecimiento diferentes incluyendo el factor de crecimiento de querat inoci to (KGF) o bien el factor de crecimiento epidérmico (EGF). El ADN que codifica I —1 del cu l se sabe que es un inductor potente de la migración y proliferación de células epiteliales como parte del proceso de cu ra i n puede también incorporarse en las matrices de la presente invención. 6. EJEMPLO: MATERIAL DE IMPLANTE FARA SU USO EN TRANSFERENCIA DE GENES EN HUESO Se pueden emplear varios materiales de implante para transferir genes al sitio de t'epa rac i ón y/o regeneración ósea in vivo. Estos materiales están indebidos en una solución que contiene el ADN a gen que debe de transferirse al sitio de nuevo crecimiento óseo. Alternativamente, se puede incorporar el ADN en la matriz según un método preferido. Un ejemplo particular de un material adecuado es colágena fibrosa que puede liofilizarse después de la extracción y purificación parcial a partir del tejido y después esterilizarse. Otra colágena particularmente preferida es colágena de tipo II con la colágena más p rticularme e preferida siendo o bien colágena recambinante de tipo II o bien colágena mineralizada de tipo II. Antes de la colocación en sitios de osteotomía, los materiales de implante está indebidas an solucionas de ADN (o bien virus) bajo condiciones estériles. La inmersión puede llevarse a cabo durante cualquier periodo de tiempo apropiado y conveniente, fpor ejemplo, de 6 minutas a una noche. La solución de ADN fpor ejemplo, plásmido) es una solución acuosa estéril, como por ejemplo agua estéril, o bien un regulador aceptable, y la concentra ión se encuentra generalmente entre aproximadamente 0.5 y 1.0 mg/ml. Los plásmidos actualmente preferidos son los plásmidas tales co o pGL2 romega), pSV40Beta-g l , pAd.CMVlacZ, y pcDNA3. 7. EJEMPLO: DETECCIÓN DE PROTE1NA IN VIV DESPUÉS DE EXPRESIÓN DE TRANSGENES 7.1 TRANSGEN DE BETA-GALACTOSIDASA Se pueda detectar inmunohistoqui icamente beta-galactosidasa bacteriana. Se fijan muestras de tejido da osteotomía en líquido de fijación de Bouins, dichas muestras son desmi ñera 1 izadas y después cortadas a la mitad a lo largo del plano longitudinal. Una mitad de cada muestra fue integrada en parafina para identificación inmunohistoquímica subsecuente de la proteína de beta-g lactasidasa bacteriana. En el casa de la in unoh istoquímica , cortes transversales (de un espesor de 2 a 3 m) fueron transferidos a platinas de microscopio revestidas con pal i-L-1 isina y fijadas en acetona a una temperatura de 0°C durante al menos 20 ip. Las secciones fueron rehidratadas en PBS. Se apagó la acti' idad de paroxidasa endógena mediante inmersión de las secciones de tejido en peróxido de hidrógeno al O. IX (en metanol al 95X) a temperatura ambiente durante 10 minutos, y las secciones apagadas fueron lavadas 3x en PBS. En algunos casos, calvarías seccionadas fueron desmi ñera 1 izadas por inmersión en EDTA al -% , pol i vini ipirrolodina al 5%, y sucrosa al 7% . 7.4, durante 24 horas a 4°C. Las secciones desminer lizadas fueron lavadas 3x antes de su. aplicación p a an icuerpos. Se emplearon anticuerpos primarios sin dilución en forma de sobrenadante de hibridoma. Los anticuerpos purificados fueron aplicados a secciones tisulares en una concentración de 5 mg/ml. Se detectaron anticuerpos primarios con IgS de antiratón de conejo biotinilada y estre tavid ina conjugada con peroxidasa (Zy ed Histostain-SPki t) . Despuués de tinción con peroxidasa, secciones fueron contrateñidas con hematoxilina. Se detectó también beta-gal bacteriano mediante ensayos de utilización de sustrato empleando equipos disponibles en el comercio (por ejemplo, Promega) según las instrucciones de los fabricantes. 7.2 TRANSGEN DE LUCIFERASA Se detectó luciferasa mediante ensayos de utilización de sustrato en donde se emplearon equipos comercia 1 ente disponibles (por ejemplo, Promega) según las instrucciones de los fabricantes. 7.3 TRANSGENES DE PTH PTH racombinante, como par ejemplo péptido hPTHÍ-34, fue ensayado en ho agenados de tejido de hueco de osteotomía, por ejemplo, empleando dos equipos de ra ioinmunoensayo disponibles co ercialmente según los protocolos del fabricante íNichal=. Institute Diagnostics, San Juan Ca is t a no, CA) . Un equipo es el equipo Intact PTH-Parathy roíd Hormona lOOT íHormonas Parat iruidea Intacta PTH KXíT? . Este rad loinmunoensayo emplea un anticuerpo pa a el e tremo carboxi de la hormona intacta y esto se emplea para medir los niveles endógenos de hormona en tejido de osteotomía.

