CA2160697A1 - Ensemble de transposition pour le transfert de gene chez les eucaryotes - Google Patents
Ensemble de transposition pour le transfert de gene chez les eucaryotesInfo
- Publication number
- CA2160697A1 CA2160697A1 CA002160697A CA2160697A CA2160697A1 CA 2160697 A1 CA2160697 A1 CA 2160697A1 CA 002160697 A CA002160697 A CA 002160697A CA 2160697 A CA2160697 A CA 2160697A CA 2160697 A1 CA2160697 A1 CA 2160697A1
- Authority
- CA
- Canada
- Prior art keywords
- transposition
- fragment
- cell
- host cell
- intron
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Abandoned
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
La présente invention a trait à un ensemble de transposition destiné au transfert d'un fragment d'ADN d'intérêt dans l'ADN nucléaire ribosomal d'une cellule eucaryote. La présente invention concerne également un moyen d'introduction, une cellule eucaryote et une composition pharmaceutique comportant ledit ensemble de transposition, ainsi que le procédé de transfert in vitro dudit fragment d'ADN.
Description
~ wo 94/24300 216 0 6 9 7 PcT/FRs4/on4ls -1 .
ENSEMBLE DE TRANSPOSITION POUR LE TRANSFERT DE GENE CHEZ LES EUCARYOTES.
20 La présente invention a pour objet un ensemble de transposition permettant le transfert de gènes d'intérêt dans le génome d'une cellule ou d'un organisme eucaryote. Un tel ensemble est particulièrement utile à des fins de thérapie génique.
De nombreux éléments pouvant être mis en oeuvre par l'intégration de gènes d'intérêt 2s dans le génome eucaryote, ont été décrits dans les publications de l'art antérieur. Les éléments classiques sont soit des vecteurs intégratifs, par exemple des vecteursrétroviraux soit des vecteurs non-intégratifs, par exemple des vecteurs adénoviraux.
Toutefois ces vecteurs de l'art antérieur ne présentent pas que des avantages.
30 En effet, les vecteurs rétroviraux s'intègrent au hasard de façon non-spécifique dans le génome cellulaire. Ainsi, le risque de mutagenèse insertionnelle liée soit à l'inactivatiori de gènes essentiels à la cellule, soit à l'activation d'oncogènes pouvant donner lieu à
une prolifération tumorale, n'est pas à négliger avant d'envisager leur utilisation en thérapie génique humaine.
3s En ce qui concerne les vecteurs non-intégratifs, ils présentent des inconvénients liés à
une instabilité du fait de leur non-intégration dans le génome cellulaire, ce qui nécessite leur atlmini~tration régulièrement renouvelée. Dans le cadre d'une thérapie génique wo 9~/24300 21 6 0 6 9 7 PCT/FR94/00419 destinée à l'homme, ceci risque de poser à long terme des problèmes d'immunisation contre le virus recombinant, des patients régulièrement traités.
Un troisième type de méthode, plus récemment décrite, permet le transfert de gènes s d'intéret par recombinaison homologue dans un site défini du génome cellulaire.
Cependant, la technique de recombinaison homologue se heurte encore à de nombreuses difficultés techniques. De plust des événements de recombinaison non-homologue peuvent également se produire, de sorte que le risque de mutagenèse insertionnelle subsiste.
D'autre part, l'art antérieur a depuis longtemps établi le schéma d'organisation et d'expression de l'ADN ribosomal (ADNr) chez les euca~otes (Reeder, Trends Genet.1990, 6, 390-395). D'une manière générale, l'ADNr est constitué par des copies multiples d'unités de transcription arrangées en tandems. Une unité transcriptionnelle 5 est composée des gènes codant respectivement pour les ARNr 18S ou 16S, 5-8S et28S ou 26S, qui entrent dans la constitution du ribosome (ci-après désigné gène ARNr 18S etc.). Chaque gène est séparé du suivant par des séquences transcrites, dont le rôle exact n'est pas encore défini. Les trois gènes ARNr compris dans une unité
transcriptionnelle sont placés sous le contrôle d'un promoteur unique situé en amont 20 dans la région non-transcrite qui sépare une unité de la suivante. Les unités d'ADNr sont transcrites par l'A~N polymérase I en une longue molécule d'ARNr précurseur(pré ARNr), qui est ensuite maturé pour produire les trois principaux types d'ARNr associés aux sous-unités ribosomates.
2s De nombreuses publications ont signalé la présence fréquente d'éléments génétiques étrangers dans l'AONr d'eucaryotes. Parmi ces éléments génétiques, on peut citer des introns de classe I ou Il et des rétroposons, par exemple de classe Rl, R2 ou R3. La présence de ces éléments étrangers peut éventuellement inactiver une fraction des unités transcriptionnelles de l'ADNr. Cela ne semble pas avoir de conséquences graves 30 pour la vie des organismes les contenant. Ce phénomène a surtout été décrit chez la drosophile.
Les introns de classes I et 11 sont définis par l'existence de séquences conservées forrnant des éléments structuraux caractéristiques de chacune des classes tels que 35 définis par Cech et Bass (1986, Annu. Rev. Biochem. 55, 599-629). Plusieurs a uteurs ont observé que certains introns de classes I et II sont mobiles. Ils peuvent être copiés et transférés spécifiquement dans des copies de gènes qui en sont dépourws (intron~) Ce processus de transposition, au moins dans la plupart des cas, s'avère être spécifique du point de we de la région d'insertion.
Parmi la soixantaine d'introns de classe I caractérisés jusqu'à présent, la majorité est localisée dans les gènes des mitochondries et des chloroplastes. L'art antérieurmentionne, dans trois cas seulement, la présence d'introns mobiles de classe I dans les gènes nucléaires. Ces introns ont été mis en évidence au niveau des gènes ARNr de trois espèces d'eucaryotes inférieurs, respectivement les gènes ARNr 26S de plusieurs souches de Te~ahyme~7a (Kan et Gall, 1982, Nucl. Acids Res., 10, 2809-2821) et de la souche carolil?a de Physar~m~ polycephal~m (Muscarella et Vogt, 1989, Cell, 56, 443-454; cet intron mobile étant désigné ci-après intron 3) et enfin dans le gène ARNr o 16S de P~7e1~mocystis calillii (Edman et al., 1988, Nature, 33~, 519-522). Jusqu'à
présent, on a pas pu mettre en évidence la présence d'introns interrompant les gènes ARNr d'eucaryotes supérieurs.
L'intron 3 de Physar1~m polycepha~1m1 est le mieux caractérisé. Sa mobilité a été
démontrée expérimentalement (Muscarella et Vogt, 1989, Cell, 56 443-454). Cet intron code en partie pour une protéine de 160 acides aminés (Muscarella et al., 1990, Mol. Cel. Biol., 10, 3386-3396). Le codon d'initiation de la traduction putatif est situé
en amont de l'intron, à l'extrémité 3' de la séquence exonique adjacente en 5' de l'intron.
La protéine codée par l'intron 3, est une endonucléase qui reconnaît une séquence cible d'au moins 18 paires de bases (pb) présente dans la région d'insertion et est capable de cliver cette séquence exactement au niveau du site d'insertion de l'intron 3 (Muscarella et Vogt, 1989, Cell, 56 443-454).
La séquence cible reconnue par l'endonucléase comprend la séquence suivante:
5'CTATGACTCTCTTAAGGTAGCCAAA3' On suppose que la transposition de l'intron 3 est initiée par la reconn~iss~nc.e de la séquence cible particulière par l'endonucléase spécifiquement codée par l'intron 3, suivie d'une coupure des deux brins de la molécule d'ADN au niveau de cette séquence particulière, libérant ainsi le site d'insertion. Puis par un échange de fibres impliquant les séquences flanquantes en 5' et 3' du site d'insertion, copie de la séquence intronique et recombinaison, I'intron 3 est inséré dans la copie du gène ARNr intron-, de manière précise et site-spécifique. Une fois l'intron 3 inséré dans une copie du gène intron~, la c séquence cible reconnue par l'endonucléase est interrompue par la séquence intronique de la manière suivante:
5'CTATGACTCTCT intron 3 TAAGGTAGCCAAA3' D'autre part, des rétroposons semblent également être présents dans l'ADNr de certains eucaryotes. D'une manière générale, les rétroposons forment un groupe très vaste et très hétérogène, notamment au niveau de leur séquence nucléotidique. Par rétroposon, wo 94/24300 PcT/FRg~mo4l9 4 2f 60~ 7 on entend des éléments apparentés aux rétrovirus, mais dépourvus de "long terminal repeats" (LTR). Ils comprennent un ou des cadre(s) de lecture ouvert(s) susceptible(s) de coder pour des protéines présentant une homologie avec des protéines rétrovirales, comme par exemple la reverse-transcriptase (Jakubczak et al., 1991, Proc. Natl. Acad.
5 Sci. USA, 88, 3295-3299).
Chez un certain nombre d'eucalyotes non-mammifères, notamment les insectes, on atrouvé des rétroposons présentant une spécificité d'insertion remarquable, localisée au niveau des gènes ARNr. La mobilité de certains d'entre eux a été observée. Plusieurs 0 familles (notamment Rl, R2 et R3) ont été définies en fonction de leur région d'insertion spécifique dans les gènes ARNr.
Les rétroposons des classes Rl et R2 sont notamment illustrés par les rétroposons RlBm et R2Bm de Bombyx mori (Xiong et Eickbush, 19~8, Cell, 55, 235-246; Xiong lS et Eickbush, 1988, Mol. Cell. Biol., 8, 114-123; Xiong et al., 1988, Nucl. Ac. Res., 16, 10561-10573) et les rétroposons RlDm et R2Dm de Drosophila melanogaster (Jakubczak et al., 1990, J. Mol. Biol., 212, 37-52). Ils contiennent un cadre de lecture ouvert susceptible de coder pour une protéine de grande taille dont la partie centrale présente une homologie avec la famille des réverse-transcriptases. Xiong et Eickbush 20 (1988, Cell, 55, 235-246) rapportent que la protéine codée par le rétroposon R2Bm de Bombyx mori présente en outre une activité endonucléase. Cette nuclé~ce reconnâît et clive une séquence cible contenue dans la région d'insertion de ~2Bm située dans le gène ARNr 28S du génome de l'insecte.
2s Une nouvelle classe de rétroposons ribosomaux, désignée R3, a récemment été mise en évidence. On n'a pas encore caractérisé de protéine codée par cet élément. Cependant, la région d'insertion spécifique de l'élément R3 dans l'ADNr de Scaria coprophila a été
décrite (Kerrebrock et al., J. Mol. Biol., 1989, 210, 1-13).
30 A côté des rétroposons, il existe un grand nombre d'éléments génétiques mobiles qui ont été parfois désignés sous le nom de rétroposons par les auteurs les décrivant, mais dont on n'a pas encore montré qu'ils codent pour une protéine présentant une homologie avec la famille des protéines rétrovirales, notamment la reverse-transcriptase. On a également trouvé ce type d'éléments au niveau de séquences bien 3s définies de gènes ARNr des organismes les contenant (voir par exemple Back et al., 1984, EMBO J., 3, 2523-2529).
De manière surprenante, on a maintenant trouvé que d'une part les séquences cibles reconnues par les endonucléases codées par les deux éléments généti~ues mobiles pour WO 94/24300 216 0 ~ 9 7 PCTtFR94/00419 lesquels les données sont disponibles (intron 3 de Physarum polycephalun? et rétroposon R2Bm de Bomb~x mori) et d'autre part les régions d'insertion de certains éléments génétiques mobiles dont on n'a pas encore montré qu'ils codent pour uneendonucléase et qui ont été divulguées dans l'art antérieur (Jakubczak et al., 1991, s Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 3295-3299; Paskwitz et Collins, 1989, Nucleic Acid Res., 17, 8125-8133; Kerrebrock et al., 1989, J. Mol. Biol., ~10, 1-13; Kan et Gall, 1982, Nucleic Acid Res., 10, 2809-2821; Edman et al., 1988, Nature, 263, 519-522), sont conservées dans les gènes ARNr de divers mammifères, notamment l'homme et la souris. Ainsi, les séquences des régions d'insertion des introns mobiles de Tetrahymena, lo de Pne2~n70cystis cari~7ii et de Physa~ m polycephalunt, et des rétroposons R2Bm de Bon1byx mori, et R3 de Scaria c~pl ophila sont conservées à l'identique dans les gènes ARNr de mammifères. Par contre, les séquences de la région d'insertion des rétroposons RlDm et RlBm sont homologues mais non identiques à une séquence présente dans le gène ARNr 28S de mammifère.
Par conséquent, la présente invention a pour objet un ensemble de transposition destiné
au transfert d'un fragment d'ADN d'intérêt dans le génome d'une cellule hôte eucaryote, qui comprend une cassette d'intégration, essentiellement constituée d'un élémentgénétique mobile au sein duquel est inséré ledit fragment d'ADN d'intérêt; ladite 20 cassette d'intégration étant capable de s'intégrer d'une façon site-spécifique dans un site d'insertion spécifique situé dans l'ADN nucléaire ribosomal de ladite cellule hôte.
Un ensemble de transposition selon l'invention présente l'avantage de permettre l'intégration d'un fragment d'ADN d'intérêt dans une région définie et non essentielle du 25 génome cellulaire. Un tel ensemble est notamment utile à des fins de thérapie génique.
Aux fins de la présente invention, la cassette d'intégration doit comporter un élément génétique mobile qui possède la capacité de s'intégrer par un méc~ni~me site-spécifique, dans de l'ADNr nucléaire, en particulier au niveau du gène ARNr 28S, 18S
30 ou 5-8S. De manière plus précise, cet élément génétique mobile doit s'intégrer dans un site d'insertion situé dans une région d'insertion dont la séquence est conservée à
l'identique ou non dans l'ADNr nucléaire de la cellule-hôte.
