KR19990044356A - 엠디엠2 단백질의 종양원 활성의 길항제 및 암 치료에 있어서 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 어떠한 p53 컨텍스트도 없이 특히 암치료를 위한 약학 조성물 제조를 위한 단백질 Mdm2의 종양원 활성을 적어도 부분적으로 길항할 수 있는 화합물의 이용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 단백질 Mdm2의 종양원 활성을 적어도 부분적으로 억제할 수 있는 화합물을 암호화하는 핵산서열을 포함하는 바이러스 벡터, 및 이에 상응하는 약학 조성물에 관한 것이다.
Description
대다수의 암이 하나 이상의 유전자의 과잉발현 및/또는 하나 이상의 돌연변이 또는 비정상 유전자의 발현을 일으키는 유전적 이상에 의해 적어도 부분적으로 유발된다는 것이 지금에 와서 잘 성립되었다. 예를 들면, 종양유전자의 발현은 대부분의 경우에 암을 일으킨다. 종양유전자는 유전적으로 병에 걸리고 이의 발현 산물이 세포의 정상적인 생물학적 기능을 붕괴하여 종양 상태를 개시하는 유전자를 의미하는 것으로 이해된다. 이제까지 대다수의 종양유전자가 동정되어 왔고 특히 돌연변이 형태가 세포 증식의 탈조절에 책임이 있는 것으로 보이는 ras, myc, fos, erb, neu, raf, src, fms, jun 및 abl 유전자가 부분적으로 특징 규명되었다.
정상적인 세포 컨텍스트에서, 이러한 종양유전자의 증식은 p53 및 Rb와 같은 소위 종양 억제 유전자의 생성에 의해 적어도 부분적으로 점검된다. 하지만, 특정 현상이 일어나서 세포 자기-조절의 메커니즘을 붕괴하여 종양 상태의 발생을 촉진한다. 이러한 사건 중의 하나는 종양 억제 유전자의 돌연변이에 있다. 따라서, p53 유전자의 결실 및/또는 돌연변이에 의해 변이된 형태가 대부분의 인간 암의 발생[참조문헌; Baker et al., Science 244 (1989) 217]에 수반되고 Rb 유전자의 불활성화 형태가 다양한 종양 및 특히 망막아종 또는 골육종과 같은 간충조직 암에 연루되어 왔다.
p53 단백질은 대부분의 정상적인 조직에서 발현되는 53 kD의 핵의 인단백질이다. 이것은 세포 주기의 조절 [참조문헌; Mercer et al. Critic Rev. Eucar. Gene Express, 2, 251, 1992], 전사 조절 [참조문헌; Fields et al., Sciences (1990) 249, 1046], DNA의 복제 [참조문헌; Wilcoq and Lane, (1991), Nature 349, 4290 and Bargonnetti et al., (1992) Cell 65 1083] 및 어팝토시스의 유도 [참조문헌; Shaw et al., (1992) P.N.A.S. USA 89, 4495]에 수반된다. 예를 들면, DNA를 손상시킬 수 있는 제제로의 세포의 노출은 p53 단백질의 후-전사 변형, 및 gadd45 (생장 억류 및 DNA 손상) [참조문헌; Kastan et al., Cell, 71, 587-597, 1992], p21 WAF/CIP [참조문헌; ElDeiry et al., Cancer Res., 54, 1169-1174, 1994] 또는 mdm2 (쥐 이중 미니트) [참조문헌; Barak et al., EMBO J., 12, 461-468, 1993]와 같은 다수의 유전자의 p53에 의한 전사 활성화를 일으키는 세포 시그널링의 연쇄반응을 개시한다.
전술한 문헌으로부터, 특히 이러한 세포 시그널링 경로에 수반되는 단백질 범위의 다양한 생물학적 기능, 기능발휘 양식 및 이의 특성에 대한 규명이 발암현상의 이해 및 암에 대한 효과적인 치료 방법의 개발을 위한 주요 관심사임을 명백히 입증한다.
본 발명은 Mdm2 단백질의 신규한 작용을 보고함으로써 이러한 컨텍스트의 구성내에 정확히 도달한다.
Mdm2 단백질은 mdm-2 유전자 (쥐 이중 미니트 2)로부터 발현되는 90 kD의 분자량을 갖는 인단백질이다. 이러한 mdm2 유전자는 본래 자생 종양 세포 BALB/c 3T3으로 클로닝되고 이의 과잉발현이 종양력을 매우 증가시킴이 관찰되었다 [참조문헌; Cahilly-Snyder et al., Somat. Cell. Mol. Genet., 13, 235-244, 1987; Fakharzadeh et al., EMBO J. 10, 1565-1569, 1991]. Mdm2/p53 복합체가 야생형 p53과 돌연변이 p53 단백질 모두를 함유하는 여러 세포주에서 동정되어 왔다 [참조문헌; Martinez et al., Genes Dev., 5, 151-159, 1991]. 또한, Mdm2가 근육 크레아틴 키나제의 활성과 같은 프로모터 상의 p53의 전사 활성을 억제하는 것으로 나타났으며, 이는 Mdm2가 p53의 활성을 조절할 수 있음을 나타낸다 [참조문헌; Momand et al., Cell, 69, 1237-1245, 1992; Oliner et al., Nature, 362, 857-860, 1993].
그러므로, 이러한 모든 결과에 비추어, Mdm2 단백질은 이제까지 p53의 활성의 조정자로서 본질적으로 인식되었다. 야생형 또는 돌연변이 p53 단백질을 복합시킴으로써 이의 전사 활성을 억제하고 이러한 방법으로 세포 증식의 탈조절에 기여한다. 따라서, 이러한 정보의 치료 수준에서의 개발은 주로 Mdm2에 의한 p53 단백질의 봉쇄를 방지하는 방법을 연구하는 데에 있다.
예상외로, 본 출원인은 이러한 Mdm2 단백질이 본래의 종양원 특성, 즉 p53 단백질과 복합된 형태와 연계된 것과는 완전히 별개인 특성을 지닌다고 설명하였다. 좀더 정확히 말해서, Mdm2 단백질은 제로 p53 컨텍스트에서 종양원성을 발생시킨다. 이러한 발견, 즉 Mdm-2의 종양원성이 p53과 독립적이고 특히 야생형 p53의 트랜스활성화 활성의 억제로부터 유발되지 않음을 지지하기 위해서, 트랜스활성화 성질을 보존하지만 Mdm-2와 더 이상 상호작용하지 않는 p53의 돌연변이체 [참조문헌; p53 (14-19); Lin et al., Genes Dev., 1994, 8, 1235-1246]가 Mdm-2의 종양원성을 차단할 수 없음을 나타냈다. Mdm-2 및 특히 Mdm-2의 1-134 영역이 p107의 과잉발현에 의해서 유도된 G1내 세포 주기의 중단을 차단해제할 수 있음을 나타내었다. 그러므로, Mdm-2가 p53을 제외한 세포 주기의 조절에 수반되는 인자중 중요한 조절자임이 입증된다.
본 발명은 Mdm2 단백질의 서열 번호 1로 동정된 서열의 단백질 서열 1-134가 상기 단백질의 종양원 포텐셜을 해독하기에 충분하다는 설명으로부터 부분적으로 유발된다.
