JP2002508976A - 遺伝子療法において使用するための、免疫原性が低下したヌクレオチド発現システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、遺伝子送達系内に免疫抑制遺伝子を取込むことにより、ウイルスベース又は非ウイルスベースの遺伝子送達方法に対する免疫応答を抑制する。これらの免疫抑制遺伝子は、治療処置に加えて又はそれ自体治療処置として使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景 遺伝子療法の分野は、近年著しい進歩をとげてきている。遺伝子欠陥が識別さ
れたこと及び遺伝子ターゲティング／送達方法が開発されてきたことが組合わさ
って、臨床遺伝子療法プロトコルの数は爆発的に増えることになった。遺伝子療
法の最大の焦点は、新しい遺伝子材料を体細胞の中に導入するための方法を開発
することにある。今日までに２つの一般的なクラスの遺伝子移入方法が展開され
てきた。第１のクラスは、ＤＮＡ媒介遺伝子移入であり、これにはさまざまな製
剤形態でＤＮＡを患者に直接投与することが関与している。これらの方法は、従
来の有機又はタンパク質化合物に極めてよく似た要領で遺伝子を薬剤として使用
している。しかしながらＤＮＡ媒介遺伝子移入はきわめて困難であることが証明
されてきた。マイクロインジェクション、リポフェクション及びレセプター媒介
エンドサイトーシスといったような方法は、通常、より低い遺伝子移入を結果と
してもたらし、通常、ターゲティングされた細胞内に新規遺伝子の過渡的な常在
しか確立しなかった。細胞内への遺伝子の永久的取込みは、培養された細胞（１
×１０⁵未満の細胞）内でのＤＮＡ媒介遺伝子移入の後にはほとんど発生せず、i
n vivo では有意に観察されていない。かくして、ＤＮＡ媒介遺伝子移入は、本 来、予測可能な時間にわたり治療的効果を提供するべく従来の非経口経路によっ
て投与される薬剤としての遺伝子の使用に制限される可能性がある。治療用遺伝
子製品の研究は、従来の薬学的薬剤ときわめて類似した形で縮重物質を患者に反
復的に投与することから成る可能性がある。

【０００２】 それにひきかえウイルス遺伝子移入には、病原性機能が欠如している合成ウイ
ルス粒子（ベクター）の構築が関与する。ウイルス粒子は、複製能力をもたず、
感染プロセスにより細胞に送達されるウイルスゲノム内に治療又は診断用遺伝子
を含有している。これまで、最も成功を博したウイルスベクターはレトロウイル
スベクターである。レトロウイルス媒介遺伝子移送のプロトタイプは、モロニー
マウス白血病ウイルスである。レトロウイルスベクターは、それらを遺伝子療法
にとって有用なものにしているいくつかの特性を有している。まず第１に挙げら
れるのは、治療用遺伝子を含有し細胞を感染させる能力をもつもののウイルス遺
伝子に欠け、潜在的ウイルスエピトープに対する宿主応答を最小限におさえる一
助となるウイルス遺伝子産物を全く発現しない「欠損」ウイルス粒子を構築する
能力である。

【０００３】 レトロウイルスベクターは、自らが運ぶ遺伝子を標的細胞の染色体内に永久的
に組込む能力をもつ。動物モデルにおける多大な実験及び臨床試行における初期
実験は、これらのベクターが高い安全限界を有することを示唆している。

【０００４】 アデノウイルスに基づくベクターが、いくつかの細胞型における in vitro 及
び in vivo での遺伝子移入のためのビヒクルとして有効であることが最近立証 された。アデノウイルスベクターは、複製用アデノウイルス粒子を産生するのに
、必要とされるｅ−１遺伝子領域及び／又はｅ−３遺伝子領域のいずれかが欠如
した欠失アデノウイルスゲノムを用いて構築される。組換え型遺伝子が、欠失遺
伝子領域の部位の中に挿入される。次に、ｅ−１又はｅ−３遺伝子を発現するこ
とができ、かくして治療用遺伝子を伴う組換え型ウイルスゲノムのみを含有する
ウイルス粒子を組立てる能力をもつ細胞系統の中でアデノウイルス粒子が産生さ
れる。

【０００５】 アデノウイルスベクターは、それらがその遺伝子を標的細胞染色体内に組込ま
ないという点で、レトロウイルスベクターと異なっている。アデノウイルスベク
ターは、数週間から数カ月の期間にわたってその組換え型遺伝子の発現を提供す
る高い効率レベルでインビトロ及びインビボで分裂及び非分裂細胞の両方のさま
ざまな細胞を感染させることになる。

【０００６】 現行の技術は増殖能力のないアデノウイルスベクター構築を可能にしたものの
、それらは完全に「欠損性」ではなく、提示されたウイルスエピトープに対する
宿主免疫応答を生成しかくしてすでに過渡的ベクターの急速な削除をひき起こす
可能性のある一連のウイルス遺伝子産物を発現することになる。アデノウイルス
ベクターは、細胞溶解及び炎症性応答を誘発する能力をもち続ける。膵嚢胞性繊
維炎の治療のための実験的臨床試行の間に重度の炎症が見られた。

【０００７】 その他のウイルスも、遺伝子療法のための潜在的ベクターとして有用でありう
る特性を示す。このような１つのウイルスに、アデノ関連性ウイルスがある。こ
れはレトロウイルスと同様、標的細胞の染色体内に永久的に組込まれる完全に欠
損性のベクターを提供することができる。このアデノウイルスベクターは、感染
を受けた細胞内の予測可能な場所に組込まれ、このタイプのベクターを、ゲノム
内に無作為に組込まれるベクターに比べ安全なものにすることができる。

【０００８】 もう１つの有望なウイルスベクターは、単純ヘルペスウイルスに基づくもので
ある。ヘルペスウイルスベクターは、細胞を感染させ、潜伏性状態で無期限に存
続する能力をもつ。従来、単純ヘルペスウイルスベクターには、それを適切な宿
主内での外来性遺伝子の持続した発現及び逐次的繁殖にとって有用なものとする
ため、ウイルスゲノムの遺伝子工学が関与している。米国特許第５,８３０,７２
７号に記述されているように付加的成分、例えばエプスタイン−バーウイルス核
抗原遺伝子及び潜在性複製起原などを添加して、ベクターをエピゾーム状態に維
持することも可能である。

【０００９】 送達方法の如何に関わらず、遺伝子療法プロトコルにおいて増えつづけている
問題には、挿入された遺伝子によりコードされたタンパク質に対する宿主の免疫
応答が関与する。大部分のプロトコルは、ウイルスベースの遺伝子送達に依存し
ており、従って野生型ウイルスが遭遇する問題と類似の問題に直面する。（Pall
ar. W. et al. 「アデノウイルスＩＸ因子ベクター内へのＥ３領域遺伝子の取込
み及び宿主の過渡的抗−ＣＤ処理による導入遺伝子発現の安定化」、Gene Ther,
３（６）：５２１−３０（１９９６）；Lochmuller, H., et al.「ＦＫ５０６に
よる過渡的免疫抑制が、成体ジストロフィ性（mdx)マウスの骨格筋に対するアデ
ノウイルス媒介ジストロフィンミニ遺伝子移入の後の持続性高レベルジストロフ
ィン発現を可能にする」、Gene Ther,３（８）：７０６−１６（１９９６）；Tr
ipathy, S.K. et al.,「導入遺伝子でコードされたタンパク質に対する免疫応答
が複製欠損性アデノウイルスベクターの注入後の遺伝子発現の安定性を制限する
。Nat Med,２（５）；５４５−５０（１９９６）；Smith, T.A. et al., 「過渡
的免疫抑制が、アデノウイルスベクターの反復的静脈内投与の成功を可能にする
」、Gene Ther ３（６）；４９６−５０２（１９９６）；Riddell, S.R. et al.
, 「ＨＩＶ感染を受けた患者における、遺伝子修飾されたＨＩＶ特異的Ｔリンパ
球のＴ細胞媒介拒絶、Nat Med ２（２）：２１６−２３（１９９６）。免疫系に
露呈されるウイルスエピトープを最小限におさえる欠損性ベクターを設計するた
めの技術の到来をもってしても、宿主の免疫系は、導入された治療用遺伝子及び
その転写されたタンパク質を外来性のものとみなし、抗原投与を排除するべく活
発に応答する。ひとたび新しい又は変容した遺伝子が送達され発現された時点で
、患者の免疫系は、それが以前に露呈されたことのないタンパク質エピトープと
遭遇する。新しいエピトープは、さまざまな手段を通してそれらを提示する細胞
及び／又はウイルスを排除するように免疫系を刺激する。遺伝子療法に対する免
疫系応答については、いくつかの遺伝子療法実験及び臨床試行において詳細に記
録されるか、又は疑いがもたれてきた（Koenig, S., ＨＩＶ患者からの教訓：免
疫応答はなおも遺伝子療法の悩みの種（或いは有望な見通し）でありつづけてい
る〔コメント〕。Nat Med.１９９６，２（２）；１６５−７；Riddell S.R. et
al.,ＨＩＶ感染患者における遺伝子修飾されたＨＩＶ特異的細胞障害性Ｔリンパ
球の細胞媒介拒絶〔コメント参照〕。Nat Med.１９９６，２（２）；２１６−２
３）。免疫応答は、大部分の遺伝子療法プロトコルの有効性を損なうことになる
治療用遺伝子発現の急速な喪失をひきおこす可能性がある。

【００１０】 ここでわかるように、当該技術分野においては、治療用遺伝子に対する宿主免
疫応答を最小限におさえ、外来性遺伝子が急速に排除されること無く存続できる
ようにする遺伝子発現系に対するニーズが存在する。本発明は、発現させるべき
治療又は診断用遺伝子に対する宿主免疫応答を低減させる免疫抑制剤をコードす
る配列を用いたヌクレオチド送達ビヒクル内で使用するための新規の発現系を提
供する。

【００１１】 本発明の１つの目的は、低減された免疫原性をもつ治療又は診断目的のための
ヌクレオチド発現系を提供することにある。

【００１２】 本発明のさらにもう１つの目的は、ビヒクルが受容体細胞の免疫応答を回避で
きるようにする複数のウイルスゲノムから分離された免疫抑制剤を内含するヌク
レオチド発現系を提供することにある。

【００１３】 本発明のさらにもう１つの目的は、受容体細胞内でより長い時間にわたり持続
的に存在することによって効力が高められた永久的細胞形質転換のためのヌクレ
オチド発現系を提供することにある。

【００１４】 本発明のさらなる目的は、ヌクレオチド送達ビヒクルの設計及び、in vivo、
in vitro 及び ex vivo での遺伝子療法を目的とする細胞の形質転換のための遺
伝子工学技術の使用において、本発明の発現系を利用するための方法及びプロト
コルを提供することにある。

【００１５】 発明の概要 本発明は、免疫抑制を通して、導入された発現系の連続的な存続を提供する組
換え型ヌクレオチド発現系を提供するために遺伝子工学技術を利用しようとして
いる。１つの態様においては、本発明は、導入された治療用遺伝子に対する宿主
免疫応答が最小限におさえられるように、ウイルスゲノム又はその機能的等価物
又は一部分から分離された免疫抑制遺伝子を発現するように適合された組換え型
発現系を提供している。

【００１６】 本書で使用されている「免疫抑制遺伝子」という語は、その発現によって、ウ
イルスが自らに対する受容体宿主の免疫系反応を回避、低減又は抑制できるよう
にするタンパク質産物が提供されることになるようなあらゆるヌクレオチド配列
を意味する。かかる免疫応答には、細胞障害性Ｔリンパ球応答、ＭＨＣ−１，Ｍ
ＨＣ−２，Ｔヘルパー細胞、サイトカイン、インタロイキン及び天然キラー細胞
、好中球、マクロファージβ細胞、血漿細胞、組織マクロファージ（例えば肝臓
内のクッパー細胞）及び樹状細胞が内含され得るが、これらに制限されるわけで
はない。これらの遺伝子の例としては、ＳＩＶ（サル免疫不全症ウイルス）nef
遺伝子；エプスタイン−バーウイルスＢＨＲＦ１，ＬＭＰ−１及びＬＭＰ−２Ａ
；アデノウイルスＥ１Ｂ／１９ｋ及びＥ１Ｂ／５５ｋ；牛痘ウイルス crmＡ及び
ＣＨＯhr；バキュロウイルスｐ３５及びＩＡＰ；伝染性軟属腫ウイルスＭＣ１５
９及びＭＣＯ６６Ｌ；ウマヘルペスウイルス−２Ｅ８；家兎痘ウイルスＳＰＩ−
１；サルウイルス４０Ｔ−Ａｇ；乳頭腫ウイルスＥ７；サイトメガロウイルス、
ＩＥ２，ＵＬ１８及びＵＳ６；粘液腫ウイルスＭ−Ｔ５，ＭＴ−２及びＭ−Ｔ４
；ワクシニアウイルスＥ３Ｌ及びＫ３Ｌ；及びヘルペスウイルスサムライＴｉｐ
が含まれるがこれらに制限されるわけではない。その他の免疫抑制遺伝子の例に
ついては以下で徹底的に論述されており、本書中の教示に従ってこれを分離し同
定することが可能である。

【００１７】 ここで「発現系」という語は、タンパク質コーディング領域の発現を達成する
のに必要な遺伝子シグナル全てに作動的に連鎖されたタンパク質コーディング領
域を内含する遺伝子配列のことを意味する。伝統的に、発現系は、タンパク質コ
ーディング領域の転写及び／又は翻訳を増大させるため又は発現に対する制御を
提供するためのプロモーター又はエンハンサといった調節要素を内含することに
なる。調節要素は、タンパク質コーディング領域の上流側又は下流側に位置設定
されていてもよいし、又はタンパク質コーディング領域を中断するイントロン（
非コーディング部分）に位置設定されていてもよい。代替的には、タンパク質コ
ーディング領域自体の配列が調節能力を含んでいることも可能である。

【００１８】 「機能的等価物」という語は、言及された配列又はタンパク質に実質的な機能
が類似しているあらゆる誘導体のことを意味する。特に「機能的等価物」という
語は、生物学的機能に対して著しく不利な効果をもたらさずにその中でヌクレオ
チド塩基及び／又はアミノ酸が付加、欠失又は置換され、当該技術分野において
既知のものであって、 Maniatis et al., 「分子クローニング」Cold Spring Ha
rkor Press（１９８９）の中で開示されているプロトコルに従って高い緊縮性条
件下でハイブリッド形成することになる誘導体を内含する。