Pour une meilleure compréhension, on précise que le terme "site d'insertion" définit 3s l'endroit entre 2 nucléotides où s'insère un élement génétique mobile. De même, par "région d'insertion", on entend les séquences nucléotidiques en 5' et 3' du sited'insertion qui sont requises pour la transposition site-spécifique. D'une manière générale, chaque élément génétique mobile possède une région d'insertion qui lui est spécifique. Comme mentionné précédemment pour les rétroposons RlBm et RlDm, il W O 94/24300 ~ ` PCT/~R9~/00419 6 216~97 n'est pas exigé que la région d'insertion dans la cellule hôte comporte à l'identique les séquences de la région d'insertion naturelle (dans l'organisme d'origine). Ainsi, la séquence de la région d'insertion dudit element génétique mobile dans la cellule hôte eucaryote présentera un degré d'llomologie avec la séquence de la région d'insertion 5 naturelle supérieur à 80%, de manière avantageuse supérieur à 90% et de préférence supérieur à 95%.
L'élément génétique mobile est avantageusement sélectionné parmi des introns mobiles de classe I ou II, et des rétroposons tels que les rétroposons de classe Rl R2 ou R3.
Un élément génétique mobile peut être constitué par un fragment fonctionnel ou un variant dudit élément. Par fragment fonctionnel, on entend tout fragment ayant conservé la capacité à s'intégrer de l'élément complet. Un variant peut comporter une ou plusieurs mutations par rapport à la séquence nucléotide naturelle de llélément, 5 notamment la substitution, addition ou délétion d'un ou plusieurs nucléotide(s), à
condition que ces mutations n'en altèrent pas la fonction.
De manière plus particulière, l'élément génétique mobile est sélectionné parmi:
- l'intron 3 de Physamm polycephalum, souche Carolina, un fragment ou un variant dudit intron, - l'intron mobile de classe I de Te~rahymena, un fragment ou un variant dudit intron, - I'intron mobile de classe I de P~et~mocysfis cari)~ii, un fragment ou un variant dudit intron, - le rétroposon R2Bm de Bombyx mori, un fragment ou un variant dudit rétroposon et, - le rétroposon R3 de Scaria coprophila, un fragment ou un variant dudit rétroposon.
La présence dans cet elément génétique mobile, de tout ou partie d'un cadre de lecture ouvert susceptible de coder pour une intégrase, est une caractéristique préférée.
D'une manière générale, par intégrase, on entend une protéine présentant une activité
35 enzymatique lui permettant de participer directement ou indirectement à la transposition de l'élément génétique mobile spécifiquement au niveau de son sited'insertion dans l'ADNr nucléaire d'une cellule eucaryote.
Avantageusement, l'intégrase peut être constituée notamment par:
WO 94/24300 21 6 0 6 9 7 PCT/FR9`1/00419 (I) une protéine présentant une activite endonucléase capable de reconnâître uneséquence cible spécifique inclue dans la région d'insertion de l'élément génétique mobile qui code pour elle et de cliver ladite séquence cible, ou
ENSEMBLE DE TRANSPOSITION POUR LE TRANSFERT DE GENE CHEZ LES EUCARYOTES.
20 La présente invention a pour objet un ensemble de transposition permettant le transfert de gènes d'intérêt dans le génome d'une cellule ou d'un organisme eucaryote. Un tel ensemble est particulièrement utile à des fins de thérapie génique.
De nombreux éléments pouvant être mis en oeuvre par l'intégration de gènes d'intérêt 2s dans le génome eucaryote, ont été décrits dans les publications de l'art antérieur. Les éléments classiques sont soit des vecteurs intégratifs, par exemple des vecteursrétroviraux soit des vecteurs non-intégratifs, par exemple des vecteurs adénoviraux.
Toutefois ces vecteurs de l'art antérieur ne présentent pas que des avantages.
30 En effet, les vecteurs rétroviraux s'intègrent au hasard de façon non-spécifique dans le génome cellulaire. Ainsi, le risque de mutagenèse insertionnelle liée soit à l'inactivatiori de gènes essentiels à la cellule, soit à l'activation d'oncogènes pouvant donner lieu à
une prolifération tumorale, n'est pas à négliger avant d'envisager leur utilisation en thérapie génique humaine.
3s En ce qui concerne les vecteurs non-intégratifs, ils présentent des inconvénients liés à
une instabilité du fait de leur non-intégration dans le génome cellulaire, ce qui nécessite leur atlmini~tration régulièrement renouvelée. Dans le cadre d'une thérapie génique wo 9~/24300 21 6 0 6 9 7 PCT/FR94/00419 destinée à l'homme, ceci risque de poser à long terme des problèmes d'immunisation contre le virus recombinant, des patients régulièrement traités.
Un troisième type de méthode, plus récemment décrite, permet le transfert de gènes s d'intéret par recombinaison homologue dans un site défini du génome cellulaire.
Cependant, la technique de recombinaison homologue se heurte encore à de nombreuses difficultés techniques. De plust des événements de recombinaison non-homologue peuvent également se produire, de sorte que le risque de mutagenèse insertionnelle subsiste.
D'autre part, l'art antérieur a depuis longtemps établi le schéma d'organisation et d'expression de l'ADN ribosomal (ADNr) chez les euca~otes (Reeder, Trends Genet.1990, 6, 390-395). D'une manière générale, l'ADNr est constitué par des copies multiples d'unités de transcription arrangées en tandems. Une unité transcriptionnelle 5 est composée des gènes codant respectivement pour les ARNr 18S ou 16S, 5-8S et28S ou 26S, qui entrent dans la constitution du ribosome (ci-après désigné gène ARNr 18S etc.). Chaque gène est séparé du suivant par des séquences transcrites, dont le rôle exact n'est pas encore défini. Les trois gènes ARNr compris dans une unité
transcriptionnelle sont placés sous le contrôle d'un promoteur unique situé en amont 20 dans la région non-transcrite qui sépare une unité de la suivante. Les unités d'ADNr sont transcrites par l'A~N polymérase I en une longue molécule d'ARNr précurseur(pré ARNr), qui est ensuite maturé pour produire les trois principaux types d'ARNr associés aux sous-unités ribosomates.
2s De nombreuses publications ont signalé la présence fréquente d'éléments génétiques étrangers dans l'AONr d'eucaryotes. Parmi ces éléments génétiques, on peut citer des introns de classe I ou Il et des rétroposons, par exemple de classe Rl, R2 ou R3. La présence de ces éléments étrangers peut éventuellement inactiver une fraction des unités transcriptionnelles de l'ADNr. Cela ne semble pas avoir de conséquences graves 30 pour la vie des organismes les contenant. Ce phénomène a surtout été décrit chez la drosophile.
Les introns de classes I et 11 sont définis par l'existence de séquences conservées forrnant des éléments structuraux caractéristiques de chacune des classes tels que 35 définis par Cech et Bass (1986, Annu. Rev. Biochem. 55, 599-629). Plusieurs a uteurs ont observé que certains introns de classes I et II sont mobiles. Ils peuvent être copiés et transférés spécifiquement dans des copies de gènes qui en sont dépourws (intron~) Ce processus de transposition, au moins dans la plupart des cas, s'avère être spécifique du point de we de la région d'insertion.
Parmi la soixantaine d'introns de classe I caractérisés jusqu'à présent, la majorité est localisée dans les gènes des mitochondries et des chloroplastes. L'art antérieurmentionne, dans trois cas seulement, la présence d'introns mobiles de classe I dans les gènes nucléaires. Ces introns ont été mis en évidence au niveau des gènes ARNr de trois espèces d'eucaryotes inférieurs, respectivement les gènes ARNr 26S de plusieurs souches de Te~ahyme~7a (Kan et Gall, 1982, Nucl. Acids Res., 10, 2809-2821) et de la souche carolil?a de Physar~m~ polycephal~m (Muscarella et Vogt, 1989, Cell, 56, 443-454; cet intron mobile étant désigné ci-après intron 3) et enfin dans le gène ARNr o 16S de P~7e1~mocystis calillii (Edman et al., 1988, Nature, 33~, 519-522). Jusqu'à
présent, on a pas pu mettre en évidence la présence d'introns interrompant les gènes ARNr d'eucaryotes supérieurs.
L'intron 3 de Physar1~m polycepha~1m1 est le mieux caractérisé. Sa mobilité a été
démontrée expérimentalement (Muscarella et Vogt, 1989, Cell, 56 443-454). Cet intron code en partie pour une protéine de 160 acides aminés (Muscarella et al., 1990, Mol. Cel. Biol., 10, 3386-3396). Le codon d'initiation de la traduction putatif est situé
en amont de l'intron, à l'extrémité 3' de la séquence exonique adjacente en 5' de l'intron.
La protéine codée par l'intron 3, est une endonucléase qui reconnaît une séquence cible d'au moins 18 paires de bases (pb) présente dans la région d'insertion et est capable de cliver cette séquence exactement au niveau du site d'insertion de l'intron 3 (Muscarella et Vogt, 1989, Cell, 56 443-454).
La séquence cible reconnue par l'endonucléase comprend la séquence suivante:
5'CTATGACTCTCTTAAGGTAGCCAAA3' On suppose que la transposition de l'intron 3 est initiée par la reconn~iss~nc.e de la séquence cible particulière par l'endonucléase spécifiquement codée par l'intron 3, suivie d'une coupure des deux brins de la molécule d'ADN au niveau de cette séquence particulière, libérant ainsi le site d'insertion. Puis par un échange de fibres impliquant les séquences flanquantes en 5' et 3' du site d'insertion, copie de la séquence intronique et recombinaison, I'intron 3 est inséré dans la copie du gène ARNr intron-, de manière précise et site-spécifique. Une fois l'intron 3 inséré dans une copie du gène intron~, la c séquence cible reconnue par l'endonucléase est interrompue par la séquence intronique de la manière suivante:
5'CTATGACTCTCT intron 3 TAAGGTAGCCAAA3' D'autre part, des rétroposons semblent également être présents dans l'ADNr de certains eucaryotes. D'une manière générale, les rétroposons forment un groupe très vaste et très hétérogène, notamment au niveau de leur séquence nucléotidique. Par rétroposon, wo 94/24300 PcT/FRg~mo4l9 4 2f 60~ 7 on entend des éléments apparentés aux rétrovirus, mais dépourvus de "long terminal repeats" (LTR). Ils comprennent un ou des cadre(s) de lecture ouvert(s) susceptible(s) de coder pour des protéines présentant une homologie avec des protéines rétrovirales, comme par exemple la reverse-transcriptase (Jakubczak et al., 1991, Proc. Natl. Acad.
5 Sci. USA, 88, 3295-3299).
Chez un certain nombre d'eucalyotes non-mammifères, notamment les insectes, on atrouvé des rétroposons présentant une spécificité d'insertion remarquable, localisée au niveau des gènes ARNr. La mobilité de certains d'entre eux a été observée. Plusieurs 0 familles (notamment Rl, R2 et R3) ont été définies en fonction de leur région d'insertion spécifique dans les gènes ARNr.
Les rétroposons des classes Rl et R2 sont notamment illustrés par les rétroposons RlBm et R2Bm de Bombyx mori (Xiong et Eickbush, 19~8, Cell, 55, 235-246; Xiong lS et Eickbush, 1988, Mol. Cell. Biol., 8, 114-123; Xiong et al., 1988, Nucl. Ac. Res., 16, 10561-10573) et les rétroposons RlDm et R2Dm de Drosophila melanogaster (Jakubczak et al., 1990, J. Mol. Biol., 212, 37-52). Ils contiennent un cadre de lecture ouvert susceptible de coder pour une protéine de grande taille dont la partie centrale présente une homologie avec la famille des réverse-transcriptases. Xiong et Eickbush 20 (1988, Cell, 55, 235-246) rapportent que la protéine codée par le rétroposon R2Bm de Bombyx mori présente en outre une activité endonucléase. Cette nuclé~ce reconnâît et clive une séquence cible contenue dans la région d'insertion de ~2Bm située dans le gène ARNr 28S du génome de l'insecte.
2s Une nouvelle classe de rétroposons ribosomaux, désignée R3, a récemment été mise en évidence. On n'a pas encore caractérisé de protéine codée par cet élément. Cependant, la région d'insertion spécifique de l'élément R3 dans l'ADNr de Scaria coprophila a été
décrite (Kerrebrock et al., J. Mol. Biol., 1989, 210, 1-13).
30 A côté des rétroposons, il existe un grand nombre d'éléments génétiques mobiles qui ont été parfois désignés sous le nom de rétroposons par les auteurs les décrivant, mais dont on n'a pas encore montré qu'ils codent pour une protéine présentant une homologie avec la famille des protéines rétrovirales, notamment la reverse-transcriptase. On a également trouvé ce type d'éléments au niveau de séquences bien 3s définies de gènes ARNr des organismes les contenant (voir par exemple Back et al., 1984, EMBO J., 3, 2523-2529).
De manière surprenante, on a maintenant trouvé que d'une part les séquences cibles reconnues par les endonucléases codées par les deux éléments généti~ues mobiles pour WO 94/24300 216 0 ~ 9 7 PCTtFR94/00419 lesquels les données sont disponibles (intron 3 de Physarum polycephalun? et rétroposon R2Bm de Bomb~x mori) et d'autre part les régions d'insertion de certains éléments génétiques mobiles dont on n'a pas encore montré qu'ils codent pour uneendonucléase et qui ont été divulguées dans l'art antérieur (Jakubczak et al., 1991, s Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 3295-3299; Paskwitz et Collins, 1989, Nucleic Acid Res., 17, 8125-8133; Kerrebrock et al., 1989, J. Mol. Biol., ~10, 1-13; Kan et Gall, 1982, Nucleic Acid Res., 10, 2809-2821; Edman et al., 1988, Nature, 263, 519-522), sont conservées dans les gènes ARNr de divers mammifères, notamment l'homme et la souris. Ainsi, les séquences des régions d'insertion des introns mobiles de Tetrahymena, lo de Pne2~n70cystis cari~7ii et de Physa~ m polycephalunt, et des rétroposons R2Bm de Bon1byx mori, et R3 de Scaria c~pl ophila sont conservées à l'identique dans les gènes ARNr de mammifères. Par contre, les séquences de la région d'insertion des rétroposons RlDm et RlBm sont homologues mais non identiques à une séquence présente dans le gène ARNr 28S de mammifère.