Este ensayo se e pleó para establecer un valor de línea basal de expresión de PTH en el modelo de osteotomía de rata . El segundo equipo es un equipo inmunoradiométrico de dos sitios para la medición de PTH de rata. Esta equipo emplea anticuerpos purificados por afinidas específicos para la terminal amino de la hormona de rata intacta (PTH1—34) y por cansiguiente medirá la producción endógena de PTH así como la proteina recambinante. Estudios previos han mostrado que estos anticuerpos reaccionan de manara cruzada con la PTH humana y que por consiguiente pueden reconocer moléculas recomb i nantes in vivo. Los valores obtenidos en el equipo No. i (anticuerpo para la terminal carboxi) fueron restados de los valores obtenidos en el equipo No. 2 (anticuerpo para el extremo amino) para obtener unas mediciones precisas y sensibles. El nivel da tejido racombinante se correlaciona por consiguiente con el grado de nueva formación ósea. 7.4 TRANSGEN DE BMP Proteínas de BMP, co o por ejemplo el producto de péptido de fcransgan de BMP-4 de murina, fueron detectadas in unahistsquímicamente empleando un anticuerpo específico que reconoce el epí opo HA (Majmudar et al., 1991, J. Bone and Min. Res. 6:869-881), co o el anticuerpo onoclanal disponible en Boehringer-M nnheim. Se pueden emplear también anticuerpos para las proteínas de BMP mismas. Tales anticuerpos, junto con varios métodos de inmunoensayo, se describen en la Patente Norteamericana No. 4,857,456, que se incorpora aquí por referencia. Se fijaron muestras de tejido de osteotomía en solución de fijación de Bsuins, dichas muestras fueron desmineralizadas y después cortadas a ia mitad a lo largo del plano longitudinal. Una mitad de cada muestra fue colocada en parafina para identificación inmunahistoquímica subsecuente de la molécula BMP-4 de murina recombinante. 8. EJEMPLO: LA TRANSFERENCIA DE UN GEN 0STE0TR0PIC0 ESTIMULA LA REGENERACIÓN/REPARACIÓN OSEA SN VIVO Se diseñó el siguiente experimento para investigar si se podría emplear la transferencia genética para crea r células transfectadas que expresan de manera constitutiva hPTH?—34 recambin te in vivo, y sí este transgen puede estimular la formación de hueso. Se analizó la velocidad de formación de hueso nuevo de la siguiente manera. Al momento de la necropsia, al sitio de la osteotomía fue cuidadosamente diseccionada para llevar a cabo un análisis histamorfométrico. Las dimensiones A-P y M—L del tejida caloso se midieron empleando c libradores. Las muestras fueron después fijadas mediante inmersión en una solución de fijación de Bouins, lavadas en etanol , y desmineralizadas en ácido fórmico regulado. Se empleó una integración plástica del material descalcificado debido a la estabilidad dimensional superior del metacrilato durante la preparación y selección de las muestras. Bloques de tejido fueron deshidratadas en concentraciones cada vez mayores de alcohol e integrados. Sa cortaron secciones de 5 m de espesor en el plano coronal empleando un microtomo de Reichert Palycot. Se prepararon secciones de mitad a lo ancho de la cavidad meduiar para evitar un sesgo de uestreo. Se tiñeron secciones para microscopía de luz empleando una tinción tricromática de Goldner para dif renciar hueso, osteaide, cartílago, y tejido fibroso. Las secciones fueron cubiertas empleando un medio de montaje de Eukitt (Calibrated Instruments, Ardsley, NY) . Se llevaron a cabo análisis histo orfométrieos en un campo claro empleando un microscopio de investigación Nikon Optiphot. Se emplearon técnicas de estareología de conteo de punto estándares usando un reticuiado de lO m :< 10 mm. Se midió el área tota del callo con una amplificación de 125 veces co o índice de ia intensidad global de la reacción da curación. Fracciones de área de hueso, cartílago. y tejida fibrosa fueron me trids can U?Í amplificación de 250 veces para es i a l a contribución relati de cada tejido a la formación de calla. Pivs o que las dimensiones del hueco de osteotomía reflejan la línea basal ( tiempo O), se empleó una medición del área ósea a intervalos subsecuentes de tiempo para indicar la velocidad de recuperación ósea. Se evaluó la significación estadística e pleanda análisis de varianza, con comparaciones psst-hoc entre grupos realizadas empleando una prueba de rango stud ian izada de Tukey. En el modelo de osteotomía de rata de 5 mm arriba descri o, se encontró que la expresión de transgen de PTH puede estimular la regaña ac ióp aparae ión de hueso en animales vivos. Esto es un hallazgo especialmente i portante puesto que se sabe que hPTHl-34 es un agente anabólico más potante cuando sa administra de manera intermitente y no continua, y es la administración de tipo continua que resulta de los métodos de transferencia de genes e pleadss aqu í . 9. EJEMPLO: TRANSFERENCIA DIRECTA DE GEN EN REGENERACIÓN OSEA I VIVO Se implantaron matrices activadas por genes que contenían ADN de plásmido de expresión en mamíferos en grandes huecos segméntales creados en el fémur de machos adultos. La implantación de matrices activadas por genes que contenían plásmidos de beta-gaiacts idasa o luciferasa provocó la absorción de ADN y la expresión de enzima funcional por parte de las células de reparación que crecían en el hueco.

A ?.c i ona latente, la implantaci n de una matriz, activada por genes que contenía ya sea un plásmido de prateína 4 morfogéniea ósea o bien un plásmido de codificación de un fragmento de hormona paratirsidea (aminoácidos 1-34) que resulta en una respuesta biológica de un nuevo relleno óseo del hueco. Finalmente, la implantación de una matriz activada por genes de dos piásmidos que codifica la prateína 4 morfagénica ósea y el fragmento de hormonas paratiraidea, que actúan s i ergé icamente in vitrs, provocó la formación más rápida de hueso nuevo que cualesquiera de estos factores solos. Estos estudios demuestran que par vez primara las células de reparación en hueso pueden ser manipuladas genét icamente in vivo. Mientras es una herramienta útil para estudiar la biología de fibroblastos de reparación y la respuesta de curación de herida, la matriz activada por ganes de la presente invención tiene también una amplia utilidad terapéutica. 