SK132797A3 - Viral vectors and their use for treating hyperproliferative disorders, in particular restenosis - Google Patents

Viral vectors and their use for treating hyperproliferative disorders, in particular restenosis Download PDF

Info

Publication number
SK132797A3
SK132797A3 SK1327-97A SK132797A SK132797A3 SK 132797 A3 SK132797 A3 SK 132797A3 SK 132797 A SK132797 A SK 132797A SK 132797 A3 SK132797 A3 SK 132797A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
virus
adenovirus
gax
gene
cell
Prior art date
Application number
SK1327-97A
Other languages
English (en)
Inventor
Didier Branellec
Kenneth Walsh
Jeffrey M Isner
Patrice Denefle
Original Assignee
Univ Case Western Reserve
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Case Western Reserve filed Critical Univ Case Western Reserve
Publication of SK132797A3 publication Critical patent/SK132797A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Oblasť techniky
Predkladaný vynález sa týka novej, zvlášť účinnej metódy liečenia patológií spojených s hyperproliferatívnymi ochoreniami prostriedkami génovej terapie. Spôsob podlá predkladaného vynálezu spočíva, konkrétnejšie, v špecifickom blokovaní proliferácie buniek vaskulárneho hladkého svalstva (vascular smooth-muscle cells - VSMZ) pomocou in vivo prenosu gax génu. Spôsob podlá predkladaného vynálezu je velmi účinne upravený na liečenie postangioplastických restenóz pomocou preexprimovania gax génu vo vaskulárnej stene. Podľa predkladaného vynálezu sa dá gax gén prenášať pomocou vírusových vektorov. Tieto vektory sú výhodne adenovírusové vektory.
su spojene tomu, že gas 6) a gadd
DNA poškodením: gadd34, exprimované v kviscentných
Doterajší stav techniky
Boli izolované rôzne gény, ktoré s blokovaním bunkového oddelenia. Tým dôjde k (rast-blokovania špecifický: gas 1 až (rast-blokovania a vyvolateľný gadd45 a gaddl53) gény sú silne bunkách, to znamená v bunkách, ktoré sú blokované v GO fáze bunkového cyklu (Schneider a kol., Celí 1988, 54: 787-793; Del Sat a kol., Celí 1992, 12: 3514-3521; Cowled a kol.,
Exp. Celí. Res. 1994, 211: 197-202; Brancolini a Schneider,
J. Celí. Biol. 1994, 124: 743-756; Zhan a kol.. Mol. Celí.
4242-4250; Jackman a kol., Cancer Res. 54:
Biol. 1993, 13
5656-5662, 1994) súlade s týmito zisteniami o génovej expresii, mikroinjekcia gas-l proteínu blokuje syntézu DNA (Del Sat a kol., Celí, 1992, 70: 595-607). Naopak pridanie je PDGF (platelet-derived growth odvodený z doštičiek) alebo fetálne týchto génov u in vivo Celí. Biol. 1992, 12:
vzťahu k stavu náprotivok in rastového faktoru ako factor - rastový faktor teľacie sérum znižuje expresiu modelov (Coccia a kol. Mol.
3514-3521). 0 tejto špecifickej expresii vo proliferácie bunky sa tiež javí, že má svoj vivo. Takto je gén gas-1 po vybratí vaječníkov silne exprimovaný v maternici myší (Ferrero a Cairo, Celí. Biol.Int.
1993, 17 857-862). Pri tom istom zvieracom modeli viedlo liečenie estrogénmi k umiestnená v maternici bunkovej proliferáci i, ktorá je a prejavuje sa zvýšením expresie proto-onkogénu c-myc a znížením expresie génu gas-1. Podobne pri hepatitickom modeli proliferácie/regenerácie je expresia génu gas-6 silne obmedzená na dobu 4 hodín po čiastočnej heptatektómii, t.j. v dobe prenosu z GO na GI; táto expresia sa vráti k normálu, pravdepodobne akonáhle bolo raz iniciované delenie hepatocytov (Ferrero a kol., J. Celí. Physiol. 1994, 158: 263-269).
Podstata vynálezu
Predkladáte! vynálezu sa zaujímal o nový gén, t.j. gén gax (rast-blokovania špecifický homeobox) a dokázal, že tento gén má vlastnosti, ktoré sú výhodné hlavne na použitie terapii hyperproliferatívnych chorôb, hlavne
Gax gén bol pôvodne zistený z krysej aorty. Kóduje v génové] restenózy. pripravenej v cDNA knižnici proteín s 303 aminokyselinami. Jeho sekvencia bola charakterizovaná a jeho kol. Mol. Celí. Biol. 1993, určité vlastnosti, ktoré sú cDNA bola klonovaná (Gorski a 6, 3722-3733). Gax gén má podobné vlastnostiam u génov gas a gadd, pretože sa tiež zdá, že reguluje prenos G0/G1 v bunkovom cykle. Rovnakým spôsobom je hladina gax mRNA znížená u krysích VSMC desaťkrát po dvoch hodinách po vystavení PDGF (Gorski a kol. Mol. Celí. Biol. 1993, 6, 3772-3773). Expresia gax génu je preto potlačená v priebehu VSMC mitogénnou odpoveďou.
Jednou z výhod spôsobu podía predkladaného vynálezu je principiálne u dospelých špecifickosť expresie krýs gax gén v kardiovaskulárnom (aorta a srdce) gax génu. Takto je exprimovaný hlavne systéme. Na druhej strane mozgu, blott.
pri demonštrovaní prítomnosti gax mRNÄ v pečeni, žalúdku alebo kostrových svaloch zlyhal northern
Post-angioplastická restenóza hyperproliferatívna choroba, ktorá nechirurgickej intervencii v oblasti škvrny. Vďaka tomu vedie angioplastiou často (až 50 je lokalizovaná sa rozvíja po aterosklerotickej liečenie aterosklerotických léz z prípadov v určitej štúdii) k restenóze, po ktorej nasleduje mechanické poškodenie arteriálnej steny. Kľúčovou udalosťou tohto mechanizmu je proliferácia a migrácia buniek vaskulárneho hladkého svalstva (VSMC) z tunica média smerom do tunica intima, hlavne z dôvodu neprítomnosti chránenia alebo spätnej väzby endoteliálnych buniek v tunica intima. Schopnosť selektívne exprimovať antiproliferatívny gén podía predkladaného vynálezu vo VSMC bunkách je veľmi podstatnou výhodou.
Ďalšou výhodou spôsobu podľa predkladaného vynálezu je skutočnosť, že gax gén patrí do skupiny homeotických génov. Tieto gény kódujú transkripčné faktory, ktoré obsahujú sekvencie (alebo homeodémy), ktoré rozpoznávajú konkrétne oblasti DNA (alebo homeoboxu) (rewiew: Gehring a kol. Celí, 788: 211-223, 1994) Homeodoména krysieho gax proteínu je obsiahnutá medzi aminokyselinami 185 a 245 homeopatické gény, ktoré boli do zahrnuté v kontrole bunkovej priebehu embryogenézy a tak posilňujú terapeutický potenciál spôsobu podía predkladaného vynálezu (review: Lawrence a Morata Celí 78: 181-198, 1994; Krumlauf, Celí 78: 191-201, 1994).
Predkladaný vynález sa tak týka poškodeného rekombinantného vírusu, ktorý obsahuje prinajmenšom jeden vložený gén kódujúci celý alebo časť GAX proteínu alebo
Je zaujímavé, že súčasnej doby identifikované sú proliferácie/rastu v variantu tohto proteínu. Vynález sa týka tiež použitia takých vírusov na liečenie hyperproliferatívnych patológií.
Vo vírusoch podlá predkladaného vynálezu môže byť vložený gén fragmentom komplementárnej DNA (cDNA) alebo genómickej DNA (gDNÄ) alebo hybridný konštrukt skladajúci sa napríklad z cDNA, do ktorej bol vložený jeden alebo viac intrónov. Gén obsahuje tiež syntetické alebo polysyntetické sekvencie. Ako už bolo uvedené, gén môže byť gén kódujúci celý alebo časť GAX proteínu alebo to môže byť variant tohto proteínu. V predkladanom vynáleze označuje pojem variant akýkoľvek mutant, fragment alebo peptid, ktorý má označenie prinajmenšom jednu biologickú vlastnosť GAX, rovnako ako akýkoľvek homológ GAX, ktorý bol získaný z iných zdrojov. Tieto fragmenty a varianty sa dajú získať akoukoľvek technikou známou odborníkom, hlavne genetickými alebo chemickými alebo enzymatickými modifikáciami alebo hybridizáciou alebo expresným klonovaním, umožňujúcim aby boli varianty vybrané podľa ich biologickej aktivity. Genetické modifikácie zahŕňajú supresiu, deléciu, mutáciu atď.
V predkladanom vynáleze je vložený gén, výhodne gén kódujúci celý alebo časť krysieho GAX proteínu alebo jeho ľudského homológu. Ešte výhodnejšie sa jedná o cDNA alebo gDNA.