Par conséquent, la présente invention a pour objet un ensemble de transposition destiné
au transfert d'un fragment d'ADN d'intérêt dans le génome d'une cellule hôte eucaryote, qui comprend une cassette d'intégration, essentiellement constituée d'un élémentgénétique mobile au sein duquel est inséré ledit fragment d'ADN d'intérêt; ladite 20 cassette d'intégration étant capable de s'intégrer d'une façon site-spécifique dans un site d'insertion spécifique situé dans l'ADN nucléaire ribosomal de ladite cellule hôte.
Un ensemble de transposition selon l'invention présente l'avantage de permettre l'intégration d'un fragment d'ADN d'intérêt dans une région définie et non essentielle du 25 génome cellulaire. Un tel ensemble est notamment utile à des fins de thérapie génique.
Aux fins de la présente invention, la cassette d'intégration doit comporter un élément génétique mobile qui possède la capacité de s'intégrer par un méc~ni~me site-spécifique, dans de l'ADNr nucléaire, en particulier au niveau du gène ARNr 28S, 18S
30 ou 5-8S. De manière plus précise, cet élément génétique mobile doit s'intégrer dans un site d'insertion situé dans une région d'insertion dont la séquence est conservée à
l'identique ou non dans l'ADNr nucléaire de la cellule-hôte.
Pour une meilleure compréhension, on précise que le terme "site d'insertion" définit 3s l'endroit entre 2 nucléotides où s'insère un élement génétique mobile. De même, par "région d'insertion", on entend les séquences nucléotidiques en 5' et 3' du sited'insertion qui sont requises pour la transposition site-spécifique. D'une manière générale, chaque élément génétique mobile possède une région d'insertion qui lui est spécifique. Comme mentionné précédemment pour les rétroposons RlBm et RlDm, il W O 94/24300 ~ ` PCT/~R9~/00419 6 216~97 n'est pas exigé que la région d'insertion dans la cellule hôte comporte à l'identique les séquences de la région d'insertion naturelle (dans l'organisme d'origine). Ainsi, la séquence de la région d'insertion dudit element génétique mobile dans la cellule hôte eucaryote présentera un degré d'llomologie avec la séquence de la région d'insertion 5 naturelle supérieur à 80%, de manière avantageuse supérieur à 90% et de préférence supérieur à 95%.
L'élément génétique mobile est avantageusement sélectionné parmi des introns mobiles de classe I ou II, et des rétroposons tels que les rétroposons de classe Rl R2 ou R3.
Un élément génétique mobile peut être constitué par un fragment fonctionnel ou un variant dudit élément. Par fragment fonctionnel, on entend tout fragment ayant conservé la capacité à s'intégrer de l'élément complet. Un variant peut comporter une ou plusieurs mutations par rapport à la séquence nucléotide naturelle de llélément, 5 notamment la substitution, addition ou délétion d'un ou plusieurs nucléotide(s), à
condition que ces mutations n'en altèrent pas la fonction.
De manière plus particulière, l'élément génétique mobile est sélectionné parmi:
- l'intron 3 de Physamm polycephalum, souche Carolina, un fragment ou un variant dudit intron, - l'intron mobile de classe I de Te~rahymena, un fragment ou un variant dudit intron, - I'intron mobile de classe I de P~et~mocysfis cari)~ii, un fragment ou un variant dudit intron, - le rétroposon R2Bm de Bombyx mori, un fragment ou un variant dudit rétroposon et, - le rétroposon R3 de Scaria coprophila, un fragment ou un variant dudit rétroposon.
La présence dans cet elément génétique mobile, de tout ou partie d'un cadre de lecture ouvert susceptible de coder pour une intégrase, est une caractéristique préférée.
D'une manière générale, par intégrase, on entend une protéine présentant une activité
35 enzymatique lui permettant de participer directement ou indirectement à la transposition de l'élément génétique mobile spécifiquement au niveau de son sited'insertion dans l'ADNr nucléaire d'une cellule eucaryote.
Avantageusement, l'intégrase peut être constituée notamment par:
WO 94/24300 21 6 0 6 9 7 PCT/FR9`1/00419 (I) une protéine présentant une activite endonucléase capable de reconnâître uneséquence cible spécifique inclue dans la région d'insertion de l'élément génétique mobile qui code pour elle et de cliver ladite séquence cible, ou
(2) une protéine présentant une homologie avec la famille des réverse-transcriptases.
On peut citer, par exemple, I'endonucléase codée en partie par l'intron 3 de Physarum popycepha~7~m Cette endonucléase initie la transposition de l'intron 3 en reconnaissant sa séquence cible et clivant la molécule d'ADN au niveau de cette séquence spécifique.
0 On peut citer également la protéine codée par le rétroposon R2Bm de Bombyx mori.
L'activité endonucléase de ladite protéine est probablement impliquée dans la transposition de R2Bm au niveau de sa région d'insertion spécifique mais par un mécanisme qui n'est pas connu à ce jour.
15 Le fragment d'ADN d'intérêt peut être introduit dans l'élément génétique mobile par les techniques classiques du génie génétique. 11 peut être intégré dans ou en dehors du cadre de lecture ouvert codant pour une éventuelle intégrase.
Selon un aspect particulièrement avantageux de l'invention, le fragment d'ADN d'intérêt 20 est inséré dans le cadre de lecture ouvert, afin d'empêcher l'expression de l'intégrase.
Ceci introduit une sécurité pour éviter la propagation incontrôlée de la c~ssette d'intégration dans le génome de la cellule hôte.
Dans ce cas, I'intégrase spécifique de l'élément génétique mobile mis en oeuvre dans 25 I'ensemble de transposition selon l'invention, devra être fournie à la cellule hôte de manière transitoire pendant un temps suffisamment long pour permettre la transposition de la cassette d'intégration dans sa région d'insertion spécifique. Les moyens de fournir en fral7s une protéine à une cellule eucaryote sont nombreux et connus de l'homme de l'art.
Par exemple, I'ensemble de transposition selon l'invention peut être introduit dans un vecteur (tel que défini ci-après), comprenant en outre une c~csette d'expression de I'intégrase spécifique de l'élément génétique mobile présent dans l'ensemble de transposition.
D'une manière alternative, on peut transfecter parallèlement la cellule hôte eucaryote avec un vecteur helper comprenant une cassette d'expression de l'intégrase ou fournir à
la cellule hôte, I'intégrase sous forme purifiée.
wo 94/24300 216 ~ ~ 9 7 PCT/~R94/(10419 Le fragment d'ADN d'intérêt peut être tout fragment capable d'être transcrit en ARN
pour produire un ARN anti-sens, par exemple une séquence d'A~N complémentaire d'un gène pathogène susceptible de former un duplex avec un transcrit pathogène afin d'inhiber la traduction en protéine pathogène. Un gène pathogène est:
5 (1) un gène qui n'est pas présent dans les cellules eucaryotes, par exemple un gène présent dans le génome d'un organisme pathogène (bactérie, virus ou parasite), ou (2) un gène homologue ou un gène homologue muté, par exemple un oncogène, qui est présent mais normalement pas exprimé dans les cellules eucaryotes normales et dont l'expression anormalement induite peut causer une maladie comme le cancer.
De façon alternative, le fragment d'ADN d'intérêt peut coder pour une protéine d'intérêt et de manière préférée, une protéine dont l'absence d'expression ou l'expression en quantité anormale ou sous forme mutante est associée à une maladie génétique.
s Le fragment d'ADN d'intérêt peut coder pour une protéine mature ou un précurseur de celle-ci. Dans le premier cas, il comprend la séquence codante pour une protéinemature permettant l'expression de la protéine de façon intrace.~ ire. Dans le dernier cas, le fragment d'ADN d'intérêt peut également inclure une séquence signal permettant 20 la sécrétion de ladite protéine de la cellule hôte. Le fragment d'ADN d'interêt peut coder pour une protéine chimérique provenant de la fusion de séquences d'origines diverses.
Les exemples de protéines pouvant être codées par le fragment d'ADN d'intérêt 25comprennent:
- des cytokines, comme l'interféron~alpha, I'interféron gamma et différents types de facteurs de croissance, - des récepteurs membranaires, comme les récepteurs impliqués dans la transmission des signaux de la surface à l'intérieur des cellules et les récepteurs reconnus par des organismes pathogènes, comme le récepteur CD4 présent à la surface des Iymphocytes T et reconnu par la glycoprotéine d'enveloppe du virus VIH (Virus d'Immunodéficience Humaine), - des enzymes, comme les ribonucléases et la thymidine-kinase (TK) du virus simplex de l'herpès de type I (HSV-I). Cette dernière présente une af~lnité supérieure par rapport à l'enzyme TK de cellule mammifère pour certains analogues de nucleosides, comme l'acyclovir ou le gancyclovir.
L'enzyme TK-HSV- I convertit les analogues en précurseurs de nucléotides. Ces précurseurs toxiques seront donc incorporés dans l'ADN des cellules en état de réplication. Cette incorporation permet de tuer spécifiquement les cellules en division, comme les cellules cancéreuses, s - des inhibiteurs d'une activité enzymatique, comme l'alphal antitrypsine, I'antithrombine III, la protéine C et les inhibiteurs de protéases spécifiques d'un organisme pathogène, - des facteurs de coagulation, comme le facteur VIII, le facteur IX et la thrombine, lo - des protéines participant aux canaux ioniques, comme la protéine CFTR
(Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), - des protéines capables d'inhiber l'activité d'une protéine produite par un gène pathogène, comme l'antigène supresseur de tumeur p53, - des variants de protéines pathogènes mutés de façon à altérer leur fonction biologique, comme des mutants trans-dominants de la protéine de régulation TAT du virus VIH capables de compétition avec la protéine virale native pour la liaison à la séquence cible, empêchant I'activation de l'expression des gènes viraux et, - des épitopes antigéniques permettant d'accroître l'immunité de la cellule hôte.
Le fragment d'ADN d'intérêt peut être muté afin de permettre l'expression d'une protéine d'intérêt dont les propriétés biologiques sont modifiées, par exemple un variant de l'alphal antitrypsine dont le résidu méthionine en position 358 du site actif a 25 été remplacé par une leucine. Un tel variant est fonctionnel dans des conditions d'oxydation telle que des conditions d'inflammation.
Une fois la cassette d'intégration introduite dans l'ADNr de la cellule hôte, le fragment d'ADN d'intérêt peut être placé sous la dépendance du promoteur de l'unité
30 transcriptionnelle de l'ADNr de la cellule hôte. De manière alternative, le fragment d'ADN d'intérêt peut être placé sous le contrôle d'éléments d'expression appropriés insérés dans l'élément génétique mobile. Expression signifie ici transcription en ARN
et/ou traduction de cet ARN en protéine.
3s Selon cette alternative, les éléments de contrôle de l'expression comprennentnotamment un promoteur approprié. De tels promoteurs sont bien connus de l'hommede l'art et sont insérés en amont du fragment d'ADN d'intérêt par les techniquesconventionnelles du génie génétique.
WO 94/24300 21 ~ 0 6 9 7 PCT/FR94/00419 Le promoteur retenu peut être un promoteur reconnu par l'ARN polymérase I, de façon à favoriser l'expression du fragment d'ADN d'intérêt, après intégration de la cassette d'intégration dans les gènes A}~Nr de la cellule hôte eucaryote. Par exemple, le fragment d'ADN d'intérêt peut être placé sous le contrôle des éléments de régulation 5 compris dans les régions non-transcrites de l'ADNr impliqués dans la transcription des gènes ARNr. De tels promoteurs seront choisis de manière à être fonctionnels dans la cellule hôte eucaryote qui a été retenue.
De manière alternative, le promoteur retenu peut être un promoteur reconnu par l'ARN
o polymérase II. De tels promoteurs sont bien connus de l'homme de l'art. Le promoteur peut être isolé d'un gène cellulaire ou d'un virus. Il peut être ubiquitaire permettant une expression permanente du fragment d'ADN dlintérêt dans tous les types de cellules hôtes. Le terme promoteur inclut egalement un promoteur régulable, par exemple un promoteur tissu-spécifique. On peut citer notamment le promoteur du gène HMG
5 (Hydroxy-Methyl-Glutaryl coenzyme A réductase), du gène TK du virus HSV-I, du virus SV40 (Simian virus 40), les promoteurs EIII et MLP (Major Late Promoter) de l'adénovirus, le LTR du virus MoMuLV (Moloney Murine Leukemia Virus), le promoteur du gène FIX conférant une expression foie-spécifique ou le promoteur des gènes immunoglobulines spécifique des cellules lymphocytaires.
De manière avantageuse, llensemble de transposition comprend outre une c~sette d'intégration des eléments permettant ou favorisant l'intégration site-spécifique de cette cassette. Selon un mode particulier de l'inven~ion, notamment lorsque l'élément génétique mobile mis en oeuvre est un intron mobile de classe I ou II, I'ensemble de 25 transposition selon l'invention comprend en outre:
- en 5' de la cassette d'intégration une région d'au plus 10kb, présentant au moins 80% d'homologie avec les séquences du gène ARNr de la cellule hôte immédiatement adjacentes en 5' audit site d'insertion; et - en 3' de la cassette d'intégration une région d'au plus 10kb, présentant au moins 80% d'homologie avec les séquences du gène ARNr de la cellule hôte immédiatement adjacentes en 3' audit site d'insertion.
En effet, il peut être avantageux de placer ladite cassette d'intégration dans un 3s environnement ADNr, particulièrement lorsque la transposition implique un phénomène d'échange de fibres comme cela a éte montré notamment pour l'intron 3. L'échange de fibres implique les séquences donneuses intron+ (de l'ensemble de transposition) et les séquences receveuses intron~ (de la cellule hote). Seule la l~csette d'intégration sera transposée dans le génome de la cellule hôte. Les séquences du gène ARNr WO 9~/24300 21 6 0 6 9 7 PCT/FR94/00419 immédiatement adjacentes en S' et 3' du site d'insertion interviennent uniquement dans le processus de transposition.
