MXPA98002924A - Aplicacion de la proteina gax para el tratamientode los canceres - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la utilización terapéutica, especialmente para el tratamiento del cáncer, deácido nucleico que codifica la totalidad o parte de la proteína GAX, o de una variante de la misma.

Description

APLICACIÓN DE LA PROTEINA GAX PARA EL TRATAMIENTO DE LOS CÁNCERES La presente invención concierne a un nuevo método para el tratamiento de los cánceres. Más particularmente, concierne a un método para el tratamiento de los cánceres por medio de la suspensión de la proliferación celular que puede encontrarse alterada en las células que expresan un oncogene, como el gene ras mutado, o que son deficientes en un gene supresor del tumor, tal como el ?53. También concierne, igualmente, al uso de vectores para la terapia génica, que permiten regular éstos, asi como a composiciones farmacéuticas que los contienen. Los productos de los genes ras, generalmente designados proteínas ?21, juegan un papel clave en el control de la división celular en todos los organismos eucariót icos , donde son investigados. Ciertas modificaciones especificas de estas proteínas les hacen perder su control normal y las conducen a volverse oncogénicas. Asi, un gran número de tumores humanos está asociado con la presencia de genes ras modificados. De igual modo, una supresión de estas proteínas ?21 puede conducir a una alteración de la proliferación celular. En un contexto celular normal, esta proliferación de los oncogenes es probablemente contrarrestada, al menos en parte, por la generación de genes llamados supresores de los tumores, como el p53 y R . Se sabe asi que la REP: 27017 proteina p53, al menos en su forma silvestre, es un factor de transcripción que regula de manera negativa el crecimiento y la división celular y que, en ciertas situaciones, es capaz de inducir la apoptosis (Yonish-Rouach et al., Nature, 352, 345-347, 1991) . Estas propiedades se manifiestan en situaciones de tensión donde la integridad del ADN celular se ve amenazada, se ha sugerido que p53 es un "guardián del genoma". Sin embargo, ciertos fenómenos pueden perturbar este mecanismo de autorregulación celular y favorecer, entonces, el desarrollo de un estado neoplástico. Uno de estos eventos consiste en las mutaciones al nivel de los genes supresores de los tumores. Es asi que las formas inactivas del gene Rb han sido colocadas como la causa de diferentes tumores, y especialmente en los retinoblas tomas o en los cánceres mesenquimat osos , como los os teosar comas , y que se ha notado la presencia de p53 mutados en aproximadamente un 40% de los tumores humanos, todos los tipos confundidos (para revisiones, ver Montenarth, Oncogene, 7, 1673-1680, 1992; Oren, FASEB J., 6, 3169-3176, 1992; Zambetti y Levine, FASEB J., 7, 855-865, 1993) . Como consecuencia, la evidencia de compuestos biológicos susceptibles de interferir en contra de este tipo de alteración de la proliferación celular y/o de reemplazar este tipo de deficiencia en los genes supresores de los tumores es, en consecuencia, de un interés principal en la aproximación de la terapéutica para la canee rogénesis . La presente invención resulta precisamente, en parte, de la evidencia que la proteina GAX constituye un inhibidor potencial de la proliferación celular inducida por las proteínas ras. Esto resulta, en particular, de la evidencia de que una proliferación celular alterada, en las células tumorales, puede ser restablecida expresando la proteina GAX. La proteina GAX es una proteina de 303 aminoácidos. Su secuencia ha sido caracterizada y su ADNc ha sido clonado (Gorski et al., Mol. Cell. Biol., 1993, 6, 3722-3733) . El gene gax (gro th arrest specific homeobox homeocaja especifica para detener el crecimiento) pertenece a la familia de los genes homeóticos. Estos genes codifican los factores de transcripción que contienen las secuencias de consenso (u homeodomini os ) que reconocen regiones especificas del ADN (u homeocajas) (revisión: Gehring et al., Cell, 78: 211-223, 1994) , El ho eodominio de la proteina gax de la rata está comprendido entre los aminoácidos 185 y 245. Este gene posee ciertas propiedades similares a las de los genes gas y Gadd, ya que parece que también controla la transición G0/G1 del ciclo celular. Así, los niveles del ARNm de gax son reducidos en las CMLV de la rata en un factor de 10, después de dos horas de exposición al PDGF (Gorski et al., Mol. Cell. Biol., 1993, 6, 3722-3733) . Entonces, la expresión del gene gax es reprimida en el curso de la respuesta mitogénica de las CMLV. Estas observaciones tienen su contraparte i n vi vo debido a que, en la rata, la hiperplasia de la íntima, provocada por el desgaste de la carótida, está asociada con una fuerte disminución de la expresión de gax (Weir et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 5457-5461). La expresión del gene gax ha puesto en evidencia, en el sistema cardiovascular, especialmente el corazón y la aorta, y hasta ahora, el uso en terapia génica de este gene estaba limitado al nivel de estas células, la expresora, naturalmente. De manera inesperada, la solicitante ha descubierto que es posible valorar ventajosamente una actividad inhibidora de la proteína GAX con respecto a la proliferación celular en las células tumorales, es decir, las células que no expresan el gene gax de manera endógena . La presente invención ofrece, así, una nueva aproximación, particularmente eficaz, para el tratamiento de los tumores asociados con una alteración de la proliferación celular, como los tumores del pulmón, no con células pequeñas, los carcinomas pancreáticos y cólicos, los os teos arcomas , etc.

