ES2210386T3 - Antagonistas de la actividad oncogenica de la proteina mdm2, y su utilizacion en el tratamiento de canceres. - Google Patents
Antagonistas de la actividad oncogenica de la proteina mdm2, y su utilizacion en el tratamiento de canceres.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE AL USO DE UN COMPUESTO CAPAZ DE ANTAGONIZAR AL MENOS PARCIALMENTE LA ACTIVIDAD ONCOGENICA DE LA PROTEINA MDM2 PARA LA PREPARACION DE UNA COMPOSICION FARMACEUTICA DESTINADA EN PARTICULAR AL TRATAMIENTO DE CANCERES DE CONTEXTO P53 NULO. SE REFIERE ADEMAS A UN VECTOR VIRICO QUE COMPRENDE UNA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA PARA UN COMPUESTO CAPAZ DE INHIBIR AL MENOS PARCIALMENTE LA ACTIVIDAD ONCOGENICA DE LA PROTEINA MDM2 Y A LA COMPOSICION FARMACEUTICA CORRESPONDIENTE.
Description
Antagonistas de la actividad oncogénica de la
proteína Mdm2, y su utilización en el tratamiento de cánceres.
La presente invención se refiere a un nuevo
método de tratamiento de patologías hiperproliferativas (cánceres,
restenosis, etc..) así como las composiciones farmacéuticas
correspondientes.
Ahora está bien establecido que una gran mayoría
de los cánceres está causada, por lo menos en parte, por anomalías
genéticas que se traducen bien sea por la sobreexpresión de uno o
varios genes y/o la expresión de uno o de genes mutados o
anormales. Por ejemplo, la expresión de oncogenes genera en la mayor
parte de los casos un cáncer. Se entiende por encogen un gen
genéticamente afectado y cuyo producto de expresión perturba el
funcionamiento biológico normal de las células, iniciándose así un
estado neoplásico. Un gran número de oncogenes están hoy en día
identificados y parcialmente caracterizados como especialmente los
genes ras, myc, fos, erb, neu, raf, src, fms, jun y
abl cuyas formas mutadas parecen responsables de una
alteración de la proliferación celular.
En un contexto celular normal, la proliferación
de estos oncogenes está presumiblemente contrapuesta al menos en
parte, por la generación de genes llamados supresores de tumores
como p53 y Rb. Sin embargo, algunos fenómenos pueden venir a
perturbar este mecanismo de autorregulación celular y favorecer
entonces el desarrollo de un estado neoplásico. Uno de estos hechos
consiste en mutaciones a nivel de genes supresores de tumores. Es
así como la forma mutada por deleción y/o mutación del gen p53 está
implicada en el desarrollo de la mayor parte de los cánceres humanos
(Baker et al., Science 244 (1998) 217) y como formas
inactivadas del gen Rb han sido puestas como causa en diferentes
tumores, y especialmente en los retinoblastomas o en los cánceres
mesenquimatosos como los osteosarcomas.
La proteína p53 es una fosfoproteína nuclear de
53kD que se expresa en la mayor parte de los tejidos normales. Está
implicada en el control del ciclo celular (Mercer et al.,
Critic Rev. Eucar. Gene Express, 2, 251, 1992), la regulación
transcripcional (Fields et al., Sciences (1990) 249, 1046),
la replicación del ADN (Wilcoq and Lane, (1991), Nature 349, 4290
et Bargonnetti et al., (1992) Cell 65 1083) y la inducción de
la apoptosis (Shaw et al., (1992) P.N.A.S.USA 89, 4495).
Así, toda exposición de células a agentes capaces por ejemplo de
dañar el ADN, inicia una cascada de señalización celular que
desemboca en una modificación post-transcripcional
de la proteína p53 y en la activación transcripcional por p53 de un
determinado número de genes tales como gadd45 (growth arrest and
DNA damage) (Kastan et al., Cell, 71,
587-597, 1992), p21 WAF/CIP (ELDeiry et al.,
Cancer Res., 54, 1169-1174, 1994) o bien además mdm2
(mouse double minute) (Barak et al., EMBO J., 12,
461-468, 1993).
De lo dicho anteriormente, resalta claramente que
la elucidación de las diferentes funciones biológicas del ensamblaje
de las proteínas implicadas especialmente en esta vía de
señalización celular, de sus modos de funcionamiento y de sus
características es de un mayor interés para la comprensión de la
cancerogénesis y la puesta a punto de métodos terapéuticos eficaces
dirigidos contra el cáncer.
La presente invención se inscribe precisamente en
este contexto proporcionando una nueva función de la proteína
Mdm2.
La proteína Mdm2 es una fosfoproteína con peso
molecular de 90 kD, expresada a partir del gen mdm-2
(murine double minute 2). Este gen mdm2 ha sido clonado en el origen
en una célula tumoral espontánea BALB/c 3T3 y ha sido constatado
que su sobreexpresión aumenta fuertemente el poder tumoral
(Cahilly-Snyder et al., Somat. Cell. Mol. Genet.,
13, 235-244, 1987.; Fakharzadeh et al., EMBO
J. 10, 1565-1569, 1991). Un complejo Mdm2/p53 ha
sido identificado en varias líneas celulares que contienen también
una p53 salvaje como proteínas p53 mutadas (Martinez et al.,
Genes Dev., 5, 151-159, 1991). Además, ha sido
mostrado que Mdm2 inhibe la actividad transcripcional de p53 sobre
un promotor como el de la actividad transcripcional de p53 sobre un
promotor como el de la creatina-quinasa de músculo
que indica que Mdm2 puede regular la actividad de p53 (Momand et
al., Cell, 69, 1237-1245, 1992; Oliner et
al., Nature, 362, 857-860, 1993). El documento
WO93/20238 describe un ensayo de diagnostico basado en la
sobreexpresión del gen mdm2. Este documento describe también el
principio de la utilización de compuestos capaces de interferir en
el enlace Mdm-2/ p53 a fin de prevenir el secuestro
de p53 por Mdm-2.
A la vista del conjunto de estos resultados, la
proteína Mdm2 es pues en estos momentos esencialmente reconocida
como un modulador de las actividades de p53. Formando complejos con
las proteínas p53 salvajes o mutadas, inhibe su actividad
transcripcional y contribuye de esta manera a la desregulación de la
proliferación celular. En consecuencia, la explotación en un plan
terapéutico de estas informaciones consiste mayoritariamente en
buscar medios para oponerse a este bloqueo por Mdm2 de la proteína
p53.