또한 이것과 상호작용할 수 있는 화합물을 사용하여 Mdm2 단백질의 종양원성을 변경시키는 것이 가능하다는 설명으로부터 유발된다. 본 발명은 또한 이러한 화합물을 직접적으로 종양으로 생체내 전달하고 이에 따라 암 발생의 통제를 허용하는 특히 효율적인 시스템을 기재한다. 이렇게하여 본 발명은 하기의 암과 같은, 특히 제로 p53 컨텍스트를 사용하여 종양의 치료에 특히 유효한 신규한 접근법을 제공한다: 대장 선암, 갑상선암, 폐 육종, 골수성 백혈병, 결장직장암, 유방암, 폐암, 위암, 식도암, B 림프종, 난소암, 방광암, 신경교아세포종 등.
그러므로, 본 발명의 제 1 요지는 제로 p53 컨텍스트를 사용하여 암을 치료하고자 하는 약학 조성물의 제조를 위해 Mdm2 단백질의 종양원 활성을 적어도 부분적으로 길항시킬 수 있는 화합물의 용도에 있다.
본 발명의 목적상, 제로 p53 컨텍스트를 사용하는 암은 p53이 p53 상 Mdm-2의 부착(이러한 부착은 p53이 종양 억제자로서 작용하는 것을 방지하고 세포가 p53에 의해 조절된 생장으로부터 탈출하도록 함)과 다른 변형 또는 메커니즘을 통하여 종양 억제 유전자 기능을 발휘할 수 없다고 생각되는 암을 의미하는 것으로 이해된다. p53의 종양 억제자 활성을 차단하는 변형 또는 메커니즘, 예를 들면 p53 유전자의 유전적 변경(점 돌연변이, 결실 등), Mdm-2가 아닌 단백질과의 상호작용, HPV-16 및 HPV-18과 같은 고-위험 인간 파필로마바이러스의 E6 단백질의 존재에 연관된 p53 단백질의 매우 신속한 단백질분해성 분해 등 중에서 철저히 언급할 수 있다.
본 발명의 목적상, Mdm2 단백질의 종양원 활성의 억제는 두 방법에 따라서 달성될 수 있다.
바람직하게는 이의 1-134 영역 수준에서 직접적으로 작용함으로써 달성된다. 따라서, 이러한 영역에 결합할 수 있는 단백질은 Mdm2의 종양원성에 대해 길항적 역할을 할 것이다.
그러나, 이러한 억제 효과는 또한 예를 들면, 서열 번호 1에 나타나는 mdm2의 135-491 영역 또는 서열 번호 1에 나타나는 C-말단 서열과 같은 이웃 영역과 화합물의 상호작용에 의해서 달성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 이러한 영역과 직접적으로 상호작용하지는 않지만 그럼에도 불구하고 이의 종양원 특성에 영향을 미칠 수 있는 화합물의 용도에 관한 것이다.
특정 양식에 따라서, 본 발명은 제로 p53 컨텍스트를 사용하여 암을 치료하고자 하는 약학 조성물을 제조하기 위해서 Mdm2 단백질의 서열 번호 1에 나타나는 1-134 영역의 수준에서 결합할 수 있는 화합물의 사용에 관한 것이다.
Mdm2 단백질의 1-134 영역의 수준에서 직접적으로 상호작용할 수 있는 화합물로서 이러한 영역에 대한 특이적 scFV를 언급할 수 있다.
ScFV는 세포내 활성인 항체의 결합성에 비할만한 결합성을 갖는 분자이다. 이들은 좀더 특별하게 항체 중쇄의 가변 영역의 결합 부위에 상응하는 펩타이드에 펩타이드 링커에 의해 결합된 항체 경쇄의 가변 영역의 결합 부위에 상응하는 펩타이드로 이루어진 분자이다. 이러한 ScFV가 유전자 전달에 의해 생체내에서 생성될 수있다는 것이 본 출원인에 의해 입증되었다 (출원 WO 94/29446 참조).
이들은 또한 Mdm2의 1-134 영역, 예를 들면 서열 번호 1을 갖는 p53 단백질의 결합 영역의 모두 또는 일부, 및 좀더 상세하게 말해서, 서열 번호 2 [참조문헌; Oliner et al., Nature, 1993, 362, 857-860]에 나타난 p53 서열의 펩타이드 1-52, 1-41 및 6-41 중 하나의 모두 또는 일부, 또는 좀더 간단하게 말해서, 좀더 정확히 [참조문헌; Lane et al., Phil. Trans. R. Soc. London B., 1995, 347, 83-87] 맵핑된 펩타이드 16-25, 또는 인간 또는 쥐 p53의 펩타이드 18-23 또는 Mdm-2와의 상호작용에 중요한 잔기가 보존되었을 [참조문헌; Picksley et al., Oncogene, 1994, 9, 2523-2529] 상술된 것과 근접한 유도된 펩타이드의 모두 또는 일부와 특이적으로 결합하는 능력에 대해 이미 공지되어 있는 펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
또한 본 발명에 따라서 서열 번호 1에 나타나는 Mdm2의 1-134 영역에 근접한 영역에 결합하고 이 결합에 의해서 Mdm2 단백질의 종양원 활성에 영향을 미치는 화합물을 사용할 수 있다. 이러한 효능에서, 예를 들면, 전사 인자 TFII, TBP 및 TaF250과 같은 단백질의 C-말단 영역의 수준에서 상호작용하는 것들, 및 예를 들면, 단백질 L5 (리보솜 단백질) 및 Rb (망막아종 단백질) 및 전사 인자 E2F (Rb에 의해 조절됨)과 같이 서열 번호 1에 나타나는 Mdm2의 135-491 영역의 수준에서 상호작용하는 단백질을 언급할 수 있다.
본 발명의 다른 요지는 또한 암을 치료하고자 하는 약학 조성물을 제조하기 위해서 Mdm2 단백질의 서열 번호 1에 나타나는 서열의 1-134 영역에 대해 특이적인 scFV의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 목적상, 상술된 모든 상호작용이 Mdm2 종양원 특성에 실질적으로 영향을 미치는 것으로 이해된다. 또한, 이러한 단백질은 Mdm2 단백질과의 결합을 위한 영역 중 하나에 관하여 활성이고 이러한 상호작용이 후자의 종양원 특성이 영향을 받도록 유도하는 이들의 부분이 사용되는 한 전체로 또는 부분적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 구성내에서, 이러한 화합물은 그 자체로 또는 유리하게는 생체내 발현을 허용하는 유전자 작제의 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 유리한 특정 양태는 제로 p53를 사용하여 암을 치료하고자 하는 약학 조성물의 제조를 위해 Mdm2 단백질의 종양원 활성을 적어도 부분적으로 길항시킬 수 있는 화합물을 암호화하는 핵산 서열을 사용함에 있다.