La presente invención describe igualmente sistemas particularmente eficaces para la liberación i n vi vo , directamente en los tumores, de estos compuestos y así luchar contra el desarrollo de los cánceres. Un primer objetivo de la invención reside encintes en la utilización de la proteína GAX, o una variante de ésta, para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de los cánceres. Más precisamente, se refiere a la utilización de al menos una secuencia nucleica que codifica la totalidad o parte de la proteína GAX, o de una variante de la misma, para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de los cánceres. Como se indicó anteriormente, se puede tratar de un gene que codifique la totalidad o parte de la proteína GAX, o de una variante de la misma. En el sentido de la presente invención, el término variante designa a cualquier mutante, fragmento o péptido que posee al menos una propiedad biológica de GAX, así como a cualquier homólogo de GAX obtenido a partir de otras especies. Estos fragmentos y variantes pueden ser obtenidos mediante cualquier técnica conocida por el entrenado en la técnica y especialmente por modificaciones genéticas y/o químicas y/o enzimáticas, o aún por hibridación o por clonación por expresión, lo cual permite la selección de variantes en función de su actividad biológica. Las modificaciones genéticas incluyen las supresiones, deleciones, mutaciones, etc. La secuencia nucleica que se aplica puede codificar la totalidad o parte de la proteína GAX de la rata o una de sus variantes. El gene utilizado en el sentido de la invención es preferiblemente el gene que codifica la proteína GAX de la rata o de su homólogo humano. Se trata, más preferiblemente, de un ADNc o de un ADNg . La secuencia nucleica reclamada puede ser inyectada tal cual a nivel del sitio que se va a tratar, o incubarse directamente con las células que se van a destruir o a tratar. En efecto, se ha descrito que los ácidos nucleicos desnudos pueden penetrar en las células sin un vector particular. Sin embargo, se prefiere, en el marco de la presente invención, utilizar un vector de administración, permitiendo mejorar (i) la eficacia de la penetración celular, (ii) la orientación hacia el blanco, (iii) la estabilidad extra- e int ra-celulares . Pueden emplearse diferentes tipos de vectores. Puede tratarse de vectores virales o no virales. El vector, según la invención, puede ser, así, un agente no viral capaz de promover la trasferencia y la expresión de la secuencia nucleica en las células procariotas o eucariotas. Los vectores químicos o bioquímicos representan una alternativa interesante a los virus naturales, en particular por razones de comodidad, de seguridad e igualmente por la ausencia de límite teórico en lo que concierne al tamaño del ADN que se va a t rans fectar . Estos vectores sintéticos tienen dos funciones principales, compactar el ácido nucleico que se va a transfectar y promover su fijación celular, así como su paso a través de la membrana plasmática y, llegado el caso, las dos membranas nucleares. Para contrarres ar la naturaleza polianiónica de los ácidos nucleicos, los vectores no virales poseen cargas pol i cat ióni cas . Entre los vectores sintéticos desarrollados, los polímeros catiónicos del tipo de la polilisina, (LKLK)n, (LKLK)n, polietilen i ina y DEAE dextran, o aún los lípidos catiónicos o 1 ipofect antes , son los más ventajosos. Poseen la propiedad de condensar el ADN y de promover su asociación con la membrana celular. Entre estos últimos, se pueden citar las 1 ipopo 1 iaminas ( 1 ipofectamina , transfectam, etc.) o liposomas. Más recientemente, se ha desarrollado el concepto de la transfección dirigida, mediada por un receptor, que aprovecha el principio de condensar el ADN gracias al polímero catiónico que dirige la fijación del complejo a la membrana, gracias a un acoplamiento químico entre el polímero catiónico y el ligando de un receptor de la membrana, presente en la superficie del tipo celular que se quiere injertar. La orientación hacia el blanco del receptor de la t ransferrina , de la insulina o del receptor de las as ial ogl i coprot eí ñas de los hepatocitos ya ha sido descrita. La secuencia nucleica utilizada en la presente invención puede ser formulada para su administración por vía tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraocular, transdérmica, etc. De preferencia, se utiliza en forma inyectable. Puede entonces ser mezclada con cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable para una formulación inyectable, especialmente para una inyección directa al nivel del sitio que se va a tratar. Puede tratarse, en particular, de soluciones estériles, isotónicas, o de composiciones secas, especialmente liofilizadas, que, por la adición, según el caso, de agua estéril o de suero fisiológico, permite la constitución de soluciones inyectables. Una inyección directa de la secuencia nucleica en el tumor del paciente es interesante porque permite concentrar el efecto terapéutico a nivel de los tejidos afectados. Las dosis utilizadas de la secuencia nucleica pueden ser adaptadas en función de diferentes parámetros y especialmente en función del vector, del modo de administración utilizado, de la patología en tratamiento o, todavía, de la duración del tratamiento buscado .