Všeobecne vložený gén obsahuje tiež sekvencie, ktoré umožňujú aby bol exprimovaný v infikovaných bunkách. Tieto sekvencie môžu byť sekvenciami, ktoré sú prirodzene zodpovedné za expresiu daného génu, pokiaľ sú tieto sekvencie schopné funkcie v infikovanej bunke. Sekvencie môžu byť tiež rôzneho pôvodu (zodpovedajúce za expresiu rôznych proteínov alebo dokonca syntetických proteínov). Hlavne to môžu byť sekvencie eukaryotných alebo vírusových génov alebo odvodené sekvencie, ktoré stimulujú alebo potláčajú transkripciu génu špecifickým alebo nešpecifickým spôsobom a vyvolateľným alebo nevyvolateľným spôsobom. Ako príklad sa môže jednať o promotorovú sekvenciu, ktorá je odvodená z genómu bunky, ktorou je žiadúce infikovať alebo z génu vírusu, hlavne promotorov adenovírusovej E1A a MLP génu, CMV alebo LTR-RSV promotora atď. Eukaryotné promotory, ktoré sa dajú tiež uviesť, sú všadeprítomné promotory (HPRT, vimentín, aktín, tubulín, atď.), promotory prechodného vlákna (desmín, neurof i lamenty, keratín, GFAP, atď.), promotory terapeutického génu (typ MDR, CFTR, faktor VIII, atď.) tkanivo-špecifické promotory (aktín promotor v bunkách hladkého svalu), promotory, ktoré sú, výhodne aktivované v deliacich sa bunkách alebo iné promotory, ktoré reagujú na stimuly (receptory steroidného hormónu, receptory retínovej kyseliny, atď) Navyše, tieto expresné sekvencie sa dajú modifikovať pridaním aktivujúcich sekvencií, regulačných sekvencií, atď. Inak, pokial vložený gén neobsahuje akékoľvek exprimované sekvencie, dajú sa vložiť do genómu poškodeného vírusu v protismere takejto sekvencie.
Navyše, vložený gén všeobecne zahŕňa v smere kódujúcej sekvencie, signálnu sekvenciu, ktorá smeruje syntetizovaný polypeptid do., vylučovacích ciest cieľovej bunky. Aj keď tieto signálne sekvencie môžu byť prirodzené GÄX signálne sekvencie, môže to byt aj iná funkčná signálna sekvencia (napríklad génu pre tymidín kinázu) alebo umelá signálna sekvencia.
Vírusy podľa predkladaného vynálezu sú poškodené vírusy a preto nie sú schopné autonómnej replikácie v cieľovej bunke. Všeobecne gén defektných vírusov, ktoré sa používajú podľa predkladaného vynálezu, neobsahuje prinajmenšom sekvencie, ktoré sú nevyhnutné na replikáciu daného vírusu v infikovanej bunke. Tieto oblasti sa dajú alebo vyňať (celé alebo časť), vyradiť z funkcie alebo ich nahradiť inými sekvenciami, hlavne vloženým génom. S výhodou si poškodený vírus uchováva sekvencie svojho genómu, ktoré sú nevyhnutné na zakapsidovanie vírusových častíc.
Vírus podľa predkladaného vynálezu je odvodený od adenovírusu, adenosúvisiaceho vírusu (AÄV) alebo retrovírusu. Podľa jedného preferovaného vyhotovenia je vírus adenovírus.
Existujú rôzne sérotypy adenovírusu, ktorých štruktúra a vlastnosti predkladaného sa líšia
Z týchto sérotypov sú podľa vynálezu preferované k použitiu typ 2 alebo typ 5 ľudského adenovírusu (Ad 2 alebo Ad 5) alebo adenovírusy zvieracieho pôvodu (pozri prihláška W094/26914). Adenovírusy zvieracieho pôvodu, ktoré sa dajú použiť podľa predkladaného vynálezu sú adenovírusy psie, hovädzie (Mavl, Beard a kol., Virology 75 (1990) 81), bravčové, z paviánov alebo iných opíc (SAV). S výhodou je adenovírus zvieracieho adenovírus, ešte výhodnejšie CAV2 adenovírus alebo A26/61 kmeň (ATCC VR-800), napríklad].
Výhodne podľa predkladaného vynálezu používajú adenovírusy ľudské, psie alebo zmes obidvoch.
Výhodne zahŕňajú poškodené vírusy podľa predkladaného vynálezu ITR, kapsidačnú sekvenciu a nukleovú kyselinu. Ešte je v genóme adenovírusu podľa predkladaného prinajmenšom oblasť El, je nefunkčná. Vírusový pôvodu psí [Manhattan zau]imavejsie vynálezu, že gén sá dá upraviť tak, že je nefunkčný, akoukoľvek technikou známou odborníkom, najmä čiastočnou deléciou alebo k uvažovanému génu (génum) in vitro (na izolovanej úplným odstránením, nahradením, pridaním jednej alebo viac báz Takéto úpravy sa dajú dosiahnuť DNA) alebo in situ, napríklad použitím techník genetickej manipulácie alebo pôsobením mutagenných činidiel. Ďalšou oblasťou sa dá modifikovať najmä oblasť E3 (W095/02697), oblasť E2 (WO94/28938), oblasť E4 (W094/28152, W094/12649 a WO95/02697) a oblasť L5 (W095/02697). Podľa preferovaného vyhotovenia obsahuje adenovírus podľa predkladaného vynálezu deléciu oblastí El a E4. Podľa ďalšieho preferovaného vyhotovenia obsahuje deléciu v oblasti El, do ktorej bola vložená oblasť E4 a sekvencie kódujúce GAX (porov. FR94 13355). Vo vírusoch podľa predkladaného vynálezu delécia v oblasti El siaha cez nukleotidy 455 až 3329 v sekvencii Ad5 adenovírusu.
Poškodené rekombinantné adenovírusy. podľa predkladaného vynálezu sa dajú pripraviť akoukoľvek technikou známou výhodne v integrovanej rekomhinácie. Príkladmi 293 ľudskej embryonálnej odborníkom (Levrero a kol., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Najmä sa pripravujú homológovou rekombináciou medzi adenovírusom a plazmidom, ktorý nesie okrem iného požadovanú DNA sekvenciu. Homológová rekombinácia je vyvolaná po kotransfekci i daného adenovírusu a plazmidu do vhodnej bunkovej línie. Použitá bunková línia by mala výhodne (i) byt transformovateľná uvedenými prvkami a (ii) obsahovať sekvencie, ktoré sú komplementárne k časti genómu poškodeného adenovírusu, forme, aby sa zabránilo riziku bunkových línií je bunková línia ľadviny (Graham a kol., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), ktorá obsahuje, najmä integrovanú do svojho genómu, ľavorukú časť genómu Ad5 adenovírusu (12 %) alebo bunkovú líniu, ktoré sú komplementárne k funkciám E1 a E4 ako bolo opísané, najmä v prihláškach č. W094/26914 a W095(02697).
Následne sú rozmnožené adenovírusy získané a čistené štandardnými molekulárne biologickými technikami ako je ilustrované v príkladoch.
Adenosúvisiace vírusy (AAV) sú DNA vírusy relatívne menšej veľkosti, ktoré sa integrujú, stabilne a miestne špecifickým spôsobom, do genómu infikovaných buniek. Sú schopné infikovať širokú škálu buniek bez ovplyvnenia bunkového rastu, morfológiou alebo diferenciáciou. Navyše sa zdá, že nie sú zahrnuté do ľudských patológií. Genóm AAV bol klonovaný sekvenovaný a charakterizovaný. Zahŕňa približne a obsahuje oblasť prevráteného terminálneho (interved terminál repeat - ITR) s dĺžkou
4700 báz opakovania približne 145 báz na každom konci, ktorá slúži ako východzi bod replikácie nevyhnutných ľavoruká časť vírusu. Zvyšok genómu je rozdelený do dvoch oblastí, ktoré majú kapsidačné funkcie: genómu, ktorá obsahuje rep gén zahrnutý vírusového génu; a pravorukú cap gén kódujúci kapsidový v replikácii vírusu a expresiu časť genómu, ktorá obsahuje proteín vírusu.
