WO2003044203A2 - Vecteur de recombinaison homologue, preparations et utilisations - Google Patents

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WO2003044203A2
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Sophie Chappuis-Flament
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Sophie Chappuis-Flament
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    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
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    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Definitions

  • the present invention relates to compositions and methods for modifying genes in cells, and their uses. It relates in particular to vectors, genetic constructs, cells and methods for the selective inactivation of genes by homologous recombination.
  • the vectors according to the invention are preferably characterized by the presence a) of a cassette framed by sequences homologous to a target gene or by cloning sites intended for the insertion of said homologous sequences, said cassette comprising in 5 'a unit bicistronic comprising a positive selection gene and a marker gene functionally linked by an IRES element, said genes being devoid of promoter, downstream of said bicistronic unit, a unit comprising a negative selection gene linked to a promoter and whose transcriptional orientation is identical to or opposite to that of the bicistronic unit, and, site-specific recombination sites flanking the bicistronic unit and the unit comprising the negative selection gene linked to a promoter, and b), of a toxic gene located downstream of said
  • the invention further relates to the use of the vectors defined above for causing mutations and / or invalidating specific genes in cells or in cell lines or populations, in particular human, by homologous recombination in vitro or ex vivo.
  • the invention thus makes it possible to create custom lines or cell populations in which one or more selected genes have been inactivated.
  • the invention also covers a process for the selective inactivation or modification of genes, as well as the cells, lines or cell populations obtained following the implementation of this process and their uses.
  • the invention can be used in the fields of research, screening, for carrying out studies or even in the therapeutic field or vaccine, for the preparation of cells intended for injection.
  • the ability to selectively inactivate or modify a gene in a cell has many applications. Indeed, this makes it possible to study the function of the inactivated gene, for example by studying the phenotype of the modified cells. This makes it possible to search for partners of a gene, to study the expression of a gene, or to reduce, for example, the toxicity or the undesirable properties linked to the expression of one (or more) genes.
  • the therapeutic (or vaccine) field numerous approaches to cell therapy based on the ex vivo preparation of cell populations have been described.
  • the present invention can be used to inactivate or alter one or more specific genes in cells for the purpose of (re) injecting these cells into a patient.
  • An objective of the present invention is to overcome the drawbacks of the techniques of the prior art and to provide methods and tools for the selective and efficient inactivation of genes in situ.
  • a particular objective of the invention is to avoid the formation of non-homologous recombinants by virtue of the combination within the vectors of the invention, of different expression cassettes whose combined action proves to be particularly effective.
  • a first object of the invention resides in a vector comprising: a) a cassette framed by sequences homologous to a target gene or by cloning sites intended for the insertion of said homologous sequences, said cassette comprising: 5 ′, a bicistronic unit comprising a positive selection gene and a marker gene functionally linked by an IRES element, said genes being devoid of promoter, downstream of said bicistronic unit, a unit comprising a negative selection gene linked to a first promoter , whose transcriptional orientation is identical or opposite to that of the bicistronic unit, and - site-specific recombination sites framing the bicistronic unit and the unit comprising the negative selection gene, and b) a toxic gene located downstream of cassette a) and provided with a second promoter.
  • the recombination vector according to the invention advantageously makes it possible to avoid non-homologous recombination events and leads to a genetic enrichment greater than that obtained hitherto by the methods classics.
  • the vector is typically a plasmid, although other embodiments can be envisaged (episome, artificial chromosome, viral vector, etc.).
  • Another object of the invention lies in the use of a vector as defined above for inactivating or altering (eg, causing one or more point mutation (s) and / or chromosomal alteration (s) ( s) specific (s) and / or deletion (s) in vitro or ex vivo, by homologous recombination, one (or more) target gene in a cell, a line or a cell population.
  • a vector as defined above for inactivating or altering eg, causing one or more point mutation (s) and / or chromosomal alteration (s) ( s) specific (s) and / or deletion (s) in vitro or ex vivo, by homologous recombination, one (or more) target gene in a cell, a line or a cell population.
  • Another object of the invention also relates to a method of inactivation or alteration of a target gene in a cell, a line or a cell population, characterized in that it comprises a) introduction into the interior of said cell, line or cell population of a vector as defined above and b) the selection of cells in which the positive selection gene and / or the marker gene are expressed, said cells having said target gene inactivated or altered.
  • aspects of the invention relate to genetically modified cells as obtained by the implementation of the method described above, and their uses, for example in screening, for the study of the function of genes or proteins , or for the preparation of cell therapy drugs.
  • the invention describes new genetic constructions allowing the specific inactivation or alteration of genes in situ.
  • the constructs of the invention are in particular vectors grouping together several functional regions ensuring high efficiency and increased selectivity.
  • the vectors according to the invention thus comprise an expression cassette a), intended to be inserted in whole or in part, at least temporarily, in the genome of the cell host, and an additional expression unit b) of a toxic gene, the description of which is given below:
  • the expression cassette a more particularly comprises the following elements:
  • a bicistronic unit comprising a positive selection gene and a marker gene functionally linked by an IRES element, said genes being devoid of promoter
  • a unit comprising a negative selection gene linked to a first promoter, whose transcriptional orientation is identical or opposite to that of the bicistronic unit, and
  • the term “gene” generally designates any nucleic acid encoding a given polypeptide. It may in particular be a cDNA, a gDNA, a synthetic DNA, an RNA, etc., or a combination of these. Typically, the gene is DNA comprising a sequence encoding the desired expression product. The gene may further comprise one or more termination regions of transcription, typically a polyadenylation signal.
  • the vector thus comprises a positive selection gene and a marker gene, constructed without their own promoter, and linked together in a functional or operational manner by an IRES element. Due to the absence of its own promoter, these genes are not expressed in the vector.
  • an IRES Internai Ribosome Entry Sites
  • the marker gene can be positioned either upstream or downstream of the IRES element and therefore of the positive selection gene.
  • the term "functionally linked” indicates that the genes are fused to the IRES sequence so as to allow synthesis of a bicistronic messenger.
  • the positive selection gene is advantageously chosen from antibiotic resistance genes or from genes inducing auxotrophy.
  • the his gene or the genes for resistance to G418, to hygromycin, to kanamycin, to puromycin or to geneticin are preferably used, in wild or mutated form.
  • the neo-native gene is even more preferably used. It is understood that other resistance genes known to those skilled in the art can be used. The particular choice of such or such gene can be made by a person skilled in the art, depending on the type of cell targeted.
  • the marker gene is preferably chosen from genes whose expression product can be visualized or detected. Particularly preferred are genes whose colored or fluorescent expression product can be visualized directly by observation of the cells, if appropriate after excitation.
  • the EGFP (“Enhanced Green Fluorescent Protein”) gene is thus particularly preferred. It can also be chosen from LacZ, CD9, PAL (alkaline phosphatase), HRP (Horse Radish Peroxidase), RFP (Red Fluorescent Protein), luciferase or EGFP derivatives such as ECFP or EXFP. Thanks to a colorimetric test based on the expression or non-expression of the marker gene, it is thus possible to rapidly detect the clones having integrated the vector cassette into their genome.
  • the IRES sequence can be any functional IRES sequence described in the prior art.
  • IRES elements of the encephalomyocarditis virus (ECMV).
  • ECMV encephalomyocarditis virus
  • Other IRES elements are present in multiple viruses or cellular genes, in particular the MLV, HTLV, HCV viruses, etc., in genes encoding growth factors, such as FGF, IGF, VEGF, or in oncogenes, for example .
  • the cassette also comprises, downstream (i.e., 3 ') from the bicistronic unit, a unit comprising a negative selection gene linked to a first promoter.
  • the negative selection gene has a promoter region and can therefore be expressed independently of any recombination event. This gene is therefore expressed in the vector before the recombination event, and also in the genome of the cell after the recombination event. On the other hand, this gene will not be expressed after excision of the cassette integrated into the genome, and therefore makes it possible to verify the completion of this optional additional step.
  • the negative selection gene can be positioned in an identical or opposite transcriptional orientation to that of the bicistronic unit, preferably in an identical orientation.
  • the negative selection gene is preferably a conditional toxicity gene, that is to say for example a gene whose expression product is not directly toxic in itself, but exerts a toxic effect on the cells. container when in the presence of another substance.
  • a conditional toxicity gene that is to say for example a gene whose expression product is not directly toxic in itself, but exerts a toxic effect on the cells. container when in the presence of another substance.
  • the TK genes coding for a thymidine kinase
  • gpt of E. coli gpt of E. coli, 5-FU, etc.
  • a preferred conditional toxic gene is a TK gene, for example of the herpes simplex virus.
  • the negative selection gene can also be a toxic gene such as dta, in particular placed under the control of a conditional promoter.
  • the negative selection gene can be placed under the control of any promoter appropriate to the cell type chosen. Mention may be made of promoters of viral, cellular, phage or synthetic origin. They can be strong or weak promoters, constitutive or regulated, selective or ubiquitous, etc. Examples that may be mentioned include promoters of viral origin (eg, CMV, LTR (including MMTV), TK, SV40, HSV, RSV), cellular (PGK, Tet-regulated, ⁇ actin), yeast ( Gal1 / Gal10, pADH1, nmtl), prokaryotes (T7, bla, Lac, Tryptophan, etc.).
  • promoters of viral origin eg, CMV, LTR (including MMTV), TK, SV40, HSV, RSV
  • cellular PGK, Tet-regulated, ⁇ actin
  • yeast Gal1 / Gal10, pADH1, nmtl
  • prokaryotes T7, bla, Lac, Tryptophan
  • the elements described above are surrounded in the cassette by site-specific recombination sites.
  • the presence of these sites in fact allows the excision of the cassette (or part thereof) of the genome of the cells under the action of a particular protein (recombinase). It is therefore possible, after homologous recombination and integration of the cassette into the genome, to eliminate all or part of the genome.
  • This has the advantage of making it possible to carry out several cycles of inactivation (or alteration) on the same population of cells with the vector system of the invention, and thus to inactivate (or alter) several genes and / or several alleles of the same gene.
  • Cre-Lox systems Hoess RH, Abremski K.; J. Mol. Biol. 1985, 181 (3), 351-362
  • FLP-FRT Andrew BJ, Proteau GA. , Beatty LG, Sadawski PD; Cell 1985, 40 (4), 796-803
  • R Choen JW, Evans BR, Yang SH, Araki H., Oshima Y., Jayaram M.; Mol. Cell. Biol. 1992 , 12 (9), 3757-3765).
  • LoxP sites are recognized by the action of a recombinase (CRE recombinase), leading to the excision of any sequence arranged between sites of the same orientation by a specific recombination event.
  • the cassette therefore comprises two LoxP sites, in the same orientation, framing the units described above, which under the action of the CRE recombinase eliminate the major part of the cassette integrated into the genome. This elimination can be verified by the loss of expression of the marker gene and of the negative selection gene.
  • LoxP site sequences are provided in nucleotides 708-750 and 6301-6365 of the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the vector according to the invention further comprises two regions of homologies with the target gene (or two (multi) cloning sites allowing the insertion of these regions of homologies ).
  • the cassette is therefore surrounded or flanked by a region of 5 'homology and a region of 3' homology, allowing, by double homologous recombination, the integration of the cassette into the cell genome, replacing a portion of the target gene.
  • Each region of homology typically comprises the sequence of a region of the target gene, for example of a region located in a 5 ′ part and of a region located in a 3 ′ part of the target gene.
  • the region of homology advantageously comprises a sequence perfectly identical to the corresponding region of the target gene. However, it is understood that certain mismatches may be tolerated.
  • Each region of homology preferably has a length sufficient to ensure the specificity of the recombination, preferably a length greater than approximately 100 bp, more preferably greater than approximately 200 bp.
  • the region of homology comprises from 0.2 to 2 kb, for example from 0.5 to 1.5 kb, preferably from 0.6 to 0.8 or from 0.6 to 2 kb.
  • the region of 5 ′ homology is located in the 5 ′ part of the gene. target, typically between the promoter and the start of the coding phase.