Para la aplicación de la presente invención, es particularmente ventajoso utilizar un virus recombinante defectuoso. Así, es posible utilizar los adenovirus, los virus del herpes, los retrovirus y, más recientemente, los virus adeno asociados. Estos vectores han demostrado ser particularmente eficaces en el plano de la transfección.

La presente invención tiene, entonces, como segundo objetivo, la utilización de un virus recombinante, defectuoso, que contenga al menos un gene insertado que codifique la totalidad o parte de la proteína GAX, o de una variante de esta. La invención reside igualmente en la utilización de un virus de este tipo para el tratamiento de los cánceres. En los vectores de la invención, el gene insertado y/o presente puede ser un fragmento de ADN complementario (ADNc), de ADN genómico (ADNg), o una construcción híbrida que consiste, por ejemplo, de un ADNc en el cual serán insertados uno o más intrones. También puede tratarse de secuencias sintéticas o semi s inte ti cas . Generalmente, el gene insertado comprende igualmente secuencias que permiten su expresión en la célula infectada. Puede tratarse de secuencias que son naturalmente responsables de la expresión del mencionado gene cuando estas secuencias son susceptibles de funcionar en la célula infectada. Puede tratarse también de secuencias de origen diferente (responsables de la expresión de otras proteínas, o igualmente, sintéticas) . Especialmente, puede tratarse de secuencias de genes eucarióticos o virales o de secuencias derivadas, que estimulan o que reprimen la transcripción de un gene de manera específica, o no, y de forma inducible, o no. Como ejemplo, se puede tratar de secuencias promotoras extraídas del genoma de la célula que se desea infectar, o del genoma de un virus, y especialmente, los promotores de los genes E1A, MLP del adenovirus, el promotor CMV, LTR-RSV, etc. Entre los promotores eucarióticos se puede citar igualmente los promotores ubiquitarios (HPRT, vimentina, actina, tubulina, etc.), los promotores de los filamentos intermedios (desmina, neurof i lamentos , queratina, GFAP, etc.), los promotores de los genes terapéuticos (tipo MDR, CFTR, factor VIII, etc.), los promotores específicos de los tejidos (promotor de la actina de las células del músculo liso), los promotores que se encuentran preferentemente activos en las células en división, o todavía los promotores que responden e un estímulo (receptor de las hormonas esteroides, receptor del ácido retinóico, etc.) . Además, estas secuencias de expresión pueden ser modificadas por la adición de secuencias de activación, de regulación, etc. Por otro lado, cuando el gene insertado no comprende secuencias de expresión, puede ser insertado en el genoma del virus defectuoso, río abajo de una secuencia de este tipo. Por otro lado, el gene insertado comprende generalmente, río arriba de la secuencia codificadora, una secuencia señal que dirige el polipéptido sintetizado en las vías de secreción de la célula blanco. Esta secuencia señal puede ser la secuencia señal natural de GAX, pero puede tratarse igualmente de cualquier otra secuencia señal funcional (la del gene de la quinasa de timidina, por ejemplo), o de una secuencia señal artificial . Los virus, según la presente invención, son defectuosos, es decir, incapaces de replicarse de forma autónoma en la célula blanco. Generalmente, el genoma de los virus defectuosos utilizados en el marco del la presente invención se encuentra, entonces, desprovisto de al menos las secuencias necesarias para la replicación del virus en la célula infectada. Estas regiones pueden ser eliminadas (en su totalidad o en parte), volverse no funcionales, ser sustituidos por otras secuencias y especialmente por el gene insertado. Preferiblemente, el virus defectuoso conserva, sin embargo, las secuencias de su genoma que son necesarias para la encapsulación de las partículas virales. Existen diferentes serotipos de adenovirus cuya estructura y propiedades varían un poco. Entre estos serotipos, se prefiere utilizar, en el marco de la presente invención, los adenovirus humanos del tipo 2 o 5 (Ad 2 o Ad5) o los adenovirus de origen animal (ver solicitud W094/26914) . Entre los adenovirus de origen animal, que pueden utilizarse en el marco de la presente invención, se pueden citar los adenovirus de origen canino, bovino, murino (ejemplo: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990), 81), ovino, porcino, aviar, o todavía, símico (ejemplo: SAV) . De preferencia, el adenovirus de origen animal es un adenovirus canino, más preferiblemente, un adenovirus CAV2 [cepa manhattan o A26/61 (ATCC VR-800), por ejemplo] . De preferencia, en el marco de la invención, se utilizan los adenovirus de origen humano o canino, o mixto. Preferiblemente, los adenovirus defectuosos de la invención comprenden los ITR, una secuencia que permite la encapsulación y el ácido nucleico de interés. Todavía más preferiblemente, en el genoma de los adenovirus de la invención, la región El, al menos, es no funcional. El gene viral considerado puede volverse no funcional por medio de cualquier técnica conocida por el entrenado en la técnica y especialmente por medio de supresión total, sustitución, deleción parcial, o adición de una o varias bases en el, o en los, gene (s) cons iderado ( s ) . Estas modificaciones pueden obtenerse i n vi t ro (sobre el ADN aislado) o i n s i t u , por ejemplo, por medio de las técnicas de ingeniería genética, o todavía, por medio de tratamiento con el uso de agentes mutagénicos. También pueden modificarse otras regiones, y especialmente la región E3 ( W095 / 02697 ) , E2 ( 094 /28938 ) , E4 (W094/28152, W094/12649, WO95/02697) y L5 ( W0 5 / 02697 ) . Según una modalidad preferida de aplicación, el adenovirus, según la invención, comprende una deleción en las regiones El y E4. Según otra modalidad de realización preferida, comprende una deleción en la región El, al nivel de la cual se inserta la región E4 y la secuencia que codifica GAX (CfFR94 13355) . En el virus de la invención, la deleción en la región El se extiende preferiblemente de los nucleótidos 455 a 3329, sobre la secuencia del adenovirus Ad5. Los adenovirus recombinantes , defectuosos, de acuerdo con la invención, pueden ser preparados por medio de cualquier técnica conocida por el entrenado en la técnica (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particular, pueden ser preparados mediante recombmación homologa entre un adenovirus y un plásmido que porta, entre otras, la secuencia del ADN de interés. La recombmación homologa se produce después de la cotrans fección de los adenovirus y del plásmido en una línea celular adecuada. La línea celular utilizada debe, de preferencia, (i) tener la capacidad de ser transformada por estos elementos, y (n) comprender las secuencias capaces de complementar la parte del genoma del adenovirus defectuoso, de preferencia en forma integrada para evitar los riesgos