JP2022553573A - Ｘ連鎖性若年網膜分離療法のためのｃｒｉｓｐｒおよびａａｖ戦略 - Google Patents

Ｘ連鎖性若年網膜分離療法のためのｃｒｉｓｐｒおよびａａｖ戦略 Download PDF

Info

Publication number
JP2022553573A
JP2022553573A JP2022524995A JP2022524995A JP2022553573A JP 2022553573 A JP2022553573 A JP 2022553573A JP 2022524995 A JP2022524995 A JP 2022524995A JP 2022524995 A JP2022524995 A JP 2022524995A JP 2022553573 A JP2022553573 A JP 2022553573A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
acid construct
protein
cell
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022524995A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2021092513A5 (ja
Inventor
チャーリーン ハント，
ヤン リウ，
グオチュン ゴン，
カーメロ ロマーノ，
ブライアン ザンブロウィッツ，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharmaceuticals Inc filed Critical Regeneron Pharmaceuticals Inc
Publication of JP2022553573A publication Critical patent/JP2022553573A/ja
Publication of JPWO2021092513A5 publication Critical patent/JPWO2021092513A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Humanized animals, e.g. knockin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/7056—Lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)

Abstract

レチノスキシンコード配列の挿入および／または発現を可能にする核酸構築物および組成物が提供される。ＲＳ１遺伝子座を標的とするヌクレアーゼ剤が提供される。標的ゲノム遺伝子座への組み込みおよび／または細胞における発現のためにそのような構築物を使用する組成物および方法も提供される。核酸構築物および組成物を使用して、Ｘ連鎖性若年網膜分離症を治療する方法も提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月８日に出願された米国出願第６２／９３２，６０８号の利益を主張し、これはすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＥＦＳ ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表への参照
ファイル６９４２３２ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに記述された配列表は１．２２メガバイトであり、２０２０年１１月６日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
ＲＳ１遺伝子は、網膜の細胞組織に関与する高度に保存された細胞外タンパク質をコードしている。ＲＳ１遺伝子は、ホモオリゴマータンパク質複合体として光受容体および双極細胞から組み立てられ、分泌される。ＲＳ１では２００を超える変異が検出されており、その多くは、機能しないタンパク質またはタンパク質分泌の欠如による黄斑変性症の早期発症につながる。機能的なＲｓ１発現の欠如は、網膜層内で分離を引き起こし、Ｘ連鎖性若年網膜分離症（ＸＬＲＳ）に関連する早期および進行性視力喪失につながる。ＸＬＲＳの遺伝子療法の臨床試験は行われているが、試験はそのエンドポイントを満たしていなかった。ＸＬＲＳの治療には新しい戦略が必要である。
内因性ＲＳ１遺伝子座などの標的ゲノム遺伝子座へのレチノスキシンコード配列の挿入および／またはレチノスキシンコード配列の発現を可能にする核酸構築物および組成物が提供される。核酸構築物および組成物は、標的ゲノム遺伝子座への組み込みおよび／もしくは細胞内での発現のための方法、またはＸ連鎖性若年網膜分離症を治療する方法において使用することができる。
一態様では、標的ゲノム遺伝子座に組み込むための双方向性核酸構築物が提供される。いくつかのそのような核酸構築物は、（ａ）第１のレチノスキシンタンパク質またはその断片の第１のコード配列を含む第１のセグメントと、（ｂ）第２のレチノスキシンタンパク質またはその断片の第２のコード配列の逆相補体を含む第２のセグメントと、を含む。いくつかのそのような構築物では、第２のセグメントは、第１のセグメントの３’（すなわち、下流）に位置する。
いくつかのそのような構築物では、第１のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片は、ヒトレチノスキシンタンパク質もしくはその断片であるか、第２のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片は、ヒトレチノスキシンタンパク質もしくはその断片であるか、または第１のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片および第２のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片の両方は、ヒトレチノスキシンタンパク質もしくはその断片である。いくつかのそのような構築物では、第１のコード配列は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなるか、第２のコード配列は、ｃＤＮＡを含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれらからなるか、または第１のコード配列および第２のコード配列の両方は、ｃＤＮＡを含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる。いくつかのそのような構築物では、第１のコード配列は、ヒトＲＳ１のエキソン２～６もしくはその縮重バリアントを含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなるか、第２のコード配列は、ヒトＲＳ１のエキソン２～６もしくはその縮重バリアントを含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなるか、または第１のコード配列および第２のコード配列の両方は、ヒトＲＳ１のエキソン２～６もしくはその縮重バリアントを含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる。
いくつかのそのような構築物では、第１のセグメントは、第１のコード配列の５’（すなわち、上流）に位置するヒトＲＳ１の第１のイントロンの断片もしくは部分を含み、かつ／または第２のセグメントは、第２のコード配列の逆相補体の３’（すなわち、下流）に位置するヒトＲＳ１の第２のイントロンの断片もしくは部分の逆相補体を含む。
いくつかのそのような構築物では、第１のレチノスキシンタンパク質またはその断片は、第２のレチノスキシンタンパク質またはその断片と同一である。いくつかのそのような構築物では、第２のコード配列は、第１のコード配列のコドン使用とは異なるコドン使用を採用する。いくつかのそのような構築物では、第２のセグメントは、第１のセグメントに対する少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の相補性を有する。いくつかのそのような構築物では、第２のセグメントは、第１のセグメントに対する約３０％未満、約３５％未満、約４０％未満、約４５％未満、約５０％未満、約５５％未満、約６０％未満、約６５％未満、約７０％未満、約７５％未満、約８０％未満、約８５％未満、約９０％未満、約９５％未満、約９７％未満、または約９９％未満の相補性を有する。いくつかのそのような構築物では、第２のコード配列の逆相補体は、（ａ）第１のコード配列に実質的に相補的ではなく、（ｂ）第１のコード配列の断片に実質的に相補的ではなく、（ｃ）第１のコード配列に高度に相補的であり、（ｄ）第１のコード配列の断片に高度に相補的であり、（ｅ）第１のコード配列の逆相補体に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％同一であり、（ｆ）第１のコード配列の逆相補体に対して約５０％～約８０％同一であるか、または（ｇ）第１のコード配列の逆相補体に対して約６０％～約１００％同一である。
いくつかのそのような構築物では、第１のセグメントは、リンカーによって第２のセグメントに連結されている。任意選択で、リンカーは、約５～約２０００ヌクレオチドの長さである。
いくつかのそのような構築物では、第１のセグメントは、第１のコード配列の３’に位置する第１のポリアデニル化シグナル配列を含み、第２のセグメントは、第２のコード配列の逆相補体の５’に位置する第２のポリアデニル化シグナル配列の逆相補体を含む。任意選択で、第１のポリアデニル化シグナル配列は、第２のポリアデニル化シグナル配列とは異なる。
いくつかのそのような構築物では、核酸構築物は、第１のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片または第２のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片の発現を駆動するプロモーターを含まない。いくつかのそのような構築物では、第１のセグメントは、第１のコード配列の５’に位置する第１のスプライスアクセプター部位を含み、第２のセグメントは、第２のコード配列の逆相補体の３’に位置する第２のスプライスアクセプター部位の逆相補体を含む。任意選択で、第１のスプライスアクセプター部位は、ＲＳ１遺伝子に由来するか、第２のスプライスアクセプター部位は、ＲＳ１遺伝子に由来するか、または第１のスプライスアクセプター部位および第２のスプライスアクセプター部位の両方は、ＲＳ１遺伝子に由来する。任意選択で、第１のスプライスアクセプター部位は、ヒトＲＳ１のイントロン１に由来するか、第２のスプライスアクセプター部位は、ヒトＲＳ１のイントロン１に由来するか、または第１のアクセプター部位および第２のスプライスアクセプター部位の両方は、ヒトＲＳ１のイントロン１に由来する。
いくつかのそのような構築物では、核酸構築物は、ホモロジーアームを含まない。いくつかのそのような構築物では、核酸構築物は、ホモロジーアームを含む。いくつかのそのような構築物では、核酸構築物は、一本鎖である。いくつかのそのような構築物では、核酸構築物は、二本鎖である。いくつかのそのような構築物では、核酸構築物は、ＤＮＡを含む。
いくつかのそのような構築物では、第１のコード配列は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化され、第２のコード配列は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されるか、または第１のコード配列および第２のコード配列の両方は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかのそのような構築物では、核酸構築物は、以下の末端構造：ヘアピン、ループ、末端逆位配列（ＩＴＲ）、またはトロイドのうちの１つ以上を含む。任意選択で、核酸構築物は、ＩＴＲを含む。
いくつかのそのような構築物では、第１のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片および／または第２のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片は、配列番号５に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかのそのような構築物では、第１のコード配列および／または第２のコード配列は、配列番号８または９に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかのそのような構築物では、第１のコード配列は、配列番号８に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、第２のコード配列は、配列番号９に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかのそのような構築物では、核酸構築物は、配列番号４６または４７に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかのそのような構築物では、第２のセグメントは、第１のセグメントの３’に位置し、第１のレチノスキシンタンパク質またはその断片および第２のレチノスキシンタンパク質またはその断片の両方は、ヒトレチノスキシンタンパク質またはその断片であり、第１のレチノスキシンタンパク質またはその断片は、第２のレチノスキシンタンパク質またはその断片に対して同一であり、第１のコード配列および第２のコード配列の両方は、ヒトＲＳ１のエキソン２～６またはその縮重バリアントを含む相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含み、第２のコード配列は、第１のコード配列のコドン使用とは異なるコドン使用を採用し、第１のセグメントは、第１のコード配列の３’に位置する第１のポリアデニル化シグナル配列を含み、第２のセグメントは、第２のコード配列の逆相補体の５’に位置する第２のポリアデニル化シグナル配列の逆相補体を含み、第１のセグメントは、第１のコード配列の５’に位置する第１のスプライスアクセプター部位を含み、第２のセグメントは、第２のコード配列の逆相補体の３’に位置する第２のスプライスアクセプター部位の逆相補体を含み、核酸構築物は、第１のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片または第２のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片の発現を駆動するプロモーターを含まず、核酸構築物は、ホモロジーアームを含まない。
別の態様では、上記の双方向性核酸構築物のいずれかを含むベクターが提供される。いくつかのそのようなベクターは、ウイルスベクターである。任意選択で、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。任意選択で、ＡＡＶは、一本鎖ゲノム（ｓｓＡＡＶ）を含む。任意選択で、ＡＡＶは、自己相補的ゲノム（ｓｃＡＡＶ）を含む。任意選択で、ＡＡＶは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ７ｍ８からなる群から選択される。
いくつかのそのようなベクターは、第１のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片または第２のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片の発現を駆動するプロモーターを含まない。いくつかのそのようなベクターは、ホモロジーアームを含まない。いくつかのそのようなベクターは、ホモロジーアームを含む。
別の態様では、上記の双方向性核酸構築物のいずれかを含む脂質ナノ粒子が提供される。
別の態様では、上記の双方向性核酸構築物のいずれかを含む細胞が提供される。いくつかのそのような細胞は、インビトロである。いくつかのそのような細胞は、インビボである。いくつかのそのような細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかのそのような細胞は、ヒト細胞である。いくつかのそのような細胞は、網膜細胞である。
いくつかのそのような細胞は、第１のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片または第２のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片を発現する。いくつかのそのような細胞では、核酸構築物は、標的ゲノム遺伝子座でゲノムに組み込まれる。いくつかのそのような細胞では、標的ゲノム遺伝子座は、内因性ＲＳ１遺伝子座である。任意選択で、核酸構築物は、内因性ＲＳ１遺伝子座のイントロン１にゲノムに組み込まれる。任意選択で、内因性ＲＳ１エキソン１は、核酸構築物の第１のコード配列または第２のコード配列にスプライスする。任意選択で、ゲノムに組み込まれた核酸構築物を含む修飾ＲＳ１遺伝子座は、配列番号２または４に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。
いくつかのそのような細胞では、内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、組み込み部位の下流の内因性ＲＳ１遺伝子の転写を妨げる。任意選択で、内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、内因性レチノスキシンタンパク質の発現を低減または排除し、それを、核酸構築物によってコードされるレチノスキシンタンパク質またはその断片の発現で置き換える。任意選択で、内因性ＲＳ１遺伝子座は、Ｘ連鎖性若年網膜分離症を引き起こす変異を含む変異ＲＳ１遺伝子を含み、ゲノムに組み込まれた核酸構築物の発現は、変異ＲＳ１遺伝子の発現を低減または排除する。
別の態様では、標的ゲノム遺伝子座へのホモロジー非依存性標的化組み込みのための核酸構築物が提供される。いくつかのそのような核酸構築物は、ヌクレアーゼ剤のヌクレアーゼ標的配列と各側で隣接しているレチノスキシンタンパク質またはその断片のコード配列を含む。標的遺伝子座との相同組換えのための核酸構築物も提供される。いくつかのそのような核酸構築物は、各側でホモロジーアームと隣接しているレチノスキシンタンパク質またはその断片のコード配列を含み、任意選択で、コード配列およびホモロジーアームは、ヌクレアーゼ剤の標的配列と各側でさらに隣接している。任意選択で、各ホモロジーアームは、約２５ヌクレオチド～約２．５ｋｂの長さである。
ホモロジー非依存性標的化組み込みのためのいくつかのそのような構築物では、核酸構築物中のヌクレアーゼ標的配列は、標的ゲノム遺伝子座への組み込みのためのヌクレアーゼ標的配列と同一であり、標的ゲノム遺伝子座におけるヌクレアーゼ標的配列は、核酸構築物が正しい方向で挿入される場合、破壊されるが、核酸構築物が反対方向で標的ゲノム遺伝子座に挿入され場合、再形成される。
いくつかのそのような構築物では、レチノスキシンタンパク質またはその断片は、ヒトレチノスキシンタンパク質またはその断片である。いくつかのそのような構築物では、レチノスキシンタンパク質またはその断片のコード配列は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかのそのような構築物では、レチノスキシンタンパク質またはその断片のコード配列は、ヒトＲＳ１のエキソン２～６またはその縮重バリアントを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかのそのような構築物では、核酸構築物は、コード配列の５’に位置するヒトＲＳ１の第１のイントロンの断片または部分を含む。いくつかのそのような構築物では、核酸構築物は、レチノスキシンタンパク質またはその断片の発現を駆動するプロモーターを含まない。いくつかのそのような構築物では、核酸構築物は、コード配列の３’に位置するポリアデニル化シグナル配列を含む。いくつかのそのような構築物では、核酸構築物は、コード配列の５’に位置するスプライスアクセプター部位を含む。任意選択で、スプライスアクセプター部位は、ＲＳ１遺伝子に由来する。任意選択で、スプライスアクセプター部位は、ヒトＲＳ１のイントロン１に由来する。
いくつかのそのような構築物は、一本鎖である。いくつかのそのような構築物は、二本鎖である。いくつかのそのような構築物は、ＤＮＡを含む。いくつかのそのような構築物では、コード配列は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化される。
いくつかのそのような構築物では、構築物は、以下の末端構造：ヘアピン、ループ、末端逆位配列（ＩＴＲ）、またはトロイドのうちの１つ以上を含む。任意選択で、コード配列およびヌクレアーゼ標的配列を含む核酸構築物は、ＩＴＲと隣接している。
いくつかのそのような構築物では、ヌクレアーゼ剤は、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡであり、ヌクレアーゼ標的配列は、ガイドＲＮＡ標的配列である。任意選択で、ガイドＲＮＡ標的配列は、逆ガイドＲＮＡ標的配列である。任意選択で、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。
いくつかのそのような構築物では、レチノスキシンタンパク質またはその断片は、配列番号５に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかのそのような構築物では、レチノスキシンタンパク質またはその断片のコード配列は、配列番号８または９に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかのそのような構築物では、核酸構築物は、配列番号４５に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかのそのような構築物では、核酸構築物は、標的ゲノム遺伝子座へのホモロジー非依存性標的化組み込みのための核酸構築物であり、レチノスキシンタンパク質またはその断片は、ヒトレチノスキシンタンパク質またはその断片であり、レチノスキシンタンパク質またはその断片のコード配列は、ヒトＲＳ１のエキソン２～６またはその縮重バリアントを含む相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含み、核酸構築物は、レチノスキシンタンパク質またはその断片の発現を駆動するプロモーターを含まず、核酸構築物は、コード配列の３’に位置するポリアデニル化シグナル配列を含み、核酸構築物は、コード配列の５’に位置するスプライスアクセプター部位を含み、核酸構築物中のヌクレアーゼ標的配列は、標的ゲノム遺伝子座への組み込みのためのヌクレアーゼ標的配列と同一であり、標的ゲノム遺伝子座におけるヌクレアーゼ標的配列は、核酸構築物が正しい方向で挿入される場合、破壊されるが、核酸構築物が反対方向で標的ゲノム遺伝子座に挿入され場合、再形成される。
いくつかのそのような構築物では、核酸構築物は、標的ゲノム遺伝子座との相同組換えのための核酸構築物であり、レチノスキシンタンパク質またはその断片は、ヒトレチノスキシンタンパク質またはその断片であり、レチノスキシンタンパク質またはその断片のコード配列は、ヒトＲＳ１のエキソン２～６またはその縮重バリアントを含む相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含み、核酸構築物は、レチノスキシンタンパク質またはその断片の発現を駆動するプロモーターを含まず、核酸構築物は、コード配列の３’に位置するポリアデニル化シグナル配列を含み、核酸構築物は、コード配列の５’に位置するスプライスアクセプター部位を含み、各ホモロジーアームは、約２５ヌクレオチド～約２．５ｋｂの長さである。
別の態様では、ホモロジー非依存性標的化組み込みのための上記の核酸構築物のいずれかを含むベクターが提供される。いくつかのそのようなベクターは、ウイルスベクターである。いくつかのそのようなベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。任意選択で、ＡＡＶは、一本鎖ゲノム（ｓｓＡＡＶ）を含む。任意選択で、ＡＡＶは、自己相補的ゲノム（ｓｃＡＡＶ）を含む。任意選択で、ＡＡＶは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ７ｍ８からなる群から選択される。
いくつかのそのようなベクターでは、ベクターは、レチノスキシンタンパク質またはその断片の発現を駆動するプロモーターを含まない。いくつかのそのようなベクターでは、ベクターは、ホモロジーアームを含まない。
別の態様では、ホモロジー非依存性標的化組み込みのための上記の核酸構築物のいずれかを含む脂質ナノ粒子が提供される。
別の態様では、ホモロジー非依存性標的化組み込みのための上記の核酸構築物のいずれかを含む細胞が提供される。いくつかのそのような細胞は、インビトロである。いくつかのそのような細胞は、インビボである。いくつかのそのような細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかのそのような細胞は、ヒト細胞である。いくつかのそのような細胞は、網膜細胞である。
いくつかのそのような細胞では、細胞は、レチノスキシンタンパク質またはその断片を発現する。いくつかのそのような細胞では、核酸構築物は、標的ゲノム遺伝子座でゲノムに組み込まれる。任意選択で、標的ゲノム遺伝子座は、内因性ＲＳ１遺伝子座である。任意選択で、核酸構築物は、内因性ＲＳ１遺伝子座のイントロン１にゲノムに組み込まれる。任意選択で、内因性ＲＳ１エキソン１は、核酸構築物中のレチノスキシンタンパク質またはその断片のコード配列にスプライスする。任意選択で、ゲノムに組み込まれた核酸構築物を含む修飾ＲＳ１遺伝子座は、配列番号２または４に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。
いくつかのそのような細胞では、内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、組み込み部位の下流の内因性ＲＳ１遺伝子の転写を妨げる。任意選択で、内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、内因性レチノスキシンタンパク質の発現を低減または排除し、それを、核酸構築物によってコードされるレチノスキシンタンパク質またはその断片の発現で置き換える。任意選択で、内因性ＲＳ１遺伝子座は、Ｘ連鎖性若年網膜分離症を引き起こす変異を含む変異ＲＳ１遺伝子を含み、ゲノムに組み込まれた核酸構築物の発現は、変異ＲＳ１遺伝子の発現を低減または排除する。
別の態様では、細胞内でレチノスキシンを発現するのに使用するための、またはレチノスキシンタンパク質もしくはその断片のコード配列を細胞内の標的ゲノム遺伝子座に組み込むのに使用するための組成物が提供される。いくつかのそのような組成物は、（ａ）標的ゲノム遺伝子座への組み込みのためのレチノスキシンタンパク質またはその断片のコード配列を含む核酸構築物と、（ｂ）ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸と、を含み、ヌクレアーゼ剤は、標的ゲノム遺伝子座のヌクレアーゼ標的配列を標的とする。
いくつかのそのような組成物は、（ａ）ホモロジー非依存性標的化組み込みのための上記の核酸構築物のいずれかと、（ｂ）ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸と、を含み、ヌクレアーゼ剤は、標的ゲノム遺伝子座のヌクレアーゼ標的配列を標的とする。任意選択で、標的ゲノム遺伝子座のヌクレアーゼ標的配列は、核酸構築物のヌクレアーゼ標的配列と同一である。任意選択で、標的ゲノム遺伝子座におけるヌクレアーゼ標的配列は、核酸構築物が正しい方向で挿入される場合、破壊されるが、核酸構築物が反対方向で標的ゲノム遺伝子座に挿入され場合、再形成される。
いくつかのそのような組成物は、（ａ）上記の双方向性核酸構築物のいずれかと、（ｂ）ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸と、を含み、ヌクレアーゼ剤は、標的ゲノム遺伝子座のヌクレアーゼ標的配列を標的とする。
いくつかのそのような組成物では、標的ゲノム遺伝子座は、ＲＳ１遺伝子にある。任意選択で、標的ゲノム遺伝子座のヌクレアーゼ標的配列は、ＲＳ１遺伝子の第１のイントロンにある。任意選択で、内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、組み込み部位の下流の内因性ＲＳ１遺伝子の転写を妨げる。任意選択で、細胞内の内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、内因性レチノスキシンタンパク質の発現を低減または排除し、それを、核酸構築物によってコードされるレチノスキシンタンパク質またはその断片の発現で置き換える。
いくつかのそのような組成物では、ヌクレアーゼ剤は、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡであり、ヌクレアーゼ標的配列は、ガイドＲＮＡ標的配列である。任意選択で、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。任意選択で、組成物は、Ｃａｓタンパク質をコードするガイドＲＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡを含む。任意選択で、Ｃａｓタンパク質をコードするガイドＲＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡは、脂質ナノ粒子内にある。任意選択で、組成物は、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡおよびガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む。任意選択で、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡおよびガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、１つ以上のウイルスベクターにある。任意選択で、１つ以上のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターである。任意選択で、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡおよびガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一のウイルスベクター（例えば、単一のＡＡＶベクター）にある。任意選択で、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡおよびガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、別個のウイルスベクター（例えば、別個のＡＡＶベクター）にある。
いくつかのそのような組成物では、核酸構築物は、ウイルスベクターにある。任意選択で、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターである。任意選択で、ＡＡＶは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ７ｍ８からなる群から選択される。
ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む組成物も提供され、ガイドＲＮＡは、ＲＳ１遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするＤＮＡ標的化セグメントを含み、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質に結合し、ＲＳ１遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列へのＣａｓタンパク質を標的とする。
いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、組成物は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸をさらに含む。任意選択で、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。任意選択で、Ｃａｓタンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に由来する。いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、組成物は、タンパク質の形態のＣａｓタンパク質を含む。
いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、組成物は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含み、核酸は、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡを含み、任意選択で、組成物は、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む。任意選択で、組成物は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含み、核酸は、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡを含み、組成物は、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含み、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡおよびガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、１つ以上のウイルスベクターにある。任意選択で、１つ以上のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターである。任意選択で、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡおよびガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一のウイルスベクター（例えば、単一のＡＡＶベクター）にある。任意選択で、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡおよびガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、別個のウイルスベクター（例えば、別個のＡＡＶベクター）にある。任意選択で、ＡＡＶは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ７ｍ８からなる群から選択される。
いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、組成物は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含み、核酸は、Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡを含み、任意選択で、組成物は、ＲＮＡの形態のガイドＲＮＡを含む。いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、組成物は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含み、核酸は、Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡを含み、組成物は、ＲＮＡの形態のガイドＲＮＡを含み、Ｃａｓタンパク質をコードするガイドＲＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡは、脂質ナノ粒子内にある。
いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡは、少なくとも１つの修飾を含む。任意選択で、Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡは、１つ以上またはすべてのウリジン位置に修飾ウリジンを含むように修飾される。任意選択で、修飾ウリジンは、シュードウリジンである。任意選択で、Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡをシュードウリジンで完全に置換する。いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡは、５’キャップを含む。いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡは、ポリ（Ａ）テールを含む。いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡは、配列番号６２４３または６２４５に示される配列を含む。
いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、哺乳動物細胞またはヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、Ｃａｓタンパク質は、配列番号２７、６２４２、または６２４６に示される配列を含む。
いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＲＳ１遺伝子のイントロンにある。任意選択で、イントロンは、ＲＳ１遺伝子の第１のイントロンである。
いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、ＲＳ１遺伝子は、ヒトＲＳ１遺伝子である。
いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、ＤＮＡ標的化セグメントは、（ａ）配列番号３１４８～６２４１のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、もしくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド、（ｂ）配列番号３１４８～４９８９のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、もしくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド、（ｃ）配列番号３１４８～３１５１、３１５４～３１８６、３１８８～３２４７、および３２４９～４３５１のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、もしくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド、（ｄ）配列番号３１５０、３１５１、３１５９、３６７５、４２９７、および４３０４のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、もしくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド、または（ｅ）配列番号４９９０～６２４１のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、もしくは少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含む。
いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、ＤＮＡ標的化セグメントは、（ａ）配列番号３１４８～６２４１のうちのいずれか１つに示される配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であり、（ｂ）配列番号３１４８～４９８９のうちのいずれか１つに示される配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であり、（ｃ）配列番号３１４８～３１５１、３１５４～３１８６、３１８８～３２４７、および３２４９～４３５１のうちのいずれか１つに示される配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であり、（ｄ）配列番号３１５０、３１５１、３１５９、３６７５、４２９７、および４３０４のうちのいずれか１つに示される配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるか、または（ｅ）配列番号４９９０～６２４１のうちのいずれか１つに示される配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である。
いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、ＤＮＡ標的化セグメントは、（ａ）配列番号３１４８～６２４１のうちのいずれか１つ、（ｂ）配列番号３１４８～４９８９のうちのいずれか１つ、（ｃ）配列番号３１４８～３１５１、３１５４～３１８６、３１８８～３２４７、および３２４９～４３５１のうちのいずれか１つ、（ｄ）配列番号３１５０、３１５１、３１５９、３６７５、４２９７、および４３０４のうちのいずれか１つ、または（ｅ）配列番号４９９０～６２４１のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、ＤＮＡ標的化セグメントは、配列番号３１５０、３１５１、３１５９、３６７５、４２９７、および４３０４のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含む。
いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、ＤＮＡ標的化セグメントは、配列番号３１５０、３１５１、３１５９、３６７５、４２９７、および４３０４のうちのいずれか１つに示される配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。
いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、ＤＮＡ標的化セグメントは、配列番号３１５０、３１５１、３１５９、３６７５、４２９７、および４３０４のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、組成物は、ＲＮＡの形態のガイドＲＮＡを含む。いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、組成物は、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む。
いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの修飾を含む。いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、少なくとも１つの修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、少なくとも１つの修飾は、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む。いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡの５’末端の最初の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾を含む。いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡの３’末端の最後の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾を含む。いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡの５’末端の最初の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む。いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡの３’末端の最後の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む。いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡの５’末端の最初の３つのヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡの３’末端の最後の３つのヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、少なくとも１つの修飾は、（ｉ）ガイドＲＮＡの５’末端の最初の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合と、（ｉｉ）ガイドＲＮＡの３’末端の最後の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合と、（ｉｉｉ）ガイドＲＮＡの５’末端の最初の３つのヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドと、（ｉｖ）ガイドＲＮＡの３’末端の最後の３つのヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドと、を含む。いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、ガイドＲＮＡは、配列番号４４の修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、ガイドＲＮＡは、単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。任意選択で、ガイドＲＮＡは、配列番号３３～３９および５３のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む２つの別個のＲＮＡ分子を含む二重ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）である。任意選択で、ｃｒＲＮＡは、配列番号２９および５２のうちのいずれか１つに示される配列を含む。任意選択で、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号３０～３２のうちのいずれか１つに示される配列を含む。
いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、組成物は、脂質ナノ粒子に関連しており、任意選択で、組成物は、ガイドＲＮＡを含む。いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、ウイルスベクターにある。いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターである。任意選択で、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡおよびガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一のウイルスベクター（例えば、単一のＡＡＶベクター）にある。任意選択で、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡおよびガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、別個のウイルスベクター（例えば、別個のＡＡＶベクター）にある。任意選択で、ＡＡＶは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ７ｍ８からなる群から選択される。
いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、組成物は、薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物である。
いくつかのそのような組成物または使用するための組成物では、組成物は、第２のガイドＲＮＡまたは第２のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡをさらに含み、第２のガイドＲＮＡは、ＲＳ１遺伝子の第２のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするＤＮＡ標的化セグメントを含み、第２のガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質に結合し、ＲＳ１遺伝子の第２のガイドＲＮＡ標的配列へのＣａｓタンパク質を標的とする。
上記の組成物または使用するための組成物のいずれかを含む細胞も提供される。任意選択で、細胞は、インビトロである。任意選択で、細胞は、インビボである。いくつかのそのような細胞は、哺乳動物細胞である。任意選択で、細胞は、ヒト細胞である。任意選択で、細胞は、網膜細胞である。
いくつかのそのような細胞では、細胞は、第１のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片、または第２のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片を発現する。いくつかのそのような細胞では、核酸構築物は、標的ゲノム遺伝子座でゲノムに組み込まれる。任意選択で、標的ゲノム遺伝子座は、内因性ＲＳ１遺伝子座である。任意選択で、核酸構築物は、内因性ＲＳ１遺伝子座のイントロン１にゲノムに組み込まれる。任意選択で、内因性ＲＳ１エキソン１は、核酸構築物の第１のコード配列または第２のコード配列にスプライスする。任意選択で、ゲノムに組み込まれた核酸構築物を含む修飾ＲＳ１遺伝子座は、配列番号２または４に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。
いくつかのそのような細胞では、内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、組み込み部位の下流の内因性ＲＳ１遺伝子の転写を妨げる。任意選択で、内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、内因性レチノスキシンタンパク質の発現を低減または排除し、それを、核酸構築物によってコードされるレチノスキシンタンパク質またはその断片の発現で置き換える。任意選択で、内因性ＲＳ１遺伝子座は、Ｘ連鎖性若年網膜分離症を引き起こす変異を含む変異ＲＳ１遺伝子を含み、ゲノムに組み込まれた核酸構築物の発現は、変異ＲＳ１遺伝子の発現を低減または排除する。
別の態様では、レチノスキシンタンパク質またはその断片のコード配列を標的ゲノム遺伝子座に組み込み、細胞内でレチノスキシンタンパク質またはその断片を発現させる方法が提供される。いくつかのそのような方法は、上記の核酸構築物、ベクター、脂質ナノ粒子、または組成物のいずれかを細胞に投与することを含み、コード配列は、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれ、レチノスキシンタンパク質またはその断片は、細胞内で発現される。任意選択で、細胞は、哺乳動物細胞である。任意選択で、細胞は、ヒト細胞である。任意選択で、細胞は、網膜細胞である。任意選択で、細胞は、インビトロである。任意選択で、細胞は、インビボである。任意選択で、細胞は、インビボで網膜細胞であり、投与は、網膜下注射または硝子体内注射を含む。
いくつかのそのような方法では、核酸構築物およびヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸は、同時に投与される。いくつかのそのような方法では、核酸構築物およびヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸は、任意の順序で連続して投与される。任意選択で、核酸構築物は、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸の前に投与される。任意選択で、核酸構築物は、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸の後に投与される。任意選択で、連続投与間の時間は、約２時間～約４８時間である。いくつかのそのような方法では、核酸構築物およびヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸は、同じ送達ビヒクルで投与される。いくつかのそのような方法では、核酸構築物およびヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸は、異なる送達ビヒクルで投与される。
いくつかのそのような方法では、標的ゲノム遺伝子座は、内因性ＲＳ１遺伝子にある。任意選択で、標的ゲノム遺伝子座のヌクレアーゼ標的配列は、内因性ＲＳ１遺伝子の第１のイントロンにある。任意選択で、核酸構築物は、内因性ＲＳ１遺伝子座のイントロン１にゲノムに組み込まれ、内因性ＲＳ１エキソン１は、核酸構築物中のレチノスキシンタンパク質またはその断片のコード配列にスプライスする。任意選択で、ゲノムに組み込まれた核酸構築物を含む修飾ＲＳ１遺伝子座は、配列番号２または４に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。いくつかのそのような方法では、内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、組み込み部位の下流の内因性ＲＳ１遺伝子の転写を妨げる。任意選択で、内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、内因性ＲＳ１遺伝子座からの内因性レチノスキシンタンパク質の発現を低減または排除し、それを、核酸構築物によってコードされるレチノスキシンタンパク質またはその断片の発現で置き換える。
別の態様では、Ｘ連鎖性若年網膜分離症を有する対象を治療する方法が提供される。いくつかのそのような方法は、上記の核酸構築物、ベクター、脂質ナノ粒子、または組成物のいずれかを対象に投与することを含み得、核酸構築物は、対象の１つ以上の網膜細胞の標的ゲノム遺伝子座に組み込まれ、そこから発現され、治療上有効なレベルのレチノスキシン発現が対象において達成される。いくつかのそのような方法では、対象は、ヒトである。いくつかのそのような方法では、対象は、Ｘ連鎖性若年網膜分離症に関連するかまたはそれを引き起こす少なくとも１つの変異を含む内因性ＲＳ１遺伝子を有する。任意選択で、変異は、Ｒ１４１Ｃ変異である。いくつかのそのような方法では、投与は、網膜下注射または硝子体内注射を含む。いくつかのそのような方法では、核酸構築物の組み込みは、網膜構造の回復をもたらす。
いくつかのそのような方法では、核酸構築物およびヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸は、同時に投与される。いくつかのそのような方法では、核酸構築物およびヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸は、任意の順序で連続して投与される。任意選択で、核酸構築物は、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸の前に投与される。任意選択で、核酸構築物は、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸の後に投与される。任意選択で、連続投与間の時間は、約２時間～約４８時間である。いくつかのそのような方法では、核酸構築物およびヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸は、同じ送達ビヒクルで投与される。いくつかのそのような方法では、核酸構築物およびヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸は、異なる送達ビヒクルで投与される。
いくつかのそのような方法では、標的ゲノム遺伝子座は、内因性ＲＳ１遺伝子にある。任意選択で、標的ゲノム遺伝子座のヌクレアーゼ標的配列は、内因性ＲＳ１遺伝子の第１のイントロンにある。任意選択で、核酸構築物は、内因性ＲＳ１遺伝子座のイントロン１にゲノムに組み込まれ、内因性ＲＳ１エキソン１は、核酸構築物中のレチノスキシンタンパク質またはその断片のコード配列にスプライスする。任意選択で、ゲノムに組み込まれた核酸構築物を含む修飾ＲＳ１遺伝子座は、配列番号２または４に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。いくつかのそのような方法では、内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、組み込み部位の下流の内因性ＲＳ１遺伝子の転写を妨げる。任意選択で、内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、内因性ＲＳ１遺伝子座からの内因性レチノスキシンタンパク質の発現を低減または排除し、それを、核酸構築物によってコードされるレチノスキシンタンパク質またはその断片の発現で置き換える。
別の態様では、細胞内のＲＳ１遺伝子を修飾する方法が提供される。いくつかのそのような方法は、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡおよびＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸を含む上記組成物のいずれかを細胞に投与することを含み、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質に結合し、ＲＳ１遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列へのＣａｓタンパク質を標的し、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡ標的配列を切断する。いくつかのそのような方法では、細胞は、哺乳動物細胞である。任意選択で、細胞は、ヒト細胞である。任意選択で、細胞は、網膜細胞である。任意選択で、細胞は、インビトロである。任意選択で、細胞は、インビボである。いくつかのそのような方法では、細胞は、網膜細胞であり、投与は、網膜下注射または硝子体内注射を含む。いくつかのそのような方法では、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＲＳ１遺伝子の第１のイントロンにある。