9.1 MATERIALES Y MÉTODOS 9.1.1 MODELO DE HUÉSPED DE MAMÍFERO Para crear una osteotomía de 5 mm, se atornillaron cuatro tornillos de un diámetro de 1.2 mm en la diafísis femoral de ratas Sprague-Dawley adultas normales bajo anastasia general y con irrigación constante. Una colocación de tornillo paralelo guiado por plantilla fue confirmada medi nte fluorografía flos tornillos estab-jn a 3.5 m en borde dal lugar de fi ador y a intervalos de 2.5 mm) . Una colocación de fijador a; terna í 0 x 10 x 5 mm) fue después obtenida en los tornillos. Placas externas de fijador fueron fabricadas con una aleación de aluminio en una laminadora de CNC para asegurar altas tolerancias. Sujetadores prefabricados con arandelas de seguridad y tornillos roscados se elaboraron de acero inoxidable. Todas las partes de fijador fueron esterilizadas con gas de óxido da etileno antes de la intervención quirúrgica. Sa crearon defectos segméntales de mm a la mitad de la estructura con una cierra oscilante Hall Micro 100 (Zim er Inc., Warsam, SN) . Se colocaron esponjas de colágena las cuales se mantuvieron en el hueco de osteotomía hasta que estuvieran rodeadas por sangra coagulada; estudios preliminares mostraron que esta maniobra fijó la esponja con el sitio de osteotomía. La incisión cutánea fue cerrada con grapas. El fijador proporcionó la estabilidad necesaria de tal manera que el desplazamiento del huésped mamífero no fuera limitado durante un periodo ds varias semanas. 9.1.2 INMUNOHISTOGUIMIC Se prepararon tejidos para microscopía de luz y se llevó a cabo i munohistaquímica según lo descrito (Wong et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 5592-5598). Secciones de histología fueron incubadas con un anticuerpo ant i-Beta-g l comerc ial ente disponible (dilución 1:200, 5' > 3') y con un anticuerpo paliclonal anti-HA.il comercialmente disponible (dilución 1:500, BAbCO). 9.1.3 ENSAYOS DE ENZIMA LUCÍFERASA Y B-gal Se determinó la actividad luciferasa y Beta-gal mediante el uso del Luciferase Assay System (Sistema de Ensayo de Luciferasa) (Promega) y Beta-galactosidase Enzy e Assay System (Sistema de Ensayo de Enzima Beta— alactosidas ) (Promega) según los protocolos ofrecidos por ei fabricante. 9.1.4 PLASMIDO DE EXPRESIÓN DE pGAMl Para ensamblar pGAMl, se preparó mARN desde el día 13.5 p.c. con embriones de ratones CD—1 empleando reactivos de equipo y protocolos (Paly AT Tract mRNA ?solation System S, Promega). Se empleó una a? ícuota de mARN para generar cADN empleando reactivos comerciales (Reverse Transar iptase System, Promega). Una secuencia de codificación de cADN de BMP-4 de ratón de longitud complata fue generada por la reacción en cadena de po merasa (PCR) empleando las siguientes condiciones: 94*C, 4 min., 1 ciclo; 94*C, i min., 65*C, i min., 72ßC, 1 min., 30 ciclos; 72°C, 8 min., 1 ciclo. La secuencia de los iniciadores de reacción en cadena de polimerasa se basó en la secuencia BMP— de ratón conocido (GenBank): iniciador corriente arriba - 5' CCAT6ATTCCTGSTAACCSAAT8CT6 3'; inidicador corriente abajo -5' CTCAGCGGCATCCGCACCCCTC 3'. Sa purificó un producto único de reacci n en cadena de psl imer-jsa del tamaño esperado (1.31-b) mediante electroforesi s en gal de agarosa y dicho producto fue clonado en el vector de clonación TA (Invitragen) . El extremo 5' del inserto de BMP-4 fus modificado adicional ente (reacción en cadena de polimerasa) mediante la adición de una secuencia de 27 nucleótidss que codifica el epítopo HA, y el inserto BMP-4 fue clonado en el vector de expresión pcABN3 (SnVi trogen) . Se preparó el ADN de plásmids el cual fue secuenci do (ambas hebras) para asegurar la orientación e integridad del inserto BMP— . El plásmido pGAMl fue expresado empleando un equipo de transcripción y translación in vitro (TNT T7 Coupled Reticulocyte Lysate System, Promega) de conformidad con los protocolos ofrecidos por el fabricante. Se llevaron a cabo radiomarcado de proteina, inmunoprecipi tación, preparación de muestra y SDS-PAGE, autaradiograf ía, transfección transiente, y análisis Western según lo descrito (Yin et al., 1995, J. Bial. Chem. 270:10147-10160). 9.1.5 PLASMIDO DE EXPRESIÓN pSAM2 Se generaron mediante reacción en cadena de pol i erasa fragmentos de cADN de hormona par iroidea humana que codifican aminoácidos preprol—34. La secuencia de los iniciadores de reacción en cadena da polimerasa se basó an la secuencia de PTH humana conocida (GenBank): iniciador corriente arriba - 5' GCG6ATCCGCGAT6ATACCT6CAAAAGACAT8 3'; iniciador corriente abajo - 5' GCGGATCCGC8TCAAAAATTGT6CACATCC 3'. Esta par de iniciadores c reó sitios Ba HS en ambos extremos del fragmento de reacción en cadena de polimerasa. El fragmento fue digerido con BamHS y ligado en un sitio de clonación de Ba Hl en ei vector de retrovirus de PLJ (Wilsan et al., 1992, Endacrinol. 130: 2947-2954). Se aisló eventualmente un clon con el inserto en la orientación de codificación (pGAM2) y dicho clon fue caracterizado mediante análisis de secuencia de ADN. Para generar sustancias madres retrovirales, la línea de células de empaque CRIP (Wilson, J.M., et al., 1992, Endocrinology 130:2947-2954) fue transfectada con 10 ug de ADN de vector recombinante empleando el método de fosfato ds calcio. Después de una incubación de una noche, se cosechó y aplicó a células de rata cultivadas uno un medio de cultivo (Medio Eagle Modificado por Dulbecco, complementado con 1015 de suero bovina fetal, penicilina (100 unidades/mi ) , y estreptomicina fl00 mg/ml) (todos los reactivos fueron adquiridos en Gibco-BRL Life Technologies, Inc.) que contenía partículas de retroviriop. Clones independientes da células de rata-í exitosamente transducidas se obtuvieron mediante procedimientos estándares de infección y selección. En resumen, se cultivaron células de rata—1 hasta confluencia, división 1:10, y se selecciona on en G4Í8 i mg/ml. Gibca—BRL Life Technologies, Inc.). En algunos casos, se combinaron colonias resistentes a antibióticos en un cultivo único. En otros casos, se mantuvieran colonias independientes de células resistentes. Se emplearon métodos similares para generar clones de células de rata-1 transduc idas con el retrovirus BAGT, que codifica la enzima bacteriana b-gal. La concentración de hPTHÍ-34 en medio de cultivo celular fue estimada mediante el uso de un equipo de radioinmunoens yo comercial (SNS-PTH, Nichols) y de conformidad con el protocolo del fabricante. La actividad biológica del péptido codificado por pGAM2 fue evaluada de conformidad con la descrito (McCauley, et al., 1994, Mol. Cell. Endocripol. lOl :331-336) . 