Použitie vektorov odvodených od AAV pre prenos génu in vitro a in vivo bolo opísané v literatúre (pozri, najmä, WO 91/18088; WO 93/092239; US 4, 797,368, US5,139,941, EP 488 528). Tieto prihlášky opisujú rôzne konštrukty odvodené od ÄAV, v ktorých sú rep alebo cap gény odstránené a nahradené požadovaným génom a použitie týchto konštruktov na prenos požadovaného génu in vitro (do kultivovaných buniek) alebo in vivo (priamo do organizmu). Poškodené rekombinantné AVV podľa predkladaného vynálezu sa dá vyhotoviť kotransekciou plazmidu obsahujúceho požadovanú nukleokyselinovú sekvenciu, ktorá je obklopená dvoma AAV prevráteného terminálneho opakovania (ITR) a plazmidu nesúceho AAV kapsidačné gény (rep a capgény), do bunkovej línie, ktorá je infikovaná ľudským pomocným vírusom (napríklad adenovírus). AAV rekombinanty, ktoré boli tak vyrobené, boli čistené štandardnými technikami. Vynález opisuje preto aj AAV odvodený rekombinantný vírus, ktorého genóm obsahuje sekvenciu kódujúcu GAX, ktorá je obklopená ÄAV ITR. Vynález sa týka plazmidu obsahujúceho sekvenciu kódujúcu GAX, ktorá
Taký plazmid sa dá použiť tak GAX sekvencia s plazmidom, tam kde je to je zahrnutý do lipozómového vektora je obklopená dvoma ITR a AAV ako je na prenos vhodné, ktorý (pseudovírus).
Konštrukcia bola rozsiahle rekombinantných retrovírusových literatúre: pozri vektorov najmä EP 7 (1985)
Najmä sú deliacesa spracovaná v
453242, EP 178220, Bernstein a kol. Gent. Eng 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, atčf retrovírusy integračné vírusy, ktoré infikujú bunky. Retrovírusový genóm zahŕňa hlavne dve LTR, kapsidačné sekvencie a tri kódujúce oblasti (gag, pol a env). U rekombinantných vektorov odvodených od retrovírusov sú gény gag, pol a env všeobecne odstránené, celé alebo čiastočné a nahradené požadovanou heterológovou nukleokyselinovou sekvenciou. Tieto vektory sa dajú konštruovať z rôznych typov retrovírusov ako sú najmä MoMuLV (murine Moloney leukaemia virus tiež označovaný ako MoMLV), MSV (murine Moloney sarcoma virus), HaSV (Harvey ο
sarcoma vírus), SNV (spleen necrosis vírus), RSV (Rous sarcoma vírus“) alebo iný priateľský vírus.
Všeobecne, aby boli skonštruované rekombinantné retrovírusy obsahujúce sekvenciu kódujúcu GAX podľa predkladaného vynálezu, je konštruovaný plazmid, ktorý obsahuje najmä LTR, kapsidašnú sekvenciu a kódujúcu sekvenciu, ktorá je potom použitá na transfekciu toho, čo je nazývané enkapsidačná bunková línia, ktorá je schopná doplňovať retrovírusove funkcie, ktoré chýbajú u plazmidov. Všeobecne sú enkapsidačné bunkové línie schopné exprimovať gény gag a env. Také enkapsidačné bunkové línie boli opísané v doterajšom stave techniky, najmä bunková línia PÄ317 (US 4,861,719), bunková línia PsiCRIP (WO 90/02806) a bunková línia GP+envAm-12 (W089/07150). Navyše, rekombinantné retrovírusy môžu obsahovať modifikácie v LTR na potlačenie transkripčnej aktivity rovnako ako enkapsidačné sekvencie, ktoré zahŕňajú časť gag génu (Bender a kol. J. Virol. 61 (1987) 1,963). Rekombinantné retrovírusy, ktoré boli vyrobené, boli následne čistené bežnými technikami.
Použitie poškodených rekombinantných adenovírusov na liečenie restenózy je veľmi výhodné. Adenovírusy majú vysokú infekčnú kapacitu na proliferujúce bunky vaskulárneho hladkého svalstva. To umožňuje použiť relatívne malé množstvá aktívnej zložky (rekombinantného adenovírusu), ktoré vedú k účinnému a veľmi rýchlemu pôsobeniu v liečených miestach. Adenovírusy podľa predkladaného vynálezu sú tiež schopné exprimovať veľkými rýchlosťami vložený gax gén, čo vedie k veľmi účinnému terapeutickému pôsobeniu. Navyše vďaka ich epizomálnej povahe zotrvávajú adenovírusy podľa predkladaného vynálezu v proliferujúci ch bunkách na obmedzenú dobu a tak majú prechodný vplyv, ktorý je vynikajúcim spôsobom upravený na žiadaný terapeutický efekt.
Predkladaný vynález sa týka tiež farmaceutického prostriedku, ktorý obsahuje jeden rekombinantných -vírusov, ktoré už alebo viac poškodených boli opísané. Také prostriedky môžu byť v takej podobe, ktorá je vhodná na predkladaného pri jateľné na plánovaný spôsob ich podávania povrchovou, orálnou, parenterálnou, intranazálnou, intravenóznou, subkutánnou, intraorakulárnou atď. cestou.
Výhodne obsahuje prostriedok podía vynálezu excipienty, ktoré . sú farmaceutický najmä na injekcie do bunkovej sú najmä sterilné, izotonické roztoky soli (hydrogén alebo dihydrogénfosforečnan sodný, chlorid sodný, draselný, vápenatý alebo horečnatý, atď. alebo zmesi takých solí), alebo suché, najmä lyofi 1 izované prostriedky, ktoré sa rekonštituujú pridaním sterilizovanej vody alebo fyziologického roztoku na i njekovateľné roztoky. Excipient tiež môže byť hydrogél, ktorý sa pripravuje z akéhokoľvek biokompatibiIného alebo nejedovatého (homo alebo hetero) polyméru. Také polyméry boli opísané, napríklad v prihláške WO 93/08845. Niektoré z nich ako najmä tie z etylénoxidu alebo propylénoxidu sú komerčne dostupné.
injekovateľné steny. Tieto prostriedky, excipienty ktoré súvisia s sa dajú poškodené predkladaného vynálezu obsahujúceho ktorú možno
Pri liečení patológií, hyperproliferatívnymi chorobami rekomhinantné adenovírusy podía podávať rôznymi cestami, najmä injekčné. S výhodou sú pri liečení restenózy adenovírusy podía predkladaného vynálezu podávané priamo do steny krvnej cievy pomocou angioplastického balónika, ktorý je pokrytý hydrofilným filmom (napríklad hydrogélom), ktorý je nasýtený adenovírusmi alebo pomocou iného katétra infúznu komôrku pre roztok adenovírusu, aplikovať presne do miesta liečenia a umožňuje adenovírusom miestne a účinné uvoľnenie v mieste liečenej bunky. Tento spôsob podávania výhodne umožňuje infikovať veíké množstvo (až 9,6 ss) buniek tunica média, ktoré tvorí preferovaný cieľ na liečenie restenózy, kým štandardné spôsoby podávania (napríklad intravenóznej injekcie) neumožňujú aby boli bunky infikované v takom rozsahu.
Spôsob liečenia podía predkladaného vynálezu výhodne pozostáva z podávania prostriedku, ktorý obsahuje hydrogél nasýtený rekombinantnými adenovírusmi do liečeného miesta. Hydrogél môže byt umiestnený priamo na povrchu liečeného tkaniva, napríklad v priebehu chirurgického zákroku.
Výhodne je hydrogél podávaný na liečené miesto pomocou katétra, napríklad balónikového katétra, najmä pri angioplasti i. Zvlášť výhodným spôsobom je, ak nasýtený hydrogél je dodávaný na liečené miesto pomocou balónikového katétra.
Dávky vírusu, ktoré sa používajú do injekcií, sa dajú upraviť podľa podmienok najmä podľa použitého spôsobu podávania a žiadaného trvania liečenia. Všeobecne sú rekombinantné vírusy podľa predkladaného vynálezu podávané vo forme dávok 104 až 1014 pfu/ml. V prípade AAV a adenovírusu sa dá použiť dávka 106 až 1O10 pfu/ml. Pojem pfu ('jednotka tvorby doštičiek) zodpovedá infekčnej sile suspenzie virónov a je určený infikovaním vhodnej bunkovej kultúry a meraním, všeobecne po 48 hodinách, počtu doštičiek infikovaných buniek. Techniky určenia pfu titra vírusového roztoku'sú dohre dokumentované v literatúre.
Predkladaný vynález ponúka nový a veľmi účinný prostriedok liečenia alebo prevencie patológií, ktoré súvisia s hyperproliferatívnymi chorobami ako je restenóza.
Ďalej sa dá toto liečenie použiť na ľuďoch, rovnako, ako na akýchkoľvek zvieratách ako sú ovce, hovädzí, dobytok, domáce zvieratá (psi, mačky, atď.) kone, ryby, atď.
Predkladaný vynález je úplnejšie opísaný v nasledujúcich príkladoch, ktoré sú len ilustratívne a nijako neobmedzujúce.
Opis obrázkov
Obrázok 1: Obrázok 2: Obrázok 3:
Obrázok 3A
Obrázok 3B Obrázok 4:
Obrázok 5:
Obrázok 6:
Obrázok 7:
Zobrazenie plazmidu pCOl.
Zobrazenie plazmidu pXL-CMV-GaxHΛ
Jadrové umiestnenie GÄXH-HA proteínu vo VSMC transfekovaných pXL-CMV-GaxH.