이러한 전체적인 견해로, 본 발명의 구성내에 사용된 핵산은 다양한 유형일 수 있다. 이들은 바람직하게는:
- 안티센스 핵산,
- Mdm2 단백질의 영역 중 하나에 직접 결합하고 이의 종양원 활성(리간드 올리고뉴클레오타이드)을 억제할 수 있는 올리고뉴클레오타이드,
- Mdm2 단백질의 영역 중 하나와 올리고머화하고 이의 종양원 활성을 억제할 수 있는 펩타이드 또는 단백질을 완전히 또는 부분적으로 암호화하는 핵산,
- Mdm2 단백질의 서열 번호 1의 1-134 영역에 대한 세포내 항체(예를 들면, 항체로부터 유도된 단일-쇄 가변 단편)를 암호화하는 핵산.
본 발명의 특정 양태에 있어서, 핵산은 안티센스 핵산이다. 이러한 안티센스는 Mdm2 단백질을 암호화하는 핵산에 상보적이고 이의 전사 및/또는 해독(안티센스 RNA) 또는 리보자임을 차단할 수 있는 RNA를 암호화하는 DNA이다.
좀더 최근에 와서는, 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 핵산의 신규한 유형이 검출되었다. 이러한 핵산은 세포 mRNA와는 하이브리드화하지 않지만 이본쇄 게놈 DNA와는 하이브리드화한다. 이러한 신규 접근법은 일부 핵산이 DNA 이중 나선의 커다란 그루브에서 특이적으로 상호작용하여 국부적으로 삼중 나선을 형성하고 표적 유전자 전사의 억제를 유발할 수 있다. 이러한 핵산은 올리고퓨린.올리고피리미딘 서열의 수준에서, 즉, 한 본쇄상의 올리고퓨린 서열과 상보적인 본쇄상의 올리고피리미딘 서열을 소유하는 영역의 수준에서 DNA 이중 나선을 선택적으로 인식하고 국부적으로 삼중 나선을 형성한다. 제 3 본쇄(올리고뉴클레오타이드)의 염기는 왓슨-크릭 염기쌍의 퓨린과의 수소 결합(Hoogsteen 또는 역 Hoogsteen 결합)을 형성한다. 이러한 핵산이 특히 문헌[참조; Prof. Helene in Anti-Cancer drug design 6 (1991) 569]에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 안티센스 핵산은 안티센스 RNA 또는 리보자임을 암호화하는 DNA 서열일 수 있다. 이렇게하여 생성된 안티센스 RNA는 mRNA 또는 표적 게놈 DNA와 상호작용하고 후자와는 이중 또는 삼중 나선을 형성할 수 있다. 이것은 또한 임의로 화학적으로 변형된, 유전자 또는 표적 RNA와 직접 상호작용할 수 있는 안티센스 서열 (올리고뉴클레오타이드)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에 따라서, 핵산은 상기에 정의된, 임의로 화학적으로 변형된 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 이것은 특히 포스포디에스테르 골격이 예를 들면, 특허원 WO 94/08003에 기재된 올리고뉴클레오타이드 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트 및 포스포로티오에이트와 같이 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 이것은 또한 아크릴화 화합물과 같은 제제와 결합된 α-올리고뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명의 목적상, 리간드 올리고뉴클레오타이드는 종양원 작용을 억제하기 위해서 Mdm-2 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고리보뉴클레오타이드 또는 올리고디옥시리보뉴클레오타이드를 의미하는 것으로 이해된다. 이러한 뉴클레오타이드는 예를 들면, SELEX 기술 [참조문헌; Edgingston, Bio/technology, 1992, 10, 137-140; patents US 5,270,163 and WO 91/19813]과 같은 "생체내 전개"에 의해 검출할 수 있다.
좀더 일반적으로, 이러한 핵산은 인간, 동물, 식물, 박테리아, 바이러스 또는 합성 등의 기원일 수 있다. 이들은 당해분야의 전문가들에게 공지된 기술에 의해, 특히 라이브러리를 스크리닝함으로써, 화학적 합성에 의해, 또는 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득된 서열의 화학적 또는 효소적 변형을 포함하는 혼합된 방법에 의해서 수득할 수 있다.
후에 지적하듯이, 이들은 또한, 플라스미드, 바이러스, 또는 화학적 벡터와 같은 벡터로 삽입될 수 있다. 이들은 또한 출원 WO 90/11092에서 기술된 기술에 따른 네이키드 DNA 형태, 또는 예를 들면, DEAE-덱스트란 [참조문헌: Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891], 핵 단백질[참조문헌: Kaneda et al., Science 243 (1989) 375], 및 리포솜 형태 [참조문헌: Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431]의 지질 또는 양이온 중합체 [참조문헌: Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413]와의 복합체 형태 등으로 주입될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 구조 내에 사용된 서열이 벡터의 일부를 형성한다. 실제로 이러한 벡터의 사용은 처리될 세포로 핵산의 주입을 증진시키고, 세포 내의 안정성을 증가시킬 수 있어, 지속적인 치료 효과를 수득 가능하게 해 준다. 또한, 동일한 벡터로 몇몇 핵산 서열을 도입할 수 있어, 치료의 효율을 증가시킨다.
동물 세포, 바람직하게는 인간 종양 세포를 형질전환시킬 수 있는 한, 사용된 벡터에는 여러 기원이 존재할 것이다. 본 발명의 바람직한 양태는, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 아데노-수반 바이러스(AAVs) 또는 허프스바이러스로부터 선택 가능한 바이러스 벡터가 사용된다.
이 점에서, 본 발명의 요지는 게놈 속으로 삽입되어, Mdm2 단백질의 종양 특성을 적어도 부분적으로 길항시킬 수 있는 화합물을 암호화하는 핵산을 포함하고 있는 임의의 바이러스 벡터이다.
좀더 상세히 말해서, 종양 포텐셜에 영향을 미치는 Mdm2 단백질과 결합가능한 화합물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고 있는 임의의 재조합 바이러스에 관한 것이다. 본 문맥에서, 핵산 서열은 상기 동정된 펩타이드, 단백질 또는 전사 인자 중 하나를 암호화한다.
좀더 바람직하게는, 이 핵산 서열은 Mdm2 단백질의 1-134 영역 (서열 번호1)의 수준에서 상호작용 가능한 scFv 또는 펩타이드를 암호화한다.
유리하게는, 본 발명의 구조 내에 이용된 바이러스는 결손형이 바람직한데, 이는 다시 말해 바이러스가 감염 세포에서 자가 복제할 수 없음을 의미한다. 일반적으로는, 본 발명의 구조내에서 이용된 결손 바이러스의 게놈 중 감염 세포 내의 바이러스 복제를 위해 필요한 최소한의 서열이 결여된다. 이 부분은 제거(전체적으로 또는 부분적으로)되거나, 작용능력이 없어지거나 또는 다른 서열, 특히 Mdm2 단백질의 종양원 특성에 길항 능력을 가진 화합물을 암호화하는 서열에 의해 치환된다. 바람직하게, 결손 바이러스는 그럼에도 불구하고 바이러스 입자의 캡시드화에 필요한 게놈의 서열을 보존하고 있다.