（正確な縮尺ではない）Ｘ連鎖性若年網膜分離症（ＸＬＲＳ）に関連するＲ１４１Ｃ変異の位置およびヒトＲＳ１のエキソン２～６を含む核酸構築物の挿入部位を含む、マウスＲｓ１遺伝子座の概略図を示す。 マウスレチノスキシン、ヒトレチノスキシン、Ｒ１４１Ｃ変異を有するヒトレチノスキシン、Ｒ１４１Ｃ変異を有するマウスレチノスキシン、およびマウスＲｓ１遺伝子座のイントロン１へのヒトＲＳ１のエキソン２～６を含む核酸構築物の組み込み時に発現するマウス／ヒトレチノスキシンハイブリッドのアラインメントを示す。 （正確な縮尺ではない）スプライスアクセプター（Ａ）、ヒトＲＳ１のエキソン２～６、およびウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡを含む第１のセグメント、ならびにＳＶ４０ポリＡの逆相補体、ヒトＲＳ１のエキソン２～６の逆相補体、およびスプライスアクセプター（Ａ）の逆相補体を含む第２のセグメントを含む双方向性核酸構築物の概略図を示す。双方向性構築物はまた、２つのヒトＲＳ１セグメント間のマウスＲｓ１遺伝子座のイントロン１を標的とするガイドＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたＵ６プロモーターを含む。星に隣接する水平の矢印は、ＮＧＳ用に設計された次世代のターゲットリシーケンシングアンプリコンを表している。双方向性ｓｓＡＡＶ構築物が上部に示され、双方向性ｓｃＡＡＶ構築物が下部に示される。 （正確な縮尺ではない）スプライスアクセプター（Ａ）、ヒトＲＳ１のエキソン２～６、およびポリＡ配列を含む、ホモロジー非依存性標的化組み込み核酸構築物の概略図を示す。構築物はまた、ヒトＲＳ１セグメントのマウスＲｓ１遺伝子座下流のイントロン１を標的とするガイドＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたＵ６プロモーターを含む。星に隣接する水平の矢印は、ＮＧＳ用に設計された次世代のターゲットリシーケンシングアンプリコンを表している。 ＲＳ１ウイルスベクターバージョン１、ＲＳ１ウイルスベクターバージョン２、またはＲＳ１ウイルスベクターバージョン３を注射したＲｏｓａＣａｓ９／＋、Ｒｓ１Ｒ１４１Ｃ／Ｙマウスの眼の光干渉断層計（ＯＣＴ）スキャンで示した網膜空洞のスコアリングを示す。少なくとも１枚の個別の画像に１～４個の空洞がある場合、スコア１が割り当てられた。少なくとも１枚の個別の画像に４個以上の空洞があるが、空洞が融合していない場合、スコア２が割り当てられた。少なくとも１枚の個別の画像に融合した空洞がある場合、スコア３が割り当てられた。少なくとも１枚の個別の画像に融合した空洞があり、網膜が伸ばされている場合は、スコア４が割り当てられた。各治療群の平均スコアは、ノンパラメトリッククラスカルウォリス一元配置分散分析および事後検定ダンの多重比較検定によって、プールされた未治療の眼を含む対照群と比較された。 ＲＳ１ウイルスベクターバージョン１（ｐｓｓＡＡＶ ｍｈＲＳ１－ｓｇｕ）、ＲＳ１ウイルスベクターバージョン２（ｐｓｃＡＡＶ ｒｓ１＿ｔａｎｄｅｍ）、またはＲＳ１ウイルスベクターバージョン３（ｐｓｓＡＡＶ ｈＲｓ１＿ＨＩＴＩ）を注射したＲｏｓａＣａｓ９／＋、Ｒｓ１Ｒ１４１Ｃ／Ｙマウスの眼のマウス網膜サンプルからのＮＧＳ結果を示す。４つの予想される配列バリアントの読み取りカウント、（１）ＷＴマウス、Ｒ１４１Ｃ変異体を含まないマウス参照配列と、（２）変異体マウス、Ｒ１４１Ｃ変異体を含むマウス参照配列と、（３）ヒト化転写物１、ヒト参照配列と、（４）ヒト化転写物２、マウスコドン最適化ヒト参照配列と、が示される。次世代のターゲットリシーケンシングアンプリコンは、図３（水平矢印）に示されている領域用に設計された。マウス網膜からのｍＲＮＡを使用して、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）増幅のテンプレートとして機能するｃＤＮＡを生成した。 ＲＳ１ウイルスベクターバージョン１（ｍｈＲＳ１－ｓｇｕ）、ＲＳ１ウイルスベクターバージョン２（ｐｓｃＡＡＶ＿ｒｓ１＿ｔａｎｄｅｍ）、またはＲＳ１ウイルスベクターバージョン３（ｈＲｓ１＿ｃＤＮＡ ＨＩＴＩ）を注射したＲｏｓａＣａｓ９／＋、Ｒｓ１Ｒ１４１Ｃ／Ｙマウスの眼のマウス網膜サンプルからのＮＧＳ結果を示す。これらのＮＧＳの結果では、別個のアンプリコンを使用してＲｓ１イントロン１ガイドＲＮＡ標的配列を増幅した。マウスの参照配列に一致するか、または非相同末端結合を含む読み取り数を定量化して、挿入せずにガイドＲＮＡが切断される頻度を評価した。 ＲＳ１ウイルスベクターバージョン１（ｍｈＲＳ１－ｓｇｕ）、ＲＳ１ウイルスベクターバージョン２（ｐｓｃＡＡＶ＿ｒｓ１＿ｔａｎｄｅｍ）、またはＲＳ１ウイルスベクターバージョン３（ｈＲｓ１＿ｃＤＮＡ ＨＩＴＩ）を注射したＲｏｓａＣａｓ９／＋、Ｒｓ１Ｒ１４１Ｃ／Ｙマウスの眼のマウス網膜サンプルからのＮＧＳ結果を示す。これらのＮＧＳの結果では、別個のアンプリコンを使用してＲｓ１イントロン１ガイドＲＮＡ標的配列を増幅した。マウスの参照配列に一致するか、または非相同末端結合を含む読み取り数を定量化して、挿入せずにガイドＲＮＡが切断される頻度を評価した。 ＲＳ１ウイルスベクターバージョン１（ｐｓｓＡＡＶ ｍｈＲＳ１－ｓｇｕ、図７Ａ）、ＲＳ１ウイルスベクターバージョン２（ｐｓｃＡＡＶ ｒｓ１＿ｔａｎｄｅｍ、図７Ｂ）、またはＲＳ１ウイルスベクターバージョン３（ｐｓｓＡＡＶ ｈＲｓ１＿ＨＩＴＩ、図７Ｃ）を注射したＲｏｓａＣａｓ９／＋、Ｒｓ１Ｒ１４１Ｃ／Ｙマウスの眼のマウス網膜サンプルからのＮＧＳ結果を示す。４つの予想される配列バリアントの読み取りカウント、（１）ＷＴマウス、Ｒ１４１Ｃ変異体を含まないマウス参照配列と、（２）変異体マウス、Ｒ１４１Ｃ変異体を含むマウス参照配列と、（３）ヒト化転写物１、ヒト参照配列と、（４）ヒト化転写物２、マウスコドン最適化ヒト参照配列と、が示される。次世代のターゲットリシーケンシングアンプリコンは、図３（水平矢印）に示されている領域用に設計された。マウス網膜からのｍＲＮＡを使用して、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）増幅のテンプレートとして機能するｃＤＮＡを生成した。マウスの参照配列に一致するか、または非相同末端結合を含む読み取り数を定量化して、挿入せずにガイドＲＮＡが切断される頻度を評価した。 ＲＳ１ウイルスベクターバージョン１（ｐｓｓＡＡＶ ｍｈＲＳ１－ｓｇｕ、図７Ａ）、ＲＳ１ウイルスベクターバージョン２（ｐｓｃＡＡＶ ｒｓ１＿ｔａｎｄｅｍ、図７Ｂ）、またはＲＳ１ウイルスベクターバージョン３（ｐｓｓＡＡＶ ｈＲｓ１＿ＨＩＴＩ、図７Ｃ）を注射したＲｏｓａＣａｓ９／＋、Ｒｓ１Ｒ１４１Ｃ／Ｙマウスの眼のマウス網膜サンプルからのＮＧＳ結果を示す。４つの予想される配列バリアントの読み取りカウント、（１）ＷＴマウス、Ｒ１４１Ｃ変異体を含まないマウス参照配列と、（２）変異体マウス、Ｒ１４１Ｃ変異体を含むマウス参照配列と、（３）ヒト化転写物１、ヒト参照配列と、（４）ヒト化転写物２、マウスコドン最適化ヒト参照配列と、が示される。次世代のターゲットリシーケンシングアンプリコンは、図３（水平矢印）に示されている領域用に設計された。マウス網膜からのｍＲＮＡを使用して、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）増幅のテンプレートとして機能するｃＤＮＡを生成した。マウスの参照配列に一致するか、または非相同末端結合を含む読み取り数を定量化して、挿入せずにガイドＲＮＡが切断される頻度を評価した。 ＲＳ１ウイルスベクターバージョン１（ｐｓｓＡＡＶ ｍｈＲＳ１－ｓｇｕ、図７Ａ）、ＲＳ１ウイルスベクターバージョン２（ｐｓｃＡＡＶ ｒｓ１＿ｔａｎｄｅｍ、図７Ｂ）、またはＲＳ１ウイルスベクターバージョン３（ｐｓｓＡＡＶ ｈＲｓ１＿ＨＩＴＩ、図７Ｃ）を注射したＲｏｓａＣａｓ９／＋、Ｒｓ１Ｒ１４１Ｃ／Ｙマウスの眼のマウス網膜サンプルからのＮＧＳ結果を示す。４つの予想される配列バリアントの読み取りカウント、（１）ＷＴマウス、Ｒ１４１Ｃ変異体を含まないマウス参照配列と、（２）変異体マウス、Ｒ１４１Ｃ変異体を含むマウス参照配列と、（３）ヒト化転写物１、ヒト参照配列と、（４）ヒト化転写物２、マウスコドン最適化ヒト参照配列と、が示される。次世代のターゲットリシーケンシングアンプリコンは、図３（水平矢印）に示されている領域用に設計された。マウス網膜からのｍＲＮＡを使用して、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）増幅のテンプレートとして機能するｃＤＮＡを生成した。マウスの参照配列に一致するか、または非相同末端結合を含む読み取り数を定量化して、挿入せずにガイドＲＮＡが切断される頻度を評価した。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびヒトＲＳ１イントロン１を標的とする６つのガイドＲＮＡのうちの１つで製剤化された脂質ナノ粒子での処理の２時間前に、ＲＳ１ウイルスベクターバージョン１（ｐｓｓＡＡＶ ｍｈＲＳ１－ｓｇｕ、図８Ａ）またはＲＳ１ウイルスベクターバージョン２（ｐｓｃＡＡＶ ｒｓ１＿ｔａｎｄｅｍ、図８Ｂ）で処理したヒト網膜芽細胞腫細胞から生じるＲＴ－ｑＰＣＲ結果を示す。デルタＣｔ値が示される（数値が小さいほど、発現は高くなる）。「Ｈｏ」は、ヒト参照配列を指し、「Ｍｏ」は、マウス発現のためにコドン最適化されたヒト参照配列を指す。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびヒトＲＳ１イントロン１を標的とする６つのガイドＲＮＡのうちの１つで製剤化された脂質ナノ粒子での処理の２時間前に、ＲＳ１ウイルスベクターバージョン１（ｐｓｓＡＡＶ ｍｈＲＳ１－ｓｇｕ、図８Ａ）またはＲＳ１ウイルスベクターバージョン２（ｐｓｃＡＡＶ ｒｓ１＿ｔａｎｄｅｍ、図８Ｂ）で処理したヒト網膜芽細胞腫細胞から生じるＲＴ－ｑＰＣＲ結果を示す。デルタＣｔ値が示される（数値が小さいほど、発現は高くなる）。「Ｈｏ」は、ヒト参照配列を指し、「Ｍｏ」は、マウス発現のためにコドン最適化されたヒト参照配列を指す。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびヒトＲＳ１イントロン１を標的とする６つのガイドＲＮＡのうちの１つで製剤化された脂質ナノ粒子での処理の２時間後に、ＲＳ１ウイルスベクターバージョン１（ｐｓｓＡＡＶ ｍｈＲＳ１－ｓｇｕ、図９Ａ）またはＲＳ１ウイルスベクターバージョン２（ｐｓｃＡＡＶ ｒｓ１＿ｔａｎｄｅｍ、図９Ｂ）で処理したヒト網膜芽細胞腫細胞から生じるＲＴ－ｑＰＣＲ結果を示す。デルタＣｔ値が示される（数値が小さいほど、発現は高くなる）。「Ｈｏ」は、ヒト参照配列を指し、「Ｍｏ」は、マウス発現のためにコドン最適化されたヒト参照配列を指す。 Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびヒトＲＳ１イントロン１を標的とする６つのガイドＲＮＡのうちの１つで製剤化された脂質ナノ粒子での処理の２時間後に、ＲＳ１ウイルスベクターバージョン１（ｐｓｓＡＡＶ ｍｈＲＳ１－ｓｇｕ、図９Ａ）またはＲＳ１ウイルスベクターバージョン２（ｐｓｃＡＡＶ ｒｓ１＿ｔａｎｄｅｍ、図９Ｂ）で処理したヒト網膜芽細胞腫細胞から生じるＲＴ－ｑＰＣＲ結果を示す。デルタＣｔ値が示される（数値が小さいほど、発現は高くなる）。「Ｈｏ」は、ヒト参照配列を指し、「Ｍｏ」は、マウス発現のためにコドン最適化されたヒト参照配列を指す。 スプライスアクセプター（Ａ）、ヒトＲＳ１のエキソン２～６、およびポリＡ配列を含む、相同組換え用の核酸構築物の概略図を示す。構築物はまた、ヒトＲＳ１セグメントのマウスＲｓ１遺伝子座下流のイントロン１を標的とするガイドＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたＵ６プロモーターを含む。構築物はまた、上流および下流のホモロジーアーム（ＨＡ）を含む。星に隣接する水平の矢印は、ＮＧＳ用に設計された次世代のターゲットリシーケンシングアンプリコンを表している。
定義
本明細書で互換的に使用される、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、コード化および非コード化アミノ酸ならびに化学的または生化学的に修飾または誘導体化したアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を含む。これらの用語には、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなどの修飾されたポリマーも含まれる。「ドメイン」という用語は、特定の機能または構造を有するタンパク質またはポリペプチドの任意の部分を指す。
本明細書で互換的に使用される、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらの類似体もしくは修飾バージョンを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含む。これらには、一本鎖、二本鎖、および多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、ならびにプリン塩基、ピリミジン塩基、または他の天然、化学的に修飾された、生化学的に修飾された、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。
「ゲノムに組み込まれた」という用語は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムに組み込まれるように、細胞に導入されている核酸を指す。細胞のゲノムへの核酸の安定した組み込みのために、任意のプロトコルを使用してよい。
「発現ベクター」または「発現構築物」または「発現カセット」という用語は、特定の宿主細胞または生命体における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な適切な核酸配列に作動可能に連結された所望のコード配列を含む組換え核酸を指す。原核生物での発現に必要な核酸配列には、通常、プロモーター、オペレーター（任意選択）、リボソーム結合部位、およびその他の配列が含まれる。真核細胞は一般に、プロモーター、エンハンサー、終結およびポリアデニル化シグナルを利用することが知られており、必要な発現を犠牲にすることなく、いくつかの要素を削除し得、他の要素を追加し得る。
「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１つの要素を含み、かつウイルスベクター粒子へのパッケージングに十分な、またはそれを許容する要素を含む、組換え核酸を指す。ベクターおよび／または粒子は、エクスビボまたはインビボのいずれかで、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の核酸を細胞に移す目的で利用され得る。ウイルスベクターの多くの形態が既知である。
タンパク質、核酸、および細胞に関して「単離された」という用語は、通常はインサイチュに存在し得る他の細胞または生物成分に関して比較的精製されているタンパク質、核酸、および細胞を含み、タンパク質、核酸、または細胞の実質的に純粋な調製物までを含み、およびそれらの実質的に純粋な調製物を含む。「単離された」という用語はまた、天然に存在する対応物を有さないタンパク質および核酸、または化学的に合成され、したがって他のタンパク質もしくは核酸によって実質的に汚染されていないタンパク質もしくは核酸を含む。「単離された」という用語はまた、それらが自然に付随する他のほとんどの細胞成分または生物成分（例えば、他の細胞タンパク質、核酸、または細胞成分もしくは細胞外成分）から分離または精製されたタンパク質、核酸、または細胞を含み得る。
「野生型」という用語は、（変異体、病変した、改変したなどとは対照的に）正常な状態または文脈に見られるような構造および／または活性を有する実体を含む。野生型遺伝子およびポリペプチドは、多くの場合、複数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在する。
「内因性配列」という用語は、細胞または動物内で天然に存在する核酸配列を指す。例えば、動物の内因性ＲＳ１配列は、動物のＲＳ１遺伝子座で天然に存在する天然のＲＳ１配列を指す。
「外因性」分子または配列には、その形態の細胞には通常存在しない分子または配列が含まれる。通常の存在には、細胞の特定の発生段階および環境条件に関する存在が含まれる。外因性分子または配列には、例えば、内因性配列のヒト化バージョンなど、細胞内の対応する内因性配列の変異バージョンが含まれ得るか、または細胞内であるが、異なる形態の（すなわち、染色体内ではない）内因性配列に対応する配列が含まれ得る。対照的に、内因性分子または配列は、その形態で、特定の細胞において、特定の発生段階で、特定の環境条件下で通常存在する分子または配列を含む。
核酸またはタンパク質の文脈で使用される場合の「異種」という用語は、核酸またはタンパク質が、同じ分子内で一緒に天然に存在しない少なくとも２つのセグメントを含むことを示す。例えば、「異種」という用語は、核酸のセグメントまたはタンパク質のセグメントに関して使用される場合、核酸またはタンパク質が、自然界で互いに同じ関係（例えば、一緒に結合）で見出されない２つ以上のサブ配列を含むことを示す。一例として、核酸ベクターの「異種」領域は、自然界で他の分子と関連して見出されない、別の核酸分子内の、または別の核酸分子に結合した核酸のセグメントである。例えば、核酸ベクターの異種領域は、自然界のコード配列に関連して見出されない配列に隣接するコード配列を含み得る。同様に、タンパク質の「異種」領域は、自然界の他のペプチド分子（例えば、融合タンパク質、またはタグ付きタンパク質）に関連して見出されない、別のペプチド分子内にあるか、またはそれに結合しているアミノ酸のセグメントである。同様に、核酸またはタンパク質は、異種標識または異種分泌または局在化配列を含み得る。
「コドン最適化」は、アミノ酸を指定する３塩基対のコドンの組み合わせの多様性によって示されるように、コドンの縮重を利用し、一般に、天然アミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、特定の宿主細胞における発現の増強のために核酸配列を修飾するプロセスを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸は、天然に存在する核酸配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、または他の任意の宿主細胞を含む、所与の原核細胞または真核細胞においてより頻度高く使用される代替コドンへと修飾することができる。コドン使用表は、例えば「コドン使用データベース」で容易に入手できる。これらの表は、様々な方法で適合させることができる。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＮａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８：２９２を参照されたい。特定の宿主における発現のための特定の配列のコドン最適化のためのコンピュータアルゴリズム（例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅを参照のこと）もまた利用可能である。
「遺伝子座」という用語は、遺伝子（または重要な配列）、ＤＮＡ配列、ポリペプチドコード配列、または生物のゲノムの染色体上の位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）の特定の位置（ｌｏｃａｔｉｏｎ）を指す。例えば、「ＲＳ１遺伝子座」は、ＲＳ１遺伝子、ＲＳ１ ＤＮＡ配列、レチノスキシンをコードする配列、またはそのような配列が常駐すると同定されている生物のゲノムの染色体上のＲＳ１の位置の特定の位置を指し得る。「ＲＳ１遺伝子座」は、例えば、エンハンサー、プロモーター、５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、またはそれらの組み合わせを含む、ＲＳ１遺伝子の調節エレメントを含み得る。
「遺伝子」という用語は、自然に存在する場合、少なくとも１つのコーディング領域と少なくとも１つの非コーディング領域を含む可能性のある染色体内のＤＮＡ配列を指す。産物（例えば、非限定的に、ＲＮＡ産物および／またはポリペプチド産物）をコードする染色体中のＤＮＡ配列は、非コードイントロンで中断されたコード領域および５’端と３’端の両方のコード領域に隣接して位置する配列を含み得、遺伝子が全長のｍＲＮＡ（５’および３’の非翻訳配列を含む）に対応するようなる。追加的に、調節配列を含む他の非コード配列（例えば、非限定的に、プロモーター、エンハンサー、および転写因子結合部位）、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位、サイレンサー、絶縁配列、およびマトリックス結合領域も遺伝子に存在してもよい。これらの配列は、遺伝子のコード領域に近接（例えば、非限定的に、１０ｋｂ以内）してもよく、または離れていてもよく、それらは遺伝子の転写と翻訳のレベルまたは速度に影響を及ぼす。
「対立遺伝子」という用語は、遺伝子のバリアント形態を指す。いくつかの遺伝子は、染色体上の同じ位置、または遺伝子座に位置する様々な異なる形態を有する。二倍体生物は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各対は、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子がある場合はホモ接合として、および２つの対立遺伝子が異なる場合はヘテロ接合として記載されている。
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが特定のポリヌクレオチド配列のための適切な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始することを指示することができるＴＡＴＡボックスを通常含むＤＮＡの調節領域である。プロモーターは、転写開始速度に影響を及ぼす他の領域をさらに含み得る。本明細書に開示されるプロモーター配列は、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写を調節する。プロモーターは、本明細書に開示される１つ以上の細胞型（例えば、真核細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、げっ歯類細胞、多能性細胞、一細胞期胚、分化した細胞、またはそれらの組み合わせ）において活性であり得る。プロモーターは、例えば、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生的に調節されたプロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的または組織特異的プロモーター）であり得る。プロモーターの例は、例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２において見出すことができ、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
構成的プロモーターは、すべての組織またはすべての発生段階の特定の組織で活性があるものである。構成的プロモーターの例としては、ヒトサイトメガロウイルス最初期（ｈＣＭＶ）、マウスサイトメガロウイルス最初期（ｍＣＭＶ）、ヒト伸長因子１アルファ（ｈＥＦ１α）、マウス伸長因子１アルファ（ｍＥＦ１α）、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ニワトリベータアクチンハイブリッド（ＣＡＧまたはＣＢｈ）、ＳＶ４０初期、およびベータ２チューブリンプロモーターが挙げられる。
誘導性プロモーターの例としては、例えば、化学的に調節されたプロモーターおよび物理的に調節されたプロモーターが挙げられる。化学的に調節されるプロモーターとしては、例えば、アルコール調節プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター）、テトラサイクリン調節プロモーター（例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、ｔｅｔ－Ｏｎプロモーター、もしくはｔｅｔ－Ｏｆｆプロモーター）、ステロイド調節プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体のプロモーター、もしくはエクジソン受容体のプロモーター）、または金属調節プロモーター（例えば、金属タンパク質プロモーター）が挙げられる。物理的に調節されるプロモーターとしては、例えば、温度調節プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター）、および光調節プロモーター（例えば、光誘導性プロモーターまたは光抑制性プロモーター）が挙げられる。
組織特異的プロモーターは、例えば、ニューロン特異的プロモーター、グリア特異的プロモーター、筋細胞特異的プロモーター、心臓細胞特異的プロモーター、腎臓細胞特異的プロモーター、骨細胞特異的プロモーター、内皮細胞特異的プロモーター、または免疫細胞特異的プロモーター（例えば、Ｂ細胞プロモーターまたはＴ細胞プロモーター）であり得る。
発生的に調節されるプロモーターとしては、例えば、発生の胚段階の間のみ、または成体細胞においてのみ活性なプロモーターが挙げられる。
「作動可能な連結」または「作動可能に連結されている」とは、その両方の成分が正常に機能し、かつ成分の少なくとも１つが他の成分のうちの少なくとも１つに及ぶ機能を媒介し得る可能性を許すような、２つ以上の成分（例えば、プロモーターおよび別の配列エレメント）の並列を含む。例えば、プロモーターが、１つ以上の転写調節因子の存在または非存在に応じてコード配列の転写のレベルを制御する場合、そのプロモーターは、コード配列に作動可能に連結され得る。作動可能な連結は、そのような配列が相互に近接していること、またはトランスに作用する（例えば、調節配列が、コード配列の転写を制御するために離れて作用し得る）ことを含み得る。
核酸の「相補性」とは、核酸の一方の鎖のヌクレオチド配列が、その核酸塩基基の配向のために、反対側の核酸鎖の別の配列と水素結合を形成することを意味する。ＤＮＡの相補的塩基は通常ＡとＴ、およびＣとＧである。ＲＮＡでは通常ＣとＧ、およびＵとＡである。相補性は完全または実質的／十分であり得る。２つの核酸間の完全な相補性は、２つの核酸が二重鎖を形成できることを意味し、二重鎖のすべての塩基がワトソン－クリック対形成によって相補的塩基に結合する。「実質的」または「十分」に相補的とは、一方の鎖の配列が反対側の鎖の配列と完全におよび／または完全に相補的ではないが、２つの鎖の塩基間で十分な結合が起こり、ハイブリダイゼーション条件のセット（例えば、塩濃度と温度）で安定したハイブリッド複合体を形成することを意味する。このような条件は、配列と標準的な数学的計算を使用してハイブリダイズした鎖のＴｍ（融解温度）を予測するか、日常的な方法を使用してＴｍを経験的に決定することによって予測できる。Ｔｍは、２つの核酸鎖間に形成されるハイブリダイゼーション複合体の集団が５０％変性する（すなわち、二本鎖核酸分子の集団が一本鎖に半分解離する）温度を含む。Ｔｍより低い温度では、ハイブリダイゼーション複合体の形成が有利であるが、Ｔｍより高い温度では、ハイブリダイゼーション複合体中の鎖の融解または分離が有利である。他の既知のＴｍ計算は核酸の構造的特徴を考慮するが、Ｔｍは、例えば、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（Ｇ＋Ｃ％）を使用することにより、１Ｍ ＮａＣｌ水溶液中の既知のＧ＋Ｃ含有量を有する核酸について推定され得る。
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含むことを要求するが、塩基間のミスマッチも可能である。２つの核酸間のハイブリダイゼーションに適切な条件は、周知の変数である、核酸の長さおよび相補性の度合いに依存する。２つの核酸配列間の相補性の度合いがより大きいと、それらの配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の値がより大きくなる。短い区間の相補性（例えば、３５以下、３０以下、２５以下、２２以下、２０以下、または１８以下のヌクレオチドにわたる相補性）を有する核酸間のハイブリダイゼーションについて、ミスマッチの位置は、重要になる（上述のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．の１１．７～１１．８を参照）。典型的には、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の例示的な最小の長さは、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、および少なくとも約３０ヌクレオチドを含む。さらに、温度および洗浄溶液の塩濃度は、相補性の領域の長さおよび相補性の度合いなどの要素に従って、必要に応じて調整され得る。
ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズするべきその標的核酸の配列と１００％相補的である必要はない。さらに、ポリヌクレオチドは、１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズし、介在するセグメント、または隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しない（例えば、ループ構造、またはヘアピン構造）ようになってもよい。ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、それらが標的とされている標的核酸配列内の標的領域に対する少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の配列相補性を含み得る。例えば、２０ヌクレオチドのうち１８ヌクレオチドが標的領域に相補的であり、したがって特異的にハイブリダイズするであろうｇＲＮＡは、９０％の相補性を表すであろう。この例において、残りの非相補的ヌクレオチドは、相補的ヌクレオチドとクラスターを形成するか、散在していてもよく、互いに、または相補的ヌクレオチドと連続的である必要はない。
核酸内の特定の区間の核酸配列間の相補性パーセントは、ＢＬＡＳＴプログラム（基本的なローカルアラインメント検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６）またはＧａｐ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）を使用して（デフォルト設定を使用し、これは（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２－４８９）のアルゴリズムを使用する）、日常的に決定できる。
本明細書で提供される方法および組成物は、様々な異なる成分を使用する。記載全体の一部の成分には、活性バリアントおよび断片を有し得る。このような成分には、例えば、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびガイドＲＮＡが含まれる。これらの成分のそれぞれの生物学的活性は、本明細書の他の場所に記載されている。「機能性」という用語は、生物学的活性または機能を示すタンパク質または核酸（またはその断片、もしくはバリアント）の生来の能力を指す。そのような生物学的活性または機能には、例えば、Ｃａｓタンパク質がガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡ配列に結合する能力が含まれ得る。機能的断片またはバリアントの生物学的機能は、元の分子と比較して同じであるか、または実際に変更され得る（例えば、それらの特異性または選択性または有効性に関して）が、分子の基本的な生物学的機能を保持する。
「バリアント」という用語は、集団で最も一般的な配列とは異なるヌクレオチド配列（例えば、１ヌクレオチド）、または集団で最も一般的な配列とは異なるタンパク質配列（例えば、１アミノ酸）を指す。
「断片」という用語は、タンパク質に言及する場合、全長タンパク質よりも短いか、または少ないアミノ酸を有するタンパク質を意味する。「断片」という用語は、核酸に言及する場合、全長の核酸よりも短いか、または少ないヌクレオチドを有する核酸を意味する。断片は、例えば、タンパク質断片を指す場合、Ｎ末端断片（すなわち、タンパク質のＣ末端の一部の除去）、Ｃ末端断片（すなわち、タンパク質のＮ末端の一部の除去）、または内部断片（すなわち、タンパク質の内部の一部の除去）であり得る。
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウで最大の一致のためにアラインさせる場合、同じである２つの配列の残基を指す。タンパク質に関して、配列同一性のパーセンテージを使用する場合、同一ではない残基位置は多くの場合に、保存的アミノ酸置換によって異なり、その保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基は同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されており、したがって、分子の機能特性を変化させない。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性パーセントを、置換の保存的性質について補正するために、上方に調整してもよい。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われている。この調整を行う手段は、周知である。典型的には、これは、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングして、それによって、配列同一性パーセンテージを増加させることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存的置換が０のスコアを与えられる場合に、保存的置換は、０～１のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実行されるように計算される。
「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインされた配列（完全にマッチする残基の数が最大）を比較することによって決定される値を含み、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのための（付加また欠失を含まない）参照配列と比較した場合に、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に発生する位置の数を決定して一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割ること、および結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。別段の定めがない限り（例えば、短い方の配列が、連結された非相同配列を含む）、比較ウィンドウは、比較される２つの配列のうちの短い方の完全長である。
別段の記載がない限り、配列同一性／類似性の値は、次のパラメータ：５０のＧＡＰ重量および３の長さ重量、およびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用するヌクレオチド配列の同一性％および類似性％；８のＧＡＰ重量および２の長さ重量、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用するアミノ酸配列の同一性％および類似性％；またはその任意の同等のプログラムを使用し、ＧＡＰバージョン１０を使用して得られた値を含む。「同等のプログラム」は、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰバージョン１０によって生成された対応するアラインメントと比較した場合、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の一致および同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを生成する任意の配列比較プログラムを含む。
「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列中に通常存在するアミノ酸の、類似のサイズ、電荷、または極性の、異なるアミノ酸との置換を指す。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、またはロイシンなどの非極性（疎水性）残基の、別の非極性残基との置換が含まれる。同様に、保存的置換の例には、アルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、またはグリシンとセリンとの間などの、１つの極性（親水性）残基の別のものとの置換が含まれる。追加的に、リジン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの塩基性残基から別のものへの置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などのある酸性残基から別の酸性残基への置換は、保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例には、非極性（疎水性）アミノ酸残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、またはメチオニンから極性（親水性）残基、例えば、システイン、グルタミン、グルタミン酸、またはリジンへの、および／または極性残基から非極性残基への置換が含まれる。典型的なアミノ酸の分類は、以下の表１に要約されている。
Figure 2022553573000002
「相同」配列（例えば、核酸配列）は、例えば、既知の参照配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるような、既知の参照配列と同一であるか、または実質的に同様である配列を含む。相同配列は、例えば、オルソログ配列およびパラロガス配列を含み得る。例えば、相同遺伝子は典型的には、種分化事象（オルソログ遺伝子）または遺伝子重複事象（パラロガス遺伝子）のいずれかを介して、共通の祖先ＤＮＡ配列に由来する。「オルソログ」遺伝子には、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した様々な種の遺伝子が含まれる。オルソログは典型的には、進化の過程で同じ機能を保持する。「パラロガス」遺伝子には、ゲノム内の重複によって関連する遺伝子が含まれる。パラログは、進化の過程で新しい機能を進化させることができる。
「インビトロ」という用語は、人工環境、および人工環境（例えば、試験管または単離された細胞もしくは細胞株）内で生じるプロセスまたは反応を含む。「インビボ」という用語は、天然環境（例えば、細胞または生物または身体）、および天然環境内で生じるプロセスまたは反応を含む。「エクスビボ」という用語は、個体の身体から取り出された細胞、およびそのような細胞内で起こるプロセスまたは反応を含む。
二本鎖切断（ＤＳＢ）に応答した修復は、主に２つの保存されたＤＮＡ修復経路である相同組換え（ＨＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して生じる。Ｋａｓｐａｒｅｋ＆Ｈｕｍｐｈｒｅｙ（２０１１）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ＆Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２：８８６－８９７を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。同様に、外因性ドナー核酸によって媒介された標的核酸の修復は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝的情報の交換の任意のプロセスを含み得る。
「組換え」という用語は、２つのポリヌクレオチド間で遺伝的情報を交換する任意のプロセスを含み、任意のメカニズムによって起こり得る。組換えは、相同性指向修復（ＨＤＲ）または相同組換え（ＨＲ）を介して起こり得る。ＨＤＲまたはＨＲには、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし得る核酸修復の形式が含まれ、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）の修復のテンプレートとして「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝的情報の伝達をもたらす。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、そのような伝達は、壊れた標的とドナーとの間に形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／またはドナーが標的の一部となる遺伝的情報を再合成するために使用される合成依存性鎖アニーリング、および／または関連するプロセスを含み得る。いくつかの場合では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が標的ＤＮＡに組み込まれる。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５３：９１０－９１８、Ｍａｎｄａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬＯＳ ＯＮＥ ７：ｅ４５７６８：１－９、およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０－５３２を参照されたく、これらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、相同テンプレートを必要とせずに、切断末端を互いにまたは外因性配列への直接ライゲーションによる、核酸における二本鎖切断の修復を含む。ＮＨＥＪによる非隣接配列のライゲーションは、多くの場合、二本鎖切断の部位の近くで欠失、挿入、または転座をもたらし得る。例えば、ＮＨＥＪはまた、切断末端を外因性ドナー核酸の末端と直接ライゲーションすることにより、外因性ドナー核酸の標的化組み込みをもたらすことができる（すなわち、ＮＨＥＪベースの捕捉）。そのようなＮＨＥＪ媒介標的化組み込みは、相同性指向修復（ＨＤＲ）経路が容易に使用することができない場合（例えば、非分裂細胞、一次細胞、および相同性に基づくＤＮＡ修復を不十分に行う細胞）、外因性ドナー核酸の挿入に好ましい場合がある。加えて、相同性指向修復とは対照的に、切断部位に隣接する配列同一性の大きな領域に関する知識は必要なく、これは、ゲノム配列の知識が限られているゲノムを有する生物への標的化挿入を試みるときに有益であり得る。組み込みは、外因性ドナー核酸と切断されたゲノム配列との間の平滑末端のライゲーションを介して、または切断されたゲノム配列においてヌクレアーゼ剤によって生成されたものに適合するオーバーハングに隣接する外因性ドナー核酸を使用する粘着末端（すなわち、５’または３’オーバーハングを有する）のライゲーションを介して進行することができる。例えば、ＵＳ２０１１／０２０７２２、ＷＯ２０１４／０３３６４４、ＷＯ２０１４／０８９２９０、およびＭａｒｅｓｃａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２３（３）：５３９－５４６を参照されたく、これらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。平滑末端がライゲーションされている場合、断片結合に必要なマイクロホモロジーの生成領域のために、標的および／またはドナーの切除が必要になる場合があり、これにより、標的配列に望ましくない改変が生じ得る。
１つ以上の列挙された要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含み得る。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は、タンパク質を単独で、または他の成分との組み合わせで含み得る。「から本質的になる」という移行句は、請求項の範囲が、特許請求の範囲に記載された特定の要素、および特許請求された発明の基本的かつ新規の特性に実質的に影響をしない要素を包含すると解釈されることを意味する。したがって、本発明の請求項で使用される場合の「から本質的になる」という用語は、「含む」と同等であると解釈されることを意図するものではない。
「任意選択的の」または「任意選択で」は、引き続いて記載された事象または状況が起こっても起こらなくてもよく、および説明が、当該事象または状況が起こる場合の例およびそれが起こらない場合の例を含むことを意味する。
値の範囲の指定は、その範囲内の、またはその範囲を定義するすべての整数、およびその範囲内の整数によって定義されるすべての部分範囲を含む。
文脈から特に明らかでない限り、「約」という用語は記載された値の±５である値を包含する。
「および／または」という用語は、関連する列挙された項目の１つ以上のありとあらゆる可能な組み合わせ、ならびに代替物（「または」）で解釈されるときの組み合わせの欠如を指し、包含する。
「または」という用語は、特定のリストの任意の１つのメンバーを指し、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。
冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の単数形は、文脈が別段に明確に規定していない限り、複数形の言及を含む。例えば、「タンパク質」または「少なくとも１つのタンパク質」という用語は、それらの混合物を含む複数のタンパク質を含み得る。
統計的に有意なとは、ｐ≦０．０５を意味する。
（発明を実施するための形態）
Ｉ．概要
Ｘ連鎖性若年網膜分離症（ＸＬＲＳ）は、レチノスキシン（ＲＳ１）の変異によって引き起こされる若年性黄斑変性症である。ＲＳ１遺伝子は、ホモオリゴマー複合体として分泌される２４ｋＤａのジスコイジンドメイン含有タンパク質をコードする。ＲＳ１の遺伝子変異は、機能しないタンパク質またはタンパク質分泌の欠如のいずれかを引き起こし、網膜層内で分裂または分裂を引き起こし、早期の進行性の視力喪失を引き起こす。ＲＳ１遺伝子の２００以上の異なる変異がＸＬＲＳを引き起こすことが知られている。疾患の原因となる変異の４０パーセントは、完全長のレチノスキシンタンパク質の欠如をもたらすと予測されるナンセンスまたはフレームシフト変異である。病気の原因となる変異の５０パーセントは、完全長の変異体タンパク質の産生を可能にするミスセンス変異である。これらのほとんどはジスコイジンドメインにあり、誤って折りたたまれたタンパク質がＥＲに保持される。
ＸＬＲＳは、レチノスキシン機能の喪失によって引き起こされる劣性疾患であるため、遺伝子置換療法は、この疾患の潜在的な治療法である。さらに、レチノスキシンは細胞外タンパク質として機能するため、有益な治療は必ずしも置換遺伝子を発現するトランスフェクト細胞に限定されるわけではなく、発現部位から分泌タンパク質が広がるため、より広い領域を包含することができる。
内因性ＲＳ１遺伝子座などの標的ゲノム遺伝子座へのレチノスキシンコード配列の挿入および／またはレチノスキシンコード配列の発現を可能にする核酸構築物および組成物が本明細書で提供される。核酸構築物および組成物は、標的ゲノム遺伝子座への組み込みおよび／もしくは細胞内での発現のための方法、またはＸ連鎖性若年網膜分離症を治療する方法において使用することができる。ヌクレアーゼ剤（例えば、内因性ＲＳ１遺伝子座を標的とする）またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸も提供され、内因性ＲＳ１遺伝子座などの標的ゲノム遺伝子座への核酸構築物の組み込みを容易にする。
ＲＳ１のイントロン１などの内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、組み込み部位の下流の内因性ＲＳ１遺伝子の転写を妨げることができる。内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、内因性レチノスキシンタンパク質（例えば、ＸＬＲＳを引き起こす変異を有する内因性レチノスキシンタンパク質）の発現を低減または排除し、それを核酸構築物によってコードされるレチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアント（例えば、ＸＬＲＳを引き起こす変異のないレチノスキシン）の発現で置き換えることができる。一例では、内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、内因性レチノスキシンタンパク質の発現を低減させる。別の例では、内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、内因性レチノスキシンタンパク質の発現を排除する。このように、核酸構築物の組み込みは、内因性ＲＳ１遺伝子（例えば、Ｒ１４１ＣなどのＸＬＲＳに関連するまたはＸＬＲＳを引き起こす１つ以上の変異を含む内因性ＲＳ１遺伝子）を同時にノックアウトし、置換レチノスキシンコード配列（例えば、ＸＬＲＳに関連する、またはＸＬＲＳを引き起こす変異を含まない置換レチノスキシンコード配列）をノックインすることができる。
ＩＩ．標的ゲノム遺伝子座への組み込みおよび標的ゲノム遺伝子座からの発現のためのレチノスキシンコード配列を含む核酸構築物
標的ゲノム遺伝子座への組み込みおよび標的ゲノム遺伝子座からの発現のための、レチノスキシンコード配列（すなわち、レチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードする）を含む核酸構築物（すなわち、外因性ドナー核酸）が本明細書で提供される。核酸構築物は、単離された核酸構築物であり得る。
レチノスキシン（Ｘ連鎖性若年網膜分離症タンパク質）は、網膜の正常な構造および機能に必要なタンパク質である。例示的なヒトレチノスキシンタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ１５５３７が割り当てられ、配列番号２に示される配列を有する。他の種のオルソログも知られている。例えば、例示的なマウスレチノスキシンタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９Ｚ１Ｌ４が割り当てられ、配列番号１に示される配列を有する。レチノスキシンは、ＲＳ１遺伝子（ＸＬＲＳ１としても知られている）によってコードされる。ヒトＲＳ１遺伝子には、５つのイントロンが間隔を置いて配置された６つの別個のエキソンが含まれている。ヒトＲＳ１遺伝子にはＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ ６２４７が割り当てられている。マウスＲｓ１遺伝子にはＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ ２０１４７が割り当てられている。ヒトＲＳ１の例示的なコード配列は、ＣＣＤＳ ＩＤ ＣＣＤＳ１４１８７．１が割り当てられ、配列番号６に示されている。レチノスキシンの変異は、黄斑病変および網膜の表層の分裂を特徴とする硝子体網膜ジストロフィーであるＸ連鎖性若年網膜分離症（ＸＬＲＳ）を引き起こす。本明細書に開示される核酸構築物は、本明細書の他の場所でより詳細に記載されるように、ＸＬＲＳを処理するための方法において使用することができる。
ＲＳ１の機能ドメインは、シグナルペプチド（ＳＰ）、ＲＳ１、およびジスコイジンドメインである。シグナル配列は、小胞体（合成部位）から原形質膜の外部リーフレットへの新生ＲＳ１の移行を誘導し、その間に、シグナル配列は、シグナルペプチダーゼによって切断され、特徴的なＲＳ１および高度に保存されたジスコイジンドメインを有する成熟タンパク質を生成する。ＲＳ１シグナル配列の異なるサブドメインは、転座を媒介するアミノ末端の正に帯電したＮ領域、標的および膜挿入に必要な疎水性コア（Ｈ）、ならびにシグナルペプチダーゼによる認識および切断の部位を決定する極性「Ｃ」領域である。ＲＳ１は、網膜光受容体および双極細胞によって顕著に発現され、松果体にも存在する。
本明細書に開示される核酸構築物に含まれるレチノスキシンコード配列は、全長レチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントのコード配列であり得る。一例では、核酸構築物に含まれるレチノスキシンコード配列は、ＲＳ１の第１のエキソンを含まない。例えば、核酸構築物に含まれるレチノスキシンコード配列は、ＲＳ１遺伝子のエキソン２～６またはそのバリアントもしくは縮重バリアントを含むことができる。一例として、ＲＳ１遺伝子のエキソン２～６を含むｃＤＮＡ断片は、配列番号８に示される配列を含むことができる。６４個のコドンの各々は、１つのアミノ酸または停止シグナルにのみ特異的であるが、単一のアミノ酸が２つ以上のコドンによってコードされている可能性があるため、遺伝コードは縮重している（すなわち、縮退している）。遺伝子の縮重バリアントは同じタンパク質をコードするが、少なくとも１つの異なるコドンを使用する。核酸構築物中のレチノスキシンコード配列は、介在するイントロンなしで相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含むことができるか、または核酸構築物は、レチノスキシンコード配列中のエキソンを分離する１つ以上のイントロンを含むことができる。例えば、核酸構築物は、エキソンおよびイントロンの両方を有するＲＳ１ゲノム遺伝子座に対応する配列を含むことができる。
レチノスキシンコード配列は、任意の生物からのものであり得る。例えば、レチノスキシンコード配列は、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、げっ歯類、マウス、ラット、またはヒトもしくはそれらのバリアントであり得る。代替的に、レチノスキシンコード配列は、キメラであり得る（例えば、一部はマウスであり、一部はヒトである）。具体的な例では、レチノスキシンコード配列は、ヒトレチノスキシンコード配列である。
レチノスキシンコード配列は、特定の細胞または生物におけるレチノスキシンへの効率的な翻訳のためにコドン最適化され得る。一例として、ヒトＲＳ１のエキソン２～６のコドン最適化バージョンは、配列番号９に示される。例えば、核酸は、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞においてより頻度高く使用される代替コドンへと修飾することができる。
レチノスキシンコード配列は、野生型レチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードすることができる。同様に、レチノスキシンコード配列は、野生型コード配列またはそのバリアントであり得る。一例では、レチノスキシンコード配列は、Ｘ連鎖性若年網膜分離症に関連する、またはそれを引き起こす変異を含まない。代替的に、レチノスキシンコード配列は、Ｘ連鎖性若年網膜分離症（例えば、Ｒ１４１Ｃ）に関連する、またはそれを引き起こす１つ以上の変異を含むことができる。
核酸構築物は、１つ以上のＲＳ１イントロンまたはその断片もしくはバリアント（例えば、１つ以上のヒトＲＳ１イントロンまたはその断片もしくはバリアント）をさらに含むことができる。例えば、核酸構築物は、ＲＳ１イントロン１またはその断片もしくはバリアントを含むことができる。ＲＳ１イントロンまたはその断片もしくはバリアントは、スプライスアクセプター部位またはその断片を含むことができる。ＲＳ１イントロン１の断片の例は、配列番号１５および１６に示されている。１つの具体的な例では、核酸構築物は、ＲＳ１イントロン１、またはＲＳ１のエキソン２～６の５’に位置するその断片もしくはバリアント（例えば、ＲＳ１のエキソン２～６を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるｃＤＮＡ配列の上流）を含むことができる。
核酸構築物は、１つ以上のスプライスアクセプター部位をさらに含むことができる。スプライスアクセプター部位を含む配列（例えば、イントロン配列）およびその逆相補体の例は、配列番号１５～２１に示されている。例えば、核酸構築物は、レチノスキシンコード配列の５’に位置するスプライスアクセプター部位を含むことができる。具体的な例では、レチノスキシンコード配列は、ＲＳ１のエキソン２～６（例えば、ヒトＲＳ１のエキソン２～６）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、スプライスアクセプター部位は、ＲＳ１エキソン１をＲＳ１エキソン２にスプライシングするのに使用されるＲＳ１（例えば、ヒトＲＳ１）のイントロン１からのスプライスアクセプター部位である。スプライスアクセプター部位という用語は、スプライシング機構によって認識および結合され得る３’イントロン／エキソン境界における核酸配列を指す。
本明細書に開示される核酸構築物はまた、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメントなどの転写後調節エレメントを含むことができる。