VSMC transfekované s vektorom pCGN (chýba GAX inzert).
VSMC transfekované s vektorom pXL-CMV-GaxHA . Jadrové umiestnenie GAX-HA proteínu vo VSMC transfekovaných Ad-CMV-Gax.
Vplyv Ad-CMV-GAX na proliferáciu VSMC (t = 24 hodín)
- VSMC sú sčítané po 24 hodinách po pôsobení
Ad-CMV-Gax (1000 pfu/bunka) alebo kontrolným adenovírusom (Ad-RSV-pGal, 1000 pfu/bunka).
Bunkový rast je blokovaný (0,5 % FSC) alebo stimulovaný (FSC 20 %).
Vplyv Ad-CMV-GAX na proliferáciu VSMC (t = 48 hodín).
- VSMC sú sčítané po 48 hodinách po pôsobení
Ad-CMV-Gax (1000 pfu/bunka) alebo kontrolným adenovírusom (Ad-RSV-QGal, 1000 pfu/bunka).
Bunkový rast je blokovaný (0,5% FCS) alebo stimulovaný (FSC 20%).
Vplyv Äd-CMV-GAX na životnosť VSMC, ktoré sú inkubované v prítomnosti fetálneho teľacieho séra (FSC 20%).
- experimentálne podmienky, porov. obrázok 6.
Obrázok 7A: bunky, ktoré nie sú liečené adenovírusom
Obrázok 7B: bunky, ktoré sú liečené Ad-RSV-pGal
Obrázok 7C: bunky, ktoré sú liečené Ad-CMV-Gax
Obrázok 8: Vplyv Ad-CMV-Gax a Ad-RSV-pGal na krysiu karotídovú artériu po pôsobení balónikového katétra.
Obrázok 8A: meranie povrchovej oblasti v intime
Obrázok 8B Obrázok 8C Obrázok 9: Obrázok 9A Obrázok 9B meranie pomeru intima ku médiu meranie luminárneho zúženia
Arteriálny prierez kontrolných a liečených ciev kontrolné cievy liečené Ad-RSV-SGal cievy liečené Ad-CMV-Gax.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Všeobecné molekulárne biologické techniky
Štandardné metódy používané v molekulárnej biológii, ako sú preparatívne extrakcie plazmidovej DNA, centrifugácie plazmidovej DNA v gradiente chloridu cesného, elektroforéza na agarózovom alebo akrylamidovom géli, čistenie fragmetov DNA elektroelúciou, extrakciou proteínu fenolom alebo zmesou fenol/chloroform, zrážaním DNA v soľnom médiu pomocou etanolu alebo izopropanolu, prevedenie do Eschericia coli, atď.,...,sú odborníkom dobre známe a sú.rozsiahlym, spôsobom opísané v literatúre [Maniatis T., a kol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982; Ausubel F.M., a kol. (editori), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987].
Plazmidy typu pBR322 a pUC a fágy série M13 boli získané komerčne (Bethesda Research Laboratories).
Na ligáciu sa DNA fragmenty oddeľujú podľa veľkosti elektroforeticky na agarózovom alebo akrilamidovom géli, extrahujú a potom inkubujú v prítomnosti T4 DNA ligázy (Biolabs) podľa odporúčania dodávateľa.
5' predĺžené konce sa dajú pri používaní vyplniť Klenowovým fragmentom E. coli DNA polymerázy I (Biolabs) podľa údajov výrobcu. 3' predĺžené konce sú zničené v prítomnosti T4 DNA polymerázy (Biolabs), ktorá sa používa podľa odporúčania výrobcu. 5'predížené konce sú zničené opatrným pôsobením SI nukleázy.
vitro miestne špecifickú mutagenézu pomocou ých oligonukleotidov je možné uskutočniť spôsobom Taylorom a kol. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) ] použitím súpravy distribuovanej firmou Amersham.
In syntet ick vyvinutým 8749-8764
Príklad 1: konštrukcia vektora pXL-CMV-GaxHA nesúceho gén kódujúci krysí gax proteín pod kontrolou CMVpromotora.
Tento príklad opisuje konštrukciu vektora, ktorý obsahuje cDNA kódujúcu gax proteín (krysí) a adenovírusové sekvencie, ktoré umožňujú rekombináciu. Ku N-koncu gax proteínu bol predaný epitop chrípkového vírusu hemaglutinín (epitop HA1), zahŕňajúci 18 aminokyselín. Také pridanie epi topu umožňuje sledovať expresiu gax, najmä imunofluorescenčnými technikami, použitím epitopu. Okrem svojej citlivosti táto umožňuje vylúčiť ako in vivo tak in vitro, šum pozadia, ktorý zodpovedá expresii endogénnych gax proteinov.
protilátok HA1 metóda zároveň
1.1. Konštrukcia plazmidu pCOl
A - Konštrukcia plazmidu pCE
EcoRl/Xbal fragment zodpovedajúci ľavorukému koncu genómu adenovírusu Ad5 bol najprv klonovaný medzi Acor a Xba miestami vektora pIC19H. Tým bol generovaný plazmid pCA. Plazmid pCA bol potom prestrihnutý Hinfi a jeho 5'predížené konce boli vyplnené Klenowovým fragmentom E. coli DNA polymerázy I; potom bolo všetko prestrihnuté Ecor. Fragment plazmidu pCA, ktorý bol takto generovaný a ktorý obsahuje ľavoruký koniec genómu adenovírusu Ad5, bol potom klonovaný medzi EcoRI a Smal miestami vektora pIC2OH (Marsh a kol., Gene 32 (1984) 481). Tým bol generovaný plazmid pCB. Plazmid pCB bol potom prestrihnutý EcoRI a jeho 5'predlžené konce boli vyplnené Klenowovým fragmentom E. coli DNA polymerázy
I; všetko potom bolo prestrihnuté BamHI. Fragment plazmidu pCB, ktorý bol takto generovaný a ktorý obsahuje lavoruký koniec genómu adenovírusu Ad5 , potom bol klonovaný medzi Nrul a BglII miestami vektora pIC2OH. Tým bol generovaný plazmid pCE ktorého výhodná charakteristika spočíva v prvých 382 pároch báz adenovírusu Ad5, ktoré nasleduje mnohonásobné klonovacie miesto.
B - konštrukcia plazmidu pCD'
Sau3A (3346)/SstI (3645) a SstI (3545)/NarI (5519) fragmenty z genómu adenovírusu Ad5 boli najprv spolu ligované a klonované medzi Clal a BamHI miestami vektora pIC2OH, čím bol generovaný plazmid pPY53. Sall/Taql fragment z plazmidu pPY53 (pripraveného z dam-pozadia), obsahujúci časť genómu adenovírusu Ad5 medzi miestami Sau3A (3346) a Tagl (5207) potom bol klonovaný medzi Sali a Clal miestami vektora pIC20H, čím bol generovaný plazmid pCA'. Tagl (5207)/NarI (5519) fragment . genómu.· Ad5 adenovírusu, pripraveného z dam- pozadia,a Sall-Tagl fragment z plazmidu pCA'potom boli spolu ligované a klonované medzi Sali a NarI miestami vektora pIC20H. Tým bol generovaný plazmid pCC'. NarI (5519)/NruI (6316) fragment genómu adenovírusu Ad5, pripraveného z dam- pozadia a Sall/NarI fragment z plazmidu pCC' potom boli spolu ligované a klonované medzi Sali a Nrul miestami vektora pIC20H. Tým bol generovaný plazmid pCD'.
C- Konštrukcia plazmidu pCOl
Čiastočným odbúravaním plazmidu pCD' pomocou Xhol a potom úplným odbúravaním pomocou Sali bol generovaný fragment, ktorý obsahoval sekvenciu adenovírusu Ad5 od miesta Sau3A (3446) až k miestu Nrul (6316). Tento fragment bol klonovaný do Sali miesta plazmidu pCE. Tým bol generovaný plazmid pCOl (obrázok 1), ktorý obsahoval lavorukú časť adenovírusu Ad5 až do miesta Hinfl (382), mnohonásobného klonovacieho miesta a Sau3A (3446)/NruI (6316) fragmentu adenovírusu Ad5 .
1.2 Konštrukcia vektora pXL-CMV-GaxHA (porov. obrázok 2)
Gax cDNA bol klonovaný medzi Xbal a vektora pCGN (Tanaka a Herr, Celí 60: Výsledný vektor, pCGN-Gax, obsahoval
BamHI miestami 375-386, 1990). promotorovú a enhancerovú sekvenciu cytomegalovírusu (CMV) (-522, +72; Boshart a kol., Celí, 41: 521-530, 1985), hlavnú sekvenciu kinázy, vrátane AUG tri aminokyseliny 6: 1309-1315, herpes simplex virus tymidín inicializačného kodónu, rovnako ako prvé (+55, +104; Rusconi a Yamamoto, EMBO J.,
1987), sekvencie kódujúce HA1 epitop [Y P Y D V P D Y A SLGGP (sekvencie id. č. 1)], krysí gax cDNA a, nakoniec polyadenylačnú sekvenciu králičieho β-globínového génu (Päbo a kol., Celí, 35: 445-453, 1983).