9,1.6 PREPARACIÓN DE ESPONJAS DE COLÁGENA ACTIVADAS POR GENES Para cada hueco de osteotomía, se humidificó totalmente colágena traqueal bovina liofilizada (10 mg , Sigma), en una solución estéril de ADN de plásmido de 0.5-1.0 mg y sa dejó incubar durante 1-16 horas a una temperatura de 4°C antas de la implantación. 9.1.7 RADIOGRAFÍA Se obtuvieron radiografías de película simple semanalmente (vista poster ior-anter ior ) mientras ios huéspedes mamíferos estaban despiertas, usando una unidad de rayas X portátil fGF, modelo 300). La >"? ?o-;?c i ón fue da 1/10 sec a 57 ¡?-' y 15 roa . 9.2 RESULTADOS 9.2.1 MODELO DE OSTEOTOMÍA Nuestro sistema de ípodelo empleó una osteotomía de media estructura de 5 mm en el fémur de rata adulta. El hueco de osteotomía fue estabilizado por medio de un fijador externo de cuatro tornillos. Mientras la reparación de osteotomía en la rata terminó 9 semanas después de la intervención quirúrgica, la forma de reparación dependa del tamaño dsl hueco: un hueco de 2 mm sana por medio de unión ósea, pera un hueco de 5 mm sana por na unión fibrosa (Rouleau, J.P., et al., Trans. Ortho. Res. Soc. 20:). Huéspedes mamíferos controlados mantenidos durante hasta 13 semanas después de la intervención quirúrgica confirmaron la observación que los huecos de 5 m sana típicamente mediante no unión fibrosa. Radiografía de película simple e histolagia semanales (figura 1A—D) demostraran que el hueso no se formaba en huéspedes mamíferos que recibían o bien una osteotomía de 5 m sala {n=3) , una osteotomía de 5 m más una esponja de colágena {n=10), o bien una osteotomía de 5 mm más una esponja da colágena que contenía ADN de plásmido desnuda de gen marcador (n=23) . Todos los 36 huecas de control sanaron mediante depósito de tejido fibroso. Los fémures de control presentaron formaci n ósea nueva pepasteal focal íuna complicación la colocación de tornillos). Se observó también después de la intervención quirúrgica una respuesta inflamatoria transiente, focal {linfocitos y macrófagos) en tejidos de hueco. 9.2.2 ESTUDIOS DE GENES MARCADORES En un estudio preliminar de factibi 1 idad, ADN de plásmido de expresión lacZ y beta-gal fueron exitosamente transferidas in vivo. El objetivo fue estandarizar el protocolo de preparación de la matriz activada par genes y el curso temporal post—oper tor io. Se colocó una GAM que codifica luciferasa en el hueco de osteotomía de una rata y se colocó una matriz activada por genes que codifica Beta-gal en el hueco de un segundo animal. Tres semanas después, se prepararon hsmogenadas de hueco (que consistían de tejido de granulación) después de una disección cuidadosa de hueso, cartílago y músculo esqueletal aledaño. Se evaluaron alícuotas de cada homogenado para determinar la expresión anzimática por ensayo de utilización de sustrato. La actividad epz imática esperada fue detectada en cada muestra de ho agenado. Se obtuvieron resultados positivos en otras experimentos en donde las condiciones variaron (por ejemplo, dosis de ADN, tiempo hasta la expresión de la proteína de ensayos) . 9.2.3 TRANSFERENCIA DE GEN BMP-4 Habiendo demostrado que las células de hueco expresan en imas fupc tona les después da la adsorción de ADN de pl asando a partir de una matri:, nos pregunta os sí i a. transferencia de ganes podría emplearse pare modular la regeneración ósea. Escogimos sobre expresar BMP-4, un factor asteoinductor que se expresa normalmente mediante células progenitoras durante la reparación de f ractura . Se generó mediante reacción en cadena de polimerasa un cADN de BMP-4 de ratón de longitud completa y dicho cADN fue subclonado en el vector de expresión eucariótica pcADN3 (Invitrogen) f figura 2). Para detectar especif icamente proteínas recombinantes, el extremo 3' de la secuencia de codificación de BMP-4 fue modificado ediante la adición de epítopo de hemaglutinina (HA). Se expresó BMP-4 recombinante a partir de este csnstructa fpGAMS) empleando un protocolo de transcripción y translación in vitro. Estudios de in unaprecipitación establecieron la capacidad del epí opo de HA para ser reconocido por un anticuerpo paliclanal anti— HA. Se evaluó la biosíntesis de BMP-4 recombinante después de la transfección transiente de células 293T cultivadas con ADN de piásmido de PGAMS. Cama se demostró mediante inmunoprecipi tac ?n, moléculas de BMP-4 fueron ensambladas en homodí eras, secretadas y procesadas según lo esperado. En conjunto, estos resultados establecieron qua el epítopo de HA fue reconocido por el anticuerpo policlonal anti-HA. Sa colocaron esponjas de colágena que contenían ADN de pGAMS en el hueco de nueve ratas adultas mantenidas durante 4-24 setBínEis. En un huésped mamífero sacrificado 4 sem na después de la i te en ión quirúrgica, estudios inmunohistoquímicas empleando el anticuerpo anti-HA demostraron la expresión de PGAMS por fibroblastos de reparación dentro del hueco. Esto fue significa ivo puesto que no observamos una tinción positiva falsa en un estudio de tejida tisular proveniente de trece huéspedes mamíferos de control. Focos micracópicos de hueso nuevo, originándose a partir da ambos márgenes quirúrgicos, se observaron también en las muestras de 4 semanas. De manera consistente con una descripción clásica de la formación de huesa mediante autoinducción (Upst, 1965, Science 150:893-899), estos focos consistieron de placas óseas recubiertas por grandes osteoblastos cuboidales y soportadas por un tejido conectivo celular compuesto de fibroblastos plea órficas vasos capilares. En siete huéspedes mamíferos sacrificados 5-12 semanas después de la intervención quirúrgica, la cantidad de huesa nuevo radiográfico se incrementó de manera constante (figura 3A) , aún cuando la BMP—4 codificada por el transgen no fue detectable mediante inmunohistoquímica. Puentes, definidos co o hueso nuevo que se extiende de los m rgenas quirúrgicos a través del hueca de osteotomía, se observaron t ípicamente a las 9 semanas. Un noveno huésped mamífero sobrevivió sin complicaciones durante 24 semanas después de la intervención quirúrgica. Para las 18 sem-i as, se formó suficiente hueso nuevo para permitir la remoción del fi ador externo, y el huésped mamífero se desplazó bien durante 6 semanas adicionales (figura 3A). Al momento del sacrificio, el hueco estaba rellanado con hueso nuevo sometido a ramodalación activa, a la excepción de una banda delgada de tejido radiol?cente cerca del margen distal dei hueco. Dado que al huésped mamífero se había desplazado exitosamente sin fijación, se considera que esta banda estaba parcialmente mineralizada. De manera consistente con esta hipótesis, se realizó una prueba biomecánica (Frankenburg et al., 1994, Trans. Ortho. Pes. Soc. 19:513), que demostró que el hueco curado tenía esencia lmente la misma resistencia mecánica que el fémur no operado del mismo huésped mamífero (diferencia de 6.31Í, prueba máxima de torción). La apariencia radiográfica dal fémur contralataral fno operado) fue sin cambio en todos los nueve casos, la que significa que los efectos de la transferencia de genes y de la sobreexpresión de BMP-4 fueron limitados al hueco de osteotomía. 