核酸構築物は、１つ以上のポリアデニル化シグナル配列をさらに含むことができる。ポリアデニル化シグナル配列、またはポリアデニル化シグナル配列を含む配列、またはその逆相補体の例は、配列番号２２～２５に示されている。例えば、核酸構築物は、レチノスキシンコード配列の３’に位置するポリアデニル化シグナル配列を含むことができる。任意の好適なポリアデニル化シグナル配列を使用することができる。ポリアデニル化シグナル配列という用語は、転写の終結およびｍＲＮＡ転写物へのポリＡテールの付加を指示する任意の配列を指す。真核生物では、転写ターミネーターはタンパク質因子によって認識され、終結の後に、ポリ（Ａ）ポリメラーゼの存在下でｍＲＮＡ転写物にポリ（Ａ）テールを追加するプロセスであるポリアデニル化が続く。哺乳動物のポリ（Ａ）シグナルは、典型的には、約４５ヌクレオチド長のコア配列で構成されており、切断とポリアデニル化の効率を高めるのに役立つ多様な補助配列が隣接している場合がある。コア配列は、ポリＡ認識モチーフまたはポリＡ認識配列と呼ばれ、切断およびポリアデニル化特異性因子（ＣＰＳＦ）によって認識される、ｍＲＮＡ内の高度に保存された上流要素（ＡＡＴＡＡＡまたはＡＡＵＡＡＡ）、ならびに定義が不十分であり、切断刺激因子（ＣｓｔＦ）によって結合される下流領域（ＵまたはＧとＵが豊富）で構成される。使用できる転写ターミネーターの例としては、例えば、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）ポリアデニル化シグナル、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）後期ポリアデニル化シグナル、ウサギベータグロビンポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）ポリアデニル化シグナル、ＡＯＸ１転写終結配列、ＣＹＣ１転写終結配列、または真核細胞における遺伝子発現の調節に適していることが知られている任意の転写終結配列が挙げられる。
核酸構築物はまた、レチノスキシンコード配列の上流にポリアデニル化シグナル配列を含むことができる。レチノスキシンコード配列の上流のポリアデニル化シグナル配列は、部位特異的リコンビナーゼによって認識されるリコンビナーゼ認識部位に隣接することができる。いくつかの構築物では、リコンビナーゼ認識部位はまた、例えば、薬剤耐性タンパク質のコード配列を含む選択カセットに隣接する。いくつかの構築物では、リコンビナーゼ認識部位は、選択カセットに隣接しない。ポリアデニル化シグナル配列は、コード配列によってコードされるタンパク質またはＲＮＡの転写および発現を妨げる。しかしながら、部位特異的リコンビナーゼに曝露すると、ポリアデニル化シグナル配列が切除され、タンパク質またはＲＮＡを発現させることができる。
そのような構成は、ポリアデニル化シグナル配列が組織特異的または発生段階特異的な方法で切除される場合、レチノスキシンコード配列を含む動物における組織特異的発現または発生段階特異的発現を可能にし得る。組織特異的または発生段階特異的な方法でのポリアデニル化シグナル配列の切除は、核酸構築物を含む動物が、組織特異的または発生段階特異的プロモーターに作動可能に連結された部位特異的リコンビナーゼのコード配列をさらに含む場合に達成され得る。次いで、ポリアデニル化シグナル配列は、それらの組織またはそれらの発生段階でのみ切除され、組織特異的発現または発生段階特異的発現を可能にする。一例では、核酸構築物によってコードされるレチノスキシンまたはその断片もしくはバリアントは、眼特異的または網膜細胞特異的な方法で発現され得る。
部位特異的リコンビナーゼには、２つの組換え部位が単一の核酸内または別個の核酸上で物理的に分離されているリコンビナーゼ認識部位間の組換えを促進することができる酵素が含まれる。リコンビナーゼの例には、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、およびＤｒｅリコンビナーゼが含まれる。Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子の一例はＣｒｅｉであり、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエキソンがイントロンによって分離され、原核細胞での発現を妨げる。そのようなリコンビナーゼは、核への局在化を促進するための核局在化シグナルをさらに含むことができる（例えば、ＮＬＳ－Ｃｒｅｉ）。リコンビナーゼ認識部位には、部位特異的リコンビナーゼによって認識され、組換え事象の基質として機能することができるヌクレオチド配列が含まれる。リコンビナーゼ認識部位の例には、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ｒｏｘ、ならびにｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、およびｌｏｘ５１７１などのｌｏｘ部位が含まれる。
核酸構築物は、レチノスキシンコード配列に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含むことができる。核酸構築物中のレチノスキシンコード配列は、動物内でのインビボまたは単離された細胞内でのインビトロでの発現のための任意の好適なプロモーターに作動可能に連結することができる。プロモーターは、構成的に活性なプロモーター（例えば、ＣＡＧプロモーターもしくはＵ６プロモーター）、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生的に調節されたプロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的または組織特異的プロモーター）であり得る。そのようなプロモーターはよく知られており、本明細書の他の場所で議論されている。発現構築物において使用することができるプロモーターには、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、眼細胞、網膜細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、または接合体のうちの１つ以上において活性なプロモーターが含まれる。具体的な例では、プロモーターは、眼細胞または網膜細胞で活性である。
代替的に、いくつかの核酸構築物は、レチノスキシンコード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含まない（例えば、いくつかの核酸構築物は、プロモーターのない構築物である）。そのような核酸構築物は、例えば、標的ゲノム遺伝子座への組み込み時に、標的ゲノム遺伝子座の内因性プロモーター（例えば、内因性ＲＳ１遺伝子座の内因性ＲＳ１プロモーター）に作動可能に連結されるように設計することができる。
セーフハーバー遺伝子座（セーフハーバー遺伝子）または内因性ＲＳ１遺伝子座など、遺伝子を発現できる任意の標的ゲノム遺伝子座を使用することができる。組み込まれた外因性ＤＮＡと宿主ゲノムとの間の相互作用は、組み込みの信頼性および安全性を制限する可能性があり、標的遺伝子改変によるものではなく、周囲の内因性遺伝子に対する組み込みの意図しない影響による明白な表現型効果をもたらす可能性がある。例えば、ランダムに挿入された導入遺伝子は、位置効果およびサイレンシングの影響を受けやすく、その発現が信頼できず、予測できないものになる可能性がある。同様に、外因性ＤＮＡの染色体遺伝子座への組み込みは、周囲の内因性遺伝子およびクロマチンに影響を及ぼし、それによって細胞の挙動および表現型を変化させる可能性がある。セーフハーバー遺伝子座には、導入遺伝子または他の外因性核酸インサートが、細胞の挙動または表現型を明白に変えることなく（すなわち、宿主細胞に有害な影響を与えることなく）、目的のすべての組織で安定かつ確実に発現できる染色体遺伝子座が含まれる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ １２：５１－５８を参照されたい。例えば、セーフハーバー遺伝子座は、挿入された遺伝子配列の発現が、隣接する遺伝子からのリードスルー発現によって乱されない遺伝子座であり得る。例えば、セーフハーバー遺伝子座には、内因性遺伝子の構造または発現に悪影響を及ぼすことなく、外因性ＤＮＡが予測可能な方法で組み込まれて機能できる染色体遺伝子座を含めることができる。セーフハーバー遺伝子座には、遺伝子外領域または遺伝子内領域、例えば、必須ではない、不要な、または明白な表現型の結果なしに破壊できる遺伝子内の遺伝子座を含めることができる。
このようなセーフハーバー遺伝子座は、すべての組織でオープンクロマチン構成を提供でき、胚発生中および成体で遍在的に発現することができる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：３７８９－３７９４を参照されたい。加えて、セーフハーバー遺伝子座を高効率で標的化することができ、セーフハーバー遺伝子座を明白な表現型を伴わずに破壊することができる。セーフハーバー遺伝子座の例には、アルブミン、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１、およびＲｏｓａ２６が含まれる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８８８，１２１号、同第７，９７２，８５４号、同第７，９１４，７９６号、同第７，９５１，９２５号、同第８，１１０，３７９号、同第８，４０９，８６１号、同第８，５８６，５２６号、ならびに米国特許公開第２００３／０２３２４１０号、同第２００５／０２０８４８９号、同第２００５／００２６１５７号、同第２００６／００６３２３１号、同第２００８／０１５９９９６号、同第２０１０／００２１８２６４号、同第２０１２／００１７２９０号、同第２０１１／０２６５１９８号、同第２０１３／０１３７１０４号、同第２０１３／０１２２５９１号、同第２０１３／０１７７９８３号、同第２０１３／０１７７９６０号、および同第２０１３／０１２２５９１号を参照されたい。
標的ゲノム遺伝子座はまた、ＸＬＲＳに関連するまたはそれを引き起こす１つ以上の変異を含む内因性ＲＳ１遺伝子座などの内因性ＲＳ１遺伝子座であり得る（例えば、コードされたレチノスキシンタンパク質におけるＲ１４１Ｃ変異）。内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、場合によっては、組み込み部位の下流の内因性ＲＳ１遺伝子の転写を妨げる可能性がある。内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、内因性レチノスキシンタンパク質の発現を低減または排除し、それを、核酸構築物によってコードされるレチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントの発現で置き換えることができる。一例では、内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、内因性レチノスキシンタンパク質の発現を低減させる。別の例では、内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、内因性レチノスキシンタンパク質の発現を排除する。このように、核酸構築物の組み込みは、内因性ＲＳ１遺伝子（例えば、ＸＬＲＳに関連するまたはＸＬＲＳを引き起こす１つ以上の変異を含む内因性ＲＳ１遺伝子）を同時にノックアウトし、置換レチノスキシンコード配列（例えば、ＸＬＲＳに関連する、またはＸＬＲＳを引き起こす変異を含まない置換レチノスキシンコード配列）をノックインすることができる。
核酸構築物は、標的ゲノム遺伝子座の任意の部分に組み込むことができる。例えば、核酸構築物は、標的ゲノム遺伝子座のイントロンもしくはエキソンに挿入することができ、または標的ゲノム遺伝子座の１つ以上のイントロンおよび／もしくはエキソンを置き換えることができる。具体的な例では、核酸構築物は、標的ゲノム遺伝子座の第１のイントロン（例えば、ＲＳ１イントロン１）などの、標的ゲノム遺伝子座のイントロンに組み込むことができる。標的ゲノム遺伝子座に組み込まれた発現カセットは、標的ゲノム遺伝子座で内因性プロモーター（例えば、内因性ＲＳ１プロモーター）に作動可能に連結することができ、または標的ゲノム遺伝子座に対して異種である外因性プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）に作動可能に連結することができる。
核酸構築物は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むことができ、それらは一本鎖または二本鎖であり得、それらは直線状または環状の形態であり得る。例えば、核酸構築物は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であり得る。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｏｓｈｉｍｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．７：１０４３１を参照されたい。核酸構築物は、ネイキッド核酸であり得るか、またはＡＡＶベクターなどのベクターによって送達され得る。具体的な例では、核酸構築物は、ＡＡＶを介して送達することができ、非相同末端結合によって内因性ＲＳ１遺伝子座に挿入することができる（例えば、核酸構築物は、ホモロジーアームを含まないものであってよい）。直線状の形態で導入された場合、核酸構築物の末端（例えば、ドナー配列）は、周知の方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護することができる。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基を直線状分子の３’末端に付加することができ、および／または自己相補的オリゴヌクレオチドを一方または両方の末端に連結することができる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：４９５９－４９６３およびＮｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６－８８９を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するための追加の方法としては、末端アミノ基の付加、ならびに例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、およびＯ－メチルリボースまたはデオキシリボース残基などの修飾ヌクレオチド間結合の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な核酸構築物は、約５０ヌクレオチド～約５ｋｂの長さ、または約５０ヌクレオチド～約３ｋｂの長さである。代替的に、核酸構築物は、約１ｋｂ～約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ～約２ｋｂ、約２ｋｂ～約２．５ｋｂ、約２．５ｋｂ～約３ｋｂ、約３ｋｂ～約３．５ｋｂ、約３．５ｋｂ～約４ｋｂ、約４ｋｂ～約４．５ｋｂ、または約４．５ｋｂ～約５ｋｂの長さであり得る。代替的に、核酸構築物は、例えば、５ｋｂ、４．５ｋｂ、４ｋｂ、３．５ｋｂ、３ｋｂ、または２．５ｋｂ以下の長さであり得る。
標的ゲノム遺伝子座での核酸構築物の組み込みは、標的ゲノム遺伝子座への目的の核酸配列の付加、または標的ゲノム遺伝子座での目的の核酸配列の置換（すなわち、欠失および挿入）をもたらし得る。いくつかの核酸構築物は、標的ゲノム遺伝子座での対応する欠失なしに、標的ゲノム遺伝子座での核酸構築物の挿入のために設計されている。他の核酸構築物は、標的ゲノム遺伝子座で目的の核酸配列を欠失し、それを核酸構築物で置き換えるように設計されている。
欠失および／または置換される標的ゲノム遺伝子座における核酸構築物または対応する核酸は、様々な長さであり得る。欠失および／または置換される標的ゲノム遺伝子座における例示的な核酸構築物または対応する核酸は、約１ヌクレオチド～約５ｋｂの長さであるか、または約１ヌクレオチド～約３ｋｂヌクレオチドの長さである。例えば、欠失および／または置換される標的ゲノム遺伝子座における核酸構築物または対応する核酸は、約１～約１００、約１００～約２００、約２００～約３００、約３００～約４００、約４００～約５００、約５００～約６００、約６００～約７００、約７００～約８００、約８００～約９００、または約９００～約１，０００ヌクレオチドの長さであり得る。同様に、欠失および／または置換される標的ゲノム遺伝子座における核酸構築物または対応する核酸は、約１ｋｂ～１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ～約２ｋｂ、約２ｋｂ～約２．５ｋｂ、約２．５ｋｂ～約３ｋｂ、約３ｋｂ～約３．５ｋｂ、約３．５ｋｂ～約４ｋｂ、約４ｋｂ～約４．５ｋｂ、約４．５ｋｂ～約５ｋｂ、またはそれ以上の長さであり得る。
欠失および／または置換される標的ゲノム遺伝子座の核酸構築物または対応する核酸は、エキソンなどのコード領域、イントロン、非翻訳領域、もしくは調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、もしくは転写リプレッサー結合要素）などの非コード領域、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
核酸構築物は、場合によっては、以下の末端構造：ヘアピン、ループ、末端逆位配列（ＩＴＲ）、またはトロイドのうちの１つ以上を含む。例えば、核酸構築物は、ＩＴＲを含むことができる。
いくつかのそのような核酸構築物は、Ｃａｓタンパク質などのヌクレアーゼ剤による標的ゲノム遺伝子座の切断またはニッキングに続いて、標的ゲノム遺伝子座（例えば、内因性ＲＳ１遺伝子座に限定されない）を修飾することができる。核酸構築物は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介したライゲーションまたは相同性指向の修復を介して、切断またはニックの入った遺伝子座を修復するように設計することができる。任意選択で、核酸構築物による修復は、ヌクレアーゼ標的配列を除去または破壊し、その結果、標的化された対立遺伝子は、ヌクレアーゼ剤によって再標的化され得ない。
いくつかの核酸構築物は、ホモロジーアームを含む。ホモロジーアームは、対称的（例えば、各４０ヌクレオチドまたは各６０クレオチド長）であってもよく、またはそれらは非対称的（例えば、３６ヌクレオチド長である１つのホモロジーアームまたは相補的領域、および９１ヌクレオチド長である１つのホモロジーアームまたは相補的領域）であり得る。他の核酸構築物は、ホモロジーアームを含まない。
本明細書に開示されるいくつかの核酸構築物は、ホモロジーアームを含む。ホモロジーアームは、レチノスキシンコード配列に隣接することができる。参照を容易にするために、ホモロジーアームは、本明細書では５’および３’（すなわち、上流および下流）ホモロジーアームと呼ばれる。この用語は、核酸構築物内の核酸インサート（例えば、レチノスキシンコード配列）に対するホモロジーアームの相対的位置に関連している。５’および３’ホモロジーアームは、標的ゲノム遺伝子座内の領域に対応し、これらは、本明細書では、それぞれ「５’標的配列」および「３’標的配列」と呼ばれる。
ホモロジーアームおよび標的配列は、２つの領域が相同組換え反応の基質として作用するのに十分なレベルの配列同一性を互いに共有する場合、互いに「対応する」または「対応している」。「相同性」という用語は、対応する配列と同一であるか、または配列同一性を共有するＤＮＡ配列を含む。所与の標的配列と核酸構築物に見られる対応するホモロジーアームとの間の配列同一性は、相同組換えが起こることを可能にする任意の程度の配列同一性であり得る。例えば、核酸構築物（またはその断片）のホモロジーアームおよび標的配列（またはその断片）によって共有される配列同一性の量は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性であり得、これにより、配列は相同組換えを起こす。さらに、ホモロジーアームと対応する標的配列との間の対応する相同性領域は、相同組換えを促進するのに十分な任意の長さであり得る。例示的なホモロジーアームは、約２５ヌクレオチド～約２．５ｋｂの長さであるか、約２５ヌクレオチド～約１．５ｋｂの長さであるか、または約２５～約５００ヌクレオチドの長さである。例えば、所与のホモロジーアーム（またはホモロジーアームのそれぞれ）および／または対応する標的配列は、約２５～約３０、約３０～約４０、約４０～約５０、約５０～約６０、約６０～約７０、約７０～約８０、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１５０、約１５０～約２００、約２００～約２５０、約２５０～約３００、約３００～約３５０、約３５０～約４００、約４００～約４５０、または約４５０～約５００ヌクレオチド長の対応する相同性領域を含み得、その結果、ホモロジーアームは、標的核酸内の対応する標的配列との相同組換えを受けるのに十分な相同性を有する。代替的に、所与のホモロジーアーム（または各ホモロジーアーム）および／または対応する標的配列は、約０．５ｋｂ～約１ｋｂ、約１ｋｂ～約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ～約２ｋｂ、または約２ｋｂ～約２．５ｋｂの長さである対応する相同性領域を含み得る。例えば、ホモロジーアームは、それぞれ約７５０ヌクレオチドの長さであり得る。別の例では、ホモロジーアームは、各々、約１５０～約７５０、約２００～約７００、約２５０～約６５０、約３００～約６００、約３５０～約５５０、約４００～約５００、約１５０～約４５０、約２００～約４５０、約２５０～約４５０、約３００～約４５０、約３５０～約４５０、約４００～約４５０、約４５０～約５００、約４５０～約５５０、約４５０～約６００、約４５０～約６５０、約４５０～約７００、約４５０～約７５０、または約４５０ヌクレオチドの長さであり得る。別の例では、ホモロジーアームは、各々、約５００～約１３００、約５５０～約１２５０、約６００～約１２００、約６５０～約１１５０、約７００～約１１００、約７５０～約１０５０、約８００～約１０００、約８５０～約９５０、約５００～約９００、約５５０～約９００、約６００～約９００、約６５０～約９００、約７００～約９００、約７５０～約９００、約８００～約９００、約８５０～約９００、約９００～約９５０、約９００～約１０００、約９００～約１０５０、約９００～約１１００、約９００～約１１５０、約９００～約１２００、約９００～約１２５０、約９００～約１３００、または約９００ヌクレオチドの長さであり得る。別の例では、ホモロジーアームは、各々、約１５００～約２１００、約１５５０～約２０５０、約１６００～約２０００、約１６５０～約１９５０、約１７００～約１９００、約１７５０～約１８５０、約１５００～約１８００、約１５５０～約１８００、約１６００～約１８００、約１６５０～約１８００、約１７００～約１８００、約１７５０～約１８００、約１８００～約１８５０、約１８００～約１９００、約１８００～約１９５０、約１８００～約２０００、約１８００～約２０５０、約１８００～約２１００、または約１８００ヌクレオチドであり得る。別の例では、各ホモロジーアームは、約４５０以下のヌクレオチド、約９００以下のヌクレオチド、または約１８００以下のヌクレオチドである。別の例では、各ホモロジーアームは、少なくとも約４５０のヌクレオチド、少なくとも約９００のヌクレオチド、または少なくとも約１８００のヌクレオチドである。ホモロジーアームは対称的（それぞれの長さがほぼ同じサイズ）であってもよく、非対称的（一方が他方よりも長い）であってもよい。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系または他のヌクレアーゼ剤を本明細書に開示される核酸構築物と組み合わせて使用する場合、ヌクレアーゼ切断部位またはヌクレアーゼ切断部位での一本鎖切断（ニック）または二本鎖切断の際に、標的配列とホモロジーアームとの間の相同組換え事象の発生を促進するように、５’および３’標的配列をヌクレアーゼ切断部位に十分に近接して（例えば、ガイドＲＮＡ標的配列に十分に近接して）位置することができる。「ヌクレアーゼ切断部位」という用語は、ヌクレアーゼ剤（例えば、ガイドＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９タンパク質）によってニックまたは二本鎖切断が作成されるＤＮＡ配列を含む。核酸構築物の５’および３’ホモロジーアームに対応する標的化遺伝子座内の標的配列は、距離がヌクレアーゼ切断部位での一本鎖切断または二本鎖切断の際の５’および３’標的配列とホモロジーアームとの間の相同組換え事象の発生を促進するような距離である場合、ヌクレアーゼ切断部位に「十分に近接して位置する」。したがって、核酸構築物の５’および／または３’ホモロジーアームに対応する標的配列は、例えば、所与のヌクレアーゼ切断部位の少なくとも１ヌクレオチド内、または所与のヌクレアーゼ切断部位の少なくとも１０ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド内であり得る。一例として、ヌクレアーゼ切断部位は、標的配列の少なくとも一方または両方に直接隣接し得る。
核酸構築物のホモロジーアームに対応する標的配列とヌクレアーゼ切断部位との位置関係は、変動し得る。例えば、標的配列は、ヌクレアーゼ切断部位の５’に位置してもよく、標的配列は、ヌクレアーゼ切断部位の３’に位置してもよく、または標的配列は、ヌクレアーゼ切断部位に隣接していてもよい。
他の核酸構築物は、いかなるホモロジーアームも含まない。そのような核酸構築物は、非相同末端結合によって挿入することができる可能性がある。例えば、そのような核酸構築物は、ヌクレアーゼ剤による切断後の平滑末端二本鎖切断に挿入することができる。具体的な例では、核酸構築物酸は、ＡＡＶを介して送達することができ、非相同末端結合によって標的ゲノム遺伝子座に挿入することができる（例えば、核酸構築物は、ホモロジーアームを含まないものであってよい）。
具体的な例では、核酸構築物は、ホモロジー非依存性標的化組み込みを介して挿入することができる。例えば、核酸構築物のレチノスキシンコード配列は、ヌクレアーゼ剤の標的部位と各側で隣接することができる（例えば、標的ゲノム遺伝子座と同じ標的部位、および同じヌクレアーゼ剤が標的ゲノム遺伝子座の標的部位を切断するために使用される）。次いで、ヌクレアーゼ剤は、レチノスキシンコード配列に隣接する標的部位を切断することができる。具体的な例では、核酸構築物は、ＡＡＶ媒介送達で送達され、レチノスキシンコード配列に隣接する標的部位の切断は、ＡＡＶの末端逆位配列（ＩＴＲ）を除去することができる。いくつかの方法では、レチノスキシンコード配列が正しい方向で標的ゲノム遺伝子座に挿入された場合、標的ゲノム遺伝子座の標的部位（例えば、隣接するプロトスペーサー隣接モチーフを含むｇＲＮＡ標的配列）はもはや存在しないが、レチノスキシンコード配列が標的ゲノム遺伝子座に反対方向に挿入されると再形成される。これは、レチノスキシンコード配列が発現のために正しい方向に挿入されることを確実にするのに役立ち得る。
標的ゲノム遺伝子座へのホモロジー非依存性標的化組み込みのための一例示的な核酸構築物では、レチノスキシンタンパク質またはその断片は、ヒトレチノスキシンタンパク質またはその断片であり、レチノスキシンタンパク質またはその断片のコード配列は、ヒトＲＳ１のエキソン２～６またはその縮重バリアントを含む相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含み、核酸構築物は、レチノスキシンタンパク質またはその断片の発現を駆動するプロモーターを含まず、核酸構築物は、コード配列の３’に位置するポリアデニル化シグナル配列を含み、核酸構築物は、コード配列の５’に位置するスプライスアクセプター部位を含み、核酸構築物中のヌクレアーゼ標的配列は、標的ゲノム遺伝子座への組み込みのためのヌクレアーゼ標的配列と同一であり、標的ゲノム遺伝子座におけるヌクレアーゼ標的配列は、核酸構築物が正しい方向で挿入される場合、破壊されるが、核酸構築物が反対方向で標的ゲノム遺伝子座に挿入され場合、再形成される。
標的ゲノム遺伝子座へのホモロジー非依存性標的化組み込みのための一例示的な核酸構築物では、レチノスキシンタンパク質またはその断片は、配列番号２または５に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。標的ゲノム遺伝子座へのホモロジー非依存性標的化組み込みのための一例示的な核酸構築物では、レチノスキシンタンパク質もしくはその断片のコード配列は、配列番号６、８、もしくは９に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは１００％同一の配列、またはその縮重バリアントを含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる。標的ゲノム遺伝子座へのホモロジー非依存性標的化組み込みのための一例示的な核酸構築物では、核酸構築物は、配列番号４５に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
他の核酸構築物は、５’末端および／または３’末端に短い一本鎖領域を有し、これは、標的ゲノム遺伝子座でのヌクレアーゼ剤媒介切断によって作成される１つ以上の突出に相補的である。例えば、いくつかの核酸構築物は、標的ゲノム遺伝子座における５’および／または３’標的配列でのヌクレアーゼ媒介切断によって作成された１つ以上の突出に相補的な５’末端および／または３’末端に短い一本鎖領域を有する。いくつかのそのような核酸構築物は、５’末端のみまたは３’末端のみに相補的領域を有する。例えば、いくつかのそのような核酸構築物は、標的ゲノム遺伝子座の５’標的配列で作成された突出に相補的な５’末端にのみ、または標的ゲノム遺伝子座の３’標的配列で作成された突出に相補的な３’末端にのみ相補的領域を有する。他のそのような核酸構築物は、５’末端と３’末端の両方に相補的領域を有する。例えば、他のそのような核酸構築物は、標的ゲノム遺伝子座でのヌクレアーゼ媒介切断によって生成される５’と３’末端との両方に相補的領域（例えば、それぞれ第１および第２の突出に相補的）を有する。例えば、核酸構築物が二本鎖である場合、一本鎖相補的領域は、ドナー核酸の上部鎖の５’末端および核酸構築物の下部鎖の５’末端から伸長し、両端に５’突出を作成することができる。代替的に、一本鎖相補的領域は、核酸構築物の上部鎖の３’末端から、およびテンプレートの下部鎖の３’末端から伸長し、３’突出を作成することができる。
相補的領域は、核酸構築物と標的核酸との間のライゲーションを促進するのに十分な任意の長さであり得る。例示的な相補的領域は、約１～約５ヌクレオチドの長さ、約１～約２５ヌクレオチドの長さ、または約５～約１５０ヌクレオチドの長さである。例えば、相補的領域は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドの長さであってよい。代替的に、相補的領域は、約５～約１０、約１０～約２０、約２０～約３０、約３０～約４０、約４０～約５０、約５０～約６０、約６０～約７０、約７０～約８０、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１１０、約１１０～約１２０、約１２０～約１３０、約１３０～約１４０、約１４０～約１５０ヌクレオチド、またはそれ以上の長さであってよい。
このような相補的領域は、２対のニッカーゼによって作成された突出を相補的にすることができる。ＤＮＡの反対側の鎖を切断して第１の二本鎖切断を作成する第１および第２のニッカーゼ、およびＤＮＡの反対側の鎖を切断して第２の二本鎖切断を作成する第３および第４のニッカーゼを使用することにより、両端が千鳥状の２つの二本鎖切断を作成できる。例えば、Ｃａｓタンパク質を使用して、第１、第２、第３、および第４のガイドＲＮＡに対応する第１、第２、第３、および第４のガイドＲＮＡ標的配列にニックを入れることができる。第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列は、ＤＮＡの第１および第２の鎖上の第１および第２のニッカーゼによって作成されたニックが二本鎖切断を作成するように、第１の切断部位を作成するように配置することができる（すなわち、第１の切断部位は、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列内のニックを含む）。同様に、第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列は、ＤＮＡの第１および第２の鎖上の第３および第４のニッカーゼによって作成されたニックが二本鎖切断を作成するように、第２の切断部位を作成するように配置することができる（すなわち第２の切断部位は、第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列内のニックを含む）。第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列および／または第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列内のニックは、突出を作成するオフセットニックであり得る。オフセットウィンドウは、例えば、少なくとも約５ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、またはそれ以上であり得る。すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５４：１３８０－１３８９、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：８３３－８３８、およびＳｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １１：３９９－４０４を参照されたい。そのような場合、二本鎖核酸構築物は、第１および第２のガイドＲＮＡ標的配列内のニックおよび第３および第４のガイドＲＮＡ標的配列内のニックによって作成された突出に相補的な一本鎖相補的領域で設計することができる。次いで、そのような核酸構築物は、非相同末端結合媒介ライゲーションによって挿入することができる。
本明細書に開示される核酸構築物のいくつかは、いずれかの方向で標的ゲノム遺伝子座に挿入され、標的ゲノム遺伝子座から発現され得る双方向性構築物である。そのような核酸構築物は、第１のレチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントの第１のコード配列を含む第１のセグメントと、第２のレチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントの第２のコード配列の逆相補体を含む第２のセグメントと、を含み得る。第２のセグメントは、例えば、核酸構築物の第１のセグメントの３’に位置することができる。
第１のセグメントおよび第２のセグメントは、直接一緒に連結することができるか、またはペプチドリンカーなどのリンカーによって連結することができる。ペプチドリンカーは、任意の好適な長さであり得る。例えば、リンカーは、約５～約２０００ヌクレオチドの長さであり得る。一例として、リンカー配列は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、５００、１０００、１５００、２０００、またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。
いくつかの双方向性構築物では、第１のレチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントは、第２のレチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントと同一である。他の双方向性構築物では、第１のレチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントは、第２のレチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントとは異なる。
いくつかの双方向性構築物では、第１のコード配列でのコドン使用は、第２のコード配列でのコドン使用と同じである。いくつかの他の双方向性構築物では、ヘアピン形成を低減するために、第２のコード配列は、第１のコード配列のコドン使用とは異なるコドン使用を採用する。このような逆相補体は、第１のセグメントのコード配列のすべてのヌクレオチドよりも少ない塩基対を形成するが、任意選択で同じポリペプチドをコードすることができる。
第２のセグメントは、第１のセグメントに対して任意の割合の相補性を有することができる。例えば、第２のセグメント配列は、第１のセグメントに対する少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の相補性を有することができる。別の例として、第２のセグメント配列は、第１のセグメントに対する約３０％未満、約３５％未満、約４０％未満、約４５％未満、約５０％未満、約５５％未満、約６０％未満、約６５％未満、約７０％未満、約７５％未満、約８０％未満、約８５％未満、約９０％未満、約９５％未満、約９７％未満、または約９９％未満の相補性を有することができる。いくつかの核酸構築物では、第２のコード配列の逆相補体は、第１のコード配列に実質的に相補的ではなく（例えば、７０％以下相補的）、第１のコード配列の断片に実質的に相補的ではなく、第１のコード配列に高度に相補的であり（例えば、少なくとも９０％相補的）、第１のコード配列の断片に高度に相補的であり、第１のコード配列の逆相補体に対して約５０％～約８０％同一であるか、または第１のコード配列の逆相補体に対して約６０％～約１００％同一であり得る。
双方向性構築物は、場合によっては、１つ以上（例えば、２つ）のポリアデニル化シグナル配列を含むことができる。いくつかの双方向性構築物では、第１のセグメントは、第１のポリアデニル化シグナル配列を含むことができる。いくつかの双方向性構築物では、第１のセグメントは、第２のポリアデニル化シグナル配列を含むことができる。いくつかの双方向性構築物では、第１のセグメントは、第１のポリアデニル化シグナル配列を含むことができ、第２のセグメントは、第２のポリアデニル化シグナル配列（例えば、ポリアデニル化シグナル配列の逆相補体）を含むことができる。いくつかの双方向性構築物では、第１のセグメントは、第１のコード配列の３’に位置する第１のポリアデニル化シグナル配列を含むことができる。いくつかの双方向性構築物では、第２のセグメントは、第２のコード配列の逆相補体の５’に位置する第２のポリアデニル化シグナル配列の逆相補体を含むことができる。いくつかの双方向性構築物では、第１のセグメントは、第１のコード配列の３’に位置する第１のポリアデニル化シグナル配列を含むことができ、第２のセグメントは、第２のコード配列の逆相補体の５’に位置する第２のポリアデニル化シグナル配列の逆相補体を含むことができる。第１および第２のポリアデニル化シグナル配列は、同じであっても異なっていてもよい。一例では、第１および第２のポリアデニル化シグナルは異なっている。
双方向性構築物は、場合によっては、１つ以上（例えば、２つ）のスプライスアクセプター部位を含むことができる。いくつかの双方向性構築物では、第１のセグメントは、第１のスプライスアクセプター部位を含むことができる。いくつかの双方向性構築物では、第１のセグメントは、第２のスプライスアクセプター部位を含むことができる。いくつかの双方向性構築物では、第１のセグメントは、第１のスプライスアクセプター部位を含むことができ、第２のセグメントは、第２のスプライスアクセプター部位（例えば、スプライスアクセプター部位の逆相補体）を含むことができる。いくつかの双方向性構築物では、第１のセグメントは、第１のコード配列の５’に位置する第１のスプライスアクセプター部位を含む。いくつかの双方向性構築物では、第２のセグメントは、第２のコード配列の逆相補体の３’に位置する第２のスプライスアクセプター部位の逆相補体を含む。いくつかの双方向性構築物では、第１のセグメントは、第１のコード配列の５’に位置する第１のスプライスアクセプター部位を含み、第２のセグメントは、第２のコード配列の逆相補体の３’に位置する第２のスプライスアクセプター部位の逆相補体を含む。第１および第２のスプライスアクセプター部位は、同じであっても異なっていてもよい。一例では、第１および第２のスプライスアクセプター部位は、異なっている。第１および／または第２のスプライスアクセプター部位は、ヒトＲＳ１遺伝子などのＲＳ１遺伝子（例えば、ＲＳ１遺伝子のイントロン１に由来）に由来し得る。
いくつかの双方向性構築物は、第１のレチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントの発現を駆動するプロモーター、および／または第２のレチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントの発現を駆動するプロモーターの逆相補体を含むことができる。代替的に、双方向性構築物は、第１のレチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアント、あるいは第２のレチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントの発現を駆動するプロモーターを含まない構築物（すなわち、プロモーターのない構築物）であり得る。
コード配列の一方または両方は、宿主細胞での発現のためにコドン最適化され得る。いくつかの双方向性構築物では、コード配列のうちの１つのみがコドン最適化される。いくつかの双方向性構築物では、第１のコード配列がコドン最適化される。いくつかの双方向性構築物では、第２のコード配列がコドン最適化される。いくつかの双方向性構築物では、両方のコード配列がコドン最適化される。
例示的な双方向性構築物では、第２のセグメントは、第１のセグメントの３’に位置し、第１のレチノスキシンタンパク質またはその断片および第２のレチノスキシンタンパク質またはその断片の両方は、ヒトレチノスキシンタンパク質またはその断片であり、第１のレチノスキシンタンパク質またはその断片は、第２のレチノスキシンタンパク質またはその断片に対して同一であり、第１のコード配列および第２のコード配列の両方は、ヒトＲＳ１のエキソン２～６またはその縮重バリアントを含む相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含み、第２のコード配列は、第１のコード配列のコドンのコドン使用とは異なるコドン使用を採用し、第１のセグメントは、第１のコード配列の３’に位置する第１のポリアデニル化シグナル配列を含み、第２のセグメントは、第２のコード配列の逆相補体の５’に位置する第２のポリアデニル化シグナル配列の逆相補体を含み、第１のセグメントは、第１のコード配列の５’に位置する第１のスプライスアクセプター部位を含み、第２のセグメントは、第２のコード配列の逆相補体の３’に位置する第２のスプライスアクセプター部位の逆相補体を含み、核酸構築物は、第１のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片または第２のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片の発現を駆動するプロモーターを含まず、任意選択で、核酸構築物は、ホモロジーアームを含まない。
例示的な双方向性構築物では、第１のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片および／または第２のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片は、配列番号２または５に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。例示的な双方向性構築物では、第１のコード配列および／または第２のコード配列は、配列番号６、８、もしくは９に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは１００％同一の配列、またはその縮重バリアントを含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる。例示的な双方向性構築物では、第１のコード配列は、配列番号８に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、第２のコード配列は、配列番号９に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。例示的な双方向性構築物では、核酸構築物は、配列番号４６または４７に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
核酸構築物は、追加の望ましい特徴（例えば、修飾または調節された安定性、蛍光標識による追跡または検出、タンパク質またはタンパク質複合体の結合部位など）を提供する修飾または配列を含み得る。核酸構築物は、１つ以上の蛍光標識、精製タグ、エピトープタグ、またはそれらの組み合わせを含むことができる。例えば、核酸構築物は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの蛍光標識などの１つ以上の蛍光標識（例えば、蛍光タンパク質または他のフルオロフォアまたは色素）を含むことができる。例示的な蛍光標識としては、フルオレセイン（例えば、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ））、テキサスレッド、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、パシフィックブルー、５－（および－６）－カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）およびＣｙ７などのフルオロフォアが挙げられる。オリゴヌクレオチドを標識するための幅広い蛍光色素が市販されている（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）。そのような蛍光標識（例えば、内部蛍光標識）は、例えば、核酸構築物の末端と適合性のある突出端を有する切断された標的核酸に直接組み込まれた核酸構築物を検出するために使用することができる。標識またはタグは、核酸構築物の５’末端、３’末端、または内部にあってよい。例えば、核酸構築物は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからＩＲ７００フルオロフォア（５’ＩＲＤＹＥ（登録商標）７００）を有する５’末端にコンジュゲートさせることができる。
核酸構築物はまた、条件付き対立遺伝子を含むことができる。条件付き対立遺伝子は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１／０１０４７９９に記載されているように、多機能対立遺伝子であってよい。例えば、条件付き対立遺伝子は、以下を含むことができる：（ａ）標的遺伝子の転写に関してセンス方向の作動配列、（ｂ）センスまたはアンチセンス方向の薬物選択カセット（ＤＳＣ）、（ｃ）アンチセンス配向の目的のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）、（ｄ）逆方向の条件付き反転モジュール（ＣＯＩＮ、エキソン分割イントロンと反転可能な遺伝子トラップのようなモジュールを利用）。例えばＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照されたい。条件付き対立遺伝子は、第１のリコンビナーゼへの曝露時に再結合して、（ｉ）作動配列およびＤＳＣを欠き、（ｉｉ）センス方向のＮＳＩとアンチセンス方向のＣＯＩＮを含む、条件付き対立遺伝子を形成する再結合可能なユニットをさらに含むことができる。例えばＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照されたい。
核酸構築物はまた、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。代替的に、核酸構築物は、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを欠くことができる。選択マーカーは、選択カセットに入れることができる。任意選択で、選択カセットは自己削除カセットにすることができる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ８，６９７，８５１およびＵＳ２０１３／０３１２１２９を参照されたい。一例として、自己削除カセットは、マウスＰｒｍ１プロモーターに作動可能に連結されたＣｒｅｉ遺伝子（イントロンによって分離されたＣｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエキソンを含む）およびヒトユビキチンプロモーターに作動可能に連結されたネオマイシン耐性遺伝子を含み得る。Ｐｒｍ１プロモーターを使用することにより、Ｆ０動物の雄の生殖細胞で特異的に自己欠失カセットを削除することができる。例示的な選択マーカーとしては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラスチシジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｋ）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、標的とされる細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。プロモーターの例は、本明細書の他の場所に記載されている。
核酸構築物はまた、レポーター遺伝子を含むことができる。例示的なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＭｍＧＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－Ｒｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、およびアルカリホスファターゼをコードするものが含まれる。このようなレポーター遺伝子は、標的とされる細胞で活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。プロモーターの例は、本明細書の他の場所に記載されている。
核酸構築物はまた、１つ以上の発現カセットまたは削除カセットを含むことができる。所与のカセットは、発現に影響を及ぼす様々な調節成分とともに、目的のヌクレオチド配列、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、およびレポーター遺伝子のうちの１つ以上を含むことができる。含めることができる選択可能なマーカーおよびレポーター遺伝子の例は、本明細書の他の場所で詳細に論じられている。
核酸構築物は、部位特異的組換え標的配列に隣接する核酸を含むことができる。代替的に、核酸構築物は、１つ以上の部位特異的組換え標的配列を含むことができる。核酸構築物全体がそのような部位特異的組換え標的配列に隣接することができるが、核酸構築物内の任意の領域または目的の個別のポリヌクレオチドもまた、そのような部位に隣接することができる。核酸構築物または核酸構築物内の目的の任意のポリヌクレオチドに隣接することができる部位特異的組換え標的配列は、例えば、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ＦＲＴ、ｒｏｘ、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。一例では、部位特異的組換え部位は、核酸構築物内に含まれる選択マーカーおよび／またはレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドに隣接している。標的化遺伝子座での核酸構築物の組み込みに続いて、部位特異的組換え部位間の配列を除去することができる。
核酸構築物はまた、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、およびタイプＩＶエンドヌクレアーゼを含む、制限エンドヌクレアーゼ（すなわち、制限酵素）のための１つ以上の制限部位を含むことができる。タイプＩおよびタイプＩＩＩの制限エンドヌクレアーゼは特定の認識部位を認識するが、典型的には、ヌクレアーゼ結合部位から可変位置で切断する。これは、切断部位（認識部位）から数百塩基対離れている場合がある。タイプＩＩシステムでは、制限活性はメチラーゼ活性とは無関係であり、切断は典型的には、結合部位内または結合部位の近くの特定の部位で起こる。ほとんどのタイプＩＩ酵素はパリンドローム配列を切断するが、タイプＩＩａ酵素は非パリンドローム認識部位を認識して認識部位の外側で切断し、タイプＩＩｂ酵素は認識部位の外側の両方の部位で配列を２回切断し、タイプＩＩｓ酵素は非対称認識部位を認識し、片側で、認識部位から約１～２０ヌクレオチドの定義された距離で切断する。ＩＶ型制限酵素はメチル化されたＤＮＡを標的とする。制限酵素は、例えば、ＲＥＢＡＳＥデータベース（ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍのウェブページ；Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：４１８－４２０、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：１８０５－１８１２、およびＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００２）ｉｎ Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ ＩＩ，ｐｐ．７６１－７８３，Ｅｄｓ．Ｃｒａｉｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ））でさらに説明および分類されている。
本明細書に開示される核酸構築物はまた、追加のコード配列を含むことができる。例えば、本明細書に開示されるいくつかの核酸構築物は、標的ゲノム遺伝子座を標的とする（例えば、ＲＳ１のイントロン１などのＲＳ１を標的とする）ガイドＲＮＡをコードする配列を含むことができる。ガイドＲＮＡをコードする配列は、Ｕ６プロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結され得る。いくつかの核酸構築物では、ガイドＲＮＡ発現カセットは、レチノスキシンコード配列の３’（下流）に位置している。いくつかの双方向性核酸構築物では、ガイドＲＮＡ発現カセットは、第１のセグメントと第２のセグメントとの間に位置している。
ＩＩＩ．核酸構築物を含むベクター
標的ゲノム遺伝子座への組み込みおよび標的ゲノム遺伝子座からの発現のための、レチノスキシンコード配列（すなわち、レチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードする）を含む核酸構築物（すなわち、外因性ドナー核酸）を含むベクターも本明細書で提供される。本明細書の他の場所に開示されているヌクレアーゼ剤（例えば、内因性ＲＳ１遺伝子座を標的とする）をコードする核酸を含むベクターも本明細書で提供される。本明細書の他の場所に開示される核酸構築物および／またはヌクレアーゼ剤（例えば、内因性ＲＳ１遺伝子座を標的とする）をコードする核酸を含むベクター（例えば、核酸構築物およびガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクター）も本明細書で提供される。ベクターは、例えば、複製起点、プロモーター、および抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を含むことができる。いくつかのそのようなベクターは、標的ゲノム遺伝子座の標的部位に対応するホモロジーアームを含む。他のそのようなベクターは、いかなるホモロジーアームも含まない。
いくつかのベクターは、環状であり得る。代替的に、ベクターは、直線状であり得る。ベクターは、脂質ナノ粒子、リポソーム、非脂質ナノ粒子、またはウイルスキャプシドを介して送達されるようにパッケージ化することができる。非限定的な例示的なベクターとしては、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、ミニ染色体、トランスポゾン、ウイルスベクター、および発現ベクターが挙げられる。
ベクターは、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターであり得る。ＡＡＶは任意の好適な血清型であり得、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）または自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）であり得る。他の例示的なウイルス／ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルスが含まれる。ウイルスは、分裂細胞、非分裂細胞、または分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染できる。ウイルスは宿主ゲノムに組み込まれてもよく、または代替的に宿主ゲノムに組み込まれなくてもよい。このようなウイルスは、免疫力が低減するように操作することもできる。ウイルスは、複製可能であってもよく、複製欠損（例えば、ビリオン複製および／またはパッケージングの追加ラウンドに必要な１つ以上の遺伝子に欠陥がある）であってもよい。ウイルスは、一過性の発現、長期的な発現（例えば、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、または３ヶ月）、または永続的な発現（例えば、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡの）を引き起こし得る。例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）は、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、および１０１６ベクターゲノム／ｍＬを含む。例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）としては、約１０１２、約１０１３、約１０１４、約１０１５および約１０１６のベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、または約１０１２～約１０１６、約１０１２～約１０１５、約１０１２～約１０１４、約１０１２～約１０１３、約１０１３～約１０１６、約１０１４～約１０１６、約１０１５～約１０１６、もしくは約１０１３～約１０１５ｖｇ／ｍＬが挙げられる。他の例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）としては、約１０１２、約１０１３、約１０１４、約１０１５および約１０１６のベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇの体重、または約１０１２～約１０１６、約１０１２～約１０１５、約１０１２～約１０１４、約１０１２～約１０１３、約１０１３～約１０１６、約１０１４～約１０１６、約１０１５～約１０１６、もしくは約１０１３～約１０１５ｖｇ／ｋｇの体重が挙げられる。