de recombinación. Como ejemplo de línea, se puede mencionar la línea embrionaria del riñon humano 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) que contiene, especialmente, integrado en su genoma, la parte izquierda del genoma de un adenovirus Ad5 (12%) o de las líneas capaces de complementar las funciones El y E4, tales como se describen especialmente en las solicitudes Nos. WO 94/26914 y WO 95/02697. Enseguida, los adenovirus que son multiplicados son recuperados y purificados según las técnicas clásicas de biología molecular. En lo que concierne a los virus adeno asociados (AAV), se trata de virus con ADN de tamaño relativamente reducido, que se integran en el genoma de las células que infectan, de manera estable y sitio específica. Son capaces de infectar un amplio espectro de células, sin inducir efecto sobre el crecimiento, la morfología o la diferenciación celulares. Por otro lado, no parecen implicados en las patologías en el ser humano. El genoma de los AAV ha sido clonado, secuenciado y caracterizado. Comprende aproximadamente 4700 bases y contiene, en cada extremo, una región repetida inversa (ITR) de aproximadamente 145 bases, que sirven de origen de la replicación para el virus. El resto del genoma es dividido en 2 regiones esenciales que llevan la función de encapsulación: la parte izquierda del genoma, que contiene el gene rep, implicado en la replicación viral y la expresión de los genes virales; la parte derecha del genoma, que contiene el gene cap, que codifica las proteínas de la cápside del virus. La utilización de los vectores derivados de los AAV para la transferencia de genes i n vi t ro e i n vi vo ya ha sido descrita en la literatura (ver especialmente WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368; US 5,139,941; EP 488 528) . Estas solicitudes describen diferentes construcciones derivadas de los AAV, en las cuales los genes rep y/o cap son omitidos (por deleción) y reemplazados por un gene de interés, y su utilización para transferir i n vi t ro (sobre las células en cultivo) o i n vi vo (directamente en un organismo) el gene de interés. Los AAV recombinante s defectuosos, según la invención, pueden ser preparados por medio de co-transfección, en una línea celular infectada por un virus auxiliar humano (por ejemplo, un adenovirus), de un plásmido que contiene la secuencia nucleica de interés, rodeada de dos regiones repetidas inversas (ITR) del AAV, y de un plásmido que lleva los genes de encapsulación (genes rep y cap) del AAV. Los AAV recombinantes producidos son purificados enseguida por las técnicas clásicas. La invención concierne, entonces, igualmente a un virus recombinante derivado de los AAV cuyo genoma comprende una secuencia que codifica la GAX, rodeado de las ITR del AAV. La invención concierne igualmente a un plásmido que comprende una secuencia que codifica la GAX rodeado por dos ITR de un AAV. Un Plásmido de este tipo puede ser utilizado tal cual para transferir la secuencia de GAX, eventualmente incorporado en un vector liposomal (pseudo-vi rus ) . Concerniendo a los retrovirus, la construcción de vectores recombinantes ha sido descrita igualmente en a literatura: ver especialmente EP 453242, EP 178220, Bernstein et al., Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particular, los retrovirus son virus que pueden integrarse, que infectan las células en división. El genoma de los retrovirus comprende esencialmente dos LTR, una secuencia de encapsulación y tres regiones que codifican (gag, pol y env) . En los vectores recombinantes derivados de los retrovirus, los genes gag, pol y env son generalmente omitidos (por deleción), en su totalidad o en parte, y reemplazados por una secuencia de ácido nucleico heterólogo de interés. Estos vectores pueden ser obtenidos a partir de diferentes tipos de retrovirus tales como, principalmente, el MoMuLV ("virus de la leucemia de moloney de los murinos"; todavía designada MoMLV) , el MSV ("virus del sarcoma de moloney de los murinos"), el HaSV ("el virus del sarcoma de Harvey"); el SNV ("virus de la necrosis del pulmón"); el RSV ("virus del sarcoma de Rous") ; o, todavía, el virus de Friend. Para construir retrovirus recombinantes que comprendan una secuencia que codifique GAX, según la invención, se construye generalmente un plásmido que comprende especialmente las LTR, la secuencia de encapsulación y la secuencia codificadora, después es utilizado para transfectar una línea celular llamada de encapsulación, capaz de aportar las funciones retrovirales defectuosas en el plásmido. Generalmente, las líneas de encapsulación son entonces capaces de expresar los genes gag, pol y env. Estas líneas de encapsulación han sido descritas en la técnica previa, y especialmente la línea PA317 ( US4 , 861 , 719 ) ; la línea PsiCRIP (WO90/02806) y la línea GP+envAm-12 (WO8907150) . Por otro lado, los retrovirus recombinantes pueden comprender modificaciones a nivel de las LTR, para suprimir la actividad de transcripción, así como las secuencias de encapsulación esperadas, que comprenden una parte del gene gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639) . Los retrovirus recombinantes producidos enseguida son purificados por medio de técnicas clásicas. Para el tratamiento de los cánceres, es muy particularmente ventajoso utilizar un adenovirus recombinante defectuoso. Es posible utilizar cantidades relativamente pequeñas del principio activo (adenovirus recombinante), y permite igualmente una acción eficaz y muy rápida sobre los sitios a tratar. Los adenovirus de la invención son igualmente capaces de expresar, en alto grado, el gene gax introducido, lo cual les confiere una acción terapéutica muy eficaz. Además, en razón de su carácter episomal, los adenovirus de la invención tienen una persistencia limitada en las células prol i fe rat i vas y entonces un efecto transitorio perfectamente adaptado al efecto terapéutico buscado. Las dosis de virus utilizadas para la inyección pueden ser adaptadas en función de diferentes parámetros y especialmente en función del modo de administración utilizado y de la duración del tratamiento buscado. De una manera general, los virus recombinantes, según la invención, son formulados y administrados en forma de dosis comprendidas entre 10" y 1014. Para los AAV y los adenovirus, también pueden utilizarse dosis desde 106 hasta alO10 pfu/mL. El término pfu ("plaque forming unit" "unidad formadora de placa") corresponde con el poder infeccioso de una suspensión de viriones, y es determinado por la infección de un cultivo celular adecuado y la medición, generalmente después de 48 horas, del número de zonas de células infectadas. Las técnicas para la determinación del título de pfu de una solución viral se encuentran bien documentadas en la literatura. La presente invención es utilizada ventajosamente i n vi vo para la destrucción de las células que se encuentran en hipe rprol i f eración (i.e., con proliferación anormal).