De manera inesperada, la firma solicitante ha
puesto en evidencia que esta proteína Mdm2 poseía un carácter
oncogénico propio, es decir totalmente distinto de aquel asociado a
su forma complejada con la proteína p53. Más precisamente, la
proteína Mdm2 desarrolla propiedades oncogénicas en un contexto sin
proteínas p53. Para apoyar este descubrimiento a saber que las
propiedades oncogénicas de Mdm-2 son independientes
de p53 y en particular que no resultan de la inhibición de la
actividad activadora de la transcripción de p53 salvaje, hemos
mostrado que un mutante de p53 (p53 (14-19); Lin
et al., Genes Dev., 1994, 8, 1235-1246) que
ha conservado sus propiedades activadoras de la transcripción pero
que no interactua más con Mdm-2 es incapaz de
bloquear las propiedades oncogénicas de Mdm-2. Se ha
mostrado igualmente que Mdm-2 y en particular el
dominio 1-134 de Mdm-2 es capaz de
desbloquear una parada del ciclo celular en G1 inducido por la
sobreexpresión de p107. Mdm-2 revela pues ser un
regulador importante de factores implicados en el control del ciclo
celular, diferente de p53.
La presente invención resulta en parte de la
puesta en evidencia que la secuencia protéica 1-134
de la secuencia identificada en SEQ ID Nº1, de la proteína Mdm2 es
suficiente para traducir el potencial oncogénico de dicha
proteína.
Resulta igualmente de la puesta en evidencia que
es posible afectar este carácter oncogénico de la proteína Mdm2
utilizando compuestos capaces de interactuar con ella. La presente
invención describe igualmente sistemas particularmente eficaces que
permiten la liberación in vivo, directamente en los tumores,
de tales compuestos y así luchar contra el desarrollo de cánceres.
La presente invención ofrece así un nuevo enfoque particularmente
eficaz para el tratamiento de tumores en particular en un contexto
sin proteínas p53 tales como los cánceres siguientes:
adenocarcinomas del colon, cánceres del tiroides, carcinomas del
pulmón, leucemias mieloides, cánceres colorrectales, cánceres del
pecho, cánceres del pulmón, cánceres gástricos, cánceres del
esófago, linfomas B, cánceres ováricos, cánceres de la vejiga,
glioblastomas, etc...
Un primer objetivo de la invención reside pues en
la utilización de un compuesto capaz de antagonizar al menos
parcialmente la actividad oncogénica de la proteína Mdm2 para la
preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento
de cánceres en un contexto sin proteínas p53.
En el sentido de la invención, se entiende por
cáncer en un contexto sin proteínas p53, un cáncer cuya p53 sea
incapaz de ejercer sus funciones de gen supresor de tumor por
cualquier modificación o cualquier mecanismo diferente como la
fijación de Mdm-2 sobre p53, esta fijación impediría
que p53 desempeñe su papel de supresor de tumor y permitiría a las
células escapar a un crecimiento regulado por p53. Se puede citar
de forma no exhaustiva entre estas modificaciones o mecanismos que
bloquean la actividad de supresor de tumor de p53, por ejemplo,
alteraciones genéticas del gen p53 ( mutaciones puntuales,
deleciones, etc), la interacción con otras proteínas como
Mdm-2, la degradación proteolítica muy rápida de la
proteína p53 ligada a la presencia de la proteína E6 de virus de
papilomas humanos de alto riesgo tales como HPV-16 y
HPV-18, etc.
En el sentido de la invención, la inhibición de
la actividad oncogénica de la proteína Mdm2 puede obtenerse según
dos métodos.
Es preferentemente llevado a cabo al intervenir
directamente a nivel del dominio 1-134 de ésta. Es
así que cualquier proteína capaz de unirse a este dominio tendrá un
papel antagonista sobre las propiedades oncogénicas de Mdm2.
Sin embargo, este efecto inhibidor puede
igualmente ser alcanzado vía interacción de un compuesto con un
dominio vecino, como por ejemplo el dominio 135-491
de mdm2, representado en la secuencia SEQ ID Nº1 o su secuencia C
terminal representada en la secuencia SEQ ID Nº1. En consecuencia,
la presente invención apunta además la utilización de cualquier
compuesto que, bien sin interactuar directamente con este dominio,
sea no obstante capaz de afectar el carácter oncogénico.
Según un modo particular, la presente invención
apunta la utilización de un compuesto capaz de unirse a nivel del
dominio 1-134 de la secuencia representada en SEQ
ID Nº1 de la proteína Mdm2 en vista a preparar una composición
farmacéutica destinada al tratamiento de cánceres en un contexto sin
proteínas p53.
Como compuesto susceptible de interactuar
directamente a nivel del dominio 1- 134, de la proteína Mdm2, se
puede citar más particularmente los scFV dirigidos específicamente
contra este dominio.
Las ScFv son moléculas que tienen propiedades de
enlace comparables a aquellas de un anticuerpo y activas
intracelularmente. Se trata más particularmente de moléculas
constituidas de un péptido que corresponde al sitio de enlace de la
región variable de la cadena ligera de un anticuerpo unido por un
enlace peptídico a un péptido correspondiente al sitio de enlace de
la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo. Se ha
mostrado por la firma solicitante como tales ScFv pueden ser
producidos in vivo por transferencia de genes (Cf solicitud
WO 94/29446).
Puede igualmente tratarse de péptidos o de
proteínas ya conocidos por su aptitud a unirse específicamente con
el dominio 1-134 de Mdm2 como por ejemplo todo o
parte del dominio de enlace de la proteína p53 con la SEQ ID Nº1 y
más particularmente todo o parte de uno de los péptidos
1-52, 1-41 y 6-41 de
la secuencia de p53 representada en SEQ ID Nº2, (Oliner et
al., Nature, 1993, 362, 857-860) o más
simplemente todo o parte del péptido 16-25
cartografiado más precisamente (Lane et al., Phil. Trans. R.
Soc. London B., 1995, 347, 83-87), o incluso los
péptidos 18-23 de p53 humano o murino, o también
péptidos derivados próximos de los anteriormente citados en los
cuales los residuos críticos para la interacción con
Mdm-2 han sido conservados (Picksley et al.,
Oncogene, 1994, 9, 2523-2529).
Igualmente pueden ser utilizados según la
invención: compuestos que se puedan unir a dominios vecinos del
dominio 1-134 de Mdm2 representado en SEQ ID Nº1 y
que afectan por una parte este enlace de la actividad oncogénica de
la proteína Mdm2. Como ejemplo, se pueden citar aquellas
interactuaciones a nivel del dominio C terminal de dicha proteína
como por ejemplo los factores transcripcionales TFII, TBP, y TaF250
igual que las proteínas que interactuan a nivel del dominio
135-491 de Mdm2 representado en SEQ ID Nº1 como por
ejemplo las proteínas L5 (proteína ribosomal) y Rb (proteína
retinoblastoma) y el factor transcripcional E2F (regulado por
Rb).