【００１９】 本書で使用されているように、「治療用遺伝子」という語は、その発現が宿主
細胞内で望まれているあらゆるヌクレオチド配列を内含するものとして解釈され
るものとする。これには、導入された遺伝子に対する免疫原性の低減の恩恵を受
けることになるような配列の導入のためのあらゆる遺伝子工学プロトコルが内含
され、アンチセンス型戦略、診断プロトコル又は遺伝子療法が含まれる。

【００２０】 かくして本発明は、１つの実施形態において、１つの細胞内でその発現が望ま
れる治療用ヌクレオチド配列及び免疫抑制剤をコードする組換え型ヌクレオチド
配列を含む組換え型発現系を内含している。免疫抑制剤及びヌクレオチド配列は
、両方の発現を促進するため単一の調節系に作動的に連鎖されていてもよいし、
或いは又ユニークな発現系の中に別々に取込まれていてもよい。

【００２１】 好ましい一実施形態において、本発明の発現系は、受容体細胞の形質転換のた
めの遺伝子送達ビヒクル又ベクター内に内含されている。免疫抑制遺伝子は、選
択されたベクターに対して非未縮重のものであり、好ましくは、ウイルスでコー
ドされたタンパク質を最小限だけ有するベクター内に維持される。本発明は遺伝
子産物の永久的組込み及び／又は発現を達成しようとする形質転換プロトコルに
とって特に有用である。本発明はさらに、上述の組換え型発現系を含有するベク
ター、かかるベクターで形質転換された細胞及び、これらの成分を使用する遺伝
子工学プロトコルをも包含するものである。

【００２２】 発明の詳細な説明 ウイルスが免疫応答の特定の側面を抑制するための手段を発達させてきたこと
はずいぶん前から知られている。（McFadden.G 及び K. Kane, いかにしてＤＮ Ａウイルスは機能的ＭＨＣ発現を混乱させ、免疫認識を変えるのか。Adv. Cance
r Res.１９９４．６３：１１７−２０９）。最近になって、一定の与えられたウ
イルスの宿主による検出及び排除における特定の段階を分断するいくつかの遺伝
子が同定され特徴づけされてきた。これらの発見事実は、潜在的に損傷を与える
ウイルス感染を防止する上で免疫系を補助しようとする研究者にとってきわめて
興味深いものであり続けてきた。これらの遺伝子のヌクレオチド配列も同様に特
徴づけされ、当業者にとって既知のアクセス可能なものとなってきた。その一例
としては、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ−４７をコードする遺伝
子（York, I.A., et al.「シトゾル単純ヘルペスウイルスタンパク質がＣＯ８＋
Ｔリンパ球に対する抗原提示を阻害する」Cell, １９９４．７７（４）：５２５
−３５；Rosenthal, K.L.,et al.,「単純ヘルペスウイルス糖タンパク質ｇＣを 発現するもののｇＢ，ｇＤ又はｇＥを発現しない細胞がマウスウイルス特異的細
胞障害性リンパ球により認識される」、J Virol. １９８７，６１（８）：２４ ３８−４７）及びヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）ＵＳ１１遺伝子（Jone
s, T.R., et al.,「ヒトサイトメガロウイルスのユニーク短領域内の多数の独立
した遺伝子座が主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ重鎖の発現をダウンレギュレ
ートする」J Virol,１９９５．６９（８）：４８３０−４１；Wiertz, E.J., et
al.,「ヒトサイトメガロウイルスＵＳ１１遺伝子産物は小胞体からシトゾルへ ＭＨＣクラスＩ重鎖を転座させる」，Cell, １９９６．８４（５）：７６９−７
９）であるが、それに制限されるわけではない。

【００２３】 本発明の発現系は、その最も単純な形では、受容体細胞中でのその発現が望ま
れている治療用遺伝子又はヌクレオチド配列、及び組換え形免疫抑制遺伝子又は
その単独の発現を内含する発現系を含んで成る。以上で規定したようなあらゆる
ヌクレオチド配列が、本発明の発現系において使用可能である。同様にして、既
知の及び今後発見されるはずの複数の免疫抑制遺伝子のうちのいずれでも使用す
ることができる。かかる遺伝子の例としては、エプスタイン−バーウイルスＢＨ
ＲＦ１，ＬＭＰ−１及びＬＭＰ−２Ａ；アデノウイルスＥ１Ｂ／１９ｋ及びＥ１
Ｂ／５５ｋ；牛痘ウイルス crmＡ及びＣＨＯhr；バキュロウイルスｐ３５及びＩ
ＡＰ；伝染性軟属腫ウイルスＭＣ１５９及びＭＣＯ６６Ｌ；ウマヘルペスウイル
ス−２Ｅ８；家兎痘ウイルスＳＰＩ−１；サルウイルス４０Ｔ−Ａｇ；乳頭腫ウ
イルスＥ７；サイトメガロウイルス，ＩＥ２，ＵＬ１８及びＵＳ６；粘液腫ウイ
ルスＭ−Ｔ５，ＭＴ−２及びＭ−Ｔ４；ワクシニアウイルスＥ３Ｌ及びＫ３Ｌ；
及びヘルペスウイルスサムライＴipが含まれる。これらの遺伝子のヌクレオチド
配列は、一般に当業者にとっては既知でしかもGen Bankといった情報源からアク
セス可能なものである。さらに、その他の免疫抑制遺伝子の同定、分離及び配列
決定は、本書中に参考として内含されている論文中で開示されており、本発明に
従って使用されるべきさらにその他の免疫抑制遺伝子を同定し配列決定するため
にこれを使用することができる.。

【００２４】 さらにもう１つの実施形態においては、単一の遺伝子療法ベクター内で、内部
リポソーム入口部位（ＩＲＥＳ）によって転写により連鎖されているか又は別々
のプロモーターによって個別に制御された多数の免疫抑制遺伝子を使用すると、
このアプローチの有効性の増強が約束される（Parks, G.D., G.M.Duke 及び A.C
. Palmenberg「脳心筋炎ウイルス３Ｃプロテアーゼ；Ｐ３領域に対してウイルス
５’非コーディング配列を連鎖させるクローンからの効率の良い無細胞発現」、
J. Virol, １９８６．６０（２）：３７６−８４。）

【００２５】 本発明のヌクレオチド発現系ならびにこの系を用いた遺伝子工学技術を利用す
る本発明の方法は、治療用遺伝子に対し生成された免疫応答を減少、阻害又は回
避させ、かくして存続時間を増大させるという利点をもつ。事実上全ての従来の
遺伝子療法プロトコルが、治療用遺伝子の存続時間の延長からの恩恵を受けるこ
とができ、従って形質転換ビヒクル内へのこれらの免疫抑制遺伝子の内含により
恩恵を受けることになる。代替的には、組換え型免疫抑制遺伝子の発現は、組織
又は細胞の同種異系移植片拒絶を減少させるために行なわれる。

【００２６】 好ましい実施形態においては、本発明のヌクレオチド発現系は、その後、問題
の遺伝子を発現させるべく細胞を形質導入し、受容体宿主細胞による遺伝子に対
するあらゆる免疫応答を低減させるのに用いられる適切な遺伝子移入ビヒクル内
に内含される。遺伝子送達ビヒクルは、当該技術分野にとって既知のあらゆる送
達ビヒクルであってよく、レセプター媒介トランスフェクションによって容易に
される単なる裸のＤＮＡならびに数多くのベクターのうちのいずれかを内含する
ことができる。かかるベクターとしては、真核性ベクター、原核性ベクター（例
えば細菌ベクター）及び制限的な意味なくレトロウイルスベクター、アデノウイ
ルスベクター、アデノ関連性ウイルスベクター、レンチウイルスベクター（ヒト
及びブタを含むその他のもの）、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン−バ
ーベクター、ＳＶ４０ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、シュード
タイプウイルスベクターを含むウイルスベクターが含まれるが、これらに制限さ
れるわけではない。

【００２７】 本発明は、治療用遺伝子の過渡的発現に対するものとして永久的発現を達成し
ようとするウイルスベクター形質転換戦略にとって特に有用である。従って、本
発明は、宿主ＤＮＡ内に組込まれるレトロウイルス、アデノ関連性又はレンチウ
イルスベクターといったようなベクターの使用に特に適している。本発明はＨＳ
Ｖベクターといったような形質転換された細胞の中で無期限に存続するベクター
系又は、エプスタイン・バー遺伝子要素の使用によるもののようにエピソーム状
態に維持されるベクター系にも特に適している。

【００２８】 本発明は同様に、欠損性でそのためウイルスエピトープを全く又は最少量しか
含まず、かくしてベクター自体又はベクター成分に対し生成された免疫反応を最
小限にするようなベクターの場合にも特に有利である。これらのベクターはさら
に、治療用遺伝子自体に対するあらゆる免疫応答を最小限におさえるべく本発明
によってさらに最適化され得る。

【００２９】 脂質媒介トランスフェクション、レセプター媒介トランスフェクション，リン
酸カルシウムトランスフェクション，電気穿孔粒子ボンバード、裸の直接ＤＮＡ
注入、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション）
といったような数多くの標準的遺伝子送達形質転換方法のいずれかを使用するこ
とが可能である。

【００３０】 本発明の発現ビヒクル（ベクター）を、当業者にとって既知の数多くの技術の
うちのいずれかによって、工学処理することが可能である。以下に記すのは、本
発明のベクターの構築及び形質転換のための技術の要約である。

【００３１】 ベクターの構築及び送達のための遺伝子工学技術 脂質媒介トランスフェクション、レセプター媒介トランスフェクション，リン
酸カルシウムトランスフェクション，電気穿孔粒子ボンバード、裸の直接ＤＮＡ
注入、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション）
といったような数多くの標準的遺伝子送達形質転換方法のいずれも、本発明のた
めに使用することができる。

【００３２】 好ましい一実施形態においては、発現系を含む本発明の発現ビヒクル又はベク
ターは、同様に、形質転換体について選択するための選択可能なマーカー遺伝子
ならびに細菌内の構成体繁殖のためにこれらの形質転換体を選択する方法も含ん
で成る。かかる選択可能なマーカーは、アンピシリン、カナマイシン、テトラサ
イクリン又はストレプトマイシンなどに対する耐性を付与するものといったよう
な抗生物質耐性遺伝子を含有する可能性がある。これらには、正の選択を提供す
るシヒドロ葉酸レダクターゼといったような原核細胞又は真核細胞からの遺伝子
又は、多薬物耐性Ｉ遺伝子、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子が含まれると考えら
れる。ネオマイシン又は Zeosyn といったようなあらゆるタイプの正のセレクタ
マーカーを使用することができ、これらのタイプのセレクタは、当該技術分野に
おいて一般に知られている。当業者には遺伝子の挿入及び欠失のための複数の手
順が知られており、開示されている。同様に、Post et al., Cell 第２４巻：５
５５−５６５（１９８１）も参照されたい。選択可能なマーカー遺伝子のために
、発現系全体を提供しなければならず、遺伝子はいずれかの端部でプロモーター
調節領域でフランキングされ、もう１方の端部で転写終止シグナル（ポリアデニ
ル化部位）でフランキングされなくてはならない。選択可能なマーカー遺伝子と
既知のあらゆるプロモーター／転写終止の組合せを使用することが可能である。
例えば、５Ｖ４０プロモーターとＳＶ４０polyＡである。

【００３３】 発現させるべき治療用遺伝子を次に本発明のベクター内に導入することができ
る。外来性ＤＮＡは、完全転写単位、プロモーターー遺伝子−polyＡを含むこと
ができ、又対象となっている遺伝子のみを挿入する必要しかないように、プロモ
ーター／転写終止配列を含有するべくベクターを工学処理することもできる。こ
れらのタイプの対照配列は当該技術において既知のものであり、任意にはリポソ
ーム結合部位配列と共にオペレータを伴って、転写開始のためのプロモーターを
内含する。かかる系の例としては、ベーターラクトース（ペニシリナーゼ）及び
ラクトースプロモーター系、(Chang et al., Nature,１９７７，１９８：１０５
６）；トリプトファン（trp)プロモーター系（Goeddel, et al., Nucleic Acid
Res., １９８０，８：４０５７）及びラムダ由来のＰ１プロモーター及びＮ遺伝
子リポソーム結合部位（Shimatake et al., Nature １９８１，２９２：１２８ ）が含まれる。ＳＶ４０polyＡといったようなさまざまなリポソーム要素と組合
わせた形で、サイトメガロウイルスプロモーター又はラウス肉腫ウイルスといっ
たその他のプロモーターも使用することができる。プロモーターは構成性、（上
述の）誘発性のプロモーター（テトラサイクリン−制御されたトランス作用因子
（ｔＴＡ）−応答性プロモーター（tet系、Paulus, W. et al.,「哺乳動物細胞 に対する遺伝子送達のための自蔵型テトラサイクリン調節レトロウイルスベクタ
ー系」、J of Virology, Jan, １９９６，第７０巻、No.1, ｐ６２〜６７））又
は、組織特異的プロモーター（例えば、Costa, et Al.,European journal of Bi
ochemistry, ２５８「ヒト肉皮細胞内の組織型プラスミノーゲン活性化体遺伝子
の転写調節：組織型プラスミノーゲン活性化体遺伝子プロモーター内で機能的要
素を認識する核因子の同定」ｐ１２３−１３１（１９９８）；Fleischmann, M.,
et Al., FEBS Letters ４４０「早期マウス胚発生中の緑色螢光タンパク質の心 臓特異的発現」，ｐ３７０−３７６，（１９９８）；Fassati, Ariberto, et Al
., Human Gene Therapy,（９：２４５９−２４６８）「自己不活性化ベクターの
長末端反復内に２つの独立したエンハンサーを挿入すると、結果として、組織特
異的発現を伴う高力価レトロウイルスベクターが得られる」（１９９８）；Vale
rie, Jerome, et Al.Human Gene Therapy ９：２６５３−２６５９，「腫瘍細胞
に対する遺伝子発現をターゲティングするための組織特異的細胞でサイクル調節
されたキメラ転写因子、（１９９８）；Takehito, Igarashi, et Al., Human Ge
ne Therapy９：２６９１−２６９８，「エストロピックレトロウイルス遺伝子の
組織特異的発現に基づく細胞ターゲティングの新たな戦略」１９９８；Lidberg,
UIf et al. The Journal of Biological Chemistry ２７３，No.４７「外分泌 すい臓内でのヒトカルボキシルエステルリパーゼ遺伝子の転写調節」１９９８；
Yu, Geng-Sheng et.Al. The Journal of Biological Chemistry ２７３ No.４９
，「脂肪酸酵素基質による組織特異的な代替的ヒトカルニチンパルミトイルトラ
ンスフェラーゼＩＢ遺伝子プロモーター，１９９８）の中で引用されているもの
）を含めた、当該技術において既知のあらゆるプロモーターであり得る。これら
のタイプの配列は、当該技術分野において周知のものであり、ＡＴＣＣ，Pharma
cia, Invitrogen, Stratagene, Promegaといった複数の供給元から市販されてい
る。