Puede aplicarse, así, para la destrucción de las células tumorales. Es particularmente adecuada para el tratamiento de los cánceres en los cuales está implicado un oncogene activado. Como ejemplo, se pueden citar los adenocarcinomas del colon, los cánceres gástricos, los cánceres del esófago, los linfomas B, los cánceres de ovario, los cánceres de la vesícula, los gl ioblas tomas , etc . Además, este tratamiento puede aplicarse tanto al hombre como a cualquier animal tal como los ovinos, bovinos, los animales domésticos (perros, gatos, etc.), los caballos, los peces, etc. La presente invención se describe más completamente con la ayuda de los ejemplos que siguen, los cuales deben ser considerados como ilustrativos y no limitantes.

LEYENDA DE LAS FIGURAS Figura 1: Representación del plásmido pCOl . Figura 2: Representación del plásmido pXL-CMV-GaxHA , Figura 3: Representación del efecto de la expresión del AdCMV gax sobre la proliferación celular en células humanas tumorales H460. Figura 4: Células tumorales H460 tratadas con el adenovirus AdCMV gax, con un M.O.I de 1000 (Figura 4C) . Figura 5: Representación del efecto del AdCMV gax sobre la proliferación celular en las células humanas tumorales de Saos . Figura 6: Representación del efecto de la expresión del AdCMV gax sobre la proliferación celular en las células humanas tumorales H358.