Otro objetivo de la presente invención apunta
igualmente la utilización de scFV dirigidos específicamente contra
este dominio 1-134 de la secuencia representada en
SEQ ID Nº1 de la proteína Mdm2 en vista a preparar una composición
farmacéutica destinada al tratamiento de cánceres.
En el sentido de la invención, se entiende que el
conjunto de las interacciones citadas anteriormente afectan de
manera consecuente el carácter oncogénico de Mdm2. Además, estas
proteínas pueden ser utilizadas, en todo o parte, en la medida en
que se utiliza su parte activa frente a uno de los dominios de
enlace con la proteína Mdm2 y que esta interacción conduce a una
afectación del carácter oncogénico de ésta.
En el marco de la presente invención, estos
compuestos pueden ser utilizados tal cual o, ventajosamente, bajo
forma de construcciones genéticas que permitan su expresión in
vivo.
Un modo de realización particularmente ventajoso
de la presente invención consiste en utilizar una secuencia nucleica
que codifique un compuesto capaz de antagonizar al menos
parcialmente la actividad oncogénica de la proteína Mdm2 para la
preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento
de cánceres en un contexto sin proteínas p53.
En esta perspectiva, los ácidos nucleicos
utilizados en el marco de la invención pueden ser de diferentes
tipos. Se trata de manera preferente:
- de ácidos nucleicos antisentido,
- de oligorribonucleótidos capaces de fijar
directamente uno de los dominios de la proteína Mdm2 y de inhibir su
actividad oncogénica (oligonucleótido ligando),
- de ácidos nucleicos que codifican en todo o
parte péptidos o proteínas capaces de oligomerizarse con uno de los
dominios de Mdm2 y de inhibir su actividad oncogénica, y
- de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos
intracelulares (por ejemplo fragmentos variables con cadena única
procedente de un anticuerpo) dirigidos contra el dominio
1-134 de la secuencia SEQ ID Nº1 de la proteína
Mdm2.
Según un modo particular de la presente
invención, el ácido nucleico es un ácido nucleico antisentido. Este
antisentido es un ADN que codifica un ARN complementario del ácido
nucleico que codifica la proteína Mdm2 y capaz de bloquear su
transcripción y/o su traducción (ARN antisentido) o un ribosoma.
Más recientemente, un nuevo tipo de ácidos
nucleicos capaces de regular la expresión de
genes-diana ha sido puesto en evidencia. Estos
ácidos nucleicos no se hibridan con los ARNm celulares, pero sí
directamente con el ADN genómico bicatenario. Este nuevo enfoque se
asienta sobre la puesta en evidencia de que algunos ácidos nucleicos
son capaces de interactuar específicamente en el gran surco de la
doble hélice del ADN para formar localmente
triples-hélices, que conducen a una inhibición de
la transcripción de genes-diana. Estos ácidos
nucleicos reconocen selectivamente la doble-hélice
de ADN a nivel de secuencias
oligopurina-oligopirimidina, es decir a nivel de
regiones que poseen una secuencia oligopúrica sobre una cadena y una
secuencia oligopirimidínica sobre la cadena complementaria, y allí
forman locamente una triple-hélice. Las bases de la
tercera cadena (el oligonucleótido) forman enlaces hidrógeno
(enlaces Hoogsteen o Hoogsteen inverso) con las purinas de los pares
de bases Watson-Crick. Estos ácidos nucleicos han
sido descritos especialmente por Pr. Hélène en
Anti-Cancer drug desing 6 (1991) 569.
Los ácidos nucleicos antisentido según la
presente invención pueden ser secuencias de ADN que codifican los
ARN antisentido o para ribosomas. Los ARN antisentido así producidos
pueden interactuar con un ARNm o un ADN genómico diana y formar con
él dobles o triples hélices. Puede igualmente tratarse de
secuencias (oligonucleótidos) antisentido, eventualmente modificadas
químicamente, capaces de interactuar directamente con el gen o el
ARN diana.
Siempre según un modo preferido de puesta en
práctica de la presente invención, el ácido nucleico es un
oligonucleótido antisentido tal como está definido anteriormente,
eventualmente modificado químicamente. Puede tratarse en particular
de oligonucleótidos cuyo esqueleto fosfodiéster ha sido modificado
químicamente, como por ejemplo oligonucleótidos fosfonatos,
fosfotriésteres, fosforamidatos y fosforotrioatos que se han
descrito, por ejemplo, en la solicitud de patente WO 94/08003. Puede
igualmente tratarse de oligonucleótidos alfa, o de oligonucleótidos
conjugados con agentes tal como los compuestos acrilantes.
En el sentido de la presente invención, se
entiende por oligonucleótido ligando, un oligorribonucleótido o un
oligodeoxirribonucleótido capaz de fijarse específicamente a la
proteína Mdm2 a fin de inhibir su función oncogénica. Estos
nucleótidos pueden por ejemplo ser puestos en evidencia por
técnicas de "evolución in vitro" como por ejemplo la
técnica SELEX (Edigngton, Bio/technology, 1992, 10,
137-140; Patentes US 5270163 y WO 91/19813).
Más generalmente, estos ácidos nucleicos pueden
ser de origen humano, animal, vegetal, bacteriano, viral, sintético,
etc. Pueden ser obtenidos por cualquier técnica conocida por el
experto, y especialmente por muestreo de bancos de datos, por
síntesis química, o también por métodos mixtos que incluyen la
modificación química o enzimática de secuencias obtenidas por
muestreo de bancos de datos.
Como se ha indicado anteriormente, pueden por
otra parte ser incorporados en vectores, tales como vectores
plasmídicos, virales o químicos. Pueden igualmente ser
administrados tal cual, bajo forma de ADN desnudo según la técnica
descrita en la solicitud WO 90/11092 o bajo forma complejada, por
ejemplo con DEAE-dextrano (Pagano et al., J.
Virol. 1 (1967) 891), con proteínas nucleares (Kaneda et al.,
Science 243 (1989) 375), con lípidos o polímeros catiónicos
(Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), bajo forma de
liposomas (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431),
etc.
Preferentemente, la secuencia utilizada en el
marco de la invención forma parte de un vector. El empleo de tal
vector permite en efecto mejorar la administración del ácido
nucleico en las células a tratar, e igualmente aumentar su
estabilidad en dichas células, lo que permite obtener un efecto
terapéutico duradero. Además, es posible introducir varias
secuencias de ácido nucleico en un mismo vector, lo que aumenta
igualmente la eficacia del tratamiento.
El vector utilizado puede ser de orígenes
diversos, en cuanto que es capaz de transformar células animales, de
preferencia células cancerosas humanas. En un modo preferido de
puesta en práctica de la invención, se utiliza un vector viral, que
puede estar elegido entre adenovirus, retrovirus, virus
adeno-asociados (AAV) o el virus del herpes.