9.2.4 TRANSFERENCIA Y EXPRESIÓN DE UN COCKTAIL DE PLASMIDO (BMP-4 •*• PTH1-34) La regeneración ósea se encuentra rej ida normalmente por varios factores que actúan en una secuencia regulada, y nos preguntamos por consiguiente si la expresión de varios factores anabólicos podría estimular ls formación de hueso de a e a m=»s potente que un solo factor. P?ra evaluar esta hipótesis, escogimos el suministro de un GAM de dos plásmidos que codifica BMP-4 más un fragmento de péptido de hormona paratiroidea (PTH) . La PTH es una hormona de 84 aminoácidos que incrementa la concentración plasmática y en fluido extracelular de Ca++. En te idos esquelet le , la administración intermitente de fragmento de PTH qua posee los requerimientos estructurales para la actividad biológica (aa 1—34) produce un efecto anabólico verdadero: numerosos estudios in vivo e in vitro ofrecen una evidencia clara que la administración de PTH1-34 en huéspedes mamíferos f incluyendo ratas) resulta en la formación de hueso de alta calidad, independiente, por un efecto de inhibición en relación con los osteoclastos combinado con un efecto de estimulación sobre las células osteogénicas (Dempster et al., 1993, Endocrin Rev. 14:690-709). El péptido PTH1-34 se conoce por interactuar de manera sinergética con BMP—4, que regula hacia arriba la expresión de receptores de PTH de superficie de células funcionales para diferenciar asteoblastas (Ahrens et al., 1993, J. Bona Min. Res. 12:871- 880). Un fragmento de cADN qua codifica PTH1-34 humana fue generado mediante reacción en cadana de polimerasa. Para establecer su actividad biológica, al fragmento fue subclonado en el vector retroviral PLJ fWilsan et al., 1^ 2, Endocrin, 130:2947-2954), generando al plés ido de expresión pGAM2 fFig. 4A). Se preparó una existencia de retrovirus recombinantes, defectuosos por rapl icación y dicha existencia se aplicó a células de rat3-I en cultivo. Se obtuvieron clones independiantes de células de rata—I transducidas, y se demostró una integración y expresión estable de ADN retraviral mediante análisis Southern y Northern. Se empleó un radiainmunoensayo para establecer- la concentración de PTH 1-34 humana en medios acondicionados de clonas individuales. Células ROS 17/2.8 posean receptores de superficie celular de PTH, que pertenecen a la superfa ilia de los receptoras acoplados con proteína G (Dempster et al., 1993, Endocrin. Rav. 14:690-709). La incubación de células ROS 17/2. B con alícuotas de medios acon icionados a partir de una línea celular transd?cida establemente (secreción >2 pg/ml a través de rad i oinmunoensayo) resultó en un incremento de 2.7 veces en cuanto a respuesta de CAMP versus el control, un resultado que estableció que el péptido PTHi-34 secretado era biológicamente activo. GAMs que csntienen ADN de plásmido p6AM2 solos estimularon GAMs óseos que contenían las ADNs da plásmido de expresión de BMP-4 y PTH1—34 fueron implantados juntos en el hueco de osteotomía de tres huéspedes mamíferos adiciónalas. Se observó la formación de fuentes a las 4 semanas en los es huéspedes mamíferos (un huésped mamífero fue sacrificado en este momento para histología), y a las 12 semanas se había formado una cantidad suficiente de hueso nuevo en los huéspedes mamíferos restantes para permitir la remoción del fijador externo (figura 5). Ambos huéspedes mamíferos estaban desplazándose bian al momento de la publicación 15 y 26 semanas después de la implantación, respectivamente, En base a radiografía de película simple, los efectss de transferencia de gen y ssbreexpresión parecen otra vez ser limitados al hueco de o teotomía. Después de estudios empleando una esponja de caiágena, se mostró también que el ADN de plásmido podía ad inistrarse a células de manera sostenida después de la encapsulación dentro de una preparación de copoi ímeros de bloque de partículas pol i láct icas-pol igl icol icas. Los resultados demuestran que las células cultivadas pueden ser transfectadas por media de ADN de plásmido liberado de las partículas pol i láct icas-pol igi ico icas. Los resultados indicaron también que fibroblastos de reparación (modelo de osteotomía de rata) in vivo recogen y expresan en ADN de plásmido liberado de capolímeros de bloques de partículas pol i lácticas-pol igl icol icas. La figura 7 demuestra que fibroblastos de reparación (modelo de osteotomía de rata) in vi o absorben y expresan ADN de plásmida de p6AM2 después de la liberación de las partículas pol J 1 ícticas—psl igl i col icas. Cama ?e ues r-i en la figura 7, la expresión de PTH1-34 codificada por pli=mido se rel e ?ons can una nueva forma ión ósea significa iva en al hueco de osteotomía. En conjunto, estos estudios muestran que la tecnología de matriz ac ivada par genes no depende de una matriz de colágena para tener éxito. Por consiguiente, la tecnología es suficientemente amplia para poder combinarse con matrices biológicas y con matrices sintéticas. 10. EJEMPLO: TRANSFERENCIA DE GENES PARA REGENERACIÓN DE TENDÓN Y PARA REGENERACIÓN DE LIGAMENTO CRUZADO SN VIVO Existe la necesidad clínica de estimular la formación de cicatrización durante ia reparación del tendón de Aquiles y ligamentos (hombros y rodillas) con el objeto de incrementar la competencia mecánica del tejido dañado. Se ha desarrollado un sistema modelo en el cual sa crean defectos segméntales en el tendón de Aquiles y se emplea un biamaterial novedoso, la pequeña mucosa intestinal a bien SIS como agente de suministro molecular/implante de tendón.