TÉCNICAS GENERALES DE BIOLOGÍA MOLECULAR Los métodos clásicamente utilizados en biología molecular, tales como las extracciones preparativas del ADN plasmídico en gradiente de cloruro de cesio, la electroforésis sobre geles de agarosa o de acrilamida, la purificación de fragmentos de ADN por elect roelución , la extracción de proteínas con fenol o con fenol -cloroformo , la precipitación del ADN en medio salino por medio de etanol o de isopropanol, la transformación en Escherichia coli, etc., son bien conocidos por el entrenado en la técnica y se describen abundantemente en la literatura [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F. M., et al., (eds.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987 ] . Los plásmidos del tipo pBR322, pUC y los fagos de la serie M13 son de origen comercial (Bethesda Research Laboratories ) . Por las uniones, los fragmentos de ADN pueden ser separados según su tamaño, por medio de electroforési s en geles de agarosa o de acrilamida, extraídos con fenol o con una mezcla fenol / cl oroformo , precipitados con etanol, después incubarse en presencia de la ADN ligasa del fago T4 (Biolabs) según las recomendaciones del proveedor. El reemplazo de los extremos 5' prominentes puede ser efectuado por el fragmento de Klenow, de la ADN Polimerasa de E. coli (Biolabs) según las especificaciones del proveedor. La destrucción de los extremos 3' prominentes se efectúa en presencia de la ADN Polimerasa del fago T4 (Biolabs), utilizada según las recomendaciones del fabricante. La destrucción de los extremos 5' prominentes se efectúa por un tratamiento facilitado por la nucleasa SI. La mutagénesis dirigida i n vi t ro por ol igodesoxinucleót idos sintéticos puede ser efectuada según un método desarrollado por Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13_ (1985) 8749-8764] utilizando el kit distribuido por Amersham.

La amplificación enzimática de los fragmentos del ADN por la técnica denominada de PCR [ Polyme rase -catalyzed C_ha i n Reaction, Saiki R.K., et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullís K.B. y Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] puede ser efectuada utilzando un "DNA thermal cycler" ("ciclizador térmico del ADN") (Perkin Elmer Cetus), según las especificaciones del fabri cante . La verificación de las secuencias nucleot í dicas puede ser efectuada por el método desarrollado por Sanger et al. [Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 7_4_ (1977) 5463-5467] utilizando el kit distribuido por Amersham.

EJEMPLO 1: construcción del vector pXL-CMV-GaxHA que lleva el gene que codifica la proteina gax de la rata, bajo el control del promotor CMV. Este ejemplo describe la construcción de un vector que contiene el ADNc que codifica la proteína gax (especie: rata) y las secuencias adenovirales que permiten una recombinación. El epitopo de la hemaglut inina del virus de la influenza (epitopo HAI), que comprende 18 aminoácidos, es adicionado al extremo N-terminal de la proteína gax (Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165, 1988) . Este procedimiento de adición de epitopos permite seguir, especialmente por medio de técnicas de inmunofluorescencia, la expresión de gax con la ayuda de anticuerpos dirigidos contra el epitopo HAI. Además de su sensibilidad, este método permite eliminar el ruido de fondo que corresponde con la expresión de proteínas gax endógenas, tanto i n vi t ro como i n vi vo . 1.1 Construcción del plásmido pCOl (Figura 1) A - Construcción del plásmido pCE El fragmento EcoRI-Xbal, que corresponde con el extremo izquierdo del genoma del adenovirus Ad5, desde un principio ha sido clonado entre los sitios EcoRI y Xbal del vector pIC19H. Esto genera el plásmido pCA. . El plásmido pCA enseguida es cortado por Hinfl, sus extremos 5' prominentes han sido reemplazados por el fragmento de Klenow, de la ADN polimerasa de E. coli, después ha sido cortado por EcoRI . El fragmento que se genera de este modo, del plásmido pCA, que contiene el extremo izquierdo del genoma del adenovirus Ad5, enseguida es clonado entre los sitios EcoRI y Smal, del vector pIC20H (Marsh et al., Gene 3_2_ (1984) 481) . Esto genera el plásmido pCB. El plásmido pCB ha sido cortado enseguida por EcoRI, sus extremos 5' prominentes han sido reemplazados por el fragmento de Klenow, de la ADN polimerasa I, de E. coli, después ha sido cortado por BamHl . El fragmento así generado, del plásmido pCB, que contiene el extremo izquierdo del genoma del adenovirus Ad5, enseguida ha sido clonado entre los sitios NruI y BglII, del vector pIC20H. Esto genera el plásmido pCE del cual una característica interesante es que posee los primeros 382 pares de bases del adenovirus Ad5, seguidos por un multisitio de clonación.

B - Construcción del plásmido pCD' El fragmento Sau3A (3346)-SstI (3645) y el fragmento SstI (3645)-NarI (5519), del genoma del adenovirus Ad5, han sido ligados y clonados, desde un principio entre los sitios Clal y BamHI, del vector pIC20H, lo cual genera el plásmido pPY53. El fragmento Sall-Taql, del plásmido pPY53, preparado a partir de un contexto dam-, que contiene la parte del genoma del adenovirus Ad5, comprende entre los sitios Sau3A (3346) y Taql (5207), ha sido clonado enseguida entre los sitios Salí y Clal, del vector pIC20H, esto genera el plásmido pCA' . El fragmento Taql (5207)-NarI (5519), del genoma del adenovirus Ad5, preparado a partir de un contexto dam- y el fragmento Sall-Taql, del plásmido pCA' has sido ligados y clonados enseguida entre los sitios Salí y NarI, del vector pIC20H. Esto genera el plásmido pCC. El fragmento NarI (5519)-Nru (6316), del genoma del adenovirus Ad5 preparado a partir de un contexto dam- y el fragmento SalI-NarI, del plásmido pCC han sido ligados y clonados enseguida entre los sitios Salí y NruI, del vector pIC20R. Esto genera el plásmido pCD'.