A esta consideración, la presente invención tiene
igualmente por objeto cualquier vector viral que incluya, inserto en
su genoma, un ácido nucleico que codifique un compuesto capaz de
antagonizar al menos parcialmente el carácter oncogénico de la
proteína Mdm2.
Más particularmente, se refiere a cualquier virus
recombinante que incluya una secuencia de ácidos nucleicos que
codifique un compuesto capaz de unirse a la proteína Mdm2 de manera
que afecte su potencial oncogénico. En este contexto, la secuencia
de ácidos nucleicos puede codificar uno de los péptidos, proteínas o
factores transcripcionales anteriormente identificados.
Más preferentemente, esta secuencia de ácidos
nucleicos codifica un scFv o un péptido capaz de interactuar a nivel
del dominio 1-134 (SEQ ID Nº1) de la proteína
Mdm2.
Ventajosamente, los virus utilizados en el marco
de la invención son preferentemente defectivos, es decir que son
incapaces de replicarse de forma autónoma en la célula infectada.
Generalmente, el genoma de los virus defectivos utilizados en el
marco de la presente invención está pues desprovisto al menos de las
secuencias necesarias para la replicación de dichos virus en la
célula infectada. Estas regiones pueden ser bien sea eliminadas (en
todo o en parte), bien sea haciéndolas no funcionales, bien sea
sustituyéndolas por otras secuencias y especialmente por la
secuencia que codifica el compuesto que posee un papel antagonista
sobre las propiedades oncogénicas de la proteína Mdm2.
Preferentemente, el virus defectivo conserva no obstante las
secuencias de su genoma que son necesarias para la encapsulación de
las partículas virales.
Tratándose más particularmente de adenovirus,
diferentes serotipos, cuya estructura y propiedades varían un poco,
han sido caracterizados. Entre estos serotipos, se prefieren
utilizar en el marco de la presente invención adenovirus humanos
del tipo 2 ó 5 (Ad 2 o Ad5) o adenovirus de origen animal (véase la
solicitud FR 93 05954). Entre los adenovirus de origen animal
utilizables en el marco de la presente invención se pueden citar
adenovirus de origen canino, bovino, murino, (ejemplo: Mav1, Beard
et al., Virology 75 (1990) 81), ovino, porcino, aviar o
también de simios (ejemplo: SAV). De preferencia, el adenovirus de
origen animal es un adenovirus canino, más preferentemente un
adenovirus CAV2 [cepa manhattan o A26/61 (ATCC
VR-800) por ejemplo]. De preferencia, se utilizan en
el marco de la invención adenovirus de origen humano o canino o
mixto.
Preferentemente, los adenovirus defectivos de la
invención incluyen ITR, una secuencia que permite la encapsulación y
la secuencia que codifica el modulador calpainas. Aún más
preferentemente, en el genoma de los adenovirus de la invención, el
gen E1 y al menos uno de los genes E2, E4, L1-L5 son
no funcionales. El gen viral considerado puede llegar a ser no
funcional por cualquier técnica conocida por el experto, y
especialmente por supresión total, sustitución, deleción parcial, o
adición de una o varias bases en el o los genes considerados. Tales
modificaciones pueden ser obtenidas in vitro (sobre ADN
aislado) o in situ, por ejemplo, por medio de técnicas de
ingeniería genética, o también por tratamiento por medio de agentes
mutágenos.
Los adenovirus recombinantes defectivos según la
invención pueden prepararse por cualquier técnica conocida por el
experto (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573;
Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particular, pueden prepararse por
recombinación homóloga entre un adenovirus y un plásmido que lleve
entre otras la secuencia de ADN que codifica el inhibidor de ETS.
La recombinación homóloga se produce después de una
co-transfección de dichos adenovirus y plásmido en
una línea celular apropiada. La línea celular utilizada debe de
preferencia (i) ser transformable por dichos elementos, y (ii),
incluir las secuencias capaces de complementar la parte del genoma
del adenovirus defectivo, de preferencia bajo forma integrada para
evitar los riesgos de recombinación. Como ejemplo de línea, se
puede mencionar la línea de riñón embrionario humano 293 (Graham
et al., J. Gen. Virol. 36 (1997) 59 ) que contiene
especialmente, integrado en su genoma, la parte izquierda del genoma
de un adenovirus Ad5 (12%). Estrategias de construcción de vectores
derivados de los adenovirus han sido igualmente descritas en las
solicitudes nº FR 93 05954 y FR 93 08596.
A continuación, los adenovirus que se han
multiplicado se recuperan y purifican según las técnicas clásicas de
biología molecular, como se ilustra en los ejemplos.
En cuanto a los virus
adeno-asociados (AAV), se trata de virus con ADN de
tamaño relativamente reducido, que se integran en el genoma de las
células que infectan, de manera estable y
sitio-específico. Son capaces de infectar un amplio
espectro de células, sin inducir efecto sobre el crecimiento, la
morfología o la diferenciación celular. Por otra parte, no parecen
implicados en patologías en el hombre. El genoma de los AAV ha sido
clonado, secuenciado y caracterizado. Incluye alrededor de 4700
bases, y contiene en cada extremo una región repetida inversa (ITR)
de alrededor de 145 bases, que sirven de origen de replicación para
el virus. El resto del genoma está dividido en 2 regiones
esenciales que llevan las funciones de encapsulación: la parte
izquierda del genoma, que contiene el gen rep implicado en la
replicación viral y la expresión de los genes virales; la parte
derecha del genoma, que contiene el gen cap que codifica las
proteínas de la cápsida del virus.
La utilización de vectores derivados de los AAV
para la transferencia de genes in vitro e in vivo ha
sido descrita en la literatura técnica (véanse especialmente WO
91/18088; WO 93/09239; US 4797368, US 5139941, EP 488528). Estas
solicitudes describen diferentes construcciones derivadas de los
AAV, en las cuales los genes rep y/o cap son eliminados y
reemplazados por un gen de interés, y su utilización para
transferir in vitro (sobre células en cultivo) o in
vivo (directamente en un organismo) dicho gen de interés. Los
AAV recombinantes defectivos según la invención pueden prepararse
por co-transfección, en una línea celular infectada
por un virus auxiliar humano (por ejemplo un adenovirus), de un
plásmido que contenga la secuencia que codifica el inhibidor de ETS
delimitado por dos regiones repetidas inversas (ITR) de AAV, y de
un plásmido que lleva los genes de encapsulación (genes rep y cap)
de AAV. Los AAV recombinantes producidos son a continuación
purificados por técnicas clásicas.