아데노바이러스를 좀더 상세히 고려하면, 구조 및 특성에 있어 약간의 차이가 있는 여러 혈청형이 특징이다. 이러한 혈청형 중에서, 본 발명의 구조 내에는 유형 2 또는 5 인간 아데노바이러스(Ad 2 또는 Ad5) 또는 동물 기원 (출원 FR 93 05954를 보라)의 아데노바이러스의 사용이 바람직하다. 본 발명의 구조 내에서 사용될 수 있는 동물 기원 아데노바이러스 중에는, 개, 소, 쥐 (예: MAV1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), 양, 돼지, 조류 또는 원숭이 (예:SAV) 기원의 아데노바이러스가 언급될 수 있다. 바람직하게, 동물 기원의 아데노바이러스는 개 아데노바이러스, 좀더 바람직하게는 CAV2 아데노바이러스이다[예를 들면, 맨해턴 종 또는 A26/61 (ATCC VR-800)]. 바람직하게는, 인간 또는 개 또는 혼합 기원의 아데노바이러스가 본 발명의 구조 내에 이용된다.
바람직하게, 본 발명의 결손 아데노바이러스는 ITR, 캡시드 시키는 서열 및 캘파인의 조정자를 암호화하는 서열을 포함한다. 좀더 바람직하게는, 본 발명의 아데노바이러스 게놈에서, E1 유전자 및 E2, E4, L1-L5 유전자 중 적어도 하나는 작용성이 없다. 고려된 바이러스 유전자는 당해 분야의 숙련인에게 공지된 임의 기술, 특히 유전자 또는 고려된 유전자에서 하나 이상의 염기의 전체적인 제거, 치환, 부분적인 결실 또는 첨가에 의해 비작용화될 수 있다. 이러한 변형은 시험관 내(분리된 DNA상) 또는 정상소재에서, 예를 들면, 유전자 공학 기술에 의해, 또는 대신으로 돌연변이 제에 의한 처리에 의해 수득될 수 있다.
본 발명에 따른 결손 재조합 아데노바이러스는 당해 분야의 숙련인에게 공지된 임의 기술[참조문헌: Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917]에 의해 제조될 수 있다. 특히, 이들은 아데노바이러스 및 플라스미드, 이 중에서도 ETS 억제제를 암호화하는 DNA 서열을 운반하는 플라스미드 사이에서 상동 재조합에 의해 제조될 수 있다. 이 상동 재조합은 아데노바이러스 및 플라스미드를 적당한 세포 주로 공-형질감염시킨 후에 일어난다. 사용되는 세포 주는 바람직하게는 (i)상기 요소에 의해 형질전환이 가능해야하고, (ii)결손 아데노바이러스 게놈 부분을 보충할 수 있는 서열, 바람직하게는 재조합의 위험을 피하기 위해 통합된 형태를 함유해야 한다. 세포주의 예로는, 특히 게놈 속에 통합된, Ad5 아데노바이러스 게놈의 좌측 부위(12%)를 함유하고 있는 인간 배 신장 주 293 [참조문헌: Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59]이 언급될 수 있다. 또한 아데노바이러스로부터 유도된 벡터의 작제를 위한 방법은 출원 Nos. FR 93 05954 및 FR 93 08596에서 기술하고 있다.
다음, 증배된 아데노바이러스를 회수하고 실시예에서 기술한 바와 같이, 종래의 분자 생물학 기술에 따라 정제한다.
아데노-수반 바이러스 (AAV)의 경우, 이들이 안정하고 부위-특이적인 방법으로 감염하는 세포의 게놈 속으로 통합하는 것은 상대적으로 작은 DNA 바이러스이다. 이들은 세포의 생장, 형태 또는 분화에 어떠한 영향을 미침이 없이, 광범위한 세포를 감염시킬 수 있다. 또한, 이들은 인간의 병리와도 관련이 없는 것 같다. AAV의 게놈은 클로닝되고, 서열분석되었으며 특징지워져 있다. 이는 약 4700 염기를 포함하고 있고, 각각의 말단에는 약 145 염기의 역 반복 부위 (ITR)를 함유하고 있는데, 이는 바이러스의 복제 기원으로 제공된다. 게놈의 잔여 부위는 캡시드화 기능을 운반하는 2개의 필수 부위로 나누어 진다: 바이러스 복제 및 바이러스 유전자의 발현과 관련된 rep 유전자를 함유한, 게놈의 좌측 부위; 및 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 cap 유전자를 함유한, 게놈의 우측 부위.
시험관 내 및 생체 내에서 유전자의 전달을 위한 AAV-유도 벡터의 사용은 문헌(특히 WO 91/18088; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488, 528을 보라)에 기술되어 있다. 이들 출원은 rep 및/또는 cap 유전자가 결실되고 관심있는 유전자에 의해 치환된 다양한 AAV-유도 작제물, 및 시험관 내 (배양 중 세포 상에서) 또는 생체 내에서(유기체에 직접적으로) 관심있는 유전자의 전달을 위한 이들의 사용을 기술하고 있다. 본 발명에 따른 결손 재조합 AAV는 인간 보조 바이러스(예를 들면 아데노바이러스)에 의해 감염된 세포 주, 두개의 AAV 역 반복 부위(ITR)에 의해 경계지어지는 ETS 억제제를 암호화하는 서열을 함유한 플라스미드, 및 AAV 캡시드 유전자(rep 및 cap 유전자)를 운반하는 플라스미드 속으로 공-형질감염시켜 제조될 수 있다. 그리고 나서 생성된 재조합 AAV를 종래의 기술로 정제한다.
허프스바이러스 및 레트로바이러스에 관해서는, 문헌에서 재조합 벡터의 작제를 광범위하게 기술하고 있다: 특히 Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP 178220, Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689. 등을 보라. 특히, 레트로바이러스는 분열 세포를 선택적으로 감염시키는 통합 바이러스이다. 따라서 이들은 암 적용을 위해 관심있는 벡터를 구성한다. 레트로바이러스 게놈은 두개의 LTRs, 캡시드 서열 및 세개의 해독 부위 (gag, pol 및 env)를 필수적으로 포함한다. 레트로바이러스로부터 유도된 재조합 벡터에서, 일반적으로 gag, pol 및 env는 완전히 또는 부분적으로 결실되고, 관심있는 이질 핵산 서열에 의해 치환된다. 이 벡터는 특히 MoMuLV ("쥐 몰로니 백혈병 바이러스", MoMLV라고도 함), MSV ("쥐 몰로니 육종 바이러스"), HaSV ("하비 육종 바이러스"); SNV("비장 괴사 바이러스"); RSV (라우스 육종 바이러스) 또는 프렌드 바이러스와 같은 다양한 유형의 레트로바이러스로부터 제조될 수 있다.
관심있는 서열을 포함하는 재조합 레트로바이러스를 작제하기 위해, 일반적으로는 특히 LTRs, 캡시드 서열 및 해당 서열을 포함하는 플라스미드를 작제한 다음 플라스미드에서 결여된 레트로바이러스 기능을 트랜스로 제공할 수 있는 소위 캡시드화 세포주를 형질감염시키기 위해 사용한다. 일반적으로, 캡시드화 주는 gag, pol 및 env 유전자를 발현시킬 수 있다. 이러한 캡시드화 주는 종래 기술분야에서, 특히 PA317 주 (US 4,861,719); PsiCRIP 주 (WO 90/12806) 및 GP+envAm-12 주 (WO 89/07150)에 관해 기술되어 있다. 또한, 재조합 레트로바이러스는 전사 활성을 억제하기 위해 LTRs내에 개질물, 및 gag 유전자의 일부를 포함하는, 연장된 캡시드 서열[참조문헌: Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1636]을 함유한다. 생성된 재조합 레트로바이러스는 종래 기술에 의해 정제된다.