【００３４】 最も好ましい実施形態においては、ベクターは、複数のユニーク制限部位が中
に作り上げられている特定的に工学処理された多重クローニング部位を含んで成
る。制限酵素及びその分割部位は、当業者にとって周知のものである。

【００３５】 好ましい一実施形態においては、ウイルスベクターを内含する生産者細胞系統
を形成するべく、治療用ヌクレオチド配列を含有するウイルスベクターを用いて
パッケージング細胞系統が形質導入される。このとき生産者細胞を直接投与する
ことができ、かくして生産者細胞は、受容体細胞を形質導入する能力をもつウイ
ルス粒子を生成する。

【００３６】 好ましい一実施形態においては、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクタ
ーである。利用可能なレトロウイルスベクターの例としては、モロニーマウス白
血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、及びラウス肉腫ウイルス、ハーベリ肉腫ウイ
ルス、鳥類白血症ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス
及び哺乳動物腫瘍ウイルスといったようなレトロウイルスから誘導されたベクタ
ーが含まれるが、これらに制限されるわけではない。

【００３７】 レトロウイルスベクターは、真核細胞内へのレトロウイルス媒介遺伝子移入を
媒介するための作用物質として有用である。レトロウイルスベクターは一般に、
ウイルスの構造遺伝子についてコードする配列の大部分が欠失し、問題の治療用
遺伝子によって置換されるような形で構築されている。構造遺伝子（すなわち g
ag, pol 及び env）は、当該技術分野において既知の遺伝子工学技術を用いてレ
トロウイルスバックボーンから除去されることが最も多い。これには、適切な制
限エンドヌクレアーゼ又は一部のケースではＢａｌ３１エキソヌクレアーゼを用
いて消化を行ない、パッケージングシグナルの該当する部分を含有するフラグメ
ントを生成することが含まれていてよい。

【００３８】 これらの新しい遺伝子は、いくつかの一般的な方法でプロウイルスバックボー
ン内に取込むことができる。最も明白な構成は、レトロウイルスの構造遺伝子が
、その後長い末端反復（ＬＴＲ）内でウイルス調節配列の制御下で転写される単
一の遺伝子によって置換されているような構成である。標的細胞内に複数の遺伝
子を導入することのできるレトロウイルスベクターも同様に構築されてきた。通
常、このようなベクターにおいては、１つの遺伝子は、ウイルスＬＴＲの調節制
御下にあり、一方第２の遺伝子は、スプライスを受けたメッセージから離れて発
現されるか又はそれ自体の内部プロモーターの調節下にある。

【００３９】 主としてパッケージング細胞内のパッケージング欠損性ヘルパーウイルスとベ
クターの間の組換えの機会を減らそうとして、ウイルスバックボーンのウイルス
成分を最小限にすることに努力が向けられてきた。ベクター自体から欠失させら
れたレトロウイルスの構造遺伝子を提供するために、パッケージング欠損性ヘル
パーウイルスが必要である。

【００４０】 １つの実施形態においては、レトロウイルスベクターは、ベクターとパッケー
ジング系の間の相同性を絶対最小限まで減らすため一連の欠失及び置換を含むＮ
２ベクター（Armentans et al., J. Virol, ６１：１６４７−１６５０）に基づ
く、Bender, et al., J. Virol ６１：１６３９〜１６４９（１９８７）内に記 述された一連のベクターの１つであってよい。これらの変化は又、ウイルスタン
パク質が発現される確率をも低減させた。これらのベクターのうちの最初のもの
、ＬＨＣ−ＸＨＣにおいては、部位特異的突然変異誘発により、ＴＡＧへのgag
の天然ＡＴＧ開始コドンが縮重され、かくしてその点から意図されていないタン
パク質合成が削除された。

【００４１】 モロニーマウス白血病ウイルス（ＭoＭuＬＶ）においては、真正 gag 開始点 まで５’ のところで、もう１つのグリコシル化タンパク質（ｐＰｒ８０^gag） の発現を可能にする読取り枠が存在する。モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭoＭu
ＳＶ）は、（ｐＰｒ８０^gagのアミノ末端の潜在的発現を不要にするグリコシル 化部位の喪失及びフレームシフトを含めたこの５’領域内の縮重を有する。従っ
て、ＬＮＬ−ＸＨＣの縮重ＡＴＧ及びＭoＭuＳＶの５’部分の両方を取込んだベ
クターＬＮＬ６が作られた。ＬＮベクター系列の５’構造は、かくして、遺伝的
に形質導入された標的細胞内でのその後のウイルス抗原産生を伴って、レトロウ
イルス読取り枠発現の可能性を無くする。パッケージング欠損性ヘルパーウイル
スとの重複を低減させるための最終的縮重において、Millerは、ＬＮベクター内
の３’ＬＴＲの直ぐ前の追加の env配列を削除した（Miller et al., Biotechni
ques, ７；９８０−９９０，１９８９）。

【００４２】 遺伝子療法に応用するためにあらゆる遺伝子移入系が満たされなくてはならな
い最大の必要条件は、安全性である。安全性は、感染性ベクターの産生のために
利用されるパッケージング系とベクターゲノム構造の組合せから導かれる。Mill
er et al. は、ベクターゲームとパッケージング欠損性ヘルパーゲノムの間のほ
ぼ全ての組換え部位の削除を通して組換え型野生型レトロウイルスの生成が最小
限に抑えられているベクターパッケージング系を作るためＬＮベクター系列との
レトロウイルス構造タンパク質の発現のためのｐＰＡＭ３プラスミド（パッケー
ジング欠損性ヘルパーゲノム）の組合せを開発した（すなわちＬＮとｐＰＡＭ３
）。

【００４３】 １つの実施形態においては、レトロウイルスベクターは、本書で前述し Bende
r et al.（１９８７）及び Miller et al.（１９８９）の中でもさらに記述され
ているもののようなＬＮベクター系列のモロニーマウス白血病ウイルスでありう
る。かかるベクターは、マウス肉腫ウイルスから誘導されたパッケージングシグ
ナルの一部分及び突然変異を受けた gag開始コドンを有する。本書で用いられる
「突然変異を受けた」という語は、gag 開始コドンが欠失又は縮重され、かくし
て gagタンパク質又はそのフラグメント又は切形が発現されないことを意味する
。

【００４４】 もう１つの実施形態においては、レトロウイルスベクターは、少なくとも４つ
のクローニング又は制限酵素認識部位を内含することができ、ここで部位のうち
少なくとも２つが１００００塩基対の中で１回未満の真核性遺伝子内平均出現頻
度をもつ。すなわち制限産物は、少なくとも１００００塩基対の平均ＤＮＡ部位
を有する。好ましいクローニング部位は、ＮotＩ，Ｓna ＢＩ，ＳalＩ及びＸho Ｉから成る群の中から選択される。好ましい実施形態においては、レトロウイル
スベクターには、これらのクローニング部位の各々が内含されている。

【００４５】 このようなクローニング部位を内含するレトロウイルスベクターが利用される
場合、レトロウイルスベクター上にあるＮotＩ，ＳnaＢＩ，ＳalＩ及びＸhoＩか
ら成る群の中から選択された少なくとも２つのクローニング部位と相容性のある
２つのＣＬＳを内含するシャトルクローニングべクターも提供することができる
。このシャトルクローニングべクターは同様に、シャトルクローニングべクター
からレトロウイルスベクターに移入される能力をもつ少なくとも１つの望ましい
遺伝子も内含する。

【００４６】 シャトルクローニングべクターは、クローニング又は制限酵素認識部位を内含
する単数又は複数のリンカーが連鎖されている基本的「バックボーン」ベクター
又はフラグメントから構築され得る。ＣＬＳ内に含まれているのは、以上で記述
した相容性又は相補的クローニング部位である。シャトルベクターの制限部位に
対応する遺伝子及び／又はプロモーターを、当該技術分野において既知の技術を
通してシャトルべクター内に連鎖させることができる。

【００４７】 シャトルクローニングべクターは、原核系の中でＤＮＡ配列を増幅するために
利用することができる。シャトルクローニングべクターは、原核系、特に細菌内
で一般に使用されるプラスミドから調製することができる。かくして、例えば、
シャトルクローニングべクターはｐＢＲ３２２及びｐＵＣ１８などといったプラ
スミドから誘導され得る。

【００４８】 ベクターは単数又は複数のプロモーターを内含している。利用可能な適切なプ
ロモーターには、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；及び Miller
et al. Biotechniqus,７：（９）；９８０−９９０（１９８９）内に記述されて
いるヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、或いはその他のプロモ
ーター（例えば制限的な意味なくヒストン，pol III 及びβ−アクチンプロモー
ターを含めた真核細胞プロモーターといった細胞プロモーター）が含まれるが、
これらに制限されるわけではない。利用可能なその他のウイルスプロモーターに
はアデノウイルスプロモーター、ＴＫプロモーター及びＢ１９パルボウイルスプ
ロモーターが含まれていてよいが、これらに制限されるわけではない。適切なプ
ロモーターの選択は、本書に含まれている教示から当業者には明らかとなること
であろう。

【００４９】 このとき、ベクターは、生産者細胞系統を形成するべくパッケージング細胞系
統を形質導入するために利用される。トランスフェクションを受けることのでき
るパッケージング細胞の例としては、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ψ２、Ψ−ＡＭ
、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ
、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋envＡＭ１２、及びＤＡＮ細胞系統が含まれるがこれ らに制限されるわけではない。治療用核酸配列を含有するベクターは、当該技術
分野において既知のあらゆる手段を通してパッケージング細胞を形質導入するこ
とができる。かかる手段としては、電気穿孔法、リポソームの使用及びＣａＰＯ ₄ 沈降法があるがこれらに制限されるわけではない。

【００５０】 生産者細胞はこのとき、望ましい受容体細胞に直接か又はそれに隣接して投与
される。

【００５１】 好ましい実施形態においては、本発明は、一般にヒトに感染するウイルスベク
ター及びヒトベースのパッケージング細胞系統を含んで成る。例えば、ヘルペス
ウイルス、エプスタイン−バーウイルスといったような一般にヒトに感染するウ
イルスから誘導され、活性α−ガラクトシルエンベロープを発現しないベクター
を使用することができる。

【００５２】 最も好ましい実施形態においては、ベクターには単純ヘルペスウイルスプラス
ミドベクターが含まれる。Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）が潜在的に
有用な遺伝子送達系として立証されてきた。Glorioso, J.C.「中枢神経系に対す
る遺伝子移送のための単純ヘルペスウイルスベクターの開発。遺伝子療法：直接
的遺伝子移入の方法と応用」。Jon A. Wolff, Editor, １９９４ Birkhauser Bo
ston, ２８１−３０２；Kennedy, P.G.,「神経病における遺伝子療法のための単
純ヘルペスウイルスベクターの使用」QJMed, Nov. １９９３，８６（１１）：６
９７−７０２；Latchman, D.S., 「遺伝子療法のための単純ヘルペスウイルスベ
クター」，Mol Biotechnol, Oct.１９９４，２（２）：１７９−９５．

【００５３】 ＨＳＶ−１ベクターは、筋肉（Huard. J.,「筋肉に対する、Ｉ型単純ヘルペス
ウイルスベクター媒介の遺伝子移入」、Gene Therapy, １９９５，２,３８５− ３９２）；及び脳（Kaplitt, M.G.,「プレプロエンケファリンが、欠損性単純ヘ
ルペスウイルスベクターを介した直接的 In Vivo遺伝子移入後の成人の脳におけ
る領域特異的及び長期的発現を生み出す」、Proc Natl Acad Sci USA, Sep１３ ，１９９４，９１（１９）：８９７９−８３。）に対する遺伝子移入のために使
用され、又マウス脳腫瘍治療のために使用されてきた（Boviatsis, E.J.,「Ganc
iclovir及び無欠性チミジンキナーゼ遺伝子を保持する単純ヘルペスウイルスベ クターで治療された脳新生物を宿すラットの長期存命」、Cancer Res. Nov１５ ，１９９４，５４（２２）：５７４５−５１；Mineta, T.,「Ganciclovir-超感 受性、リボヌクレオチドリダクターゼ、欠損性単純ヘルペスウイルス突然変異体
を用いた悪性グリオーバの治療」、Cancer Res, Aug１，１９９４，５４（１５ ）：３９６３−６。

【００５４】 作業をより容易にするため及びより大きな挿入（最高１４０kb）の能力を有す
ることから、ヘルパーウイルス依存性ミニウイルスベクターが開発されてきた。
Geller.,Al.「欠損性単純ヘルペスウイルスベクターのための効率の良い欠失突 然変異体パッケージング系：ヒト遺伝子療法及び神経生理学に対するその潜在的
応用」Proc Natl Acad Sci USA, Nov １９９０，８７（２２）：８９５０−４；
Frenkel. N.,「単純ヘルペスウイルスアンプリコン：汎用欠損性ウイルスベクタ
ー」、Gene Therapy. 1. Supplement 1 ,１９９４。当該技術分野では、複製不 全アンプリコンが構築されてきており、その一例は、本書に参考として内含され
ている Geller et al., Science,２４１，Sept. １９９８によるｐＨＳＶｌａｃ
ベクターである。これらのＨＳＶアンプリコンは、外因性ＤＮＡの挿入のための
スペースを提供するべくＨＳＶゲノムの大きい欠失を含んでいる。標準的には、
これらは、ＨＳＶ−１ パッケージング部位、ＨＳＶ−１「oriS」複製部位及び ＩＥ４/５プロモーター配列を含む。これらのビリオンは、繁殖のためヘルパー ウイルスに依存している。