  • the 5 ′ homology region corresponds to all or part of the target gene sequence located between the promoter and the ATG initiation codon.
  • the vectors of the invention further include a toxic gene, located downstream (ie, 3 ') from the cassette, under the control of a promoter.
  • a toxic gene located downstream (ie, 3 ') from the cassette, under the control of a promoter.
  • This toxic gene increases the frequency of homologous double recombination and therefore confers on the vector and the methods of the invention a higher efficiency.
  • the expression of this gene being toxic, the selection of cells having carried out homologous recombination in the 3 ′ region of the targeted gene is facilitated, since this recombination leads to the elimination of the toxic gene. As a result, only the cells that have eliminated the toxic gene survive.
  • the toxic gene is a gene whose expression product induces direct or conditional destruction of the cell containing it.
  • the destruction is direct when the expression product exerts a toxic effect by itself, such as for example a toxin (example: genes coding for botulinum toxin or for tetanus toxin), etc.
  • a preferred example of a toxic gene is the dta gene.
  • Conditional toxicity genes which can be used are those described above for the negative selection gene, for example gpt, tk, 5-fu. The toxic gene is however preferably different from the negative selection gene.
  • the toxic gene can be placed under the control of different promoters, strong or weak, regulated or constitutive, selective or ubiquitous, as defined above for the negative selection gene.
  • a toxic gene such as dta, producing direct toxicity
  • the transcriptional orientation of the toxic gene can be identical or opposite to that of the negative selection gene and / or of the bicistronic unit.
  • An object of the present invention therefore relates to a vector comprising a toxic gene different from the negative selection gene, said genes being able to be chosen from gpt, tk or dta, the toxic gene preferably being the dta gene and the negative selection gene being preferably the tk gene.
  • a particular object of the invention resides in a vector, characterized in that it comprises: a) a cassette framed by sequences homologous to a target gene or by cloning sites intended for the insertion of said homologous sequences, said cassette comprising: in 5 ′, a bicistronic unit comprising a gene for resistance to an antibiotic and a marker gene whose expression product can be visualized, said genes being devoid of promoter and functionally linked by an IRES element, downstream of said unit bicistronic and in the same transcriptional orientation, a unit comprising a conditional toxicity gene linked to a first promoter, and LoxP recombination sites flanking the bicistronic unit and the unit comprising the toxicity gene, and b) a gene whose expression product is toxic to the cell containing it, located downstream of cassette a) and provided with a second promoter, said second pro engine being weak.
  • Another particular object of the invention relates to a vector comprising: a) a cassette framed by sequences homologous to a target gene or by cloning sites intended for the insertion of said homologous sequences, said cassette comprising: in 5 ′, a bicistronic unit comprising a Neo gene and an EGFP gene, said genes being devoid of promoter and operably linked by an IRES element, downstream of said bicistronic unit and in the same transcriptional orientation, a unit comprising a TK gene linked to a first promoter, and - LoxP recombination sites framing the bicistronic unit and the unit comprising the toxicity gene, and b) a dta gene, located downstream of the cassette a) under the control of the dta promoter.
  • compositions of the cassette and of the vector according to the invention can be linked to each other directly, or separated by regions of functionally neutral nucleic acids (cloning sites, regions not coding, etc.).
  • the vectors of the invention can be prepared by known techniques of molecular biology, comprising steps of synthesis, cloning, ligation, selection, etc., as illustrated in the examples.
  • the vectors of the invention can be of varied nature and origin, such as for example plasmids, episomes, artificial chromosomes, viral vectors, etc.
  • the vectors of the invention are circular, double-stranded vectors. They are particularly plasmids.
  • the plasmids used for the construction can be of commercial origin, such as in particular the plasmids pUC, pBR, pcDNA, pBluescript, etc. They can be mixed, synthetic, etc. plasmids.
  • the plasmids do not contain, apart from the elements indicated above, other regions homologous to a target gene or other resistance or selection genes.
  • these plasmids are preferably extra-chromosomal, and do not contain an origin of functional replication in the envisaged host cell.
  • the invention also relates to any recombinant nucleic acid comprising a cassette a) as defined above, optionally in combination with an expression unit b) as defined above.
  • the invention also relates to methods and methods for the inactivation or alteration of target genes, using vectors as defined above.
  • a particular object of the invention resides in a method of inactivation or alteration of a target gene in a cell, a line or a cell population, characterized in that it comprises a) the introduction in said cell, line or cell population of a vector as defined above and b) the selection of cells in which the positive selection gene and / or the marker gene are expressed, said cells having said target gene inactivated or altered.
  • Another subject of the invention relates to a method of inactivation or alteration of a target gene in a cell, comprising the selection of two regions of homology of the target gene, a 5 'region and a 3' region; the introduction of nucleic acids comprising the sequence of these regions into a vector as defined above, at the (multi) cloning sites; the introduction of the resulting vector into the genome of a host cell, line or population and the selection of cells, lines or populations in which the target gene is inactivated or altered.
  • the invention can be implemented with different cell types, on primary cultures or established lines, on mixed tissues or cultures, etc.
  • the cells can be eukaryotic, in particular mammalian and more particularly human cells. They can be somatic or embryonic, stem or differentiated. Mention may be made, for example, of fibroblast cells, hepatocytes, muscles (skeletal, cardiac, smooth, blood vessel, etc.), nerves (neuron, glials, astrocytes), epithelial cells, renals, oculars, etc. It can also be yeast, prokaryotic or plant cells.
  • the DT40 line established from a hen lymphoma known to be very recombinogenic. It can also be the lines HCT116, DLD1 (human lines established from cells originating from a colorectal carcinoma), LF1 (fibroblasts of human embryonic lung), LL1 (fibroblasts of human embryonic skin), TK6 (human lymphoblastic line), HaCaT (human keratinocytes), U937 (human monocytes), HCT15, SW480, Colo320, Co115, EB, HbhOO, Rat-1, PC12 (rat photochromocytoma), etc.
  • HCT116 human lines established from cells originating from a colorectal carcinoma
  • LF1 fibroblasts of human embryonic lung
  • LL1 fibroblasts of human embryonic skin
  • TK6 human lymphoblastic line
  • HaCaT human keratinocytes
  • U937 human monocytes
  • the present invention therefore makes it possible not only to invalidate one or more genes but also to cause point mutations, to generate specific chromosomal alterations (by introducing loxP sequences on two different chromosomes), or even large deletions in the genome.
  • the vectors can be introduced (step a)) into the cells by any technique known to a person skilled in the art, adapted to the cell type considered.
  • the cells and the vector are brought into contact in an appropriate device (plate, box, tube, pocket, etc.), for a period of time sufficient to allow the transfer of vector into the cells.
  • the vector is introduced into the cells by electroporation, precipitation with calcium phosphate, or by using one or more transfection-facilitating compounds, such as lipids, polymers, liposomes and peptides, etc.
  • the cells are cultured in any suitable medium, such as RPMI, DMEM, etc.
  • Selection of cells in which the target gene has been inactivated or altered can be made based on the expression of genes included in the bicistronic unit, ie, the positive selection gene and the marker gene.
  • step b) of selection is carried out by visual detection of the expression product of the marker gene. This selection is then confirmed by verification of the expression of the positive selection gene, for example of resistance to a given antibiotic.
  • the cells thus obtained therefore comprise, in their genome, a target gene inactivated or altered, comprising a cassette as defined above in place of part of the gene sequence.
  • a target gene inactivated or altered comprising a cassette as defined above in place of part of the gene sequence.
  • These cells are directly usable for the study of the function of the inactivated or altered gene, or for the selection of compounds modulating the expression of the inactivated or targeted gene, as described in more detail below.
  • the method comprises one or more additional steps aiming at eliminating the integrated cassette (or a part thereof) from the genome, to allow in particular the carrying out of additional cycles (s) of gene inactivation.
  • the elimination or excision of the cassette is carried out using the site-specific recombination system present in the cassette.
  • the method of the invention comprises an additional step c) of bringing the cells into contact with a recombinase specific for the site-specific recombination sites contained in the vector, and of selecting the cells no longer expressing the marker gene and / or the negative selection gene.
  • the recombinase used is the CRE recombinase (eg, when the cassette comprises LoxP sites).
  • the recombinase can be added to the culture medium in the form of protein, or alternatively in the form of a nucleic acid encoding the protein.
  • the nucleic acid can be introduced into the same population of cells, before or after the inactivation step, the expression of the recombinase being induced by activation of a promoter.
  • the nucleic acid encoding the recombinase can also be introduced into another population of cells, the co-culture of the cells leading to bringing the inactivated cells into contact with the enzyme.
  • the nucleic acid encoding the recombinase is introduced into the population of cells after the inactivation step, for example using a vector, typically a viral vector (preferably adenovirus).
  • the cells therefore exhibit an allele of the target gene inactivated or altered, but no longer contain in their genome the entire cassette originating from the vector.
  • these selected cells no longer express the marker gene, the positive selection gene or the negative selection gene.
  • the elimination of the cassette is preferably verified or validated by detection of the absence of expression of the negative selection gene, for example by demonstration of the absence of sensitivity to ganciclovir, when the negative selection gene is a TK gene.
  • These cells can be used to study the function of the inactivated gene. Preferably, they can be used for a new cycle of inactivation or alteration, aiming either to inactivate / alter the second allele of the target gene, or to inactivate / alter another target gene.
  • the method of the invention therefore comprises at least one additional step of introducing a vector as defined above into said cells and of selecting cells expressing the positive selection gene and / or the marker gene, allowing the inactivation of two alleles of the target gene or of one or more alleles of several target genes in a cell, a line or a cell population.
  • Homologous recombination also makes it possible, in certain cases, to determine the function of the isoforms generated by alternative splicing of the transcripts thanks to the invalidation of the exons specific to the mRNA coding for one of the isoforms.
  • a vector according to the invention using the properties of a visualizable marker such as GFP in particular, makes it possible to generate lines in which the marker is expressed under the control of regulatory sequences of the gene of interest. Thanks to these labeled lines, it is possible to study the factors which regulate the expression of the gene under physiological conditions, that is to say without overexpression, after transfection.
  • An object of the invention thus relates to the creation of a hybrid gene comprising the entire sequence of the gene of interest fused to all or part of the GFP sequence so as to express a chimeric protein containing all or part of the GFP in N- or C-terminal position. This fusion does not alter the function of the protein, thus making it possible to study its localization and its intracellular dynamics. without causing the overexpression observed during the implementation of conventional techniques using transfection.
  • the vectors according to the invention can be used to treat primary cell cultures and in particular hematopoietic stem cells intended to be used in the context of graft treatment of neurodegenerative pathologies.
  • Homologous recombination using a vector according to the invention can also be used to repair defective genes in somatic cells, possibly pluripotent, prior to the transplant of these cells.
  • An object of the invention therefore also relates to the cells obtained by the implementation of the method and the use of a cell, line or cell population according to the invention for the preparation of a cell composition intended for the implementation a method of therapeutic, vaccine or surgical treatment in humans or animals.
  • compositions comprising the cells thus modified, in particular pharmaceutical compositions.
  • kits for implementing methods for modifying the genome of cells in vitro or ex vivo comprising a vector as described above.
  • FIG. 1 represents a vector of the invention in which the positions of the different cassettes of the “pBsk + cassettes” construction are indicated.
  • FIG. 2 represents the nucleic sequence of a vector of the invention (SEQ ID NO: 1
  • Bases 3166 to 5870 pGK promoter / TK gene / pGK polyA
  • Bases 5870 to 5940 Lox P
  • Bases 5941 to 6000 MCSB
  • Bases 6001 to 7140 pHSVTK / Gene dta / polyA
  • MCS multiple cloning site
  • the insertion of MCSA is carried out by: - digestion of the plasmid pBluescript SK with the restriction enzymes kpnl and Hindlll (New England Biolabs / Ozyme), construction of MCSA, without stop codon (TGA, TAA, TAG) in its sequence , but with the cleavage sites for the following restriction enzymes: Fsel-Nsil MCSA is obtained after hybridization of two sense and antisense oligonucleotides. It is then cut at the ends by the restriction enzymes kpnl and Hindlll (New England Biolabs / Ozyme). ligation of MCSA with pBluescript SK, - Obtaining of the vector pBluescript SKA.