유리하게는, 본 발명의 벡터내에, Mdm2의 종양원 특성에 길항적인 성질을 가진 화합물을 암호화하는 서열이 종양 세포내에서 발현되도록 하는 시그널의 통제하에 놓여진다. 바람직하게는, 이들은 이종 발현 시그널, 즉 원래 억제제의 발현에 책임이 있는 것과는 다른 시그널이다. 이들은 다른 단백질의 발현을 위해 책임이 있는 특정 서열, 또는 합성 서열일 수 있다. 특히, 진핵 생물 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열일 수 있다. 예를 들면, 이들은 감염시키고자 하는 세포 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 또한, 사용된 바이러스를 포함하여, 바이러스 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 이 점에서, 예를 들면, E1A, MLP, CMV, RSV-LTR 프로모터 등이 언급될 수 있다. 또한, 이들 발현 서열은 활성 또는 조절 서열 또는 조직-특이적 발현을 허락하는 서열의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 실제로는, DNA를 발현시키고 바이러스가 종양 세포를 효과적으로 감염시키는 경우에만 효과적인 종양 세포에서 특이적이거나 압도적으로 활성적인 발현 시그널을 사용하는 것이 특히 유리하다.
특정 양태에서, 본 발명은 바이러스 프로모터의 통제하에서(특히 RSV-LTR 및 CMV 프로모터로부터 선택), Mdm2의 종양원 특성에 길항적인 성질을 소유한 화합물을 암호화하는 cDNA 서열을 포함하는 결손 재조합 바이러스에 관한 것이다.
여전히 바람직한 양태에서, 본 발명은 종양 세포에서 압도적인 발현을 허락하는 프로모터의 통제하에 Mdm2의 종양원 특성에 길항적인 성질을 소유하는 화합물을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 결여 재조합 바이러스에 관한 것이다.
심지어 잔여 발현이 다른 유형의 세포에서 관찰될지라도, 발현 수준이 종양 세포에서 높은 경우 본 발명을 위해 발현은 압도적인 것으로 간주된다.
본 발명은 또한 일반적으로 암 치료를 위해 의도된 약학 조성물의 제조를 위한 서열 번호 1으로 표현되는 Mdm2 단백질 서열의 1-134 영역에 대한 세포내 항체또는 대신으로 scFV를 암호화하는 핵산 서열의 사용에까지 확장된다.
이는 또한 Mdm2 단백질의 종양 활성을 저해할 수 있는 화합물을 포함한 임의의 약제 조성물, 또는 이러한 화합물을 암호화하는 핵산 서열과 관련이 있다. 본 발명의 특정 양태에 따르면, 이 조성물은 앞서 기술된 하나 이상의 결여 재조합 바이러스를 포함한다. 이러한 약제 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내 또는 경피 투여 등을 위해 제형될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약제 조성물은 주입가능한 제형, 특히 환자의 종양으로 직접적인 주입을 위해 약학적으로 수용가능한 비히클을 함유한다. 이는 특정 등장 살균 용액 또는 건조, 특히 동결-건조된 조성물로써, 경우에 따라서는 주입가능한 용액의 제조를 위해 멸균수 또는 생리 식염수가 첨가될 수 있다. 환자의 종양으로의 직접적인 주입은 환부의 수준에 따라 치료의 효과를 집중시킬 수 있기 때문에 유리하다.
주입을 위해 사용된 결여 재조합 바이러스의 투여량은 다양한 파라미터, 특히 바이러스 벡터, 사용된 주입 양태, 관련 병리 또는 치료의 원하는 지속 기간에 따라 조절될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스를 제형하고 104내지 1014pfu/ml, 바람직하게는 106내지 1010pfu/ml의 투여량의 형태로 주입한다. 용어 pfu ("플라크 형성 단위")는 바이러스 용액의 감염도에 대응되고 적당한 세포 배양조직을 감염시켜, 일반적으로는 48시간 후에, 감염된 세포의 플라크 수를 헤아려 결정된다. 바이러스 용액의 pfu 역가를 측정하는 기술은 확실한 문헌에 입각하고 있다. 레트로바이러스와 관련해서, 본 발명에 따른 조성물은 이식을 위해, 생성 세포를 직접적으로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약제 조성물은 Mdm2 단백질의 종양 활성을 중화시켜 결과적으로 어떤 세포 형태의 증식을 조절하는데 특히 유리하다.
특히, 이 약제 조성물은 예를 들면 하기 종양과 같은 제로 p53을 소유하고 있는 종양의 치료를 위해 적당하다: 갑상선암, 폐암, 골수성 백혈병, 결장직장암, 유방암, 위암, 식도암, B 림프종, 난소암, 방광암, 신경교아세포종 등.
본 발명은 과증식(즉, 비정상적인 증식을 함)을 하는 세포의 파괴를 위해 생체내에서 유리하게 이용된다. 이리하여 종양 세포 또는 도관 벽(재협착)의 평활 근 세포의 파괴에 적용할 수 있다.
본 발명의 다른 이점은 하기의 실시예 및 도면을 숙독해 봄으로써 잘 나타나 있을 것이며, 이는 본 발명을 예시하는 것으로써 본 발명을 제한하지 않는 것으로 간주 되어야한다.
본 발명은 과증식 병리(암, 재협착증 등)의 치료 방법 및 상응하는 약학 조성물에 관한 것이다.
도 1: Mdm-2 단백질을 A 내지 F로 표현한 도.
도 2: 다양한 Mdm-2 단백질을 발현시키는 플라스미드에 의한 Saos-2 세포의 형질감염 그래프도.
도 3: 다양한 p53에 의한 Mdm2의 형질전환 특성 저해의 개략도.
도 4: 세포 주기에 미치는 Mdm2의 과발현의 효과도.
도 5: 세포 주기에 미치는 Mdm2의 과발현의 효과도.
일반적인 분자 생물학 기술
플라스미드 DNA의 예비 추출, 칼슘 클로라이드 구비에서 플라스미드 DNA의 원심분리, 아가로스 또는 아크릴아미드 겔 전기영동, 전기용리에 의한 DNA 단편의 정제, 단백질의 페놀 또는 페놀-클로로포름 추출, 에탄올 또는 이소프로판올에 의한 염수 매질에서 DNA의 침전, 이. 콜라이에서의 형질전환 등과 같은 분자 생물학에서 통상적으로 이용된 방법은 당해 분야의 숙련인에게 익히 공지되어 있으며 문헌[참조: Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al.(eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]에서 풍부하게 기술되어 있다.
연결을 위해, DNA 단편을 아가로스 또는 아크릴아미드겔 전기영동에 따라 분리하여, 페놀 또는 페놀/클로로포름 혼합물로 추출하고, 에탄올로 침전시킨 다음 공급업자의 권장에 따라 T4 파지 DNA 리가제 (Biolabs)의 존재하에서 배양할 수 있다.