【００５５】 組換えを最小限におさえるため、主として２つのタイプの突然変異ヘルパーウ
イルスが開発された。本書では、その他の相補的ＨＳＶヘルパーウイルス系が考
慮されており、これらは当業者の技能範囲内に入るものである。開発されてきた
かかる系の１つは、温度感受性突然変異体である。ＩＥ３遺伝子内のＴＳ突然変
異を用いて、ＨＳＶ温度感受性（ＴＳ）突然変異体が開発された。Davison et a
l,１９８４，J. Gen. Virol., ６５：８５９−８６３。その結果、このウイルス
は、ＩＥ表現型をもち、ＤＮＡを複製せず、細胞の生理学を著しく変更せず、３
７℃で後代ウイルスを産生しない。ウイルスは３７℃の許容温度で成長する。し
かしながら、ＴＳ突然変異体は野生型に戻る傾向をもっていた。

【００５６】 これとは対照的に、第２のヘルパーウイルス系は、ＩＥ３遺伝子の大部分が単
純に欠失された状態にある欠失突然変異体である。これらは、野生型には戻らな
い。従って、欠失突然変異体をヘルパーウイルスとして使用してパッケージング
されたＨＳＶ−１ベクターは、本発明の最も好ましいヘルパーウイルスである。
例えば、Patterson et al., １９９０，J. Gen. Virol., ７１：１７７５−１７
８３を参照のこと。その他の複製不全ヘルパーウイルスも使用可能であり、当業
者であれば、適切な複製及び発現機能を提供することになる複製不全ヘルパーウ
イルスを結果としてもたらし、ヘルパー細胞系統及びベクターと調整されるＩＥ
遺伝子又はその他の遺伝子の中でのその他の突然変異も本発明の範囲内で考慮さ
れているということがわかるだろう。それがＩＥ３又は複製依存性遺伝子を発現
するか又は、すでに形質転換されていて市販されているヘルパー細胞系統を得る
能力を有するかぎり、この段階のためにいかなる細胞系統でも使用することがで
きる。ｐＨＥ及びＩＥ３遺伝子を含有するプラスミドを同時に導入することによ
り、いかなる細胞系統でも使用することができる。次に、電気穿孔法、リン酸カ
ルシウムＤＮＡ トランスフェクション又はその他の任意の適切な方法によりヘ ルパー細胞系統に対しベクターを送達する。ｐＨＥ及びＩＥ３遺伝子を含有する
プラスミドを同時に導入することにより、いかなる細胞系統でも使用することが
できる。次に、ヘルパーウイルスＩＥ３欠失突然変異体又は複製不全のものであ
るその他の対応する欠失突然変異体で、細胞を感染させる。ＩＥ３遺伝子又はヘ
ルパー細胞系統内のその他のこのような遺伝子はヘルパーウイルスを補完し、結
果として生産的ＨＳＶ−１感染をもたらし、結果として得られたウイルス株は、
全て複製無能であるベクターＤＮＡ又はヘルパーウイルスＤＮＡのいずれかを含
有するＨＳＶ−１粒子で構成されている。ヘルパー細胞系統に関するさらなる情
報及び方法論は、Geller et al.,ＰＮＡＳ，８７；８９５０−８９５４，１９９
０年１１月、「欠損性単純ヘルペスウイルスベクターのための効率の良い欠失突
然変異体パッケージ系：ヒト遺伝子療法及び神経細胞生理学に対するその潜在的
応用」で開示されている。本発明は、１０倍の力価及び非常に大きなＤＮＡイン
サート能力を達成するエピゾーム形態で細胞中にベクターを維持できるようにす
るエプスタイン−バーウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス又はウシ乳頭腫ウイルスＩ
型からのもののようなその他のウイルス配列と、複製不全ＨＳＶアンプリコンを
組合わせるＨＳＶミニベクターを含んで成る。

【００５７】 本発明の１実施形態には、（ａ）（ヘルパーウイルスから複製及びパッケージ
するためのシグナルに応答した）プラスミドの複製パッケージのための「oriＳ 」複製起点及びパッケージ／分割シグナルのためのＨＳＶ−１「ａ」配列；（ｂ
）宿主ゲノムへの組込みの無い複製そして、２つの分裂中の細胞の各々の中への
均等な複製のため核内でエピゾーム形態でベクターを維持できるようにするＥＢ
Ｖ潜伏性複製起点（oriＰ）及びエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）核抗原 （ＥＢＮＡ−１）遺伝子；好ましくは（ｃ）E. coli 内でのベクターの繁殖のた
めの原核細胞からの遺伝子（アンピシリン耐性又はテトラサイクリン耐性遺伝子
といったような選択可能なマーカー遺伝子及び col. E１ ori) 及び（ｄ）ＵＳ １１といったような免疫抑制タンパク質をコードする配列を含むヘルパーウイル
ス依存性ミニウイルスベクターが関与している。任意には、ベクターは又、正の
ハイグロマイシン選択のための遺伝子といったような第２の選択可能なマーカー
を提供する原核性遺伝子も含んでいてよい。

【００５８】 この特定の実施形態において、単純ヘルペスウイルスカプシド内へのミニベク
ターＤＮＡのパッケージ機能は、ヘルパーウイルス及びヘルパー細胞系統によっ
て提供される。

【００５９】 さらにもう１つの実施形態においては、Mann et al.,「レトロウイルスパッケ
ージ突然変異体の構築及びヘルパーを含まない欠損性レトロウイルスを産生する
ためのその使用」、３３ Sal., ｐ１５３〜１５９，１９８３年５月，Journal o
f Virology,１９８９年９月ｐ３８２２〜３８２９，１９８９年９月；Samulski 「組換え型アデノ関連性ウイルスのヘルパーを含まない株；正常な組込みにはウ
イルス遺伝子発現は必要とされない」；及び Kohn et al.,「哺乳動物細胞内へ の高効率遺伝子移入：広い哺乳動物宿主範囲をもつヘルパーを含まない組換え型
レトロウイルスの生成」、ＰＮＡＳ，８１；６３４９−６３５３，１９８４．１
０月にあるように、ヘルパーを含まないウイルスベクターを産生するようにＨＳ
Ｖベクターを工学処理することができる。

【００６０】 本発明の発現系及び形質転換ビヒクルは、望ましいヌクレオチド配列の in vi
tro, ex vivo 又は in vivo発現を内含するあらゆる診断又は治療用遺伝子工学 プロトコルのために使用することができる。例えば、本発明の発現ビヒクルは、
単純ヘルペスウイルス、チミジンキナーゼ遺伝子移送系による場合のように（Ma
rtuza RL et al.,「遺伝子工学処理されたウイルス突然変異体を用いたヒトグリ
オーマの実験的療法」、Science １９９１：２５２：８５４−８５６），ガン治
療における数多くの治療用処置プロトコルのうちのいずれにおいても使用可能で
ある。同様に、骨髄パージといったような ex vivo遺伝子療法プロトコルにおい
ては、（Seth P., et al.,ヒト乳房腫瘍細胞に対するアデノウイルス媒介遺伝子
移入：ガン遺伝子療法及び骨髄パージのためのアプローチ」；Cancer Res. ５６
（６）：１３４６−１３５１（１９９６；Andersen, N.S., et al.,「最小残留 疾患のポリメラーゼ連鎖反応検出により評価された外とう膜リンパ腫内での免疫
学的パージの失敗」、Blood,９０（１０）：４２１２−４２２１（１９９７）。
かくして、形質転換された細胞は、患者の体内に再度導入された時点で、減少し
た免疫応答を生成することになる。これらは同様に、診断目的でも使用可能であ
る。

【００６１】 さらに好ましい実施形態においては、本発明は、本書内の教示に従って構築さ
れ、実質的に配列番号１，２，３又は４内に記されたとおりの配列又はその一部
分又はその機能的等価物を有するポリヌクレオチドを含む、ヌクレオチド発現ビ
ヒクル（ｐＬＸＳＩ−ＩＲＥＳ−Ｎ，ｐＬＩＳＮ，ｐＬＸＳＵ−ＩＲＥＳ−Ｎ，
ｐＬＧＳＮ，ｐＬＩＳＨ，ｐＬＵＩＳＮ及びｐＬＵＳＮ）を提供している。

【００６２】 治療用遺伝子の送達に基づく遺伝子工学プロトコルに加えて、本発明のさらに
もう１つの実施形態においては、免疫抑制遺伝子はそれ自体、細胞に導入される
べき治療用遺伝子でありうる。独力で送達されるこれらの免疫抑制発現系は、数
多くのプロトコルの中で治療薬として使用することが可能である。

【００６３】 例えば、いくつかのクラスのウイルスは、そのタンパク質産物がＣＴＬ応答を
特異的に抑制する免疫抑制遺伝子を発達させた。（McFadden, G. and K.Kane,「
いかにしてＤＮＡウイルスは、免疫認識を変えるべく機能的ＭＨＣ発現を混乱さ
せるか」Adv Cancer Res６３：１１７−２０９（２９９４）；Fruh, K, et al.,
「抗原提示のためのペプチド輸送体のウイルス阻害物質」Nature３７５：６５３
０）：４１５−８（１９９５）；Wold, W.S.and L.R.Gooding,「アデノウイルス
のＥ３領域：宿主免疫監視及びウイルス−細胞相互作用に関与する遺伝子カセッ
ト」Virology, １８４（１）：１−８（１９９１）；Beersma, M.F., M.J. Bijl
makers, and H.L. Ploegh,「ヒトサイトメガロウイルスがクラスＩＨ連鎖の安定
生を減少させることによりＨＬＡクラスＩ発現をダウンレギュレートする」J Im
munol,１５１（９）：４４５５−６４（１９９３））。このような２つの遺伝子
には、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＵ）ＩＣＰ−４７をコードする遺伝子（
York, I.A., et al.,「シトゾル単純ヘルペスウイルスタンパク質が、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球に対する抗原提示を阻害する」Cell, １９９４．７７（４）：５２５
−３５；Rosenthal, K.L., et al.,単純ヘルペスウイルス糖タンパク質ｇｃを発
現するもののｇＢ，ｇＤ又はｇＥを発現しない細胞が、マウスウイルス特異的細
胞障害性Ｔリンパ球により認識される」J Virol,１９８７．６１（８）：２４３
８−４７）及びヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）ＵＳ１１遺伝子（Jones,
T.R. et al.,「ヒトサイトメガロウイルスユニーク短領域内の多数の独立した 遺伝子座が主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ重鎖の発現をダウンレギュレート
する」J Virol,１９９５．６９（８）：４８３０−４１；Wiertz, E,J.,et al.,
「ヒトサイトメガロウイルスＵＳ１１遺伝子産物は小胞体からシトゾルまでＭＨ
ＣクラスＩ重鎖を転座させる」Cell, １９９６．８４（５）：７６９−７９）が
含まれる。

【００６４】 ＣＴＬ応答は、クローン病、糖尿病及びアレルギー反応を含めた多くの自己免
疫疾患における寄与因子として同定されてきた（Harris, S.J.,et al.,「主要ハ
ウスダストダニアレルゲン内のマウスＭＨＣクラスＩエピトープの予想及びＴ１
型ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘発」Int Immunol,１９９７．９（２）：２７３−８０
；Nagata, M., et al., 肥満していない糖尿病マウス内の細胞障害性Ｔリンパ球
によるすい島細胞の破壊」J Immunol,１９８９．１４３（４）：１１５５−６２
）。

【００６５】 本発明に従うと、本発明の免疫抑制発現系は、これらの疾患に付随するＣＴＬ
免疫応答を阻害するための治療薬として投与することができる。ここでも単独で
あるか又は発現ビヒクルの中に入った発現系は、当業者によって決定される疾患
の治療又はその症候の軽減に有効な量で、患者に対して投与される。

【００６６】 この療法の潜在的標的である付加的自己免疫疾患には以下のものが含まれる：
自己免疫貧血症又は血球減少症、潰瘍性大腸炎、血管性心臓疾患、囲心病、脈管
炎、過敏症肺臓炎、間質性肺疾患、心筋症、糸球体症、肝炎／肝硬変、急性／慢
性膵炎、異物反応、肺炎症性症候群、変形性関節症、乾癬、サルコイドーシス、
脈管炎、ビーチ症候群、siogronssya、多発性筋炎、皮膚筋炎、全身性硬化症、 即時型過敏性疾患、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、全身性紅斑性狼瘡、強直
性脊椎炎、好酸球性肺炎、重症筋無力症、神経筋接合部疾患、脱髄疾患、多発性
軟骨炎、感染性関節炎、カルシウム結晶沈着を原因とする関節炎、変形性関節症
、未分化脊椎関節症、ショーグレン症候群、免疫学的に仲介された皮膚疾患、急
性多発性脳脊髄炎、急性白質脳炎、筋ジストロフィー、糸球体症、炎症性腸疾患
、心臓弁膜症、肺性心、心筋炎。罹患した組織内の細胞によるＭＨＣＩ発現の全
体的抑制は、疑わしい免疫応答を低減又は削除するはずである。さらに器官移植
体が、これらの遺伝子提供といった局在化した免疫抑制から多大な恩恵を受ける
ことができる。（Qin, L.,et al.,「ウイルスＩＬ−１０遺伝子のレトロウイル ス媒介移入がマウスの心臓同種異系移植片の生存をひきのばす」J Immunol,１９
９６．１５６（６）：２３１６−２３）。

【００６７】 さらにもう１つの実施形態においては、移植体器官内のこれらの遺伝子の発現
の成功が患者に全身的免疫抑制を提供する必要性及びそれに関連する問題を低減
又は削除することになる。