Afin de favoriser la transposition de la cassette d'intégration, on préférera avoir une homologie parfaite entre les séquences donneuses et receveuses impliquées dans l'échange de fibre. Ainsi, un ensemble de transposition préféré comprendra en outre:
- en 5' de la cassette d'intégration une région d'au plus IOkb, présentant 100% d'homologie avec les séquences du gène ARNr de la cellule hôte o immédiatement adjacentes en S' audit site d'insertion; et - en 3' de la cassette d'intégration une région d'au plus 10kb, présçnt~nt 100% d'homologie avec les séquences du gène ARNr de la cellule hôte immédiatement adjacentes en 3' audit site d'insertion.
15 Les séquences du gène ARNr immédiatement adjacentes en 5' et 3' au site d'insertion peuvent être isolées selon les techniques classiques du génie génétique, par exemple par clonage ou PCR (Polymerase Chain Reaction) ou synthèse chimique. De manière plusparticuljère, ces séquences auront une longueur d'au plus lOkb, de manière avantageuse d'au plus 3kb et de préférence d'au plus 0,4 kb.
La présente invention concerne également un moyen d'introduction d'un ensemble de transposition selon l'invention dans une cellule eucaryote. De tels moyens consistant à
introduire un acide nucléique dans une cellule eucaryote sont généralement connus de l'homme de l'art.
Aux fins de la présente invention, I'ensemble de transposition selon l'invention peut être introduit dans un moyen d'introduction sélectionné parmi les véhicules de délivrance de type liposomes et lipides cationiques synthétiques et les vecteurs de clonage etd'expression classiquement utilisés dans les cellules eucaryotes. L'encapsulation dans un 30 véhicule de délivrance et les techniques de clonage dans des vecteurs constituent des techniques classiques connues de l'homme de l'art. Mais d'autres protocoles permettant d'introduire un acide nucléique dans une cellule peuvent également être employés, comme par exemple la precipitation au phosphate de calcium, la technique du DEAEdextrane, I'injection directe de l'acide nucléique dans une cellule ou le bombardement 35 de microparticules d'or couvertes d'acide nucléique dans les cellules d'un animal.
L'acide nucléique peut être introduit sous forme superenroulee, circulaire ou linéaire.
D'une manière avantageuse, le moyen d'introduction selon l'invention est un vecteur comprenant les éléments appropriés à sa maintenance dans la cellule hôte pendant un wo 94/24300 , 2 ~ 7 PCT/FRg4/00419 temps suffisamment long pour permettre le transfert de la cassette d'intégration dans la région d'insertion. Un tel vecteur doit être capable d'entrer dans une cellule eucaryote supérieure, de rester de préférence sous forme extrachromosomique et de se maintenir dans la cellule pendant un temps suffisamment long pour permettre la transposition de 5 la cassette d'intégration dans le génome de la cellule hôte. Un tel vecteur peut être sous la forme d'un plasmide ou d'un vecteur viral.
De préférence, le moyen d'introduction selon l'invention est un vecteur de type non-intégratif. On peut citer un vecteur dérivé du virus de l'herpès simplex ou d'uno adénovirus. D'une manière particulièrement préférée, le moyen d'introduction selon l'invention est un vecteur dérivé d'un adénovirus, comme par exemple l'adénovirus de type 5.
Selon un mode avantageux et comme évoqué précédemment, le moyen d'introduction 5 selon l'invention peut contenir en outre une cassette d'expression permettant la production de l'intégrase spécifique de l'ensemble de transposition.
Une telle c~csette d'expression comprend le fragment d'ADN codant pour ladite intégrase, placé sous le contrôle d'éléments appropriés permettant son exy~ession. Par 20 éléments appropriés permettant son expression, on entend l'ensemble des éléments permettant la transcription dudit fragment d'ADN en ARNm et la traduction de l'ARNm en protéine. Ces éléments comportent notamment un promoteur approprié, depréférence un promoteur reconnu par l'ARN polymérase II et pennettant une expression forte et ubiquitaire, par exemple le promoteur SV40.
Le moyen d'introduction selon l'invention peut en outre comprendre une cassette d'expression permettant l'expression d'un gène de sélection, perrnettant la détection et l'isolement des cellules hôtes comprenant ledit moyen d'introduction. Dans le contexte de l'invention, le gène codant pour le marqueur de sélection peut etre sous le contrôle 30 d'éléments appropries permettant son expression dans la cellule hôte, tels que définis ci-dessus.
L'invention est également relative à un procédé i~7 l~itro de transfert d'un fragment d'ADN d'intérêt dans le génome d'une cellule hôte eucaryote au niveau de l'ADN
3s nucléaire ribosomal, selon lequel on introduit dans ladite cellule hôte un ensemble de transposition selon l'invention ou un moyen d'introduction selon l'invention.
Avantageusement, on peut en outre fournir dans le procédé i~l vitro selon l'invention, I'intégrase spécifique de l'ensem~le de transposition selon l'invention à la cellule hôte.
~ WO 94/24300 21 6 113 6 9 7 PCT/FR94/0041~
L'invention a également pour objet une cellule eucaryote comprenant un ensemble de transposition selon l'invention ou un moyen d'introduction selon l'invention. Ladite cellule sera de manière avantageuse une cellule de mammifère, et de manière préférée 5 une cellule humaine.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent thérapeutique, un ensemble de transposition selon l'invention, un moyen d'introduction selon l'invention ou une cellule selon l'invention, en o association avec un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
La composition pharmaceutique selon l'invention, est en particulier destinée au traitement préventif ou curatif de maladies telles que:
- des maladies génétiques, comme par exemple l'hémophilie ou la mucoviscidose, - des cancers, comme par exemple ceux induits par des oncogènes ou des virus, - des maladies rétrovirales, comme par exemple le SIDA (syndrome de l'immunodéficience acquise), et - des maladies virales récurrentes, comme par exemple les infections virales provoquées par le virus de l'herpès.
Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière 2s conventionnelle. En particulier, on associe une quantité thérapeutiquement efficace d'un agent thérapeutique à un support tel qu'un diluant. Une composition selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans ledomaine de l'art, en particulier par voie sous-cutanée, par voie intramuscul~ire, par voie intraveineuse ou par voie intra-trachéale. L'administration peut avoir lieu en dose 30 unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. La voie d'administration et le dosage appropriés varient en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu traité ou du fragment d'ADN d'intérêt. Une composition pharmaceutique peut comprendre en outre un adjuvant acceptable d'un point de vuepharmaceutique.
Avantageusement, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend en outre une intégrase ou une cassette d'expression de l'intégrase.
WO94/24300 216 0 6 9 7 pcT~ lon4ls L'invention s'etend égaiement à une méthode de traitement selon laquelle on administre une quantité thérapeutiquement ef~lcace d'un ensemble de transposition selon l'invention un moyen d'introduction selon l'invention ou une cellule selon l'invention à
un patient ayant besoin d'un tel traitement.
s L'invention est illustree ci-après en référence à la figure 1 qui représente schématiquement un ensemble de transposition (I) (grande boîte blanche) qui comprend de 5' vers 3': les séquences du gène ARNr (6) (boîte hachurée) en 5' du site d'insertion (5) (traits noirs) une cassette d'intégration (3) (petite boîte blanche) o constituée d'un élément génétique mobile (4) (boîte rayée horizontalement) au sein duquel est inséré un fragment d'ADN d'intérêt (2) (boîte pointillée) et les séquences du gène ARNr (7) (boîte hachurée) en 3' du site d'insertion (5).
EXEMPLES:
EXEMPLE 1: Construction d'un ensemble de transposition pour l'inté~ration site-spécifique dans les ~ènes ARNr 28S d'une cellule humaine. mettant en oeuvre l'intron 3 de Phvsan~m polycephal1~n1 souche Carolina.
20 L'exemple se réfère à un ensemble de transposition qui comporte (I) l'intron 3 modifié de manière à créer un site unique de restriction XhoI dans la séquence intronique. Le site X77oI permettra d'introduire un fragment d'ADN
d'intérêt quelconque. En ef~et le fragment d'ADN d'intérêt peut être isolé de manière à
présenter des e~l~é"~i~és cohésives compatibles avec les exl~e"~;~és générées par une 25 digestion XhoI (fragment de restriction XhoI ou SQII OU XhoI-Sa/I ou addition de linkers XhoI et/ou Sa/I ou mutagenèse dirigée afin de créer les sites X77oI et/ou Sal~
requis). D'une manière alternative, le site de clonage X77oI peut être traité par exemple à la nucléase de haricot Mung afin de générer des eA~ré~-ilés franches entre lesquelles on peut cloner tout fragment d'ADN d'intérêt à bouts francs. Le fragment d'ADN de 30 0,94 kb comportant l'intron 3 peut être isolé notamment par clonage, PCR ou synthétiséchimiquement et (2) les séquences immédiatement adjacentes en 5' et 3' au site d'insertion de l'intron 3. Ces séquences sont isolées du gène ARNr 28S humain comprenant la région d'insertion de l'intron 3 parfaitement conservée. Ainsi l'intron mobile sera placé dans un 3s environnement ADNr. L'échange de fibres impliquera des séquences parfaitementhomologues puisque toutes deux d'origine humaine (séquences donneuses de la cassette d'intégration et séquences receveuses de la cellule humaine hôte). Les séquences immédiatement adjacentes en 5' et 3' peuvent etre isolées not~mment par clonage, PCR ou synthétisees chimiquement.
WO 9~/24300 PCT/FR94/00419 15 ~160697 1. Clonage par PCR des séquences immédiatement adjacentes en 5' et 3' au site d'insertion de l'intron 3 à partir du ~ène humain ARNr 28S.
5 Des amorces ont été définies à l'aide de la séquence du gène ARNr 28S humain inclus dans la banque de donnée DNAstar (référence: HUMRGM, la séquence reportée allantde la position + I à la position + 5025). On a localisé le site d'insertion et la région d'insertion de l'intron 3 (tels que reportés dans Muscarella et Vogt, 1989, Cell, 56, 443-454). Le site d'insertion est compris entre les nucléotides 3742 et 3743 du gène ARNr 0 28S humain.
Un premier fragment d'ADN correspondant au fragment allant de. Ia position 2324 à la position 3742 du gène ARNr 28S humain est généré par PCR. L'amorce correspondantau brin codant (position 2324 à 2349) est reportée dans la SEQ ID NO: 1 Elle lS comporte en outre une extrémité S' libre portant les sites Hi~7dIII et NheI. L'amorce reverse est décrite dans la SEQ ID NO: 2 et comporte une extrémité 5' incluant les sites SpeI et X~aI. L'amplification est réalisée avec la polymérase de Thermus Aquaticus (Perkin Elmer Cetus) selon les conditions standards indiquées par le fabricant. On utilise comme matrice du DNA humain préparé classiquement. Le produit 20 amplifié est vérifié sur gel d'agarose et séquencé.
On isole également par PCR, le deuxième fragment de gène ARNr 28S humain. Il s'agit de la portion de gène allant de la position 3743 à 4438. Les deux oligonucléotides mis en oeuvre sont reportés dans les SEQ ID NO: 3 et 4. La première amorce comporte à
25 son e"llé.,.ilé 5' un site SpeI tandis que l'amorce reverse contient de 5' vers 3' les sites EcoR~, NheI et Bg/lI. La réaction d'amplification est réalisée à partir de l'ADNgénomique humain préparé classiquement, dans les conditions standards courammentemployées par l'homme du métier. Le fragment PCR ainsi généré est vérifié sur gel d'agarose et séquencé.
Le fragment comprenant Ikb de séquences humaines immédiatement adjacentes en S' au site d'insertion de l'intron 3, est digéré par les enzymes Hi ?dIII et SpeI. Le fragment comprenant les séquences immédiatement adjacentes en 3' est digéré par SpeI et EcoRI. Les deux fragments sont ensuite ligués dans le plasmide pUC 19 (Yanisch-35 Perron et al., 1985, Gene, 33, 103-119) préalablement digéré par Hi~7dIII et EcoRI. Le mélange de ligation est transformé dans la souche Escherichia coli SK (E. coli 5K) donnant lieu au plasmide pHREI.
2. Clona~e de l'intron 3 de Phvsar7/m polvcephal1~nt modifié.
WO 94/24300 _ 21 6 0 6 9 7 PCl`~FR9~/00419 On isole l'intron 3 (0,94kb) par la technique PCR. Les amorces sont établies à partir des données de séquence reportées dans la littérature (Muscarella et al, 1990, Mol.
Cell. Biol., 10, 3386-3996; Johansen et al, 1992, Curr. Genet., 22, 297-304). Les amorces sont décrites dans les SEQ ID NO: 5 et 6. Elles comprennent toutes deux un site Kp~7I dans leur région 5'.
La réaction d'amplification est ef~ectuée à partir d'une banque d'ADN génomique de Physarum polycephal~ , souche Calo1i~1a (Muscarella et Vogt, 1989, Cell, 56, 443-0 454), en appliquant les conditions standards connues de l'homme de métier. Aprèsamplification, la taille du fragment obtenu est contrôlée sur gel d'agarose et sa séquence vérifiée Le fragment PCR est digéré par Kp~rI et cloné dans le site Kp~I du vecteur pUCl915 pour donner prNEI.
Le vecteur pINEI est digéré par NheI, site unique situé dans l'intron 3 de Physarum polycephal~ . Le vecteur pINEI linéarisé est traité à la nucléase de haricot Mung et ligué à un linker XhoI (Stratagène). Le vecteur en résultant est désigné pINEII et 20 comporte donc un site uni~ue XhoI pour l'insertion d'un fragment d'ADN d'intérêt.