돌출 5′ 말단의 충진은 공급업자의 명세에 따라 이. 콜라이의 DNA 폴리머라제의 클레나우 단편에 의하여 수행될 수 있다. 돌출 3′ 말단의 파괴는 제조업자의 권장에 따라 사용된 T4 파지 DNA 폴리머라제(Biolabs)의 존재하에 수행된다. 돌출 5′말단의 파괴는 S1 뉴클레아제로 조절된 처리를 함으로써 수행된다.
합성 올리고데옥시뉴클레오타이드에 의한 시험관내 돌연변이생성은 Amersham에 의하여 배급된 키트를 사용하여 Taylor 등에 의하여 개발된 방법[참조문헌: Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764]에 따라 수행될 수 있다.
소위 PCR 기술[폴리머라제-촉매 연쇄반응, Sasaki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K. B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155(1987)
335-350]에 의한 DNA 단편의 효소증폭은 제조업자의 명세에 따라 "DNA 열 사이클러"(Perkin Elmer Cetus)를 사용하여 수행될 수 있다. 게놈 DNA의 증폭은 특히 하기조건하에서 수행할 수 있다: 적당한 탐침을 사용하여 100℃에서 5분, 95℃에서 1분, 58℃에서 2분 및 이어서 72℃에서 3분간의 30 사이클. 증폭산물을 겔 전기영동으로 분석한다.
뉴클레오타이드 서열의 증명은 Amersham 배급 키트를 사용하여 Sanger 등[참조문헌: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467]에 의하여 개발된 방법에 의하여 수행될 수 있다.
재료 및 방법
1. 사용된 작제물:
- 플라스미드 pBKCMV는 Stratagene에서 판매하고 있으며 네오마이신 내성 유전자를 함유하고 있다.
- 각각 야생형 p53 및 p53 R273H를 암호화하는 플라스미드 pC53C1N3 및 p53-4.2. N3는 A. Levine[참조문헌: Hinds et al., Cell Growth and Diff.. (1990), 1, 571]에 기재되어 있다.
- 플라스미드 pBKp53 (R273H)는 인간 p53 미니유전자를 함유한다. 이는 pC53-4.2 N3으로부터 수득된다.
- 플라스미드 pBKMdm2는 mdm2 암호화 서열이 뒤따르는 β-글로빈 암호화 서열의 말단의 비해독 영역으로 이루어진 암호화 카세트를 pBKCMV 중으로 클로닝함으로써 수득된다.
- 플라스미드 pGKhygro는 하이그로마이신 내성 유전자[참조문헌: Nature (1990) 348, 649-651)]를 발현한다.
- 네오마이신 내성 유전자의 발현을 허용하는 플라스미드 pCMVNeoBam[참조문헌: Hinds et al., (1990) Cell. Growth and Diff., 1, 571-580].
- 단백질 p107의 발현 및 표면 마커 CD20의 발현을 허용하는 플라스미드 pCMVp107 및 pCMVCD20[참조문헌:Zhu et al., (1993) Genes and Development, 7 1111-1125].
- 단백질 E2F-4 및 E2F-5의 발현을 허용하는 플라스미드 pCMVE2F 및 pCMVE2F-5[참조문헌: Sardet et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sc., 92, 2403-2407].
- 유리상태로 있거나 p53(6-41) 또는 p53(16-25)와 동위상으로 융합되어 있는 LexA의 DNA에의 결합을 위한 영역(aa 1-87)의 발현을 허용하는 플라스미드 pLexA, pLexA(6-41), pLexA(16-25). pLexA(6-41) 및 pLexA(16-25)는 LGME에서 작제된 플라스미드 pLexApolyII(Strasbourg)로부터 수득된다.
- p107: p107(385-1068), p107(1-781) 및 p107(781-1068)[참조문헌: Zhu et al., EMBO J. 14 (1995) 1904]의 진핵세포 발현을 위한 플라스미드.
- 플라스미드 pSGK1HAp107은 p107의 시험관내 및 생체내 발현을 허용한다. p107은 코작 서열의 컨텍스트에 있으며 HP 에피토프는 p107의 C 말단에서 융합으로 발현된다.
- 플라스미드 pBC-MDM2 및 pBC-MDM2(1-134)는 MDM2 및 MDM2(1-134)를 pBC 중으로 클로닝함으로써 수득된다[참조문헌: Chatton et al., Biotechniques 18 (1995) 142].
- 플라스미드 pGex-MDM2 및 pGex-MDM2(1-177)는 MDM2 및 MDM2(1-177)를 pGex 중으로 클로닝함으로써 수득된다.
2. 방법
p53의 발현은 모노클로날 항체 D01의 보조로 전 세포 추출물상에 웨스턴 블로팅함으로써 측정된다.
Mdm2 단백질을 암호화하는 mRNA의 발현은 반정량식 RT-PCR로 측정한다.
DNA의 오염 부재는 PCR로 체크한다.
실시예 1: mdm2의 형질전환성의 증명
Saos-2 세포를 플라스미드 pBKMDM2, 대조군 플라스미드 pBKp53 (R273H) 또는 음성 p53 대조군 플라스미드 pBKCMV로 형질감염시키고, 이어서 제네티신 418(G418) 내성에 대하여 선별해낸다.
제 1 분석에서, 클론을 개별적으로 선발하여 전파하며 반면에 다른 2 분석에서는 분리되지 않은 클론을 연질 한천배지에서 배양한다.
이를 위해서, 104세포를 0.375% 연질한천에 이중으로 접종한다. 24 시간 후, 50 세포 이상인 콜로니의 총수 및 콜로니에 의한 세포수(콜로니 크기)를 측정한다. 주어진 각각의 값은 이중으로 수행된 4 실험의 평균에 해당한다. 수득된 결과는 표 1에 나타내었다. mdm2에 상응하는 분석 1에서의 클론은 M1 내지 M6로 동정되고, p53-1 내지 p53-6하에 p53 (R273H)에 대한 것들 및 Co1 내지 Co5하의 대조군에 대한 것들.
예상대로 Co1 및 Co4는 형질감염된 mdm2를, Co1-3은 p53 단백질을 발현하지 않는다.