En el presente ejemplo, se demuestra la capacidad de suministrar y expresar constructos de genes marcadores en la regeneración da tejido de tendón empleando el injerto de SIS. 10.1 MATERIALES Y MÉTODOS Se crearon defectos segméntales en tendón de Aquiles y se empleó una preparación de SIS co o implante de tendón/ istema de suministra molecular. Se prepararon soluciones madres de plásmido {psVogal, Promega) de conformidad con protocolas estándares (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, (Clonación Molecular, Un Manual da Laboratorio), Cold Spring Harbar Labaratory Press). Se p repa ó un material de injerto de SIS a partir de un segmento de yeyuno de cerdos adultos (Badylak et al., 1989, J. Surg. Res. 47:74-80). Al momento de la cosecha, se removieron tejidos mesentéricos, el segmento fue invertido, y se removieran tanto la mucosa co o la submucosa superficial par media de una técnica de abrasión mecánica. Después de devolver ei segmento a su orientación original, se enjuagaran las capas de serosa y dsl músculo, dichas capas fueron esterilizadas mediante un tratamiento con ácido paracético diluido, y almacenadas a una temperatura de 4'C hasta su uso. Perros mestizos f todos los estudias) fueron anestesiados, intubados, colocados en recu bencia lateral derecha en un cojín de calentamiento, y mantenidos con anestesia por inhalación. Sa empleó una incisión lateral a partir de la unión entre músculo y tendón hasta la fascia plantar para exponer el tendón de Aquilas. Se envolvió una hoja de SIS de doble espesor alrededor de una parte central del tendón, ambos extremos fueron suturados, se removió un segmento de tendón de 1,5 cm a través de una abertura lateral en e] material us injerto, y cerró el injerto y el sitio de la intervención quirúrgica. La pata fue inmovilizada durante 6 semanas y después empleada libremente durante 6 semanas. Se recogieron tejidos de injerto en puntos de tiempo indicados a continuación, dichos tejidos fueran fijados an solución de Bouiris, e integrados en parafina. Se cortaron y emplearon secciones de tejido f8 µm) para inaiunoh istoquímica . 10.2 RESULTADOS En un estudio inicial, un material de SIS solos (injerto de SIS sola) promovió la regeneración del tendón de Aquiles después de la creación da un defecto segmental en perros mestizos durante un período que se extendió durante hasta 6 meses después de la intervención quirúrgica. El proceso de remodalación involucró la formación rápida de tejido de granulación y la eventual degradación dei injerto. No se formó tejido da cicatrización y no se observó ninguna evidencia de rechazo mediado por el sistema inmune. En un segundo estudio, se mojó SIS an una solución de ADN de plásmido f injerto de SIS + plásmído) y dicho injerto fue subsecuentemente implantado como injerto de tendón de Aquiles (n=2 perros) o bien injerto de ligamento cruzado fn=2 perros) en perros mestizos normales. Un plásmido pSVBeta gal que emplea secuencias de regulación del virus 40 de los simios para impulsar la actividad Beta-g iactosidasa (Beta-gal) pudo detectarse mediante mrnunoh istoqu ímica empleando un anticuerpo especifico en 4/4 huéspedas mamíferos. Cama control negativo, no SH detectó ninguna actividad Beta-gal en el tendón de Aquilas no apera do , ni en el ligando cruciado de estos huéspedes mamíferos. Por consiguiente, se desprende que SIS facilitó la absorción y subsecuente expresión de ADN de plásmido en células de neotend?n tanto en tendón camo en ligamento. Se diseñó un tercer estudio para evaluar el transcurso temporal de la expresión del transgen Beta-gal. Se implantaron injertos de SIS+plásmida durante 3, 6, 9, y 12 semanas (n=2 perros por punto de tiempa) y se ensayó ia expresión de transgenes mediante i munohistaquímica. Se cortaron y montaron seccionas transversales (8 µm) de tejido fijado según Bouins, integrado en parafina en platinas Probeon Plus (Fisher). Se llevó a cabo un estudio inmunahistoquímico de conformidad con al protocolo proporcionado con el equipo Histostain—SP (Zy ed). En resumen, las platinas fueron incubadas con un anticuerpo anti-Beta-galactosidasa bien caracterizada {dilución 12:00, 5' —> 3'), dichas platinas fueron lavadas en PBS, incubadas con un segundo anticuerpo biotinilado, lavadas, teñidas con el conjugado enzimático más una mezcla de cromógeno de sustrato, y después contría ten idas con nema tox i lina y eosina. Se detactó una actividad Beta-gal bacteriana en tendones que recibieron el injerto de SIS+plásmido (8/8 huéspedes mamífero- ), Aún cuando la e:p rasión de trapsgenes no es rigurosamente cuan i a iva, present un p_.eo a las ^—1 semanas. La ei-presión da gen Beta-gal bacteriano no se detectó en 35 huéspedes mamíferos que recibieron injertos de SIS solo. 11. EJEMPLO: TRANSFERENCIA DE GEN ADENO IRAL EN LA REGENERACIÓN OSEA SN VSVO Un método alternativo para lograr la transferencia genética in vivo para la regeneración tisular es el uso de un evento de transferencia mediada por adensvirus. Se logró una transferencia exitosa par gen adenoviral de un constructo de gen marcador en células de reparación de hueso en el modelo de osteotomía de la rata. 11.1 MATERIALES Y MÉTODOS pAd. CMVlacZ, vector adenoviral, es un ejemplo de un vector adenoviral defectuosa de replicación que puede replicarse en células permisivas (Stratford-Parricaudat et al., 1992, J. Clin. Invest. 90:626-630). En este vector particular, el re l zador/promotor inicial del eito egalovirus (CMV) ss emplea para activar la transcripción de lacZ con una secuencia de pol iadeni lación de SV40 clonada corriente abajo del gen reportero (Davidsop et al., 1993, N ture Genetics 3:219-223). pAd.RSV4 tiene esencialmente la misma estructura que pAdCMVlacZ, sin embargo, el promotor de CMV y el sitio de clonación único Bglll han sida reemplazados a través e un cassette con un f agment! E-G ? I qua consiste de ?n promotor de RSV, un sitio da clonación múltiple, y un sitio pol?«'A-r). La mayor flexibilidad de este vector es útil en la subclonación de genes osteatrópicos, camo por ejemplo el fragmento de cADN de hPTHl-34, para su uso en estudios posteriores. Se sumergió un implante Ultra Fiber (mr) durante 6 minutos en una solución de virus AdCMV lacZ (10,000,000,000- 100,000,000,000 unidades farmadoras de placas o bien PFU/ l ) y después se implantó en el sitio de ostsotamía. Se permitió que el defecto sanara durante 3 semanas, durante dicho período de tiempo, el pragreso de respuesta de curación de herida fue onitoreado por examen radiográfico semanal. A las tres semanas, se estimó que el 40U del defecto estaba relleno con tejido de callo. El huésped mamífero fue sacrificado y se fijaran las tejidas en fijación de Bouins, y después los te idos fueron desmi ñera 1 izadas durante 7 días empleando soluciones estándares de ácido fórmico. 