【００６８】 さらにもう１つの実施形態では、本発明の免疫抑制系は、ガン治療プロトコル
における治療薬として使用可能である。この実施形態に従うと、本発明の免疫抑
制系には、高レベルで発現される多くの免疫抑制剤が含まれる。高レベルで、こ
れらの作用物質は、免疫系の標的となり、免疫系は形質導入された細胞をターゲ
ティングし破壊する。かくして、この系は、これらの細胞に対する免疫応答を生
成するべく腫瘍細胞を形質導入し細胞を死滅させるのに使用することができる。
Leong, CC,「ヒトサイトメガロウイルス感染における天然キラー細胞の細胞障害
性の変調：内因性クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体及びウイルスクラスＩ相同
体の役割」J. Exp. Med., １８８（３）：６１４（１９９８）；Yokoyama, W.M.
,「天然キラー細胞レセプター」Current Opinion in Immunology,１０（３）： ２９８−３０５（１９９８）；Komatsu, F., et al.,抗−ＨＴＬＶ−１に起因す
る抗体依存性細胞媒介細胞障害性と、成人Ｔ細胞白血病細胞系統上の主要組織適
合遺伝子複合体クラスＩ抗原の負のシグナルの関係」Oncology Research,１０（
２）：５９−６７（１９９８）；Fletcher, J.M.,et al.,「サイトメガロウイル
ス（ＣＭＶ）感染細胞の天然キラー細胞溶解は細胞表面クラスＩ ＨＬＡのＣＭ Ｖ誘発されたダウンレギュレーションとではなく、細胞表面リンパ球機能関連抗
原−３（ＬＦＡ−３）発現ウイルスにより誘発された変更と相関関係をもつ」Jo
urnal of Immunology,１６１（５）：２３６５−２３７４（１９９８）。 この実施形態のためには、発現系は、腫瘍細胞に対して自殺遺伝子の発現を向
けるための誘発性又は好ましくは腫瘍特異的なプロモーターを内含することにな
る。このようなプロモーターは当業者にとって既知でかつアクセス可能なもので
ある：Gotoh, et. al., The Journal of Urology, Vol１６０「アンドロゲン非 依存性ヒト前立腺ガンのための前立腺特異的抗原プロモーターベースの遺伝子療
法の開発」ｐ２２０−２２９ １９９８；Pang, Shen et. al, Cancer Research
Vo１５７「前立腺特異的抗原の組織特異的発現の原因となる正の調節要素の同定
」ｐ４９５−４９９,(１９９７）；Lin, Ching・Shwun, et. Al, The Journal o
f Biological Chemistry, Vol２６８ No.４「正常な細胞及び新生細胞内のヒト Ｌ−プラスチン遺伝子プロモーターの特徴づけ」ｐ２７９３−２８０１（１９９
３）；及び Lin, Ching-Shwun et.Al., DNA and Cell Biology, volume１６ No.
Ｉ「マウスＬ−プラスチン遺伝子プロモーター：その同定とヒトＬ−プラスチン
遺伝子プロモーターとの比較」ｐ９−１６（１９９７）。

【００６９】 本書に記述されている方法及び組成物の恩恵を完全に利用するために、数多く
の一般的遺伝子療法改良を使用することが考慮され、本発明の範囲内に入るよう
意図されている。このようにして、より高いウイルス力価の産生、より効率の良
い遺伝子送達、及びターゲティングされた遺伝子送達といったような改良が利用
されることになり、本発明の範囲内に入ることが意図される。

【００７０】 遺伝子療法ベクターを改良するための付加的成分の選択及び使用は、日常的実
験を通して単純に特徴づけされるものとして見られ、本発明の範囲内に入るべく
意図されている。

【００７１】 本書で引用される全ての参考文献は、以下のものを含め、その全体が参考とし
て明らかに本書に内含される： Miller, et al., 「ヘルパーウイルス産生を導く組換えを回避するためのレト
ロウイルス パッケージ細胞系統の再設計」、Molecular and Cellular Biology 、６：（８），２８９５−２９０２（１９８６）。 Koenig, Scott, 「ＨＩＶ患者からの教訓：免疫応答はなおも遺伝子療法の悩 みの種（或いは有望な見通し）でありつづけている」Nature Medicine,２：（６
），１６５（１９９６）。 York. I.A. et al.「シトゾル単純ヘルペスウイルスタンパク質がＣＤ８＋Ｔ リンパ球に対する抗原提示を阻害する」、Cell.１１：５２５−５３５（１９９ ４）。 Rosenthal, K, 「単純ヘルペスウイルス糖タンパク質ｇＣを発現するもののｇ
Ｂ，ｇＤ又はｇＥを発現しない細胞がマウスウイルス特異的細胞障害性リンパ球
により認識される」、Journal of Virology,６１（８）２４３８−２４４７（１
９８７）。 Jones et al., 「ヒトサイトメガロウイルスのユニーク短領域内の多数の独立
した遺伝子座が主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ重鎖の発現をダウンレギュレ
ートする」、Journal of Virology,６９（８）４８３０−４８４１。 Wientz et al.,「ヒトサイトメガロウイルスＵＳ１１遺伝子産物は小胞体から
シトゾルへＭＨＣクラスＩ重鎖を転座させる」、Cell ８４，７６９−７９ Hill, et al.,「単純ヘルペスウイルスは、宿主免疫を回避するべくＴＡＰを オフにする」、Nature, ３７５ ４１１−４１５（１９９５） Galocha et al.,「ＩＣＰ４７の活性部位すなわち、抗原処理（ＴＡＰ）に結 びつけられた主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）でコードされたペプチドの単
純ヘルペスウイルスでコードされた阻害物質が、ＮＨ₂−末端３５残基にマッピ ングする」、１８５（９）１５６５−１５７２（１９９７） Tomazin et al., 「ＴＡＰのペプチド結合部位に対する単純ヘルペスウイルス
ＩＣＰ４７タンパク質の安定した結合」、ＥＭＢＯ Ｊ１５（１３）３２５６− ３２６６（１９９６） Kwangseog et al.,「単純ヘルペスウイルスタンパク質ＩＣＰ４７によるＴＡ Ｐ阻害の分子メカニズム及び種特異性」，ＥＭＢＯ Ｊ １５（１３）３２４７−
３２５５（１９９６） Fruh et al.,「抗原提示のためのペプチド輸送体のウイルス阻害物質」、Natu
re, ３７５ ４１５−４１８（１９９５） Machold et al., 「ＨＣＭＶ遺伝子産物ＵＳ１１及びＵＳ２は、マウス組織適
合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ重鎖の対立形質を攻撃するそれらの能力にお
いて異なっている」、J Exp. Med.,１８５（２）３６３−３６６（１９９７） Jones et al., 「ヒトサイトメガロウイルスＵＳ２は、主要組織適合遺伝子複
合体クラスＩ重鎖を不安定にする」Journal of Virology,７１（２）２９７０−
２９７９（１９９７） Nagata, M., et al., 肥満していない糖尿病マウス内の細胞障害性Ｔリンパ球
によるすい島細胞の破壊」、Journal of Immunology,１４３，１１５５−１１６
２（１９７８）。 Qin, L.,et al., 「ウイルスＩＬ−１０遺伝子のレトロウイルス媒介移入がマ
ウスの心臓同種異系移植片の生存をひきのばす」The Journal of Immunology,１
５６ ２３１６−２３２３（１９９６）。 Parks. et al.,「脳心筋炎ウイルス３Ｃプロテアーゼ：ウイルス５’非コーデ
ィング配列をＰ３領域に連鎖するクローンからの効率の良い無細胞発現」Journa
l of Virology ６０（２）３７６−３８４（１９８６） Fruh et al.,「抗原提示のためのペプチド輸送体のウイルス阻害物質」Nature
, ３７５ ４１５−４１８（１９９５）

【００７２】 以下の例は、本発明の組成物及び方法をさらに例示することを意図したもので
あり、いかなる形であれ本発明を制限しようとするものではない。

【００７３】

【実施例】

例１ 数多くのタイプの免疫応答のうち、ＭＨＣＩで制限された抗原に対するＣＴＬ
細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答は、ウイルス感染に対する宿主応答におい
て早期に主要な役割を果たすものであることが知られている。予想される通り、
導入遺伝子及びウイルスタンパク質に対する宿主ＣＴＬの応答は、ウイルスベー
スの遺伝子療法プロトコルの中で観察されてきた。ウイルスベクターの宿主排除
（ＦＫ５０６による過渡的免疫抑制は、Lochmuller, H et al.,「成体ジストロ フィー(mdx）マウスの骨格筋に対するアデノウイルス媒介のジストロフィンミニ
遺伝子の移入の後の持続した高レベルジストロフィン発現を可能にする。Gene T
her,３（８）：７０６−１６（１９９６）；Smith T.A. et al.,「過渡的免疫抑
制は、アデノウイルスベクターを反復的にうまく静脈内投与できるようにする」
、Gene Ther ３（６）：４９６−５０２（１９９６）；Riddell S.R., et al.,
「ＨＩＶ感染した患者における遺伝子修飾したＨＩＶ特異的細胞障害性Ｔリンパ
球のＴ細胞媒介拒絶」、Nat Med ２（２）；２１６−２３（１９９６））及び導
入遺伝子に対する特異的Ｔ細胞応答（Poller, W et al,「アデノウイルスＩＸ因
子ベクター内へのＥ３領域遺伝子の取込み及び宿主の過渡的抗ＣＤ４処理による
導入遺伝子発現の安定化」、Gene Ther,３（６）；５２１−３０（１９９６）；
Tripathy, S.K. et al.,「導入遺伝子でコードされたタンパク質に対する免疫応
答が、複製欠損性アデノウイルスベクターの注入後の遺伝子発現の安定性を制限
する」、Nat Med,２（５）；５４５−５０（１９９６））が充分に報告されてき
ている。従って、宿主ＣＴＬ応答を克服し、ベクターの生存を延ばすことが、今
、遺伝子療法系における優先度の高い最終目標として認識されている。

【００７４】 通常の経路では、ＭＨＣＩ分子は、小胞体（ＥＲ）の管腔内で合成され、充分
成熟した状態となる。成熟ＭＨＣＩ分子は、ゴルジ体を通って輸送され、細胞表
面上に提示される。組立てられていないＭＨＣＩ分子は、ゴルジ体の中で分解さ
れ、細胞表面上で提示されない。（McFadden, G. and K. Kane,「いかにしてDNA
ウイルスは、免疫認識を変えるべく機能的ＭＨＣ発現を混乱させるか」、Adv Ca
ncer Res ６３：１１７−２０９（１９９３））。抗原エピトープを決定する８ 〜１０個のアミノ酸ペプチドは、主としてプロテオゾ−ムによってシトゾル内で
外来性タンパク質から生成され、抗原処理（ＴＡＰ）ペプチド輸送体に結びつけ
られた輸送体によってＥＲ内に輸送される（Heemels, M.T., et al.,「抗原処理
と結びつけられた輸送体の変異体によっるペプチド転座」、Science ２６２（５
１４２）：２０５９−６３（１９９３））。免疫抑制剤ＩＣＰ４７は、TAP輸送 体のシトゾル側でペプチド負荷部位に結合する（Tomazin, R., et al.,「TAPの ペプチド結合部位に対する単純ヘルペスウイルスＩＣＰ４７タンパク質の安定し
た結合」、EMBO J. １５（１３）：３２５６−６６（１９９６）。このＩＣＰ４
７（ＴＡＰ）会合は、８〜１０個のアミノ酸ウイルスペプチドがＥＲ内に入るの
を防ぎ、かくして細胞表面上に存在するＭＨＣＩ分子の数を低減させる。ｈＣＭ
Ｖ ＵＳ１１遺伝子産物は、抗原処理及び提示経路内で異なる段階に影響を及ぼ す。ＵＳ１１遺伝子は、ＭＨＣＩ分子をＥＲからそれらが急速に分解されるシト
ゾルへと転座させる膜内外糖タンパク質をコードする。(Beersma, M.F., M.J.Bi
jlmakers,及び H.L.Ploegh,「ヒトサイトメガロウイルスは、クラスＩのＨ鎖の 安定性を低減させることによりＨＬＡクラスＩ発現をダウンレギュレートする」
、J Immunol, １５１（９）：４４５５−６４（１９９３）。ＵＳ１１が発現さ れる細胞内では、新たに合成されたＭＨＣ１が１分未満の半減期を有し、細胞表
面では提示されない。これらのウイルスタンパク質は小さく、レトロウイルス遺
伝子療法ベクターのパッケージサイズの制約条件を容易に満たす。

【００７５】 これらの実験のためには、マウス由来のレトロウイルスベクターＬＸＳＮが、
ウイルス免疫抑制遺伝子を送達し発現するために使用された。（Miller, A.D.及
び C.Buttimore, 「ヘルパーウイルス産生を導く組換えを回避するためのレトロ
ウイルスパッケージ細胞系統の再設計」、Mol Cell Biol.１９８６，６（８）；
２８９５−９０２）。ＬＸＳＮは、必要な細胞シャトル遺伝子とレトロウイルス
インサート（図１）で構成されている。レトロウイルスインサートは、レトロウ
イルス組込みのための５’及び３’の長い末端反復（ＬＴＲ）を有し、ＳＶ４０
プロモーターが、ネオマイシン相同体Ｇ４１８と共に選択可能マーカーとして使
用するためネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ発現を制御する。さらに、
ＬＸＳＮは、ベクターが適切なパッケージ細胞系統内でウイルス粒子を産生でき
るようにする拡張されたパッケージシグナルを有する。（Miller, A.D. 及び C.
Buttimore, 「ヘルパーウイルス産生を導く組換えを回避するためのレトロウイ ルスパッケージ細胞系統の再設計」。Mol Cell Biol. １９８６，６（８）；２ ８９５−９０２；Miller, A.D., レトロウイルス パッケージ細胞、Hum Gene Th
er,１９９０．１（１）：５−１４）。パッケージ細胞系統は、ウイルスgag pol
及び env遺伝子と安定した形でトランスフェクションされる。この系は、トラ ンスフェクションを受けたＬＸＳＮ パッケージ細胞系統から複製無能レトロウ イルス粒子を産生できるようにする。ＬＸＳＮベクターは、５’ＬＴＲプロモー
ターの下流側にあるマルチクローニング部位の中に遺伝子を挿入することによっ
て修飾可能である。ＬＸＳＮベクターは、本発明において使用される遺伝子を送
達するのに有用であることが立証されたが、以下に紹介する対照実験は、その他
のウイルス及び非ウイルス送達方法がさらに一層有効なものであることが立証さ
れる可能性もあるということを示唆している。

【００７６】 我々は、遺伝子療法ベクターに対する細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）免疫応
答をダウンレギュレートするため２つのウイルス遺伝子、すなわちＩ型単純ヘル
ペスウイルス（ＨＳＶ）ＩＣＰ−４７をコードする遺伝子（York I.A., et al.
「シトゾル単純ヘルペスウイルスタンパク質がＣＤ８＋Ｔリンパ球に対する抗原
提示を阻害する」Cell, １９９４．７７（４）：５２５−３５；Rosenthal, K.L
., et al.,「単純ヘルペスウイルス糖タンパク質ｇＣを発現するもののｇＢ，ｇ
Ｄ又はｇＥを発現しない細胞がマウスウイルス特異的細胞障害性リンパ球により
認識される 」、J Virol. １９８７，６１（８）：２４３８−４７）及びヒトサ
イトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）ＵＳ１１遺伝子（Jones, T.R., et al.,「ヒト
サイトメガロウイルスのユニーク短領域内の多数の独立した遺伝子座が主要組織
適合遺伝子複合体クラスＩ重鎖の発現をダウンレギュレートする」J Virol,１９
９５．６９（８）：４８３０−４１；Wiertz, E.J., et al.,「ヒトサイトメガ ロウイルスＵＳ１１遺伝子産物は小胞体からシトゾルへＭＨＣクラスＩ重鎖を転
座させる」，Cell, １９９６．８４（５）：７６９−７９）を利用してきた。