En cuanto a los virus del herpes y los
retrovirus, la construcción de vectores recombinantes ha sido
ampliamente descrita en la literatura técnica: véanse especialmente
Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP
178220, Bernstein et al., Genet. Eng. 7 (1985) 235;
McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particular, los
retrovirus son virus integrativos, que infectan selectivamente las
células en división. Constituyen pues vectores de interés para
aplicaciones de cáncer. El genoma de los retrovirus incluye
esencialmente dos LTR, una secuencia de encapsulación y tres
regiones codificantes (gag, pol y env). En los vectores
recombinantes derivados de los retrovirus, los genes gag, pol y env
están generalmente eliminados, en todo o en parte, y reemplazados
por una secuencia de ácido nucleico heterólogo de interés. Estos
vectores pueden realizarse a partir de diferentes tipos de
retrovirus tales como especialmente MoMuLV ("murine moloney
leukemia virus"; también llamado MoMLV), MSV ("murine moloney
sarcoma virus"), HaSV ("harvey sarcoma virus"); SNV
("spleen necrosis virus"); RSV ("rous sarcoma virus") o
también el virus de Friend.
Para construir retrovirus recombinantes que
incluyan una secuencia de interés, se construye generalmente un
plásmido que incluya especialmente los LTR, la secuencia de
encapsulación y dicha secuencia de interés, después se utiliza para
transfectar una línea celular llamada de encapsulación, capaz de
llevar en trans las funciones retrovirales deficientes en el
plásmido. Generalmente, las líneas de encapsulación son pues
capaces de expresar los genes gag, pol y env. Tales líneas de
encapsulación han sido descritas en la técnica anterior, y
especialmente la línea PA317 (US 4861719); la línea PsiCRIP (WO
90/02806) y la línea GP+envAM-12 (WO 89/07150). Por
otra parte, los retrovirus recombinantes pueden incluir
modificaciones a nivel de LTR para suprimir la actividad
transcripcional, así como secuencias de encapsulación extendidas,
que incluyen una parte del gen gag (Bender et al., J. Virol.
61 (1987) 1639). Los retrovirus recombinantes producidos son a
continuación purificados por técnicas clásicas.
Ventajosamente, en los vectores de la invención,
la secuencia que codifica el compuesto que posee propiedades
antagonistas sobre el carácter oncogénico de Mdm2 se coloca bajo el
control de señales que permiten su expresión en las células
tumorales. Preferentemente, se trata de señales de expresión
heterólogas, es decir de señales diferentes de aquellas
naturalmente responsables de la expresión del inhibidor. Puede
tratarse en particular de secuencias responsables de la expresión de
otras proteínas, o de secuencias sintéticas. Especialmente, puede
tratarse de secuencias promotoras de genes eucariotas o virales.
Por ejemplo, puede tratarse de secuencias promotoras procedentes del
genoma de la célula que se desea infectar. Así mismo, puede
tratarse de secuencias promotoras procedentes del genoma de un
virus, incluso del virus utilizado. A esta consideración, se pueden
citar por ejemplo los promotores E1A, MLP, CMV,
LTR-RSV, etc. Además, estas secuencias de expresión
pueden ser modificadas por adición de secuencias de activación, de
regulación, o que permitan una expresión
tejido-específica. Puede en efecto ser
particularmente interesante utilizar señales de expresión activas
específicamente o mayoritariamente en las células tumorales, de
manera que esta secuencia de ADN no sea expresada y no produzca su
efecto cuando el virus ha efectivamente infectado una célula
tumoral.
En un modo particular de realización, la
invención se refiere a un virus recombinante defectivo que incluye
una secuencia de ADNc que codifica un compuesto que posee
propiedades antagonistas sobre el carácter oncogénico de Mdm2 bajo
el control de un promotor viral, elegido de preferencia entre
LTR-RSV y el promotor CMV.
Siempre en un modo preferido, la invención se
refiere a un virus recombinante defectivo que incluye una secuencia
de ADN que codifica un compuesto que posee propiedades antagonistas
sobre el carácter oncogénico de Mdm2 bajo el control de un promotor
que permita una expresión mayoritaria en las células tumorales.
La expresión se considera como mayoritaria en el
sentido de la invención cuando, aun si una expresión residual se
observa en otros tipos celulares, los niveles de expresión son
superiores en las células tumorales.
La presente invención se extiende igualmente a la
utilización de una secuencia nucleica que codifica anticuerpos
intracelulares o también scFV, dirigidos contra el dominio
1-134 de la secuencia de la proteína Mdm2
representada en SEQ ID Nº1 para la preparación de una composición
farmacéutica destinada de manera general al tratamiento del
cáncer.
Se refiere igualmente a cualquier composición
farmacéutica que incluya un compuesto capaz de inhibir la actividad
oncogénica de la proteína Mdm2, o una secuencia de ácidos nucleicos
que codifican tal compuesto. Según un modo particular de
realización de la invención esta composición incluye uno o varios
virus recombinantes defectivos tal como están descritos
anteriormente. Estas composiciones farmacéuticas pueden estar
formuladas en vista a las administraciones por vía tópica, oral,
parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea,
intraocular, transdermica, etc. De preferencia, las composiciones
farmacéuticas de la invención contienen un vehículo
farmacéuticamente aceptable para una formulación inyectable,
especialmente para una inyección directa en el tumor del paciente.
Puede tratarse en particular de disoluciones estériles, isotónicas,
o de composiciones secas, especialmente liofilizadas, que, por
adición según el caso de agua esterilizada o de suero fisiológico,
permitan la constitución de soluciones inyectables. La inyección
directa en el tumor del paciente es ventajosa porque permite
concentrar el efecto terapéutico a nivel de los tejidos
afectados.
Las dosis de virus recombinantes defectivos
utilizados para inyección pueden ser adaptadas en función de
diferentes parámetros, y especialmente en función del vector viral,
del modo de administración utilizado, de la patología referida o
también de la duración del tratamiento buscado. De una manera
general, los adenovirus recombinantes según la invención están
formulados y administrados bajo forma de dosis comprendidas entre
10^{4}y 10^{14}pfu/ml, y de preferencia 10^{6}a
10^{10}pfu/ml. El término pfu ("plaque forming unit")
corresponde al poder infeccioso de una disolución de virus, y está
determinado por infección de un cultivo celular apropiado, y medido,
generalmente después de 48 horas, del número de placas de células
infectadas. Las técnicas de determinación del título pfu de una
disolución viral están bien documentadas en la literatura técnica.
En cuanto a los retrovirus, las composiciones según la invención
pueden incluir directamente las células productoras, en vista de su
implantación.
Las composiciones farmacéuticas según la
invención son particularmente ventajosas para neutralizar la
actividad oncogénica de las proteínas Mdm2 y de hecho para modular
la proliferación de algunos tipos celulares.