11.2. RESULTADOS Los resultados obtenidos demostraron de manera conclusiva la expresión del producto de gen marcador en células de tipo condrocita en el hueco de osteotomía (figura 6). La señal dirigida hacia el núcleo se observó también en p reosteab 1 a s to . 12. EJEMPLO: TRANSFERENCI OE GENES A MÚSCULO ESOUEi ETAL Exista la .-.a es ida clínica da asti ula la formación da cicatrices durante la reparación de tejidos blandas ademas da tendón de Aqui les y ligamentos (hombro y rodilla) para mejorar la competencia mecánica del tejido dañado. Un sistema modelo se desa rolló en el cual se hacen incisiones en m?sculaesqueletal de rata adulta y una preparación de sutura es revestida can una preparación de partículas de PL6A y ADN de plásmido de liberación sostenida se emplea camo dispositivo de músculoesqueletal /suministro de genes. Para demostrar la factibilidad de las composiciones de revestimiento y de los métadas de la invención, una sutura quirúrgica fue revestida con ADN marcador (que codifica fasfatasa alcalina placental humana) y se empleó para suturar tejida del músculo de rata. El experimento demuestra la transferencia y expresión exitosa de ADN en el tejido reparado can la sutura reves ida. 12.1 MATERIALES Y MÉTODOS 12.1.1 PREPARACIÓN DE COMPOSICIÓN DE REVESTIMIENTO DE ADf4- PLGA A una solución de PLGA/clorofar a (314 (peso/volumen) copal ímero 50/50 de ácido poliláetica pol igl icol ico PLGA, pesa molecular promedia 90,000, viscosidad inherente: 1.07) se agregó O.2 L de una solución que contenía ADN marcador que codifica fosfatasa alcalina placental humana (1 mg de ADN, Tps-EDTA 0.5 M , EDTA 0.5 mM,pH 7.3). La solución t_, emul ai f ic i a mediante sometimiento a ór ice durante 2 minutos seguido por sonicación durante 30 segundos y a una temperatura de aproximadamente 0°C empleando un sonicadar de tipo sonda de micapunta can una potencia de salida de 55 Watts. Este proceso proporcionó una emulsión que tenía una apariencia de tipa leche. 12.2 REVESTIMIENTO DE UNA SUTURA QUIRÚRGICA Se perforó un orificia en una pieza de lámina revestida par Teflón (Norton Performance Pl stic Corp., Akron, OH) empleando una aguja de tamaño 22. En el orificia se colocó una gota (aproximadamente 60 µL ) de una emulsión de ADN- PLGA. Se empleó una sutura crómica 3-0 de una longitud de 70 cm íEthicon) a través del orificio para revestir la sutura. Conforme ia sutura pasó a través dei orificio, se empapó de un revestimiento uniforme delgado (aproximadamente 30 µm de espesor) de ia composición de revestimiento. Se permitió que la sutura se secara en el aire durante apro imadamente 3 minutos, y ei procesa de revestimiento se repitió 15 veces permitiendo que cada revestimiento sa seque al aire. La sutura revestida fue examinada mediante microscopía electrónica (a pi icación: 150 veces), y se encontró qua la sutura estaba más revestida con un revestimiento uniforme de ADN-PLGA. Además, ei revestimiento permaneció intacto aún después de pasar la sutura a través del tejido va ias veces. 12.1.3 REPARACIÓN DE MÚSCULO ESQUELETAL CON LA SUTURA REVESTIDA La sutura preparada arriba fue cocida en al te ido del músculo esqueletal de dos ratas adultas normales con resultados quirúrgicos satisfactorios. La sutura presentó buenas propiedades de fijación. Una semana después, se disecó el músculo más la sutura, se congeló en nitrógeno líquido y se molió en polvo. El polvo fue incubado en 200 µL de regulador de lisis, dicha polvo fue expuesta a tres ciclos de cangelamienta-descongelamiento y clarificado. £1 líquido claro fue ensayado para determinar la actividad de fosfatasa alcalina empleando métodos estándares después de incubación a una temperatura de 65°C. 12.2 RESULTADOS Las resultados indicaron que el músculo esqueletal de rata cocido can suturas revestidas y recuperada después de una semana presentaba una actividad fosfatasa alcalina, lo qua indica que el gen de fasfatasa alcalina del marcador fue expresado en el tejido muscular. Recuperaciones de control no mostraran una actividad de fosfa asa alcalina significativa. Estos datos demuestran que las emulsiones pueden emplearse para revestir efectivamente suturas y administrar genes a células de reparación proliferantes in v i o. 13. EJEMPLO: TRANSFERENCIA DE SENES A VASO SANGUÍNEO E: i ste la necesidad línica de evitar una fibrosis excesi-a ( restaños i s ) que pueda ocurrir, por ejemplo, durante ia reparación de vasos sanguíneos y después de una angioplastía. Esto puede lograrse, por ejemplo, suministrando genes que codifican inhibidares de la lisil oxidasa, a bian mediante la transferencia de genes que codifican ciertos TGF-Beta. Exista además la necesidad clínica de regular la angiagénesis , por ejemplo, en casas de trastornas par insuficiencia vascular, donde el objetivo es la estimulación de la formación de nuevos vasos con el abjeta de evitar la hipoxia tisular y la muerte de las células. Un sistema modelo ha sido desarrollado en el cual células de reparación en vasos sanguíneos grandes en conejos son transfectadas con una preparación de partículas de PLGA y ADN de plásmido de liberación prolongada. Células de reparación están presentes porque estos vasos sanguíneos de conejo tienen una lesión celular que imita ia atarosclerosis clínica en seres humanos. El presente ejemplo demuestra la capacidad de administrar y expresar constructos de genes marcadores en células de reparación de grandes vasos sanguíneas. 