On peut citer, par exemple, I'endonucléase codée en partie par l'intron 3 de Physarum popycepha~7~m Cette endonucléase initie la transposition de l'intron 3 en reconnaissant sa séquence cible et clivant la molécule d'ADN au niveau de cette séquence spécifique.
0 On peut citer également la protéine codée par le rétroposon R2Bm de Bombyx mori.
L'activité endonucléase de ladite protéine est probablement impliquée dans la transposition de R2Bm au niveau de sa région d'insertion spécifique mais par un mécanisme qui n'est pas connu à ce jour.
15 Le fragment d'ADN d'intérêt peut être introduit dans l'élément génétique mobile par les techniques classiques du génie génétique. 11 peut être intégré dans ou en dehors du cadre de lecture ouvert codant pour une éventuelle intégrase.
Selon un aspect particulièrement avantageux de l'invention, le fragment d'ADN d'intérêt 20 est inséré dans le cadre de lecture ouvert, afin d'empêcher l'expression de l'intégrase.
Ceci introduit une sécurité pour éviter la propagation incontrôlée de la c~ssette d'intégration dans le génome de la cellule hôte.
Dans ce cas, I'intégrase spécifique de l'élément génétique mobile mis en oeuvre dans 25 I'ensemble de transposition selon l'invention, devra être fournie à la cellule hôte de manière transitoire pendant un temps suffisamment long pour permettre la transposition de la cassette d'intégration dans sa région d'insertion spécifique. Les moyens de fournir en fral7s une protéine à une cellule eucaryote sont nombreux et connus de l'homme de l'art.
Par exemple, I'ensemble de transposition selon l'invention peut être introduit dans un vecteur (tel que défini ci-après), comprenant en outre une c~csette d'expression de I'intégrase spécifique de l'élément génétique mobile présent dans l'ensemble de transposition.
D'une manière alternative, on peut transfecter parallèlement la cellule hôte eucaryote avec un vecteur helper comprenant une cassette d'expression de l'intégrase ou fournir à
la cellule hôte, I'intégrase sous forme purifiée.
wo 94/24300 216 ~ ~ 9 7 PCT/~R94/(10419 Le fragment d'ADN d'intérêt peut être tout fragment capable d'être transcrit en ARN
pour produire un ARN anti-sens, par exemple une séquence d'A~N complémentaire d'un gène pathogène susceptible de former un duplex avec un transcrit pathogène afin d'inhiber la traduction en protéine pathogène. Un gène pathogène est:
5 (1) un gène qui n'est pas présent dans les cellules eucaryotes, par exemple un gène présent dans le génome d'un organisme pathogène (bactérie, virus ou parasite), ou (2) un gène homologue ou un gène homologue muté, par exemple un oncogène, qui est présent mais normalement pas exprimé dans les cellules eucaryotes normales et dont l'expression anormalement induite peut causer une maladie comme le cancer.
De façon alternative, le fragment d'ADN d'intérêt peut coder pour une protéine d'intérêt et de manière préférée, une protéine dont l'absence d'expression ou l'expression en quantité anormale ou sous forme mutante est associée à une maladie génétique.
s Le fragment d'ADN d'intérêt peut coder pour une protéine mature ou un précurseur de celle-ci. Dans le premier cas, il comprend la séquence codante pour une protéinemature permettant l'expression de la protéine de façon intrace.~ ire. Dans le dernier cas, le fragment d'ADN d'intérêt peut également inclure une séquence signal permettant 20 la sécrétion de ladite protéine de la cellule hôte. Le fragment d'ADN d'interêt peut coder pour une protéine chimérique provenant de la fusion de séquences d'origines diverses.
Les exemples de protéines pouvant être codées par le fragment d'ADN d'intérêt 25comprennent:
- des cytokines, comme l'interféron~alpha, I'interféron gamma et différents types de facteurs de croissance, - des récepteurs membranaires, comme les récepteurs impliqués dans la transmission des signaux de la surface à l'intérieur des cellules et les récepteurs reconnus par des organismes pathogènes, comme le récepteur CD4 présent à la surface des Iymphocytes T et reconnu par la glycoprotéine d'enveloppe du virus VIH (Virus d'Immunodéficience Humaine), - des enzymes, comme les ribonucléases et la thymidine-kinase (TK) du virus simplex de l'herpès de type I (HSV-I). Cette dernière présente une af~lnité supérieure par rapport à l'enzyme TK de cellule mammifère pour certains analogues de nucleosides, comme l'acyclovir ou le gancyclovir.
L'enzyme TK-HSV- I convertit les analogues en précurseurs de nucléotides. Ces précurseurs toxiques seront donc incorporés dans l'ADN des cellules en état de réplication. Cette incorporation permet de tuer spécifiquement les cellules en division, comme les cellules cancéreuses, s - des inhibiteurs d'une activité enzymatique, comme l'alphal antitrypsine, I'antithrombine III, la protéine C et les inhibiteurs de protéases spécifiques d'un organisme pathogène, - des facteurs de coagulation, comme le facteur VIII, le facteur IX et la thrombine, lo - des protéines participant aux canaux ioniques, comme la protéine CFTR
(Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), - des protéines capables d'inhiber l'activité d'une protéine produite par un gène pathogène, comme l'antigène supresseur de tumeur p53, - des variants de protéines pathogènes mutés de façon à altérer leur fonction biologique, comme des mutants trans-dominants de la protéine de régulation TAT du virus VIH capables de compétition avec la protéine virale native pour la liaison à la séquence cible, empêchant I'activation de l'expression des gènes viraux et, - des épitopes antigéniques permettant d'accroître l'immunité de la cellule hôte.
Le fragment d'ADN d'intérêt peut être muté afin de permettre l'expression d'une protéine d'intérêt dont les propriétés biologiques sont modifiées, par exemple un variant de l'alphal antitrypsine dont le résidu méthionine en position 358 du site actif a 25 été remplacé par une leucine. Un tel variant est fonctionnel dans des conditions d'oxydation telle que des conditions d'inflammation.
Une fois la cassette d'intégration introduite dans l'ADNr de la cellule hôte, le fragment d'ADN d'intérêt peut être placé sous la dépendance du promoteur de l'unité
30 transcriptionnelle de l'ADNr de la cellule hôte. De manière alternative, le fragment d'ADN d'intérêt peut être placé sous le contrôle d'éléments d'expression appropriés insérés dans l'élément génétique mobile. Expression signifie ici transcription en ARN
et/ou traduction de cet ARN en protéine.
3s Selon cette alternative, les éléments de contrôle de l'expression comprennentnotamment un promoteur approprié. De tels promoteurs sont bien connus de l'hommede l'art et sont insérés en amont du fragment d'ADN d'intérêt par les techniquesconventionnelles du génie génétique.
WO 94/24300 21 ~ 0 6 9 7 PCT/FR94/00419 Le promoteur retenu peut être un promoteur reconnu par l'ARN polymérase I, de façon à favoriser l'expression du fragment d'ADN d'intérêt, après intégration de la cassette d'intégration dans les gènes A}~Nr de la cellule hôte eucaryote. Par exemple, le fragment d'ADN d'intérêt peut être placé sous le contrôle des éléments de régulation 5 compris dans les régions non-transcrites de l'ADNr impliqués dans la transcription des gènes ARNr. De tels promoteurs seront choisis de manière à être fonctionnels dans la cellule hôte eucaryote qui a été retenue.
De manière alternative, le promoteur retenu peut être un promoteur reconnu par l'ARN
o polymérase II. De tels promoteurs sont bien connus de l'homme de l'art. Le promoteur peut être isolé d'un gène cellulaire ou d'un virus. Il peut être ubiquitaire permettant une expression permanente du fragment d'ADN dlintérêt dans tous les types de cellules hôtes. Le terme promoteur inclut egalement un promoteur régulable, par exemple un promoteur tissu-spécifique. On peut citer notamment le promoteur du gène HMG
5 (Hydroxy-Methyl-Glutaryl coenzyme A réductase), du gène TK du virus HSV-I, du virus SV40 (Simian virus 40), les promoteurs EIII et MLP (Major Late Promoter) de l'adénovirus, le LTR du virus MoMuLV (Moloney Murine Leukemia Virus), le promoteur du gène FIX conférant une expression foie-spécifique ou le promoteur des gènes immunoglobulines spécifique des cellules lymphocytaires.
De manière avantageuse, llensemble de transposition comprend outre une c~sette d'intégration des eléments permettant ou favorisant l'intégration site-spécifique de cette cassette. Selon un mode particulier de l'inven~ion, notamment lorsque l'élément génétique mobile mis en oeuvre est un intron mobile de classe I ou II, I'ensemble de 25 transposition selon l'invention comprend en outre:
- en 5' de la cassette d'intégration une région d'au plus 10kb, présentant au moins 80% d'homologie avec les séquences du gène ARNr de la cellule hôte immédiatement adjacentes en 5' audit site d'insertion; et - en 3' de la cassette d'intégration une région d'au plus 10kb, présentant au moins 80% d'homologie avec les séquences du gène ARNr de la cellule hôte immédiatement adjacentes en 3' audit site d'insertion.
En effet, il peut être avantageux de placer ladite cassette d'intégration dans un 3s environnement ADNr, particulièrement lorsque la transposition implique un phénomène d'échange de fibres comme cela a éte montré notamment pour l'intron 3. L'échange de fibres implique les séquences donneuses intron+ (de l'ensemble de transposition) et les séquences receveuses intron~ (de la cellule hote). Seule la l~csette d'intégration sera transposée dans le génome de la cellule hôte. Les séquences du gène ARNr WO 9~/24300 21 6 0 6 9 7 PCT/FR94/00419 immédiatement adjacentes en S' et 3' du site d'insertion interviennent uniquement dans le processus de transposition.
Afin de favoriser la transposition de la cassette d'intégration, on préférera avoir une homologie parfaite entre les séquences donneuses et receveuses impliquées dans l'échange de fibre. Ainsi, un ensemble de transposition préféré comprendra en outre:
- en 5' de la cassette d'intégration une région d'au plus IOkb, présentant 100% d'homologie avec les séquences du gène ARNr de la cellule hôte o immédiatement adjacentes en S' audit site d'insertion; et - en 3' de la cassette d'intégration une région d'au plus 10kb, présçnt~nt 100% d'homologie avec les séquences du gène ARNr de la cellule hôte immédiatement adjacentes en 3' audit site d'insertion.
15 Les séquences du gène ARNr immédiatement adjacentes en 5' et 3' au site d'insertion peuvent être isolées selon les techniques classiques du génie génétique, par exemple par clonage ou PCR (Polymerase Chain Reaction) ou synthèse chimique. De manière plusparticuljère, ces séquences auront une longueur d'au plus lOkb, de manière avantageuse d'au plus 3kb et de préférence d'au plus 0,4 kb.
La présente invention concerne également un moyen d'introduction d'un ensemble de transposition selon l'invention dans une cellule eucaryote. De tels moyens consistant à
introduire un acide nucléique dans une cellule eucaryote sont généralement connus de l'homme de l'art.
Aux fins de la présente invention, I'ensemble de transposition selon l'invention peut être introduit dans un moyen d'introduction sélectionné parmi les véhicules de délivrance de type liposomes et lipides cationiques synthétiques et les vecteurs de clonage etd'expression classiquement utilisés dans les cellules eucaryotes. L'encapsulation dans un 30 véhicule de délivrance et les techniques de clonage dans des vecteurs constituent des techniques classiques connues de l'homme de l'art. Mais d'autres protocoles permettant d'introduire un acide nucléique dans une cellule peuvent également être employés, comme par exemple la precipitation au phosphate de calcium, la technique du DEAEdextrane, I'injection directe de l'acide nucléique dans une cellule ou le bombardement 35 de microparticules d'or couvertes d'acide nucléique dans les cellules d'un animal.
L'acide nucléique peut être introduit sous forme superenroulee, circulaire ou linéaire.
D'une manière avantageuse, le moyen d'introduction selon l'invention est un vecteur comprenant les éléments appropriés à sa maintenance dans la cellule hôte pendant un wo 94/24300 , 2 ~ 7 PCT/FRg4/00419 temps suffisamment long pour permettre le transfert de la cassette d'intégration dans la région d'insertion. Un tel vecteur doit être capable d'entrer dans une cellule eucaryote supérieure, de rester de préférence sous forme extrachromosomique et de se maintenir dans la cellule pendant un temps suffisamment long pour permettre la transposition de 5 la cassette d'intégration dans le génome de la cellule hôte. Un tel vecteur peut être sous la forme d'un plasmide ou d'un vecteur viral.
De préférence, le moyen d'introduction selon l'invention est un vecteur de type non-intégratif. On peut citer un vecteur dérivé du virus de l'herpès simplex ou d'uno adénovirus. D'une manière particulièrement préférée, le moyen d'introduction selon l'invention est un vecteur dérivé d'un adénovirus, comme par exemple l'adénovirus de type 5.
Selon un mode avantageux et comme évoqué précédemment, le moyen d'introduction 5 selon l'invention peut contenir en outre une cassette d'expression permettant la production de l'intégrase spécifique de l'ensemble de transposition.
Une telle c~csette d'expression comprend le fragment d'ADN codant pour ladite intégrase, placé sous le contrôle d'éléments appropriés permettant son exy~ession. Par 20 éléments appropriés permettant son expression, on entend l'ensemble des éléments permettant la transcription dudit fragment d'ADN en ARNm et la traduction de l'ARNm en protéine. Ces éléments comportent notamment un promoteur approprié, depréférence un promoteur reconnu par l'ARN polymérase II et pennettant une expression forte et ubiquitaire, par exemple le promoteur SV40.
Le moyen d'introduction selon l'invention peut en outre comprendre une cassette d'expression permettant l'expression d'un gène de sélection, perrnettant la détection et l'isolement des cellules hôtes comprenant ledit moyen d'introduction. Dans le contexte de l'invention, le gène codant pour le marqueur de sélection peut etre sous le contrôle 30 d'éléments appropries permettant son expression dans la cellule hôte, tels que définis ci-dessus.