En particular, estas composiciones farmacéuticas
son apropiadas en el tratamiento de cánceres sin presencia de
proteínas p53 como por ejemplo los cánceres siguientes:
adenocarcinomas del colon, cánceres del tiroides, carcinomas del
pulmón, leucemias mieloides, cánceres colorrectales, cánceres del
pecho, cánceres del pulmón, cánceres gástricos, cánceres del
esófago, linfomas B, cánceres ováricos, cánceres de la vejiga,
glioblastomas, etc.
La presente invención es ventajosamente utilizada
in vivo para la destrucción de células en hiperproliferación
(i.e. en proliferación anormal). Es también aplicable a la
destrucción de células tumorales o células de músculo liso de la
pared vascular (restenosis).
Otras ventajas de la presente invención
aparecerán con la lectura de los ejemplos y figuras que siguen, que
deben ser considerados como ilustrativos y no limitativos.
Figura 1: Representación de proteínas
Mdm-2 de A a F.
Figura 2: Gráfica de la transfección de células
Saos-2 con plásmidos que expresan diversas
proteínas Mdm-2.
Figura 3: Representación esquemática de la
inhibición de las propiedades transformantes de Mdm2 por diferentes
p53.
Figura 4: Efecto de una sobreexposición Mdm2
sobre el ciclo celular.
Figura 5: Efecto de una sobreexposición Mdm2
sobre el ciclo celular.
Los métodos clásicamente utilizados en biología
molecular tales como extracciones preparativas de ADN plasmídico,
centrifugación de ADN plasmídico en gradiente de cloruro de cesio,
electroforesis sobre geles de agarosa o de acrilamida, purificación
de fragmentos de ADN por electroelución, extracciones de proteínas
con fenol o con fenol-cloroformo, precipitación de
ADN en medio salino por etanol o isopropanol, transformación en
Escherichia coli, etc....son bien conocidos por el experto y
están abundantemente descritos en la literatura técnica [Maniatis T.
et al., "Molecular Cloning, a Laboratory
Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al., (eds), "Current
Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New
York, 1987].
Para las ligaduras, los fragmentos de ADN pueden
separarse según su tamaño por electroforesis en geles de agarosa o
de acrilamida, extractos con fenol o por una mezcla
fenol/cloroformo, precipitados con etanol después incubados en
presencia de la ADN ligasa del fago T4 (Biolabs) según las
recomendaciones del proveedor.
La inserción de nucleótidos en los extremos 5'
prominentes puede efectuarse por el fragmento de Klenow de la ADN
Polimerasa I de E. coli (Biolabs) según las especificaciones
del proveedor. La destrucción de los extremos 3' prominentes se
efectúa en presencia de la ADN Polimerasa del fago T4 (Biolabs)
utilizado según las recomendaciones del fabricante. La destrucción
de los extremos 5' prominentes se efectúa por un tratamiento
dirigido por la nucleasa S1.
La mutagénesis dirigida in vitro por
oligodeoxynucleótidos sintéticos puede efectuarse según el método
desarrollado por Taylor et al., [Nucleic Acids Res.
13 (1985) 8749-8764 ] utilizando el
dispositivo de ensayo distribuido por Amersham.
La amplificación enzimática de fragmentos de ADN
por la técnica llamada de PCR
[Polymérase-catalyzed-Chain-Reaction,
Saiki R.K. et al., Science 230 (1985)
1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym.
155 (1987) 335- 350] puede efectuarse utilizando un "DNA
thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) según las especificaciones
del fabricante. La amplificación de ADN genómico se realiza más
particularmente en las condiciones siguientes: 5 minutos a 100º C,
30 ciclos de un minuto a 95º C, 2 minutos a 58º C después 3 minutos
a 72º C por medio de sondas apropiadas. Los productos de
amplificación son analizados por electroforesis sobre gel.
La verificación de las secuencias nucleotídicas
puede efectuarse por el método desarrollado por Sanger et
al., [Proc Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1997) 5463- 5467]
utilizando el dispositivo de ensayo distribuido por Amersham.
- plásmido pBKCMV está comercializado por
Stratagéne y contiene el gen de resistencia a la neomicina.
- plásmidos pC53C1N3 y p53-4.2.
N3 que codifican respectivamente p53 salvaje y p53 R273H que
provienen de A. Levine (Hinds et al., Cell Growth and
Diff. (1990), 1, 571).
- plásmido pBKp53 (R273H) que contiene el minigen
humano p53. Ha sido obtenido a partir de
pC53-4.2.N3.
- plásmido pBKMdm2 ha sido obtenido por clonaje
en pBKCMV de una casete codificante que consiste en la región no
traducida del extremo de la secuencia que codifica la \beta
globina seguida de la secuencia que codifica mdm2.
- plásmido pGKhygro expresa el gen de resistencia
a la higromicina (Nature (1990) 348,
649-651).
- plásmido pCMVNeoBam que permite la expresión
del gen de resistencia a la neomicina (Hinds et al., (1990)
Cell. Growth and Diff., 1, 571-580).
- plásmidos pCMVp107 y pCMVCD20 que permiten la
expresión de la proteína p107 y del marcador de superficie CD20 (Zhu
et al., (1993) Genes and Development, 7,
1111-1125).
- plásmidos pCMVE2F-4 y
pCMVE2F-5 que permiten la expresión de las proteínas
E2F-4 y E2F-5 (Sardet et al.,
(1995) Proc. Natl. Acad. SC., 92, 2403- 2407).
- plásmidos pLex A, pLexA (6-41),
pLexA (16-25) que permiten la expresión del dominio
de fijación al ADN de Lex A (aa 1 a 87) libre o fusionado en fase
con p53 (6-41) o p53 (16-25). pLexA
(6-41) y pLexA (16-25) han sido
obtenidos a partir del plásmido pLexApolyII construido por LGME
(Strasbourg).
- plásmidos de expresión eucariota de p107: p107
(385-1068), p107 (1-781) y p107
(781-1068) (Zhu et al., EMBO J. 14 (1995)
1904).
- plásmido pSGK1HAp107 permite la expresión in
vitro e in vivo de p107. p107 está en el contexto de una
secuencia Kozak y el epítopo HA está expresado en fusión con el
extremo C-terminal de p107.
- plásmidos pBC-MDM2 y
pBC-MDM2 (1-134) han sido obtenidos
por clonaje de MDM2 y MDM2 (1-134) en pBC (Chatton
et al., Biotechniques 18 (1995) 142).
- plásmidos pGex-MDM2 y
pGex-MDM2 (1-177) han sido obtenidos
por clonaje de MDM2 y MDM2 (1-177) en pGex.
La expresión de p53 está determinada por Western
Blotting sobre el extracto celular entero con la ayuda de un
anticuerpo monoclonal D01.
La expresión del ARNm que codifica la proteína
Mdm2 está estimada por RT-PCR semi
cuantitativa.