  • SensMCSA SEQ ID NO: 2
  • AntisensMCSA SEQ ID NO: 3
  • the insertion of MCSB is carried out by: digestion of the plasmid pBluescript SKA with the restriction enzymes EcoRI and NotI (New England Biolabs / Ozyme), construction of the MCSB, possessing the cleavage sites for the restriction enzymes: EcoRI-BstEII -Pstl-BamHI-HpaI-NheI-SwaI-AvrlI-Aflll-
  • MCSB is obtained after hybridization of two sense and antisense oligonucleotides.
  • oligonucleotides necessary for the construction of the MCSB have as sequence:
  • SensMCSB SEQ ID NO: 4
  • AntisensMCSB (SEQ ID NO: 5): 5'- atagt agcgg ccgcc ccctc gagtt aatta actta agcct aggat ttaaa tgcta gcgtt aaccg ggatc ccgtt ctgca ggggt aaccc ggaat tccgg-3 '
  • Construction is carried out according to the following stages.
  • the plasmid pT102 is digested with the following restriction enzymes: * Pstl and BamHI (New England Biolabs / Ozyme): cassette pGKpolyA
  • GenBank accession number in GenBank: AF092543 pGK promoter (bases 3715 to 3207 in complementary reverse) and L19900 TK gene (bases 741 to 2571).
  • the plasmid pBluescript SKAB is digested with the restriction enzymes Pstl and BamHI (New England Biolabs / Ozyme),
  • Neo gene without promoter
  • the plasmid is constructed according to the following protocol.
  • the oligonucleotides used for faithful amplification with the Pfu turbo have the sequence: Hin3Neo (SEQ ID NO: 6)
  • Kpnl-Bbs / -Sa // - Fse / - ⁇ / s // - Pt77 // - Sap / - ⁇ / de / -Hindlll-EcorV ⁇ gene Neo / pGKpolyA
  • LoxP is obtained after hybridization of two sense and antisense oligonucleotides.
  • the loxP sequence contains the cleavage sites for restriction enzymes: BamHI-Ndel - LoxP Hindlll-Hpal
  • the oligonucleotides necessary for the construction of LoxP sites have the following sequence:
  • SensBNLoxpHH (SEQ ID NO: 8):
  • AntisensBNLoxpHH (SEQ ID NO: 9): 5'- gggtt aaccc caagc ttggg atata acttc gtata gcata catta tacga agtta tcata tgcgg gatcc cg-3 '
  • the ⁇ GFP can be used for the vector p ⁇ GTD but not for the vector p ⁇ TD, the construction of which continues in paragraph VII.
  • the adapter is obtained after hybridization of two sense and antisense oligucleotides.
  • the adapter sequence contains the EcoRI restriction site and the cohesive end of the AfIII restriction site. After ligation of this adapter the AfIII site will no longer be functional, due to the introduction of a mutation.
  • oligonucleotides necessary for the construction of the adapter have the following sequence:
  • SENSADAPTECO SEQ ID NO: 10.
  • the plasmid is constructed according to the following protocol:
  • IRES-EGFP cassette Digestion of the plasmid plRES2-EGFP (Clontech) with the restriction enzymes EcoRI and AfIII (New England Biolabs / Ozyme): IRES-EGFP cassette. - ligation of the adapter at the 3 'end of the IRES-EGFP poly A cassette,
  • pBluescript SKAIoxNeo ⁇ GFPTKIoxBdta The vector is constructed according to the following protocol: a. Digestion of the plasmid pdta with the restriction enzymes Xhol and NotI (New England Biolabs / Ozyme): cassette pMcidta.
  • the 5 ′ and 3 ′ region of the targeted gene is chosen by determining the complete sequence of the region of the gene to be invalidated and identifying its exon / intron structure and its precise restriction map.
  • the cleavage sites for the restriction enzymes which can be used to insert the different genomic regions can be chosen:
  • the usable sites are:
  • the usable sites are:
  • the 3 ′ genomic fragment can be envisaged depending on the restriction sites present in this 3 ′ region of the gene to be invalidated.
  • the fragment is obtained either by faithful amplification, or by enzymatic digestion.
  • amplification is better suited since the sequence of the product of the targeted gene must advantageously be in phase with the reading frame of the positive selection gene (Neo). It is understood that the region of homology can also be synthesized artificially.
  • the 5 'flanking region has an average size of 800 to 2000 base pairs while the size of the flanking 3' region consists, approximately, of 2000 to 5000 base pairs.
  • the oligonucleotides necessary for amplification are synthesized artificially.
  • SR restriction site
  • Oligo sens SR specific gene sequence targeted
  • Oligo antisense Specific sequence of the targeted SR gene
  • the antisense oligonucleotide is located so as to create a fusion protein between the product of the targeted gene and the “neomycin phopotransferase”.
  • the fragment obtained by amplification is digested with suitable restriction enzymes and is then purified on a gel.
  • the digestion is carried out with the restriction enzymes of the genomic DNA according to the restriction sites available in the MCS B of the homologous recombination vector.
  • the different digested DNA fragments are then purified on a gel.
  • Digestion of the pBluescript SKAIoxNeoTKIoxBdta vector is carried out with restriction enzymes identical to those which are chosen to digest the ends of the DNA fragments corresponding to the 5 'and 3' flanking regions of the targeted gene. Ligation of the 5 'and 3' regions of the targeted gene is carried out in the cloning sites respectively upstream and downstream of the positive and negative selection cassettes (Neo and TK) of the homologous recombination vector.
  • the selection of the clones obtained having integrated the vector can be carried out according to the following protocol:
  • Elimination of the selection cassette This step is advantageously carried out as follows: - Amplification of the heterozygous clone in the selection medium in a T25 culture vessel, infection with an adenovirus-Cre (recombinant adenovirus defective for replication, including the genome recombinant comprises a region encoding recombinase CRE) overnight, or transfection with the expression vector of Cre transfer in a 96-well plate in the absence of selection and in the presence of gancyclovir (the growth of the cells shows the simultaneous elimination Neo and Thymidine Kinase genes), culture for two weeks in order to eliminate the presence of the cre cre recombinase protein, verification of the elimination of the cassettes by PCR amplification after having chosen specific oligonucleotides of the targeted gene framing the cassettes of selection (These oligonucleotides give an amplification of different size depending on the elimination or not of the Neo and TK cassettes), freezing of the heterozygous clones
  • homozygous clones The preparation of the homozygous clones is obtained by a new transfection (by electroporation) of the heterozygous clones, according to the protocol described above, then transfer to a dozen T75 culture vessels. Homozygous clones are selected as follows:
  • the clones are pushed at low density in a 96-well plate in the presence of selection, - selection of EGFP clones + selection for 14 to 21 days using G418, transfer of the isolated clones to a new well of a 96-well plate, 2-day selection, amplification of the clones and preparation of genomic DNA for each clone, isolation of the positive clones by PCR amplification,

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Abstract

La présente invention concerne des compositions et méthodes pour la modification de gènes dans des cellules, et leurs utilisations. Elle concerne notamment des vecteurs comprenant a) une cassette encadrée par des séquences homologues à un gène cible ou par des sites de clonage destinés à l'insertion desdites séquences homologues, ladite cassette comprenant en 5' une unité bicistronique comprenant un gène de sélection positive et un gène marqueur liés fonctionnellement par un élément IRES, lesdits gènes étant dépourvus de promoteur, en aval de ladite unité bicistronique, une unité comprenant un gène de sélection négative lié à un promoteur et dont l'orientation transcriptionnelle est identique ou opposée à celle de l'unité bicistronique, et, des sites de recombinaison site-spécifique encadrant l'unité bicistronique et l'unité comprenant le gène de sélection négative lié à un promoteur, et b), un gène toxique situé en aval de ladite cassette et pourvu d'un promoteur.

Description

VECTEUR DE RECOMBINAISON HOMOLOGUE, PREPARATIONS ET
UTILISATIONS.
La présente invention concerne des compositions et méthodes pour la modification de gènes dans des cellules, et leurs utilisations. Elle concerne notamment des vecteurs, constructions génétiques, cellules et méthodes pour l'inactivation sélective de gènes par recombinaison homologue. Les vecteurs selon l'invention sont préférentiellement caractérisés par la présence a) d'une cassette encadrée par des séquences homologues à un gène cible ou par des sites de clonage destinés à l'insertion desdites séquences homologues, ladite cassette comprenant en 5' une unité bicistronique comprenant un gène de sélection positive et un gène marqueur liés fonctionnellement par un élément IRES lesdits gènes étant dépourvus de promoteur, en aval de ladite unité bicistronique, une unité comprenant un gène de sélection négative lié à un promoteur et dont l'orientation transcriptionnelle est identique ou opposée à celle de l'unité bicistronique, et, des sites de recombinaison site-spécifique encadrant l'unité bicistronique et l'unité comprenant le gène de sélection négative lié à un promoteur, et b), d'un gène toxique situé en aval de ladite cassette et de la séquence homologue 3' (ou du site de clonage correspondant), et pourvu d'un promoteur.
L'invention concerne par ailleurs l'utilisation des vecteurs définis ci-dessus pour provoquer des mutations et/ou invalider des gènes spécifiques dans des cellules ou dans des lignées ou populations cellulaires, notamment humaines, par recombinaison homologue in vitro ou ex vivo. L'invention permet ainsi de créer, à façon, des lignées ou populations cellulaires dans lesquelles un ou plusieurs gènes choisis ont été inactivés. L'invention couvre également un procédé d'inactivation ou de modification sélective de gènes, ainsi que les cellules, lignées ou populations cellulaires obtenues suite à la mise en œuvre de ce procédé et leurs utilisations. L'invention peut être utilisée dans les domaines de la recherche, du criblage, pour la réalisation d'études ou encore dans le domaine thérapeutique ou vaccinal, pour la préparation de cellules destinées à être injectées.
La possibilité d'inactiver ou de modifier sélectivement un gène dans une cellule offre de nombreuses applications. En effet, cela permet d'étudier la fonction du gène inactivé, par exemple en étudiant le phénotype des cellules modifiées. Cela permet de rechercher des partenaires d'un gène, d'étudier l'expression d'un gène, ou de réduire par exemple la toxicité ou les propriétés indésirables liées à l'expression d'un (ou plusieurs) gènes. Dans le domaine thérapeutique (ou vaccinal), de nombreuses approches de thérapie cellulaire basées sur la préparation ex vivo de populations cellulaires ont été décrites. La présente invention peut être utilisée pour inactiver ou altérer un ou plusieurs gènes déterminés dans des cellules, dans le but de (ré)injecter ces cellules à un patient.
La mise à disposition de méthodologies et d'outils efficaces pour l'inactivation ou la modification sélective de gènes dans des cellules pourrait donc permettre de développer ces approches.
A cet égard, des méthodes d'enrichissement génétique basées sur la recombinaison homologue ont récemment été mises au point. Ces méthodes reposent sur l'utilisation de régions homologues à un gène cible, pour permettre son inactivation sélective in situ par double recombinaison homologue. Certaines de ces méthodes permettent de réduire le nombre de recombinaisons qui pourraient survenir au niveau de loci incorrects (non homologues) grâce à l'utilisation d'un gène de sélection négative situé au niveau des parties flanquantes du vecteur de ciblage. Les parties flanquantes sont les régions qui présentent une homologie avec la cible chromosomique et permettent ainsi la recombinaison homologue. Dans un tel vecteur les régions flanquantes 5' et 3' encadrent une région centrale au niveau de laquelle se situe le gène de sélection positive. Les gènes de sélection sont des unités d'expression indépendantes qui possèdent leurs propres promoteurs et leurs propres sites de polyadénylation.