L'invention est également relative à un procédé i~7 l~itro de transfert d'un fragment d'ADN d'intérêt dans le génome d'une cellule hôte eucaryote au niveau de l'ADN
3s nucléaire ribosomal, selon lequel on introduit dans ladite cellule hôte un ensemble de transposition selon l'invention ou un moyen d'introduction selon l'invention.
Avantageusement, on peut en outre fournir dans le procédé i~l vitro selon l'invention, I'intégrase spécifique de l'ensem~le de transposition selon l'invention à la cellule hôte.
~ WO 94/24300 21 6 113 6 9 7 PCT/FR94/0041~
L'invention a également pour objet une cellule eucaryote comprenant un ensemble de transposition selon l'invention ou un moyen d'introduction selon l'invention. Ladite cellule sera de manière avantageuse une cellule de mammifère, et de manière préférée 5 une cellule humaine.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent thérapeutique, un ensemble de transposition selon l'invention, un moyen d'introduction selon l'invention ou une cellule selon l'invention, en o association avec un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
La composition pharmaceutique selon l'invention, est en particulier destinée au traitement préventif ou curatif de maladies telles que:
- des maladies génétiques, comme par exemple l'hémophilie ou la mucoviscidose, - des cancers, comme par exemple ceux induits par des oncogènes ou des virus, - des maladies rétrovirales, comme par exemple le SIDA (syndrome de l'immunodéficience acquise), et - des maladies virales récurrentes, comme par exemple les infections virales provoquées par le virus de l'herpès.
Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière 2s conventionnelle. En particulier, on associe une quantité thérapeutiquement efficace d'un agent thérapeutique à un support tel qu'un diluant. Une composition selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans ledomaine de l'art, en particulier par voie sous-cutanée, par voie intramuscul~ire, par voie intraveineuse ou par voie intra-trachéale. L'administration peut avoir lieu en dose 30 unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. La voie d'administration et le dosage appropriés varient en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu traité ou du fragment d'ADN d'intérêt. Une composition pharmaceutique peut comprendre en outre un adjuvant acceptable d'un point de vuepharmaceutique.
Avantageusement, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend en outre une intégrase ou une cassette d'expression de l'intégrase.
WO94/24300 216 0 6 9 7 pcT~ lon4ls L'invention s'etend égaiement à une méthode de traitement selon laquelle on administre une quantité thérapeutiquement ef~lcace d'un ensemble de transposition selon l'invention un moyen d'introduction selon l'invention ou une cellule selon l'invention à
un patient ayant besoin d'un tel traitement.
s L'invention est illustree ci-après en référence à la figure 1 qui représente schématiquement un ensemble de transposition (I) (grande boîte blanche) qui comprend de 5' vers 3': les séquences du gène ARNr (6) (boîte hachurée) en 5' du site d'insertion (5) (traits noirs) une cassette d'intégration (3) (petite boîte blanche) o constituée d'un élément génétique mobile (4) (boîte rayée horizontalement) au sein duquel est inséré un fragment d'ADN d'intérêt (2) (boîte pointillée) et les séquences du gène ARNr (7) (boîte hachurée) en 3' du site d'insertion (5).
EXEMPLES:
EXEMPLE 1: Construction d'un ensemble de transposition pour l'inté~ration site-spécifique dans les ~ènes ARNr 28S d'une cellule humaine. mettant en oeuvre l'intron 3 de Phvsan~m polycephal1~n1 souche Carolina.
20 L'exemple se réfère à un ensemble de transposition qui comporte (I) l'intron 3 modifié de manière à créer un site unique de restriction XhoI dans la séquence intronique. Le site X77oI permettra d'introduire un fragment d'ADN
d'intérêt quelconque. En ef~et le fragment d'ADN d'intérêt peut être isolé de manière à
présenter des e~l~é"~i~és cohésives compatibles avec les exl~e"~;~és générées par une 25 digestion XhoI (fragment de restriction XhoI ou SQII OU XhoI-Sa/I ou addition de linkers XhoI et/ou Sa/I ou mutagenèse dirigée afin de créer les sites X77oI et/ou Sal~
requis). D'une manière alternative, le site de clonage X77oI peut être traité par exemple à la nucléase de haricot Mung afin de générer des eA~ré~-ilés franches entre lesquelles on peut cloner tout fragment d'ADN d'intérêt à bouts francs. Le fragment d'ADN de 30 0,94 kb comportant l'intron 3 peut être isolé notamment par clonage, PCR ou synthétiséchimiquement et (2) les séquences immédiatement adjacentes en 5' et 3' au site d'insertion de l'intron 3. Ces séquences sont isolées du gène ARNr 28S humain comprenant la région d'insertion de l'intron 3 parfaitement conservée. Ainsi l'intron mobile sera placé dans un 3s environnement ADNr. L'échange de fibres impliquera des séquences parfaitementhomologues puisque toutes deux d'origine humaine (séquences donneuses de la cassette d'intégration et séquences receveuses de la cellule humaine hôte). Les séquences immédiatement adjacentes en 5' et 3' peuvent etre isolées not~mment par clonage, PCR ou synthétisees chimiquement.
WO 9~/24300 PCT/FR94/00419 15 ~160697 1. Clonage par PCR des séquences immédiatement adjacentes en 5' et 3' au site d'insertion de l'intron 3 à partir du ~ène humain ARNr 28S.
5 Des amorces ont été définies à l'aide de la séquence du gène ARNr 28S humain inclus dans la banque de donnée DNAstar (référence: HUMRGM, la séquence reportée allantde la position + I à la position + 5025). On a localisé le site d'insertion et la région d'insertion de l'intron 3 (tels que reportés dans Muscarella et Vogt, 1989, Cell, 56, 443-454). Le site d'insertion est compris entre les nucléotides 3742 et 3743 du gène ARNr 0 28S humain.
Un premier fragment d'ADN correspondant au fragment allant de. Ia position 2324 à la position 3742 du gène ARNr 28S humain est généré par PCR. L'amorce correspondantau brin codant (position 2324 à 2349) est reportée dans la SEQ ID NO: 1 Elle lS comporte en outre une extrémité S' libre portant les sites Hi~7dIII et NheI. L'amorce reverse est décrite dans la SEQ ID NO: 2 et comporte une extrémité 5' incluant les sites SpeI et X~aI. L'amplification est réalisée avec la polymérase de Thermus Aquaticus (Perkin Elmer Cetus) selon les conditions standards indiquées par le fabricant. On utilise comme matrice du DNA humain préparé classiquement. Le produit 20 amplifié est vérifié sur gel d'agarose et séquencé.
On isole également par PCR, le deuxième fragment de gène ARNr 28S humain. Il s'agit de la portion de gène allant de la position 3743 à 4438. Les deux oligonucléotides mis en oeuvre sont reportés dans les SEQ ID NO: 3 et 4. La première amorce comporte à
25 son e"llé.,.ilé 5' un site SpeI tandis que l'amorce reverse contient de 5' vers 3' les sites EcoR~, NheI et Bg/lI. La réaction d'amplification est réalisée à partir de l'ADNgénomique humain préparé classiquement, dans les conditions standards courammentemployées par l'homme du métier. Le fragment PCR ainsi généré est vérifié sur gel d'agarose et séquencé.
Le fragment comprenant Ikb de séquences humaines immédiatement adjacentes en S' au site d'insertion de l'intron 3, est digéré par les enzymes Hi ?dIII et SpeI. Le fragment comprenant les séquences immédiatement adjacentes en 3' est digéré par SpeI et EcoRI. Les deux fragments sont ensuite ligués dans le plasmide pUC 19 (Yanisch-35 Perron et al., 1985, Gene, 33, 103-119) préalablement digéré par Hi~7dIII et EcoRI. Le mélange de ligation est transformé dans la souche Escherichia coli SK (E. coli 5K) donnant lieu au plasmide pHREI.
2. Clona~e de l'intron 3 de Phvsar7/m polvcephal1~nt modifié.
WO 94/24300 _ 21 6 0 6 9 7 PCl`~FR9~/00419 On isole l'intron 3 (0,94kb) par la technique PCR. Les amorces sont établies à partir des données de séquence reportées dans la littérature (Muscarella et al, 1990, Mol.
Cell. Biol., 10, 3386-3996; Johansen et al, 1992, Curr. Genet., 22, 297-304). Les amorces sont décrites dans les SEQ ID NO: 5 et 6. Elles comprennent toutes deux un site Kp~7I dans leur région 5'.
La réaction d'amplification est ef~ectuée à partir d'une banque d'ADN génomique de Physarum polycephal~ , souche Calo1i~1a (Muscarella et Vogt, 1989, Cell, 56, 443-0 454), en appliquant les conditions standards connues de l'homme de métier. Aprèsamplification, la taille du fragment obtenu est contrôlée sur gel d'agarose et sa séquence vérifiée Le fragment PCR est digéré par Kp~rI et cloné dans le site Kp~I du vecteur pUCl915 pour donner prNEI.
Le vecteur pINEI est digéré par NheI, site unique situé dans l'intron 3 de Physarum polycephal~ . Le vecteur pINEI linéarisé est traité à la nucléase de haricot Mung et ligué à un linker XhoI (Stratagène). Le vecteur en résultant est désigné pINEII et 20 comporte donc un site uni~ue XhoI pour l'insertion d'un fragment d'ADN d'intérêt.
3. Insertion de l'intron 3 de PhY.sart~m polYcephal~m (XhoI) dans un environnement gène ARNr 28S humain 25 Le fragment Kp~I obtenu par digestion de prNEII est traité à la polymérase de T4 pour donner un fragment à bouts francs dont les eAII é~n;lés 5' et 3' correspondent exactement à celles de l'intron.
Parallèlement, pHREI est digéré par les enzymes X~aI et SpeI, puis traité a la nucléase 30 de haricot Mung (selon la technique reportée dans Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Press). Ceci génère un grand fragment comportant la majorité du vecteur pHREI, dont les e,~l~é~ és franches correspondent respectivement aux nucléotides en position 3742 et 3743 du gène ARNr 28S humain.
35 Le fragment issu de prNEII comportant l'intron 3 de Physan~m polycephal~m est ligué
au vecteur pHREI traité comme indiqué ci-dessus, pour donner le vecteur pHREII.
Après introduction d'un fragment d'ADN d'intérêt, le vecteur pH~EI comprendra donc un ensemble de transposition permettant l'insertion d'une cassette d'intégration (intron 3 co"~prenant un fragment d'ADN d'intérêt) dans le gène ARNr 28S humain.
~ 17 _ 2160697 EXEMPLE 2: Construction d'un vecteur adénoviral pour l'intégration du gène néomycine (neo) dans le ~énome humain.
On construit un vecteur adénoviral comportant:
(1) I'intron 3 de Physartm1 polycephal1~m (Xho+) au niveau duquel on introduit une première cassette d'expression permettant l'expression du gène neo, (2) une deuxième cassette d'expression, celle de l'endonucléase site-specifique IPpo, codée en partie par l'intron 3. La deuxième cassette d'expression permettra la production de l'endonucléase IPpo pendant un temps suffisamment long pour pennettre la transposition de la cassette d'intégration dans le génomede la cellule hôte. Le codon initiateur de la traduction de IPpo se situe dans la séquence exonique en 5' de l'intron 3 dans le gène ARNr 26S de Physarum polycephal~l/n. La séquence immédiatement adjacente en 5' au site d'insertion isolée du gène ARNr 28S humain ne contient pas l'ATG initiateur présent dans la région équivalente chez Physarum, et (3) Les éléments appropriés à la maintenance du vecteur dans la cellule hôte pendant un temps suffisamment long pour permettre la transposition de la cassette d'intégration.
1. Construction de la cassette d'expression de IPpo.
2s Un fragment de 167 nucléotides contenant la région poly A de SV40 (Fitzgerald et Shenk, 1981, Cell, 2~, 251-260) est synthétisé sous forme d'un fragment HiodIII-EcoPl à l'aide d'un synthétiseur automatique (Milligen 7500). Un site BglII est introduit juste en amont du site ~coRI.
On isole un fragment Hfndlll-BamHI de pMSG-CAT (Pharmacia) comprenant le promoteur précoce du virus SV40. On introduit le fragment synthétique HindIII-EcoRI
et le fragment HindllI-Ban7HI dans un dérivé du vecteur pUCl9 (HindIII) digéré par - BamHI et EcoRl. Le dérivé est obtenu après digestion de pUCl9 par HindIII et traitement à la polymérase de T4. Le vecteur obtenu est désigné pSV40EI.
Un fragment d'ADN comportant la séquence codant pour la nucléase IPpo est isolé
sous forme d'un fragment PCR. La séquence reportée dans l'art antérieur (Muscarella et al., 1990, Mol. Cell. Biol, 10, 3386-3396) a permis de définir deux amorces, qui sont respectivement décrites dans les SEQ ID NO: 7 et 8. Les 2 oligonucléotides wo 9~/24300 21 6 ~ 6 ~ 7 PCT~Rg~/00419 comportent un site ~i~7dIII à leur extrémité 5'. L'amplification est effectuée dans les conditions standards connues de l'homme de métier à partir d'une banque d'ADN
génomique de Phy.sar~/m p~lycepJ?ah~m, souche Carolina.
5 Le fragment PCR généré, après vérification sur gel d'agarose et sequençage, est digéré
par Hi~tdIlI et introduit dans le site unique Hi~ldIII du vecteur pSV40EI. On identifie un clone présentant une orientation correcte de la séquence codant pour IPpo vis à vis du promoteur SV40. Le clone est désigné pSV40EII.
0 2. Clona~e de la cassette d'expression de l'endonucléase IPpo dans le vecteur pHREII.
Le vecteur pHREII est digéré par BglI] et traité à la polymérase de T4. Le vecteur pSV40EII est digéré par les enzymes PstI et Bg/II. Le fragment PstI-Bg~I comportant la cassette d'expression de IPpo, est traité à la nucléase de haricot Mung. Puis on ligue 5 le fragment ainsi traité au vecteur pHREII donnant lieu à p~EIII.