ｓｓＤＮＡ ＡＡＶゲノムは、２つのオープンリーディングフレーム、ＲｅｐおよびＣａｐで構成され、相補的ＤＮＡ鎖の合成を可能にする２つの末端逆位配列が隣接している。ＡＡＶトランスファープラスミドを構築する場合、導入遺伝子は２つのＩＴＲの間に配置され、ＲｅｐおよびＣａｐはトランスで供給される。ＲｅｐおよびＣａｐに加えて、ＡＡＶはアデノウイルス由来の遺伝子を含むヘルパープラスミドを必要とする場合がある。これらの遺伝子（Ｅ４、Ｅ２ａ、およびＶＡ）はＡＡＶ複製を仲介する。例えば、トランスファープラスミド、Ｒｅｐ／Ｃａｐ、およびヘルパープラスミドをアデノウイルス遺伝子Ｅ１＋を含むＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、感染性ＡＡＶ粒子を生成することができる。代替的に、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、およびアデノウイルスヘルパー遺伝子を組み合わせて単一のプラスミドとすることもできる。同様のパッケージングセルおよび方法は、レトロウイルスなどの他のウイルスにも使用できる。
ＡＡＶの複数の血清型が確認されている。これらの血清型は、感染する細胞の種類（すなわち、それらの指向性）が異なり、特定の細胞型の優先的な形質導入を可能にする。光受容体細胞に対する血清型には、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が含まれる。網膜色素上皮組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が含まれる。具体的な例では、核酸構築物を含むＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、またはＡＡＶ８であり得る。
指向性は、キャプシドと異なるウイルス血清型からのゲノムの混合である偽型付けによってさらに洗練することができる。例えば、ＡＡＶ２／５は、血清型５のキャプシドにパッケージされた血清型２のゲノムを含むウイルスを示す。偽型ウイルスの使用は、形質導入効率を改善するだけでなく、指向性を変えることができる。異なる血清型に由来するハイブリッドキャプシドを使用して、ウイルスの指向性を改変することもできる。例えば、ＡＡＶ－ＤＪには、８つの血清型由来のハイブリッドキャプシドが含まれており、インビボで幅広い細胞型にわたって高い感染力を示す。ＡＡＶ－ＤＪ８は、ＡＡＶ－ＤＪの特性を示すが、脳への取り込みが強化された別の例である。ＡＡＶ血清型は、変異によっても修飾できる。ＡＡＶ２の変異修飾の例には、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、およびＳ６６２Ｖが含まれる。ＡＡＶ３の変異修飾の例には、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆ、およびＴ４９２Ｖが含まれる。ＡＡＶ６の変異修飾の例には、Ｓ６６３ＶおよびＴ４９２Ｖが含まれる。他の偽型／修飾ＡＡＶバリアントには、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ８．２、およびＡＡＶ／ＳＡＳＴＧが含まれる。具体的な例では、ＡＡＶは、ＡＡＶ７ｍ８であり、これはすべての網膜層および光受容体への非常に効率的な送達を媒介するＡＡＶバリアントである。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄａｌｋａｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５：１８９ｒａ７６を参照されたい。
導入遺伝子の発現を加速するために、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）バリアントを使用することができる。ＡＡＶは細胞のＤＮＡ複製機構に依存して、ＡＡＶの一本鎖ＤＮＡゲノムの相補的鎖を合成するため、導入遺伝子の発現が遅れる可能性がある。この遅延に対処するために、感染時に自発的にアニーリングすることができる相補的配列を含むｓｃＡＡＶを使用することができ、宿主細胞のＤＮＡ合成の必要性を排除する。しかしながら、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターも使用できる。
パッケージング容量を増やすために、より長い導入遺伝子を、１つ目は３’スプライスドナー、２つ目は５’スプライスアクセプターである２つのＡＡＶトランスファープラスミドに分割することができる。細胞の共感染時に、これらのウイルスはコンカテマーを形成し、一緒にスプライシングされ、完全長の導入遺伝子を発現させることができる。これにより、より長い導入遺伝子の発現が可能になるが、発現の効率は低下する。容量を増やすための同様の方法は、相同組換えを利用する。例えば、導入遺伝子は２つのトランスファープラスミドに分割できるが、共発現が相同組換えおよび全長導入遺伝子の発現を誘導するように、実質的な配列の重複がある。
ＩＶ．核酸構築物を含む脂質ナノ粒子
標的ゲノム遺伝子座への組み込みおよび標的ゲノム遺伝子座からの発現のための、レチノスキシンコード配列（すなわち、レチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードする）を含む核酸構築物（すなわち、外因性ドナー核酸）を含む脂質ナノ粒子も本明細書で提供される。本明細書の他の場所に開示されているヌクレアーゼ剤（例えば、内因性ＲＳ１遺伝子座を標的とする）をコードする核酸を含む脂質ナノ粒子も本明細書で提供される。本明細書の他の場所に開示されている核酸構築物およびヌクレアーゼ剤（例えば、内因性ＲＳ１遺伝子座を標的とする）をコードする核酸を含む脂質ナノ粒子も本明細書で提供される。
脂質製剤は、生体分子を分解から保護すると同時に、細胞への取り込みを改善することができる。脂質ナノ粒子は、分子間力によって互いに物理的に結合した複数の脂質分子を含む粒子である。これらには、ミクロスフェア（単層および多層ベシクル、例えば、リポソームを含む）、エマルジョン中の分散相、ミセル、または懸濁液中の内相が含まれる。そのような脂質ナノ粒子は、送達のために１つ以上の核酸またはタンパク質をカプセル化するために使用することができる。カチオン性脂質を含む製剤は、核酸などのポリアニオンを送達するのに有用である。含めることができる他の脂質は、中性脂質（すなわち、非荷電または両性イオン脂質）、陰イオン脂質、トランスフェクションを増強するヘルパー脂質、およびナノ粒子がインビボで存在できる時間を増加させるステルス脂質である。好適なカチオン性脂質、中性脂質、アニオン性脂質、ヘルパー脂質、およびステルス脂質の例は、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１６／０１０８４０Ａ１およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１に見出すことができる。例示的な脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質および１つ以上の他の成分を含むことができる。一例では、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質を含むことができる。別の例では、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質およびＤＳＰＣなどの中性脂質を含むことができる。別の例では、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質、ＤＳＰＣなどの任意の中性脂質、およびＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３などのステルス脂質を含むことができる。
ＬＮＰは、以下の１つ以上またはすべてを含み得る：（ｉ）カプセル化およびエンドソーム脱出のための脂質、（ｉｉ）安定化のための中性脂質、（ｉｉｉ）安定化のためのヘルパー脂質、ならびに（ｉｖ）ステルス脂質を含む。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２２（９）：２２２７－２２３５およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。特定のＬＮＰでは、カーゴは、ヌクレアーゼ剤をさらに含むことができる。特定のＬＮＰでは、カーゴは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸をさらに含むことができる。特定のＬＮＰでは、カーゴは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、およびガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸をさらに含むことができる。特定のＬＮＰにおいて、カーゴは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸、および核酸構築物を含み得る。
カプセル化およびエンドソーム脱出のための脂質は、カチオン性脂質であり得る。脂質はまた、生分解性イオン化可能脂質などの生分解性脂質であり得る。好適な脂質の一例は、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノアートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノアートである脂質ＡまたはＬＰ０１である。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２２（９）：２２２７－２２３５およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。好適な脂質の別の例は、（（５－（（ジメチルアミノ）メチル）－１，３－フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン－８，１－ジイル）ビス（デカノアート）とも呼ばれる、（（５－（（ジメチルアミノ）メチル）－１，３－フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン－８，１－ジイル）ビス（デカノアート）である脂質Ｂである。好適な脂質の別の例は、２－（（４－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン－１，３－ジイル（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－９，１２－ジエノアート）である脂質Ｃである。好適な脂質の別の例は、３－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）－１３－（オクタノイルオキシ）トリデシル３－オクチルウンデカノアートである脂質Ｄである。他の好適な脂質としては、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）としても知られる）））が含まれる。
本明細書に記載のＬＮＰでの使用に適したいくつかのそのような脂質は、インビボで生分解性である。例えば、そのような脂質を含むＬＮＰには、脂質の少なくとも７５％が、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間以内、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から除去されるものが含まれる。別の例として、ＬＮＰの少なくとも５０％が、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間以内、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から除去される。
このような脂質は、それらが含まれる培地のｐＨに応じてイオン化可能であってよい。例えば、わずかに酸性の培地では、脂質はプロトン化され、したがって正電荷を帯びることができる。逆に、例えば、ｐＨが約７．３５である血液などのわずかに塩基性の媒体では、脂質はプロトン化されない可能性があり、したがって電荷を帯びない可能性がある。いくつかの実施形態では、脂質は、少なくとも約９、９．５、または１０のｐＨでプロトン化され得る。そのような脂質が電荷を帯びる能力は、その固有のｐＫａに関連している。例えば、脂質は、独立して、約５．８～約６．２の範囲のｐＫａを有し得る。
中性脂質は、ＬＮＰを安定化し、その加工を改善するよう機能する。好適な中性脂質の例には、様々な中性、非荷電、または双性イオン性脂質が含まれる。本開示における使用に好適な中性リン脂質の例は、５－ヘプタデシルベンゼン－１，３－ジオール（レゾルシノール）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１－ミリストイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リソホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルロレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リソホスファチジルエタノールアミンおよびこれらの組み合わせを含むが、これらには限定されない。例えば、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）からなる群から選択され得る。
ヘルパー脂質には、トランスフェクションを増強する脂質が含まれる。ヘルパー脂質がトランスフェクションを増強するメカニズムは、粒子安定性を増強することを含んでもよい。場合によっては、ヘルパー脂質が膜の融合性を高めることができる。ヘルパー脂質は、ステロイド、ステロール、およびアルキルレゾルシノールを含む。好適なヘルパー脂質の例には、コレステロール、５－ヘプタデシルレゾルシノール、およびヘミコハク酸コレステロールが含まれる。一例では、ヘルパー脂質はコレステロールまたはヘミコハク酸コレステロールであり得る。
ステルス脂質には、ナノ粒子がインビボで存在できる時間の長さを変える脂質が含まれる。ステルス脂質は、例えば、粒子凝集を低減し、粒子サイズを制御することによって製剤化プロセスにおいて有用である。ステルス脂質は、ＬＮＰの薬物動態特性を調節し得る。好適なステルス脂質には、脂質部分に連結された親水性頭部基を有する脂質が含まれる。
ステルス脂質の親水性頭部基は、例えば、ＰＥＧ（しばしばポリ（エチレンオキシド）と呼ばれる）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリアミノ酸、およびポリＮ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドに基づくポリマーから選択されるポリマー部分を含んでもよい。ＰＥＧという用語は、ポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマーを意味する。特定のＬＮＰ製剤では、ＰＥＧはＰＥＧ２０００とも呼ばれるＰＥＧ－２Ｋであり、平均分子量は約２，０００ダルトンである。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。
ステルス脂質の脂質部分は、例えば、独立して約Ｃ４～約Ｃ４０の飽和または不飽和の炭素原子を含むアルキル鎖長を有するジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基を含むものを含むジアシルグリセロールまたはジアシルグリカミドから由来し得、ここで鎖は１つ以上の、例えば、アミドまたはエステルなどの官能基を含み得る。ジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基は、１つ以上の置換アルキル基をさらに含み得る。
一例として、ステルス脂質は、ＰＥＧ－ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、およびＰＥＧ－ジステアロイルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（ｌ－［８’－（コレスト－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキシアミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＧ）、ポリ（エチレングリコール）－２０００－ジメタクリレート（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＡ））、および１，２－ジステアリルオキシプロピル－３－アミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＡ）から選択してもよい。１つの具体的な例において、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧであってよい。
ＬＮＰは、製剤中の成分脂質の異なるそれぞれのモル比を含むことができる。ＣＣＤ脂質のモル％は、例えば、約３０モル％～約６０モル％、約３５モル％～約５５モル％、約４０モル％～約５０モル％、約４２モル％～約４７モル％、または約４５％であってよい。ヘルパー脂質のモル％は、例えば、約３０モル％～約６０モル％、約３５モル％～約５５モル％、約４０モル％～約５０モル％、約４１モル％～約４６モル％、または約４４モル％であってよい。中性脂質のモル％は、例えば、約１モル％～約２０モル％、約５モル％～約１５モル％、約７モル％～約１２モル％、または約９モル％であってよい。ステルス脂質のモル％は、例えば、約１モル％～約１０モル％、約１モル％～約５モル％、約１モル％～約３モル％、約２モル％、または約１モル％であってよい。
ＬＮＰは、生分解性脂質（Ｎ）の正に帯電したアミン基と、カプセル化される核酸の負に帯電したリン酸基（Ｐ）との間で異なる比を有することができる。これは、方程式Ｎ／Ｐで数学的に表すことができる。例えば、Ｎ／Ｐ比は、約０．５～約１００、約１～約５０、約１～約２５、約１～約１０、約１～約７、約３～約５、約４～約５、約４、約４．５、または約５であってよい。
いくつかのＬＮＰでは、カーゴはＣａｓ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含むことができる。Ｃａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡは、異なる比であってよい。例えば、ＬＮＰ製剤は、約２５：１～約１：２５の範囲、約１０：１～約１：１０の範囲、約５：１～約１：５の範囲、または約１：１のＣａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡとの比を含んでもよい。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１～約１：５、または約１０：１のＣａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸との比を含んでもよい。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１０、２５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５、１：１０、または１：２５のＣａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸との比を含んでもよい。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１～約１：２の、Ｃａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸との比を含んでもよい。具体的な例において、Ｃａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡとの比は、約１：１または約１：２であってよい。
ＬＮＰの例示的な投薬には、総ＲＮＡ（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ）カーゴ含有量に対して約０．１、約０．２５、約０．３、約０．５、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約８、もしくは約１０ｍｇ／ｋｇ体重（ｍｐｋ）、または、約０．１～約１０、約０．２５～約１０、約０．３～約１０、約０．５～約１０、約１～約１０、約２～約１０、約３～約１０、約４～約１０、約５～約１０、約６～約１０、約８～約１０、約０．１～約８、約０．１～約６、約０．１～約５、約０．１～約４、約０．１～約３、約０．１～約２、約０．１～約１、約０．１～約０．５、約０．１～約０．３、約０．１～約０．２５、約０．２５～約８、約０．３～約６、約０．５～約５、約１～約５、もしくは約２～約３ｍｇ／ｋｇの体重が含まれる。そのようなＬＮＰは、例えば、静脈内に投与することができる。一例では、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１～約０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量を使用することができる。例えば、約０．０１、約０．０３、約０．１、約０．３、約１、約３、または約１０ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量を使用することができる。ＬＮＰの追加の例示的な投薬には、総ＲＮＡ（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ）カーゴ含有量に対して約０．１、約０．２５、約０．３、約０．５、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約８または約１０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）体重、または約０．１～約１０、約０．２５～約１０、約０．３～約１０、約０．５～約１０、約１～約１０、約２～約１０、約３～約１０、約４～約１０、約５～約１０、約６～約１０、約８～約１０、約０．１～約８、約０．１～約６、約０．１～約５、約０．１～約４、約０．１～約３、約０．１～約２、約０．１～約１、約０．１～約０．５、約０．１～約０．３、約０．１～約０．２５、約０．２５～約８、約０．３～約６、約０．５～約５、約１～約５、もしくは約２～約３ｍｇ／ｋｇの体重が含まれる。そのようなＬＮＰは、例えば、静脈内に投与することができる。一例では、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１～約０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量を使用することができる。例えば、約０．０１、約０．０３、約０．１、約０．３、約０．５、約１、約２、約３、または約１０ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量を使用することができる。別の例では、約０．５～約１０、約０．５～約５、約０．５～約３、約１～約１０、約１～約５、約１～約３、または約１～約２ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量を使用することができる。
Ｖ．核酸構築物および／またはヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸を含む組成物
本明細書に開示される標的ゲノム遺伝子座への組み込みおよびそれからの発現のためのレチノスキシンコード配列（すなわち、レチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードする）を含む核酸構築物、ベクター、または脂質ナノ粒子、ならびにヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸を含む組成物も本明細書で提供される。本明細書に開示される標的ゲノム遺伝子座への組み込みおよびそれからの発現のための、レチノスキシンコード配列（すなわち、レチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードする）、ベクター、または脂質ナノ粒子を含む核酸構築物を含む組成物も本明細書で提供される。ヌクレアーゼ剤もしくはヌクレアーゼ剤をコードする核酸（例えば、ヌクレアーゼ剤がＲＳ１遺伝子または遺伝子座を標的とする）、またはヌクレアーゼ剤もしくはヌクレアーゼ剤をコードする核酸を含むベクターまたは脂質ナノ粒子を含む組成物も本明細書で提供される。そのような組成物は、例えば、細胞内でレチノスキシンを発現するのに使用するため、またはレチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントのコード配列を細胞内の標的ゲノム遺伝子座に組み込むのに使用するためのものであり得る。そのような組成物はまた、例えば、Ｘ連鎖性若年網膜分離症（ＸＬＲＳ）を有する対象を治療するのに使用するためのものであり得る。そのような組成物は、標的ゲノム遺伝子座（または核酸構築物を含むベクターもしくは脂質ナノ粒子）への組み込みのためのレチノスキシンタンパク質またはその断片のコード配列を含む核酸構築物と、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸と、を含み得、ヌクレアーゼ剤は、標的ゲノム遺伝子座のヌクレアーゼ標的配列を標的とする。ヌクレアーゼ剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（例えば、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ）または任意の他の好適なヌクレアーゼ剤であり得る。好適なヌクレアーゼ剤の例を以下に提供する。
Ａ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系
本明細書に開示される方法および組成物は、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系またはそのような系の構成要素を利用して、細胞内のゲノム（例えば、ＲＳ１遺伝子座）を修飾することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系には、Ｃａｓ遺伝子の発現に関与する、またはその活性を指示する転写産物および他の要素が含まれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えば、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ系、またはタイプＶ系（例えば、サブタイプＶ－ＡまたはサブタイプＶ－Ｂ）であり得る。本明細書に開示される方法および組成物は、核酸の部位特異的結合または切断のためにＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓタンパク質と複合体化したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む）を利用することによってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いることができる。
本明細書に開示される組成物および方法で使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、非天然発生型であり得る。「天然に存在しない」系は、系の１つ以上の構成要素が、それらの天然に存在する状態から改変または変異されている、それらが天然に関連する少なくとも１つの他の構成要素を少なくとも実質的に含まない、またはそれらが天然に関連しない少なくとも１つの他の構成要素と関連するなど、ヒトの手の関与を示す任意のものを含む。例えば、いくつかのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、天然に発生しないｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を一緒に含む非天然発生型ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いるか、天然に発生しないＣａｓタンパク質を用いるか、または天然に発生しないｇＲＮＡを用いる。
１．Ｃａｓタンパク質
Ｃａｓタンパク質は一般に、ガイドＲＮＡと相互作用できる少なくとも１つのＲＮＡ認識または結合ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメインまたはＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質－タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、および他のドメインを含み得る。いくつかのそのようなドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメイン）は、ネイティブのＣａｓタンパク質に由来し得る。他のそのようなドメインを追加して、修飾Ｃａｓタンパク質を作製することができる。ヌクレアーゼドメインは、核酸分子の共有結合の切断を含む、核酸切断に対する触媒活性を有する。切断は、平滑末端または千鳥状の末端を生成することができ、それは一本鎖または二本鎖であり得る。例えば、野生型のＣａｓ９タンパク質は、通常、平滑の切断産物を生成する。代替的に、野生型Ｃｐｆ１タンパク質（例えば、ＦｎＣｐｆ１）は、非標的鎖のＰＡＭ配列から１８番目の塩基対の後および標的鎖の２３番目の塩基の後に切断が生じる、５－ヌクレオチドの５’オーバーハングを有する切断産物をもたらし得る。Ｃａｓタンパク質は、完全な切断活性を有し、標的ゲノム遺伝子座で二本鎖切断を作成することができるか（例えば、平滑末端を含む二本鎖切断）、またはそれは標的ゲノム遺伝子座で一本鎖切断を作成するニッカーゼであり得る。
Ｃａｓタンパク質の例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、およびＣｕ１９６６、ならびにそれらの相同体または修飾バージョンが挙げられる。
例示的なＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９タンパク質に由来するタンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来するものであり、典型的には、保存されたアーキテクチャを有する４つの重要なモチーフを共有する。モチーフ１、２、および４は、ＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３は、ＨＮＨモチーフである。例示的なＣａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉに由来する。Ｃａｓ９ファミリーメンバーの追加の例は、ＷＯ２０１４／１３１８３３に記載されており、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２が割り当てられている）は、例示的なＣａｓ９タンパク質である。例示的なＳｐＣａｓ９タンパク質配列は、配列番号２７（配列番号２６に示さているＤＮＡ配列によってコードされている）に示されている。例示的なＳｐＣａｓ９ ｃＤＮＡ配列は、配列番号２８に示されている。より小さなＣａｓ９タンパク質（例えば、ＳａＣａｓ９およびＣｊＣａｓ９およびＮｍｅ２Ｃａｓ９などのＣａｓ９およびガイドＲＮＡのガイドＲＮＡコード配列および調節エレメントと組み合わせた場合にそのコード配列が最大ＡＡＶパッケージング容量と互換性があるＣａｓ９タンパク質）は、他の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｊ７ＲＵＡ５が割り当てられている）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。同様に、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）例えば、（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０Ｐ８９７が割り当てられている）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８：１４５００を参照されたい。ＳａＣａｓ９は、ＳｐＣａｓ９よりも小さく、ＣｊＣａｓ９は、ＳａＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９の両方よりも小さい。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９（Ｎｍｅ２Ｃａｓ９）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、Ｅｄｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ７３（４）：７１４－７２６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座（Ｓｔ１Ｃａｓ９）によってコードされるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９ Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ３遺伝子座（Ｓｔ３Ｃａｓ９）由来のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９）は、他の例示的なＣａｓ９タンパク質である。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣａｓ９（ＦｎＣａｓ９）または代替ＰＡＭを認識するＲＨＡ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ９バリアント（Ｅ１３６９Ｒ／Ｅ１４４９Ｈ／Ｒ１５５６Ａ置換）は、他の例示的なＣａｓ９タンパク質である。これらおよび他の例示的なＣａｓ９タンパク質は、例えば、Ｃｅｂｒｉａｎ－Ｓｅｒｒａｎｏ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ（２０１７）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ２８（７）：２４７－２６１で概説されており、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｃａｓ９コード配列、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、およびＣａｓ９タンパク質配列の例は、ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＷＯ２０１４／０６５５９６、ＷＯ２０１６／１０６１２１およびＷＯ２０１９／０６７９１０に提供されており、これらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＯＲＦおよびＣａｓ９アミノ酸配列の特定の例は、表３０の段落［０４４９］ＷＯ２０１９／０６７９１０に提供され、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびＯＲＦの特定の例は、ＷＯ２０１９／０６７９１０の段落［０２１４］～［０２３４］に提供される。一例として、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号６２４２に示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。そのようなＣａｓ９タンパク質は、配列番号６２４３を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるｍＲＮＡによってコードされ得る。別の例として、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号６２４６に示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。そのようなＣａｓ９タンパク質は、配列番号６２４５を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるｍＲＮＡによってコードされ得る。
Ｃａｓタンパク質の別の例は、Ｃｐｆ１（ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ１由来のＣＲＩＳＰＲ）タンパク質である。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９の対応するドメインに相同なＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを、Ｃａｓ９の特徴的なアルギニンに富むクラスターの対応物とともに含む大きなタンパク質（約１３００アミノ酸）である。しかしながら、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠いており、ＨＮＨドメインを含む長い挿入を含むＣａｓ９とは対照的に、ＲｕｖＣ様ドメインは、Ｃｐｆ１配列において隣接している。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ １６３（３）：７５９－７７１を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。例示的なＣｐｆ１タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、およびＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅに由来する。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１；ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ｑ７Ｑ２が割り当てられている）は、例示的なＣｐｆ１タンパク質である。
Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（すなわち、本質的に発生するもの）、修飾Ｃａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓタンパク質バリアント）、または野生型もしくは修飾Ｃａｓタンパク質の断片であり得る。Ｃａｓタンパク質はまた、野生型または修飾Ｃａｓタンパク質の触媒活性に関して、活性なバリアントまたは断片であり得る。触媒活性に関する活性なバリアントまたは断片は、野生型または修飾Ｃａｓタンパク質またはその一部に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を含み得、活性なバリアントは、所望の切断部位で切断する能力を保持し、したがってニック誘導または二本鎖切断誘導活性を保持する。ニック誘導または二本鎖切断誘導活性のアッセイは知られており、一般に、切断部位を含むＤＮＡ基質上のＣａｓタンパク質の全体的な活性および特異性を測定する。
Ｃａｓタンパク質は、核酸結合親和性、核酸結合特異性、および酵素活性のうちの１つ以上を増加または減少させるように修飾され得る。Ｃａｓタンパク質は、安定性など、タンパク質の他の活性または特性を変更するように修飾することもできる。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つ以上のヌクレアーゼドメインを修飾、欠失、または不活性化することができ、またはＣａｓタンパク質を短縮して、タンパク質の機能に必須ではないドメインを除去するか、またはＣａｓタンパク質の活性または特性を最適化（例えば、増強または低減）することができる。
修飾Ｃａｓタンパク質の一例は、修飾ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１タンパク質であり、これは、非特異的ＤＮＡ接触を低減するように設計された改変を内包するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の忠実度の高いバリアント（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）である。例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５２９（７５８７）：４９０－４９５を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。修飾Ｃａｓタンパク質の別の例は、オフターゲット効果を低減するように設計された修飾ｅＳｐＣａｓ９バリアント（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）である。例えば、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１（６２６８）：８４－８８を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。他のＳｐＣａｓ９バリアントには、Ｋ８５５ＡおよびＫ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａが含まれる。これらおよび他の修飾Ｃａｓタンパク質は、例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｅｂｒｉａｎ－Ｓｅｒｒａｎｏ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ（２０１７）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ２８（７）：２４７－２６１で概説されており、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。修飾Ｃａｓ９タンパク質の別の例は、ｘＣａｓ９であり、これは拡大された範囲のＰＡＭ配列を認識することができるＳｐＣａｓ９バリアントである。例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ ５５６：５７－６３を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ｃａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、野生型Ｃｐｆ１タンパク質は、一般に、おそらく二量体立体配座で、標的ＤＮＡの両方の鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、一般に、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインは各々、二本鎖ＤＮＡの異なる鎖を切断して、ＤＮＡに二本鎖切断を行うことができる。例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２１を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ヌクレアーゼドメインの１つ以上またはすべてを欠失または変異させることで、それらがもはや機能しなくさせるか、またはヌクレアーゼ活性を低減させることができる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質でヌクレアーゼドメインの１つが欠失または変異している場合、結果として得られるＣａｓ９タンパク質はニッカーゼと呼ばれ、二本鎖標的ＤＮＡ内で一本鎖切断を生成できるが、二本鎖切断は生成できない（すなわち、相補的鎖または非相補的鎖を切断できるが、両方を切断することはできない）。ヌクレアーゼドメインの両方が削除または変異された場合、得られたＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖（例えば、ヌクレアーゼヌルまたはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、または触媒活性を伴わないＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ））を切断する能力が低減される。Ｃａｓ９タンパク質でヌクレアーゼドメインが欠失または変異している場合、Ｃａｓ９タンパク質は二本鎖切断誘導活性を保持する。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の例は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の１０位でのアスパラギン酸塩からアラニンへ）変異である。同様に、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＨＮＨドメインにあるＨ９３９Ａ（アミノ酸８３９位でのヒスチジンからアラニンへ）、Ｈ８４０Ａ（アミノ酸８４０位でのヒスチジンからアラニンへ）、またはＮ８６３Ａ（アミノ酸Ｎ８６３位でのアスパラギンからアラニンへ）は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換し得る。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の他の例には、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９への対応する変異が含まれる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（２１）：９２７５－９２８２およびＷＯ２０１３／１４１６８０を参照されたい。このような変異は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ媒介変異誘発、または全遺伝子合成などの方法を使用して生成することができる。ニッカーゼを生成する他の変異の例は、例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２およびＷＯ２０１３／１４２５７８において見出すことができ、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ヌクレアーゼドメインのすべてがＣａｓタンパク質で削除または変異された場合（例えば、ヌクレアーゼドメインの両方がＣａｓ９タンパク質で削除または変異された場合）、得られたＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖（例えば、ヌクレアーゼヌルまたはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質）を切断する能力が低減される。１つの特定の例は、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９二重変異体、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９と最適にアラインされた場合の別の種からのＣａｓ９の対応する二重変異体である。別の特定の例は、Ｄ１０Ａ／Ｎ８６３Ａ Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９二重変異体、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９と最適にアラインされた場合の別の種からのＣａｓ９の対応する二重変異体である。
ｘＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例は、ＳｐＣａｓ９について前述したものと同じである。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９タンパク質の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＣａｓ９酵素（ＳａＣａｓ９）は、Ｎ５８０位での置換（例えば、Ｎ５８０Ａ置換）およびＤ１０位での置換（例えば、Ｄ１０Ａ置換）を含み得、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質をもたらす。例えば、ＷＯ２０１６／１０６２３６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も知られている（例えば、Ｄ１６ＡとＨ５８８Ａとの組み合わせ）。Ｓｔ１Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である（例えば、Ｄ９Ａ、Ｄ５９８Ａ、Ｈ５９９Ａ、およびＮ６２２Ａの組み合わせ）。Ｓｔ３Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である（例えば、Ｄ１０ＡとＮ８７０Ａとの組み合わせ）。ＣｊＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である（例えば、Ｄ８ＡとＨ５５９Ａとの組み合わせ）。ＦｎＣａｓ９およびＲＨＡ ＦｎＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である（例えば、Ｎ９９５Ａ）。
Ｃｐｆ１タンパク質の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も公知である。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、およびＭｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７（ＭｂＣｐｆ１ Ｃｐｆ１）由来のＣｐｆ１タンパク質に関して、そのような変異には、ＡｓＣｐｆ１の９０８、９９３、もしくは１２６３位またはＣｐｆ１オルソログの対応する位置、あるいはＬｂＣｐｆ１の８３２、９２５、９４７、もしくは１１８０位またはＣｐｆ１オルソログの対応する位置での変異が含まれ得る。そのような変異は、例えば、ＡｓＣｐｆ１の変異Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、およびＤ１２６３ＡもしくはＣｐｆ１オルソログの対応する変異、またはＬｂＣｐｆ１のＤ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、Ｄ９４７Ａ、およびＤ１１８０ＡもしくはＣｐｆ１オルソログの対応する変異のうちの１つ以上を含み得る。例えば、ＵＳ２０１６／０２０８２４３を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ｃａｓタンパク質はまた、融合タンパク質として異種ポリペプチドに作動可能に連結され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は切断ドメインまたはエピジェネティック修飾ドメインに融合させることができる。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０８９２９０を参照されたい。Ｃａｓタンパク質は、安定性の増加または減少を提供する異種ポリペプチドに融合することもできる。融合ドメインまたは異種ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質の内部に位置し得る。
一例として、Ｃａｓタンパク質は、細胞内局在化を提供する１つ以上の異種ポリペプチドに融合してもよい。そのような異種ポリペプチドは、例えば、核を標的とするための単一部分ＳＶ４０ ＮＬＳおよび／または二部分アルファインポーチンＮＬＳなどの１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアを標的とするためのミトコンドリア局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなどを含んでもよい。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（８）：５１０１－５１０５を参照されたい。そのような細胞内局在化シグナルは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内の任意の場所に位置し得る。ＮＬＳは、一続きの塩基性アミノ酸を含むことができ、単節型配列または双節型配列であり得る。任意選択で、Ｃａｓタンパク質は、Ｎ末端にＮＬＳ（例えば、アルファ－インポーチンＮＬＳまたは単節型ＮＬＳ）およびＣ末端にＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳまたは双節型ＮＬＳ）を含む２つ以上のＮＬＳを含み得る。Ｃａｓタンパク質はまた、Ｎ末端に２つ以上のＮＬＳおよび／またはＣ末端に２つ以上のＮＬＳを含み得る。
Ｃａｓタンパク質は、例えば、１～１０個のＮＬＳと融合され得る（例えば、１～５つのＮＬＳと融合されるか、１つのＮＬＳと融合され得る。１つのＮＬＳが使用される場合、ＮＬＳは、Ｃａｓタンパク質配列のＮ末端またはＣ末端で連結され得る。ＮＬＳはまた、Ｃａｓタンパク質配列内に挿入され得る。代替的に、Ｃａｓタンパク質は、２つ以上のＮＬＳと融合され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、２、３、４、または５つのＮＬＳと融合され得る。具体的な例では、Ｃａｓタンパク質は、２つのＮＬＳと融合され得る。特定の状況では、２つのＮＬＳは、同じ（例えば、２つのＳＶ４０ ＮＬＳ）または異なり得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、カルボキシ末端で連結された２つのＳＶ４０ ＮＬＳ配列に融合され得る。代替的に、Ｃａｓタンパク質は、２つのＮＬＳと融合され得、１つはＮ末端で、１つはＣ末端で連結されている。他の例では、Ｃａｓタンパク質は、３つのＮＬＳと融合され得るか、またはＮＬＳなしで融合され得る。ＮＬＳは、例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４９）またはＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号５０）などの単一部分配列であり得る。ＮＬＳは、ヌクレオプラスミンのＮＬＳ、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号５１）などの二部分配列であり得る。具体的な例では、単一のＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４９）ＮＬＳは、Ｃａｓタンパク質のＣ末端で連結され得る。１つ以上のリンカーは、任意選択で融合部位に含まれる。
Ｃａｓタンパク質はまた、細胞透過性ドメインまたはタンパク質導入ドメインに作動可能に連結され得る。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ－１ ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルスからのＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ－１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルスからの細胞透過性ペプチド、またはポリアルギニンペプチド配列に由来し得る。例えば、ＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１３／１７６７７２を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。細胞透過性ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＣａｓタンパク質内の任意の場所に位置し得る。
Ｃａｓタンパク質はまた、追跡または精製を容易にするために、蛍光タンパク質、精製タグ、またはエピトープタグなどの異種ポリペプチドに作動可能に連結され得る。蛍光タンパク質の例には、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、および任意の他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例には、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、およびカルモジュリンが挙げられる。
Ｃａｓタンパク質は、標識された核酸またはドナー配列に係留してもよい。そのような係留（すなわち、物理的結合）は、共有相互作用または非共有相互作用を介して達成することができ、係留は、直接（例えば、タンパク質またはインテイン修飾上のシステインまたはリジン残基の修飾によって達成することができる直接融合または化学的結合を介して）またはストレプトアビジンまたはアプタマーなどの１つ以上の介在するリンカーまたはアダプター分子を介して達成することができる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５（１）：４１－５５、Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４６（４６）：８８１９－８８２２、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ ａｎｄ Ｄｉｘｏｎ（２００９）Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．６２（１０）：１３２８－１３３２、Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．１０（９）：１５５１－１５５７、およびＫｈａｔｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０（１４）：４５３２－４５３９を参照されたい。タンパク質－核酸コンジュゲートを合成するための非共有戦略には、ビオチン－ストレプトアビジンおよびニッケル－ヒスチジン法が含まれる。共有結合タンパク質－核酸コンジュゲートは、様々な化学物質を使用して適切に機能化された核酸とタンパク質を接続することによって合成できる。これらの化学物質のいくつかは、タンパク質表面のアミノ酸残基（例えば、リジンアミンまたはシステインチオール）へのオリゴヌクレオチドの直接結合を含むが、他のより複雑なスキームは、タンパク質の翻訳後修飾または触媒もしくは反応性タンパク質ドメインの関与を必要とする。タンパク質の核酸への共有結合の方法には、例えば、オリゴヌクレオチドのタンパク質リジンまたはシステイン残基への化学的架橋、発現されたタンパク質ライゲーション、化学酵素的方法、および光アプタマーの使用が含まれ得る。標識された核酸またはドナー配列は、Ｃａｓタンパク質のＣ末端、Ｎ末端、または内部領域に係留されていてもよい。一例では、標識された核酸またはドナー配列は、Ｃａｓタンパク質のＣ末端またはＮ末端に係留される。同様に、Ｃａｓタンパク質は、標識された核酸またはドナー配列の５’末端、３’末端、または内部領域に係留されていてもよい。すなわち、標識された核酸またはドナー配列は、任意の方向および極性で係留してもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、標識された核酸またはドナー配列の５’末端または３’末端に係留されていてもよい。