D'autres méthodes permettent d'identifier les recombinaisons survenues au niveau du locus homologue au moyen de vecteurs dont le gène de sélection positif ne possède pas son propre promoteur et ne s'exprime, après la recombinaison homologue, que grâce au promoteur du gène cible. Dans une telle méthode des événements de recombinaison non homologues peuvent néanmoins se produire lorsque le vecteur s'intègre près d'un promoteur chromosomique qui permet une expression suffisamment forte pour générer un clone drogue résistant.
Un objectif de la présente invention est de pallier aux inconvénients des techniques de l'art antérieur et de fournir des méthodes et outils pour l'inactivation sélective et efficace de gènes in situ. Un objectif particulier de l'invention est d'éviter la formation de recombinants non homologues grâce à la combinaison au sein des vecteurs de l'invention, de différentes cassettes d'expression dont l'action combinée s'avère particulièrement efficace.
A cet égard, un premier objet de l'invention réside dans un vecteur comprenant : a) une cassette encadrée par des séquences homologues à un gène cible ou par des sites de clonage destinés à l'insertion desdites séquences homologues, ladite cassette comprenant : en 5', une unité bicistronique comprenant un gène de sélection positive et un gène marqueur liés fonctionnellement par un élément IRES, lesdits gènes étant dépourvus de promoteur, en aval de ladite unité bicistronique, une unité comprenant un gène de sélection négative lié à un premier promoteur, dont l'orientation transcriptionnelle est identique ou opposée à celle de l'unité bicistronique, et - des sites de recombinaison site-spécifique encadrant l'unité bicistronique et l'unité comprenant le gène de sélection négative, et b) un gène toxique situé en aval de la cassette a) et pourvu d'un second promoteur.
Le vecteur de recombinaison selon l'invention permet avantageusement d'éviter les événements de recombinaison non homologues et conduit à un enrichissement génétique supérieur à celui obtenu jusqu'ici par les méthodes classiques. Le vecteur est typiquement un plasmide, même si d'autres formes de réalisation peuvent être envisagées (épisome, chromosome artificiel, vecteur viral, etc.).
Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un vecteur tel que défini ci- avant pour inactiver ou altérer (e.g., provoquer une ou plusieurs mutation(s) ponctuelle(s) et/ou altération(s) chromosomique(s) spécifique(s) et/ou délétion(s)) in vitro ou ex vivo, par recombinaison homologue, un (ou plusieurs) gène cible dans une cellule, une lignée ou une population cellulaire.
Un autre objet de l'invention concerne également un procédé d'inactivation ou d'altération d'un gène cible dans une cellule, une lignée ou une population cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend a) l'introduction à l'intérieur de ladite cellule, lignée ou population cellulaire d'un vecteur tel que défini ci-avant et b) la sélection des cellules dans lesquelles le gène de sélection positive et/ou le gène marqueur s'expriment, lesdites cellules présentant ledit gène cible inactivé ou altéré.
D'autres aspects de l'invention concernent les cellules génétiquement modifiées telles qu'obtenues par la mise en œuvre du procédé décrit ci-dessus, et leurs utilisations, par exemple en criblage, pour l'étude de la fonction de gènes ou de protéines, ou pour la préparation de médicaments de thérapie cellulaire.
Description du vecteur
Comme indiqué, l'invention décrit de nouvelles constructions génétiques permettant l'inactivation ou l'altération spécifique de gènes in situ. Les constructions de l'invention sont notamment des vecteurs regroupant plusieurs régions fonctionnelles assurant une grande efficacité et une sélectivité accrue.
Les vecteurs selon l'invention comprennent ainsi une cassette d'expression a), destinée à s'insérer en tout ou partie, au moins temporairement, dans le génome de l'hôte cellulaire, et une unité supplémentaire d'expression b) d'un gène toxique, dont la description est réalisée ci-dessous :
La cassette d'expression a) comprend plus particulièrement les éléments suivants :
- en 5', une unité bicistronique comprenant un gène de sélection positive et un gène marqueur liés fonctionnellement par un élément IRES, lesdits gènes étant dépourvus de promoteur,
- en aval de ladite unité bicistronique, une unité comprenant un gène de sélection négative lié à un premier promoteur, dont l'orientation transcriptionnelle est identique ou opposée à celle de l'unité bicistronique, et
- des sites de recombinaison site-spécifique encadrant l'unité bicistronique et l'unité comprenant le gène de sélection négative.
Par ailleurs, l'ensemble des éléments ci-dessus est encadré par des séquences homologues à un gène cible d'intérêt, ou par des sites de clonage destinés à l'insertion de telles séquences homologues.
Au sens de l'invention, le terme « gène » désigne, de manière générale, tout acide nucléique codant un polypeptide donné. Il peut s'agir notamment d'un ADNc, d'un ADNg, d'un ADN synthétique, d'un ARN, etc., ou d'une combinaison de ceux-ci. Typiquement, le gène est un ADN comprenant une séquence codant le produit d'expression désiré. Le gène peut comporter en outre une ou des régions de terminaison de la transcription, typiquement un signal de polyadénylation. Le vecteur comprend ainsi un gène de sélection positive et un gène marqueur, construits sans promoteur propre, et liés entre-eux de manière fonctionnelle ou opérationnelle par un élément IRES. En raison de l'absence de promoteur propre, ces gènes ne sont pas exprimés dans le vecteur. Leur expression ne peut donc avoir lieu qu'après un événement de recombinaison homologue dans la région 5' flanquante de la cassette (ou du vecteur), conduisant à placer le gène de sélection positive et le gène marqueur sous la dépendance du promoteur du gène cible dans le génome de la cellule. Dans ces conditions, les fonctions codées par le gène de sélection positive et le gène marqueur ne s'expriment que si un événement de recombinaison s'est produit entre la séquence homologue 5' placée dans le vecteur et la partie correspondante du gène cible. Ainsi, la sélection de clones dans lesquels la recombinaison s'est produite peut être faite simplement par détection du produit d'expression du gène marqueur et/ou du gène de sélection positive.
Comme indiqué, une séquence IRES (« Internai Ribosome Entry Sites »), située entre le gène de sélection positive et le gène marqueur, crée un messager bicistronique présentant deux phases ouvertes de lecture (gène cible/gène de sélection positive et gène marqueur). Le gène marqueur peut être indifféremment positionné en amont ou en aval de l'élément IRES et donc du gène de sélection positive. Le terme « lié de manière fonctionnelle » indique que les gènes sont fusionnés à la séquence IRES de manière à permettre la synthèse d'un messager bicistronique.
Le gène de sélection positive est choisi avantageusement parmi les gènes de résistance aux antibiotiques ou parmi les gènes induisant une auxotrophie. A cet égard on peut citer à titre d'exemple le gène his ou les gènes de résistance au G418, à l'hygromycine, à la kanamycine, à la puromycine ou à la généticine. Le gène his ou le gène néo sont préférentiellement utilisés, sous forme sauvage ou mutée. Le gène néo natif est encore plus préférentiellement utilisé. Il est entendu que d'autres gènes de résistance connus de l'homme du métier peuvent être utilisés. Le choix particulier de tel ou tel gène peut être effectué par l'homme du métier, en fonction du type cellulaire visé.
Le gène marqueur est choisi de préférence parmi les gènes dont le produit d'expression peut être visualisé ou détecté. On préfère tout particulièrement les gènes dont le produit d'expression coloré ou fluorescent, peut être visualisé directement par observation des cellules, le cas échéant après excitation. Le gène EGFP (« Enhanced Green Fluorescent Protein ») est ainsi particulièrement préféré. Il peut encore être choisi parmi LacZ, CD9, PAL (alkaline phosphatase), HRP (Horse Radish Peroxidase), RFP (Red Fluorescent Protein), la luciférase ou des dérivés de l'EGFP tels que l'ECFP ou l'EXFP. Grâce à un test colorimétrique basé sur l'expression ou la non expression du gène marqueur, il est ainsi possible de détecter rapidement les clones ayant intégré dans leur génome la cassette du vecteur.
La séquence IRES peut être toute séquence IRES fonctionnelle décrite dans l'art antérieur. On peut citer à titre d'exemple les éléments IRES du virus encéphalomyocarditis (ECMV). D'autres éléments IRES sont présents dans de multiples virus ou gènes cellulaires, notamment les virus MLV, HTLV, HCV, etc., dans des gènes codant des facteurs de croissance, tels FGF, IGF, VEGF, ou dans des oncogènes, par exemple.
La cassette comporte en outre, en aval (i.e., 3') de l'unité bicistronique, une unité comprenant un gène de sélection négative lié à un premier promoteur. Contrairement à l'unité bicistronique, le gène de sélection négative comporte une région promotrice et peut donc s'exprimer indépendamment de tout événement de recombinaison. Ce gène s'exprime donc dans le vecteur avant l'événement de recombinaison, et également dans le génome de la cellule après l'événement de recombinaison. En revanche, ce gène ne sera pas exprimé après excision de la cassette intégrée au génome, et permet donc de vérifier la réalisation de cette étape supplémentaire facultative. Comme indiqué, le gène de sélection négative peut être positionné dans une orientation transcriptionnelle identique ou opposée à celle de l'unité bicistronique, de préférence dans une orientation identique.
Le gène de sélection négative est préférentiellement un gène de toxicité conditionnelle, c'est-à-dire par exemple un gène dont le produit d'expression n'est pas directement toxique en lui-même, mais exerce un effet toxique sur les cellules le contenant lorsqu'il est en présence d'une autre substance. A titre d'exemples particuliers, on peut citer notamment les gènes TK (codant une thymidine kinase), gpt d'E. coli, 5-FU, etc. Un gène toxique conditionnel préféré est un gène TK, par exemple du virus de l'herpès simplex. Le gène de sélection négative peut également être un gène toxique tel que dta, notamment placé sous contrôle d'un promoteur conditionnel.
Le gène de sélection négative peut être placé sous le contrôle de tout promoteur approprié au type cellulaire choisi. On peut citer des promoteurs d'origine virale, cellulaire, de phages, ou synthétique. Il peut s'agir de promoteurs forts ou faibles, constitutifs ou régulés, sélectifs ou ubiquitaires, etc. A titre d'exemples on peut citer notamment des promoteurs d'origine virale (e.g., CMV, LTR (dont MMTV), TK, SV40, HSV, RSV), cellulaire (PGK, Tet-regulated, β actine), de levure (Gal1/Gal10, pADH1 , nmtl ), de procaryotes (T7, bla, Lac, Tryptophane, etc.).
Comme indiqué, les éléments décrits ci-dessus sont encadrés dans la cassette par des sites de recombinaison site-spécifique. La présence de ces sites permet en effet l'excision de la cassette (ou d'une partie de celle-ci) du génome des cellules sous l'action d'une protéine particulière (recombinase). Il est donc possible, après recombinaison homologue et intégration de la cassette dans le génome, d'en éliminer tout ou partie du génome. Ceci présente l'avantage de permettre d'effectuer plusieurs cycles d'inactivation (ou d'altération) sur une même population de cellules avec le système vecteur de l'invention, et ainsi d'inactiver (ou d'altérer) plusieurs gènes et/ou plusieurs allèles d'un même gène.
Différents systèmes de recombinaison site-spécifiques ont été rapportés dans l'art antérieur et peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention. On peut citer à titres d'exemples particuliers les systèmes Cre-Lox (Hoess R.H., Abremski K. ; J. Mol. Biol. 1985, 181(3), 351-362), FLP-FRT (Andrew B.J., Proteau GA., Beatty L.G., Sadawski P.D. ; Cell 1985, 40(4), 796-803) ou R (Chen J.W., Evans B.R., Yang S. H., Araki H., Oshima Y., Jayaram M. ; Mol. Cell. Biol. 1992, 12(9), 3757-3765). Dans le système Cre-Lox, des sites LoxP sont reconnus par l'action d'une recombinase (la recombinase CRE), conduisant à l'excision de toute séquence disposée entre les sites de même orientation par un événement de recombinaison spécifique. Dans un mode de réalisation préféré, la cassette comprend donc deux sites LoxP, dans la même orientation, encadrant les unités décrites ci-dessus, qui permettent sous l'action de la recombinase CRE d'éliminer la majeure partie de cassette intégrée au génome. Cette élimination peut se vérifier par la perte de l'expression du gène marqueur et du gène de sélection négative. Des exemples spécifiques de séquence de sites LoxP sont fournis dans les nucléotides 708-750 et 6301-6365 de la séquence SEQ ID NO :1.