13.1 MATERIALES Y MÉTODOS Para este estudio se emplearon conejos blancos New Zealand de ambas sexos, can un pasa de 3.1 a 3.5 kg. Los conejos fueran aneste i dos empleando quetamina (35/mg/kg) y xilazina (5mg/kg) SM, y se logró una anestesia de mantenimiento con la adminis ación a través da una vena margina de quetamina IV (8mg/kg). Se aislaron segmentos de aproximadamente 2c de ambas arterias iliacas entre la bifurcación aórtica descendente y al ligamento inguinal, dichos segmentos fueron amarrados, y se ligaran todas las pequeñas ramificaciones de estos segmentos arteriales. Se evitó la formación local de trombo por medio de la administración en la vena marginal de la oreja de heparina (ÍOO mg). A través de arteriotamía iliaca, se introdujo un catétar de angioplastía de globo (globo de 2.0 mm) en segmentos de arterias iliacas y el globo fue dilatado durante 1 minuta a una presión de 8 at . Después de la dilatación del globo, se removió el catéter de angioplastía, se administraron 20 mg de heparina de manera intraarterial para evitar trombosis distal. Ambos extremos de la artería iliaca fueron apretados con seda lO.O, se impulsó la suspensión de 5 mg/ml de ADN-Nanopart ículas en cada arteria iliaca durante 3 minutos a 0.5 atm. Se estructuró la herida. Se sacrificaron los conejas 2 semanas después de la angioplastí con globo y suministro de nanapartícula. A través de una incisión abdominal inferior vertical, se aislaron ambas arterias iliacas. Se removió bi lateralmente un segmento de 2 cm de arteria iliaca. Se tomaron camo muestra de control arterias carótidas de conejo. El tejido fue conservado en nitrógeno líquido para ensayo de fosfatasa alcalina. 13.2 RESULTADOS Los resultados de los ensayos de expresión de fosfatasa indicaron que una formulación de nanopartículas más ADN podía suministrar ácidos nucleicos a células de reparación en las arterias iliacas de conejos jóvenes lesionados con un catéter de globo. Tanto la arteria iliaca derecha como izquierda fueron positivas para la actividad fosfatasa después de exposición a las formulaciones de nanopartículas más ADN. No se detectó ninguna actividad fasfatasa en la aorta de control. Estos resultados positivos indican que, después de exposición a una matriz activada por genes, células de reparación en grandes vasos sanguíneos pueden absorber y expresar moléculas de ácido nucleico. La presente invención na se limita en cuanto a su alcance a las modalidades ejemplificadas que tienen el propósito de ilustrar aspectos específicos de la invención, y todos las clanes, secuencias da ADN o aminoácidos funcion lmente equivalente sa encuentran dentro del alcance de la invención. Da hecho, los expertos en la materia podrán efectuar varias modificaciones a la presenta invención a partir de la descripción anterior y de los dibujos anexos. Tales modificaciones sa encuentran dentro del alcance de las reivin i a iones a a;' as. 9,e entenderá también qua todos los tamaños en paras de base sue s ofrecen para los nucleótidas son j ro- i a iones y se emplean para propósitos da desc ipción.

Claims (25)

1. REI I DICACIONES i. Un método para transferir una molécula de ADN qua contiene un promotor unido de manera operativa a una secuencia que codifica un producto de gen en una célula de reparación de mamífero, que comprende la aplicación de una matriz biacampa tibie que contiene la molécula de ADN a una lesión en el cuerpo, de tal manera que células de reparación que migran hacia el sitio de ia lesión se infiltren en la matriz, adquieran la molécula de ADN, y expresen el producto de gen codificada por ei ADN in vivo.
2. 2. El método de la reivindicación 1 dande la matriz biocompatible es colágena, metal, hidroxiapati t , biovidria, aluminato, materiales da biocerámica, proteínas purificadas o bien composiciones de matrices e raceluíare ,
3. 3. El método de la reivindicación 1 donde la matriz biocompat ible es colágena.
4. 4. El método de 3a reivindicación 3 donde la colágena es colágena de tipo SI„
5. 5. El método de la reivindicación 1 donde el ADN codifica una prateína terapéutica.
6. 6. El método da l a rei i ica i n t donde al ADN transferido codifica un factor de crecimiento.
7. 7. Fl método de la reivin icación 1 donde el ADN transferido es más que una molécula de ADN.
8. 8. El método de la reivindicación 6 donde e l factor de crecimiento es factor de crecimiento transformante—Beta (TGF-Beta), factor de cree imiento de fibroblasto FGF) , fae:tor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento de tipo insulina (IGF), o bien factor arfagénico de hueso (BMP).
9. 9. El método de la reivindicación 5 donde ia proteína terapéutica es una hormona.
10. 10. El método de la reivindicación 9 donde la hormona es hormona de crecimiento (GH).
11. 11. El método de la reivindicación 9 donde ia hormona es hormona paratiraidea humana (PTH).
12. 12. El método de la reivi dicación 1 dsnde dicho sitio de lesión es un sitio de una fractura de hueso.
13. 13. El método de la reivindicación 1 donde dicho sitio de lesión es un sitio de daño a tejido conectivo.
14. 14. El método de la reivindicación 1 donde dicho sitio de lesión es un sitio de daño a órgano.
15. 15. Una matriz activada par genes que comprende una matriz biocompatible que contiene una molécula de ADN que tiene un promotor unida de manera operativa a una secuencia que co i f i c a una proteína terapéutica.
16. 16. Una matriz activada par genes que comprenda una matriz L>?acompa ?ble que contiene una molécula de ADN qua tiene un promotor unido de manera operativa a una secuencia que codifica un ARN de ant i sentido.
17. 17. Una matriz activada por genes que comprende una matriz biocompatible que contiene una molécula de ADN que tiene un promotor unido de manera operativa a una secuencia qua codifica un factor de crecimiento.
18. 18. La matriz activada por genes de la reivindicación 17 dande el factor de crecimiento es TGFBeta, FGF, PDGF, IGF, o BMP.
19. 19. La matriz activada por genas de la reivindicación 15, donde la matriz no contiene más que una molécula de ADN.
20. 20. La matriz activada por genes de la reivindicación 16, donde ia matriz es colágena, metal, hidraxiapatita , biavidrio, aluminato, materiales de biocerámica, materiales metálicos, proteínas purificadas o bien composiciones de matrices extracelulares.
21. 21. La matriz activada por genes de ia reivindicación 15, donde la matriz biocompa ible es colágena.
22. 22. La matriz activada por genes de la reivindicación 21, donde la colágena es colágena de tipo II.
23. 23. Lín equipo que comprende, en un recipiente adecuado, una preparación de matriz activada por genas.
24. 24. Un equipa que comprende, en un recipiente a e ua da , una preparación de matriz b i ocampa ible y una re a a i n de D que codifica una prateína terapéutica.
25. 25. Un método para preparar una composición de ADN-matriz, que comprende la puesta en contacto de una molécula de ADN con una matriz biocompatible de tal manera que el ADN esté unido de manera no covalente con la matriz.