【００７７】 ＬＩＳＮは、ＨＳＶ ＤＮＡからＨＳＶＩＣＰ−４７遺伝子をクローニングし 、それをＬＸＳＮ遺伝子療法ベクター内にサブクローニングすることによって作
られた（図２Ａ）。ＨＳＶＩＣＰ−４７遺伝子は、８７アミノ酸の即時早期ＨＳ
Ｖタンパク質についてコードする。ＩＣＰ−４７タンパク質は、ＭＨＣＩ処理及
び提示経路のＴＡＰタンパク質に結合し、ＥＲ内にウイルスペプチドを輸送する
その能力を阻害する（Hill, A et al.「単純ヘルペスウイルスは、宿主免疫を回
避するためＴＡＰをオフにする」 Nature,１９９５．３７５（６５３０）：４１
１−５；Ahn, K., et al.,「単純ヘルペスウイルスによるＴＡＰ阻害の分子メカ
ニズムと種特異性」ＩＣＰ４７．Embo J. １９９６．１５（１３）：３２４７−
５５）。ペプチドが無い場合ＭＨＣ−Ｉ分子は急速に分解され、細胞表面に輸送
されない。（York, I.A., et al.,「シトゾル単純ヘルペスウイルスタンパク質 がＣＤ８＋Ｔリンパ球に対する抗原提示を阻害する」Cell, １９９４．７７（４
）：５２５−３５；Fruh, K., et al.,「抗原提示のためのペプチド輸送体のウ イルス阻害物質」Nature, １９９５、３７５（６５３０）：４１５−８）。

【００７８】 ＭＨＣ−Ｉ細胞表面発現をダウンレギュレートすることが示された第２のウイ
ルス遺伝子ｈＣＭＶ ＵＳ１１が、同様に近年になって同定され特徴づけされた 。ＭＨＣ−Ｉ分子は、膜の中に定着させられた重鎖及び会合されたβ２マイクロ
グロブリン鎖で構成されている。ｈＣＭＶ ＵＳ１１遺伝子産物は、ＨＭＣ−Ｉ 重鎖をＥＲ管腔からシトゾルまで転座させ、このシトゾルにおいてこの重鎖はプ
ロテオゾームにより分解されるということが立証されてきた。（Machold, R.P.,
et al.,ＭＣＭＶ遺伝子産物ＵＳ１１及びＵＳ２は、マウスの主要組織適合遺伝
子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ重鎖の対立形質を攻撃するその能力において異なっ
ている」J Exp Med,１９９７．１８５（２）：３６３−６；Jones,T.R. and L.
Sun,「ヒトサイトメガロウイルスＵＳ２は主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ重
鎖を不安定にする」J Virol,１９９７．７１（４）：２９７０−９）。ＬＵＳＮ
ベクターは、ｈＣＭＶ感染細胞系統からｈＣＭＶ ＵＳ１１遺伝子をクローニン グし、その後それをＬＸＳＮベクター内にサブクローニングすることによって構
築された（図２Ｂ）。

【００７９】 アデノウイルスＧＰ１９Ｋをコードする遺伝子を取込んだ第３のベクターＬＧ
ＳＮも、類似の要領で構築された（図１２）（データ示さず）。ＭＨＣＩの処理
及び提示経路の抑制にはＧＰ１９ｋも同様に関与しており、これらの研究におい
ては、ＬＧＳＮベクターも使用された。

【００８０】 ＭＨＣ−１発現をダウンレギュレートする上でのその有効性を見極めるべくＬ
ＩＳＮ及びＬＵＳＮベクターの両方をテストする目的で、該タンパク質を発現す
る細胞系統を構築することが必要であった。ウイルス上清を生成するために、２
つのマウスパッケージ細胞系統が使用された。まず第１に、ＧＰＥ８６細胞をリ
ポゾームトランスフェクション方法を用いてベクターでトランスフェクションし
た。ＧＰＥ系統からの上清を使用してＰＡ３１７細胞を形質導入し、Ｇ４１８含
有培地内で選択により、成功したトランスフェクタントを同定した。その後、Ｐ
Ａ３１７細胞系統からの上清を用いてＡ３７５細胞を形質導入した。Ａ３７５は
、ヒト黒色腫細胞系統であり、上述の手順は、２つの混合個体群細胞系統つまり
Ａ３７５／ＬＩＳＮ及びＡ３７５／ＬＵＳＮを結果としてもたらした。ＬＸＳＮ
ベクターを取込んだ状態のＡ３７５対照細胞Ａ３７５／ＬＸＳＮを生成するため
、同じ３段階方法を使用した。ノーザンブロット分析が、適切な細胞系統中のＬ
ＩＳＡ及びＬＵＳＮＲＮＡの存在を確認した（図３）。ＭＨＣ−Ｉ細胞表面発現
を評価するため、抗ＭＨＣ−ＩモノクローナルＡｂ，Ｈ５８Ａ及びＦＩＴＣ標識
づけされた antマウス ２次Ａｂを使用した。結果を、螢光活性化された細胞選 別装置を用いて分析した。Ａｂ標識づけプロセス中に細胞が透過性付与されるこ
とはなく、従って、螢光の減少は、細胞表面ＭＨＣ−１の減少を表わしている。
Ａ３７５細胞の自己螢光及びＦＩＴＣ標識づけされた２次的Ａｂの背景結合を評
価し、それが無視できるものであることがわかった（図４）。Ａ３７５／ＬＸＳ
Ｎ細胞系統は、ウイルス感染に対する一般的応答として観察された細胞ＭＨＣ−
１発現の著しい増大を往々にして示した。Ａ３７５／ＬＸＳＮは、大部分の遺伝
子療法送達方法がウイルスベースであることから、これらの実験にとってさらに
適切な対照である。ＬＩＳＮ及びＬＵＳＮベクターは両方共、Ａ３７５／ＬＸＳ
Ｎレベル又はＡ３７５レベルのいずれかからＭＨＣ−Ｉ発現を著しく低減させた
。

【００８１】 細胞表面ＭＨＣ−Ｉの減少が、ＣＴＬ細胞溶解を低減させるという望ましい効
果をもつか否かを見極めるため、細胞障害性検定を実施した（図５）。この検定
では、安定したシトゾル酵素、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を測定す
ることによって標的細胞を溶解させるＣＴＬの能力が測定される。ＣＴＬエフェ
クタ細胞を用いて、ベクターで形質導入された標的細胞をインキュベートした後
、Ｏ．Ｄ．４９２で読取った基質呈色反応を用いて、ＬＤＨ放出量を測定する。
５つのエフェクタ−標的比を用い、自発的放出と培地背景ＬＤＨの両方を読取り
値から差し引いた。エフェクタ細胞として、クローン選択したＴ急性リンパ芽球
性白血病（ＴＡＬＬ）細胞系統（ＴＡＬＬ−１０４，Ａ標的細胞Ｃ）をエフェク
タ細胞として使用した。ＴＡＬＬ−１０４細胞は、腫瘍細胞の高特異性溶解を有
するものとして知られ、従ってこの検定にはきわめて適している。ＭＨＣ−Ｉ細
胞表面結果から予測されるように、Ａ３７５／ＬＸＳＮは、ＴＡＬＬ細胞による
最高の特異的溶解を示し、その後にＡ３７５，Ａ３７５／ＬＩＳＮ 及び Ａ３７
５／ＬＵＳＮがそれぞれ続いている。Ａ３７５は細胞系統は、図４及び６Ｄに姿
を現わしている。６Ｄは４の反復であり、従って数字がわずかに異なっている。
図４にグラフ表示された実験を見ればわかるように、Ａ３７５／ＬＵＳＮ 対 Ａ
３７５／ＬＸＳＮ（それぞれ０.９３対１７.５）の細胞表面ＭＨＣ−Ｉの１８分
の１の減少の結果、１０：１の比でＴＡＬＬ溶解のほぼ４３％の減少がもたらさ
れた。Ａ３７５／ＬＩＳＮ対Ａ３７５／ＬＸＳＮの細胞表面ＭＨＣ−Ｉの８分の
１の減少（２.１９対１７.５）は、ＴＡＬＬ溶解の３２％の下降に対応していた
。これらの結果は、観察された細胞表面上のＭＨＣ−Ｉの減少レベルが、ＣＴＬ
の細胞溶解活性を低減させるのに充分であることを実証している。これらの結果
は、テスト対象の全ての細胞系統において一貫性のあるものであった。かくして
、ＨＳＶ ＩＣＰ−４７遺伝子及びｈＣＭＶ ＵＳ１１遺伝子は共に、宿主のＣＴ
Ｌ応答からＬＸＳＮ遺伝子療法ベクターを保護する。

【００８２】 ベクター構築 ＩＣＰ４７をコードするヘルペスウイルス遺伝子に対するプライマを、以下の
特徴をもつように設計した：順方向プライマ：遺伝子配列の開始に対し相補的な
２４ｂｐ，リポゾーム結合を促進するための Kosak配列、Hind III エンドヌク レアーゼ制限部位及び、プライマ末端及び Hind III 部位の安定化を助けるべく
添加されるグアニン及びシトシンヌクレオチド。逆方向プライマ：遺伝子の末端
であるアンチセンス配列に対し相補的な２４ｂｐ，Hind III 部位、及びＧＣク ランプ。遺伝子のＰＣＲ増幅を実施し、アガロースゲル電気泳動により確認した
（データ示さず）。増幅中ＴＡＱポリメラーゼによって残されたＡオーバーハン
グを活用するＰＣＲョ(Invitrogen)Ｔ/Ａクローニングベクターの中に産物を非指 向的にクローニングした。標本の同一性を確認するため、標本を配列決定した（
データ示さず）。その後、Ｅco ＲＩ部位においてＬＸＳＮマウスレトロウイル スバックボーン内含にＩＣＰ４７をサブクローニングさせた。制限消化物により
ＬＩＳＮの適正な配位が確認された。以下の差異を除き、上述のものと同じプロ
セスに従って、ＬＵＳＮベクターを生成した：プライマはｈＣＭＶ ＵＳ１１遺 伝子向けに設計し、鋳型は精製されたｈＣＭＶ ＤＮＡ(Sigma) であった。ＬＩ ＳＮは以下の要領で構築した。

【００８３】 ノーザン分析 完全ＲＮＡ精製キット（Quiagen Inc. Rneasy^TM）を用いて、形質導入された 混合Ａ３７５細胞系統からＲＮＡを精製した。成形済みの１.２５％アガロース ゲル（ＦＭＣ Bioproducts）の各レーン上に１０μｇの精製ＲＮＡを投入した。
ＲＮＡを、０.４５μｍの孔径のナイロン膜にサザンブロットし（Oncor Sure Bl
ot^TM）、紫外線光を用いて架橋させた。ランダムプライミングされたＤＮＡ標識
づけキット（Boehringer Manhein Inc.)を用いてＬＸＳＮ汚染を回避するべく非
ＬＸＳＮベクターからＩＣＰ４７及びＵＳ１１の両方の遺伝子について³²Ｐ放射
性標識付けされたＤＮＡプローブを作製した。プローブを、ハイブリダイゼーシ
ョン溶液（Oncor Hybrizo/^TMＩ）中で４２度で１２時間膜と共にインキュベート
し、２×ＳＳＣ/０.１％ＳＤＳ中で２回５分間洗浄した。膜をフィルムに露呈し
現像した。

【００８４】 ＭＨＣＩ発現検定： 細胞表面ＭＨＣＩ阻害、形質導入されたＡ３７５細胞の混合個体群を、１時間
３７度で０.１μｇ／０.５×１０⁶細胞の割合で抗−ＭＨＣＩＡｂ（ＶＭＲＤ In
c.)で標識づけした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、３７度で１時間、ヤギ抗マウ スＦＩＴＣ標識づけ済み二次Ａｂ(Sigma）の１：１５０希釈液を添加した。再び
細胞を２回洗浄し、フェノール赤を含まず又血清を含まないＦＡＣＳ分析用Ｏpt
i−ＭＥＭＲ（Gibco BRL)培地内で再懸濁させた。各々の３つの標本を平均し、 標準偏差を決定した。Ａ３７５Ａｂ無し、Ａ３７５一次無し及びＡ３７５が、形
質導入を受けていない対照である。

【００８５】 ＣＴＬ応答抑制検定： ＴＡＬＬ−１０４エフェクタ細胞による、Ａ３７５形質導入を受けた標的細胞
の特異的溶解。９６ウェルの組織培養平板（４ウェル／データポイント）上で５
×１０³個の標的細胞／ウェルをアリコートにする。エフェクタ細胞を１０：１ ，７.５：１，５：１，２.５：１，及び１.２５：１の比率で添加し、７時間イ ンキュベートする。１組の対照ウェルを完全に溶解させることによって、１００
％溶解を決定する。ウェル内に放出された安定したシトゾル酵素（乳酸デヒドロ
ゲナーゼ、ＬＤＨ）の量を測定し呈色反応（Promega Corp. Cytotox ９６Ｒ検定
キット）を用いることによって、細胞溶解を決定する。基線ＬＤＨレベルを確立
し、エフェクタ及び標的細胞による自発的ＬＤＨ放出を差し引く。呈色反応の範
囲は、４９２nmで９６ウェル平板の分光光度計を用いて決定する。