C - Construcción del Plásmido pCOl Una digestión parcial con Xhol, después una digestión completa con Salí, del plásmido pCD' genera un fragmento de restricción que contiene la secuencia del adenovirus Ad5, del sitio Sau3A (3446), en el sitio NruI (6316) . Este fragmento ha sido clonado en el sitio Salí del plásmido pCE . Esto genera el plásmido pCOl (Figura 1), que contiene la parte izquierda del adenovirus Ade5, hasta el sitio Hinfl (382), un sitio múltiple de clonación y el fragmento Sau3A (3446)-NruI (6316) del adenovirus Ad5. 1.2. Construcción del vector pXL-CMV-GaxH? (cf. Figura 2) El ADNc de Gax ha sido clonado entre los sitios Xbal-BamHI del vector pCGN (Tanaka y Herr, Cell 60: 375-386, 1990) . El vector pGCN-Gax resultante, contiene el promotor precoz y la secuencia mejoradora del citomegalovirus (CMV) (-522, +72; Boshart et al., Cell, 41: 521-530, 1985), la secuencia de inicio de la quinasa de timidina, del virus del Herpes simple, incluyendo el codón de iniciación AUG, así como los tres primeros aminoácidos (+55, +104; Rusconi y Yamamoto, EMBO J., 6: 1309-1315, 1987), la secuencia que codifica el epitopo HAI, el ADNc de gax de la rata y finalmente la secuencia de poli adenilación del gene de la ß-globina del conejo (Pabo et al., Cell, 35: 445-453, 1983). El vector pCGN-Gax enseguida es cortado por Xmnl y Sfil, y el fragmento obtenido, que contiene el promotor, el ADNc y la secuencia de pol iadeni lación , previamente tratado con el secuencia de Klenow, ha sido introducido en el sitio EcoRV del vector vehículo pCOl que contiene las secuencias adenovirales necesarias para la recombinación. El plásmido obtenido ha sido designado pXL-CMV-GaxHA (cf. Figura 2) .

EJEMPLO 2 : Construcción del adenovirus recombinante Ad-CMVqax El vector pXL-CMV-GaxHA, preparado en el Ejemplo 1, enseguida es linearizado y cot rans fectado para la recombinación con un vector adenoviral defectuoso, en las células ayudantes (línea 293) que aporta en la posición trans las funciones codificadas por las regiones El (ElA y E1B) del adenovirus. El adenovirus Ad-CMVgax ha sido obtenido por medio de recombinación homologa i n vi vo entre el adenovirus Ad.RSVßgal ( St rat ford-Pe r r i caudet et al., J. Clin. Invest 90 (1992) 626) y el vector pXL-CMV-GaxHA, según el protocolo siguiente: el vector pXL-CMV-GaxHA, linearizado por la enzima Xmnl y el adenovirus Ad.RSVßgal, linearizado por Clal, han sido cot rans f ectados en la línea 293, en presencia de fosfato de calcio, para permitir la recombinación homologa. Los adenovirus recombinantes generados de esta manera han sido seleccionados para purificación sobre placa. Después de su aislamiento, el adenovirus recombinante es amplificado en la línea celular 293, lo cual conduce a un sobrenadante del cultivo que contiene el adenovirus defectuoso recombinante, no purificado, que tiene un título de aproximadamente 1010 pfu/mL. Las partículas virales son purificadas .por centrifugación en gradiente de cloruro de cesio, según las técnicas conocidas (ver especialmente Graham et al., Virology 52 (1973) 456) . El adenovirus Ad-CMVgax es conservado a -80°C en glicerol al 10%.

EJEMPLO 3 : Control de la expresión del Ad-CMVgax en las células tumorales humanas H460. Las células tumorales humanas H460, derivadas de un cáncer del pulmón que no tiene células pequeñas, han sido transducidas por el adenovirus recombinante Ad-CMV gax y por un virus control que expresa la ß-galact os idasa (Ad-RSV-ßgal) con valores cada vez mayores de la multiplicidad de la infección (M. O. I.) (Figura 3). Después de 1 hora 30 de incubación en presencia de la solución adenoviral, el medio de cultivo que comprende 10% de suero fetal es renovado y las células se incuban durante un periodo de 48 horas. La viabilidad celular es controlada por una prueba de exclusión del azul de tripan, entonces se determina el número de células viables por pozo del cultivo. Se utilizan dos lotes del adenovirus AdCMV gax, Ad-gax y Ad-gax(2), y corresponden a dos producciones independientes en las células 293. Las actividades de los dos lotes han probado ser comparables y bien diferentes del adenovirus control AdRSVßgal. La utilización de Ad-RSV-ßgal previamente ha permitido demostrar la capacidad de un adenovirus recombinante para transducir de manera eficaz las células H460. Así se ha detectado la actividad ßgal nuclear en más del 75% de las células tratadas por el Ad-RSV-ßgal (M.O.I. 1000) . Al mismo tiempo, se ha puesto en evidencia la expresión de la proteína gax en las células transducidas por el Ad-CMV gax, por inmunofluorescencia. Se ha demostrado que las eficacias de la transducción de los virus Ad-CMV gax y del Ad-RSV-ßgal son comparables. El tratamiento de las células H460 por el Ad-CMV gax se asocia con una reducción de la proliferación celular, pero igualmente tiene una ci totoxi cidad masiva, detectada 48 horas después de la transducción por el adenovirus (cf . Figuras 4A, 4B y 4C) . Un efecto de este tipo no se observó con el adenovirus control. Estos hechos demuestran entonces que la sobreexpres ion de la proteína gax se acompaña de una suspensión del crecimiento de las células H460. De manera interesante, las células H460 expresan una proteína ras utada (Ki-ras) . Nuestros datos demuestran, de manera sorprendente, que la expresión de la proteína gax permite restablecer el control de la proliferación celular inicialmente alterado por la proteína ras modificada. El carácter dominante del factor gax frente a las mutaciones oncogénicas de ras no está limitado a los carcinomas del pulmón. Se han obtenido resultado similares, a saber, una suspensión del crecimiento por AdCMV gax, sobre las células HCT116, derivadas de un carcinoma del colon. Se ha descrito una mutación del oncogene ras (G13C) y del gene DCC en esta línea celular (Brattain et al., Cáncer Research, 41: 1751-1756, 1981) .