Pour permettre la recombinaison homologue spécifique d'un gène cible désiré, le vecteur selon l'invention comprend en outre deux régions d'homologies avec le gène cible (ou deux (multi)sites de clonage permettant l'insertion de ces régions d'homologies). La cassette est donc encadrée ou flanquée d'une région d'homologie 5' et d'une région d'homologie 3', permettant, par double recombinaison homologue, l'intégration de la cassette dans le génome cellulaire, en remplacement d'une portion du gène cible. Chaque région d'homologie comporte typiquement la séquence d'une région du gène cible, par exemple d'une région située dans une partie 5' et d'une région située dans une partie 3' du gène cible. Pour assurer une plus grande sélectivité, la région d'homologie comporte avantageusement une séquence parfaitement identique à la région correspondante du gène cible. Toutefois, il est entendu que certains mésappariements peuvent être tolérés. Chaque région d'homologie comporte préférentiellement une longueur suffisante pour assurer la spécificité de la recombinaison, de préférence une longueur supérieure à environ 100 pb, plus préférentiellement supérieure à environ 200 pb. De manière particulièrement préférée, la région d'homologie comprend de 0,2 à 2 kb, par exemple de 0,5 à 1 ,5 kb, de préférence de 0,6 à 0,8 ou de 0,6 à 2 kb. D'autre part, pour permettre ou faciliter l'expression de l'unité bicistronique par le promoteur du gène cible après l'étape de recombinaison, il est préférable que la région d'homologie 5' soit localisée dans la partie 5' du gène cible, typiquement entre le promoteur et le début de la phase codante. De manière particulièrement préférée, la région d'homologie 5' correspond à tout ou partie de la séquence du gène cible située entre le promoteur et le codon d'initiation ATG.
En plus de la cassette d'intégration décrite ci-dessus, les vecteurs de l'invention comprennent en outre un gène toxique, situé en aval (i.e., en 3') de la cassette, sous contrôle d'un promoteur. La présence de ce gène toxique augmente la fréquence de double recombinaison homologue et confère donc au vecteur et aux méthodes de l'invention une efficacité supérieure. En effet, l'expression de ce gène étant toxique, la sélection des cellules ayant effectué une recombinaison homologue dans la région 3' du gène ciblé est facilitée, car cette recombinaison conduit à l'élimination du gène toxique. De ce fait, seules les cellules ayant éliminé le gène toxique survivent.
Typiquement, le gène toxique est un gène dont le produit d'expression induit la destruction directe ou conditionnelle de la cellule le contenant. La destruction est directe lorsque le produit d'expression exerce un effet toxique par lui-même, comme par exemple une toxine (exemple : gènes codant pour la toxine botulique ou pour la toxine tétanique), etc. Un exemple préféré de gène toxique est le gène dta. Des gènes de toxicité conditionnelle utilisables sont ceux décrits plus avant pour le gène de sélection négative, par exemple gpt, tk, 5-fu. Le gène toxique est toutefois préférentiellement différent du gène de sélection négative.
Le gène toxique peut être placé sous le contrôle de différents promoteurs, forts ou faibles, régulés ou constitutifs, sélectifs ou ubiquitaires, tels que définis ci-avant pour le gène de sélection négative. Toutefois, dans le cas d'un gène toxique tel que dta, produisant une toxicité directe, on préfère utiliser un promoteur faible, modéré ou régulé, de sorte que la toxicité ne conduise pas à la destruction de l'ensemble des cellules avant la recombinaison.
L'orientation transcriptionnelle du gène toxique peut être identique ou opposée à celle du gène de sélection négative et/ou de l'unité bicistronique.
Un objet de la présente invention concerne donc un vecteur comprenant un gène toxique différent du gène de sélection négative, lesdits gènes pouvant être choisis parmi gpt, tk ou dta, le gène toxique étant de préférence le gène dta et le gène de sélection négative étant de préférence le gène tk. Un objet particulier de l'invention réside dans un vecteur, caractérisé en ce qu'il comprend : a) une cassette encadrée par des séquences homologues à un gène cible ou par des sites de clonage destinés à l'insertion desdites séquences homologues, ladite cassette comprenant : en 5', une unité bicistronique comprenant un gène de résistance à un antibiotique et un gène marqueur dont le produit d'expression peut être visualisé, lesdits gènes étant dépourvus de promoteur et liés fonctionnellement par un élément IRES, en aval de ladite unité bicistronique et dans la même orientation transcriptionnelle, une unité comprenant un gène de toxicité conditionnelle lié à un premier promoteur, et des sites de recombinaison LoxP encadrant l'unité bicistronique et l'unité comprenant le gène de toxicité, et b) un gène dont le produit d'expression est toxique pour la cellule le contenant, situé en aval de la cassette a) et pourvu d'un second promoteur, ledit second promoteur étant faible.
Un autre objet particulier de l'invention concerne un vecteur comprenant : a) une cassette encadrée par des séquences homologues à un gène cible ou par des sites de clonage destinés à l'insertion desdites séquences homologues, ladite cassette comprenant : en 5', une unité bicistronique comprenant un gène Néo et un gène EGFP, lesdits gènes étant dépourvus de promoteur et liés fonctionnellement par un élément 1RES, en aval de ladite unité bicistronique et dans la même orientation transcriptionnelle, une unité comprenant un gène TK lié à un premier promoteur, et - des sites de recombinaison LoxP encadrant l'unité bicistronique et l'unité comprenant le gène de toxicité, et b) un gène dta, situé en aval de la cassette a) sous contrôle du promoteur dta. Les différents éléments entrant dans la composition de la cassette et du vecteur selon l'invention peuvent être liés les uns aux autres de manière directe, ou séparés par des régions d'acides nucléiques neutres sur le plan fonctionnel (sites de clonage, régions non-codantes, etc.). Les vecteurs de l'invention peuvent être préparés par des techniques connues de biologie moléculaire, comprenant des étapes de synthèse, clonage, ligation, sélection, etc., comme illustré dans les exemples.
Les vecteurs de l'invention peuvent être de nature et d'origine variées, comme par exemple des plasmides, épisomes, chromosomes artificiels, vecteurs viraux, etc. Préférentiellement, les vecteurs de l'invention sont des vecteurs circulaires, double brin. Il s'agit tout particulièrement de plasmides. Les plasmides utilisés pour la construction peuvent être d'origine commerciale, comme notamment les plasmides pUC, pBR, pcDNA, pBluescript, etc. Il peut s'agir de plasmides mixtes, de synthèse, etc. Typiquement, les plasmides ne comportent pas, en dehors des éléments indiqués ci-dessus, d'autres régions homologues à un gène cible ou d'autres gènes de résistance ou de sélection. En outre, ces plasmides sont préférentiellement extra-chromosomiques, et ne comportent pas d'origine de réplication fonctionnelle dans la cellule hôte envisagée.
L'invention concerne également tout acide nucléique recombinant comprenant une cassette a) telle que définie ci-avant, éventuellement en combinaison avec une unité d'expression b) telle que définie ci-avant.
Procédé d'inactivation ou d'altération de gènes cibles
Comme indiqué, l'invention est également relative à des procédés et méthodes pour l'inactivation ou l'altération de gènes cibles, utilisant des vecteurs tels que définis ci-avant. A cet égard, un objet particulier de l'invention réside dans un procédé d'inactivation ou d'altération d'un gène cible dans une cellule, une lignée ou une population cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend a) l'introduction dans ladite cellule, lignée ou population cellulaire d'un vecteur tel que défini ci-avant et b) la sélection des cellules dans lesquelles le gène de sélection positive et/ou le gène marqueur s'expriment, lesdites cellules présentant ledit gène cible inactivé ou altéré.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé d'inactivation ou d'altération d'un gène cible dans une cellule, comprenant la sélection de deux régions d'homologies du gène cible, une région 5' et une région 3' ; l'introduction d'acides nucléiques comprenant la séquence de ces régions dans un vecteur tel que défini ci-avant, au niveau des (multi)sites de clonage ; l'introduction du vecteur résultant dans le génome d'une cellule, lignée ou population hôte et la sélection des cellules, lignées ou populations dans lesquelles le gène cible est inactivé ou altéré.
L'invention peut être mise en œuvre avec différents types cellulaires, sur des cultures primaires ou des lignées établies, sur des tissus ou cultures mixtes, etc.
Les cellules peuvent être des cellules eucaryotes, notamment de mammifère et plus particulièrement humaines. Elles peuvent être somatiques ou embryonnaires, souches ou différenciées. On peut citer par exemple des cellules de fibroblastes, hépatocytes, musculaires (squelettique, cardiaque, lisse, vaisseau sanguin, etc), nerveuses (neurone, gliales, astrocytes), cellule épithéliales, rénales, oculaires, etc. Il peut également s'agir de levures, cellules procaryotes ou végétales.
Parmi les lignées cellulaires on distingue notamment la lignée DT40 établie à partir d'un lymphome de poule connu pour être très recombinogène. Il peut également s'agir des lignées HCT116, DLD1 (lignées humaine établies à partir de cellules issues d'un carcinome colorectal), LF1 (fibroblastes de poumon embryonnaire humain), LL1 (fibroblastes de peau embryonnaire humaine), TK6 (lignée lymphoblastique humaine), HaCaT (kératinocytes humains), U937 (monocytes humains), HCT15, SW480, Colo320, Co115, EB, HbhOO, Rat-1 , PC12 (photochromocytome de rat), etc. Cette liste non exhaustive est donnée à titre d'exemple. D'autres lignées connues de l'homme du métier peuvent être choisies et utilisées dans le cadre de l'invention sans effort particulier de sa part.
L'un des grands intérêts de la recombinaison homologue qui la distingue des autres approches utilisant par exemple les iARN ou les oligonucléotides anti-sens, tient dans la capacité de cette technique à provoquer des mutations déterminées en un site spécifique du gène (knock-in versus knock-out). La présente invention permet donc non seulement d'invalider un ou plusieurs gènes mais également de provoquer des mutations ponctuelles, de générer des altérations chromosomiques spécifiques (en introduisant des séquences loxP sur deux chromosomes différents), ou encore de grandes délétions dans le génome.
La combinaison d'éléments génétiques appropriés dans un seul vecteur de recombinaison homologue permet ainsi d'améliorer, de façon particulièrement avantageuse, les fréquences d'invalidation d'un gène cible notamment et en particulier dans les cellules somatiques humaines.
Pour la mise en œuvre des procédés de l'invention, les vecteurs peuvent être introduits (étape a)) dans les cellules par toute technique connue de l'homme du métier, adaptée au type cellulaire considéré. Généralement, les cellules et le vecteur sont mis en contact dans un dispositif approprié (plaque, boite, tube, poche, etc.), pendant une période de temps suffisante pour permettre le transfert de vecteur dans les cellules. Typiquement, le vecteur est introduit dans les cellules par électroporation, précipitation au phosphate de calcium, ou en utilisant un ou des composés facilitant la transfection, tels que des lipides, polymères, liposomes et peptides, etc. Les cellules sont cultivées dans tout milieu adapté, tel que RPMI, DMEM, etc. La sélection des cellules dans lesquelles le gène cible a été inactivé ou altéré peut être effectuée sur la base de l'expression des gènes compris dans l'unité bicistronique, i.e., le gène de sélection positive et le gène marqueur. Typiquement, l'étape b) de sélection est réalisée grâce à la détection visuelle du produit d'expression du gène marqueur. Cette sélection est ensuite confirmée par vérification de l'expression du gène de sélection positive, par exemple de la résistance à un antibiotique donné.