Ｃａｓタンパク質は、任意の形態で提供され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などのタンパク質の形態で提供してもよい。代替的に、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡなどの、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で提供してもよい。任意選択で、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞または生物におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞においてより頻度高く使用される代替コドンへと修飾することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸が細胞に導入されると、Ｃａｓタンパク質は、一時的、条件付き、または構成的に細胞内で発現され得る。
ｍＲＮＡとして提供されるＣａｓタンパク質は、安定性および／または免疫原性の特性の改善のために修飾され得る。修飾は、ｍＲＮＡ内の１つ以上のヌクレオシドに対して行われ得る。ｍＲＮＡ核酸塩基への化学修飾の例には、シュードウリジン、１－メチル－シュードウリジン、および５－メチル－シチジンが挙げられる。例えば、Ｎ１－メチルシュードウリジンを含むキャップされポリアデニル化されたＣａｓ ｍＲＮＡを使用することができる。同様に、Ｃａｓ ｍＲＮＡは、同義コドンを使用してウリジンを枯渇させることによって修飾され得る。
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、細胞のゲノムにおいて安定して組み込まれ、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。代替的に、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、発現構築物中のプロモーターに作動可能に連結され得る。発現構築物は、遺伝子または他の目的の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を指示することができ、そのような目的の核酸配列を標的細胞に導入することができる任意の核酸構築物を含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクター内に存在してもよい。代替的に、それは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターとは別個のベクターまたはプラスミドであってもよい。発現構築物において使用することができるプロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生が制限された前駆細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚のうちの１つ以上において活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってよい。任意選択で、プロモーターは、一方向のＣａｓタンパク質と他の方向のガイドＲＮＡの両方の発現を駆動する双方向プロモーターであってもよい。このような双方向プロモーターは、（１）遠位配列要素（ＤＳＥ）、近位配列要素（ＰＳＥ）、およびＴＡＴＡボックスの３つの外部制御要素を含む完全な従来の一方向Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ならびに（２）ＤＳＥの５’末端に逆方向に融合されたＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターで構成してもよい。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスに隣接しており、プロモーターは、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを追加することによって逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを作成することにより、双方向にすることができる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００７４５３５を参照されたい。双方向プロモーターを使用してＣａｓタンパク質とガイドＲＮＡをコードする遺伝子を同時に発現させることにより、コンパクトな発現カセットを生成して送達を容易にすることができる。
様々なプロモーターを使用して、Ｃａｓ発現またはＣａｓ９発現を駆動できる。いくつかの方法では、ＣａｓまたはＣａｓ９コード配列がＡＡＶ構築物に適合することができるように小さなプロモーターが使用される。例えば、ＣａｓまたはＣａｓ９および１つ以上のｇＲＮＡ（例えば、１つのｇＲＮＡまたは２つのｇＲＮＡまたは３つのｇＲＮＡまたは４つのｇＲＮＡ）は、ＬＮＰ媒介送達（例えば、ＲＮＡの形態）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達（例えば、ＡＡＶ２媒介送達、ＡＡＶ５媒介送達、ＡＡＶ８媒介送達またはＡＡＶ７ｍ８媒介送達）を介して送達することができる。例えば、ヌクレアーゼ剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９であり得、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよび内因性ＲＳ１遺伝子座（例えば、ＲＳ１のイントロン１）を標的とするｇＲＮＡは、ＬＮＰ媒介送達、またはＣａｓ９をコードするＤＮＡおよび内因性ＲＳ１遺伝子座（例えば、ＲＳ１のイントロン１）を標的とするｇＲＮＡコードするＤＮＡは、ＡＡＶ媒介送達を介して送達することができる。ＣａｓまたはＣａｓ９およびｇＲＮＡは、単一のＡＡＶで、または２つの別個のＡＡＶを介して送達することができる。例えば、第１のＡＡＶは、ＣａｓまたはＣａｓ９発現カセットを担持することができ、第２のＡＡＶは、ｇＲＮＡ発現カセットを担持することができる。同様に、第１のＡＡＶは、ＣａｓまたはＣａｓ９発現カセットを担持することができ、第２のＡＡＶは、２つ以上のｇＲＮＡ発現カセットを担持することができる。代替的に、単一のＡＡＶは、ＣａｓまたはＣａｓ９発現カセット（例えば、プロモーターに作動可能に連結されたＣａｓまたはＣａｓ９コード配列）およびｇＲＮＡ発現カセット（例えば、プロモーターに作動可能に連結されたｇＲＮＡコード配列）を担持することができる。同様に、単一のＡＡＶは、ＣａｓまたはＣａｓ９発現カセット（例えば、プロモーターに作動可能に連結されたＣａｓまたはＣａｓ９コード配列）および２つ以上のｇＲＮＡ発現カセット（例えば、プロモーターに作動可能に連結されたｇＲＮＡコード配列）を担持することができる。Ｕ６プロモーターまたはｓｍａｌｌ ｔＲＮＡ Ｇｌｎなど、様々なプロモーターを使用してｇＲＮＡの発現を駆動することができる。同様に、Ｃａｓ９の発現を駆動するために様々なプロモーターを使用できる。例えば、Ｃａｓ９コード配列がＡＡＶ構築物に適合することができるように小さなプロモーターが使用される。同様に、小さなＣａｓ９タンパク質（例えば、ＳａＣａｓ９またはＣｊＣａｓ９を使用して、ＡＡＶパッケージング容量を最大化する）。
ｍＲＮＡとして提供されるＣａｓタンパク質は、安定性および／または免疫原性の特性の改善のために修飾され得る。修飾は、ｍＲＮＡ内の１つ以上のヌクレオシドに対して行われ得る。ｍＲＮＡ核酸塩基への化学修飾の例としては、シュードウリジン、１－メチル－シュードウリジン、および５－メチル－シチジンが挙げられる。Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡはまたキャップされ得る。キャップは、例えば、＋１リボヌクレオチドがリボースの２’Ｏ位でメチル化されているキャップ１構造であり得る。キャッピングは、例えば、インビボで優れた活性を与えることができ（例えば、天然のキャップを模倣することによって）、宿主の自然免疫系の刺激を低減する天然の構造をもたらすことができる（例えば、自然免疫系のパターン認識受容体の活性化を低減することができる）。Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは、ポリアデニル化することもできる（ポリ（Ａ）テールを構成するため）。Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは、シュードウリジンを含むように修飾することもできる（例えば、シュードウリジンで完全に置換することができる）。別の例として、Ｎ１－メチルシュードウリジンを含むキャップされポリアデニル化されたＣａｓ ｍＲＮＡを使用することができる。別の例として、シュードウリジンで完全に置換されたＣａｓ ｍＲＮＡを使用することができる（すなわち、すべての標準的なウラシル残基は、ウラシルが窒素－炭素ではなく炭素－炭素結合で結合しているウリジン異性体であるシュードウリジンで置換される）。同様に、Ｃａｓ ｍＲＮＡは、同義コドンを使用してウリジンを枯渇させることによって修飾され得る。例えば、シュードウリジンで完全に置換されたキャップおよびポリアデニル化されたＣａｓ ｍＲＮＡを使用することができる。
Ｃａｓ ｍＲＮＡは、少なくとも１つ、複数、またはすべてのウリジン位置に修飾ウリジンを含むことができる。修飾ウリジンは、５位で修飾されたウリジンであり得る（例えば、ハロゲン、メチル、またはエチルで）。修飾ウリジンは、１位で修飾されたシュードウリジンであり得る（例えば、ハロゲン、メチル、またはエチルで）。修飾ウリジンは、例えば、シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、５－メトキシウリジン、５－ヨードウリジン、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの例では、修飾ウリジンは、５－メトキシウリジンである。いくつかの例では、修飾ウリジンは、５－ヨードウリジンである。いくつかの例では、修飾ウリジンは、シュードウリジンである。いくつかの例では、修飾ウリジンは、Ｎ１－メチル－シュードウリジンである。いくつかの例では、修飾ウリジンは、シュードウリジンとＮ１－メチル－シュードウリジンとの組み合わせである。いくつかの例では、修飾ウリジンは、シュードウリジンと５－メトキシウリジンとの組み合わせである。いくつかの例では、修飾ウリジンは、Ｎ１－メチルシュードウリジンと５－メトキシウリジンとの組み合わせである。いくつかの例では、修飾ウリジンは、５－ヨードウリジンとＮ１－メチル－シュードウリジンとの組み合わせである。いくつかの例では、修飾ウリジンは、シュードウリジンと５－ヨードウリジンとの組み合わせである。いくつかの例では、修飾ウリジンは、５－ヨードウリジンと５－メトキシウリジンとの組み合わせである。
本明細書に開示されるＣａｓ ｍＲＮＡはまた、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、またはＣａｐ２などの５’キャップを含み得る。５’キャップは、一般に、５’－三リン酸を介して、ｍＲＮＡの５’から３’鎖の最初のヌクレオチドの５’位（すなわち、最初のキャップ近位ヌクレオチド）に連結された７－メチルグアニンリボヌクレオチド（例えば、ＡＲＣＡに関してさらに修飾され得る）である。Ｃａｐ０では、ｍＲＮＡの第１および第２のキャップ近位ヌクレオチドのリボースは両方とも、２’－ヒドロキシルを含む。Ｃａｐ１では、ｍＲＮＡの第１および第２の転写ヌクレオチドのリボースは、それぞれ、２’－メトキシおよび２’－ヒドロキシルを含む。Ｃａｐ２では、ｍＲＮＡの第１および第２のキャップ近位ヌクレオチドのリボースは両方とも、２’－メトキシを含む。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｔｉｂａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１（３３）：１２０２５－３０およびＡｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１４（１１）：Ｅ２１０６－Ｅ２１１５を参照されたい。ヒトｍＲＮＡなどの哺乳動物ｍＲＮＡを含むほとんどの内因性高等真核生物ｍＲＮＡは、Ｃａｐ１またはＣａｐ２を含む。Ｃａｐ１およびＣａｐ２とは異なるＣａｐ０および他のキャップ構造は、ＩＦＩＴ－１およびＩＦＩＴ－５などの自然免疫系の構成要素によって非自己として認識されるため、ヒトなどの哺乳動物では免疫原性であり得、Ｉ型インターフェロンを含むサイトカインレベルの上昇を引き起こす可能性がある。ＩＦＩＴ－１およびＩＦＩＴ－５などの自然免疫系の構成要素もｅＩＦ４Ｅと競合して、ｍＲＮＡとＣａｐ１またはＣａｐ２以外のキャップとの結合を競合し、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する可能性がある。
キャップは共転写で含めることができる。例えば、ＡＲＣＡ（アンチリバースキャップアナログ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号ＡＭ８０４５）は、グアニンリボヌクレオチドの５’位に連結された７－メチルグアニン３’－メトキシ－５’－三リン酸を含むキャップ類似体であり、開始時に転写物にインビトロで組み込むことができる。ＡＲＣＡは、最初のキャップ近位ヌクレオチドの２’位がヒドロキシルであるＣａｐ０キャップをもたらす。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＳｔｅｐｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）ＲＮＡ７：１４８６－１４９５を参照されたい。
ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｎ－７１１３）またはＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＧＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧ、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｎ－７１３３）を使用して、Ｃａｐ１構造を共転写的に提供する。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧおよびＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＧＧの３’－Ｏ－メチル化バージョンはまたは、それぞれ、カタログ番号Ｎ－７４１３およびＮ－７４３３としてＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている。
代替的に、転写後にキャップをＲＮＡに追加することもできる。例えば、ワクシニアキャッピング酵素は、市販されており（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ２０８０Ｓ）、Ｄ１サブユニットによって提供されるＲＮＡトリホスファターゼおよびグアニリルトランスフェラーゼ活性と、Ｄ１２サブユニットによって提供されるグアニンメチルトランスフェラーゼを有する。したがって、Ｓ－アデノシルメチオニンおよびＧＴＰの存在下で、ＲＮＡに７－メチルグアニンを付加してＣａｐ０を与えることができる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｕｏ ａｎｄ Ｍｏｓｓ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：４０２３－４０２７およびＭａｏ ａｎｄ Ｓｈｕｍａｎ（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２４４７２－２４４７９を参照されたい。
Ｃａｓ ｍＲＮＡは、ポリアデニル化（ポリＡまたはポリ（Ａ）またはポリアデニン）テールをさらに含むことができる。ポリＡテールは、例えば、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００のアデニン、および任意選択で最大３００のアデニンを含む。例えば、ポリＡテールは、９５、９６、９７、９８、９９、または１００のアデニンヌクレオチドを含むことができる。
２．ガイドＲＮＡ
「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）に結合し、かつＣａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の位置に標的化するＲＮＡ分子である。ガイドＲＮＡは、「ＤＮＡ標的化セグメント」（ガイド配列とも呼ばれる）および「タンパク質結合セグメント」の２つのセグメントで構成できる。「セグメント」は、ＲＮＡ中のヌクレオチドの連続したストレッチなどの、分子のセクションまたは領域を含む。Ｃａｓ９のものなど、いくつかのｇＲＮＡは、「アクチベーターＲＮＡ」（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）および「ターゲッターＲＮＡ」（例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）の２つの別個のＲＮＡ分子を含み得る。他のｇＲＮＡは、単一ＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）であり、これはまた「単一分子ｇＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」、または「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれ得る。例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＷＯ２０１４／０６５５９６、ＷＯ２０１４／０８９２９０、ＷＯ２０１４／０９３６２２、ＷＯ２０１４／０９９７５０、ＷＯ２０１３／１４２５７８、およびＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）またはｃｒＲＮＡとトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との組み合わせのいずれかを指す。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子（単一のガイドＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）として、または２つの別個のＲＮＡ分子（二重ガイドＲＮＡまたはｄｇＲＮＡ）として関連付けることができる。例えば、Ｃａｓ９の場合、シングルガイドＲＮＡは、（例えば、リンカーを介して）ｔｒａｃｒＲＮＡに融合したｃｒＲＮＡを含むことができる。例えば、Ｃｐｆ１の場合、標的配列への結合および／またはその切断を実現するために必要なのはｃｒＲＮＡだけである。「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」という用語は、二重分子（すなわち、モジュラー）ｇＲＮＡおよび単一分子ｇＲＮＡの両方を含む。本明細書に開示されるいくつかの方法および組成物において、ｇＲＮＡは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ ｇＲＮＡまたはその同等物である。本明細書に開示されるいくつかの方法および組成物において、ｇＲＮＡは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９ ｇＲＮＡまたはその同等物である。
例示的な２分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「ターゲッターＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子および対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「アクチベーターＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的セグメント（一本鎖）と、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の半分を形成するヌクレオチドのストレッチ（つまり、ｃｒＲＮＡテール）の両方を含む。ＤＮＡ標的化セグメントの下流（３’）に位置するｃｒＲＮＡテールの例は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号２９）またはＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号５２）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメントのいずれも、配列番号２９または５２の５’末端に結合して、ｃｒＲＮＡを形成することができる。
対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（アクチベーターＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の残りの半分を形成するヌクレオチドのストレッチを含む。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチは、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチと相補的であり、それをハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。したがって、各ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言われ得る。例示的なｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号３０）、ＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号３１）、またはＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号３２）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方が必要とされる系では、ｃｒＲＮＡおよび対応するｔｒａｃｒＲＮＡは、ハイブリダイズしてｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡのみが必要な系では、ｃｒＲＮＡはｇＲＮＡであってもよい。ｃｒＲＮＡは追加的に、標的ＤＮＡの相補的鎖にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡ標的セグメントを提供する。細胞内での修飾に使用される場合、所与のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子が使用される種に特異的になるように設計され得る。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８２３－８２６、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６０９６）：８１６－８２１、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（３）：２２７－２２９、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（３）：２３３－２３９、およびＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８１９－８２３を参照されたい。
所与のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（ｃｒＲＮＡ）は、以下により詳細に記載されるように、標的ＤＮＡの相補的鎖上の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して配列特異的様式で標的ＤＮＡと相互作用する。したがって、ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は変化してもよく、ｇＲＮＡおよび標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の位置を決定する。目的のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列にハイブリダイズするように修飾され得る。天然発生型ｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および生物によって異なるが、２１～４６ヌクレオチドの長さの２つのダイレクトリピート（ＤＲ）が隣接する、２１～７２ヌクレオチド長の標的化セグメントを含むことが多い（例えば、ＷＯ２０１４／１３１８３３を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの場合、ＤＲは３６ヌクレオチド長であり、標的化セグメントは３０ヌクレオチド長である。３’に位置するＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡと相補的であり、それをハイブリダイズし、それは順にＣａｓタンパク質と結合する。
ＤＮＡ標的化セグメントは、例えば、少なくとも約１２、少なくとも約１５、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、または少なくとも約４０ヌクレオチドの長さを有し得る。そのようなＤＮＡ標的化セグメントは、例えば、約１２～約１００、約１２～約８０、約１２～約５０、約１２～約４０、約１２～約３０、約１２～約２５、または約１２～約２０ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１５～約２５ヌクレオチド（例えば、約１７～約２０ヌクレオチド、または約１７、１８、１９、もしくは２０ヌクレオチド）であり得る。例えば、ＵＳ２０１６／００２４５２３を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、１６～２０ヌクレオチド長、または１７～２０ヌクレオチド長である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、２１～２３ヌクレオチド長である。Ｃｐｆ１の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、少なくとも１６ヌクレオチド長または少なくとも１８ヌクレオチド長さである。
一例では、ＤＮＡ標的化セグメントは、約２０ヌクレオチドの長さであり得る。しかしながら、より短い配列およびより長い配列も標的化セグメントに使用することができる（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドの長さなどの、１５～２５ヌクレオチドの長さ）。ＤＮＡ標的化セグメントと対応するガイドＲＮＡ標的配列との間の同一性の程度（またはＤＮＡ標的化セグメントとガイドＲＮＡ標的配列の他の鎖との間の相補性の程度）は、例えば、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％であり得る。ＤＮＡ標的化セグメントおよび対応するガイドＲＮＡ標的配列には、１つ以上のミスマッチが含まれ得る。例えば、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントおよび対応するガイドＲＮＡ標的配列には、１～４、１～３、１～２、１、２、３、または４つのミスマッチが含まれ得る（例えば、ガイドＲＮＡ標的配列の全長が、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０以上のヌクレオチドである）。例えば、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントおよび対応するガイドＲＮＡ標的配列には、ガイドＲＮＡ標的配列の全長が、２０ヌクレオチドである、１～４、１～３、１～２、１、２、３、または４つのミスマッチが含まれ得る。
一例として、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１４８～６２４１のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的セグメント）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＤＮＡ標的化セグメント（すなわち、ガイド配列）を含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１４８～６２４１のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、もしくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド（ＤＮＡ標的化セグメント）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１４８～６２４１のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１４８～６２４１のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１４８～６２４１のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続するヌクレオチド（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１４８～６２４１のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続するヌクレオチド（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１４８～６２４１のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的セグメント）と３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、または１ヌクレオチド以下異なる配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１４８～６２４１のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続するヌクレオチド（ＤＮＡ標的化セグメント）と３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、または１ヌクレオチド以下異なる配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。このようなガイド配列の例を表２および３に示す。
ガイドＲＮＡは、ヒトＲＳ１遺伝子を標的とすることができる。一例として、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１４８～４９８９のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的セグメント）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＤＮＡ標的化セグメント（すなわち、ガイド配列）を含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１４８～４９８９のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、もしくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド（ＤＮＡ標的化セグメント）を含むか、本質的にそれからかなるか、またはそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１４８～４９８９のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１４８～４９８９のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１４８～４９８９のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続するヌクレオチド（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１４８～４９８９のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続するヌクレオチド（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１４８～４９８９のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的セグメント）と３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、または１ヌクレオチド以下異なる配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１４８～４９８９のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続するヌクレオチド（ＤＮＡ標的化セグメント）と３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、または１ヌクレオチド以下異なる配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。
ガイドＲＮＡは、ヒトＲＳ１遺伝子を標的とし、オフターゲット効果を回避するように選択することができる。一例として、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１４８～３１５１、３１５４～３１８６、３１８８～３２４７、および３２４９～４３５１のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的セグメント）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＤＮＡ標的化セグメント（すなわち、ガイド配列）を含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１４８～３１５１、３１５４～３１８６、３１８８～３２４７、および３２４９～４３５１のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、もしくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド（ＤＮＡ標的化セグメント）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１４８～３１５１、３１５４～３１８６、３１８８～３２４７、および３２４９～４３５１のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１４８～３１５１、３１５４～３１８６、３１８８～３２４７、および３２４９～４３５１のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１４８～３１５１、３１５４～３１８６、３１８８～３２４７、および３２４９～４３５１のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続するヌクレオチド（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１４８～３１５１、３１５４～３１８６、３１８８～３２４７、および３２４９～４３５１のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続するヌクレオチド（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１４８～３１５１、３１５４～３１８６、３１８８～３２４７、および３２４９～４３５１のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的セグメント）と３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、または１ヌクレオチド以下異なる配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１４８～３１５１、３１５４～３１８６、３１８８～３２４７、および３２４９～４３５１のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続するヌクレオチド（ＤＮＡ標的化セグメント）と３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、または１ヌクレオチド以下異なる配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。
ガイドＲＮＡは、ヒトＲＳ１遺伝子を標的とすることができる。一例として、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１５０、３１５１、３１５９、３６７５、４２９７、および４３０４のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的セグメント）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＤＮＡ標的化セグメント（すなわち、ガイド配列）を含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１５０、３１５１、３１５９、３６７５、４２９７、および４３０４のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、もしくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド（ＤＮＡ標的化セグメント）を含むか、本質的にそれからかなるか、またはそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１５０、３１５１、３１５９、３６７５、４２９７、および４３０４のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１５０、３１５１、３１５９、３６７５、４２９７、および４３０４のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１５０、３１５１、３１５９、３６７５、４２９７、および４３０４のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続するヌクレオチド（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１５０、３１５１、３１５９、３６７５、４２９７、および４３０４のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続するヌクレオチド（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１５０、３１５１、３１５９、３６７５、４２９７、および４３０４のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的セグメント）と３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、または１ヌクレオチド以下異なる配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１５０、３１５１、３１５９、３６７５、４２９７、および４３０４のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続するヌクレオチド（ＤＮＡ標的化セグメント）と３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、または１ヌクレオチド以下異なる配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。
ガイドＲＮＡは、マウスＲｓ１遺伝子を標的とすることができる。一例として、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号４９９０～６２４１（例えば、配列番号５４７７または５９８１）のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的セグメント）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＤＮＡ標的化セグメント（すなわち、ガイド配列）を含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号４９９０～６２４１（例えば、配列番号５４７７または５９８１）のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、もしくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド（ＤＮＡ標的化セグメント）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号４９９０～６２４１（例えば、配列番号５４７７または５９８１）のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号４９９０～６２４１（例えば、配列番号５４７７または５９８１）のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号４９９０～６２４１（例えば、配列番号５４７７または５９８１）のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続するヌクレオチド（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号４９９０～６２４１（例えば、配列番号５４７７または５９８１）のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続するヌクレオチド（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号４９９０～６２４１（例えば、配列番号５４７７または５９８１）のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的セグメント）と３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、または１ヌクレオチド以下異なる配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号４９９０～６２４１（例えば、配列番号５４７７または５９８１）のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続するヌクレオチド（ＤＮＡ標的化セグメント）と３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、または１ヌクレオチド以下異なる配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。
ＴｒａｃｒＲＮＡは、任意の形態（例えば、完全長ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、および様々な長さであり得る。それらには、一次転写物または処理された形態が含まれ得る。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡの一部として、または２分子ｇＲＮＡの一部としての別個の分子として）は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５、またはそれ以上のヌクレオチド）のすべてまたは一部を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例には、１７１ヌクレオチド、８９ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、および６５ヌクレオチドのバージョンが含まれる。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７１（７３４０）：６０２－６０７、ＷＯ２０１４／０９３６６１を参照されたい。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内のｔｒａｃｒＲＮＡの例としては、ｓｇＲＮＡの＋４８、＋５４、＋６７、および＋８５バージョン内に見出されるｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが挙げられ、ここで、「＋ｎ」は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの最大＋ｎヌクレオチドがｓｇＲＮＡに含まれることを示す。ＵＳ８，６９７，３５９を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補的鎖との間の相補性パーセントは、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であり得る。ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補的鎖との間の相補性パーセントは、約２０個の連続するヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であり得る。一例として、ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補的鎖との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補的鎖の５’末端にある１４個の連続するヌクレオチドにわたって１００％であってもよく、残りの部分にわたって０％まで低くてもよい。そのような場合、ＤＮＡ標的化セグメントは、１４ヌクレオチド長であるとみなされ得る。別の例として、ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補的鎖との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補的鎖の５’末端にある７個の連続するヌクレオチドにわたって１００％であってもよく、残りの部分にわたって０％まで低くてもよい。このような場合、ＤＮＡ標的セグメントは７ヌクレオチド長であるとみなすことができる。いくつかのガイドＲＮＡでは、ＤＮＡ標的セグメント内の少なくとも１７ヌクレオチドがターゲットＤＮＡの相補的鎖に相補的である。例えば、ＤＮＡ標的セグメントは、２０ヌクレオチド長であってもよく、標的ＤＮＡの相補的鎖との１、２、または３つのミスマッチを含むことができる。一例では、ミスマッチは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に対応する相補的鎖（すなわち、ＰＡＭ配列の逆相補体）の領域に隣接していない（例えば、ミスマッチは、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントの５’末端にあるか、またはミスマッチは、ＰＡＭ配列に対応する相補的鎖の領域から、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、もしくは１９塩基対離れている）。
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的であるヌクレオチドの２つのストレッチを含み得る。タンパク質結合セグメントの相補的ヌクレオチドは、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。目的のｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、Ｃａｓタンパク質と相互作用し、ｇＲＮＡは、結合したＣａｓタンパク質を、ＤＮＡ標的化セグメントを介して標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に配向する。
単一ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメントおよび足場配列（すなわち、ガイドＲＮＡのタンパク質結合またはＣａｓ結合配列）を含み得る。例えば、そのようなガイドＲＮＡは、３’足場配列に結合された５’ＤＮＡ標的化セグメントを有することができる。例示的な足場配列は、以下を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる：ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ（バージョン１、配列番号３３）、ＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン２、配列番号３４）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン３、配列番号３５）、ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン４、配列番号３６）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（バージョン５、配列番号３７）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（バージョン６、配列番号３８）、ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵ（バージョン７、配列番号３９）、またはＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン８、配列番号５３）。いくつかのガイドｓｇＲＮＡでは、バージョン６の４つの末端Ｕ残基が存在しない。いくつかのガイドｓｇＲＮＡでは、バージョン６の４つの末端Ｕ残基のうちの１つ、２つ、または３つしか存在しない。本明細書に開示されるガイドＲＮＡ標的配列のうちのいずれかを標的化するガイドＲＮＡは、例えば、ガイドＲＮＡの３’末端の例示的なガイドＲＮＡ足場配列のうちのいずれかに融合したガイドＲＮＡの５’末端のＤＮＡ標的化セグメントを含み得る。すなわち、本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメントのうちのいずれかは、上記の足場配列のうちのいずれか１つの５’末端に結合して、単一ガイドＲＮＡ（キメラガイドＲＮＡ）を形成することができる。
ガイドＲＮＡは、追加の望ましい特徴（例えば、修飾または調節された安定性；細胞内標的化；蛍光標識による追跡；タンパク質またはタンパク質複合体の結合部位など）を提供する修飾または配列を含み得る。すなわち、ガイドＲＮＡは、１つ以上の修飾ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、または標準的なＡ、Ｇ、Ｃ、およびＵ残基の代わりに、またはそれに加えて使用される１つ以上の非天然および／もしくは天然に存在する成分もしくは構成を含むことができる。そのような修飾の例には、例えば、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニレートキャップ（ｍ７Ｇ））、３’ポリアデニル化テール（すなわち、３’ポリ（Ａ）テール）、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質および／またはタンパク質複合体による調節された安定性および／または調節されたアクセス可能性を可能にするため）、安定性制御配列、ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内の位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する修飾または配列、追跡を提供する修飾または配列（例えば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を容易にする部分への複合体化、蛍光検出を可能にする配列など）、タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）の結合部位を提供する修飾または配列、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。修飾の他の例には、操作されたステムループ二重構造、操作されたバルジ領域、ステムループ二重構造の操作されたヘアピン３’、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例えば、ＵＳ２０１５／０３７６５８６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。バルジは、ｃｒＲＮＡ様領域と最小のｔｒａｃｒＲＮＡ様領域で構成される二重鎖内のヌクレオチドの対になっていない領域であり得る。バルジは、二重鎖の片側に、対になっていない５’－ＸＸＸＹ－３’を含むことができ、Ｘは、任意のプリンであり、Ｙは、反対側の鎖のヌクレオチドおよび二重鎖の反対側の対になっていないヌクレオチドの領域とゆらぎ対を形成し得るヌクレオチドであり得る。
修飾されていない核酸は、分解されやすい場合がある。外因性核酸はまた、自然免疫応答を誘導し得る。修飾は、安定性を導入し、免疫原性を低減するのに役立ち得る。ガイドＲＮＡは、例えば、以下のうちの１つ以上を含む修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを含むことができる：（１）ホスホジエステル骨格結合における、非結合リン酸酸素の１つもしくは両方および／または結合リン酸酸素の１つ以上の改変もしくは置換（例示的な骨格修飾）、（２）リボース糖の２’ヒドロキシルの改変または置換などのリボース糖の構成要素の改変または置換（例示的な糖修飾）、（３）リン酸部分の脱リン酸化リンカーによる置換（大規模な置換）（例示的な骨格修飾）、（４）非標準的な核酸塩基を含む天然に存在する核酸塩基の修飾または置換（例示的な塩基修飾）、（５）リボース－リン酸骨格の置換または修飾（例示的な骨格修飾）、（６）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾（例えば、末端リン酸基の除去、修飾、もしくは置換、または部分、キャップ、もしくはリンカーの結合（３’または５’キャップの修飾は、糖および／または骨格修飾を含み得る））、ならびに（７）糖の修飾または置換（例示的な糖修飾）。他の可能なガイドＲＮＡ修飾には、ウラシルまたはポリ－ウラシルトラクトの修飾または置換が含まれる。例えば、ＷＯ２０１５／０４８５７７およびＵＳ２０１６／０２３７４５５を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。同様の修飾を、Ｃａｓ ｍＲＮＡなどのＣａｓコード核酸に行うことができる。例えば、Ｃａｓ ｍＲＮＡは、同義のコドンを使用してウリジンを枯渇させることによって修飾することができる。
上記のホースでのような化学修飾を組み合わせて、２、３、４、またはそれ以上の修飾を有することができる残基（ヌクレオシドおよびヌクレオチド）を含む修飾ｇＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡを提供することができる。例えば、修飾残基は、修飾された糖および修飾された核酸塩基を有することができる。一例では、ｇＲＮＡのすべての塩基が修飾されている（例えば、すべての塩基は、ホスホロチオエート基などの修飾されたリン酸基を有する）。例えば、ｇＲＮＡのすべてまたは実質的にすべてのリン酸基をホスホロチオエート基で置換することができる。代替的または追加的に、修飾ｇＲＮＡは、５’末端またはその近くに少なくとも１つの修飾残基を含むことができる。代替的または追加的に、修飾ｇＲＮＡは、３’末端またはその近くに少なくとも１つの修飾残基を含むことができる。
いくつかのｇＲＮＡは、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の修飾残基を含む。例えば、修飾ｇＲＮＡにおける少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の位置は、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドであり得る。