La ausencia de contaminación del ADN está
verificada por PCR.
Células Saos-2 se transfectaron
bien sea con un plásmido pBKMDM2, un plásmido testigo pBKp53 (R273H)
o un plásmido testigo en p53 negativo pBKCMV, después se
seleccionaron para la resistencia a la Geneticina 418 (G418).
En un primer ensayo, los clones se seleccionaron
individualmente y se propagaron mientras que en los 2 otros ensayos,
los clones no aislados se pusieron en cultivo en un medio agar
semi-sólido.
Para esto, 10^{4} células se sembraron en
duplicado en 0,375% de agar semi- sólido. Después de 24 horas, se
determinó el número total de colonias con más de 50 células así
como el número de células por colonia (tamaño de las colonias). Cada
valor dado corresponde a una media de cuatro experiencias
realizadas en doble. Los resultados obtenidos se presentan en la
tabla I. Los clones en el ensayo nº1 correspondientes a mdm2 se
identificaron bajo M1 a M6, los de p53 (R273H) bajo
p53-1 a p53-6 y los del testigo bajo
Co1 a Co5.
Como se esperaba, Co1 y Co4 no expresaron el mdm2
transfectado y Co 1-3 la proteína p53.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Células Saos-2 se transfectaron
bien sea con plásmidos pBKCMV que expresan a la vez resistencia neo
y las proteínas mdm-2 de A a F descritas en la
figura 1, bien sea un plásmido testigo pBKCMV vacío, después
seleccionados para la resistencia a la G418. Las células
supervivientes se reagruparon, se amplificaron después se ensayaron
para la formación de colonias en agar semi-sólido.
Los resultados de la figura 2 se expresaron en número de clones
formados en agar semi-sólido relativo a aquel con
mdm-2 entero (A). Estos resultados proceden de dos
experiencias representativas de transfección independientes en las
cuales entre 3 y 7 muestras de células diferentes se ensayaron,
siguiendo la construcción. Muestran claramente que el dominio
N-terminal de mdm- 2 posee propiedades oncogénicas.
La construcción más eficaz corresponde a la proteína entera.
Un lote de células Saos-2 se
transformaron por Mdm-2 se
co-transfectaron con el plásmido pGKhygro y bien sea
pC53C1N3 (p53) pC53-4.2N3 p53
(R(273)H, p53 (1- 52), pLexA (6-41),
pLexA (16-25), pLexA, p53 (L14Q,F19S), p53
(L22Q,W23S), bien sea pCMVNeoBam, después se seleccionaron para la
resistencia a la higromicina en presencia de G418. 100000 células
que provenían de 3 a 5 muestras independientes de células
resistentes se sembraron en duplicado en agar
semi-sólido (0,375%). Después de 25 días de
cultivo, las colonias que contenían al menos 50 células se
contaron. La figura 3 presenta los resultados de una experiencia
representativa y da una representación esquemática de las diferentes
p53 ensayadas para inhibir las propiedades transformantes de
Mdm-2. Resulta de esta experiencia que solo las
construcciones que permiten la expresión de proteínas capaces de
unirse a la proteína mdm-2, en este caso p53, p53
R273H, p53 (1-52), LexA (6-41), Lex
(16-25) inhiben las propiedades oncogénicas de
Mdm-2. En cambio, los dobles mutantes que se ha
demostrado han perdido la capacidad de enlace a
mdm-2 (Lin et al., Gene Dev., 1994, 8, 1235-
1246) no tienen efecto inhibidor. El hecho de que el mutante p53
(14-19) que ha conservado las propiedades
activadoras de la transcripción de la p53 salvaje no inhiba la
transformación por Mdm-2 confirma que las
propiedades oncogénicas de Mdm-2 son independientes
de la inhibición por Mdm-2 de las propiedades
activadoras de la transcripción de p53.
Células Saos-2 se
co-transfectaron con tres tipos de plásmidos, (i) un
plásmido para la expresión de CD-20 (pCMVCD20, 2
\mug, que codifica el marcador de superficie celular
CD-20), (ii) un plásmido (9 \mug) de expresión de
tipo CMV (promotor del citomegalovirus) sin secuencia codificante o
que codifica Mdm-2 (PBKCMVMdm2), el dominio
1-134 de Mdm-2 (PBKCMVMdm2
(1-134)), E2F-4 o
E2F-5 (pCMVE2F-4,
pCMVE2F-5), y (iii) un vector de expresión de p107
(pCMVp107, 9 \mug). A continuación las células se trataron para
el análisis por FACScan (como ha sido descrito por Zhu et
al., Gene Dev., 1993, 7, 1111-1125). Los
resultados de una experiencia representativa se representaron en la
figura 4. Demuestra claramente que en ausencia de p107
sobreexpresado, la expresión de Mdm-2 o de su
dominio 1-134 no tiene efecto sobre el ciclo
celular. En cambio, la expresión de Mdm-2 y, con una
eficacia, su dominio 1-134 es capaz de inhibir la
parada del ciclo celular en G1 inducido por 107. Este ejemplo
demuestra claramente que Mdm-2 no es solo un
inhibidor de la actividad activadora de la transcripción de p53,
sino que es también un regulador positivo del ciclo celular capaz
de inhibir factores implicados en el control de éste.
En una experiencia similar, células
Saos-2 se co-transfectaron con 1
\mug de p107 (385-1068), 8 \mug de pCMVNéoBam, 1
\mug de pXJMDM2, 8 \mug de pXJ41 y 2 \mug de pCMVCD20. Los
resultados de una experiencia representativa están indicados en la
figura 5. Muestran que la expresión de MDM2 puede inhibir el bloqueo
en G1 inducido por p107 y por el mutante de deleción p107
(385-1068) que es capaz de interactuar con MDM2.
Este ejemplo demuestra una interacción física
entre MDM2 y p107, in vitro como in vivo. Estos
resultados están correlacionados con la actividad de MDM2 a nivel
del ciclo celular (ejemplo 4).
p107 marcado con S35 in vitro se puso en
contacto con la proteína GST-MDM2 (vector
pGex-MDM2) o GST-MDM2
(1-177) (vector pGex-MDM2
(1-177)) inmovilizado sobre bolas de glutation
sefarosa. P107 unido a MDM2 se reveló después con gel de
poliacrilamida por autorradiografía. Los resultados obtenidos se
presentan en la Tabla II a continuación.