Les cellules ainsi obtenues comprennent donc, dans leur génome, un gène cible inactivé ou altéré, comprenant une cassette telle que définie ci-avant en lieu et place d'une partie de la séquence du gène. Ces cellules sont directement utilisables pour l'étude de la fonction du gène inactivé ou altéré, ou pour la sélection de composés modulant l'expression du gène inactivé ou ciblé, comme décrit plus en détails dans la suite du texte.
Dans une variante avantageuse, le procédé comprend une ou des étapes supplémentaires visant à éliminer la cassette intégrée (ou une partie de celle-ci) du génome, pour permettre notamment la réalisation de cycles supplémentaire(s) d'inactivation de gènes. De manière avantageuse, l'élimination ou l'excision de la cassette est réalisée en utilisant le système de recombinaison site-spécifique présent dans la cassette.
A cet égard, dans un mode de réalisation particulier, le procédé de l'invention comprend une étape c) supplémentaire de mise en contact des cellules avec une recombinase spécifique des sites de recombinaison site-spécifique contenus dans le vecteur, et de sélection des cellules n'exprimant plus le gène marqueur et/ou le gène de sélection négative. Dans un mode de réalisation spécifique, la recombinase utilisée est la recombinase CRE (e.g., quand la cassette comprend des sites LoxP). La recombinase peut être ajoutée au milieu de culture sous forme de protéine, ou bien sous forme d'un acide nucléique codant la protéine. Dans ce cas, l'acide nucléique peut être introduit dans la même population de cellules, préalablement ou postérieurement à l'étape d'inactivation, l'expression de la recombinase étant induite par activation d'un promoteur. L'acide nucléique codant la recombinase peut également être introduit dans une autre population de cellules, la co-culture des cellules conduisant à mettre en contact les cellules inactivée avec l'enzyme. Préférentiellement, l'acide nucléique codant la recombinase est introduit dans la population de cellules après l'étape d'inactivation, par exemple au moyen d'un vecteur, typiquement d'un vecteur viral (adénovirus de préférence).
A l'issue de cette étape, les cellules présentent donc un allèle du gène cible inactivé ou altéré, mais ne contiennent plus dans leur génome la cassette entière provenant du vecteur. En particulier, ces cellules sélectionnées n'expriment plus le gène marqueur, ni le gène de sélection positive, ni le gène de sélection négative. L'élimination de la cassette est préférentiellement vérifiée ou validée par détection de l'absence d'expression du gène de sélection négative, par exemple par démonstration de l'absence de sensibilité au ganciclovir, lorsque le gène de sélection négative est un gène TK.
Ces cellules peuvent être utilisées pour étudier la fonction du gène inactivé. Préférentiellement, elles sont utilisables pour un nouveau cycle d'inactivation ou d'altération, visant soit à inactiver/altérer le second allèle du gène cible, soit à inactiver/altérer un autre gène cible.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de l'invention comprend donc au moins une étape supplémentaire d'introduction d'un vecteur tel que défini ci- avant dans lesdites cellules et de sélection des cellules exprimant le gène de sélection positive et/ou le gène marqueur, permettant l'inactivation des deux allèles du gène cible ou d'un ou plusieurs allèles de plusieurs gènes cibles dans une cellule, une lignée ou une population cellulaire.
Ce cycle peut bien entendu être répété plusieurs fois pour inactiver/altérer d'autres gènes éventuels. Utilisations
La technique de recombinaison homologue proposée par la présente invention et mettant en œuvre un vecteur selon l'invention permet d'envisager plusieurs types d'applications :
Il est par exemple possible d'invalider un ou plusieurs gènes d'intérêt médicaux dans différents types de lignées cellulaires qui seront ensuite utilisées dans le cadre du criblage d'agents pharmacologiques.
Grâce aux vecteurs et méthodologies décrits dans la présente demande, il est également possible de muter plusieurs gènes successivement dans la même lignée cellulaire. Cette approche permet ainsi d'inactiver les gènes codant pour les protéines d'un même complexe, d'une même voie biochimique ou de voies différentes.
La recombinaison homologue permet, par ailleurs, dans certain cas, de déterminer la fonction des isoformes générées par épissage alternatif des transcrits grâce à l'invalidation des exons spécifiques à l'ARNm codant pour l'une des isoformes.
L'utilisation d'un vecteur selon l'invention utilisant les propriétés d'un marqueur visualisable tel que la GFP notamment, permet de générer des lignées dans lesquelles le marqueur s'exprime sous le contrôle de séquences régulatrices du gène d'intérêt. Grâce à ces lignées marquées, il est possible d'étudier les facteurs qui régulent l'expression du gène dans des conditions physiologiques, c'est-à-dire sans surexpression, après transfection.
Un objet de l'invention concerne ainsi la création d'un gène hybride comprenant la totalité de la séquence du gène d'intérêt fusionnée à tout ou partie de la séquence de la GFP de manière à exprimer une protéine chimérique contenant tout ou partie de la GFP en position N- ou C-terminale. Cette fusion n'altère pas la fonction de la protéine permettant ainsi d'étudier sa localisation et sa dynamique intracellulaire sans provoquer la surexpression observée lors de la mise en œuvre des techniques classiques utilisant la transfection.
Ce marqueur permet donc, dans le cadre de greffe de cellules chez l'animal et en particulier chez l'homme, de suivre le devenir du greffon. En effet, les vecteurs selon l'invention peuvent être utilisés pour traiter des cultures primaires de cellules et en particulier des cellules souches hématopoïëtiques destinées à être utilisées dans le cadre d'un traitement par greffe de pathologies neuro-dégénératives.
La recombinaison homologue utilisant un vecteur selon l'invention peut également être utilisée pour réparer des gènes défectueux dans des cellules somatiques, éventuellement pluripotentes, préalablement à la greffe de ces cellules.
Un objet de l'invention concerne donc également les cellules obtenues par la mise en œuvre du procédé et l'utilisation d'une cellule, lignée ou population cellulaire selon l'invention pour la préparation d'une composition cellulaire destinée à la mise en œuvre d'une méthode de traitement thérapeutique, vaccinale ou chirurgicale chez l'homme ou l'animal.
Elle concerne également des compositions comprenant les cellules ainsi modifiées, notamment des compositions pharmaceutiques.
Elle concerne également des kits pour la mise en œuvre de procédés de modification du génome de cellules in vitro ou ex vivo, comprenant un vecteur tel que décrit ci-avant.
D'autres aspects et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs, ainsi que des dessins sur lesquels :
La figure 1 représente un vecteur de l'invention dans lequel les positions des différentes cassettes de la construction « pBsk+cassettes » sont indiquées. La figure 2 représente la séquence nucléique d'un vecteur de l'invention (SEQ ID
NO :1 ). Les positions des éléments sont indiquées :
Bases 1 à 652 : pBluescript SK
Bases 653 à 710 : MCSA Bases 710 à 753 : Lox P
Bases 754 à 1560 : Gène Néo
Bases 1561 à 3165 : IRES/Gène EGFP/polyA
Bases 3166 à 5870 : pGK promoteur/Gène TK/pGK polyA
Bases 5870 à 5940 : Lox P Bases 5941 à 6000 : MCSB
Bases 6001 à 7140 : pHSVTK/ Gène dta/polyA
Bases 7141 à 9363 : pBluescript SK
EXEMPLE 1 : Construction du vecteur de recombinaison homologue
I. Vecteur initial
Utilisation du vecteur pBluescript SK dont le numéro d'accession dans GenBank est X52325 (Stratagene).
II. Modification du site de clonage multiple (MCS ou « polylinker ») :
1. L'insertion du MCSA est réalisée par : - digestion du plasmide pBluescript SK avec les enzymes de restriction kpnl et Hindlll (New England Biolabs/Ozyme), construction du MCSA, sans codon stop (TGA, TAA, TAG) dans sa séquence, mais avec les sites de coupure pour les enzymes de restriction suivants : Fsel-Nsil Le MCSA est obtenu après l'hybridation de deux oligonucléotides sens et antisens. Il est ensuite coupé aux extrémités par les enzymes de restriction kpnl et Hindlll (New England Biolabs/Ozyme). ligation du MCSA avec le pBluescript SK, - Obtention du vecteur pBluescript SKA.
Les oligonucléotides nécessaires à la construction du MCSA ont pour séquence : SensMCSA (SEQ ID NO : 2) :
5'- ggggt acccc gaaga cgtcg acggc cggcc tgcat gcatg cacac gtggc ttctt ccata tgccc aagct tggg-3'
AntisensMCSA (SEQ ID NO : 3) :
5'- cccaa gcttg ggcat atgga agaag ccacg tgtgc atgca tgcag gccgg ccgtc gacgt cttcg gggta cccc-5'
2. L'insertion du MCSB est réalisée par : digestion du plasmide pBluescript SKA avec les enzymes de restriction EcoRI et Notl (New England Biolabs/Ozyme), construction du MCSB, possédant les sites de coupure pour les enzymes de restriction : EcoRI-BstEII-Pstl-BamHI-Hpal-Nhel-Swal-AvrlI-Aflll-
Pacl-Xho-Notl
Le MCSB est obtenu après hybridation de deux oligonucléotides sens et antisens.
Il est ensuite coupé aux extrémités par les enzymes de restriction EcoRI et Notl
(New England Biolabs/Ozyme), - ligation du MCSB avec le pBluescript SKA, obtention du vecteur pBluescript SKAB
Les oligonucléotides nécessaires à la construction du MCSB ont pour séquence :
SensMCSB (SEQ ID NO : 4) :
5'- ccgga attcc gggtt acccc tgcag aacgg gatcc cggtt aacgc tagca tttaa atcct aggct taagt taatt aactc gaggg ggcgg ccgct actat-3'
AntisensMCSB (SEQ ID NO : 5) : 5'- atagt agcgg ccgcc ccctc gagtt aatta actta agcct aggat ttaaa tgcta gcgtt aaccg ggatc ccgtt ctgca ggggt aaccc ggaat tccgg-3'
3. Visualisation du nouveau site de clonage multiple : Sites de clonage multiple initial du pBluescript SK :
Kpnl-Apal-Eco109-Xhol-Sall-Clal-Hindlll-EcoRV-EcoRI-Pstl-Smal-BamHI-Spel- Xbal-Notl
Sites de clonage multiple insérés dans pBluescript SKAB : Kpnl-Bbs/-Sa//-Fse/-Λ/s/7-Pm//-(SaiP/)-Λ/ e/-Hindlll-EcoRV-EcoRI-BsfE//-Psf/- BamHI-Hpal-Nhel-Swal-Avrll-Aflll-Pacl-Xho-Not\
III. Insertion du gène de sélection négative Thymidine Kinase TK pour la sélection des clones ayant éliminé le gène de résistance Néomvcine
1. Construction du pBluescript SKABTK :
La construction est réalisée selon les étapes suivantes.
Le plasmide pT102 est digéré avec les enzymes de restriction suivantes: * Pstl et BamHI (New England Biolabs/Ozyme) : cassette pGKpolyA
Numéro d'accession dans GenBank : X76683 (des bases 7894 et 8347)
* EcoRI et Bstell (New England Biolabs/Ozyme) : cassette pGKpromoteur/gène
TK.
Numéro d'accession dans GenBank : AF092543 promoteur pGK (des bases 3715 à 3207 en reverse complémentaire) et L19900 gène TK (des bases 741 à 2571 ).
- Le plasmide pBluescript SKAB est digéré avec les enzymes de restriction Pstl et BamHI (New England Biolabs/Ozyme),
- ligation de la cassette pGKpolyA,
- obtention du plasmide pBluescript SKABpolyA, - digestion du plasmide pBluescript SKABpolyA avec les enzymes de restriction EcoRI et Bstell (New England Biolabs/Ozyme),
- ligation de la cassette pGKpromoteur/gène TK, - obtention du plasmide pBluescriptSKABTK.