3. Introduction de la cassette d'expression d'un fra~ment d'ADN d'intérêt dans l'intron 3.
20 La première cassette d'expression du fragment d'ADN d'intérêt comprend en séquence de 5' vers 3' respectivement:
(1) le promoteur TK du virus HSV, (2) le gène néomycine, et (3) la région polyA du virus SV40.
Le fragment XhoI-SalI de l,lkb comprenant ladite cassette d'e,.pres~ion est isolé du plasmide pMCI neo (Stratagène), est cloné dans le vecteur p~EIII linéarisé par X~7oI.
Le vecteur en résultant est désigné pHRE IV.
30 4. Clonage dans un vecteur adénoviral et infection de cellules hôtes.
On isole du vecteur pHRElV le fragment NheI comprenant l'ensemble de transposition (intron 3 dans lequel est introduit la première cassette d'e~p.ession neo, flanqué des séquences adjacentes 5' et 3' du gène ARN 28S humain) et la deuxième c~sette 35 d'expression de IPpo. Le fragment purifié est traité à la polymérase de T4 avant d'etre inséré dans le vecteur pXCX2 (Spessot et al., 1989, Virology, 168, 378-387).
Le vecteur en résultant est utilisé pour générer un adénovirus recombinant par les méthodes conventionnelles, comme par exemple, la méthode reportée dans Spessot et WO 9~/24300 PCT/FR94/00419 19 2160~97 al. (1989, Virology, IC8, 378-387). Le vecteur adénoviral recombinant est construit à
partir d'un mutant de délétion de l'adénovirus de type 5 (Thimmappaye et al. 1982, Cell, 31, 543-551). Le vecteur adenoviral recombinant ainsi obtenu est utilisé pour infecter des cellules humaines en culture.
s On cultive les cellules dans les conditions conventionnelles connues de l'homme de l'art.
48 heures après l'infection, les cellules sont placées dans un milieu de culture contenant de la néomycine.
0 La présence du gène neo dans les cellules peut être contrôlée par leur phénotype de résistance à la néomycine et vérifiée par Southern blot. L'insertion site-spécifique de la cassette d'intégration dans le génome cellulaire peut être vérifiée par PCR. On utilisera de préférence, une amorce complémentaire à une séquence du gène ARNr 28S humain non présente dans l'ensemble de transposition (en 5' de la position 2324 ou en 3' de la 15 position 4438) et une amorce complémentaire à une séquence de la cassette d'intégration normalement non présente dans le génome cellulaire (par exemple del'intron 3 ou de la cassette d'expression du gène neo). On obtiendra un fragment PCR
d'une taille définie uniquement en cas d'intégration site-spécifique de la cassette d'intégration dans le gène ARNr 28S humain.
EXEMPLE 3: Construction d'un vecteur plasmidique (épisomal) réplicatif pour l'inté~ration du gène néomycine dans le génome humain.
Le fragment Nhel de l'exemple 2.4 est inséré dans le vecteur pREP4 (Grager et al., 25 1989, Gene, 81, 385-294; Invitrogen Corporation, British Bio-Technology Products LTD, Oxon, UK; reference V 004-50) au niveau du site unique NheI.
Le vecteur en résultant est transfecté dans une lignée de cellules humaines en culture comme indiqué dans Yates et al. (1985, Nature, 313, 812-815). A titre indicatif, on 30 mentionne la lignée 293, lignee de rein embryonnaire humain, disponible à l'ATCC. 48 heures après la transfection les cellules sont placées dans un milieu de culture sélectif.
On vérifie la présence du gène neo intégré dans le génome cellulaire comme décrit dans I'exemple 2.4.
W 094/24300 PCT~R94/00419 216~697 ~
o LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: Transgene S.A.
(B) RUE: 11 rue de Molsheim (C) VILLE: Strasbourg (E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 67082 (G) TELEPHONE: (33) 88 27 91 00 (H) TELECOPIE: (33) 88 22 58 07 (ii) TITRE DE L' INVENTION: Ensem~le de transposition destine au transfert d'un gene d'interet dans le genome d'une cellule eucaryote.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 8 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 44 paires de bases (B) TYPE: acide nucl~ique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide de synthese (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 42 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide de synthese ~ W 09~/2430n _ 21 6 0 G 9 7 PCT~R94/00419 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGVEUR: 37 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple ~ (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide de synthese (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 48 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide de synthese (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide de synthese W 094/24300 , _ 21 ~ 0 6 9 7 PCT~R9~/00419 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 31 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide de synthese (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide de synthese (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 34 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide de synthese 2 1 ~ ~ PCT~R94/00419 ~ W 094/24300 ~ U ~ 6 9 7 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
CCCAAAAGCT TCAGTGCTCT GGATGTTAAA ATGG
Parallèlement, pHREI est digéré par les enzymes X~aI et SpeI, puis traité a la nucléase 30 de haricot Mung (selon la technique reportée dans Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Press). Ceci génère un grand fragment comportant la majorité du vecteur pHREI, dont les e,~l~é~ és franches correspondent respectivement aux nucléotides en position 3742 et 3743 du gène ARNr 28S humain.
35 Le fragment issu de prNEII comportant l'intron 3 de Physan~m polycephal~m est ligué
au vecteur pHREI traité comme indiqué ci-dessus, pour donner le vecteur pHREII.
Après introduction d'un fragment d'ADN d'intérêt, le vecteur pH~EI comprendra donc un ensemble de transposition permettant l'insertion d'une cassette d'intégration (intron 3 co"~prenant un fragment d'ADN d'intérêt) dans le gène ARNr 28S humain.
~ 17 _ 2160697 EXEMPLE 2: Construction d'un vecteur adénoviral pour l'intégration du gène néomycine (neo) dans le ~énome humain.
On construit un vecteur adénoviral comportant:
(1) I'intron 3 de Physartm1 polycephal1~m (Xho+) au niveau duquel on introduit une première cassette d'expression permettant l'expression du gène neo, (2) une deuxième cassette d'expression, celle de l'endonucléase site-specifique IPpo, codée en partie par l'intron 3. La deuxième cassette d'expression permettra la production de l'endonucléase IPpo pendant un temps suffisamment long pour pennettre la transposition de la cassette d'intégration dans le génomede la cellule hôte. Le codon initiateur de la traduction de IPpo se situe dans la séquence exonique en 5' de l'intron 3 dans le gène ARNr 26S de Physarum polycephal~l/n. La séquence immédiatement adjacente en 5' au site d'insertion isolée du gène ARNr 28S humain ne contient pas l'ATG initiateur présent dans la région équivalente chez Physarum, et (3) Les éléments appropriés à la maintenance du vecteur dans la cellule hôte pendant un temps suffisamment long pour permettre la transposition de la cassette d'intégration.
1. Construction de la cassette d'expression de IPpo.
2s Un fragment de 167 nucléotides contenant la région poly A de SV40 (Fitzgerald et Shenk, 1981, Cell, 2~, 251-260) est synthétisé sous forme d'un fragment HiodIII-EcoPl à l'aide d'un synthétiseur automatique (Milligen 7500). Un site BglII est introduit juste en amont du site ~coRI.
On isole un fragment Hfndlll-BamHI de pMSG-CAT (Pharmacia) comprenant le promoteur précoce du virus SV40. On introduit le fragment synthétique HindIII-EcoRI
et le fragment HindllI-Ban7HI dans un dérivé du vecteur pUCl9 (HindIII) digéré par - BamHI et EcoRl. Le dérivé est obtenu après digestion de pUCl9 par HindIII et traitement à la polymérase de T4. Le vecteur obtenu est désigné pSV40EI.
Un fragment d'ADN comportant la séquence codant pour la nucléase IPpo est isolé
sous forme d'un fragment PCR. La séquence reportée dans l'art antérieur (Muscarella et al., 1990, Mol. Cell. Biol, 10, 3386-3396) a permis de définir deux amorces, qui sont respectivement décrites dans les SEQ ID NO: 7 et 8. Les 2 oligonucléotides wo 9~/24300 21 6 ~ 6 ~ 7 PCT~Rg~/00419 comportent un site ~i~7dIII à leur extrémité 5'. L'amplification est effectuée dans les conditions standards connues de l'homme de métier à partir d'une banque d'ADN
génomique de Phy.sar~/m p~lycepJ?ah~m, souche Carolina.
5 Le fragment PCR généré, après vérification sur gel d'agarose et sequençage, est digéré
par Hi~tdIlI et introduit dans le site unique Hi~ldIII du vecteur pSV40EI. On identifie un clone présentant une orientation correcte de la séquence codant pour IPpo vis à vis du promoteur SV40. Le clone est désigné pSV40EII.
0 2. Clona~e de la cassette d'expression de l'endonucléase IPpo dans le vecteur pHREII.
Le vecteur pHREII est digéré par BglI] et traité à la polymérase de T4. Le vecteur pSV40EII est digéré par les enzymes PstI et Bg/II. Le fragment PstI-Bg~I comportant la cassette d'expression de IPpo, est traité à la nucléase de haricot Mung. Puis on ligue 5 le fragment ainsi traité au vecteur pHREII donnant lieu à p~EIII.
3. Introduction de la cassette d'expression d'un fra~ment d'ADN d'intérêt dans l'intron 3.
20 La première cassette d'expression du fragment d'ADN d'intérêt comprend en séquence de 5' vers 3' respectivement:
(1) le promoteur TK du virus HSV, (2) le gène néomycine, et (3) la région polyA du virus SV40.
Le fragment XhoI-SalI de l,lkb comprenant ladite cassette d'e,.pres~ion est isolé du plasmide pMCI neo (Stratagène), est cloné dans le vecteur p~EIII linéarisé par X~7oI.
Le vecteur en résultant est désigné pHRE IV.
30 4. Clonage dans un vecteur adénoviral et infection de cellules hôtes.
On isole du vecteur pHRElV le fragment NheI comprenant l'ensemble de transposition (intron 3 dans lequel est introduit la première cassette d'e~p.ession neo, flanqué des séquences adjacentes 5' et 3' du gène ARN 28S humain) et la deuxième c~sette 35 d'expression de IPpo. Le fragment purifié est traité à la polymérase de T4 avant d'etre inséré dans le vecteur pXCX2 (Spessot et al., 1989, Virology, 168, 378-387).
Le vecteur en résultant est utilisé pour générer un adénovirus recombinant par les méthodes conventionnelles, comme par exemple, la méthode reportée dans Spessot et WO 9~/24300 PCT/FR94/00419 19 2160~97 al. (1989, Virology, IC8, 378-387). Le vecteur adénoviral recombinant est construit à
partir d'un mutant de délétion de l'adénovirus de type 5 (Thimmappaye et al. 1982, Cell, 31, 543-551). Le vecteur adenoviral recombinant ainsi obtenu est utilisé pour infecter des cellules humaines en culture.
s On cultive les cellules dans les conditions conventionnelles connues de l'homme de l'art.
48 heures après l'infection, les cellules sont placées dans un milieu de culture contenant de la néomycine.
0 La présence du gène neo dans les cellules peut être contrôlée par leur phénotype de résistance à la néomycine et vérifiée par Southern blot. L'insertion site-spécifique de la cassette d'intégration dans le génome cellulaire peut être vérifiée par PCR. On utilisera de préférence, une amorce complémentaire à une séquence du gène ARNr 28S humain non présente dans l'ensemble de transposition (en 5' de la position 2324 ou en 3' de la 15 position 4438) et une amorce complémentaire à une séquence de la cassette d'intégration normalement non présente dans le génome cellulaire (par exemple del'intron 3 ou de la cassette d'expression du gène neo). On obtiendra un fragment PCR
d'une taille définie uniquement en cas d'intégration site-spécifique de la cassette d'intégration dans le gène ARNr 28S humain.
EXEMPLE 3: Construction d'un vecteur plasmidique (épisomal) réplicatif pour l'inté~ration du gène néomycine dans le génome humain.
Le fragment Nhel de l'exemple 2.4 est inséré dans le vecteur pREP4 (Grager et al., 25 1989, Gene, 81, 385-294; Invitrogen Corporation, British Bio-Technology Products LTD, Oxon, UK; reference V 004-50) au niveau du site unique NheI.
Le vecteur en résultant est transfecté dans une lignée de cellules humaines en culture comme indiqué dans Yates et al. (1985, Nature, 313, 812-815). A titre indicatif, on 30 mentionne la lignée 293, lignee de rein embryonnaire humain, disponible à l'ATCC. 48 heures après la transfection les cellules sont placées dans un milieu de culture sélectif.
On vérifie la présence du gène neo intégré dans le génome cellulaire comme décrit dans I'exemple 2.4.
W 094/24300 PCT~R94/00419 216~697 ~
o LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: Transgene S.A.
(B) RUE: 11 rue de Molsheim (C) VILLE: Strasbourg (E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 67082 (G) TELEPHONE: (33) 88 27 91 00 (H) TELECOPIE: (33) 88 22 58 07 (ii) TITRE DE L' INVENTION: Ensem~le de transposition destine au transfert d'un gene d'interet dans le genome d'une cellule eucaryote.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 8 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 44 paires de bases (B) TYPE: acide nucl~ique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide de synthese (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 42 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide de synthese ~ W 09~/2430n _ 21 6 0 G 9 7 PCT~R94/00419 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGVEUR: 37 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple ~ (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide de synthese (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 48 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide de synthese (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide de synthese W 094/24300 , _ 21 ~ 0 6 9 7 PCT~R9~/00419 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 31 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide de synthese (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide de synthese (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 34 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide de synthese 2 1 ~ ~ PCT~R94/00419 ~ W 094/24300 ~ U ~ 6 9 7 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
CCCAAAAGCT TCAGTGCTCT GGATGTTAAA ATGG
Claims (24)
1. Un ensemble de transposition (1) destiné au transfert d'un fragment d'ADN
d'intérêt (2) dans le génome d'une cellule hôte eucaryote, qui comprend une cassette d'intégration (3), essentiellement constituée d'un élément génétique mobile (4) au sein duquel est inséré ledit fragment d'ADN d'intérêt; ladite cassette d'intégration étant capable de s'intégrer d'une façon site-spécifique dans un site d'insertion spécifique (5) situé dans l'ADN nucléaire ribosomal de ladite cellule hôte.
d'intérêt (2) dans le génome d'une cellule hôte eucaryote, qui comprend une cassette d'intégration (3), essentiellement constituée d'un élément génétique mobile (4) au sein duquel est inséré ledit fragment d'ADN d'intérêt; ladite cassette d'intégration étant capable de s'intégrer d'une façon site-spécifique dans un site d'insertion spécifique (5) situé dans l'ADN nucléaire ribosomal de ladite cellule hôte.