修飾されていない核酸は、分解されやすい場合がある。外因性核酸はまた、自然免疫応答を誘導し得る。修飾は、安定性を導入し、免疫原性を低減するのに役立ち得る。本明細書に記載のいくつかのｇＲＮＡは、細胞内または血清ベースのヌクレアーゼに対する安定性を導入するために、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むことができる。本明細書に記載されているいくつかの修飾ｇＲＮＡは、細胞の集団に導入された場合、自然免疫応答の低減を示す可能性がある。
本明細書に開示されるｇＲＮＡは、修飾残基のリン酸基が、１つ以上の酸素を異なる置換基で置換することによって修飾され得る骨格修飾を含むことができる。修飾は、本明細書に記載されるように、修飾されていないリン酸部分を修飾されたリン酸基で大規模に置換することを含み得る。リン酸骨格の骨格修飾には、非荷電リンカーまたは非対称電荷分布を有する荷電リンカーのいずれかをもたらす変化も含まれ得る。
修飾されたリン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレン酸、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルが挙げられる。修飾されていないリン酸基のリン原子は、アキラル性である。しかしながら、非架橋酸素のうちの１つを上記の原子または原子の基のうちの１つに置換すると、リン原子がキラルになる可能性がある。立体中心のリン原子は、「Ｒ」配置（Ｒｐ）または「Ｓ」配置（Ｓｐ）のいずれかを有することができる。骨格は、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドに結合する酸素）を、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレンホスホネート）で置換することによっても修飾することができる。置換は、結合酸素または結合酸素の両方で生じる可能性がある。
リン酸基は、特定の骨格修飾でリンを含まないコネクタに置換することができる。いくつかの実施形態では、荷電リン酸基は、中性部分によって置換することができる。リン酸基を置換することができる部分の例としては、例えば、メチルホスホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルマセタール、ホルマセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノが挙げられるが、これらに限定されない。
核酸を模倣することができる足場はまた、リン酸リンカーおよびリボース糖がヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチド代用物によって置換させるように構築され得る。そのような修飾は、骨格および糖修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、代理骨格によってつながれ得る。例としては、モルフォリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代用物が挙げられるが、これらに限定されない。
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、糖基への１つ以上の修飾（糖修飾）を含むことができる。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）を修飾することができる（例えば、いくつかの異なるオキシまたはデオキシ置換基で置換することができる）。２’－アルコキシドイオンを形成するためにヒドロキシルを脱プロトン化することができなくなるため、２’ヒドロキシル基への修飾は核酸の安定性を高めることができる。
２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（または、「Ｒ」は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲが挙げられ、式中、Ｒは、例えば、Ｈまたは任意選択で置換されたアルキルであり得、ｎは、０～２０（例えば、０～４、０～８、０～１０、０～１６、１～４、１～８、１～１０、１～１６、１～２０、２～４、２～８、２～１０、２～１６、２～２０、４～８、４～１０、４～１６、および４～２０）の整数であり得る。２’ヒドロキシル基修飾は、２’－Ｏ－Ｍｅであり得る。同様に、２’ヒドロキシル基修飾は、２’－フルオロ修飾であり得、これは２’ヒドロキシル基をフッ化物で置き換える。２’ヒドロキシル基修飾は、２’ヒドロキシルが、例えば、Ｃ１－６アルキレンまたはＣ１－６ヘテロアルキレンブリッジによって、同じリボース糖の４’炭素に接続され得るロックされた核酸（ＬＮＡ）を含み得、例示的なブリッジは、メチレン、プロピレン、エーテルまたはアミノブリッジ；Ｏ－アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミンまたはポリアミノであり得る）およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎ－アミノ、（アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノまたはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）を含み得る。２’ヒドロキシル基修飾は、リボース環がＣ２’－Ｃ３’結合を欠いているアンロックされた核酸（ＵＮＡ）を含み得る。２’ヒドロキシル基修飾は、メトキシエチル基（ＭＯＥ）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、例えば、ＰＥＧ誘導体）を含み得る。
デオキシ２’修飾には、水素（すなわち、例えば、部分的にｄｓＲＮＡのオーバーハング部分にあるデオキシリボース糖）、ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロまたはヨード）、アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）、ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２－アミノ（アミノは、例えば、本明細書に記載されるように）、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、シアノメルカプト、アルキル－チオ－アルキル、チオアルコキシ、ならびにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルを含み得、これらは、任意選択で、例えば、本明細書に記載のアミノで置換することができる。
糖修飾は、リボース中の対応する炭素とは反対の立体化学的配置を有する１つ以上の炭素を含み得る糖基を含むことができる。したがって、修飾核酸は、糖として、例えば、アラビノースを含むヌクレオチドを含み得る。修飾核酸はまた、脱塩基糖を含み得る。これらの脱塩基糖はまた、構成糖原子のうちの１つ以上でさらに修飾することができる。修飾核酸はまた、Ｌ型である１つ以上の糖（例えば、Ｌ－ヌクレオシド）を含み得る。
修飾核酸に組み込むことができる、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、核酸塩基とも呼ばれる修飾塩基を含み得る。核酸塩基の例としては、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの核酸塩基は、修飾核酸に組み込むことができる修飾残基を提供するために修飾され得るか、または完全に置換され得る。ヌクレオチドの核酸塩基は、独立して、プリン、ピリミジン、プリン類似体、またはピリミジン類似体から選択することができる。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、例えば、塩基の天然に存在する合成誘導体を含むことができる。
二重ガイドＲＮＡでは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの各々に修飾を含めることができる。このような修飾は、ｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡの一端または両端にあり得る。ｓｇＲＮＡでは、ｓｇＲＮＡの一端または両端の１つ以上の残基が化学的に修飾されているか、かつ／または内部ヌクレオシドが修飾されているか、かつ／またはｓｇＲＮＡ全体が化学的に修飾されている可能性がある。いくつかのｇＲＮＡは、５’末端修飾を含む。いくつかのｇＲＮＡは、３’末端修飾を含む。
本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１８／１０７０２８Ａｌに開示される修飾パターンのうちの１つを含むことができる。本明細書に開示されるガイドＲＮＡはまた、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１７／０１１４３３４に開示される構造／修飾パターンのうちの１つを含むことができる。本明細書に開示されるガイドＲＮＡはまた、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１７／１３６７９４、ＷＯ２０１７／００４２７９、ＵＳ２０１８／０１８７１８６、またはＵＳ２０１９／００４８３３８に開示される構造／修飾パターンのうちの１つを含むことができる。
一例として、ガイドＲＮＡの５’または３’末端のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含むことができる（例えば、塩基は、ホスホロチオアート基である修飾されたリン酸基を有することができる）。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’または３’末端の２、３、または４つの末端ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含み得る。別の例として、ガイドＲＮＡの５’および／または３’末端のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有し得る。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’および／または３’末端（例えば、５’末端）の２、３、または４つの末端ヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾を含み得る。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１およびＦｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２２（９）：２２２７－２２３５を参照されたい。他の可能な修飾は、本明細書の他の場所でより詳細に説明されている。１つの具体的な例において、ガイドＲＮＡは、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡ残基に２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。別の具体的な例では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用しないすべての２’ＯＨ基が２’－Ｏ－メチル類似体に置き換えられ、Ｃａｓ９と最小限の相互作用をゆするガイドＲＮＡのテール領域は、５’および３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合で修飾されている。追加的に、ＤＮＡ標的化セグメントは、いくつかの塩基に２’－フルオロ修飾を有することができる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３５（１２）：１１７９－１１８７を参照されたい。修飾されたガイドＲＮＡの他の例は、例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／１０７０２８Ａ１に提供されている。そのような化学修飾は、例えば、エキソヌクレアーゼからのより優れた安定性および保護をガイドＲＮＡに提供して、それらが修飾されていないガイドＲＮＡよりも長く細胞内に存続することを可能にする。このような化学修飾は、例えば、ＲＮＡを積極的に分解したり、細胞死をもたらす免疫カスケードを引き起こしたりする可能性のある自然免疫応答から保護することもできる。
一例として、本明細書に記載のガイドＲＮＡのいずれも、少なくとも１つの修飾を含むことができる。一例では、少なくとも１つの修飾は、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含む。例えば、少なくとも１つの修飾は、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含むことができる。代替的または追加的に、少なくとも１つの修飾は、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含むことができる。代替的または追加的に、少なくとも１つの修飾は、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含むことができる。一例では、本明細書に記載のガイドＲＮＡは、１つ以上の２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドおよびヌクレオチド間の１つ以上のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。
修飾は、ガイドＲＮＡの任意の場所に生じ得る。一例として、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’末端の最初の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾を含み、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの３’末端の最後の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾、またはそれらの組み合わせを含む。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの最初の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合、ガイドＲＮＡの最後の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合、またはそれらの組み合わせを含むことができる。代替的または追加的に、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’末端の最初の３つのヌクレオチドでの２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含むことができ、ガイドＲＮＡの３’末端の最後の３つのヌクレオチドでの２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
一例では、修飾ｇＲＮＡは、以下の配列：ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号４４）を含むことができ、「Ｎ」は、任意の天然または非天然のヌクレオチドであり得、Ｎ残基の全体性は、本明細書に記載のＲＳ１ ＤＮＡ標的化セグメントを含む（例えば、配列番号４４に示される配列、Ｎ残基は、配列番号３１４８～６２４１のうちのいずれか１つ、または配列番号３１４８～４９８９のうちのいずれか１つ、または配列番号３１４８～３１５１、３１５４～３１８６、３１８８～３２４７、および３２４９～４３５１のうちのいずれか１つ、または配列番号３１５０、３１５１、３１５９、３６７５、４２９７、および４３０４のうちのいずれか１つ、または配列番号４９９０～６２４１（例えば、５４７７または５９８１）のうちのいずれか１つのＤＮＡ標的化セグメントで置換される）。「ｍＡ」、「ｍＣ」、「ｍＵ」、および「ｍＧ」という用語は、２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されたヌクレオチド（それぞれ、Ａ、Ｃ、Ｕ、およびＧ）を示す。「＊」という記号は、ホスホロチオエート修飾を示す。ホスホロチオエート連結または結合は、ホスホジエステル結合、例えばヌクレオチド塩基間の結合において、硫黄が１つの非架橋リン酸酸素の代わりに使用される結合を指す。ホスホロチオエートを使用してオリゴヌクレオチドを生成する場合、修飾オリゴヌクレオチドはＳ－オリゴと呼ばれることもあり得る。Ａ＊、Ｃ＊、Ｕ＊またはＧ＊という用語は、ホスホロチオエート結合で次の（例えば３’）ヌクレオチドに連結されるヌクレオチドを示す。「ｍＡ＊」、「ｍＣ＊」、「ｍＵ＊」および「ｍＧ＊」という用語は、２’－Ｏ－Ｍｅ置換され、ホスホロチオエート結合で次の（例えば、３’）ヌクレオチドに連結されるヌクレオチド（それぞれＡ、Ｃ、Ｕ、およびＧ）を示す。
ヌクレオチド糖環に影響を与えることが示されている他の化学修飾は、ハロゲン置換である。例えば、ヌクレオチド糖環の２’－フルオロ（２’－Ｆ）置換は、オリゴヌクレオチド結合親和性およびヌクレアーゼ安定性を高めることができる。脱塩基ヌクレオチドとは、窒素塩基を欠くヌクレオチドを指す。反転した塩基とは、通常の５’から３’への結合（すなわち、５’から５’への結合または３’から３’への結合）から反転した結合を有するものを指す。
脱塩基ヌクレオチドは、逆結合で結合することができる。例えば、脱塩基ヌクレオチドは、５’から５’への結合を介して末端５’ヌクレオチドに結合され得るか、または脱塩基ヌクレオチドは、３’から３’への結合を介して末端３’ヌクレオチドに結合され得る。末端の５’または３’ヌクレオチドのいずれかにある逆脱塩基ヌクレオチドは、逆脱塩基エンドキャップと呼ばれることもあり得る。
一例では、５’末端の最初の３、４、または５ヌクレオチドのうちの１つ以上、および３’末端の最後の３、４、または５ヌクレオチドのうちの１つ以上が修飾されている。修飾は、例えば、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆ、逆塩基性ヌクレオチド、ホスホロチオエート結合、または安定性および／または性能を高めることがよく知られている他のヌクレオチド修飾であり得る。
別の例では、５’末端の最初の４ヌクレオチド、および３’末端の最後の４ヌクレオチドをホスホロチオエート結合で連結することができる。
別の例では、５’末端の最初の３つのヌクレオチド、および３’末端の最後の３つのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含むことができる。別の例では、５’末端の最初の３つのヌクレオチド、および３’末端の最後の３つのヌクレオチドは、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。別の例では、５’末端の最初の３つのヌクレオチド、および３’末端の最後の３つのヌクレオチドは、逆塩基性ヌクレオチドを含む。
ガイドＲＮＡは、任意の形態で提供され得る。例えば、ｇＲＮＡは、２つの分子（別個のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）または１つの分子（ｓｇＲＮＡ）のいずれかとしてＲＮＡの形態で、および任意にＣａｓタンパク質との複合体の形態で提供され得る。ｇＲＮＡはまた、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供され得る。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一ＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）または別個のＲＮＡ分子（例えば、別個のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードすることができる。後者の場合、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、１つのＤＮＡ分子として、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをそれぞれコードする別個のＤＮＡ分子として提供され得る。
ｇＲＮＡがＤＮＡの形態で提供される場合、ｇＲＮＡは、一時的、条件付き、または構成的に細胞内で発現され得る。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞のゲノムにおいて安定して組み込まれ、細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。代替的に、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、発現構築物中のプロモーターに作動可能に連結され得る。例えば、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸などの異種核酸を含むベクター内にあり得る。代替的に、それは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクターとは別個のベクターまたはプラスミドであり得る。そのような発現構築物において使用され得るプロモーターには、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発達的に制限された前駆細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚のうちの１つ以上において活性なプロモーターが含まれる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであり得る。そのようなプロモーターはまた、例えば、双方向プロモーターであり得る。好適なプロモーターの特定の例には、ヒトＵ６プロモーター、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、またはマウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを挙げられる。別の例では、ｓｍａｌｌ ｔＲＮＡ Ｇｌｎを使用して、ガイドＲＮＡの発現を駆動してもよい。
代替的に、ｇＲＮＡは、他の様々な方法で調製され得る。例えば、ｇＲＮＡは、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写によって調製され得る（例えば、ＷＯ２０１４／０８９２９０およびＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたく、それらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ガイドＲＮＡはまた、化学的合成によって調製された合成的に生成された分子であり得る。例えば、ガイドＲＮＡを化学的に合成して、最初の３つの５’および３’末端ＲＮＡ残基に２’－Ｏ－メチル類似体および３’ホスホロチオアートヌクレオチド間結合を含むことができる。
ガイドＲＮＡ（またはガイドＲＮＡをコードする核酸）は、１つ以上のガイドＲＮＡ（例えば、１、２、３、４、またはそれ以上のガイドＲＮＡ）およびガイドＲＮＡの安定性を増加させる（例えば、所与の貯蔵条件下（例えば、－２０℃、４℃、または周囲温度）で、分解生成物が、出発核酸またはタンパク質の０．５重量％を下回るままであるような、閾値を下回る期間を延長するか、またはインビボで安定性を増加させる）担体を含む組成物中にあり得る。そのような担体の非限定的な例には、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－コグリコール－酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コキレート（ｃｏｃｈｌｅａｔｅｓ）、および脂質微小管が挙げられる。そのような組成物は、Ｃａｓ９タンパク質などのＣａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードする核酸をさらに含み得る。
３．ガイドＲＮＡ標的配列
ガイドＲＮＡの標的ＤＮＡには、結合に十分な条件が存在する場合に、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントが結合するＤＮＡに存在する核酸配列が含まれる。好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件には、細胞に通常存在する生理学的条件が含まれる。他の好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ｇＲＮＡに相補的であり、かつそれとハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は、「相補的鎖」と呼ばれることができ、「相補的鎖」に相補的である（したがって、Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡに相補的ではない）標的ＤＮＡの鎖は、「非相補的鎖」または「テンプレート鎖」と呼ばれることができる。
標的ＤＮＡは、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補的鎖上の配列と非相補的鎖上の対応する配列（例えば、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する）の両方を含む。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、「ガイドＲＮＡ標的配列」という用語は、ガイドＲＮＡが相補的鎖上でハイブリダイズする配列に対応する（すなわち、その逆相補体）非相補的鎖上の配列を具体的に指す。すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＰＡＭに隣接する非相補的鎖上の配列（例えば、Ｃａｓ９の場合、ＰＡＭの上流または５’）を指す。ガイドＲＮＡ標的配列は、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと同等であるが、ウラシルの代わりにチミンを含む。一例として、ＳｐＣａｓ９酵素のガイドＲＮＡ標的配列は、非相補的鎖上の５’－ＮＧＧ－３’ＰＡＭの上流の配列を指し得る。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの相補的鎖に対して相補性を有するように設計されており、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補的鎖との間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ではない。ガイドＲＮＡが本明細書でガイドＲＮＡ標的配列を標的とするものとして言及される場合、それは、ガイドＲＮＡが、非相補的鎖上のガイドＲＮＡ標的配列の逆相補体である標的ＤＮＡの相補的鎖配列にハイブリダイズすることを意味する。
標的ＤＮＡまたはガイドＲＮＡ標的配列は、任意のポリヌクレオチドを含み得、例えば、細胞の核または細胞質内、あるいはミトコンドリアまたは葉緑体などの細胞の細胞小器官内に位置し得る。標的ＤＮＡまたはガイドＲＮＡ標的配列は、細胞に対して内因性または外因性の任意の核酸配列であり得る。ガイドＲＮＡ標的配列は、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列または非コード配列（例えば、調節配列）であり得るか、または両方を含み得る。
Ｃａｓタンパク質による標的ＤＮＡの部位特異的結合および切断は、（ｉ）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡの相補的鎖との間の塩基対合相補性、および（ｉｉ）標的ＤＮＡの非相補的鎖にある、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフの両方によって決定される位置で起こり得る。ＰＡＭは、ガイドＲＮＡ標的配列に隣接し得る。任意選択で、ガイドＲＮＡ標的配列は、３’末端でＰＡＭが隣接し得る（例えば、Ｃａｓ９の場合）。代替的に、ガイドＲＮＡ標的配列は、５’末端でＰＡＭが隣接し得る（例えば、Ｃｐｆ１の場合）。例えば、Ｃａｓタンパク質の切断部位は、ＰＡＭ配列の上流または下流（例えば、ガイドＲＮＡ標的配列内）の約１～約１０または約２～約５塩基対（例えば、３塩基対）であり得る。ＳｐＣａｓ９の場合、ＰＡＭ配列（すなわち、非相補的鎖上）は、５’－Ｎ１ＧＧ－３’であり得、Ｎ１は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ＰＡＭは、標的ＤＮＡの非相補的鎖上のガイドＲＮＡ標的配列の３’のすぐ近くである。したがって、相補的鎖上のＰＡＭに対応する（すなわち、逆相補体）配列は、５’－ＣＣＮ２－３’であり、Ｎ２は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが標的ＤＮＡの相補的鎖にハイブリダイズする配列の５’のすぐ近くである。いくつかのそのような場合、Ｎ１およびＮ２は、相補的であることができ、Ｎ１～Ｎ２塩基対は、任意の塩基対であり得る（例えば、Ｎ１＝ＣおよびＮ２＝Ｇ、Ｎ１＝ＧおよびＮ２＝Ｃ、Ｎ１＝ＡおよびＮ２＝Ｔ、またはＮ１＝ＴおよびＮ２＝Ａ）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９の場合、ＰＡＭは、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲであり得、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴであり得、Ｒは、ＧまたはＡであり得る。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９の場合、ＰＡＭは、例えば、ＮＮＮＮＡＣＡＣまたはＮＮＮＮＲＹＡＣであり得、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴであり得、Ｒは、ＧまたはＡであり得る。いくつかの場合（例えば、ＦｎＣｐｆ１の場合）では、ＰＡＭ配列は、５’の上流にあり、配列５’－ＴＴＮ－３’を有し得る。
ガイドＲＮＡ標的配列の例は、ＳｐＣａｓ９タンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前の２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列＋ＰＡＭの２つの例は、ＧＮ１９ＮＧＧ（配列番号４０）またはＮ２０ＮＧＧ（配列番号４１）である。例えば、ＷＯ２０１４／１６５８２５を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。５’末端のグアニンは、細胞内のＲＮＡポリメラーゼによる転写を促進することができる。ガイドＲＮＡ標的配列およびＰＡＭの他の例は、インビトロでのＴ７ポリメラーゼによる効率的な転写を促進するために、５’末端に２つのグアニンヌクレオチドを含み得る（例えば、ＧＧＮ２０ＮＧＧ、配列番号４２）。例えば、ＷＯ２０１４／０６５５９６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。他のガイドＲＮＡ標的配列およびＰＡＭは、５’ＧまたはＧＧおよび３’ＧＧまたはＮＧＧを含む、配列番号４０～４２の４～２２ヌクレオチド長を有し得る。さらに他のガイドＲＮＡ標的配列およびＰＡＭは、配列番号４０～４２の１４～２０ヌクレオチド長を有し得る。
ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、例えば、ＲＳ１遺伝子の第１のイントロン、またはＲＳ１遺伝子の第１のイントロンに隣接する配列（例えば、ＲＳ１遺伝子の第１のエキソンまたは第２のエキソン）を標的とすることができる。
標的ＤＮＡにハイブリダイズしたＣＲＩＳＰＲ複合体の形成は、ガイドＲＮＡ標的配列（すなわち、標的ＤＮＡの非相補的鎖上のガイドＲＮＡ標的配列およびガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補的鎖上の逆相補体）に対応する領域内または領域の近くの標的ＤＮＡの一方または両方の鎖の切断をもたらし得る。例えば、切断部位は、ガイドＲＮＡ標的配列内にあり得る（例えば、ＰＡＭ配列に対して定義された位置に）。「切断部位」は、Ｃａｓタンパク質が一本鎖切断または二本鎖切断を生成する標的ＤＮＡの位置を含む。切断部位は、一本鎖のみ（例えば、ニッカーゼが使用される場合）または二本鎖ＤＮＡの両方の鎖上にあり得る。切断部位は、両方の鎖上の同じ位置にあり得るか（平滑末端を生成する；例えば、Ｃａｓ９）、または各鎖上の異なる部位にあり得る（千鳥状の末端を生成する（すなわち、オーバーハング）；例えば、Ｃｐｆ１）。千鳥状の末端は、例えば、各々が異なる鎖上の異なる切断部位で一本鎖切断を生成し、それによって二本鎖切断を生成する２つのＣａｓタンパク質を使用することによって生成され得る。例えば、第１のニッカーゼは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１の鎖上に一本鎖切断を作成することができ、第２のニッカーゼは、オーバーハング配列が作成されるようにｄｓＤＮＡの第２の鎖上に一本鎖切断を作成することができる。いくつかの場合では、第１の鎖のニッカーゼのガイドＲＮＡ標的配列または切断部位は、第２の鎖のニッカーゼのガイドＲＮＡ標的配列または切断部位から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、または１，０００塩基対分離されている。
ヒトＲＳ１遺伝子などのＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、ＲＳ１遺伝子の任意の所望の位置を標的とすることができる。ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、例えば、ＲＳ１遺伝子の第１のイントロン、またはＲＳ１遺伝子の第１のイントロンに隣接する配列（例えば、ＲＳ１遺伝子の第１のエキソンまたは第２のエキソン）を標的とすることができる。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＲＳ１遺伝子の任意の連続する配列を含むことができる。ＲＳ１遺伝子という用語は、ＲＳ１調節プロモーターおよびエンハンサー配列ならびにコード配列を含むゲノム領域を含む。ガイドＲＮＡ標的配列は、コード配列、非コード配列（例えば、プロモーターまたはエンハンサー領域などの調節エレメント）、またはそれらの組み合わせを含むことができる。一例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、エキソンをコードする任意のＲＳ１の連続するコード配列を含むことができる。一例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＲＳ１遺伝子のエキソン１にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＲＳ１遺伝子のエキソン２にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＲＳ１遺伝子のエキソン３にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＲＳ１遺伝子のエキソン４にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＲＳ１遺伝子のエキソン５にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＲＳ１遺伝子のエキソン６にあり得る。ガイドＲＮＡ標的配列は、ＲＳ１イントロンのいずれかに連続する配列を含むこともできる。一例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＲＳ１遺伝子のイントロン１にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＲＳ１遺伝子のイントロン２にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＲＳ１遺伝子のイントロン３にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＲＳ１遺伝子のイントロン４にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＲＳ１遺伝子のイントロン５にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＲＳ１遺伝子のイントロン６にあり得る。
ガイドＲＮＡ標的配列は、オフターゲット修飾を最小限に抑えるか、またはオフターゲット効果を回避するように選択することもできる（例えば、オフターゲットゲノム配列とのミスマッチが２つ以下になることを回避することによって）。
一例として、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号５４～３１４７うちのいずれか１つに示されるガイドＲＮＡ標的配列を標的とすることができる。別の例として、ＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号５４～３１４７のうちのいずれか１つに示されるガイドＲＮＡ標的配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続するヌクレオチドを標的とすることができる。このようなガイドＲＮＡ標的配列の例を表２および３に示す。
一例として、ヒトＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号５４～１８９５のうちのいずれか１つに示されるガイドＲＮＡ標的配列を標的とすることができる。別の例として、ヒトＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号５４～１８９５のうちのいずれか１つに示されるガイドＲＮＡ標的配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続するヌクレオチドを標的とすることができる。
一例として、ヒトＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号５４～５７、６０～９２、９４～１５３、および１５５～１２５７のうちのいずれか１つに示されるガイドＲＮＡ標的配列を標的とすることができる。別の例として、ヒトＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号５４～５７、６０～９２、９４～１５３、および１５５～１２５７のうちのいずれか１つに示されるガイドＲＮＡ標的配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続するヌクレオチドを標的とすることができる。
一例として、ヒトＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号５６、５７、６５、５８１、１２０３、および１２１０のうちのいずれか１つに示されるガイドＲＮＡ標的配列を標的とすることができる。別の例として、ヒトＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号５６、５７、６５、５８１、１２０３、および１２１０のうちのいずれか１つに示されるガイドＲＮＡ標的配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続するヌクレオチドを標的とすることができる。
一例として、マウスＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号１８９６～３１４７（例えば、配列番号２３８３または２８８７）のうちのいずれか１つに示されるガイドＲＮＡ標的配列を標的とすることができる。別の例として、マウスＲＳ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号１８９６～３１４７（例えば、配列番号２３８３または２８８７）のうちのいずれか１つに示されるガイドＲＮＡ標的配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続するヌクレオチドを標的とすることができる。
Figure 2022553573000003
Figure 2022553573000004
Figure 2022553573000005
Figure 2022553573000006
Figure 2022553573000007
Figure 2022553573000008
Figure 2022553573000009
Figure 2022553573000010
Figure 2022553573000011
Figure 2022553573000012
Figure 2022553573000013
Figure 2022553573000014
Figure 2022553573000015
Figure 2022553573000016
Figure 2022553573000017
Figure 2022553573000018
Figure 2022553573000019
Figure 2022553573000020
Figure 2022553573000021
Figure 2022553573000022
Figure 2022553573000023
Figure 2022553573000024
Figure 2022553573000025
Figure 2022553573000026
Figure 2022553573000027
Figure 2022553573000028
Figure 2022553573000029
Figure 2022553573000030
Figure 2022553573000031
Figure 2022553573000032
Figure 2022553573000033
Figure 2022553573000034
Figure 2022553573000035
Figure 2022553573000036
Figure 2022553573000037
Figure 2022553573000038
Figure 2022553573000039
Figure 2022553573000040
Figure 2022553573000041
Figure 2022553573000042
Figure 2022553573000043
Figure 2022553573000044
Figure 2022553573000045
Figure 2022553573000046
Figure 2022553573000047
Figure 2022553573000048
Figure 2022553573000049
Figure 2022553573000050
Figure 2022553573000051
Figure 2022553573000052
Figure 2022553573000053
Figure 2022553573000054
Figure 2022553573000055
Figure 2022553573000056
Figure 2022553573000057
Figure 2022553573000058
Figure 2022553573000059
Figure 2022553573000060
Figure 2022553573000061
Figure 2022553573000062
Figure 2022553573000063
Figure 2022553573000064
Figure 2022553573000065
Figure 2022553573000066
Figure 2022553573000067
Figure 2022553573000068
Figure 2022553573000069
Figure 2022553573000070
Figure 2022553573000071
Figure 2022553573000072
Figure 2022553573000073
Figure 2022553573000074
Figure 2022553573000075
Figure 2022553573000076
Figure 2022553573000077
Figure 2022553573000078
Figure 2022553573000079
Figure 2022553573000080
Figure 2022553573000081
Figure 2022553573000082
Figure 2022553573000083
Figure 2022553573000084
Ｂ．他のヌクレアーゼ剤およびヌクレアーゼ剤の標的配列
所望の標的配列においてニックまたは二本鎖切断を誘導する任意のヌクレアーゼ剤を、本明細書に開示される方法および組成物で使用することができる。ヌクレアーゼ剤が所望の標的配列でニックまたは二本鎖切断を誘導する限り、天然に存在するか、または天然のヌクレアーゼ剤を使用することができる。代替的に、修飾または操作されたヌクレアーゼ剤を使用することができる。「操作されたヌクレアーゼ剤」は、その天然の形態から操作された（修飾または誘導された）ヌクレアーゼを含み、所望の標的配列においてニックまたは二本鎖切断を特異的に認識および誘導する。したがって、操作されたヌクレアーゼ剤は、天然の天然に存在するヌクレアーゼ剤から誘導することができ、または人工的に作成または合成することができる。操作されたヌクレアーゼは、例えば、標的配列においてニックまたは二本鎖切断を誘導することができ、標的配列は、天然の（非操作または非修飾）ヌクレアーゼ剤によって認識されたであろう配列ではない。ヌクレアーゼ剤の修飾は、タンパク質切断剤中のわずか１アミノ酸または核酸切断剤中の１ヌクレオチドであってよい。標的配列または他のＤＮＡにおいてニックまたは二本鎖切断を生成することは、本明細書では、標的配列または他のＤＮＡを「切断する（ｃｕｔｔｉｎｇ）」または「切断する（ｃｌｅａｖｉｎｇ）」と呼ぶことができる。
例示された標的配列の活性バリアントおよび断片も提供される。そのような活性バリアントは、所与の標的配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を含むことができ、活性バリアントは、生物学的活性を保持し、したがって配列特異的様式でヌクレアーゼ剤によって認識および切断され得る。ヌクレアーゼ剤による標的配列の二本鎖切断を測定するためのアッセイは公知である。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＦｒｅｎｄｅｗｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７６：２９５－３０７を参照されたい。
ヌクレアーゼ剤の標的配列は、標的遺伝子座の中または近くの任意の場所に位置し得る。標的配列は、遺伝子のコード領域内、または遺伝子の発現に影響を及ぼす調節領域内に位置してもよい。ヌクレアーゼ剤の標的配列は、イントロン、エキソン、プロモーター、エンハンサー、調節領域、または任意の非タンパク質コード領域に位置してもよい。
ヌクレアーゼ剤の１つの種類は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、原核生物または真核生物のゲノム内の特定の標的配列で二本鎖切断を行うために使用できる配列特異的ヌクレアーゼのクラスである。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、天然または操作された転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター、またはその機能的部分を、例えば、ＦｏｋＩなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに融合することによって作成される。独自のモジュラーＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインにより、特定のＤＮＡ認識特異性を備えたタンパク質の設計が可能になる。したがって、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、特定のＤＮＡ標的部位を認識するように操作することができ、したがって、所望の標的配列で二本鎖切断を行うために使用することができる。すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１０／０７９４３０；Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７（５０）：２１６１７－２１６２２、Ｓｃｈｏｌｚｅ ＆ Ｂｏｃｈ（２０１０）Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ １：４２８－４３２、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０）１８６：７５７－７６１、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１０）ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ７０４、およびＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：１４３－１４８を参照されたい。
好適なＴＡＬヌクレアーゼの例、および好適なＴＡＬヌクレアーゼを調製するための方法は、例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１１／０２３９３１５Ａ１、ＵＳ２０１１／０２６９２３４Ａ１、ＵＳ２０１１／０１４５９４０Ａ１、ＵＳ２００３／０２３２４１０Ａ１、ＵＳ２００５／０２０８４８９Ａ１、ＵＳ２００５／００２６１５７Ａ１、ＵＳ２００５／００６４４７４Ａ１、ＵＳ２００６／０１８８９８７Ａ１、およびＵＳ２００６／００６３２３１Ａ１に開示されている。様々な実施形態では、例えば、目的の遺伝子座または目的のゲノム遺伝子座において標的核酸配列内またはその近くを切断するＴＡＬエフェクターヌクレアーゼが操作され、ここで、標的核酸配列は、標的化ベクターによって修飾される配列またはその近くにある。本明細書で提供される様々な方法および組成物での使用に適したＴＡＬヌクレアーゼには、本明細書に記載の標的ベクターによって修飾される標的核酸配列またはその近くに結合するように特別に設計されたものが含まれる。
いくつかのＴＡＬＥＮでは、ＴＡＬＥＮの各モノマーは、２つの超可変残基を介して単一の塩基対を認識する３３～３５のＴＡＬリピートを含む。いくつかのＴＡＬＥＮでは、ヌクレアーゼ剤は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの独立したヌクレアーゼに作動可能に連結されたＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。例えば、ヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むことができ、第１および第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結され、第１および第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインは、様々な長さ（１２～２０ｂｐ）のスペーサー配列によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖における２つの隣接する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットは二量体化して、標的配列で二本鎖切断を行う活性ヌクレアーゼを作成する。
本明細書に開示される様々な方法および組成物で使用されるヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をさらに含むことができる。いくつかのＺＦＮでは、ＺＦＮの各モノマーは３つ以上のジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインは３ｂｐのサブサイトに結合する。他のＺＦＮでは、ＺＦＮは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの独立したヌクレアーゼに作動可能に連結されたジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。例えば、ヌクレアーゼ剤は、第１のＺＦＮおよび第２のＺＦＮを含むことができ、第１および第２のＺＦＮのそれぞれは、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットに作動可能に連結され、第１および第２のＺＦＮは、約５～７ｂｐのスペーサーで分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖における２つの隣接する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットは二量体化して、二本鎖切断を行う活性ヌクレアーゼを生成する。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００６／０２４６５６７、ＵＳ２００８／０１８２３３２、ＵＳ２００２／００８１６１４、ＵＳ２００３／００２１７７６、ＷＯ／２００２／０５７３０８Ａ２、ＵＳ２０１３／０１２３４８４、ＵＳ２０１０／０２９１０４８、ＷＯ／２０１１／０１７２９３Ａ２、およびＧａｊ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３１（７）：３９７－４０５を参照されたい。
ヌクレアーゼ剤（すなわち、操作されたヌクレアーゼ剤）の活性バリアントおよび断片も提供される。そのような活性バリアントは、天然のヌクレアーゼ剤に対して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有していてもよく、活性バリアントは、所望の標的配列で切断する能力を保持し、したがって、ニックまたは二本鎖切断誘導活性を保持する。例えば、本明細書に記載のヌクレアーゼ剤のいずれも、天然エンドヌクレアーゼ配列から修飾し、天然ヌクレアーゼ剤によって認識されなかった標的配列でニックまたは二本鎖切断を認識および誘導するように設計してもよい。したがって、いくつかの操作されたヌクレアーゼは、対応する天然のヌクレアーゼ剤標的配列とは異なる標的配列でニックまたは二本鎖切断を誘導する特異性を有する。ニックまたは二本鎖切断誘導活性のためのアッセイは知られており、一般に、標的配列を含むＤＮＡ基質上のエンドヌクレアーゼの全体的な活性および特異性を測定する。
ヌクレアーゼ剤は、任意の知られている手段によって細胞または動物に導入され得る。ヌクレアーゼ剤をコードするポリペプチドは、細胞または動物に直接導入され得る。代替的に、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドを細胞または動物に導入され得る。ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドが導入されると、ヌクレアーゼ剤は、一時的、条件付き、または構成的に細胞内で発現され得る。ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、発現カセットに含まれ得、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターに作動可能に連結され得る。プロモーターの例は、本明細書の他の場所でさらに詳細に論じられている。代替的に、ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼ剤をコードするｍＲＮＡとして細胞に導入され得る。
ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、細胞のゲノムに安定して組み込まれ、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。代替的に、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、発現ベクターまたは標的化ベクターにあり得る。
ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドの導入によりヌクレアーゼ剤が細胞に提供される場合、ヌクレアーゼ剤をコードするそのようなポリヌクレオチドは、天然に存在するヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチド配列と比較して、目的の細胞においてより高い使用頻度を有するコドンを置換するように修飾され得る。例えば、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、または任意の他の目的の宿主細胞を含む、目的の所与の真核細胞においてより頻度高く使用される代替コドンへと修飾することができる。
「ヌクレアーゼ剤の標的配列」という用語は、ヌクレアーゼ剤によってニックまたは二本鎖切断が誘導されるＤＮＡ配列を含む。ヌクレアーゼ剤の標的配列は、細胞に対して内因性（または天然）であり得るか、または標的配列は、細胞に対して外因性であり得る。細胞にとって外因性である標的配列は、細胞のゲノム内で天然に存在しない。標的配列はまた、標的遺伝子座に配置されることを望む目的のポリヌクレオチドに対して外因性であり得る。場合によっては、標的配列は宿主細胞のゲノムに一度だけ存在する。
標的配列の長さは変動してもよく、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対の場合は約３０～３６ｂｐ（すなわち、各ＺＦＮについて約１５～１８ｂｐ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の場合は約３６ｂｐ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの場合は約２０ｂｐの標的配列を含む。
ＶＩ．核酸構築物および／またはヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸を含む細胞または動物またはゲノム