| 연질한천배지상에서의 생장, 콜로니(크기) | 발현 | ||||
| MDM2 | P53 | ||||
| 실험 1(분리된 클론) | MDM2 | M1M2M3M4M5M6 | 634(100-600)594(100-600)460(100-600)310(50-500)57(50-200)23(50) | +++++++/-+ | NDNDNDNDNDND |
| 대조군 | Co1Co2Co3Co4Co5 | 97(500-200)68(50-200)35(50-100)11(50)4(50) | -NDND-ND | ---NDND | |
| p53R(273)H | p53-1p53-2p53-3p53-4p53-5p53-6 | 190(50-600)137(50-300)88(50-200)53(50-200)47(50-200)38(50-100) | NDNDNDNDNDND | ++++++++++++++++ | |
| MDM2 | M-P1 | 395(100-1000) | ++ | ND | |
| 실험 2 | 대조군 | Co-p1Co-P2 | 21(50-200)18(50-200) | NDND | NDND |
| MDM2 | M-P1M-P2 | 255(50-300)220(50-300) | NDND | NDND | |
| 실험 3 | 대조군 | Co-P1CO-P2Co-P3Co-P4 | 110(50-200)110(50-200)100(50-200)75(50-200) | NDNDNDND | NDNDNDND |
실시예 2: 연질한천에서 Saos-2 세포의 성장 자극에 필수적이고 충분한Mdm-2(1-134) 서열번호 1의 N 말단 영역
Saos-2 세포는 도 1에 기술된 A 내지 F에서 neo 내성 및 mdm-2 단백질 모두를 발현하는 플라스미드 pBKCMV, 또는 엠프티 대조군 플라스미드 pBKCMV로 형질감염시키고 이어서 G418 내성에 대하여 선별해낸다. 생존 세포를 합하여 증폭시킨 다음 연질한천에서의 콜로니 형성에 대하여 시험한다. 도 2의 결과는 전체 mdm-2(A)으로 한 것에 대한 연질한천에 형성된 콜로니의 수로 표현하였다. 이러한 결과는 상이한 세포의 3 내지 7 푸울이 작제물에 따라 시험된 형질감염을 대표하는 두 독립실험으로부터 수득된다. 이들은 mdm-2의 N 말단 영역이 종양원 특성을 지니고 있음을 명확히 보여준다. 가장 효과적인 작제물은 전체 단백질에 상응한다.
실시예 3: 야생형 p53, p53의 돌연변이체 및 p53의 단편에 의한 Mdm-2의 종양원성의 역전
Mdm-2로 형질전환된 Saos-2 세포의 뱃치를 플라스미드 pGKhygro 및 pC53C1N3 (p53) pC53-4.2N3 p53(R273H, p53 (1-52), pLexA(6-41), pLexA(16-25), pLexA, p53(L14Q,F19S), p53(L22Q,W23S), 또는 pCMVNeoBam으로 공형질감염시키고, 이어서 G418의 존재하 하이그로마이신 내성에 대하여 선별해낸다. 내성 세포의 3 내지 5 독립 푸울로부터 100,000 세포를 연질한천(0.375%)에 이중으로 접종한다. 배양 25일 후, 적어도 50 세포를 함유하는 콜로니가 대표적인 실험 결과를 제시하며 Mdm-2의 형질전환 성질 억제 시험된 각종 p53의 도식적인 대표를 부여한다. 이러한 실험으로부터 mdm-2 단백질에 결합할 수 있는 단백질의 발현을 허용하는 작제물, 이 경우에는 p53, p53 R273H, p53(1-52), LexA(6-41), LexA(16-25)만이 Mdm-2의 종양원성을 억제하는 것으로 나타났다. 한편, mdm-2와의 결합능을 상실한 것으로 나타난 이중 돌연변이체[참조문헌: Lin et al., Gene dev., 1994, 8, 1235-1246]는 억제효과를 보유하지 않고있다. 야생형 p53의 트랜스활성화 특성을 보전한 돌연변이체 p53(14-19)가 Mdm-2에 의한 트랜스활성화를 억제하지 않는다는 사실은 Mdm-2의 종양원성이 p53의 트랜스활성화 성질의 Mdm-2에 의한 억제와 무관함을 확인시켜 준다.
실시예 4: Saos-2 세포에서 p107에 의하여 유도된 세포주기의 G1기의 차단을 억제하는 Mdm-2
Saos-2 세포를 세 유형의 플라스미드, 즉 (i)CD-20 발현용 플라스미드(pCMVCD20, 2μg, 세포 표면마커 CD-20 암호화), (ii) 암호화 서열이 없거나 Mdm-2 (PBKCMVMdm2), Mdm-2의 1-134 영역(PBKCMVMdm2(1-134)), E2F-4 또는 E2F-5 (pCMVE2F-4, pCMVE2F-5)를 암호화하지 않는 CMV형 발현 플라스미드 (9 μg(사이토메갈로바이러스 프로모터), 및 (iii) p107 발현용 벡터(pCMVp107, 9μg). 이어서, 세포를 문헌[참조: Zhu et al., Gene Dev., 1993, 7, 1111-1125]에 기술된 바와 같이 FACScan 분석을 위해 처리한다. 대표적인 실험 결과는 도 4에 도시되어 있다. 발현된 p107의 부재하에서, Mdm-2 또는 이의 1-134 영역의 발현이 세포주기에 영향을 미치지 않음을 명확히 입증한다. 한편, Mdm-2 및, 효율적으로는 이의 1-134 영역의 발현은 p107에 의하여 유도된 G1에서 세포주기의 정지를 고양할 수 있다. 이러한 예는 Mdm-2가 p53의 트랜스활성화 활성의 억제제일 뿐만 아니라 이의 조절에 연루된 인자를 억제할 수 있는 세포주기의 양성 조절제임을 명확히 입증한다.
이와 유사한 실험에서, Saos-2 세포를 1μg의 pXJMDM2, 8μg의 pXJ41 및 2μ의 pCMVCD20으로 공형질감염시킨다. 대표적인 실험 결과를 도 5에 표시하였다.; 이들은 MDM2의 발현이 p107 및 MDM2와 상호작용할 수 있는 결실 돌연변이체 p107(385-1068)에 의하여 유도된 G1에서의 차단을 고양시킬 수 있음을 보여준다.실시예 5: 시험관내 및 생체내에서 p107과 상호작용하는 MDM2
본 실시예는 시험관내 및 생체내에서 MDM2와 p107간의 물리적 상호작용을 설명한다. 이러한 결과는 세포주기의 수준에서 MDM2 활성과 상관관계가 있다(실시예 4).
5.1. 시험관내
시험관내 S35-표지한 p107을 글루타치온 세파로스 비드상에 부동화시킨 단백질 GST-MDM2 (벡터 pGex-MDM2) 또는 GST-MDM2(1-177) (벡터 pGex-MDM2(1-177))와 접촉시킨다. MDM2와 결합된 p107은 자동방사선촬영에 의하여 폴리아클리아미드 겔 후에 나타난다. 수득된 결과를 하기 표 2에 나타냈다.
5.2. 생체내
Cos 세포를 융합 단백질 GST-MDM2 또는 GST-MDM2(1-134)을 발현하는 플라스미드 pBC-MDM2 또는 pBC-MDM2(1-134), p107 발현용 플라스미드 또는 p107의 돌연변이체 발현용 플라스미드와 공형질감염시킨다. 전체세포 추출물로부터 수득된 GST-MDM2-p107 단백질 복합체가 글루타치온 세파로스 비드상에서 분리되며 p107 단백질이 안티-p107 폴리클로날 항체(Santa Cruz p107-C18)로 웨스턴 블로팅함으로써 나타난다. 수득된 결과를 하기 표 2에 나타냈다.
| p107 | p107(385-1068) | p107(1-781) | p107(385-1068) | |
| 생체내 | ||||
| GST-MDM2 | + | + | + | + |
| GST-MDM2(1-134) | + | nd | nd | nd |
| 시험관내 | ||||
| GST-MDM2 | + | nd | nd | nd |
| GST-MDM2(1-177) | + | nd | nd | nd |
결과는 시험관내, 및 또한 세포에서 MDM2와 p107간의 단백질-단백질 상호작용이 존재함을 입증한다. 세포 형질전환에 필수적인 MDM2의 영역(1-134)은 p107과 상호작용하는 영역이다. 이러한 영역은 "포켓 영역" 부분, 영역"A" 및 "스페이서"에 더욱 정확하게 위치되어 있는 것으로 위치분석되었다.