Vektor pCGN-Gax bol potom prestrihnutý XmnI a Sfil a vzniknutý .fragment . obsahujúci promotor, cDNA a polyadenylačnú sekvenciu, bol po úprave podľa Klanowa vložený do EcoRV miesta člnkového vektora pCOl, ktorý obsahoval adenovírusové sekvencie potrebné na rekombináciu. Plazmid, ktorý hol získaný bol označený pXL-CMV-GaxHA (porov. obrázok 2).
Príklad 2: demonštrácia proliferačne inhibičných vlastností plazmidu pXL-CMV-gax-HA.
Tento príklad opisuje postupy, ktoré sa dajú použiť na demonštráciu kvality homológových rekombinačných vektorov (porov. príklad 1), v ohľade expresie (detekcie gax proteínu a HA epitopu) a v ohľade aktivity (vplyv na proliferáciu).
Bunky vaskulárneho hladkého svalstva (vascular smooth-muscle cells - VSMC) boli kultivované enzymatickým odbúravaním NZW králičej aorty spôsobom upraveným podľa
Chamley a kol. (Celí Tissue Res. 177: 503-522 1977). Stručne povediac, po vybratí bola aorta inkubovaná pri 37°C počas 45 minút v prítomnosti kolagenázy (kolagenáza II, Cooper Biomedical). Druhé odbúravanie sa potom uskutočňovalo počas dvoch hodín v prítomnosti kolagenázy a elastázy (Biosys), čím bola získaná bunková suspenzia. Bunky boli udržiavané v prítomnosti 20% fetálneho teľacieho séra a použité na všetky testy (porov. ďalej). Vo všetkých týchto experimentoch boli bunky hladkého svalstva charakterizované imunoznačením pomocou anti-aSM aktín protilátky (F-3777, Sigma).
Na overenie kvality expresných vektorov (porov. Príklad 1), boli prítomnosť a umiestnenie gax proteínu monitorované u každého konštruktu imunofluorescenciou. Aby bolo možné uskutočniť toto sledovanie, bunky hladkého
3T3 bunky boli transfekované plazmidmi a pCGNgax v prítomnosti zmesi DOSPA/DOPE (Lipofectamine, Gibco BRL). Bunky boli inkubované v prítomnosti komplexu v médiu neobsahujúcom fetálne teľacie sérum 8 hodín (optimálne trvanie: 8 hodín na SMC). Po inkubácii počas 24 hodín v prítomnosti fetálneho teľacieho séra boli bunky kultivované na mikroskopickej doštičke (Titertek), pri sledovaní imunofluorescencie, počas ďalších 24 hodín. Bunky boli potom fixované v prítomnosti 4% paraformaldehydu a následne permabi1 izované prídavkom 0,1% tritónu. Po nasýtení buniek v prítomnosti hovädzieho séra albumínu (BSA, Sigma), bola pridaná na úspešne uskutočnenie pokusu anti-HA protilátka (12CA5, Boehringer Mannheim) a potom protilátka konjugovaná s fluoresceínom.
Imunofluorescenčné pokusy uskutočnené súčasne na NIH3T3 bunkách a na primárnej kultúre králičích VSMC dokázali, že pCGNgax tak člnkový plazmid pXL-CMV-GaxHA proteín, ktorý je umiestnený v jadre (porov. kontrolný plazmid; 3B: plazmid
Navyše bolo možné po extrakcii jadrových svalstva alebo pXL-CMV-Gax HA
DNA/1ipozóm počas 4 až ako plazmid naozaj kódujú obrázok 3A:
pXL-CMV-GÄäaxHA ) proteínov z buniek transfekovaných pXL-CMV-Gax dokázať, pomocou Western blottu, proteín, ktorý je detekovaný protilátkou proti HA epitopu.
Potom bol zisťovaný vplyv uvedených vektorov na proliferáciu bunky. Aby bolo možné toto určenie vykonať bola použitá nepriama metóda, ktorá je založená na meraní tvorby kolónie. Stručne povedané, NIH3T3 myšacej embryonáln'e j bunky boli použité k uskutočneniu testu vzniku kolónie upraveným spôsobom podľa Schweighoffer a kol. (Mol. Celí. Biol. 1993, 13: 39-43). Stručne povediac, bunky sú kontrastekované s plazmidom, ktorý nesie gén rezistencie na neomycin a s prebytkom požadovaného vektora (pCGNgax alebo pXL-CMV-GaxHA). Po selekcii v G41S boli kolónie zafarbené roztokom karbolfuchsínu (Diagnostica, Merck) a spočítané. Výsledky reprezentatívneho experimentu, ktoré sú uvedené v tabuľke 1, demonštrujú zníženie počtu kolónií v prípade buniek transfekovaných pCGNgax.
Tabuľka 1
Podmienky transfekcie 3T3 buniek Počet kolónii po selekcii v G418
pCGN (5 (jg) + pSV2neo (1 pg) (§) 183 + 28 (*)
pCGNgax (5pg) + pSV2neo (IM?) 93 + 11
(§) pCGN kontrolný vektor: neprítomnosť gax inzertu (*) P < 0,01
Príklad 3: Konštrukcia rekombinantného adenovírusu Ad-CMVgax
Vektor pXL-CMV-GaxHA, pripravený podľa príkladu 1, bol následne 1inearizovaný a kontrasfekovaný na rekombináciu s poškodeným adenovírusovým vektorom do pomocných buniek (bunková línia 293), ktorej dodávajú funkcie kódované oblasťami adenovírusu El (E1A a E1B).
Adenovírus Ad-CMVgax bol získaný prostriedkami in vivo homológnou rekombináciou medzi adenovírusom Ad.RSVpgal (Stratford Perricaudet a kol., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626) a vektorom pXL-CMV-GaxHA podľa nasledujúceho postupu: vektor pXL-CMV-GaxHA, linearizovaný s enzýmom XmnI a adenovírus Ad.RSVPgal, linearizovaný s Clal, boli kotransfekované do bunkovej línie 293 v prítomnosti fosforečnanu vápenatého aby mohla prebiehať homológna rekombinácia. Rekombinantné adenovírusy, ktoré boli týmto spôsobom generované, boli vybrané doštičkovým čistením. Po izolácii bol rekombinantný adenovírus rozmnožený v bunkovej línii 293, čo vedie ku kvapaline nad kultúrou, ktorá obsahuje nevyčistené rekombinantné poškodené adenovírusy, ktoré majú titer 10 pfu/ml.
Vírusové častice boli čistené odstreďovaním v gradiente chloridu cesného podľa známych postupov (pozri najmä Graham a kol., Virológie 52 (1973) 456). Adenovírus Ad-CMVgax bol uchovávaný pri - 80°C v 20% (hmôt.) glyceroli.
Príklad 4: demonštrácia proliferačno inhibičných vlastností adenovírusu Ad-CMVgax.
inkubovaná v kontrolného adenovírus prítomnosti adenovírusu exprimujúci adenovírusu (ad-RSV(3Gal :
Tento príklad opisuje postupy, ktoré sa dajú použiť na demonštráciu kvality rekombinantného adenovírusu, čo sa týka produkcie gax proteínu a čo sa týka biologickej aktivity (vplyv na bunkovú proliferáciu).
Králičia aorta bola
Ad-CMVgaxHA a rekombinantný β-galaktozidázu s kontrolou RSV promotora), ktorý je riedený v médiu (DMEM, 0,5 % FCS). Po jednej hodine pri 37°C vo vlhkej atmosfére bolo médium, obsahujúce roztok adenovírusu odsaté a nahradené novým médiom (DMEM, 0,5 % FCS) počas 18 až 24 hodín. Potom bolo pridané médium, bohaté na FCS (konečná koncentrácia FCS: 20 %), aby sa stimulovala proliferácia buniek a bunky boli po 24 hodinách a po 48 hodinách spočítané.
Navyše, 24 hodín po pridaní roztoku adenovírusu bola monitorovaná expresia gax proteinu bunkami VSMC technikou opísanou v príklade 2, najmä značením jadra prostriedkami imunofluorescencie (lokalizácie proteinu) a tiež Western blottom. Proteín produkovaný rekombinantným adenovírusom je účinne detekovaný protilátkami, ktoré rozpoznávajú HA epitop a majú rovnakú elektroforetickú mobilitu ako gax proteín, ktorý je detekovaný v jadre VSMC, ktoré boli transfekované s pCGNgax alebo pXL-CMV-GaxHA. Obrázok 4 ilustruje umiestnenie Gax proteinu vo VSMC, ktoré boli inkubované v prítomnosti Ad-CMVgaxHA.