【００８６】 例２ ＬＩＳＮ及びＬＵＳＮを構築した後、Ａ３７５に加えてその他の細胞系統内で
もレトロウイルス系内で予想した通りに遺伝子が発現され働いたか否かを見極め
るため、上述のとおりに実験を行なった。ベクター生産者細胞を作製し、いくつ
かの細胞系統を形質導入した。ノーザン分析は、標的細胞系統内の両方の遺伝子
の転写を確認した（データ示さず）。抗ＭＨＣＩモノクローナル一次Ａｂ及びＦ
ＩＴＣ標識づけされた二次Ａｂを用いて、細胞表面ＭＨＣＩを測定した。螢光活
性化細胞（ＦＡＣＳ）分析を用いて、結果を測定した（図６Ａ−Ｆ）。ＬＩＳＮ
又はＬＵＳＮベクターで形質導入された細胞の混合個体群は、テスト対象のヒト
細胞系統全てにおいてＬＸＳＮで形質導入された対照に比べて著しい細胞表面Ｍ
ＨＣＩの減少を示した。従って、テスト対象の両方の遺伝子はこれらの細胞系統
におけるＭＨＣＩ細胞表面発現のレベルを著しく低減させた。

【００８７】 ＭＨＣＩの減少がＣＴＬ活性の減少を導くことになるか否かを見極めるため、
クローン選択されたＴ急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ−１０４）細胞系統を得た
。ＴＡＬＬ−１０４は、腫瘍細胞全般に対する増強した細胞障害性効果を示すＣ
Ｄ８＋ＣＴＬ系統である。（R.,O. C., et al.「小児期急性Ｔ−リンパ芽球性白
血病の成長因子必要条件：染色体異常の存在と in vitro で永久的に成長する能
力の間の相関関係」Blood,７７（７）：１５３４−４５（１９９１））。Ａ３７
５及びＶＡＮ細胞系統を特異的に溶解するその能力を決定するべくＴＡＬＬ細胞
をテストした（図７Ａ及びＢ）。以前に観察された細胞表面ＭＨＣ１の減少した
レベルと、ＴＡＬＬ細胞による特異的溶解の低減したレベルはよく似ている。こ
のデータから、我々は、ＭＨＣＩ細胞表面発現の低減が、形質導入を受けたＬＩ
ＳＮ又はＬＵＳＮ細胞の in vitro でのＣＴＬによる溶解の減少を導くという結
論を下す者である。これらの実験において使用される全てのウイルス及び細胞培
養材料は、学会の方針に従った生物安全性レベル２の作用物質として取扱われる
。

【００８８】 例３ ＩＣＰ４７及びＵＳ１１は、各々、ＭＨＣＩ制限エピトープの発現を減少させ
る。いずれか１方の遺伝子が単独で行なうよりも両方の遺伝子の場合の方が優れ
た働きをするか否かを見極めるため、２つの異なるアプローチを使用することが
できる。まず第１に、異なる選択方法を用いた２つの別々のベクターの同時形質
導入が行なわれることになる。第２に、ＩＲＥＳ内部プロモーターを含有する単
一の構成体から両方の遺伝子を発現させた。２つの遺伝子を発現する単一の構成
体は、１つの複雑化要因としてのＲＮＡレベルの差異を無くする。上述のアプロ
ーチは両方共、比較的新しいＩＲＥＳ技術での予見しがたい問題を回避する目的
で同時に追求される。図１５，１６，１９及び２０を参照のこと。選択方法とし
てハイグロマイシン耐性を使用する、ＬＩＳＮに類似したベクターが構築される
ことになる（図８）。このＬＩＳＨベクターは次に、パッケージ細胞内にトラン
スフェクションされ、上清は、すでにＬＵＳＮベクターを含有する標的細胞を形
質導入するために使用されることになる。２重の形質導入を受けた細胞は、Ｇ４
１８及びハイグロマイシンの両方を使用するために選択された。

【００８９】 例４ ウイルス内に見られるち密なゲノムは、内部リボソーム入口部位（ＩＲＥＳ）
を取込むことによって単一のＲＮＡ分子から離れて多数の遺伝子を発現するため
のシステムの発展を導いた。市販のＩＲＥＳ（Movagen ｐＣＩＴＥ−４ａ−ｃ(t
) ）は、長さ約４５０ｂｐで、非常に有効に翻訳を開始することが示されてきた
。（Parks, G. D., G.M.Duke 及びA.C. Palmenberg,「脳心筋ウイルス３Ｃプロ テアーゼ；Ｐ３領域に対しウイルス５’非コーディング配列を連鎖するクローン
からの効率の良い無細胞発現」、J. Virol６０（２）：３７６−８４（１９８６
）。ＬＵＩＳＮベクター（図９）は、標的細胞系統を形質導入するために作製さ
れ使用されることになる。

【００９０】 上述のモデルのいずれかによってひき起こされるＭＨＣＩ細胞表面減少のレベ
ルを、記述された抗体ベースのプロトコル（図６）を用いて決定する。特異的溶
解阻害を、記述された方法（図７）を用いて見極めることになる。

【００９１】 例５ ＨＳＶＩＣＰ４７及びｈＣＭＶ ＵＳ１１は両方共、テストされた細胞系統の 細胞表面 のＭＨＣＩ及びＣＴＬ特異的溶解の量を著しく低下させる。遺伝子療
法プロトコルにおけるこれらの遺伝子の潜在的応用には、さまざまな器官及び組
織に対するターゲティングされたベクター送達が関与する可能性が高い。さらに
、一次細胞培養に対し確立された細胞系統を比較した時点で、遺伝子発現に著し
い差異が存在することが立証された。一次細胞培養中のＬＩＳＮ及びＬＵＳＮの
機能を評価するため、選択された一次細胞培養を用いて、ＭＨＣＩ形質導入、発
現、及び細胞障害性実験が反復されることになる。ヒトの肝臓、肺、腎臓及び骨
髄からの一次培養は現在市販されており、これを形質導入しＭＨＣＩ細胞表面減
少についてテストすることになる。 その他の組織からの一次細胞培養をテストすることも可能である。

【００９２】 ＬＩＳＮ及びＬＵＳＮベクターのためのパッケージ細胞系統が確立されてきて
いる。以上で列挙した標的細胞を形質導入するためには、これらの系統からの上
清が使用される。形質導入された標的細胞は、ネオマイシン相同体であるＧ４１
８の中で２−４週間選択されることになる。

【００９３】 ＭＨＣＩ細胞表面減少を、記述された方法（図６）を用いて評価する。ＴＡＬ
Ｌ−１０４細胞による特異的溶解を、記述されたとおり（図７）に測定する。

【００９４】 例６ ＣＴＬ活性の減少が結果として in vivo でのベクター生存の延長をもたらす ことになるか否かを見極めることが有利であろう。このアプローチの潜在的利用
分野はかなり多様であり、特定の利用分野に対処するためのモデルを作る必要が
ある。in vivo モデルの選択に関する１つの複雑化要因が、図１０に示されてい
るＩＣＰ４７及びＵＳ１２１の機能の中で立証されている。ＩＣＰ４７は、ここ
に示されている９Ｌ細胞系統といったラット細胞系統及び他の場所で報告されて
いるようなその他のげっ歯類系統の中で機能しない。（Ahn, K, et al.,「単純 ヘルペスウイルスＩＣＰ４７によるＴＡＰ阻害の分子メカニズムと種特異性」EM
BO J, １５（１３）：３２４７−５５（１９９６）。これはＴＡＰのげっ歯類バ
ージョン上にＩＣＰ４７結合部位が存在しないからである。従って、ＵＳ１１機
能をテストするためには、in vivo げっ歯類モデルのみが使用されることになる
。ＩＣＰ４７の in vivo機能は、イヌ骨髄細胞系統Ｄ１７によって示されている
ようにイヌといったそこでそれが働くことがわかっているモデルの中で評価され
ることになる。さらに、in vivo モデルは複雑であることから、成功を期待して
いくつかの道を追求することが賢明である。第１のモデルは、骨髄細胞中で螢光
マーカー遺伝子ＧＦＰを発現することになる（Heim, R.,A.B.Cubitt, and R.Y.
Tsien,「改良型緑色螢光〔文字〕」Nature, ３７３（６５１６）：６６３−４（
１９９５）。このアプローチは、血液細胞中に由来する数多くの異なる遺伝病の
治療におけるＩＣＰ４７／ＵＳ１１免疫ダウンレギュレーションの取込みを評価
する上で有用となる。第２のモデルは、器官移植体及び／又は自己免疫疾患の治
療的処置として免疫抑制自体を使用することに注目するものである。全器官形質
導入技術における最近の改良によって、遺伝子療法ベクターで器官を形質導入し
た後、器官移植体実験を行なうことが可能となる。（Shaked, A., et al.,「移 植体設定におけるアデノウイルス媒介の遺伝子移入、II。同形移植片内の移入ｃ
ＤＮＡの成功裡の発現」Transplantation,５７（１０：１５０８−１１）（１９
９４）。第３のモデルは、イヌにおけるα−Ｌ−イズロンダーゼ欠損症の研究に
おいて追求されることになる。Shull, et.Al.,Human Gene Therapy, ７：１５９
５−１６０３「イヌのムコ多糖体沈着症」における筋芽細胞遺伝子療法：α−Ｌ
−イズロニダーゼに対する免疫応答による排除」（１９９６）。

【００９５】 形質導入されたリンパ球は、細胞及び体液性免疫応答の両方により、in vivo
での一般的リンパ球個体群から急速に除去される。（Tripathy. S.K. et al.,「
導入遺伝子でコードされたタンパク質に対する免疫応答は、複製欠損性アデノウ
イルスベクターの注入後の遺伝子発現の安定性を制限する」、Nat Med,２（５）
：５４５−５０（１９９６）；Riddell, S.R., et al.,「ＨＩＶ感染患者におけ
る遺伝子修飾されたＨＩＶ特異的細胞障害性リンパ球のＴ細胞媒介拒絶」；Nat
Med ２（２）：２１６−２３（１９９６）。細胞免疫応答は７日目にピークに達
するが、一方Ａｂ応答は、約１４日目でピークに達する。ＣＴＬ応答を除去する
と、in vivo での形質導入を受けたリンパ球の生存がひき延ばされるはずである
。螢光リンパ球を得るためには、ＬＧＳＮ，ＬＧＩＳＮ及びＬＧＵＳＮという３
つのベクターが構築されることになる（図１１）。ベクター生産者細胞を確立し
、上清をリンパ球の形質導入のために使用する。

【００９６】 マウスリンパ球を分離し、形質導入し、選択し、同系動物体内に輸注により戻
す。螢光マーカーの持続性が、周期的血液標本のＦＡＣＳ分析によって評価され
ることになる。

【００９７】 これらの免疫抑制遺伝子の最も直接的な応用は、免疫抑制を治療に使用するこ
とにある。このアプローチの魅力は、免疫抑制遺伝子を治療用遺伝子とすること
によって移入に必要とされる遺伝子の数を最小限におさえるという点にある。現
在、高い効率で肝臓といったような全器官に形質導入するのに使用することので
きる技術がいくつか存在する。さらに、或るタイプの糖尿病、関節炎、狼瘡など
といったいくつかの自己免疫障害が、自己エピトープに対するＣＴＬ活性に合わ
せて追跡されてきた。これらの疾病についての一次細胞培養データ及び動物モデ
ルが利用可能であることから、ＵＳ１１/ＩＣＰ４７機能をテストすることが可 能となるだろう。

【００９８】 このアプローチを利用すべく我々が計画している１つの例として、イヌのα−
Ｌ−イデュロンダーゼ遺伝子の補正バージョンを用いてＭＰＳＩ（ムコ多粘体沈
着症Ｉ）を治療するためのイヌのモデル系が存在する。初期試行は、免疫応答の
問題に遭遇している。このベクターは、α−Ｌ−ＩＤベクター内に免疫抑制を取
込み、それがうまく行くならば、疾病を治療するためヒトのα−Ｌ−ＩＤ遺伝子
について使用することができるだろう。Fassati. A,「自己不活性化ベクターの 長い末端反復内への２つの独立したエンハンサの挿入の結果、組織特異的発現を
伴う高力価のレトロウイルスベクターが得られる」、Human Gene Therapy, ９：
２４５９−２４６８（１９９８）；Shull et al.,「体液性免疫応答がイヌのＭ ＰＳＩにおける遺伝子療法を制限する」Blood.８８（１）：３７７−３７９（１
９９６）。

【００９９】 このプロトコルには、３つの遺伝子を発現するベクターの構築が必要とされる
。図１２に示されたＬαＳＩ／Ｎ及びＬαＳＵ／Ｎ構成体は、これらの必要条件
を満たすものと思われる。このベクターは骨髄細胞を形質導入するために用いら
れ、α−ＩＤの産生が長期間監視されることになる。免疫抑制遺伝子無しのこれ
までの実験が、骨髄細胞の約５％が長期にわたり治療以下のレベルでα−ＩＤを
発現すること、そして、この低い発現レベルが一部には、α−ＩＤタンパク質に
対する免疫応答に起因するものであることを実証している。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＬＸＳＮレトロウイルス遺伝子療法ベクターを概略的に表わす。

【図２Ａ及び２Ｂ】 使用されたクローニング方法及びその結果得られたベクターを概略的に表わす
。図２Ａは、精製されたＨＳＶＤＮＡから増幅されたシャトルベクター内に連鎖
されたＨＳＶＩＣＰ４７をコードする遺伝子である。この遺伝子は、その同一性
を確認するために配列決定された。遺伝子はその後、ＬＸＳＮのＥcoＲＩ制御部
位内にクローニングされ、結果としてＬＩＳＮベクターをもたらした。図２Ｂは
、ＬＵＳＮベクターを得るべくｈＣＭＶ感染細胞系統から類似の方法を用いてク
ローニングされたｈＣＭＶＵＳ１１遺伝子である。

【図３Ａ，３Ｂ及び３Ｃ】 構築された細胞系統が、期待されたＲＮＡを翻訳していたことを確認するため
のノーザンブロット分析を示す。図３Ａは、１０μｇの合計ＲＮＡ調製物を４つ
の指示された細胞系統から分離する１.２５％のアガロースゲル電気泳動である 。図３Ｂは、ナイロン膜に移され、放射性標識づけされたＩＣＰ４７ＤＮＡでプ
ローブ探査され、オートラジオグラフィによって検出されたＲＮＡである。観察
されたバンドは、ＬＩＳＮ ＲＮＡについての予測されたサイズである。図３Ｃ は、放射性標識づけされたＵＳ１１ＤＮＡでプローブ探査された同じナイロン膜
である。観察されたバンドはＬＵＳＮ ＲＮＡの予測されたサイズである。