本明細書に開示される方法によって産生されるゲノム、細胞、および動物も提供される。同様に、標的ゲノム遺伝子座、ベクター、脂質ナノ粒子、または本明細書に記載の組成物への組み込みおよびそれからの発現のための、レチノスキシンコード配列（すなわち、レチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードする）を含む核酸構築物を含むゲノム、細胞、および動物も提供される。同様に、記載されたヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸（例えば、内因性ＲＳ１遺伝子座を標的とする）またはベクター、脂質ナノ粒子、または本明細書に記載の組成物を含むゲノム、細胞、および動物も提供される。ゲノム、細胞、または動物は、標的ゲノム遺伝子座（例えば、ＲＳ１遺伝子座）にゲノムに組み込まれた核酸構築物を含むことができ、レチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントを発現することができる。レチノスキシンコード配列は、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれると、標的ゲノム遺伝子座で内因性プロモーターに作動可能に連結され得るか、または核酸構築物に存在する外因性プロモーターに作動可能に連結され得る。核酸構築物が本明細書に開示される双方向性核酸構築物である場合、ゲノム、細胞、または動物は、第１のレチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントを発現することができるか、あるいは第２のレチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントを発現することができる。いくつかのゲノム、細胞、または動物では、標的ゲノム遺伝子座は、ＲＳ１遺伝子座である。例えば、核酸構築物は、内因性ＲＳ１遺伝子座のイントロン１にゲノムに組み込まれ得る。次いで、内因性ＲＳ１エキソン１は、核酸構築物中のレチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントのコード配列にスプライスすることができる。具体的な例では、ゲノムに組み込まれた核酸構築物を含む修飾ＲＳ１遺伝子座は、配列番号２または４に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。具体的な例では、ゲノムに組み込まれた核酸構築物を含む修飾ＲＳ１遺伝子座は、配列番号６、１１または１２に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＲＳ１コード配列を含む。
いくつかのゲノム、細胞、または動物では、内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、組み込み部位の下流の内因性ＲＳ１遺伝子の転写を妨げる。例えば、内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、内因性レチノスキシンタンパク質の発現を低減または排除し、それを、核酸構築物によってコードされるレチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントの発現で置き換えることができる。一例では、内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、内因性レチノスキシンタンパク質の発現を低減させる。別の例では、内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、内因性レチノスキシンタンパク質の発現を排除する。具体的な例では、内因性ＲＳ１遺伝子座は、Ｘ連鎖性若年網膜分離症を引き起こす変異を含む変異ＲＳ１遺伝子を含み、ゲノムに組み込まれた核酸構築物の発現は、変異ＲＳ１遺伝子の発現を低減または排除する。
核酸構築物が安定して組み込まれる標的ゲノム遺伝子座は、核酸構築物からのレチノスキシンコード配列についてヘテロ接合であり得るか、または核酸構築物からのレチノスキシンコード配列についてホモ接合であり得る。二倍体生物は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各対は、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子がある場合はホモ接合として、および２つの対立遺伝子が異なる場合はヘテロ接合として記載されている。本明細書に記載のゲノムに組み込まれた核酸構築物を含む動物は、その生殖系列の標的ゲノム遺伝子座に核酸構築物を含むことができる。
本明細書で提供されるゲノム、細胞、または動物は、例えば、動物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、およびヒトを含む、例えば、真核生物であり得る。「動物」という用語には、哺乳動物、魚類、鳥類が含まれる。哺乳動物は、例えば、非ヒト哺乳動物、ヒト、げっ歯動物、ラット、マウス、またはハムスターであり得る。他の非ヒト哺乳動物には、例えば、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、雄ウシ、シカ、バイソン、家畜（例えば、ウシ、去勢牛などのウシ種、ヒツジ、ヤギなどのヒツジ種、ならびにブタ、およびイノシシなどのブタ種）が含まれる。鳥類には、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、アヒルなどが含まれる。飼育動物および農業用動物も含まれる。「非ヒト」という用語はヒトを除外する。
細胞は、単離された細胞（例えば、インビトロ）であり得るか、または動物内でインビボであり得る。細胞はまた、任意のタイプの未分化または分化状態であり得る。例えば、細胞は、全能性細胞、多能性細胞（例えば、ヒト多能性細胞、またはマウス胚性幹（ＥＳ）細胞またはラットＥＳ細胞などの非ヒト多能性細胞）、または非多能性細胞であってよい。全能性細胞には、任意の細胞型を生じさせることができる未分化細胞が含まれ、多能性細胞には、２つ以上の分化細胞型に発達する能力を有する未分化細胞が含まれる。
本明細書で提供される細胞はまた、生殖細胞（例えば、精子または卵母細胞）であってよい。細胞は、有糸分裂能力のある細胞または有糸分裂的に不活性な細胞、減数分裂能力のある細胞または減数分裂的に不活性な細胞であり得る。同様に、細胞はまた、初代体細胞または初代体細胞ではない細胞であり得る。体細胞には、配偶子、生殖細胞、配偶子細胞、または未分化幹細胞ではない任意の細胞が含まれる。例えば、細胞は、肝細胞、腎臓細胞、造血細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、間葉系細胞、ケラチノサイト、血液細胞、メラノサイト、単球、単核細胞、単球前駆細胞、Ｂ細胞、赤芽球－巨核球細胞、好酸球、マクロファージ、Ｔ細胞、膵島ベータ細胞、外分泌細胞、膵臓前駆細胞、内分泌前駆細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、ニューロン、グリア細胞、神経幹細胞、ニューロン、肝芽細胞、肝細胞、心筋細胞、骨格筋芽細胞、平滑筋細胞、管細胞、腺房細胞、アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、ＰＰ細胞、胆管細胞、白色または褐色脂肪細胞、または眼細胞（例えば、小柱網目細胞、網膜色素上皮細胞、網膜微小血管内皮細胞、網膜周囲細胞、結膜上皮細胞、結膜線維芽細胞、虹彩色素上皮細胞、角膜細胞、水晶体上皮細胞、非色素繊毛上皮細胞、眼脈絡膜線維芽細胞、光受容細胞、神経節細胞、双極細胞、水平細胞、またはアマクリン細胞）であり得る。例えば、細胞は、網膜細胞（例えば、光受容体）などの眼細胞であり得る。
本明細書で提供される細胞は、正常で健康な細胞であってよいか、または罹患した細胞または変異体を担持する細胞であってよい。例えば、細胞は、ＸＬＲＳに関連するか、またはそれを引き起こす１つ以上の変異を含むことができる（例えば、レチノスキシンタンパク質におけるＲ１４１Ｃ置換をコードする）。
本明細書で提供される動物は、ヒトであってよいか、またはそれらは、ヒト以外の動物であってよい。本明細書に記載の核酸または発現カセットを含む非ヒト動物は、本明細書の他の場所に記載されている方法によって作製することができる。「動物」という用語には、哺乳動物、魚類、鳥類が含まれる。哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウマ、雄ウシ、シカ、バイソン、ヒツジ、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモット）、および家畜（例えば、ウシおよび去勢牛などのウシ種、ヒツジおよびヤギなどのヒツジ種、ならびにブタおよびイノシシなどのブタ種）が含まれる。鳥類には、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、およびアヒルが含まれる。家畜および農業用動物も含まれる。「非ヒト動物」という用語は、ヒトを除外する。ヒト以外の動物の具体的な例には、マウスおよびラットなどのげっ歯類が含まれる。
非ヒト動物は、あらゆる遺伝的背景からのものであってよい。例えば、好適なマウスは、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、１２９およびＣ５７ＢＬ／６の雑種、ＢＡＬＢ／ｃ系統、またはスイスウェブスター系統からのものであり得る。１２９系統の例には、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、および１２９Ｔ２が含まれる。例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０：８３６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｃ５７ＢＬ系統の例には、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａｌ＿ｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａが含まれる。好適なマウスはまた、前述の１２９系統と前述のＣ５７ＢＬ／６系統の雑種（例えば、５０％１２９と５０％Ｃ５７ＢＬ／６）からのものであり得る。同様に、好適なマウスは、前述の１２９系統の雑種または前述のＢＬ／６系統の雑種（例えば、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統）からのものであり得る。
同様に、ラットは、例えば、ＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、またはフィッシャーＦ３４４またはフィッシャーＦ６などのフィッシャーラット系統からのものであり得る。ラットはまた、上述の２つ以上の系統の雑種に由来する系統から得ることができる。例えば、好適なラットは、ＤＡ系統またはＡＣＩ系統からのものであり得る。ＡＣＩラット系統は、白い腹および足、ならびにＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有する黒いアグーチを持っていることを特徴としている。このような系統は、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給源から入手できる。Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチコートおよびＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有することを特徴としている。このようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ ＲｉｖｅｒおよびＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給源から入手できる。場合によっては、好適なラットは近交系ラット系統に由来する可能性がある。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０２３５９３３を参照されたい。
ＶＩＩ．標的ゲノム遺伝子座の修飾、細胞内でのレチノスキシンの発現、またはＸＬＲＳの治療のための方法
標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法、または本明細書に開示される標的ゲノム遺伝子座への組み込みおよびそれからの発現のためのレチノスキシンコード配列（すなわち、レチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードする）を含む核酸構築物を使用して細胞内でレチノスキシンを発現するための方法も本明細書で提供される。標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法、または本明細書に開示される標的ゲノム遺伝子座への組み込みおよびそれからの発現のためのレチノスキシンコード配列（すなわち、レチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードする）を含む核酸構築物と組み合わせて本明細書に開示されるヌクレアーゼ剤（またはそれをコードする核酸）を使用して細胞内でレチノスキシンを発現するための方法も本明細書で提供される。本明細書に開示されるヌクレアーゼ剤（またはそれをコードする核酸）を使用して標的ゲノム遺伝子座を修飾するための方法も本明細書で提供される。
この方法は、例えば、標的ゲノム遺伝子座（例えば、内因性ＲＳ１遺伝子座）を修飾する方法であり得る。いくつかのそのような方法は、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸を投与することを含み、ヌクレアーゼ剤は、標的ゲノム遺伝子座のヌクレアーゼ標的配列を標的とし、標的ゲノム遺伝子座を切断する。
この方法は、例えば、レチノスキシンタンパク質またはその断片のコード配列を標的ゲノム遺伝子座に組み込み、細胞内でレチノスキシンタンパク質またはその断片を発現させる方法であり得る。いくつかのそのような方法は、本明細書の他の場所に記載されているような核酸構築物、ベクター、または脂質ナノ粒子を細胞に投与することを含む。次いで、コード配列を標的ゲノム遺伝子座に組み込むことができ、レチノスキシンタンパク質またはその断片が細胞内で発現される。レチノスキシンコード配列は、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれると、標的ゲノム遺伝子座で内因性プロモーターに作動可能に連結され得るか、または核酸構築物に存在する外因性プロモーターに作動可能に連結され得る。いくつかのそのような方法は、本明細書の他の場所に記載されるような核酸構築物、ベクター、または脂質ナノ粒子、およびヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸を細胞に投与することを含み、ヌクレアーゼ剤は、標的ゲノム遺伝子座のヌクレアーゼ標的配列を標的とする。ヌクレアーゼ剤は、標的ゲノム遺伝子座を切断することができ、核酸構築物からのコード配列は、レチノスキシンタンパク質またはその断片が細胞内で発現されるように、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれ得る。いくつかのそのような方法は、本明細書に開示される核酸構築物、ベクター、または脂質ナノ粒子を含む組成物、およびヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸を細胞に投与することを含み、ヌクレアーゼ剤は、標的ゲノム遺伝子座のヌクレアーゼ標的配列を標的とする。ヌクレアーゼ剤は、標的ゲノム遺伝子座を切断することができ、核酸構築物からのコード配列は、レチノスキシンタンパク質またはその断片が細胞内で発現されるように、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれ得る。ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸は、例えば、ベクター（例えば、ＡＡＶベクターなどのウイルスベクター）または脂質ナノ粒子に投与することができる。
上記の方法の細胞は、単離された細胞（例えば、インビトロ）であり得るか、または動物内でインビボであり得る。細胞はまた、任意のタイプの未分化または分化状態であり得る。例えば、細胞は、全能性細胞、多能性細胞（例えば、ヒト多能性細胞、またはマウス胚性幹（ＥＳ）細胞またはラットＥＳ細胞などの非ヒト多能性細胞）、または非多能性細胞であってよい。全能性細胞には、任意の細胞型を生じさせることができる未分化細胞が含まれ、多能性細胞には、２つ以上の分化細胞型に発達する能力を有する未分化細胞が含まれる。
細胞はまた、生殖細胞（例えば、精子または卵母細胞）であり得る。細胞は、有糸分裂能力のある細胞または有糸分裂的に不活性な細胞、減数分裂能力のある細胞または減数分裂的に不活性な細胞であり得る。同様に、細胞はまた、初代体細胞または初代体細胞ではない細胞であり得る。体細胞には、配偶子、生殖細胞、配偶子細胞、または未分化幹細胞ではない任意の細胞が含まれる。例えば、細胞は、肝細胞、腎臓細胞、造血細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、間葉系細胞、ケラチノサイト、血液細胞、メラノサイト、単球、単核細胞、単球前駆細胞、Ｂ細胞、赤芽球－巨核球細胞、好酸球、マクロファージ、Ｔ細胞、膵島ベータ細胞、外分泌細胞、膵臓前駆細胞、内分泌前駆細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、ニューロン、グリア細胞、神経幹細胞、ニューロン、肝芽細胞、肝細胞、心筋細胞、骨格筋芽細胞、平滑筋細胞、管細胞、腺房細胞、アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、ＰＰ細胞、胆管細胞、白色または褐色脂肪細胞、または眼細胞（例えば、小柱網目細胞、網膜色素上皮細胞、網膜微小血管内皮細胞、網膜周囲細胞、結膜上皮細胞、結膜線維芽細胞、虹彩色素上皮細胞、角膜細胞、水晶体上皮細胞、非色素繊毛上皮細胞、眼脈絡膜線維芽細胞、光受容細胞、神経節細胞、双極細胞、水平細胞、またはアマクリン細胞）であり得る。例えば、細胞は、網膜細胞（例えば、光受容体）などの眼細胞であり得る。
本明細書で提供される細胞は、正常で健康な細胞であってよいか、または罹患した細胞または変異体を担持する細胞であってよい。例えば、細胞は、ＸＬＲＳ（例えば、Ｒ１４１Ｃ）に関連するか、またはそれを引き起こす１つ以上の変異を含むことができる。
細胞は、例えば、動物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、およびヒトを含む、例えば、真核生物であり得る。具体的な例では、細胞は、ヒト細胞である。「動物」という用語には、哺乳動物、魚類、鳥類が含まれる。哺乳動物は、例えば、非ヒト哺乳動物、ヒト、げっ歯動物、ラット、マウス、またはハムスターであり得る。他の非ヒト哺乳動物には、例えば、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、雄ウシ、シカ、バイソン、家畜（例えば、ウシ、去勢牛などのウシ種、ヒツジ、ヤギなどのヒツジ種、ならびにブタ、およびイノシシなどのブタ種）が含まれる。鳥類には、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、アヒルなどが含まれる。飼育動物および農業用動物も含まれる。「非ヒト」という用語はヒトを除外する。
細胞は動物内でインビボであり得る。動物は、ヒトであり得るかまたは非ヒト動物であり得る。本明細書に記載の核酸または発現カセットを含む非ヒト動物は、本明細書の他の場所に記載されている方法によって作製することができる。「動物」という用語には、哺乳動物、魚類、鳥類が含まれる。哺乳動物には、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウマ、雄ウシ、シカ、バイソン、ヒツジ、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモット）、および家畜（例えば、ウシおよび去勢牛などのウシ種、ヒツジおよびヤギなどのヒツジ種、ならびにブタおよびイノシシなどのブタ種）が含まれる。鳥類には、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、およびアヒルが含まれる。家畜および農業用動物も含まれる。「非ヒト動物」という用語はヒトを除外する。ヒト以外の動物の具体的な例には、マウスおよびラットなどのげっ歯類が含まれる。
非ヒト動物は、あらゆる遺伝的背景からのものであってよい。例えば、好適なマウスは、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、１２９およびＣ５７ＢＬ／６の雑種、ＢＡＬＢ／ｃ系統、またはスイスウェブスター系統からのものであり得る。１２９系統の例には、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、および１２９Ｔ２が含まれる。例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０：８３６を参照されたく、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。Ｃ５７ＢＬ系統の例には、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａｌ＿ｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａが含まれる。好適なマウスはまた、前述の１２９系統と前述のＣ５７ＢＬ／６系統の雑種（例えば、５０％１２９および５０％Ｃ５７ＢＬ／６）からのものであり得る。同様に、好適なマウスは、前述の１２９系統の雑種または前述のＢＬ／６系統の雑種（例えば、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統）からのものであり得る。
同様に、ラットは、例えば、ＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、またはフィッシャーＦ３４４またはフィッシャーＦ６などのフィッシャーラット系統からのものであり得る。ラットはまた、上述の２つ以上の系統の雑種に由来する系統から得ることができる。例えば、好適なラットは、ＤＡ系統またはＡＣＩ系統からのものであり得る。ＡＣＩラット系統は、白い腹および足、ならびにＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有する黒いアグーチを持っていることを特徴としている。このような系統は、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給源から入手できる。Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチコートおよびＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有することを特徴としている。このようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ ＲｉｖｅｒおよびＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給源から入手できる。場合によっては、好適なラットは近交系ラット系統に由来する可能性がある。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０２３５９３３を参照されたい。
Ｘ連鎖性若年網膜分離症（ＸＬＲＳ）を有する対象を治療する方法も提供される。そのような方法は、本明細書の他の場所に記載されるような核酸構築物、ベクター、脂質ナノ粒子、または組成物をＸＬＲＳを有する対象に投与することを含み得、核酸構築物は、対象の１つ以上の網膜細胞（例えば、光受容体）の標的ゲノム遺伝子座に組み込まれ、そこから発現され、治療上有効なレベルのレチノスキシン発現が対象において達成される。対象は、例えば、Ｘ連鎖性若年網膜分離症（例えば、Ｒ１４１Ｃ）に関連するか、またはそれを引き起こす少なくとも１つの変異を含む内因性ＲＳ１遺伝子を有することができる。レチノスキシンコード配列は、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれると、標的ゲノム遺伝子座で内因性プロモーターに作動可能に連結され得るか、または核酸構築物に存在する外因性プロモーターに作動可能に連結され得る。そのような方法は、本明細書の他の場所に記載されるような核酸構築物、ベクター、脂質ナノ粒子、または組成物、およびヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸を対象に投与することを含み得、ヌクレアーゼ剤は、標的ゲノム遺伝子座のヌクレアーゼ標的配列を標的とし、核酸構築物は、対象の１つ以上の網膜細胞（例えば、光受容体）の標的ゲノム遺伝子座に組み込まれ、そこから発現され、治療上有効なレベルのレチノスキシン発現が対象において達成される。そのような方法は、本明細書に開示される核酸構築物、ベクター、または脂質ナノ粒子を含む組成物、およびヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸を対象に投与することを含み得、ヌクレアーゼ剤は、標的ゲノム遺伝子座のヌクレアーゼ標的配列を標的とし、核酸構築物は、対象の１つ以上の網膜細胞（例えば、光受容体）の標的ゲノム遺伝子座に組み込まれ、そこから発現され、治療上有効なレベルのレチノスキシン発現が対象において達成される。
ＸＬＲＳは、黄斑の病理および網膜の表層の分裂を特徴とする硝子体網膜ジストロフィーである。黄斑の変化はほとんどすべての場合に存在する。眼底では、放射状に配向した網膜内中心窩嚢胞がスポークホイール構成で見られ、ほとんどの場合、中心窩反射が存在しない。加えて、症例の約半数は、網膜の下側頭部分に両側性末梢網膜分離症を有する。典型的な眼底の外観とは別に、斜視、眼振、軸性遠視、色覚異常、中心窩転位症が存在し得る。最も重要な合併症は、硝子体出血、網膜剥離、および血管新生緑内障である。「スポークホイール」パターンの中心窩分裂は、眼底検査の特徴的な所見であり、ほぼ１００％の症例に存在する。分裂は、患者の最大５０％で末梢的に生じ得る。末梢の分裂は、サポートされていない交差血管からの出血の可能性がある内葉の穴および裂け目を引き起こし得る。追加の末梢変化としては、ＲＰに似た色素沈着、網膜線維症、および白い斑点が挙げられる。
ＸＬＲＳはレチノスキシン機能の喪失によって引き起こされる劣性疾患であるため、遺伝子置換療法がこの疾患の潜在的な治療法とみなされてきた。さらに、レチノスキシンは細胞外タンパク質として機能するため、有益な治療は必ずしも置換遺伝子を発現するトランスフェクト細胞に限定されるわけではなく、発現部位から分泌タンパク質が広がるため、より広い領域を包含することができる。
いくつかの方法では、核酸構築物の組み込みは、網膜構造の回復（例えば、少なくとも部分的な網膜構造の回復）をもたらす。いくつかの方法では、核酸構築物の組み込みは、網膜機能の回復（例えば、少なくとも部分的な網膜機能の回復）をもたらす。
上記の方法でＸＬＲＳを有する対象は、上記に開示された任意のタイプの動物であり得る。特定の例では、対象は、ヒトである。
動物のインビボで細胞を標的とする方法では、核酸構築物を動物の特定のタイプの細胞に挿入することができる。ヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸）および核酸構築物を動物に導入するための方法およびビヒクルは、動物のどのタイプの細胞が標的とされるかに影響を及ぼし得る。いくつかの方法では、例えば、核酸構築物は、光受容体などの網膜細胞の標的ゲノム遺伝子座（例えば、内因性ＲＳ１遺伝子座）に挿入される。ヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸）および核酸構築物を動物に導入するための方法およびビヒクル（脂質ナノ粒子媒介送達、およびＡＡＶ２媒介送達、ＡＡＶ５媒介送達、ＡＡＶ８媒介送達、またはＡＡＶ７ｍ８媒介送達ならびに硝子体内または網膜下注射などの、眼または網膜細胞（例えば、光受容体）を標的とする方法およびビヒクルを含む）は、本明細書の他の場所でより詳細に開示されている。
セーフハーバー遺伝子座（セーフハーバー遺伝子）または内因性ＲＳ１遺伝子座など、遺伝子を発現できる任意の標的ゲノム遺伝子座を使用することができる。そのような遺伝子座は、本明細書の他の場所でより詳細に説明されている。具体的な例では、標的ゲノム遺伝子座は、ＸＬＲＳに関連するかまたはそれを引き起こす１つ以上の変異を含む内因性ＲＳ１遺伝子座（例えば、Ｒ１４１Ｃ）などの内因性ＲＳ１遺伝子座であり得る。例えば、核酸構築物は、内因性ＲＳ１遺伝子座のイントロン１にゲノムに組み込まれ得る。次いで、内因性ＲＳ１エキソン１は、核酸構築物中のレチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントのコード配列にスプライスすることができる。具体的な例では、ゲノムに組み込まれた核酸構築物を含む修飾ＲＳ１遺伝子座は、配列番号２または４に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする。具体的な例では、ゲノムに組み込まれた核酸構築物を含む修飾ＲＳ１遺伝子座は、配列番号６、１１または１２に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＲＳ１コード配列を含む。
内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、場合によっては、組み込み部位の下流の内因性ＲＳ１遺伝子の転写を妨げる可能性がある。内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、内因性レチノスキシンタンパク質の発現を低減または排除し、それを、核酸構築物によってコードされるレチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントの発現で置き換えることができる。一例では、内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、内因性レチノスキシンタンパク質の発現を低減させる。別の例では、内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、内因性レチノスキシンタンパク質の発現を排除する。対象をＸＬＲＳで治療する方法など、インビボで細胞を標的とする方法では、１つ以上の細胞の内因性ＲＳ１遺伝子座への核酸構築物の組み込みは、１つ以上の細胞の内因性レチノスキシンタンパク質の発現を低減または排除し、それを、核酸構築物によってコードされるレチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントの発現で置き換えることができる。このように、核酸構築物の組み込みは、内因性ＲＳ１遺伝子（例えば、Ｒ１４１ＣなどのＸＬＲＳに関連するまたはＸＬＲＳを引き起こす１つ以上の変異を含む内因性ＲＳ１遺伝子）を同時にノックアウトし、置換レチノスキシンコード配列（例えば、ＸＬＲＳに関連する、またはＸＬＲＳを引き起こす変異を含まない置換レチノスキシンコード配列）をノックインすることができる。しかしながら、他の方法では、ＸＬＲＳに関連するかまたはそれを引き起こす１つ以上の変異を含む内因性ＲＳ１遺伝子を最初に不活性化することができ（例えば、内因性ＲＳ１遺伝子を標的とし、かつ破壊する１つ以上のヌクレアーゼ剤を使用して）、置換レチノスキシンコード配列（例えば、ＸＬＲＳに関連するまたはＸＬＲＳを引き起こす変異を含まない置換レチノスキシンコード配列）を含む核酸構築物は、その後、標的ゲノム遺伝子座に組み込むことができる。他の方法では、核酸構築物を最初に組み込むことができ、その後、内因性ＲＳ１遺伝子を不活化することができる。
レチノスキシンコード配列を含む核酸構築物の標的ゲノム遺伝子座、特に内因性ＲＳ１遺伝子座への標的挿入は、複数の利点を提供する。そのような方法は、レチノスキシンコード配列の安定した長期発現を可能にするための安定した修飾をもたらす。ＲＳ１遺伝子座に関して、そのような方法は、内因性ＲＳ１プロモーターおよび調節領域を利用して、生理学的に関連する発現（発現のレベル、発現のタイミング、および発現の位置）を達成することができる。例えば、核酸構築物中のレチノスキシンコード配列は、プロモーターのない遺伝子を含むことができ、挿入された核酸構築物は、標的ゲノム遺伝子座（例えば、ＲＳ１遺伝子座）の内因性プロモーターに作動可能に連結され得る。内因性プロモーターの使用は、核酸構築物にプロモーターを含める必要がなく、（例えば、ＡＡＶでは）通常効率的にパッケージングされない可能性があるより大きな導入遺伝子のパッケージングを可能にするため、有利である。代替的に、核酸構築物中のレチノスキシンコード配列は、核酸構築物中の外因性プロモーターに作動可能に連結され得る。使用できるプロモーターのタイプの例は、本明細書の他の場所に開示されている。
任意選択で、標的ゲノム遺伝子座の内因性遺伝子（例えば、内因性ＲＳ１遺伝子）のいくつかまたはすべてを、核酸構築物からのレチノスキシンコード配列の挿入時に発現させることができる。代替的に、いくつかの方法では、標的ゲノム遺伝子座の内因性遺伝子のいずれも発現されない。一例として、核酸構築物の組み込み後の修飾された標的ゲノム遺伝子座（例えば、修飾ＲＳ１遺伝子座）は、内因性分泌シグナルまたはその断片を含むキメラタンパク質および核酸構築物によってコードされるレチノスキシンタンパク質をコードし得る。別の例では、ＲＳ１遺伝子座の第１のイントロンを標的とすることができる。ＲＳ１の分泌シグナルペプチドは、ＲＳ１遺伝子のエキソン１およびエキソン２の一部によってコードされる。このようなシナリオでは、スプライスアクセプターおよびレチノスキシンコード配列を担持するプロモーターのないカセットが、レチノスキシンタンパク質の発現および分泌をサポートする。内因性ＲＳ１エキソン１と組み込みレチノスキシンコード配列との間のスプライシングは、組み込み核酸構築物によってコードされるレチノスキシンタンパク質配列に作動可能に連結されたエキソン１によってコードされる内因性レチノシシン配列を含むキメラｍＲＮＡおよびタンパク質を作成する。
核酸構築物中のレチノスキシンコード配列は、本明細書の他の場所に記載されているように、相同組換え（ＨＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を含む任意の手段によって標的ゲノム遺伝子座に挿入することができる。
具体的な例では、核酸構築物は、ホモロジー非依存性標的化組み込み（例えば、方向性のあるホモロジー非依存性標的化組み込み）を介して挿入することができる。例えば、核酸構築物のレチノスキシンコード配列は、ヌクレアーゼ剤の標的部位と各側で隣接することができる（例えば、標的ゲノム遺伝子座と同じ標的部位、および同じヌクレアーゼ剤が標的ゲノム遺伝子座の標的部位を切断するために使用される）。次いで、ヌクレアーゼ剤は、レチノスキシンコード配列に隣接する標的部位を切断することができる。具体的な例では、核酸構築物は、ＡＡＶ媒介送達で送達され、レチノスキシンコード配列に隣接する標的部位の切断は、ＡＡＶの末端逆位配列（ＩＴＲ）を除去することができる。ＩＴＲを除去すると、繰り返された配列のために配列決定作業が妨げられる可能性があるため、成功したターゲティングの評価が容易になる。いくつかの方法では、レチノスキシンコード配列が正しい方向で標的ゲノム遺伝子座に挿入された場合、標的ゲノム遺伝子座の標的部位（例えば、隣接するプロトスペーサー隣接モチーフを含むｇＲＮＡ標的配列）はもはや存在しないが、レチノスキシンタンパク質コード配列が標的ゲノム遺伝子座に反対方向に挿入されると再形成される。これは、レチノスキシンコード配列が発現のために正しい方向に挿入されることを確実にするのに役立ち得る。
核酸構築物（またはベクターまたはＬＮＰ）およびヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸が、核酸構築物と一緒に投与される方法では、核酸構築物およびヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸は、同時に投与され得る。代替的に、核酸構築物およびヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸は、任意の順序で連続して投与され得る。例えば、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸の後に核酸構築物は、投与され得、またはヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸は、核酸構築物の後に投与され得る。例えば、ヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸は、核酸構築物の投与の約１時間～約４８時間、約１時間～約２４時間、約１時間～約１２時間、約１時間～約６時間、約１時間～約２時間、約２時間～約４８時間、約２時間～約２４時間、約２時間～約１２時間、約２時間～約６時間、約３時間～約４８時間、約６時間～約４８時間、約１２時間～約４８時間、または約２４時間～約４８時間の前後に投与され得る。
核酸構築物およびヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸は、任意の好適な送達ビヒクルで投与され得る。いくつかの方法では、核酸構築物およびヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸は、同じ送達ビヒクル（例えば、同じ脂質ナノ粒子またはベクター）で投与され得る。ヌクレアーゼ剤がＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸およびガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含むいくつかの方法では、両方の成分を同じ送達ビヒクルで投与することができ、または代替的にはそれらを別個の送達ビヒクルに送達することができる。他の方法では、核酸構築物およびヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸は、異なる送達ビヒクルで投与することができる（例えば、第１のベクターまたはＬＮＰにおけるヌクレアーゼ剤またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸の投与、およびＡＡＶベクターなどの第２のベクターにおける核酸構築物の投与）。
ヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸）および核酸構築物は、本明細書の他の場所に開示されるように、任意の送達方法（例えば、ＡＡＶ、ＬＮＰ、またはＨＤＤ）および任意の投与経路（硝子体内注射または網膜下注射）を介して、任意の形態（例えば、ＤＮＡまたはガイドＲＮＡのＲＮＡ；ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＣａｓタンパク質のタンパク質）で導入することができる。一例として、核酸構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達（例えば、ＡＡＶ２媒介送達、ＡＡＶ５媒介送達、ＡＡＶ８媒介送達、またはＡＡＶ７ｍ８媒介送達）を介して送達される。同様に、ヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸）は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介送達またはＡＡＶ媒介送達によって送達することができる。例えば、ヌクレアーゼ剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９であり得、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよび内因性ＲＳ１遺伝子座（例えば、ＲＳ１のイントロン１）を標的とするｇＲＮＡは、ＬＮＰ媒介送達またはＡＡＶ媒介送達を介して送達され得、核酸構築物（双方向性構築物またはホモロジー非依存性標的化組み込み構築物）は、ＡＡＶ２媒介送達、ＡＡＶ５媒介送達、ＡＡＶ８媒介送達、またはＡＡＶ７ｍ８媒介送達を介して送達され得る。別の具体的な例では、ヌクレアーゼ剤をコードする核酸および核酸構築物の両方が、ＡＡＶ媒介送達を介して（例えば、単一のＡＡＶまたは２つの別個のＡＡＶを介して）送達される。例えば、第１のＡＡＶは、Ｃａｓ９発現カセットを担持することができ、第２のＡＡＶは、ｇＲＮＡ発現カセットおよび核酸構築物を担持することができる。同様に、第１のＡＡＶは、Ｃａｓ９発現カセットを担持することができ、第２のＡＡＶは、２つ以上のｇＲＮＡ発現カセットおよび核酸構築物を担持することができる。代替的に、第１のＡＡＶは、Ｃａｓ９発現カセット（例えば、プロモーターに作動可能に連結されたＣａｓ９コード配列）およびｇＲＮＡ発現カセット（例えば、プロモーターに作動可能に連結されたｇＲＮＡコード配列）を担持することができ、第２のＡＡＶは、核酸構築物を担持することができる。同様に、第１のＡＡＶは、Ｃａｓ９発現カセット（例えば、プロモーターに作動可能に連結されたＣａｓ９コード配列）および２つのｇＲＮＡ発現カセット（例えば、プロモーターに作動可能に連結されたｇＲＮＡコード配列）を担持することができ、第２のＡＡＶは、核酸構築物を担持することができる。Ｕ６プロモーターまたはｓｍａｌｌ ｔＲＮＡ Ｇｌｎなど、様々なプロモーターを使用してｇＲＮＡの発現を駆動することができる。同様に、Ｃａｓ９の発現を駆動するために様々なプロモーターを使用できる。いくつかの方法では、Ｃａｓ９コード配列がＡＡＶ構築物に適合することができるように小さなプロモーターが使用される。いくつかの方法では、小さなＣａｓ９タンパク質（例えば、ＳａＣａｓ９またはＣｊＣａｓ９を使用して、ＡＡＶパッケージング容量を最大化する）。
本明細書に開示される方法は、細胞または動物のヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸）ならびに標的ゲノム遺伝子座への組み込みおよび標的ゲノム遺伝子座からの発現のための、レチノスキシンコード配列（すなわち、レチノスキシンタンパク質またはその断片もしくはバリアントをコードする）を含む核酸構築物（すなわち、外因性ドナー核酸）を投与または導入することを含む。「導入すること」は、核酸またはタンパク質が動物内の細胞の内部または細胞の内部にアクセスできるように、細胞または動物に核酸またはタンパク質を提示することを含む。導入することは、任意の手段によって達成することができ、２つ以上の構成要素（例えば、２つの構成要素、またはすべての構成要素）を、任意の組み合わせで同時にまたは逐次的に細胞または動物に導入することができる。例えば、ヌクレアーゼ剤は、核酸構築物を導入する前に細胞または動物に導入することができる。加えて、２つ以上の構成要素は、同じ送達方法または異なる送達方法によって細胞または動物に導入することができる。同様に、２つ以上の構成要素は、同じ投与経路または異なる投与経路によって動物に導入することができる。
ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ（例えば、インビトロ転写されたＲＮＡ）の形態で、またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で細胞に導入することができる。同様に、Ｃａｓ９タンパク質、ＺＦＮ、またはＴＡＬＥＮなどのタンパク質構成要素は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質の形で細胞に導入することができる。例えば、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質はどちらもＲＮＡの形態で導入できる。ＤＮＡの形態で導入されると、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞内で活性のあるプロモーターに作動可能に連結することができる。例えば、ガイドＲＮＡは、ＡＡＶを介して送達され、Ｕ６プロモーターの下でインビボで発現できる。そのようなＤＮＡは、１つ以上の発現構築物中にあり得る。例えば、そのような発現構築物は、単一の核酸分子の構成要素であり得る。代替的に、それらは、２つ以上の核酸分子の間で任意の組み合わせで分離することができる（すなわち、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡをコードするＤＮＡおよび１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、別個の核酸分子の構成要素であり得る）。
ガイドＲＮＡまたはヌクレアーゼ剤をコードする核酸は、発現構築物中のプロモーターに作動可能に連結することができる。発現構築物は、遺伝子または他の目的の核酸配列の発現を指示することができ、そのような目的の核酸配列を標的細胞に導入することができる任意の核酸構築物を含む。発現構築物において使用することができる適切プロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生が制限された前駆細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、または１細胞期胚のうちの１つ以上において活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであってよい。任意選択で、プロモーターは、一方向のガイドＲＮＡと他の方向の別の構成要素の両方の発現を駆動する双方向プロモーターであってもよい。このような双方向プロモーターは、（１）遠位配列要素（ＤＳＥ）、近位配列要素（ＰＳＥ）、およびＴＡＴＡボックスの３つの外部制御要素を含む完全な従来の一方向Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ならびに（２）ＤＳＥの５’末端に逆方向に融合されたＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターで構成してもよい。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥとＴＡＴＡボックスに隣接しており、プロモーターは、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを追加することによって逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを作成することにより、双方向にすることができる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００７４５３５を参照されたい。双方向プロモーターを使用してガイドＲＮＡと別の構成要素をコードする遺伝子を同時に発現させることにより、コンパクトな発現カセットを生成して送達を容易にすることができる。
ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡ（または他の構成要素）をコードする核酸は、ガイドＲＮＡの安定性を増加させる（例えば、所定の保存条件下（例えば、－２０℃、４℃、または周囲温度）で、分解産物が閾値未満、例えば、出発核酸もしくはタンパク質の０．５重量％未満のままである期間を延長する、またはインビボでの安定性を増加させる）担体を含む組成物中で提供され得る。そのような担体の非限定的な例には、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－コグリコール－酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コキレート（ｃｏｃｈｌｅａｔｅｓ）、および脂質微小管が挙げられる。
本明細書で提供される方法は、核酸またはタンパク質を細胞に導入するための特定の方法に依存せず、核酸またはタンパク質が少なくとも１つの細胞の内部にアクセスできることのみに依存する。様々な細胞型に核酸およびタンパク質を導入するための方法は、当該技術分野で知られており、例えば、安定トランスフェクション方法、一過性トランスフェクション方法、およびウイルス媒介性方法が挙げられる。
トランスフェクションプロトコル、ならびに核酸またはタンパク質を細胞に導入するためのプロトコルは異なり得る。非限定的なトランスフェクション法には、リポソーム、ナノ粒子、リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（２）：４５６－６７、Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４（４）：１５９０－４、およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ（１９９１）．Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ．ｐｐ．９６－９７）、デンドリマー、またはＤＥＡＥ－デキストランもしくはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを使用する化学物質ベースのトランスフェクション法が含まれる。非化学的方法には、電気穿孔法、ソノポレーション、および光トランスフェクションが含まれる。粒子ベースのトランスフェクションには、遺伝子銃の使用、またはマグネットアシストトランスフェクション（Ｂｅｒｔｒａｍ（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７，２７７－２８）が含まれる。ウイルス法もトランスフェクションに使用することができる。
細胞への核酸またはタンパク質の導入はまた、電気穿孔法、細胞質内注射、ウイルス感染、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、トランスフェクション、脂質媒介トランスフェクション、またはヌクレオフェクションによって媒介され得る。細胞への核酸またはタンパク質の導入は、アデノ随伴ウイルスによって媒介され得る。ヌクレオフェクションは、核酸基質を細胞質だけでなく核膜を介して核に送達することを可能にする改善された電気穿孔法技術である。加えて、本明細書に開示される方法でのヌクレオフェクションの使用は、典型的には、通常の電気穿孔法よりもはるかに少ない細胞を必要とする（例えば、通常の電気穿孔法による７００万に対してわずか約２００万）。一例では、ヌクレオフェクションは、ＬＯＮＺＡ（登録商標）ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）システムを使用して行われる。
細胞（例えば、１細胞期胚）への核酸またはタンパク質の導入は、マイクロインジェクションによっても達成され得る。１細胞期胚では、マイクロインジェクションは母体および／または父方の前核または細胞質に行うことができる。マイクロインジェクションが１つの前核のみに行われる場合は、サイズが大きいため、父方の前核が適している。ｍＲＮＡのマイクロインジェクションは、好ましくは細胞質へ（例えば、ｍＲＮＡを翻訳機構に直接送達するために）のものであるが、一方で、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするかもしくはＲＮＡをコードする核酸のマイクロインジェクションは、好ましくは、核／前核へのものである。代替的に、マイクロインジェクションは、核／前核および細胞質の両方への注射によって実施することができ、針を最初に核／前核に導入し、最初の量を注射することができ、１細胞期胚から針を除去しながら、２番目の量を細胞質に注射することができる。Ｃａｓタンパク質が細胞質に注入される場合、Ｃａｓタンパク質は、核／前核への送達を確実にするために、核局在化シグナルを含むことが好ましい。マイクロインジェクションを実施する方法は周知である。例えば、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｇｙ Ａ，Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ Ｍ，Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ Ｋ，Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｒ．，２００３，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０７：１５０２２－１５０２６、およびＭｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０９：９３５４－９３５９を参照されたい。１細胞期胚への導入は、エレクトロポレーションによっても達成され得る。
細胞または動物への核酸またはタンパク質の導入を可能にするために、様々な方法および組成物が本明細書で提供される。核酸またはタンパク質を細胞または動物に導入するためのそのような方法には、例えば、ベクター送達、粒子媒介送達、エキソソーム媒介送達、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介送達、細胞透過性ペプチド媒介送達、または埋め込み型デバイスを介した送達が含まれ得る。具体的な例として、核酸またはタンパク質は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ、Ｌ－乳酸－コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質渦巻状物、または脂質微小管などの担体中で、細胞または動物に導入することができる。動物への送達のいくつかの具体例には、流体力学的送達、ウイルス媒介送達（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達、またはアデノウイルス、レンチウイルス、もしくはレトロウイルスによる）、および脂質ナノ粒子媒介送達が含まれる。１つの具体的な例では、ヌクレアーゼ剤および核酸構築物の両方は、ＬＮＰ媒介送達を介して送達され得る。別の具体的な例では、ヌクレアーゼ剤および核酸構築物の両方は、ＡＡＶ媒介送達を介して送達され得る。例えば、ヌクレアーゼ剤および核酸構築物は、複数の異なるＡＡＶベクター（例えば、２つの異なるＡＡＶベクター）を介して送達され得る。ヌクレアーゼ剤がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）である具体例では、第１のＡＡＶベクターは、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）を送達することができ、第２のＡＡＶベクターは、ｇＲＮＡおよび核酸構築物を送達することができる。例えば、Ｃａｓ９コード配列がＡＡＶ構築物に適合することができるように、小さなプロモーターを使用することができる。
別の具体的な例では、ヌクレアーゼ剤は、ＬＮＰ媒介送達を介して送達することができ、核酸構築物は、ＡＡＶ媒介送達を介して送達することができる。別の具体的な例では、ヌクレアーゼ剤は、ＡＡＶ媒介送達を介して送達することができ、核酸構築物は、ＬＮＰ媒介送達を介して送達することができる。
核酸の導入は、ＡＡＶ媒介送達またはレンチウイルス媒介送達（例えば、ＡＡＶベクターまたはレンチウイルスベクター）などのウイルス媒介送達によっても達成することができる。他の例示的なウイルス／ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルスが含まれる。ウイルスは、分裂細胞、非分裂細胞、または分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染できる。ウイルスは宿主ゲノムに組み込まれてもよく、または代替的に宿主ゲノムに組み込まれなくてもよい。このようなウイルスは、免疫力が低減するように操作することもできる。ウイルスは、複製可能であってもよく、複製欠損（例えば、ビリオン複製および／またはパッケージングの追加ラウンドに必要な１つ以上の遺伝子に欠陥がある）であってもよい。ウイルスは、一過性の発現、長期的な発現（例えば、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、または３ヶ月）、または永続的な発現（例えば、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡの）を引き起こし得る。例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）は、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、および１０１６ベクターゲノム／ｍＬを含む。例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）としては、約１０１２、約１０１３、約１０１４、約１０１５および約１０１６のベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、または約１０１２～約１０１６、約１０１２～約１０１５、約１０１２～約１０１４、約１０１２～約１０１３、約１０１３～約１０１６、約１０１４～約１０１６、約１０１５～約１０１６、もしくは約１０１３～約１０１５ｖｇ／ｍＬが挙げられる。他の例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）としては、約１０１２、約１０１３、約１０１４、約１０１５および約１０１６のベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇの体重、または約１０１２～約１０１６、約１０１２～約１０１５、約１０１２～約１０１４、約１０１２～約１０１３、約１０１３～約１０１６、約１０１４～約１０１６、約１０１５～約１０１６、もしくは約１０１３～約１０１５ｖｇ／ｋｇの体重が挙げられる。