Výsledky reprezentatívneho experimentu, ktoré sú uvedené na obrázku 4, demonštrujú značné zníženie počtu buniek po pridaní Ad-CMVgaxHA vírusu. Na druhej strane toto zníženie počtu buniek nebolo pozorované po pôsobení kontrolného adenovírusu použitého, v rovnakej koncentrácii (M.O.I. 1000). Súčasne sme pomocou imunofluorescencie overili, že táto vysoká infekčnosť umožňuje ako β-gal značkovému génu (použitie anti-E.Coli β-gal protilátky, Monosan) tak gax proteinu (použitie anti-HA protilátky, porov. príklad 2), aby boli exprimované vo viac než 90 % populácie králičích VSMC.
Pridanie ad-RSV-^gal vírusu je spojené so slabým cytostatickým efektom (-13 %) po kultivácii počas 24 hodín v prítomnosti fetálneho teľacieho séra (20 %). Za rovnakých experimentálnych podmienok viedlo pôsobenie Ad-CMVgaxHA k 57 % zníženie počtu buniek (porov. obrázok 5). Biologická aktivita Ad-CMVgaxHA vírusu je veľmi zrejmá po 48 hodinách kultivácie a dokonca môže súvisieť i s bunkovou smrťou (porov. obrázky 6 a 7).
Tak je blokovanie proliferácie, ktorá je spôsobená Ad-CMVdaxHA, spojené so značným znížením počtu buniek, ktoré sa dajú detekovať po kultivácii počas 24 hodín (porov. obrázok 5). Je zaujímavé, že tento vplyv Ad-CMVgaxHA bol pozorovaný u buniek, ktoré boli stimulované vysokou koncentráciou FCS (20 %), ale nie u buniek, ktoré boli zbavené FCS (0,5 &) (porov. obrázok 6). Tento príklad preto ukazuje, že rekombinantný adenovírus, ktorý kóduje gax proteín, môže účinne blokovať bunkové delenie bez akéhokoľvek značného vplyvu na životnosť buniek, ktoré sú blokované v GO fáze ich cyklu.
Vplyv Ad-CMVgaxHA adenovírusu na životnosť VSMC v kultúre je ďalej ilustrovaný obrázkom 7.
Inhihičné vlastnosti Ad-CMVgaxHA na syntézu DNA boli potvrdené pokusy o začlenení hrómdeoxyuridínu (BrdU). Stručne povedané, po 24 hodinách po pridaní adenovírusu boli inkubované VSMC v prítomnosti FCS (10 % až 20 %) a BrdU (10 μΜ), ktorý je do buniek začleňovaný miesto tymínu pri fáze DNA syntézy a dá sa detekovať špecifickými protilátkami. Začlenenie BrdU holo kvantifikované pomocou prietokovej cytometri e.
Ten istý spôsob prietokovej cytometrie bol použitý na
I , vizualizáciu postupu králičích ‘VSMC buniek, upravených Ad-CMVgaxHA, v ich bunkovom cykle. Pôsobenie Ad-CMVgaxHA je spojené s blokovaním bunkového cyklu vo fáze GO/G1.
Príklad 5: inhihícia intimálnej hyperplazie pomocou adenovírus-gax in vivo.
Tento príklad ukazuje účinnosť rekombinantných adenovírusov v modeli vaskulárnej patológie.
Použitý model arteriálnej lézie je založený na obrusovaní krysej karotídy (Clows a kol., Lab. Invest. 49 (1983) 327-333). U tohto modelu, VSMC dediferencujú, proliferujú a migrujú do formy neointimy, ktorá môže čiastočne pohlcovať artériu, do dvoch týždňov poškodenia.
Sprague-Dawley krysy boli anestetikované intraperitoneálnou injekciou pentoharbitálu (45 mg/kg). Nasledovala vonkajšia karotídová arteriotómia, krysie karotídové artérie boli obnažené balónikovým katétrom a vystavené 1.10 pfu Ad-CMVgaxHA alebo Ad-RSVPGal. Adenovírus bol použitý v roztoku obsahujúcom 15 % poloxaméru 407, ktorý uľahčuje prenos génu adenovírusu. Dvadsať minút po inkubácii bol roztok vírusu odobraný a boli odstránené ligatúry, čím bola obnovená cirkulácia. Krysy boli utratené po dvoch týždňoch a na reze liečených ciev boli uskutočnené kvantitatívne morfometrické analýzy. Výsledky sú uvedené na obrázkoch 8 a 9.
Získané výsledky ukazujú, že všetkých deväť Ad--RSVP-Gal transfekovaných karotídových artérií malo silnú VSMC proliferáciu a rozvoj značného neointimálneho zhrubnutia. Plocha neointimy bola 0,186 +/- 0,02 mm2 (SEM) s rozsahom 0,10 až 0,28. Luminálna patentencia bola príslušne zúžená na 40 +/- 4 (rozsah 21 až 63), obrázok 8C. Pomer intima : média bol 1,51 +/- 0,l(rozsah 0,87 až 2,17). Tieto výsledky boli podobné výsledkom získaným skôr u kontrolných ciev, na ktoré sa pôsobilo fyziologickým roztokom. Na rozdiel od toho, pôsobenie Ad-CMVfaxHA značne, znížilo patologickú reakciu na poškodenie balónikom. U ciev liečených Ad-CMVgaxHA bola priemerná plocha neointimálna lézia 0,076 +/- 0,02 mm2 (rozsah 0 až 0,19), luminálne zoslabenie bolo znížené na
17,5 +/-5 %. Štatistická analýza potvrdila, že liečenie Ad-CMVgaxHA značne inhibuje rozvoj intimálneho zhrubnutia relatívne ku kontrolám Äd-RSVp-Gal. Konkrétne, liečenie Ad-CMVgaxHA znížilo pomer intima: média o 69 %, intimálnu plochu o 59 % a luminálne zoslabenie o 56 % (obrázky 8A a 8B). Značný vplyv na intimálnu hyperplaziu bol ďalej zdôraznený výsledkami získanými z prierezu kontrolných (obrázok 9A) alebo liečených (obrázok 9B) zvierat.
Tento príklad demonštruje veľmi účinnú aktivitu pri zostavovaní rastu konštruktu Ad-CMVgaxHA in vivo. Táto aktivita je veľmi špecifická a nebola pozorovaná u kontrolných zvierat. Prezentované výsledky jasne ukazujú terapeutickú aktivitu Ad-CMVgaxHA na vaskulárnu morfológiu a najmä na hyperplaziu, ktorá je spojená s postangioplastickou restenózou. Použitie vírusu ako je adenovírus, na prenos Gax génu in vivo je zvlášť účinné. Tento spôsob je ďalej výhodný, pretože je založený na nahradení génu. Tento spôsob je jedinečný v tom, že spôsobuje účinnosť dopravy a génovú terapiu do dvoch terapeutických vlastností: zastavenie rastu a konštitutívnu expresiu vo vaskulárnom systéme. Prenos Gax génu podľa predkladaného vynálezu vyvoláva špecifickú regresiu hyperproliferatívneho ochorenia vaskulárnej cievy a následne tak normalizuje arteriálne funkcie. Miestny prenos Gax génu podľa predkladaného vynálezu je tiež výhodný najmä v tom, že nevadí reendotelizačnému procesu, ktorý nasleduje po lézii artérie. Navyše okrem priameho vplyvu na bunkovú proliferáciu a vaskulárnu morfológiu, prenos gax génu podľa predkladaného vynálezu môže mať aj užitočný nepriamy vplyv na syntézu extracelulárnej matrice a na remodeláci u. Tieto výsledky ukazujú, že prenos Gax génu podľa predkladaného vynálezu je výrazný nový pokrok v liečení vaskulárnuch lézii, ktoré vznikajú po angioplasti i.
Zoznam sekvencií (1) Všeobecné informácie:
(i) Vynálezca:
Meno: ČASE WESTERN RESERVE UNIVERSITY Ulica:
Mesto: Cleveland Štát: Ohio Krajina: USA Poštový kód: 44106 (i) Vynálezca:
Meno: Branellec, Didier
Ulica: 1, Rue Saint-Benoit
Mesto: 94210 La Varenne-Saint Hilaire
Štát:
Krajina: Francúzsko Poštový kód: .
(i) Vynálezca:
Meno: Walsh, Kenneth Ulica: 207 Judy Farm Road Mesto: Carlisle Štát: Massachusetts Krajina: USA Poštový kód: 01741 (i) Vynálezca:
Meno: 34 Brenton Road Mesto: Weston Štát: Massachusetts Krajina: USA
Poštový kód: 02193 (ii) Názov vynálezu: Vírusové vektory a ich použitie na liečenie hyperproliferatívnych ochorení, najmä restenózy (iii) Počet sekvencii: 1 (iv) Korešpondenčná adresa:
(A) Adresa: Rhone-Poulenc Rorer Inc.