【図４】 この図では、抗ＭＨＣＩモノクローナルＡｂ及びＦＩＴＣ標識づけされた二次
的Ａｂを用いて、相対的なＭＨＣクラスＩ細胞表面発現が決定された。結果は、
螢光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）によって分析され、その結果が図４に示さ
れている。Ａ３７５ Ａｂ無は、Ａ３７５細胞系統による自己螢光を測定する。 Ａ３７５一次無は、二次Ａｂからの評価できるレベルの非特異的結合が存在する
か否かを見極めるためニ次Ａｂのみで標識づけされたものである。

【図５】 ５つのエフェクタ／標的細胞比にわたり決定されたＴＡＬＬ−１０４ＣＴＬ細
胞による４つの標的細胞系統の特異的溶解を描いている。この特異的溶解は、方
法の中で記述されているとおりに決定された。

【図６Ａ−Ｆ】 細胞表面のＭＨＣＩ阻害を描いている。形質導入された細胞の混合個体群を、
１時間３７度で０.１μｇ／０.５×１０⁶細胞の割合で抗ＭＨＣＩＡｂ（ＶＭＲ ＤＩnc.)で標識づけした。ＰＢＳ２ｘで細胞を洗浄し、ヤギ抗マウスＦＩＴｃで
標識づけされた二次Ａｂ（Sigma)の１：１５０希釈液を３７度で１時間添加した
。２ｘで細胞を再度洗浄し、ＦＡＣＳ分析のためフェノール赤を含まない／血清
を含まないＯpti-ＭＥＭＲ培地内でこれを懸濁させた。各々の３つの標本を平均
し、標準偏差を決定した。Ａｂ無、一次無、形質導入を受けていない対照及びＬ
ＸＳＮで形質導入された対照について、全ての細胞系統をテストした。６Ａ（形
質導入された２９３細胞系統）は、形質転換されたヒト腎臓上皮細胞系統である
。６Ｂ（形質導入されたＶＡ１３細胞系統）は、形質転換されたヒト線維芽細胞
系統である。６Ｃ（形質導入されたＡ５４９細胞系統）は、ヒト肺ガン細胞系統
である。６Ｄ（形質導入されたＡ３７５細胞系統、これは図４で記述した実験の
くり返しである）は、ヒト黒色腫細胞系統である。６Ｅ（形質導入されたＯvcar
細胞系統) は、ヒトの卵巣ガン細胞系統である。６Ｆ（形質導入されたＩＧＲＯ
Ｖ細胞系統）は、ヒトの卵巣ガン細胞系統である。誤差バーは、３つの試行から
の平均の標準誤差を表わす。

【図７Ａ及び７Ｂ】 ＴＡＬＬ−１０４エフェクタ細胞による形質導入された標的細胞の特異的溶解
を描いている。１ウェルにつき５×１０³個の標的細胞を９６ウェルの組織培養 平板（４ウェル／データポイント）上でアリコートに分ける。指示された比でエ
フェクタ細胞を添加し、６時間インキュベートする。一組の対照ウェルを完全に
溶解させることによって１００％の分解を決定する。ウェル内に放出された安定
したシトゾル酵素（乳酸デヒドロゲナーゼ、ＬＤＨ）の量を測定し、呈色反応（
Promega Corp. Cytotox９６Ｒ検定キット）を使用することによって細胞溶解を 見極める（Sinensky, M.C., A.L.Leiser, 及び H.Babich, 「過酸化カルバミド の細胞障害性の酸化的ストレスの側面；in vitro研究」、Toxicol Lett, ７５（
１−３）；１０１−９（１９９５））。基線ＬＤＨレベルを立証し、エフェクタ
及び標的細胞による自発的ＬＤＨ放出を差し引く。９２ｎｍでの９６ウェル平板
分光光度計を用いて、呈色反応の範囲を見極める。Ａ３７５対照及び形質導入さ
れた細胞系統の７Ａ ＴＡＬＬ−１０４特異的溶解。これは、図５の場合と全く 同じデータ（図７Ａ）である。ＶＡ１３対照及び形質導入された細胞系統の７Ｂ ＴＡＬＬ−１０４特異的溶解。

【図８】 ＬＩＳＨベクターの概略図を表わす。ＬＩＳＮとの主たる差異が、ネオマイシ
ン耐性遺伝子に代ってハイグロマイシン耐性遺伝子が使用されている点にあるＬ
ＩＳＨの構造。

【図９】 ＬＵＩＳＮベクターの概略図を表わす。ＩＣＰ４７及びＵＳ１１が、内部リボ
ソーム入口部位ＩＲＥＳを用いて同じＲＮＡ分子から発現されている、ＬＩＵＳ
Ｎの構造。この構成体は、ＭＨＣ１レベル及び特異的溶解を評価するのに必要と
される対照の数を最小限におさえる。

【図１０Ａ及び１０Ｂ】 イヌ及びラットの細胞中のＩＣＰ４７及びＵＳ１１機能を表わす。イヌ骨髄細
胞系統Ｄ１７Ａ）及びラットのグリア芽細胞腫細胞系統９ＬＢ）を形質導入させ
、前述のとおりに、細胞表面ＭＨＣ１について検定した。ＩＣＰ４７は、げっ歯
類の細胞中では機能しないがイヌの細胞中では機能する。ＵＳ１１はげっ歯類及
びイヌの細胞の両方において機能する。

【図１１】 リンパ球発現ベクターを描いている。ＩＲＥＳ免疫抑制カセットが構築されＬ
ＧＳＮベクター内に挿入されることになる。ヒト化され赤色シフトされたｅＧＥ
Ｐ（Clonetech Inc)をＬＸＳＮベクター内にサブクローニングすることにより、
ＬＧＳＮベクターを構築した。

【図１２】 ＬαＳＩ／Ｎ及びＬαＳＵ／Ｎベクターを概略的に表わしている。両方のベク
ターを共に前述のとおりに免疫抑制について、又ウエスタン分析によりα−ＩＤ
発現についてテストすることになる。

【図１３】 本発明に従って設計されたｐＬＵＳＮベクターの地図である。

【図１４】 ｐＬＵＳＮベクターのヌクレオチド配列（配列番号２）である。

【図１５】 本発明に従って設計されたｐＬＸＳＵ−ＩＲＥＳ−Ｎベクターの地図である。

【図１６】 ｐＬＸＳＵ−ＩＲＥＳ−Ｎベクターのヌクレオチド配列（配列番号５）である
。

【図１７】 本発明に従って設計されたｐＬＩＳＮベクターの地図である。

【図１８】 ｐＬＩＳＮベクターのヌクレオチド配列（配列番号１）である。

【図１９】 本発明に従って設計されたｐＬＸＳＩ−ＩＲＥＳ−Ｎベクターの地図である。

【図２０】 ｐＬＸＳＩ−ＩＲＥＳ−Ｎベクターのヌクレオチド配列（配列番号３）である
。

【図２１】 ｐＬＸＳＮベクターのヌクレオチド配列（配列番号４）である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 Ａ６１Ｋ 35/76 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:93） // Ａ６１Ｋ 35/76 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:93） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 DA02 EA02 FA02 FA07 FA10 HA17 4B065 AA91Y AA93X AA95Y AA97Y AC10 AC20 BA02 BA25 CA24 CA44 4C084 AA13 ZC012 4C086 AA01 EA16 NA10 ZC01 4C087 AA01 BC83 ZC01

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 免疫抑制遺伝子をコードするヌクレオチド配列、 プロモーター、及び 転写終止シグナル、 を含む、治療用遺伝子導入のためのヌクレオチド発現系において、受容体細胞内
   への形質転換の時点で、前記治療用遺伝子に対する受容体細胞の免疫応答を阻害
   するか、回避するか又は削除する能力を有するヌクレオチド発現系。
2. 【請求項２】 前記免疫抑制遺伝子が、ＳＩＶ（サル免疫不全症ウイルス）
   nef 遺伝子；エプスタイン−バーウイルスＢＨＲＦ１、ＬＭＰ−１及びＬＭＰ−
   ２Ａ；アデノウイルスＥ１Ｂ／１９ｋ及びＥ１Ｂ／５５ｋ；牛痘ウイルス crmＡ
   及びＣＨＯhr；バキュロウイルスｐ３５及びＩＡＰ；伝染性軟属腫ウイルスＭＣ
   １５９及びＭＣＯ６６Ｌ；ウマヘルペスウイルス−２Ｅ８；家兎痘ウイルスＳＰ
   Ｉ−１；サルウイルス４０Ｔ−Ａｇ；乳頭腫ウイルスＥ７；サイトメガロウイル
   スＵＳ１１、ＩＥ２、ＵＬ１８及びＵＳ６；粘液腫ウイルスＭ−Ｔ５，ＭＴ−２
   及びＭ−Ｔ４；ワクシニアウイルスＥ３Ｌ及びＫ３Ｌ；及びヘルペスウイルスＩ
   ＣＰ４７及びサムライＴipから成る群の中から選択される、請求項１記載の発現
   系。
3. 【請求項３】 前記免疫応答が、細胞障害性Ｔリンパ球応答、ＭＨＣ−１、
   ＭＨＣ−２、Ｔヘルパー細胞、サイトカイン、インターロイキン及び天然キラー
   細胞から成る群の中から選択される、請求項１記載の発現系。
4. 【請求項４】 前記免疫抑制遺伝子が組換え型非未縮重免疫抑制遺伝子であ
   る請求項１記載のヌクレオチド発現系を含んで成る受容体細胞中への治療用遺伝
   子の永久的導入のための組換え型ウイルスベクター。
5. 【請求項５】 受容体細胞 ＤＮＡ内への前記ヌクレオチド発現系の永久的 組込みを提供する、請求項４記載のウイルスベクター。
6. 【請求項６】 潜伏状態又はエピゾーム状態で形質転換された細胞内に無期
   限に存続することのできるウイルスベクターである、請求項４記載のウイルスベ
   クター。
7. 【請求項７】 レトロウイルス系ウイルス、アデノ関連性ウイルス、ヘルペ
   スウイルス、レンチウイルス及びエプスタイン−バーウイルスから成る群の中か
   ら選択される、請求項５記載のベクター。
8. 【請求項８】 形質転換体の選択のためマーカー選択遺伝子をコードする発
   現系をさらに含んで成る、請求項４記載のベクター。
9. 【請求項９】 内部リボソーム入口部位をさらに含んで成る、請求項４記載
   のベクター。
10. 【請求項１０】 前記選択遺伝子が抗生物質耐性遺伝子である、請求項４記
    載のベクター。
11. 【請求項１１】 前記抗生物質耐性遺伝子が、アンピシリン耐性遺伝子、カ
    ナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子から
    成る群の中から選択される、請求項１０記載のベクター。
12. 【請求項１２】 多重クローニング部位をさらに含んで成る、請求項４記載
    のベクター。
13. 【請求項１３】 前記ベクターを細菌中で繁殖させるための原核遺伝子をさ
    らに含んで成る請求項４記載のベクター。
14. 【請求項１４】 誘発性プロモーター、構成性プロモーター、組織特異性プ
    ロモーター及び人工プロモーターエンハンサから成る群の中から選択されたプロ
    モーターをさらに含んで成る、請求項１又は４記載の発現系。
15. 【請求項１５】 前記免疫抑制遺伝子が、エプスタイン−バーウイルスＢＨ
    ＲＦ１，ＬＭＰ−１及びＬＭＰ−２Ａ；アデノウイルスＥ１Ｂ／１９ｋ及びＥ１
    Ｂ／５５ｋ；牛痘ウイルスｃｒｍＡ及びＣＨＯｈｒ；バキュロウイルスｐ３５及
    びＩＡＰ；伝染性軟属腫ウイルスＭＣ１５９及びＭＣＯ６６Ｌ；ウマヘルペスウ
    イルス−２Ｅ８；家兎痘ウイルスＳＰＩ−１；サルウイルス４０Ｔ−Ａｇ；乳頭
    腫ウイルスＥ７；サイトメガロウイルスＵＳ１１、ＩＥ２、ＵＬ１８及びＵＳ６
    ；粘液腫ウイルスＭ−Ｔ５，ＭＴ−２及びＭ−Ｔ４；ワクシニアウイルスＥ３Ｌ
    及びＫ３Ｌ；及びヘルペスウイルスＩＣＰ４７及びサムライＴｉｐから成る群の
    中から選択される、請求項４記載の組換え型ウイルスベクター。
16. 【請求項１６】 前記免疫応答が、細胞障害性Ｔリンパ球応答、ＭＨＣ−１
    、ＭＨＣ−２、Ｔヘルパー細胞、サイトカイン、インタロイキン及び天然キラー
    細胞、好中球、β細胞、血漿細胞、組織マクロファージ、樹状細胞及びマクロフ
    ァージから成る群の中から選択される請求項４記載のウイルスベクター。
17. 【請求項１７】 前記免疫応答がＭＨＣ−Ｉである、請求項１６記載の発現
    系。
18. 【請求項１８】 請求項４記載のベクターで形質転換された受容体細胞。
19. 【請求項１９】 導入された治療用遺伝子に対する宿主細胞免疫応答を低減
    させる方法において、前記宿主細胞に対し請求項４記載のヌクレオチドベクター
    を導入する段階を含んで成る方法。
20. 【請求項２０】 ＭＨＣ−Ｉ自己免疫疾患の治療方法において、請求項１記
    載のヌクレオチド発現系を該治療を必要としている動物に対して投与する段階を
    含んで成り、前記免疫抑制遺伝子が、ＭＨＣ−Ｉ免疫応答を阻害する免疫抑制遺
    伝子である方法。
21. 【請求項２１】 前記免疫抑制遺伝子が、ヒトサイトメガロウイルスＵＳ１
    １及びヘルペスウイルスＩＣＰ４７から成る群の中から選択される、請求項２０
    記載の方法。
22. 【請求項２２】 腫瘍細胞を死滅させる方法において、請求項１記載のヌク
    レオチド発現系を前記細胞に導入する段階を含み、前記免疫抑制遺伝子は、天然
    キラー応答が受容体宿主細胞内で生成されるようなレベルで発現させられる方法
    。
23. 【請求項２３】 前記ヌクレオチド発現系が腫瘍特異的プロモーターを含ん
    で成る請求項２２記載の方法。
24. 【請求項２４】 ＵＳ１１及びＩＣＰ４７から成る群の中から選択された免
    疫抑制遺伝子を含む発現系、抗生物質耐性遺伝子を含む発現系といった要素を含
    んで成るプラスミドレトロウイルスベクター。
25. 【請求項２５】 配列番号１、２、３又は４のヌクレオチド配列及びその機
    能的等価物を含んで成るプラスミドレトロウイルスベクター。