서열목록
(1)일반정보
(i)출원인:
(A) 성명: 롱프랑 로라 소시에테 아노님
(B) 거리: 아브뉴 레이몽 아롱 20
(C) 시: 앙토니
(E) 국명: 프랑스
(F) 우편번호: 92165
(G) 전화: (1) 40.91.69.22
(H) 팩시밀리: (1) 40.91.72.96
(ii)출원인:
(A) 성명: 엥스띠뛰 나시오날 드 라 상트 에 드라 러쉐르쉐 메디칼(INSERM)
(B) 거리: 뤼 드 톨비악 101
(C) 시: 파리 세데 13
(E) 국명: 프랑스
(F) 우편번호: 75654
(G) 전화: 44.23.60.61
(H) 팩시밀리: 45.85.68.56
(ii)발명의 명칭: MDM2 단백질의 종양원 활성 길항제 및 암치료에 있어서 이의 용도
(iii)서열수: 2개
(iv)컴퓨터 판독형:
(A)매체형: 테이프
(B)컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C)운영 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D)소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버전 #1.30(EPO)
(2) 서열번호 1에 대한 정보:
(i)서열특징:
(A)길이: 1476 염기쌍
(B)유형: 뉴클레오타이드
(C)본쇄형: 일본쇄
(D)토폴로지: 선형
(ii)분자형: cDNA
(iii)가설: 없음
(iv)안티센스: 없음
(ix)특성:
(A)명칭/키: CDS
(B)위치: 1..1476
(xi)서열배열: 서열번호 1:
(2) 서열번호 2에 대한 정보:
(i)서열특징:
(A)길이: 1182 염기쌍
(B)유형: 뉴클레오타이드
(C)본쇄형: 일본쇄
(D)토폴로지: 선형
(ii)분자형: cDNA
(iii)가설: 없음
(iv)안티센스: 없음
(ix)특성:
(A)명칭/키: CDS
(B)위치: 1..1182
(xi)서열배열: 서열번호 2:
Claims (25)
- 제로 p53 컨텍스트를 사용한 암치료용 약학 조성물 제조를 위한 Mdm2 단백질의 종양원 활성을 적어도 부분적으로 길항할 수 있는 화합물의 용도.
- 제 1 항에 있어서, 서열번호 1로 표현된 Mdm2 단백질 서열의 1-134 영역 수준에서 결합할 수 있는 화합물의 용도.
- 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 화합물이 Mdm2 단백질의 1-134 영역에 대한 scFV임을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 화합물이 서열번호 2로 표현된 서열의 펩타이드 1-52, 1-41, 6-41, 16-25, 18-23 또는 이들의 유도체 중 하나로 완전히 또는 부분적으로 표현됨을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항에 있어서, Mdm2 단백질의 서열번호 1로 표현된 1-134 영역에 인접한 영역에 결합할 수 있고 이러한 결합에 의하여 단백질의 종양원 활성에 영향을 미칠 수 있는 화합물의 용도.
- 제 1 항 또는 5 항에 있어서, 화합물이 Mdm2 단백질의 C 말단 영역과 상호작용함을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항, 5 항 또는 6 항에 있어서, TFII, TBF 및 TAF250 중에서 선택된 전사인자를 수반함을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항 또는 5 항에 있어서, 화합물이 Mdm2 단백질의 135-491 영역과 상호작용함을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항, 5 항 또는 8 항에 있어서, 단백질 Rb, L5 및 전사인자 E2F 중에서 선택된 단백질을 완전히 또는 부분적으로 수반함을 특징으로 하는 용도.
- 암치료용 약학 조성물의 제조를 위한 Mdm2 단백질의 1-134 영역에 대한 scFV의 용도.
- 제로 p53 컨텍스트를 사용한 암치료용 약학 조성물 제조를 위한 Mdm2 단백질의 종양원 활성을 길항할 수 있는 화합물을 암호화하는 핵산의 용도.
- -안티센스 핵산,-Mdm2 단백질의 영역의 하나와 직접 결합할 수 있고 이의 종양원 활성을 억제할 수 있는 리간드 올리고뉴클레오타이드,-Mdm2의 영역 중 하나와 올리고머화할 수 있고 이의 종양원 활성을 억제할 수 있는 펩타이드 또는 단백질을 완전히 또는 부분적으로 암호화하는 핵산, 및-서열번호 1로 표현된 Mdm2 단백질 서열의 1-134 영역에 대한 내세포성 항체를 암호화하는 핵산을 수반함을 특징으로 하는 용도.
- 제 12 항에 있어서, 안티센스 핵산이 Mdm2 단백질 암호화 핵산에 상보적인 RNA를 암호화하고 이의 전사 및/또는 이의 해독 (안티센스 RNA) 또는 리보자임을 차단할 수 있는 DNA임을 특징으로 하는 용도.
- 제 11 항 내지 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 DEAE-덱스트란과, 핵 단백질과, 또는 양이온 중합체 또는 지질과의 리포솜 형태의 복합체 형태로 또는 그 자체로 사용됨을 특징으로 하는 용도.
- 제 11 항 내지 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 벡터 부분을 형성함을 특징으로 하는 용도.
- 제 15 항에 있어서, 핵산이 아데노바이러스, 레트로바이러스 및 아데노-수반 바이러스 중에서 선택된 바이러스 벡터 부분을 형성함을 특징으로 하는 용도.
- Mdm2 단백질의 종양원 활성을 적어도 부분적으로 억제할 수 있는 화합물을 암호화하는 핵산서열을 포함하는 바이러스 벡터.
- 제 17 항에 있어서, 핵산서열이 Mdm2 단백질의 1-134 영역(서열번호 1)의 수준에서 상호작용할 수 있는 scFV 또는 펩타이드를 암호화함을 특징으로 하는 바이러스 벡터.
- 제 17 항 또는 18 항에 있어서, 아데노바이러스, 레트로바이러스 및 아데노- 수반 바이러스 중에서 선택됨을 특징으로 하는 바이러스 벡터.
- 제 17 항 내지 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스 또는 레트로바이러스임을 특징으로 하는 바이러스 벡터.
- 제 1 항 내지 11 항 중 어느 한 항에서 정의한 Mdm2 단백질의 종양원 활성을 억제할 수 있는 화합물을 포함하는 약학 조성물.
- 제 12 항 또는 13 항에서 정의한 Mdm2 단백질의 종양원 활성을 억제할 수 있는 화합물을 암호화하는 핵산서열을 포함하는 약학 조성물.
- 제 22 항에 있어서, 제 14 항 내지 20 항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 바이러스 벡터를 포함함을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 23 항에 있어서, 종양내 투여용으로 제형된 조성물.
- 암치료용 약학 조성물 제조를 위한 Mdm2 단백질의 1-134 영역(서열번호 1)에 대한 내세포 항체를 암호화하는 핵산서열의 용도.
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