(B) Ulica: 500 Arcola Rd. 3C43 (C) Mesto: Collegeville (D) štát: PA (E) Krajina: USA (F) Poštový kód: 19426 (v) Forma čitateľná pre počítač (A) Typ média: disketa (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (CT Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Pate'ntln Release č. 1.0,
Verzia č. 1.30 (vi) Údaje o súčasnej prihláške:
(A) Číslo prihlášky: PCT (B) Dátum podania:
(C) Klasifikácia:
(vii) Údaje o predchádzajúcej prihláške:
(A) Číslo prihlášky: Fr 95-04234 (B) Dátum podania: 31.3.1995 (viii) Informácie o právnom zástupcovi /agentovi/ (A) Meno: Savitzki, Martin F.
(B) Registračné číslo: 26,699 (C) Číslo referencie / označenie: ST95022-US (ix) Telekomunikačné údaje:
(A) Telefón: (610)454-3816 (B) Telefax: (610)454-3808 (2) Údaje o sekvencii id. č. 1:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 14 aminokyselín (B) Typ: aminokyselinová (C) Vláknitosť:
(D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (v) Typ fragmentu: vnútorný (ix) Opis sekvencie: sekvencie id. č. 1:
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Gly Gly Pro
Priemyselná využiteľnosť
Vírusové vektory podľa predkladaného priemyselne využiteľné pri výrobe liekov hyperproliferatívnvch ochorení, najmä restenózy vynálezu sú na liečenie
PATENTOVÉ

Claims (17)

1. Poškodený rekombinantný vírus obsahujúci prinajmenšom jeden vložený gén kódujúci celý alebo časť GAX proteínu alebo variantu tohto proteínu.
2. Vírus podľa nároku 1, v ktorého genórae chýbajú oblasti, ktoré sú nevyhnutné na jeho replikáciu v infikovanej bunke.
3. Vírus podľa nároku 1 alebo 2, ktorý je adenovírus, výhodne typu Ad 5 alebo Ad 2.
4. Vírus podľa nároku 1 alebo 2, ktorý je adenovírus zvieracieho, výhodne psieho pôvodu.
5. Vírus podía jedného z nárokov 1 alebo 2, v ktorom vložený gén kóduje celý alebo časť krysieho GAX proteínu alebo variantu tohto proteínu.
6. Vírus podľa nároku 5, v ktorom vložený gén kóduje krysí GAX proteín alebo jeho ľudský homológ.
7. Vírus podľa jedného z nárokov 1 alebo 2, v ktorom vložený gén je cDNA.
8. Vírus podľa jedného z nárokov 1 až 2, v ktorom vložený gén je gDNA.
9. Vírus podľa jedného z nárokov 1 až 2, v ktorom vložený gén obsahuje sekvencie, ktoré mu umožňujú byt exprimovaným v infikovanej bunke.
10. Vírus podľa jedného z nárokov 1 až 2, v ktorom vložený gén obsahuje signálnu sekvenciu, ktorá smeruje syntetizovaný polypeptid do sekrečných ciest cieľovej bunky .
11. Adenovírus podľa nároku 3 alebo 4, ktorý obsahuje deléciu celej alebo časti oblasti E1.
12. Adenovírus podľa nároku 11, ktorý navyše obsahuje deléciu celej alebo časti oblasti E4.
13. Vírus podľa nároku 1 alebo 2, ktorý je adenosúvi s iaci vírus (adeno-associated virus-AAV).
14. Vírus podľa nároku 1 alebo 2, ktorý je retrovírus.
15. Použitie vírusu podľa jedného z nárokov 1 až 2 na prípravu farmaceutického prostriedku, ktorý je určený na liečenie alebo prevenciu patológií, ktoré súvisia s hyperproliferatívnymi ochoreniami.
16. Použitie podľa nároku 15, na prípravu farmaceutického prostriedku, ktorý je určený na liečenie restenózy.
17. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje jeden alebo viac poškodených
rekombinantných 2 . vírusov podľa j edného z nárokov 1 alebo 18. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 17, vyznačuj úci s a tým, že je v i njekovateľnej forme a tým , že obsahuje 104 až 101 4
SK1327-97A 1995-03-31 1996-03-28 Viral vectors and their use for treating hyperproliferative disorders, in particular restenosis SK132797A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9504234A FR2732357B1 (fr) 1995-03-31 1995-03-31 Vecteurs viraux et utilisation pour le traitement des desordres hyperproliferatifs, notamment de la restenose
PCT/US1996/004493 WO1996030385A1 (en) 1995-03-31 1996-03-28 Viral vectors and their use for treating hyperproliferative disorders, in particular restenosis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK132797A3 true SK132797A3 (en) 1998-07-08

Family

ID=9477928

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1327-97A SK132797A3 (en) 1995-03-31 1996-03-28 Viral vectors and their use for treating hyperproliferative disorders, in particular restenosis

Country Status (16)

Country Link
US (2) US5851521A (sk)
EP (1) EP0817791A4 (sk)
JP (1) JPH11503314A (sk)
KR (1) KR19980703454A (sk)
CN (1) CN1190402A (sk)
AP (1) AP1011A (sk)
AU (1) AU701345B2 (sk)
BR (1) BR9608449A (sk)
CA (1) CA2216878A1 (sk)
CZ (1) CZ308897A3 (sk)
FR (1) FR2732357B1 (sk)
HU (1) HUP9801767A3 (sk)
OA (1) OA10516A (sk)
SI (1) SI9620059A (sk)
SK (1) SK132797A3 (sk)
WO (1) WO1996030385A1 (sk)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5856121A (en) * 1994-02-24 1999-01-05 Case Western Reserve University Growth arrest homebox gene
US7423125B2 (en) 1995-08-01 2008-09-09 Vegenics Limited Antibodies to VEGF-C
FR2740344B1 (fr) * 1995-10-31 1997-11-21 Rhone Poulenc Rorer Sa Application de la proteine gax au traitement de cancers
FR2754822B1 (fr) * 1996-10-18 1998-11-27 Rhone Poulenc Rorer Sa Polypeptides comprenant des domaines de la proteine gax, impliques dans la repression de transcription et/ou interagissant avec d'autres proteines, acides nucleiques correspondants et leurs utilisations
US6335010B1 (en) * 1996-11-08 2002-01-01 University Of California At San Diego Gene therapy in coronary angioplasty and bypass
WO2000041732A1 (en) 1999-01-19 2000-07-20 The Children's Hospital Of Philadelphia Hydrogel compositions for controlled delivery of virus vectors and methods of use thereof
CA2396628A1 (en) * 2000-01-25 2001-08-02 Edwards Lifesciences Corporation Delivery systems for treatment of restenosis and anastomotic intimal hyperplasia
DE60131146T2 (de) 2000-02-25 2008-03-06 Ludwig Institute For Cancer Research Material und verfahren die hybridvaskularendothelwachstumfaktoren dns und proteine enthalten und screeningverfahren für modulatoren
US20030100889A1 (en) * 2001-07-05 2003-05-29 Nicolas Duverger Method of administration of a gene of interest to a vascular tissue
US20030180936A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-25 Memarzadeh Bahram Eric Method for the purification, production and formulation of oncolytic adenoviruses
US20040220656A1 (en) * 2003-04-30 2004-11-04 Epstein Samuel J. Coated medical devices and methods of making the same
US20080215137A1 (en) * 2003-04-30 2008-09-04 Boston Scientific Scimed, Inc. Therapeutic driving layer for a medical device
AU2004272114B2 (en) * 2003-09-12 2010-11-04 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Animal model for protease activity and liver damage
US7422741B2 (en) 2004-03-05 2008-09-09 Vegenics Limited VEGFR-3 fusion proteins
US7582442B2 (en) * 2004-03-16 2009-09-01 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for using aleveolar macrophage phospholipase A2
US7319015B2 (en) * 2004-03-16 2008-01-15 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for using alveolar macrophage phospholipase A2
GB0416487D0 (en) 2004-07-23 2004-08-25 Isis Innovation Modified virus
US20090233986A1 (en) * 2004-07-27 2009-09-17 Mount Sinai School Of Medicine Methods and compositions for using sax2
FI20050753A (fi) 2004-09-03 2006-03-04 Licentia Oy Uudet peptidit
WO2006101629A2 (en) * 2005-02-17 2006-09-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated SODIUM CHANNEL PROTEIN TYPE III α-SUBUNIT SPLICE VARIANT
KR100747646B1 (ko) 2005-02-25 2007-08-08 연세대학교 산학협력단 데코린 유전자를 포함하는 유전자 전달 시스템 및 이를 포함하는 약제학적 항종양 조성물
WO2007022287A2 (en) 2005-08-15 2007-02-22 Vegenics Limited Modified vegf and pdgf with improved angiogenic properties
US20080200408A1 (en) * 2005-09-30 2008-08-21 Mccormack Kenneth Deletion mutants of tetrodotoxin-resistant sodium channel alpha subunit
US7972813B2 (en) * 2005-09-30 2011-07-05 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Tetrodotoxin-resistant sodium channel alpha subunit