2. Visualisation de la construction SKABTK obtenue KDn\-Bbsl-Sall-Fsel-Nsil-Pmll-(Sapl)-Ndel-H\nd 111-EcoRV-EcoRI- pGKpromoteur/gène TK|-esfE//-Psf/-| pGKpolyA|-8at77ry/-Hpa/-Λ/ ?e/-Snta/-/A\ r//-
Figure imgf000023_0001
IV. Insertion du gène de sélection positive de résistance à la néomycine, gène Neo, sans promoteur
1. Construction du pBuescript SKABNeoTK :
Le plasmide est construit selon le protocole suivant.
- Amplification PCR du plasmide pT102 avec l'oligonucléotide Hin3Neo à cheval sur le codon ATG d'initiation du gène Neo et l'oligonucléotide pASTOPSEl hybridant à l'extrémité 3' du polyA du gène Neo,
- obtention d'un fragment d'ADN contenant la séquence du gène « Néomycine phosphotransférase » avec une séquence de polyadénylation mais sans promoteur
Numéro d'accession dans GenBank : AF113968 Gène « Neomycin phosphotransférase » (des bases 2727 à 3430).
Les oligonucléotides utilisés pour l'amplification fidèle avec la Pfu turbo (stratagene) ont pour séquence : Hin3Neo (SEQ ID NO : 6)
5'cccaa gcttg gg|atg| ggatc ggcca ttgaa caaga tgga-3' pASTOPSE1(SEQ ID NO : 7)
5'cggaa ttctc agtca gtcat gctga tctcg caggc tatg-3'
- ligation du fragment PCR dans le vecteur pGEMT (Promega)
- séquençage du plasmide pGEMTNeo (Génome express, Grenoble).
- digestion du plasmide pGEMTNeo avec les enzymes de restriction Hindlll et EcoRI (New England Biolabs/Ozyme)
- digestion du plasmide pBluescript SKABTK avec les enzymes de restriction Hindlll et EcoRI (New England Biolabs/Ozyme). - ligation de la cassette Neo dans le plasmide pBluescript SKABTK.
- obtention du plasmide pBluescript SKABNeoTK
2. Visualisation de la construction pBluescript SKABNeoTK obtenue :
Kpnl-Bbs/-Sa//-Fse/-Λ/s//-Pt77//- Sap/ -Λ/de/-Hindlll-EcorV^ gèneNeo/pGKpolyA|
EcorHpGKpromoteur/gèneTK|-gsfE//-Psf/ HpGKpoiyA|-5atτ7H/-Hpa/-Λ//7e/-SMta/ w/7-Λ/7/7-Pac/-X/7θ-Notl
V. Insertion de deux séquences loxP reconnues spécifiquement par la recombinase CRE :
1. Construction du loxP :
Le loxP est obtenu après l'hybridation de deux oligonucléotides sens et antisens. La séquence loxP contient les sites de coupure pour les enzymes de restriction : BamHI-Ndel — LoxP Hindlll-Hpal
Les oligonucléotides nécessaires à la construction des sites LoxP ont pour séquence :
SensBNLoxpHH (SEQ ID NO : 8) :
5'- cggga tcccg catat gataa cttcg tataa tgtat gctat acgaa gttat atccc aagct tgggg ttaac cc-3'
AntisensBNLoxpHH (SEQ ID NO : 9) : 5'- gggtt aaccc caagc ttggg atata acttc gtata gcata catta tacga agtta tcata tgcgg gatcc cg-3'
2. Insertion du premier site LoxP :
- Digestion du plasmide pBluescript SKABNeoTK avec les enzymes de restriction Ndel et Hindlll (New England Biolabs/Ozyme), - digestion du plasmide LoxP avec les enzymes de restriction Ndel et Hindlll (New England Biolabs/Ozyme),
- ligation du LoxP avec le pBluescript SKABNeoTK,
- obtention du vecteur pBluescript SKAIoxBNeoTK
3. Insertion du deuxième site LoxP :
- Digestion du plasmide pBluescript SKAIoxBNeoTK avec les enzymes de restriction BamHI et Hpal (New England Biolabs/Ozyme), - digestion des extrémités du LoxP avec les enzymes de restriction BamHI et Hpal (New England Biolabs/Ozyme),
- ligation du LoxP avec le pBluescript SKABIoxNeoTK,
- obtention du vecteur pBluescript SKAIoxNeoTKIoxB.
4. Visualisation de la construction pBluescript SKAIoxNeoTKIoxB obtenue :
Kvïa-BbsI-SalI-FseI-NsiI-PmlI-(SapI)-NdeI^oxΕ -Hmdm-Ecoτ\A QèneNeolr}GKiiolyM
ΕcorI-^pGKpromoteur/gèneTM-^tEH-E t^pGKpolyA^-EαfflH^LoχR-Hpα/-Nbe/-Swα/-
AvrII-AflII-PacI-Xho-Noû
Plusieurs vecteurs sont réalisables à ce stade. L'ΕGFP est utilisable pour le vecteur pΝGTD mais pas pour le vecteur pΝTD dont la construction se poursuit au paragraphe VII.
VI. Insertion du gène codant pour la protéine verte fluorescente ΕGFP pour optimiser la sélection des clones recombinants pour le vecteur pΝGTD.
1. Construction d'un adaptateur ΕcoRI :
L'adaptateur est obtenu après hybridation de deux oligucleotides sens et antisens. La séquence de l'adaptateur contient le site de restriction EcoRI et l'extrémité cohésive du site de restrictin AfIII. Après ligation de cet adaptateur le site AfIII ne sera plus fonctionnel, dû à l'introduction d'une mutation.
Extrémité 3'EGFP AfIII Aflll*EcoRI Adaptateur
C (ttaag) C 11 a a T ggaattcgg
GAATT (c) GAATT a ccttaagcc
Les oligonucléotides nécessaires à la construction de l'adaptateur ont pour séquence :
SENSADAPTECO (SEQ ID NO : 10)
5'- ttaat ggaat tcgg-3'
ANTISADAPTECO (SEQ ID NO : 11)
5'- ccgaa ttcca-3'
2. Construction de pBluescript SKAIoxNeoEGFPTKIoxB :
Le plasmide est construit selon le protocole suivant :
- Digestion du plasmide plRES2-EGFP (Clontech) avec les enzymes de restriction EcoRI et AfIII (New England Biolabs/Ozyme) : cassette IRES-EGFP. - ligation de l'adaptateur à l'extrémité 3' de la cassette IRES-EGFP poly A,
- digestion de la cassette IRES-EGFP avec l'enzyme de restriction EcoRI (New England Biolabs/Ozyme),
- digestion du plasmide pBluescript SKAIoxNeoTKIoxB avec l'enzyme de restriction EcoRI (New England Biolabs/Ozyme), - ligation de la cassette IRES-EGFP avec le plasmide pBluescript SKAIoxNeoTKIoxB.
- obtention du vecteur pBluescript SKAIoxNeoEGFPTKIoxB. 3. Visualisation de la construction pBluescript SKAIoxNeoEGFPKIoxB obtenue :
KpnI-Efa/-Sα//-E e/-N //-Em//-(S^/ Mfe^LoxI^-HindIII-EcorN-^ gèneNeo/pGKpolyAj. Εcorl-ttRΕS-ΕGFPpoIy A^-ΕcorI GKpromoteur/gèneTK|-^tEH-E t/-jpGKpolyAj
BamHI Loxt-HpaI-NheI-SwaI-AvrII-AβII-PacI-Xho-^oÛ
4. Elimination de la séquence poly A du gène Néo pour pNGTD :
La séquence est éliminée comme suit :
- Digestion partielle avec l'enzyme de restriction Pstl (New England Biolabs/Ozyme)
- Ligation du plasmide sans la séquence de polyadénylation du gène Néo.
5. Visualisation de la construction obtenue :
KpnI-Eb /-Sα//-E e/-N^//-Em//- Sa^/ N^LoxP-HindIH-EcorV^gèneNéo|^IRE!^
|ΕGF polyA-ΕcoRI-]pGKpromoteur/gèneTK|-^tEH-E t^pGKpolyAj-^/nH/-]LoxP|-
HpaI-NheI-SwaI-AvrII-AflII-PacI-Xho-Notl
VII. Insertion du gène de sélection négative codant pour la toxine diphtérique A dta pour favoriser la recombinaison homologue.
1. Construction de pBluescript SKAIoxNeoΕGFPTKIoxBdta : Le vecteur est construit selon le protocole suivant : a. Digestion du plasmide pdta avec les enzymes de restriction Xhol et Notl (New England Biolabs/Ozyme) : cassette pMcidta.
Numéro d'accession dans GenBank: E00489 gène dta (des bases 376-954). b. digestion du plasmide pBluescript SKAIoxNeoEGFPTKIoxB avec les enzymesde restriction Notl (digestion partielle) et Xhol (New England
Biolabs/Ozyme), c. ligation de la cassette dta avec le plasmide pBluescript SKAIoxNeoEGFPTKIoxB, d. obtention du vecteur pBluescript SKAIoxNeoEGFPTKIoxBdta. e. digestion du plasmide pBluescript SKAIoxNeoTKIoxB avec les enzymesde restriction Notl (digestion partielle) et Xhol (New England Biolabs/Ozyme), f. ligation de la cassette dta avec le plasmide pBluescript SKAIoxNeoTKIoxB, g. obtention du vecteur pBluescript SKAIoxNeoTKIoxBdta.
2. Visualisation des constructions pBluescript SKAIoxNeoEGFPTKIoxBdta et pBluescript SKAIoxNeoTKIoxBdta obtenues :
pNGTD
Kpn\-Bbsl-Sall-Fsel-Nsil-Pmll-(Sapl)-Ndel- LoxP -Hindlll-EcorV- gèneNeoj -Ecorl-
IRES-EGFP|polyA-EcorHpGKpromoteur/gèneTr^-βsfE//-Psf/-|pGKpolyA|-βa/77H/- \LoxP\-Hpal-Nhel-Swal-Avrll-A I-Pacl-Xh romote rdtei-N t\
PNTD
Kpnl-B ?s/-Sa//-Fse/-/Vs/7-Pm//- Sap/)-Λ/ /e/- ^xFj-Hindlll-EcorV gèneNeo/pGKpolyA|-EcorHpGKpromoteur/gèneTK|-βsfE//-Psf GKpolyA! BamHI LoxP\-Hpal-Nhel-Swal-Avrll-Aflll-Pacl-Xho^pro ote rdt^- ot\
EXEMPLE 2 : Insertion des séquences génomiques 5' et 3' flanquantes du gène à invalider
I. Choix des régions 5' et 3' flanquantes du gène ciblé
Avantageusement, la région 5' et 3' du gène ciblé est choisie par détermination de la séquence complète de la région du gène à invalider et identification de sa structure exon/intron et de sa carte de restriction précise. Sur la base de ces éléments, les sites de coupure pour les enzymes de restriction utilisables pour insérer les différentes régions génomiques peuvent être choisis: Pour la région genomique 5' flanquante du gène ciblé, les sites utilisables sont : Pour pNGTP : Fsel-Nsil
Pour la région genomique 3' flanquante du gène ciblé, les sites utilisables sont :
Nhel-Swal-Aflll-Pacl-Xho
La digestion par l'enzyme Swal (New England Biolabs/Ozyme) créé des extrémités franches, permettant l'insertion de tout fragment d'ADN genomique dont les extrémités sont également franches.
II. Obtention des régions 5' et 3' flanquantes du gène ciblé
Plusieurs possibilités d'obtention du fragment genomique 3' sont envisageables en fonction des sites de restriction présents dans cette région 3' du gène à invalider. Ainsi le fragment est obtenu soit par amplification fidèle, soit par digestion enzymatique. Pour la région 5' flanquante, une amplification est mieux adaptée puisque la séquence du produit du gène ciblé doit être avantageusement en phase avec le cadre de lecture du gène de sélection positive (Néo). Il est entendu que la région d'homologie peut également être synthétisée artificiellement. La région 5' flanquante a une taille de 800 à 2000 paires de bases en moyenne alors que la taille de la région 3' flanquante est constituée, approximativement, de 2000 à 5000 paires de bases.