EJEMPLO 5 : Control de la expresión del Ad-CMV-gax en las células tumorales humanas en un ambiente sin p53 Las células H358, derivadas también de un carcinoma del pulmón, sin células pequeñas, constituyen un modelo de deficiencia para la proteína p53. Esta línea celular presenta, en efecto, una deleción homocigótica para el gene p53 (Maxwell y Roth, Oncogene 8: 3421, 1993) . De manera ventajosa, el adenovirus Ad-gax bloquea de manera eficaz el crecimiento de las células H358 y provoca una ci totoxicidad masiva 48 horas después de la transducción adenoviral (Figura 5) . Esta muerte celular no se detecta en presencia de un adenovirus control Ad-RSV-ßgal. Estos datos demuestran que la sobreexpres ion de gax bloquea de manera específica y eficaz el crecimiento de las células tumorales deficientes para p53. De manera interesante, estos datos no se limitan a las células derivadas de los carcinomas del pulmón. En efecto, el crecimiento de las células humanas Saos, derivadas de un os teosa coma , también se bloquea después del tratamiento con Ad-CMV gax. Las células Saos constituyen un modelo celular en un ambiente que no contiene p53 ni pRb . De nuevo, esta suspensión del crecimiento depende de la concentración de virus utilizada y no se observa después de la transducción de las células cancerosas por el virus control (Figura 6). Así, más del 90% de las células Saos-2 son positivas para la actividad ßgal después de la inducción por AdRSV ßgal con una multiplicidad de infección de 250. En las mismas condiciones experimentales (multiplicidad de la infección de 250), AdCMV gax ocasiona una reducción de la viabilidad celular superior al 70%. Gax ha sido descrito inicialmente como un gene que detiene el crecimiento, la solicitante ha observado de manera sorprendente que la suspensión del crecimiento es seguida por una muerte celular que se parece a la apoptosis. La contraparte i n vi vo de la muerte celular inducida por la sobreexpresión de Gax puede, de manera ventajosa ser asociada a un beneficio terapéutico en el paciente con cáncer . Se hace constar que, con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos a que la misma se refiere. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES 1. El uso de la proteína GAX, o de una variante de la misma, caracterizado porque es para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de los cánceres.
2. 2. El uso de al menos una secuencia nucleica que codifica la totalidad o parte de la proteína GAX, o de una variante de la misma, caracte izado porque es para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de los cánceres.
3. 3. El uso, de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la secuencia nucleica es utilizada en forma acomplejada con DEAE-dext ran , con las proteínas receptoras, o con lípidos o polímeros catiónicos, en forma de liposomas o desnuda tal cual.
4. 4. El uso, de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la secuencia nucleica forma parte de un vector viral recombinante.
5. 5. El uso, de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la secuencia nucleica forma parte de un vector viral, escogido entre los adenovirus, los retrovirus y los virus adeno-asoci ados .
6. 6. El uso, de conformidad con la reivindicación 4 o 5, caracterizado porque se trata de un adenovirus de origen animal, de preferencia canino.
7. 7. El uso, de conformidad con la reivindicación 4, 5 o 6, caracterizado porque se trata de un adenovirus de origen animal, de preferencia canino.
8. 8. El uso, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizado porque la secuencia nucleica utilizada codifica la totalidad o parte de la proteína GAX de la rata, o de una variante de la misma.
9. 9. El uso, de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la secuencia nucleica utilizada codifica la proteína GAX de rata, o su homologa humana.
10. 10. El uso, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, caracterizado porque la secuencia nucleica utilizada es un ADNc.
11. 11. El uso, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, caracterizado porque la secuencia nucleica utilizada es un ADNg.
12. 12. El uso, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 11, caracterizado porque la secuencia nucleica utilizada comprende secuencias que permiten su expresión en la célula infectada.
13. 13. El uso, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 12, caracterizado porque la secuencia nucleica utilizada comprende una secuencia señal que dirige el polipéptido sintetizado en las vías de secreción de la célula blanco.