CA2633468C (en) 2005-12-14 2014-02-18 Licentia Ltd Novel neurotrophic factor protein and uses thereof
US20090214496A1 (en) * 2006-01-30 2009-08-27 Licentia Ltd. Bmx/etk tyrosine kinase gene therapy materials and methods
EP2548578B1 (en) 2006-05-17 2014-08-20 The Ludwig Institute for Cancer Research Targeting VEGF-B regulation of fatty acid transporters to modulate human diseases
FI20070808A0 (fi) 2007-10-25 2007-10-25 Mart Saarma GDNF:n silmukointivariantit ja niiden käytöt
EP2241626B1 (en) 2008-01-09 2016-01-06 Konkuk University Industrial Cooperation Corp Baculovirus-based vaccines
US20090196854A1 (en) * 2008-02-04 2009-08-06 Kytos Biosystems S.A. Methods and compositions for use of crl 5803 cells for expression of biotherapeutics and encapsulated cell-based delivery
FI20080326A0 (fi) 2008-04-30 2008-04-30 Licentia Oy Neurotroofinen tekijä MANF ja sen käytöt
US8052970B2 (en) * 2008-06-30 2011-11-08 The Regents Of The University Of Michigan Lysosomal phospholipase A2 (LPLA2) activity as a diagnostic and therapeutic target for identifying and treating systemic lupus erythematosis
EP2496268A4 (en) 2009-11-06 2013-06-19 Univ Chung Ang Ind GENE DELIVERY SYSTEMS BASED ON NANOPARTICLES
KR101232123B1 (ko) 2010-10-08 2013-02-12 연세대학교 산학협력단 재조합된 유전자발현 조절서열을 가지는 종양 특이적 발현이 개선된 유전자 전달체
ES2748577T3 (es) 2011-05-19 2020-03-17 Univ Michigan Regents Agentes de fijación de la integrina alfa-2 y uso de los mismos para inhibir la proliferación de las células de cáncer
JP5969044B2 (ja) 2011-11-24 2016-08-10 バイロメッド カンパニー リミテッド アデノウイルス生産新規細胞株及びその用途
EP2785683B1 (en) 2011-11-30 2020-02-05 Ludwig Institute for Cancer Research Ltd. Inkt cell modulators and methods of using the same
GB201120860D0 (en) 2011-12-05 2012-01-18 Cambridge Entpr Ltd Cancer immunotherapy
WO2013184209A1 (en) 2012-06-04 2013-12-12 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Mif for use in methods of treating subjects with a neurodegenerative disorder
PT2892617T (pt) 2012-09-06 2018-10-18 Univ Chicago Polinucleótidos antisenso para induzir o salto de exão e métodos de tratamentos de distrofias
KR101429696B1 (ko) 2012-11-21 2014-08-13 국립암센터 안전성 및 항암활성이 증가된 재조합 아데노바이러스 및 이의 용도
CA2901226C (en) 2013-02-18 2020-11-17 Vegenics Pty Limited Vascular endothelial growth factor binding proteins
WO2014191630A2 (en) 2013-05-28 2014-12-04 Helsingin Yliopisto Non-human animal model encoding a non-functional manf gene
ES2846902T3 (es) 2015-04-08 2021-07-30 Univ Chicago Composiciones y procedimientos para corregir la distrofia muscular de cinturas tipo 2C mediante omisión de exones
EP3363447A4 (en) 2015-10-12 2019-07-03 Industry - University Cooperation Foundation Hanyang University ADENOVIRUS COMPLEX FOR GENETIC TRANSFER OR GENE THERAPY
EP3515480A1 (en) 2016-09-20 2019-07-31 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH New swine influenza vaccine
AR109540A1 (es) 2016-09-20 2018-12-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Moléculas promotoras para expresar antígenos virales
CN109715204B (zh) 2016-09-20 2023-08-22 勃林格殷格翰动物保健有限公司 新的ehv插入位点orf70
TW201823467A (zh) 2016-09-20 2018-07-01 德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司 犬腺病毒載體
US11850215B2 (en) 2017-12-13 2023-12-26 Genemedicine Co., Ltd. Recombinant adenoviruses and stem cells comprising same

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8424757D0 (en) * 1984-10-01 1984-11-07 Pasteur Institut Retroviral vector
FR2573436B1 (fr) * 1984-11-20 1989-02-17 Pasteur Institut Adn recombinant comportant une sequence nucleotidique codant pour un polypeptide determine sous le controle d'un promoteur d'adenovirus, vecteurs contenant cet adn recombinant, cellules eucaryotes transformees par cet adn recombinant, produits d'excretion de ces cellules transformees et leurs applications, notamment a la constitution de vaccins
US4797368A (en) * 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US5139941A (en) * 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US4861719A (en) * 1986-04-25 1989-08-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center DNA constructs for retrovirus packaging cell lines
CA1339354C (en) * 1988-09-01 1997-08-26 The Whitehead Institute For Biomedical Research Recombinant retroviruses with amphotropic and ecotropic host ranges
US5585362A (en) * 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
CA2039921A1 (en) * 1990-04-16 1991-10-17 Xandra O. Breakefield Transfer and expression of gene sequences into central nervous system cells using herpes simplex virus mutants with deletions in genes for viral replication
WO1991018088A1 (en) * 1990-05-23 1991-11-28 The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors
US5173414A (en) * 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5252479A (en) * 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
ATE307212T1 (de) * 1992-11-18 2005-11-15 Arch Dev Corp Adenovirus-gelenkter gen-transfer zum herz-und glatten vaskulären muskel
EP0673431A1 (en) * 1992-12-03 1995-09-27 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
FR2705361B1 (fr) * 1993-05-18 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
FR2705686B1 (fr) * 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
CA2144040A1 (fr) * 1993-07-13 1995-01-26 Michel Perricaudet Vecteurs adenoviraux defectifs et utilisation en therapie genique
US5856121A (en) * 1994-02-24 1999-01-05 Case Western Reserve University Growth arrest homebox gene

Also Published As

Publication number Publication date
BR9608449A (pt) 1999-11-30
OA10516A (en) 2002-04-22
AP1011A (en) 2001-09-22
MX9707549A (es) 1998-07-31
AU5531596A (en) 1996-10-16
KR19980703454A (ko) 1998-11-05
EP0817791A1 (en) 1998-01-14
HUP9801767A2 (hu) 1998-10-28
AP9701117A0 (en) 1996-03-28
FR2732357B1 (fr) 1997-04-30
CZ308897A3 (cs) 1998-03-18
CA2216878A1 (en) 1996-10-03
WO1996030385A1 (en) 1996-10-03
AU701345B2 (en) 1999-01-28
FR2732357A1 (fr) 1996-10-04
HUP9801767A3 (en) 1999-04-28
SI9620059A (sl) 1998-06-30
EP0817791A4 (en) 1998-07-15
US5851521A (en) 1998-12-22
CN1190402A (zh) 1998-08-12
USRE37933E1 (en) 2002-12-10
JPH11503314A (ja) 1999-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK132797A3 (en) Viral vectors and their use for treating hyperproliferative disorders, in particular restenosis
AU738651B2 (en) Promoter for smooth muscle cell expression
Smith Viral vectors in gene therapy
EP0752002A1 (en) Inhibition of arterial smooth muscle cell proliferation
KR19990044356A (ko) 엠디엠2 단백질의 종양원 활성의 길항제 및 암 치료에 있어서 이의 용도
EP0938553B1 (en) Dna encoding dp-75 and a process for its use
KR20010110770A (ko) 유전자 치료 및 치료 스크리닝에 유용한 ｅＮＯＳ 돌연변이
US7329741B2 (en) Polynucleotides that hybridize to DP-75 and their use
KR100336551B1 (ko) 망막아종 단백질의 조직 특이적 발현
JPH11514881A (ja) Ｇａｘタンパク質の癌治療への応用
US11952599B2 (en) Single adeno-associated virus (AAV)-sized nucleotide for use in CRISPR interference or activation
WO1996015245A1 (en) A process of inhibiting non-neoplastic pathological cell proliferation
SK51199A3 (en) Polypeptides comprising gax protein domains, involved in repressing transcription and/or interacting with other proteins, corresponding nucleic acids and their use
MXPA04011944A (es) Secuencias de control del gen corin humano.
KR19990022193A (ko) 델타 피62, 이의 변이체, 핵산 서열 및 용도
MXPA97007549A (en) Viral vectors and their use to treat disordershiperproliferativos, in particular resteno
US7169764B1 (en) Promoter for smooth muscle cell expression
US7541343B2 (en) Inhibiting cellular proliferation by expressing yin yang-1
AU2002308413B2 (en) Yin yang 1
KR100720201B1 (ko) 트랜스진의 신경-특이성 발현을 위한 음성 조절요소의 용도
WO1996029423A1 (en) Compositions and methods for inducing infection by retroviral vectors outside of their host range
AU2002308413A1 (en) Yin yang 1