Células Cos se co-transfectaron
con un plásmido pBC-MDM2 o pBC-MDM2
(1-134) que expresan una proteína de fusión
GST-MDM2 o GST-MDM2
(1-134), con un plásmido de expresión de p107 o de
un mutante de p107. Los complejos de proteínas
GST-DM2- p107 que provienen de extractos celulares
totales se aislaron sobre bolas de glutation sefarosa y las
proteínas p107 se revelaron por Western blot con un anticuerpo
policlonal anti-p107 (Santa Cruz
p107-C18). Los resultados obtenidos se presentan en
la Tabla II a continuación.
| p107 | p107(385-1068) | p107(1-781) | p107(385-1068) | |
| In Vivo | ||||
| GST-MDM2 | + | + | + | + |
| GST-MDM2(1-134) | + | nd | nd | nd |
| In Vitro | ||||
| GST-MDM2 | + | nd | nd | nd |
| GST-MDM2(1-177) | + | nd | nd | nd |
Los resultados demuestran que hay una interacción
proteína- proteína entre MDM2 y p107 in vitro, pero también
en la célula. La región de MDM2 necesaria para la transformación
celular (1-134) es la región que interactua con
p107. Esta región ha sido localizada como estando situada más
precisamente en una parte del "pocket domain", región "A"
y el "spacer".
(1) INFORMACIONES GENERALES:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: RHONE POULENC RORER S.A.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 20, Avenue Raymond Aron
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: ANTONY
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAIS: FRANCIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 92165
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 40916922
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- FAX: (1) 40917296
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM)
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 101, Rue de Tolbiac
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: PARIS Cedex 13
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAIS: FRANCIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 75654
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 44236061
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- FAX: 45856856
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ANTAGONISTAS DE LA ACTIVIDAD ONCOGÉNICA DE LA PROTEÍNA MDM2 Y SU UTILIZACIÓN EN EL TRATAMIENTO DE CÁNCERES
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DESCIFRABLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Cinta
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA DE EXPLOTACIÓN: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release # 1.0, Version 1.30 (OEB)
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC ID Nº1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1476 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/LLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: 1...1476
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID Nº1:
\vskip0.666000\baselineskip
(3) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID Nº: 2
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1182 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/LLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: 1...1182
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:SEQ ID Nº2:
Claims (23)
1. Utilización de un compuesto capaz de
antagonizar al menos parcialmente la actividad oncogénica de la
proteína Mdm2 para la preparación de una composición farmacéutica
destinada al tratamiento de cánceres en un contexto sin proteínas
p53.
2. Utilización según la reivindicación 1 de un
compuesto capaz de unirse a nivel del dominio 1-134
de la secuencia de la proteína Mdm2 representada en SEQ ID Nº1.
3. Utilización según una de las reivindicaciones
1 ó 2, caracterizada porque el compuesto es un scFV dirigido
contra el dominio 1-134 de dicha proteína Mdm2.
4. Utilización según una de las reivindicaciones
1 ó 2, caracterizada porque el compuesto está representado
en todo o parte por uno de los péptidos 1-52,
1-41, 6-41, 16-25,
18-23 de la secuencia representada en SEQ ID Nº2 o
de sus derivados.
5. Utilización según la reivindicación 1 de un
compuesto capaz de unirse a un dominio vecino del dominio
1-134 representado en SEQ ID Nº1 de la proteína Mdm2
y que afecta parte de esta unión la actividad oncogénica de dicha
proteína.
6. Utilización según la reivindicación 1 ó 5,
caracterizada porque el compuesto interactúa con el dominio
C terminal de la proteína Mdm2.
7. Utilización según la reivindicación 1, 5 ó 6,
caracterizada porque se trata de un factor transcripcional
elegido entre TFII, TBP y TAF250.
8. Utilización según la reivindicación 1 ó 5,
caracterizada porque el compuesto interactúa con el dominio
135-491 de la proteína Mdm2.
9. Utilización según la reivindicación 1, 5 u 8,
caracterizada porque se trata en todo o parte de una
proteína elegida entre las proteínas Rb, L5 y el factor
transcripcional E2F.
10. Utilización de un scFV dirigido contra el
dominio 1-134 de la proteína Mdm2 para la
preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento
de cánceres.
11. Utilización de un ácido nucleico que codifica
un compuesto capaz de antagonizar la actividad oncogénica de la
proteína Mdm2 para la preparación de una composición farmacéutica
destinada al tratamiento de cánceres en un contexto sin proteínas
p53.
12. Utilización según la reivindicación 11,
caracterizada porque se trata de:
- ácidos nucleicos antisentido,
- oligonucleótidos ligandos capaces de fijar
directamente uno de los dominios de la proteína Mdm2 y de inhibir su
actividad oncogénica,
- ácidos nucleicos que codifican en todo o parte
péptidos o proteínas capaces de oligomerizarse con uno de los
dominios de Mdm2 y de inhibir su actividad oncogénica, y
- ácidos nucleicos que codifican anticuerpos
intracelulares dirigidos contra el dominio 1-134 de
la secuencia de la proteína Mdm2 representada en SEQ ID Nº1.
13. Utilización según la reivindicación 12,
caracterizada porque el ácido nucleico antisentido es un ADN
que codifica un ARN complementario del ácido nucleico que codifica
la proteína Mdm2 y capaz de bloquear su transcripción y/o su
traducción (ARN antisentido) o un ribosoma.
14. Utilización según una de las reivindicaciones
11 a 13, caracterizada porque el ácido nucleico se utiliza
bajo forma complejada con DEAE-dextrano, con
proteínas nucleares, o con lípidos o polímeros catiónicos, bajo
forma de liposomas o también tal cual.
15. Utilización según una de las reivindicaciones
11 a 13, caracterizada porque el ácido nucleico forma parte
de un vector.
16. Utilización según la reivindicación 15,
caracterizada porque el ácido nucleico forma parte de un
vector viral, elegido entre adenovirus, retrovirus y virus
adeno-asociados.
\newpage
17. Vector viral caracterizado porque la
secuencia de ácidos nucleicos codifica un scFV capaz de interactuar
a nivel del dominio 1-134 (SEQ ID Nº 1) de la
proteína Mdm2.
18. Vector viral según la reivindicación 17,
caracterizado porque se elige entre adenovirus, retrovirus y
virus adeno-asociados.
19. Vector viral según las reivindicaciones 17 y
18, caracterizado porque se trata de un adenovirus o de un
retrovirus.
20. Composición farmacéutica que comprende un
vector que comprende un ácido nucleico que codifica un scFv capaz de
interactuar a nivel del dominio 1- 134 (SEQ ID Nº1) de la proteína
Mdm2.
21. Composición farmacéutica según la
reivindicación 20, caracterizada porque el vector es un
vector plasmídico o un vector viral elegido entre adenovirus,
retrovirus o adenovirus asociados.
22. Composición según la reivindicación 21
formulada en vista de una administración
intra-tumoral.
23. Utilización de una secuencia nucleica que
codifica anticuerpos intracelulares, dirigidos contra el dominio
1-134 (SEQ ID Nº1) de la proteína Mdm2 para la
preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento
del cáncer.
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