2. Un ensemble de transposition selon la revendication 1, dans lequel l'élément génétique mobile est sélectionné parmi le groupe comprenant les introns de classe I ou II et les rétroposons de classe R1, R2 ou R3.
3. Un ensemble de transposition selon la revendication 2, dans lequel l'élément génétique mobile est sélectionné parmi:
- I'intron 3 de Physarum polycephalum, souche Carolina un fragment ou un variant dudit intron, - I'intron mobile de classe I de Tetrahymena un fragment ou un variant dudit intron, - I'intron mobile de classe I de Pneumocystis carinii un fragment ou un variant dudit intron, - le rétroposon R2Bm de Bombyx mori, un fragment ou un variant dudit rétroposon et, - le rétroposon R3 de Scaria coprophila un fragment ou un variant dudit rétroposon.
- I'intron 3 de Physarum polycephalum, souche Carolina un fragment ou un variant dudit intron, - I'intron mobile de classe I de Tetrahymena un fragment ou un variant dudit intron, - I'intron mobile de classe I de Pneumocystis carinii un fragment ou un variant dudit intron, - le rétroposon R2Bm de Bombyx mori, un fragment ou un variant dudit rétroposon et, - le rétroposon R3 de Scaria coprophila un fragment ou un variant dudit rétroposon.
4. Un ensemble de transposition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3,dans lequel l'élément génétique mobile comprend tout ou partie d'un cadre de lecture ouvert codant pour une intégrase.
5. Un ensemble de transposition selon la revendication 4, dans lequel le fragment d'ADN d'intérêt est inséré dans le cadre de lecture ouvert codant pour ladite intégrase.
6. Un ensemble de transposition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5,dans lequel le fragment d'ADN d'intérêt est susceptible d'être transcrit en ARN
pour produire un ARN anti-sens ou après traduction dudit ARN, pour produire une protéine d'intérêt.
pour produire un ARN anti-sens ou après traduction dudit ARN, pour produire une protéine d'intérêt.
7. Un ensemble de transposition selon la revendication 6, dans lequel le fragment d'ADN d'intérêt est en outre placé sous le contrôle d'éléments appropriés permettant l'expression dudit fragment d'ADN dans la cellule hôte eucaryote
8. Un ensemble de transposition selon la revendication 7, dans lequel les éléments appropriés comprennent un promoteur, ledit promoteur étant sélectionné parmi le groupe des promoteurs reconnus par l'ARN polymérase I et par l'ARN
polymérase II.
polymérase II.
9. Un ensemble de transposition selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, qui comprend en outre:
- en 5' de la cassette d'intégration une région d'au plus 10kb (6), présentant au moins 80% d'homologie avec les séquences du gène ARNr de la cellule hôte immédiatement adjacentes en 5' audit site d'insertion; et - en 3' de la cassette d'intégration une région d'au plus 10kb (7), présentant au moins 80% d'homologie avec les séquences du gène ARNr de la cellule hôte immédiatement adjacentes en 3' audit site d'insertion.
- en 5' de la cassette d'intégration une région d'au plus 10kb (6), présentant au moins 80% d'homologie avec les séquences du gène ARNr de la cellule hôte immédiatement adjacentes en 5' audit site d'insertion; et - en 3' de la cassette d'intégration une région d'au plus 10kb (7), présentant au moins 80% d'homologie avec les séquences du gène ARNr de la cellule hôte immédiatement adjacentes en 3' audit site d'insertion.
10. Un ensemble de transposition selon la revendication 9, qui comprend en outre:
- en 5' de la cassette d'intégration une région d'au plus 10kb, présentant 100% d'homologie avec les séquences du gène ARNr de la cellule hôte immédiatement adjacentes en 5' audit site d'insertion; et - en 3' de la cassette d'intégration une région d'au plus 10kb, présentant 100% d'homologie avec les séquences du gène ARNr de la cellule hôte immédiatement adjacentes en 3' audit site d'insertion.
- en 5' de la cassette d'intégration une région d'au plus 10kb, présentant 100% d'homologie avec les séquences du gène ARNr de la cellule hôte immédiatement adjacentes en 5' audit site d'insertion; et - en 3' de la cassette d'intégration une région d'au plus 10kb, présentant 100% d'homologie avec les séquences du gène ARNr de la cellule hôte immédiatement adjacentes en 3' audit site d'insertion.
11. Moyen d'introduction dans une cellule eucaryote d'un ensemble de transposition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.
12. Moyen d'introduction selon la revendication 11, sélectionné parmi les véhicules de délivrance de type liposomes et lipides cationiques synthétiques et les vecteurs de clonage et d'expression.
13. Moyen d'introduction selon la revendication 12, dans lequel ledit moyen d'introduction est un vecteur comprenant les éléments appropriés à sa maintenance dans la cellule hôte pendant un temps suffisamment long pour permettre le transfert de la cassette d'intégration dans la région d'insertion.
14. Moyen d'introduction selon la revendication 13, dans lequel le vecteur est un vecteur de type non-intégratif.
15. Moyen d'introduction selon la revendication 14, dans lequel le vecteur est un vecteur dérivé d'un adénovirus.
16. Moyen d'introduction selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, dans lequel le vecteur contient en outre une cassette d'expression permettant la production de l'intégrase spécifique de l'ensemble de transposition.
17. Moyen d'introduction selon l'une quelconque des revendications 11 à 16, dans lequel le vecteur contient en outre une cassette d'expression permettant l'expression d'un gène de sélection.
18. Procédé in vitro de transfert d'un fragment d'ADN d'intérêt dans le génome d'une cellule hôte eucaryote au niveau de l'ADN nucléaire ribosomal, selon lequel on introduit dans ladite cellule hôte un ensemble de transposition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou un moyen d'introduction selon l'une quelconque des revendications 11 à 17.
19. Procédé selon la revendication 18, selon lequel on fournit en outre l'intégrase spécifique de l'ensemble de transposition à la cellule hôte.
20. Cellule eucaryote comprenant un ensemble de transposition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou un moyen d'introduction selon l'une quelconque des revendications 11 à 17.
21. Cellule eucaryote selon la revendication 20, selon laquelle ladite cellule est une cellule de mammifère.
22. Cellule eucaryote selon la revendication 21, selon laquelle ladite cellule est une cellule humaine.
23. Composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent thérapeutique, un ensemble de transposition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, un moyen d'introduction selon l'une quelconque des revendications 11 à 17 ou une cellule selon l'une quelconque des revendications 20 à 22, en association avec un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
24. Composition pharmaceutique selon la revendication 23, comprenant en outre une intégrase ou une cassette d'expression de l'intégrase.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR93/04530 | 1993-04-16 | ||
| FR9304530A FR2703996B1 (fr) | 1993-04-16 | 1993-04-16 | Ensemble de transposition destine au transfert d'un gene d'interet dans le genome d'une cellule eucaryote. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA2160697A1 true CA2160697A1 (fr) | 1994-10-27 |
Family
ID=9446159
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CA002160697A Abandoned CA2160697A1 (fr) | 1993-04-16 | 1994-04-14 | Ensemble de transposition pour le transfert de gene chez les eucaryotes |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6346414B1 (fr) |
| EP (1) | EP0694072A1 (fr) |
| JP (1) | JPH08508878A (fr) |
| AU (1) | AU686156B2 (fr) |
| CA (1) | CA2160697A1 (fr) |
| FR (1) | FR2703996B1 (fr) |
| WO (1) | WO1994024300A1 (fr) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6077697A (en) * | 1996-04-10 | 2000-06-20 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
| US20030033617A1 (en) | 1996-04-10 | 2003-02-13 | Gyula Hadlaczky | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
| US6025155A (en) * | 1996-04-10 | 2000-02-15 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
| US6638756B2 (en) * | 2000-12-05 | 2003-10-28 | California Institute Of Technology | Chimeric cell-targeting pathogenic organism and method of therapeutic use |
| NZ529597A (en) * | 2001-05-30 | 2005-12-23 | Chromos Molecular Systems Inc | Plant artificial chromosomes, uses thereof and methods of preparing plant artificial chromosomes |
| FR3024464A1 (fr) * | 2014-07-30 | 2016-02-05 | Centre Nat Rech Scient | Ciblage de vecteurs integratifs non-viraux dans les sequences d'adn nucleolaires chez les eucaryotes |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4670388A (en) * | 1982-12-30 | 1987-06-02 | Carnegie Institution Of Washington | Method of incorporating DNA into genome of drosophila |
| HUT50875A (en) * | 1986-11-01 | 1990-03-28 | Oxford Gene Systems Ltd | Process for producing particular hybrid hiv antigenes |
| EP0330661B1 (fr) * | 1986-11-01 | 1994-01-12 | British Bio-Technology Limited | Proteines et particules de fusion |
| ZA887732B (en) * | 1987-10-20 | 1990-05-30 | Luminis Pty Ltd | Bacterial strain |
| EP0485701A1 (fr) * | 1990-09-28 | 1992-05-20 | American Cyanamid Company | Insertion d'ADN au moyen de transposones modifiés |
| CA2072581A1 (fr) * | 1990-10-25 | 1992-04-26 | Clague Hodgson | Methode de transfert de genes a l'aide de retrotransposons |
-
1993
- 1993-04-16 FR FR9304530A patent/FR2703996B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-04-14 EP EP94913647A patent/EP0694072A1/fr not_active Withdrawn
- 1994-04-14 CA CA002160697A patent/CA2160697A1/fr not_active Abandoned
- 1994-04-14 WO PCT/FR1994/000419 patent/WO1994024300A1/fr not_active Application Discontinuation
- 1994-04-14 JP JP6522836A patent/JPH08508878A/ja not_active Ceased
- 1994-04-14 AU AU65719/94A patent/AU686156B2/en not_active Ceased
- 1994-04-14 US US08/532,657 patent/US6346414B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU686156B2 (en) | 1998-02-05 |
| JPH08508878A (ja) | 1996-09-24 |
| FR2703996B1 (fr) | 1995-07-21 |
| WO1994024300A1 (fr) | 1994-10-27 |
| EP0694072A1 (fr) | 1996-01-31 |
| AU6571994A (en) | 1994-11-08 |
| FR2703996A1 (fr) | 1994-10-21 |
| US6346414B1 (en) | 2002-02-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1453962B1 (fr) | Oligonucleotides inhibiteurs et leur utilisation pour reprimer specifiquement un gene codant pour un recepteur aux androgenes | |
| EP3237615B1 (fr) | Crispr présentant ou associé avec un domaine de déstabilisation | |
| US20230416787A1 (en) | SYSTEMS AND METHODS FOR ONE-SHOT GUIDE RNA (ogRNA) TARGETING OF ENDOGENOUS AND SOURCE DNA | |
| EP1071804B1 (fr) | Utilisation de sequences d'adn de structure triplex pour le transfert de sequences nucleotidiques | |
| EP0998568B1 (fr) | Mutant ayant une activite uracile phosphoribosyl transferase | |
| US20180305692A1 (en) | Antisense oligonucleotides for the treatment of leber congenital amaurosis | |
| EP0659216B1 (fr) | Vecteur retroviral pour le transfert et l'expression de genes a visee therapeutique, dans des cellules eucaryotes | |
| EP3230451A1 (fr) | Arn guides protégés (pgrnas) | |
| FR2732357A1 (fr) | Vecteurs viraux et utilisation pour le traitement des desordres hyperproliferatifs, notamment de la restenose | |
| CA2225551A1 (fr) | Virus auxiliaires pour la preparation de vecteurs viraux recombinants | |
| WO1998002529A1 (fr) | Lignees d'encapsidation hautement productrices | |
| CA2318374C (fr) | Oligonucleotides de l'arnt suppresseur humain et procede d'utilisation | |
| WO2003052117A2 (fr) | Procedes et produits relatifs a la transfection non virale | |
| EP0889969B1 (fr) | Vecteurs adenoviraux recombinants pour la therapie genique des tumeurs humaines | |
| CA2160697A1 (fr) | Ensemble de transposition pour le transfert de gene chez les eucaryotes | |
| WO1996010087A1 (fr) | Methode de traitement des cancers par regulation de l'activite des proteines ras | |
| FR2740344A1 (fr) | Application de la proteine gax au traitement de cancers | |
| WO2003044203A2 (fr) | Vecteur de recombinaison homologue, preparations et utilisations | |
| CA2184297C (fr) | Virus recombinants codant pour une activite glutamate decarboxylase (gad) | |
| JP2002508976A (ja) | 遺伝子療法において使用するための、免疫原性が低下したヌクレオチド発現システム | |
| JP4653751B2 (ja) | 合成された哺乳動物のレトロトランスポゾン遺伝子 | |
| JPH09505984A (ja) | 遺伝子座制御領域の制御下のウイルスｄｅｃｏｙタンパク質の発現およびその使用 | |
| CN114144231B (zh) | 用于治疗癌症的crispr方法 | |
| EP0828832A2 (fr) | $g(D)P62, SES VARIANTS, SEQUENCES D'ACIDES NUCLEIQUES LES CODANT, ET LEURS UTILISATIONS EN THERAPIE GENIQUE ANTI-CANCEREUSE | |
| EP1006123A2 (fr) | Protéines d'enveloppe, methodes et utilisations |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EEER | Examination request | ||
| FZDE | Discontinued |