1. Amplification fidèle avec la Pfu turbo (Stratagene) ou le Highexpand High Fidelity (Roche) des régions choisies :
Les oligonucléotides nécessaires à l'amplification sont synthétisés artificiellement.
Ils présentent à une extrémité le site de restriction (SR) compatible pour son insertion dans le vecteur de recombinaison homologue.
Oligo sens : SR séquence spécifique du gène ciblé
Oligo antisens : Séquence spécifique du gène ciblé SR
Dans le cas de la région 5' flanquante, l'oligonucléotide antisens est situé de manière à créer une protéine de fusion entre le produit du gène ciblé et la « neomycin phopotransferase ».
Le fragment obtenu par amplification est digéré par les enzymes de restriction adaptées et est ensuite purifié sur gel.
2. Digestion enzymatique de la région 3' choisie :
La digestion est réalisée avec les enzymes de restriction de l'ADN genomique selon les sites de restriction disponibles dans le MCS B du vecteur de recombinaison homologue. Les différents fragments d'ADN digérés sont ensuite purifiés sur gel.
III. Insertion des régions 5' et 3' flanquantes du gène ciblé dans le vecteur de recombinaison homologue
La digestion du vecteur pBluescript SKAIoxNeoTKIoxBdta est réalisée avec les enzymes de restriction identiques à celles qui sont choisies pour digérer les extrémités des fragments d'ADN correspondant aux régions 5' et 3' flanquantes du gène ciblé. La ligation des régions 5' et 3' du gène ciblé est effectuée dans les sites de clonage respectivement en amont et en aval des cassettes de sélection positive et négative (Néo et TK) du vecteur de recombinaison homologue.
IV. Préparation du vecteur de recombinaison homologue pour la transfection et transfection
Pour introduire le vecteur dans une population cellulaire, différentes stratégies sont utilisables. Parmi celles-ci, il est possible de linéariser le plasmide, puis de l'introduire par électroproration, selon le schéma général suivant :
Ouverture du vecteur avec Fsel en amont des cassettes de sélection, purification du vecteur « linéarisé », transfection par électroporation de cellules somatiques humaines choisies, - transfert dans une dizaine de récipients de culture T75 : culture une nuit,
V. Sélection des clones exprimant le marqueur EGFP et stabilisation par résistance au G418
La sélection des clones obtenus ayant intégré le vecteur peut être réalisée selon le protocole suivant :
Sélection des clones EGFP+,
Culture des clones à faible densité dans une plaque à 96 puits (à raison de 8 plaques de 96 puits par récipient de culture T75), - sélection 14 à 21 jours en présence de G418 dans le milieu, transfert par trypsination des clones isolés dans un nouveau puits d'une plaque de 96 puits, sélection pendant 2 jours.
VI. Isolement des clones invalidés pour le gène ciblé L'isolement et la vérification des clones dans lesquels le gène cible a été invalidé peuvent être réalisées selon le protocole suivant :
Amplification des clones et préparation de l'ADN genomique de chaque clone, isolement rapide des clones positifs par amplification PCR grâces aux oligonucléotides spécifiques du gène ciblé (ces oligonucléotides donnent après amplification un fragment d'ADN de taille différente pour le gène sauvage ou invalidé), - congélation des clones positifs hétérozygotes.
VII. Obtention de clones homozygotes pour le gène ciblé
Pour la réalisation de clones homozygotes, il est possible grâce à l'invention de réaliser un second cycle d'inactivation, portant sur le second allèle. Préalablement, la cassette intégrée au niveau du premier allèle est éliminée, au moins en partie.
1. Elimination de la cassette de sélection : Cette étape est avantageusement réalisée comme suit : - Amplification du clone hétérozygote en milieu de sélection dans un récipient de culture T25, infection avec un adénovirus-Cre (adénovirus recombinant défectif pour la réplication, dont le génome recombinant comporte une région codant la recombinase CRE) pendant une nuit, ou transfection par le vecteur d'expression de la Cre transfert dans une plaque à 96 puits en absence de sélection et en présence de gancyclovir (la croissance des cellules montre l'élimination simultanée des gènes Néo et Thymidine Kinase), culture pendant deux semaines afin d'éliminer la présence de la protéine cre recombinase, vérification de l'élimination des cassettes par amplification PCR après avoir choisi des oligonucléotides spécifiques du gène ciblé encadrant les cassettes de sélection (Ces oligonucléotides donnent une amplification de taille différente selon l'élimination ou non des cassettes Néo et TK), congélation des clones hétérozygotes sans cassette de sélection, amplification du clone hétérozygote sans sélection dans un récipient de culture T75.
2. Sélection des clones homozygotes :
La préparation des clones homozygotes est obtenue par une nouvelle transfection (par électroporation) des clones hétérozygotes, selon le protocole décrit précédemment, puis transfert dans une dizaine de récipients de culture T75. Les clones homozygotes sont sélectionnés comme suit :
une nuit après la transfection, les clones sont mis à pousser à faible densité dans une plaque à 96 puits en présence de sélection, - sélection des clones EGFP+ sélection pendant 14 à 21 jours à l'aide de G418, transfert des clones isolés dans un nouveau puits d'une plaque de 96 puits, sélection 2 jours, amplification des clones et préparation de l'ADN genomique pour chaque clone, isolement des clones positifs par amplification PCR,
Congélation des clones positifs homozygotes.
Bien entendu, il est possible d'invalider un second gène en utilisant le même vecteur de recombinaison homologue après élimination de la cassette Néo (voir VII.1 ).

Claims

REVENDICATIONS
1. Vecteur caractérisé en ce qu'il comprend : a) une cassette encadrée par des séquences homologues à un gène cible ou par des sites de clonage destinés à l'insertion desdites séquences homologues, ladite cassette comprenant : en 5', une unité bicistronique comprenant un gène de sélection positive et un gène marqueur liés fonctionnellement par un élément IRES, lesdits gènes étant dépourvus de promoteur, en aval de ladite unité bicistronique, une unité comprenant un gène de sélection négative lié à un premier promoteur, dont l'orientation transcriptionnelle est identique ou opposée à celle de l'unité bicistronique, et des sites de recombinaison site-spécifique encadrant l'unité bicistronique et l'unité comprenant le gène de sélection négative, et b) un gène toxique situé en aval de la cassette a) et pourvu d'un second promoteur.
2. Vecteur selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le gène de sélection positive est un gène de résistance à un antibiotique ou un gène induisant une auxotrophie, par exemple le gène his ou les gènes de résistance à la Néomycine, à l'hygromycine, à la kanamycine, à la puromycine ou à la généticine.
3. Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le gène marqueur est un gène dont le produit d'expression peut être visualisé, de préférence le gène EGFP.
4. Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le gène de sélection négative est un gène de toxicité conditionnelle, de préférence choisi parmi gpt et tk, plus préférentiellement le gène tk.
5. Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le gène toxique est un gène dont le produit d'expression induit la destruction directe ou conditionnelle de la cellule le contenant, de préférence choisi parmi gpt, tk et dta, plus préférentiellement le gène dta.
6. Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le gène de sélection négative et le gène toxique sont différents.
7. Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'élément IRES provient du virus encephalomyocarditis (ECMV).
8. Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le premier promoteur est un promoteur viral, par exemple le promoteur du gène CMV, TK, LTR.
9. Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le second promoteur est un promoteur faible, modéré ou régulé, par exemple le promoteur du gène dta.
10. Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les sites de recombinaison site-spécifique sont des sites LoxP.
11. Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que chaque séquence homologue comprend au moins 0,2 kb de la séquence du gène cible, préférentiellement de 0,6 à 2 kb.
12Necteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide.
13. Vecteur, caractérisé en ce qu'il comprend : a) une cassette encadrée par des séquences homologues à un gène cible ou par des sites de clonage destinés à l'insertion desdites séquences homologues, ladite cassette comprenant : en 5', une unité bicistronique comprenant un gène de résistance à un antibiotique et un gène marqueur dont le produit d'expression peut être visualisé, lesdits gènes étant dépourvus de promoteur et liés fonctionnellement par un élément IRES, en aval de ladite unité bicistronique et dans la même orientation transcriptionnelle, une unité comprenant un gène de toxicité conditionnelle lié à un premier promoteur, et des sites de recombinaison LoxP encadrant l'unité bicistronique et l'unité comprenant le gène de toxicité, et b) un gène dont le produit d'expression est toxique pour la cellule le contenant, situé en aval de la cassette a) et pourvu d'un second promoteur, ledit second promoteur étant faible.
14. Utilisation d'un vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes pour inactiver in vitro ou ex vivo, par recombinaison homologue, un gène cible dans une cellule, une lignée ou une population cellulaire.
15. Utilisation d'un vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 pour provoquer, in vitro ou ex vivo, une ou plusieurs mutations ponctuelles et/ou altérations chromosomiques spécifiques et/ou délétions au sein d'un gène cible dans une cellule, une lignée ou une population cellulaire.
16. Utilisation d'un vecteur selon l'une des revendications 1 à 13 pour la préparation in situ d'un gène hybride contenant tout ou partie de la séquence d'un gène cible en fusion avec la séquence codant un marqueur, notamment EGFP, ledit gène hybride exprimant dans ladite cellule une protéine chimérique contenant tout ou partie du produit d'expression du gène cible fusionné à la séquence en acide aminés de la protéine marqueur, ladite protéine chimérique pouvant être détectée ou visualisée dans les cellules.
17.Procédé d'inactivation ou d'altération d'un gène cible dans une cellule, une lignée ou une population cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend a) l'introduction à l'intérieur de ladite cellule, lignée ou population cellulaire d'un vecteur selon l'une des revendications 1 à 13 et b) la sélection des cellules dans lesquelles le gène de sélection positive et/ou le gène marqueur s'expriment, lesdites cellules présentant ledit gène cible inactivé ou altéré.
18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'étape b) est réalisée grâce à la détection visuelle du produit d'expression du gène marqueur.
19. Procédé selon l'une des revendications 17 ou 18, caractérisé en ce qu'il comprend une étape c) supplémentaire de mise en contact des cellules avec une recombinase spécifique des sites de recombinaison site-spécifique contenus dans le vecteur, et de sélection des cellules n'exprimant plus le gène marqueur et/ou le gène de sélection négative.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape supplémentaire d'introduction d'un vecteur selon l'une des revendications 1 à 13 dans lesdites cellules et de sélection des cellules exprimant le gène de sélection positive et/ou le gène marqueur, permettant l'inactivation des deux allèles du gène cible ou d'un ou plusieurs allèles de plusieurs gènes cibles dans une cellule, une lignée ou une population cellulaire.
21. Procédé selon l'une des revendications 17 à 20, caractérisé en ce que le vecteur est introduit dans les cellules par électroporation, précipitation au phosphate de calcium, ou en utilisant un ou des composés facilitant la transfection, tels que des lipides, polymères, liposomes et peptides.
22. Procédé selon l'une des revendications 17 à 21 , caractérisé en ce que les cellules sont des cellules de mammifère.
23. Cellule, lignée ou population cellulaire, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un gène inactivé ou altéré grâce au procédé selon l'une des revendication 17 à 22.
24. Cellule selon la revendication 23, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule eucaryote, notamment de mammifère et plus particulièrement humaine.
25. Cellule selon l'une des revendications 23 ou 24, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule somatique ou embryonnaire, souche ou différenciée.
26. Cellule selon la revendication 23, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure, d'une cellule procaryote ou végétale.
27. Utilisation d'une cellule, lignée ou population cellulaire selon l'une des revendications 23 à 26, pour le criblage de molécules capables de moduler l'expression du ou des gènes inactivés.
28. Utilisation d'une cellule, lignée ou population cellulaire selon l'une des revendications 23 à 26 pour la préparation d'une composition cellulaire destinée à la mise en œuvre d'une méthode de traitement thérapeutique, vaccinale ou chirurgicale chez l'homme ou l'animal.
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