ｓｓＤＮＡ ＡＡＶゲノムは、２つのオープンリーディングフレーム、ＲｅｐおよびＣａｐで構成され、相補的ＤＮＡ鎖の合成を可能にする２つの末端逆位配列が隣接している。ＡＡＶトランスファープラスミドを構築する場合、導入遺伝子は２つのＩＴＲの間に配置され、ＲｅｐおよびＣａｐはトランスで供給される。ＲｅｐおよびＣａｐに加えて、ＡＡＶはアデノウイルス由来の遺伝子を含むヘルパープラスミドを必要とする場合がある。これらの遺伝子（Ｅ４、Ｅ２ａ、およびＶＡ）はＡＡＶ複製を仲介する。例えば、トランスファープラスミド、Ｒｅｐ／Ｃａｐ、およびヘルパープラスミドをアデノウイルス遺伝子Ｅ１＋を含むＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、感染性ＡＡＶ粒子を生成することができる。代替的に、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、およびアデノウイルスヘルパー遺伝子を組み合わせて単一のプラスミドとすることもできる。同様のパッケージングセルおよび方法は、レトロウイルスなどの他のウイルスにも使用できる。
ＡＡＶの複数の血清型が確認されている。これらの血清型は、感染する細胞の種類（すなわち、それらの指向性）が異なり、特定の細胞型の優先的な形質導入を可能にする。光受容体細胞に対する血清型には、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が含まれる。網膜色素上皮組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８が含まれる。具体的な例では、核酸構築物を含むＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、またはＡＡＶ８であり得る。
指向性は、キャプシドと異なるウイルス血清型からのゲノムの混合である偽型付けによってさらに洗練することができる。例えば、ＡＡＶ２／５は、血清型５のキャプシドにパッケージされた血清型２のゲノムを含むウイルスを示す。偽型ウイルスの使用は、形質導入効率を改善するだけでなく、指向性を変えることができる。異なる血清型に由来するハイブリッドキャプシドを使用して、ウイルスの指向性を改変することもできる。例えば、ＡＡＶ－ＤＪには、８つの血清型由来のハイブリッドキャプシドが含まれており、インビボで幅広い細胞型にわたって高い感染力を示す。ＡＡＶ－ＤＪ８は、ＡＡＶ－ＤＪの特性を示すが、脳への取り込みが強化された別の例である。ＡＡＶ血清型は、変異によっても修飾できる。ＡＡＶ２の変異修飾の例には、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、およびＳ６６２Ｖが含まれる。ＡＡＶ３の変異修飾の例には、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆ、およびＴ４９２Ｖが含まれる。ＡＡＶ６の変異修飾の例には、Ｓ６６３ＶおよびＴ４９２Ｖが含まれる。他の偽型／修飾ＡＡＶバリアントには、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ８．２、およびＡＡＶ／ＳＡＳＴＧが含まれる。具体的な例では、ＡＡＶは、ＡＡＶ７ｍ８であり、これはすべての網膜層および光受容体への非常に効率的な送達を媒介するＡＡＶバリアントである。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄａｌｋａｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５：１８９ｒａ７６を参照されたい。
導入遺伝子の発現を加速するために、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）バリアントを使用することができる。ＡＡＶは細胞のＤＮＡ複製機構に依存して、ＡＡＶの一本鎖ＤＮＡゲノムの相補的鎖を合成するため、導入遺伝子の発現が遅れる可能性がある。この遅延に対処するために、感染時に自発的にアニーリングすることができる相補的配列を含むｓｃＡＡＶを使用することができ、宿主細胞のＤＮＡ合成の必要性を排除する。しかしながら、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターも使用できる。
パッケージング容量を増やすために、より長い導入遺伝子を、１つ目は３’スプライスドナー、２つ目は５’スプライスアクセプターである２つのＡＡＶトランスファープラスミドに分割することができる。細胞の共感染時に、これらのウイルスはコンカテマーを形成し、一緒にスプライシングされ、完全長の導入遺伝子を発現させることができる。これにより、より長い導入遺伝子の発現が可能になるが、発現の効率は低下する。容量を増やすための同様の方法は、相同組換えを利用する。例えば、導入遺伝子は２つのトランスファープラスミドに分割できるが、共発現が相同組換えおよび全長導入遺伝子の発現を誘導するように、実質的な配列の重複がある。
特定のＡＡＶにおいて、カーゴはヌクレアーゼ剤（すなわち、ヌクレアーゼ剤をコードする核酸）を含めることができる。特定のＡＡＶでは、カーゴはガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含むことができる。特定のＡＡＶにおいて、カーゴは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、およびガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含み得る。特定のＡＡＶにおいて、カーゴは、本明細書の他の場所に記載されるような核酸構築物を含むことができる。特定のＡＡＶにおいて、カーゴは、本明細書の他の場所に記載されるようなヌクレアーゼ剤および核酸構築物を含むことができる。特定のＡＡＶにおいて、カーゴは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、およびガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸、ならびに本明細書の他の場所に記載されるような核酸構築物を含むことができる。
核酸とタンパク質の導入は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介送達によっても達成できる。例えば、ＬＮＰ媒介送達は、ＲＮＡの形態でガイドＲＮＡを送達するために使用することができる。このような方法による送達は、ガイドＲＮＡの一過性の存在をもたらし、生分解性脂質はクリアランスを改善し、忍容性を改善し、免疫原性を低下させる。脂質製剤は、生体分子を分解から保護すると同時に、細胞への取り込みを改善することができる。脂質ナノ粒子は、分子間力によって互いに物理的に結合した複数の脂質分子を含む粒子である。これらには、ミクロスフェア（単層および多層ベシクル、例えば、リポソームを含む）、エマルジョン中の分散相、ミセル、または懸濁液中の内相が含まれる。そのような脂質ナノ粒子は、送達のために１つ以上の核酸またはタンパク質をカプセル化するために使用することができる。カチオン性脂質を含む製剤は、核酸などのポリアニオンを送達するのに有用である。含めることができる他の脂質は、中性脂質（すなわち、非荷電または両性イオン脂質）、陰イオン脂質、トランスフェクションを増強するヘルパー脂質、およびナノ粒子がインビボで存在できる時間を増加させるステルス脂質である。好適なカチオン性脂質、中性脂質、アニオン性脂質、ヘルパー脂質、およびステルス脂質の例は、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１６／０１０８４０Ａ１およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１に見出すことができる。例示的な脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質および１つ以上の他の成分を含むことができる。一例では、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質を含むことができる。別の例では、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質およびＤＳＰＣなどの中性脂質を含むことができる。別の例では、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質、ＤＳＰＣなどの任意の中性脂質、およびＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、またはＳ０３３などのステルス脂質を含むことができる。
ＬＮＰは、以下の１つ以上またはすべてを含み得る：（ｉ）カプセル化およびエンドソーム脱出のための脂質、（ｉｉ）安定化のための中性脂質、（ｉｉｉ）安定化のためのヘルパー脂質、および（ｉｖ）ステルス脂質を含む。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２２（９）：２２２７－２２３５およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。特定のＬＮＰでは、カーゴは、ヌクレアーゼ剤を含むことができる。特定のＬＮＰでは、カーゴはガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含むことができる。特定のＬＮＰにおいて、カーゴは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、およびガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を含み得る。特定のＬＮＰでは、カーゴに外因性ドナー配列を含むことができる。特定のＬＮＰでは、カーゴは、ヌクレアーゼ剤および外因性ドナー配列を含むことができる。特定のＬＮＰにおいて、カーゴは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸、および外因性ドナー配列を含み得る。
カプセル化およびエンドソーム脱出のための脂質は、カチオン性脂質であり得る。脂質はまた、生分解性イオン化可能脂質などの生分解性脂質であり得る。好適な脂質の一例は、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノアートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノアートである脂質ＡまたはＬＰ０１である。例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２２（９）：２２２７－２２３５およびＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。好適な脂質の別の例は、（（５－（（ジメチルアミノ）メチル）－１，３－フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン－８，１－ジイル）ビス（デカノアート）とも呼ばれる、（（５－（（ジメチルアミノ）メチル）－１，３－フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン－８，１－ジイル）ビス（デカノアート）である脂質Ｂである。好適な脂質の別の例は、２－（（４－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン－１，３－ジイル（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－９，１２－ジエノアート）である脂質Ｃである。好適な脂質の別の例は、３－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）－１３－（オクタノイルオキシ）トリデシル３－オクチルウンデカノアートである脂質Ｄである。他の好適な脂質としては、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）としても知られる）））が含まれる。
本明細書に記載のＬＮＰでの使用に適したいくつかのそのような脂質は、インビボで生分解性である。例えば、そのような脂質を含むＬＮＰには、脂質の少なくとも７５％が、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間以内、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から除去されるものが含まれる。別の例として、ＬＮＰの少なくとも５０％が、８、１０、１２、２４、もしくは４８時間以内、または３、４、５、６、７、もしくは１０日以内に血漿から除去される。
このような脂質は、それらが含まれる培地のｐＨに応じてイオン化可能であってよい。例えば、わずかに酸性の培地では、脂質はプロトン化され、したがって正電荷を帯びることができる。逆に、例えば、ｐＨが約７．３５である血液などのわずかに塩基性の媒体では、脂質はプロトン化されない可能性があり、したがって電荷を帯びない可能性がある。いくつかの実施形態では、脂質は、少なくとも約９、９．５、または１０のｐＨでプロトン化され得る。そのような脂質が電荷を帯びる能力は、その固有のｐＫａに関連している。例えば、脂質は、独立して、約５．８～約６．２の範囲のｐＫａを有し得る。
中性脂質は、ＬＮＰを安定化し、その加工を改善するよう機能する。好適な中性脂質の例には、様々な中性、非荷電、または双性イオン性脂質が含まれる。本開示における使用に好適な中性リン脂質の例は、５－ヘプタデシルベンゼン－１，３－ジオール（レゾルシノール）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１－ミリストイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リソホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルロレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リソホスファチジルエタノールアミンおよびこれらの組み合わせを含むが、これらには限定されない。例えば、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）からなる群から選択され得る。
ヘルパー脂質には、トランスフェクションを増強する脂質が含まれる。ヘルパー脂質がトランスフェクションを増強するメカニズムは、粒子安定性を増強することを含んでもよい。場合によっては、ヘルパー脂質が膜の融合性を高めることができる。ヘルパー脂質は、ステロイド、ステロール、およびアルキルレゾルシノールを含む。好適なヘルパー脂質の例には、コレステロール、５－ヘプタデシルレゾルシノール、およびヘミコハク酸コレステロールが含まれる。一例では、ヘルパー脂質はコレステロールまたはヘミコハク酸コレステロールであり得る。
ステルス脂質には、ナノ粒子がインビボで存在できる時間の長さを変える脂質が含まれる。ステルス脂質は、例えば、粒子凝集を低減し、粒子サイズを制御することによって製剤化プロセスにおいて有用である。ステルス脂質は、ＬＮＰの薬物動態特性を調節し得る。好適なステルス脂質には、脂質部分に連結された親水性頭部基を有する脂質が含まれる。
ステルス脂質の親水性頭部基は、例えば、ＰＥＧ（しばしばポリ（エチレンオキシド）と呼ばれる）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリアミノ酸、およびポリＮ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドに基づくポリマーから選択されるポリマー部分を含んでもよい。ＰＥＧという用語は、ポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマーを意味する。特定のＬＮＰ製剤では、ＰＥＧはＰＥＧ２０００とも呼ばれるＰＥＧ－２Ｋであり、平均分子量は約２，０００ダルトンである。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１７３０５４Ａ１を参照されたい。
ステルス脂質の脂質部分は、例えば、独立して約Ｃ４～約Ｃ４０の飽和または不飽和の炭素原子を含むアルキル鎖長を有するジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基を含むものを含むジアシルグリセロールまたはジアシルグリカミドから由来し得、ここで鎖は１つ以上の、例えばアミドまたはエステルなどの官能基を含み得る。ジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基は、１つ以上の置換アルキル基をさらに含み得る。
一例として、ステルス脂質は、ＰＥＧ－ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、およびＰＥＧ－ジステアロイルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（ｌ－［８’－（コレスト－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキシアミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＧ）、ポリ（エチレングリコール）－２０００－ジメタクリレート（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＡ））、および１，２－ジステアリルオキシプロピル－３－アミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＡ）から選択してもよい。１つの具体的な例において、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧであってよい。
ＬＮＰは、製剤中の成分脂質の異なるそれぞれのモル比を含むことができる。ＣＣＤ脂質のモル％は、例えば、約３０モル％～約６０モル％、約３５モル％～約５５モル％、約４０モル％～約５０モル％、約４２モル％～約４７モル％、または約４５％であってよい。ヘルパー脂質のモル％は、例えば、約３０モル％～約６０モル％、約３５モル％～約５５モル％、約４０モル％～約５０モル％、約４１モル％～約４６モル％、または約４４モル％であってよい。中性脂質のモル％は、例えば、約１モル％～約２０モル％、約５モル％～約１５モル％、約７モル％～約１２モル％、または約９モル％であってよい。ステルス脂質のモル％は、例えば、約１モル％～約１０モル％、約１モル％～約５モル％、約１モル％～約３モル％、約２モル％、または約１モル％であってよい。
ＬＮＰは、生分解性脂質（Ｎ）の正に帯電したアミン基と、カプセル化される核酸の負に帯電したリン酸基（Ｐ）との間で異なる比を有することができる。これは、方程式Ｎ／Ｐで数学的に表すことができる。例えば、Ｎ／Ｐ比は、約０．５～約１００、約１～約５０、約１～約２５、約１～約１０、約１～約７、約３～約５、約４～約５、約４、約４．５、または約５であってよい。
いくつかのＬＮＰでは、カーゴはＣａｓ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含むことができる。Ｃａｓ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡは、異なる比であってよい。例えば、ＬＮＰ製剤は、約２５：１～約１：２５の範囲、約１０：１～約１：１０の範囲、約５：１～約１：５の範囲、または約１：１のＣａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡとの比を含んでもよい。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１～約１：５、または約１０：１のＣａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸との比を含んでもよい。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１０、２５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５、１：１０、または１：２５のＣａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸との比を含んでもよい。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１～約１：２の、Ｃａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸との比を含んでもよい。具体的な例において、Ｃａｓ ｍＲＮＡとｇＲＮＡとの比は、約１：１または約１：２であってよい。
ＬＮＰの例示的な投薬には、総ＲＮＡ（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ）カーゴ含有量に対して約０．１、約０．２５、約０．３、約０．５、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約８、もしくは約１０ｍｇ／ｋｇ体重（ｍｐｋ）、または、約０．１～約１０、約０．２５～約１０、約０．３～約１０、約０．５～約１０、約１～約１０、約２～約１０、約３～約１０、約４～約１０、約５～約１０、約６～約１０、約８～約１０、約０．１～約８、約０．１～約６、約０．１～約５、約０．１～約４、約０．１～約３、約０．１～約２、約０．１～約１、約０．１～約０．５、約０．１～約０．３、約０．１～約０．２５、約０．２５～約８、約０．３～約６、約０．５～約５、約１～約５、もしくは約２～約３ｍｇ／ｋｇの体重が含まれる。そのようなＬＮＰは、例えば、静脈内に投与することができる。一例では、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１～約０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量を使用することができる。例えば、約０．０１、約０．０３、約０．１、約０．３、約１、約３、または約１０ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量を使用することができる。ＬＮＰの追加の例示的な投薬には、総ＲＮＡ（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ）カーゴ含有量に対して約０．１、約０．２５、約０．３、約０．５、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約８または約１０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）体重、または約０．１～約１０、約０．２５～約１０、約０．３～約１０、約０．５～約１０、約１～約１０、約２～約１０、約３～約１０、約４～約１０、約５～約１０、約６～約１０、約８～約１０、約０．１～約８、約０．１～約６、約０．１～約５、約０．１～約４、約０．１～約３、約０．１～約２、約０．１～約１、約０．１～約０．５、約０．１～約０．３、約０．１～約０．２５、約０．２５～約８、約０．３～約６、約０．５～約５、約１～約５、もしくは約２～約３ｍｇ／ｋｇの体重が含まれる。そのようなＬＮＰは、例えば、静脈内に投与することができる。一例では、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１～約０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量を使用することができる。例えば、約０．０１、約０．０３、約０．１、約０．３、約０．５、約１、約２、約３、または約１０ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量を使用することができる。別の例では、約０．５～約１０、約０．５～約５、約０．５～約３、約１～約１０、約１～約５、約１～約３、または約１～約２ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量を使用することができる。
免疫原性を低下させるために、送達様式を選択することができる。例えば、異なる構成要素は、異なる様式（例えば、二峰性送達）によって送達され得る。これらの異なる様式は、対象の送達された分子に異なる薬力学または薬物動態特性を与える可能性がある。例えば、異なる様式は、異なる組織分布、異なる半減期、または異なる時間的分布をもたらす可能性がある。いくつかの送達様式（例えば、自律複製またはゲノム組み込みによって細胞内で持続する核酸ベクターの送達）は、分子のより持続的な発現および存在をもたらすが、他の送達様式は、一過性で持続性が低い（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質の送達）。より一時的な方法で、例えばＲＮＡとして成分を送達することにより、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体が存在し、短期間のみ活性化することを保証し、免疫原性を低減させることができる。このような一時的な送達は、オフターゲット修飾の可能性を低減することもできる。
インビボでの投与は、例えば、硝子体内注射または網膜下注射を介することを含む、任意の好適な経路によることができる。（全身的アプローチと比較して）有意に少量の成分は、全身的に投与された場合（例えば、静脈内）と比較して、局所的に投与された場合（例えば、網膜下または硝子体内）に効果を発揮し得る。局所投与様式はまた、治療有効量の成分が全身投与されるときに起こり得る潜在的に毒性の副作用の発生率を低減または排除し得る。
ヌクレアーゼ剤（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸）および／または本明細書に開示される核酸構築物を含む組成物は、１つ以上の生理学的および薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または助剤を使用して製剤化することができる。製剤は、選択した投与経路に依存する可能性がある。「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤、賦形剤、または補助剤が製剤の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに実質的に有害ではないことを意味する。
投与の頻度および投与回数は、他の要因の中でもとりわけ、核酸構築物またはヌクレアーゼ剤（またはヌクレアーゼ剤をコードする核酸）の半減期および投与経路に依存し得る。細胞または動物への核酸またはタンパク質の導入は、ある期間にわたって１回または複数回実施することができる。例えば、導入は、ある期間にわたって一度だけ、ある期間にわたって少なくとも２回、ある期間にわたって少なくとも３回、ある期間にわたって少なくとも４回、ある期間にわたって少なくとも５回、ある期間にわたって少なくとも６回、ある期間にわたって少なくとも７回、ある期間にわたって少なくとも８回、ある期間にわたって少なくとも９回、ある期間にわたって少なくとも１０回、ある期間にわたって少なくとも１１回、ある期間にわたって少なくとも１２回、ある期間にわたって少なくとも１３回、ある期間にわたって少なくとも１４回、ある期間にわたって少なくとも１５回、ある期間にわたって少なくとも１６回、ある期間にわたって少なくとも１７回、ある期間にわたって少なくとも１８回、ある期間にわたって少なくとも１９回、またはある期間にわたって少なくとも２０回、実施することができる。
任意選択で、そのような方法は、動物または細胞において挿入されたレチノスキシンコード配列またはコードされたレチノスキシンタンパク質の発現および／または活性を評価することをさらに含むことができる。標的化遺伝子改変を有する細胞を同定するために様々な方法を使用することができる。スクリーニングは、親染色体の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイを含むことができる。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの定量的ＰＣＲを介して実施することができる。リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセットおよび非標的参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅された配列を認識する蛍光プローブを含むことができる。好適な定量的なアッセイの他の例としては、蛍光媒介インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化プローブすべてに対する定量的ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分子ビーコンプローブ、またはＥｃｌｉｐｓｅ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、の目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００５／０１４４６５５を参照されたい）。
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）もスクリーニングに使用できる。次世代シーケンシングは、「ＮＧＳ」または「超並列シーケンシング」または「ハイスループットシーケンシング」と呼ばれることもある。ＮＧＳは、ＭＯＡアッセイに加えてスクリーニングツールとして使用して、標的となる遺伝子改変の正確な性質と、それが細胞タイプ、組織タイプ、または臓器タイプ間で一貫しているかどうかを定義できる。
動物における標的ゲノム遺伝子座の修飾を評価することは、任意の組織または臓器からの任意の細胞型にあり得る。例えば、評価は、同じ組織または臓器（例えば、眼）からの複数の細胞型、または組織または臓器内の複数の位置からの細胞で行うことができる。これは、標的組織または臓器内のどの細胞型が標的化されているか、または組織または臓器のどのセクションが核酸構築物によって到達されているかについての情報を提供することができる。別の例として、評価は複数の種類の組織または複数の臓器で行うことができる。特定の組織、臓器、または細胞型が標的にされる方法では、これは、その組織または臓器がどれほど効果的に標的にされるか、および他の組織または臓器にオフターゲット効果があるかどうかについての情報を提供することができる。
レチノスキシンの発現を測定するための方法は、例えば、タンパク質発現を測定することを含むことができる。そのような方法はよく知られている。そのような方法はまた、レチノスキシンコード配列によってコードされるｍＲＮＡの発現を評価することを含み得る。この測定は、眼内または眼内の特定の細胞型もしくは領域（例えば、光受容体などの網膜細胞）で行うことができる。
使用することができるアッセイの一例は、無傷の固定組織との関連で、単一ヌクレオチドの変化を含む、細胞特異的に編集された転写物を定量化することができる方法である、ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）アッセイである。ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）ＲＮＡ ＩＳＨアッセイは、遺伝子編集の特性評価においてＮＧＳおよびｑＰＣＲを補完することができる。ＮＧＳ／ｑＰＣＲは野生型および編集された配列の定量的平均値を提供できるが、組織内の編集された細胞の不均一性またはパーセンテージに関する情報は提供しない。ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）ＩＳＨアッセイは、組織全体のランドスケープビューと、編集されたｍＲＮＡ転写物を含む標的組織内の実際の細胞数を定量化できる単一細胞分解能での野生型対編集された転写物の定量化とを提供できる。ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）アッセイは、ペアオリゴ（「ＺＺ」）プローブを使用して非特異的なバックグラウンドなしでシグナルを増幅し、単一分子ＲＮＡ検出を実現する。しかしながら、ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）プローブの設計とシグナル増幅システムにより、１ＺＺプローブを使用した単一分子ＲＮＡの検出が可能になり、無傷の固定組織における単一ヌクレオチドの編集および変異を差次的に検出できる。
レチノスキシンタンパク質の活性を測定するためのアッセイには、例えば、光干渉断層計（ＯＣＴ）および網膜電図（ＥＲＧ）試験が含まれ得る。ＯＣＴスキャンを使用して、網膜腔のスコアリングおよび／または網膜光受容体の厚さの測定をすることができる。他のアッセイには、視運動学的試験が含まれる。そのような方法はよく知られている。例えば、修飾される細胞または動物が、Ｘ連鎖性若年網膜分離症に関連するかまたはそれを引き起こす変異（例えば、Ｒ１４１Ｃ変異）を有する細胞である場合、そのような機能アッセイを使用して、疾患表現型の救済を評価することができる。光干渉断層計（ＯＣＴ）は、黄斑領域の高解像度断面画像を提供する。ＸＬＲＳを有する患者では、ＯＣＴは主に網膜の内顆粒層および外網状層に嚢胞性空間を示す。このような機能試験には、網膜電図（ＥＲＧ）試験も含まれ、これは、光刺激に応答して網膜の神経細胞および非神経細胞によって生成される電気的活性を測定する診断試験である。ＸＬＲＳは、ＥＲＧのフォトトピックおよびスコトピックのｂ波振幅の低減に関連している。
上記または下記で引用されているすべての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、アクセッション番号などは、各項目が、参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されたのと同じ程度に、すべての目的に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列の異なるバージョンが違う時間にアクセッション番号に関連付けられている場合、本出願の有効な出願日においてアクセッション番号に関連付けられるバージョンを意味する。有効な出願日とは、該当する場合、アクセッション番号に関する実際の出願日以前または優先出願の出願日を意味する。同様に、刊行物、ウェブサイトなどの異なるバージョンが違う時間に公開されている場合、別段の指定のない限り、本出願の有効な出願日の直近に公開されたバージョンを意味する。別段に他の指示がない限り、本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様を、任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本発明は、明瞭さおよび理解の目的に対し図表および例を介していくつかの詳細が記載されているが、添付の特許請求の範囲内で、ある特定の変化および修正を実施することができることが明らかになろう。
配列の簡単な説明
添付の配列表に列記されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基のための標準的な文字略語、およびアミノ酸のための三文字表記を使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進み３’末端に至る標準規則に従っている。各ヌクレオチド配列の１本の鎖のみが示されているが、相補的鎖は、示されている鎖を任意に参照することによって含まれると理解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供される場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重バリアントもまた提供されることが理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進みカルボキシ末端に至る標準規則に従っている。
Figure 2022553573000085
Figure 2022553573000086
実施例１．ＸＬＲＳマウスモデルのマウスＲｓ１遺伝子座へのＲＳ１コード配列の挿入
インビボでの潜在的なＸ連鎖性若年網膜分離療法（ＸＬＲＳ）ＣＲＩＳＰＲ治療戦略をモデル化するために、すべての組織でＣａｓ９タンパク質の構成的発現を伴うマウス株を生成し（ＲｏｓａＣａｓ９／＋、例えば、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１９／００３２１５５およびＷＯ２０１９／０２８０３２を参照されたい）、それをマウスレチノスキシンの変異体コピー（Ｒｓ１）（Ｒｓ１Ｒ１４１Ｃ／Ｙ）を含有するマウスと交配させて、ＲｏｓａＣａｓ９／＋、Ｒｓ１Ｒ１４１Ｃ／Ｙマウスを生成した。Ｒｓ１ Ｒ１４１Ｃ変異を有するマウスは、レチノスキシンの細胞内保持を引き起こすことで、網膜内分裂、網膜変性、ＥＲＧ ｂ波の低減など、ヒトの状態の主要な特徴を複製する。
Ｒｓ１遺伝子は、網膜の細胞組織に関与する高度に保存された細胞外タンパク質である。Ｒｓ１遺伝子は、ホモオリゴマータンパク質複合体として光受容体および双極細胞から組み立てられ、分泌される。Ｒｓ１では２００を超える変異が検出されており、その多くは、機能しないタンパク質またはタンパク質分泌の欠如による黄斑変性症の早期発症につながる。機能的なＲｓ１発現の欠如は、網膜層内で分離を引き起こし、ＸＬＲＳに関連する早期および進行性視力喪失につながる。現在まで、ＸＬＲＳ治療にＣａｓ９テクノロジーを使用した前臨床または臨床研究を報告している出版物は存在しない。ここでは、マウスのＲｓ１の非分泌Ｒ１４１Ｃバリアントを救助するためにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と組み合わせてＣａｓ９を使用するためのアプローチについて説明する。構築物は、網膜の内因性Ｒｓ１遺伝子座（例えば、光受容体）に組み込まれるように設計されており、ハイブリッドマウス－ヒトＲＳ１転写物は、内因性Ｒｓ１プロモーターを介して発現される。
ＡＡＶ血清型７ｍ８の網膜下送達により、導入遺伝子の発現が成功した（データは示さず）。ＡＡＶは１年以上異所的に持続する可能性があるが、変異体Ｒｓ１表現型の永続的な救済のための戦略の開発に努めている。この目的のために、ＷＴヒトＲＳ１エキソン２～６（プロモーターなし）およびマウスＲｓ１イントロン１を標的とするガイドＲＮＡをコードする３つのウイルスベクターを設計した。ガイドＲＮＡの配列は配列番号４３に示され、マウスＲｓ１イントロン１のガイドＲＮＡ標的配列は配列番号２３８３に示されている。これらのウイルスのいずれか１つをＲｏｓａＣａｓ９／＋、Ｒｓ１Ｒ１４１Ｃ／Ｙマウスに注射すると、ガイドＲＮＡの発現により、Ｒｓ１遺伝子座が切断され、ヒトＲＳ１ ｃＤＮＡ断片を含むウイルスゲノムが組み込まれると予想された。マウスのＲｓ１遺伝子座を図１に示す。マウスエキソン１はヒトエキソン２～６ｃＤＮＡにスプライスし（図２）、ハイブリッドマウスヒトタンパク質の発現は変異体マウスＲｓ１の転写を妨げるはずである。
ウイルスベクターバージョン１（配列番号４７）は、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターへの双方向性挿入によって生成された。２００塩基のＲＳ１ヒトイントロン１（エキソン２スプライスシグナルを含む）を、ヒトＲＳ１転写物のエキソン２～６をコードするｃＤＮＡの前に配置し、続いてウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡ（Ｔｈ）を配置した。第２のヒトｃＤＮＡは、マウスのコドン最適化によって生成され、反対方向でベクターに組み込まれた。この配列は、マウススプライスシグナルおよびＳＶ４０ポリＡ（Ｔｍｈ）を含む２００ｂｐが隣接していた。配列は、ウイルス転写物が自己アニーリングする可能性を低減するために十分に発散するように設計された。さらに、転写物の間にｓｇＲＮＡ発現ユニットを加えた（図３Ａ）。この戦略の利点は、ウイルスゲノムをどちらの方向にも挿入でき、対立遺伝子救出のための生存可能なリーディングフレームを形成できることである。
ウイルスベクターバージョン２（配列番号４６）は、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターへの双方向性挿入によって生成された。このバージョンはバージョン１と同じように構成されているが、２つの違いを有する。最初に、配列は自己相補的ＡＡＶベクターに組み込まれた。次に、２１００ｂｐの最大自己相補的ゲノムサイズに準拠するために、スプライスシグナル領域を６０ｂｐに縮小した（図３Ａ）。
ウイルスベクターバージョン３（配列番号４５）は、ホモロジー非依存性標的化組み込み（ＨＩＴＩ）用に設計された。ＨＩＴＩは、Ｃａｓ９認識配列の必要性を利用して、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を有する。この構築物は、ＴｈおよびＲｓ１イントロン１を標的とする同じガイドＲＮＡを発現するように設計された。しかしながら、バージョン１および２にガイドＲＮＡ標的配列が含まれていない場合、バージョン３の各側には逆ガイドＲＮＡ標的配列が隣接している（図３Ｂ）。ウイルスゲノムが二本鎖になると、１つのガイドＲＮＡ配列を発現し、マウスＲｓ１イントロン１およびウイルスゲノムの両側で同時に二本鎖切断を引き起こし、ＩＴＲ配列を効果的に切断する。ここで、解放されたウイルスゲノムは、どちらの方向でもマウスゲノムに自由に挿入できるようになる。しかしながら、ｃＤＮＡが逆方向に組み込まれる場合は、ガイドＲＮＡ標的配列を再構成して、Ｃａｓ９のさらなる切断に利用できるはずである。ｃＤＮＡが所望の方向に組み込まれると、ガイドＲＮＡ標的配列が破壊され、配列が所定の位置に固定される。
バージョン１および２のＲｓ１配列はほぼ同一であるが、ウイルスの骨格は二本鎖ウイルスの生成のタイミングを変更し、遺伝子挿入の効率に影響を与え得る。第２の鎖が合成されるメカニズムの違いにより、ｓｃＡＡＶはｓｓＡＡＶよりも速く二本鎖になる。ｓｓＡＡＶの両方のＩＴＲは複製起点として機能し、新しく合成された鎖を切断する一本鎖ヌクレアーゼドメインを含むことができる。複製はどちらのＩＴＲからも開始できるため、＋鎖および－鎖の混合が生成される。ポリメラーゼが他のＩＴＲに到達すると、合成された鎖が切断されかつ放出される。補体鎖を合成するための主要なメカニズムは、宿主細胞機構を使用することである。しかしながら、低レベルでは、ウイルスによって合成された＋鎖および－鎖は、自発的にアニーリングして二本鎖ウイルスを生成し得る。ｓｃＡＡＶの場合、２つのＩＴＲ配列のうちの１つが変異して、ヌクレアーゼドメインが除去される。複製フォークはアクティブなＩＴＲで始まり、切断されることなく変異体ＩＴＲを通過し、反対側の鎖で合成が続行される。二本鎖ウイルスを生成するための＋鎖および－鎖の両方の自己補体を含む一本鎖合成。
バージョン１～３は各々、Ｃａｓ９マウス骨格のマウスＲｓ１遺伝子座での遺伝子挿入を仲介することができた。パイロット研究では、少量のウイルスが各マウスの右眼に注射され、左眼は対照として注射されなかった。両方の網膜を採取し、半分に切断した。各網膜の半分は、マウスＲｓ１遺伝子座のイントロン１での非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の特性評価に使用された。残りの半分を使用して、変異体領域でのＮＧＳアンプリコン配列用のｃＤＮＡを生成した。ＰＣＲの効率およびバイアスにより、各転写物のバリアントを増幅することはできなかったが、実際の発現プロファイルを定量化することはできなかった。ＮＨＥＪの特性評価は、ガイドＲＮＡ活性および挿入活性への手がかりを提供する。ＮＨＥＪの検出は、変異体マウス転写物を発現する可能性が高い遺伝子挿入のない対立遺伝子を意味する。いずれかの修飾転写物の検出は、遺伝子挿入が起こったことを示す。
１３匹のマウスを右眼に注射した：バージョン１では３匹、バージョン２および３では各々５匹。光干渉断層計（ＯＣＴ）イメージングで見られるように、注射されたすべての眼の網膜組織は改善された。図４を参照されたい。各眼の３つの異なる位置からのＯＣＴスキャン（各々６１枚の画像を含む）で示された網膜腔のスコアリングは、３人の独立したリーダーによる以下の事前設定された基準に基づいて行われた。少なくとも１枚の個別の画像に１～４個の空洞がある場合、スコア１が割り当てられた。少なくとも１枚の個別の画像に４個以上の空洞があるが、空洞が融合していない場合、スコア２が割り当てられた。少なくとも１枚の個別の画像に融合した空洞がある場合、スコア３が割り当てられた。少なくとも１枚の個別の画像に融合した空洞があり、網膜が伸ばされている場合は、スコア４が割り当てられた。各治療群の平均スコアは、ノンパラメトリッククラスカルウォリス一元配置分散分析および事後検定ダンの多重比較検定によって、プールされた未治療の眼を含む対照群と比較された。
次世代のターゲットリシーケンシングアンプリコンは、図３に示す領域（水平矢印）用に設計され、これらの領域は、４つの予想される配列バリアント（（１）ＷＴマウス、Ｒ１４１Ｃ変異体を含まないマウス参照配列と、（２）変異体マウス、Ｒ１４１Ｃ変異体を含むマウス参照配列と、（３）ヒト化転写物１、ヒト参照配列と、（４）ヒト化転写物２、マウスコドン最適化ヒト参照配列と）が示される。研究マウスからマウス網膜を採取し、組織から全ｍＲＮＡを抽出した。ｍＲＮＡを使用してｃＤＮＡを生成し、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）増幅のテンプレートとして機能させた。配列識別用のバーコードが組み込まれた標的固有のオリゴを使用して、組織ごとに４つのバリアントすべてを増幅した。各マウスのＰＣＲ産物を標準化し、さらに調製するために単一のチューブにプールした。完成したライブラリをＭｉＳｅｑにロードし、２×３００プログラムを使用してサンプルを配列決定した。次いで、情報コードを使用してサンプルをデコンボリューションし、新規の配列参照を作成した。各バリアントに一致した読み取り数を定量化し、バリアントの読み取りカウントを合計読み取りカウントで割ってパーセンテージを取得した。予想通り、ＷＴマウスの配列は雌のＲｏｓａＣａｓ９／＋、Ｒｓ１Ｒ１４１Ｃ／＋マウスでのみ見られた。予想される４つの配列バリアントのＮＧＳ結果を図５に示す。ＰＣＲバイアスおよび効率は考慮されていない。別個のアンプリコンを使用して、Ｒｓ１イントロン１ガイドＲＮＡ標的配列を増幅した。マウスの参照配列に一致するか、非相同末端結合を含む読み取り数を定量化して、挿入せずにガイドＲＮＡが切断される頻度を評価した。図６Ａおよび６Ｂを参照されたい。図５の表のデータの一部を示す棒グラフを、バージョン１～３のそれぞれの図７Ａ～７Ｃに示す。
すべてのマウスは、すべての転写物の様々なレベルを示し、すべてのマウスのＴｍｈ読み取り数よりも多くのＴｈ読み取り数があった。予想通り、高いＮＨＥＪ率を有するマウスでは、ヒト転写物の存在量が少なかった。バージョン１および２は同様の配列プロファイルを有していたが、バージョン３は残留変異体マウス転写物の存在が多かった。これは、特定の挿入方向が必要なためである可能性がある。ガイドＲＮＡの設計は、挿入を所望の挿入に向けて推進するのに役立つはずだが、Ｃａｓ９切断により、再標的化の可能性を超えて認識配列が損傷した可能性がある。追加的に、ウイルスゲノムへの大きな挿入／欠失（インデル）により、スプライスシグナルが破壊され、適切な発現が妨げ得る。
実施例２．ヒト網膜芽細胞腫細胞のヒトＲＳ１遺伝子座へのＲＳ１コード配列の挿入
次に、インビトロでＷＥＲＩ－Ｒｂ１ヒト網膜芽細胞腫細胞のヒトＲＳ１遺伝子座へのＲＳ１コード配列の挿入を試験した。ＷＥＲＩ－Ｒｂ１細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ １６９ＴＭ）は、ヒト網膜芽細胞腫に由来した。網膜芽細胞腫細胞は光受容体の前駆細胞であり、光受容細胞株が利用できないため、適切なインビトロ光受容細胞モデルである。細胞は、ＩＣＣおよびＲＴ－ＰＣＲによって網膜特異的細胞マーカーで社内で特徴付けられ、錐体特異的ｍＲＮＡ／タンパク質のみが示され、それらの桿体対応物は見られず、この新生物が錐体細胞系統であったことを示唆している。加えて、ＲＳ１はＷＥＲＩ－Ｒｂ１細胞によって発現および放出されることが報告された。また、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルでＲＳ１発現を検出した（データは示さず）。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ヒトＲＳ１およびＣａｓ９ ｍＲＮＡのイントロン１を標的とする６つのガイドＲＮＡのうちの１つで製剤化された（配列番号６２４５に示される配列）。
Figure 2022553573000087
最初の実験では、懸濁液中のヒト網膜芽細胞腫細胞に約５ｅ５ ＭＯＩのＡＡＶドナー（実施例１からのウイルスベクターバージョン１および２）を形質導入し、感染の２時間後にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＬＮＰを投与した。１０００ｎｇのＬＮＰで投与された「高」サンプルを除いて、すべてのＬＮＰをウェル当たり５００ｎｇ（４８ウェルプレート）で投与した。次いで、ＲＴ－ｑＰＣＲによる完全な遺伝子発現分析を行った。ＲＴ－ｑＰＣＲは、サンプルから全ＲＮＡを採取し、それらをＤＮＡｓｅで処理して、サンプルに含まれるすべてのＤＮＡを分解することによって実施された。次に、ＲＮＡサンプルを逆転写して、サンプルに含まれるすべてのｍＲＮＡのｃＤＮＡを作成した。次いで、標的固有のＴａｑＭａｎアッセイを使用して、細胞内で発現する固有のＲＳ１配列を定量化した。感染から７２時間後にＲＮＡを採取した。上記のように処理した全ＲＮＡおよびＤＮＡａｓｅを採取することにより、逆転写制御は完了しなかった。対照として、ｃＤＮＡが生成されないように逆転写ポリメラーゼを水に置き換えた。逆転写および対照の非逆転写サンプルは、ハウスキーピング遺伝子（ＤＲＯＳＨＡ）を使用して実行された。ウイルスベクターバージョン１（一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターへの双方向性挿入）の結果を図８Ａに示す。ウイルスベクターバージョン１（自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターへの双方向性挿入）の結果を図８Ｂに示す。これらの結果は、ＲＮＡの量および質の違いを正規化するためにデルタＣｔとして示される。数値が小さいほど、標的配列の発現が高くなる。これらの結果は、導入された配列の強力な発現を示している。ＴａｑＭａｎアッセイおよびウイルス配列は、内因性のヒトＲＳ１発現の交差検出を低減するために最適化された。第２の実験では、懸濁液中のヒト網膜芽細胞腫細胞に約５ｅ５ ＭＯＩのＡＡＶドナー（実施例１からのウイルスベクターバージョン１および２）を形質導入し、感染の２時間前にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＬＮＰを投与した。１０００ｎｇのＬＮＰで投与された「高」サンプルを除いて、すべてのＬＮＰをウェル当たり５００ｎｇ（４８ウェルプレート）で投与した。次いで、ＲＴ－ｑＰＣＲによる完全な遺伝子発現分析を行った。ウイルスベクターバージョン１（一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターへの双方向性挿入）の結果を図９Ａに示す。ウイルスベクターバージョン１（自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターへの双方向性挿入）の結果を図９Ｂに示す。これらの結果は、ＲＮＡの量および質の違いを正規化するためにデルタＣｔとして示される。数値が小さいほど、標的配列の発現が高くなる。これらの結果は、導入された配列の強力な発現を示している。ＴａｑＭａｎアッセイおよびウイルス配列は、内因性のヒトＲＳ１発現の交差検出を低減するために最適化された。
実施例３．相同組換えを介したＸＬＲＳマウスモデルのマウスＲｓ１遺伝子座へのＲＳ１コード配列の挿入
インビボでの潜在的なＸ連鎖性若年網膜分離療法（ＸＬＲＳ）ＣＲＩＳＰＲ治療戦略をモデル化するために、すべての組織でＣａｓ９タンパク質の構成的発現を伴う実施例１に記載のマウス株を使用し、それをマウスレチノスキシンの変異体コピー（Ｒｓ１）（ＲｏｓａＣａｓ９／＋、Ｒｓ１Ｒ１４１Ｃ／Ｙマウス）を含有するマウスと交配させた。マウスのＲｓ１の非分泌Ｒ１４１Ｃバリアントを救助するためにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と組み合わせてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用する。構築物は、相同組換えを介して網膜の内因性Ｒｓ１遺伝子座（例えば、光受容体）に組み込まれるように設計されており、ハイブリッドマウス－ヒトＲＳ１転写物は、内因性Ｒｓ１プロモーターを介して発現される。マウスは、網膜がまだ有糸分裂、細胞分化、および成熟を経験しているＰ１４の年齢にある。注射は網膜の有糸分裂中に行われ、評価は注射後２ヶ月の有糸分裂後である。
ＷＴヒトＲＳ１エキソン２～６（プロモーターなし）およびマウスＲｓ１イントロン１を標的とするガイドＲＮＡ（配列番号２８８７に示されるガイドＲＮＡ標的配列）をコードする３つのウイルスベクターを設計し、これらすべての要素を隣接させたホモロジーアームによる。図１０を参照されたい。これらの要素には、各側には逆ガイドＲＮＡ標的配列が隣接している。ウイルスゲノムが二本鎖になると、１つのガイドＲＮＡ配列を発現し、マウスＲｓ１イントロン１およびウイルスゲノムの両側で同時に二本鎖切断を引き起こし、ＩＴＲ配列を効果的に切断する。第１のウイルスベクターのホモロジーアームは各々約１８００ｂｐであり、第２のウイルスベクターのホモロジーアームは各々約９００ｂｐであり、第３のウイルスベクターのホモロジーアームは各々約４５０ｂｐである。３つのベクターの配列は、それぞれ、配列番号６２４７～６２４９に示されている。これらのウイルスのいずれかをＲｏｓａＣａｓ９／＋、Ｒｓ１Ｒ１４１Ｃ／Ｙマウスの眼に注射すると、ガイドＲＮＡの発現により、Ｒｓ１遺伝子座が切断され、ヒトＲＳ１ ｃＤＮＡ断片を含むウイルスゲノムとの相同組換えが起こる。マウスのＲｓ１遺伝子座を図１に示す。マウスエキソン１はヒトエキソン２～６ｃＤＮＡにスプライスし（図２）、ハイブリッドマウスヒトタンパク質の発現は変異体マウスＲｓ１の転写を妨げる。
網膜を採取し、半分に切断する。各網膜の半分は、マウスＲｓ１遺伝子座のイントロン１での非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の特性評価に使用される。残りの半分を使用して、変異体領域でのＮＧＳアンプリコン配列用のｃＤＮＡを生成する。ＮＨＥＪの特性評価は、ガイドＲＮＡ活性および挿入活性に関する情報を提供する。ＮＨＥＪの検出は、変異体マウス転写物を発現する可能性が高い遺伝子挿入のない対立遺伝子を意味する。挿入された転写物の検出は、遺伝子挿入が起こったことを示す。
網膜組織は、光干渉断層計（ＯＣＴ）イメージングによって評価される。ＯＣＴスキャンでの網膜腔のスコアリングは、３人の独立したリーダーによる以下の事前設定された基準に基づいて行われる。少なくとも１枚の個別の画像に１～４個の空洞がある場合、スコア１が割り当てられる。少なくとも１枚の個別の画像に４個以上の空洞があるが、空洞が融合していない場合、スコア２が割り当てられる。少なくとも１枚の個別の画像に融合した空洞がある場合、スコア３が割り当てられる。少なくとも１枚の個別の画像に融合した空洞があり、網膜が引き伸ばされている場合、スコア４が割り当てられる。各治療群の平均スコアは、ノンパラメトリッククラスカルウォリス一元配置分散分析および事後検定ダンの多重比較検定によって、プールされた未治療の眼を含む対照群と比較される。
研究マウスからマウス網膜を採取し、組織から全ｍＲＮＡを抽出した。ｍＲＮＡを使用してｃＤＮＡを生成し、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）増幅のテンプレートとして機能させる。配列識別用のバーコードが組み込まれた標的固有のオリゴを使用して、組織ごとにバリアントすべてを増幅する。各マウスのＰＣＲ産物を標準化し、さらに調製するために単一のチューブにプールする。完成したライブラリをＭｉＳｅｑにロードし、２×３００プログラムを使用してサンプルを配列決定する。次いで、情報コードを使用してサンプルをデコンボリューションし、新規の配列参照を作成する。各バリアントに一致した読み取り数を定量化し、バリアントの読み取りカウントを合計読み取りカウントで割ってパーセンテージを取得する。
実施例４．相同組換えを介したヒト網膜芽細胞腫細胞のヒトＲＳ１遺伝子座へのＲＳ１コード配列の挿入
次に、インビトロでのヒト網膜芽細胞腫細胞における相同組換えを介したヒトＲＳ１遺伝子座へのＲＳ１コード配列の挿入を試験する。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ヒトＲＳ１およびＣａｓ９ ｍＲＮＡのイントロン１を標的とするガイドＲＮＡで製剤化される。最初の実験では、懸濁液中のヒト網膜芽細胞腫細胞に約５ｅ５ ＭＯＩのＡＡＶドナー（実施例３からのウイルスベクターだが、ヒトＲＳ１ホモロジーアームを有する）を形質導入し、感染の２時間後にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＬＮＰを投与する。すべてのＬＮＰは、ウェル当たり５００ｎｇまたはウェル当たり１０００ｎｇで投与される。次いで、ＲＴ－ｑＰＣＲによる完全な遺伝子発現分析が行われる。第２の実験では、懸濁液中のヒト網膜芽細胞腫細胞に約５ｅ５ ＭＯＩのＡＡＶドナー（実施例３からのウイルスベクターだが、ヒトＲＳ１ホモロジーアームを有する）を形質導入し、感染の２時間前にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＬＮＰを投与した。すべてのＬＮＰは、ウェル当たり５００ｎｇまたはウェル当たり１０００ｎｇで投与された。次いで、ＲＴ－ｑＰＣＲによる完全な遺伝子発現分析が行われる。

Claims (223)

  1. 標的ゲノム遺伝子座に組み込むための核酸構築物であって、前記核酸構築物が、双方向性であり、
    （ａ）第１のレチノスキシンタンパク質またはその断片の第１のコード配列を含む第１のセグメントと、
    （ｂ）第２のレチノスキシンタンパク質またはその断片の第２のコード配列の逆相補体を含む第２のセグメントと、を含む、核酸構築物。
  2. 前記第２のセグメントが、前記第１のセグメントの３’に位置する、請求項１に記載の核酸構築物。
  3. 前記第１のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片が、ヒトレチノスキシンタンパク質もしくはその断片であるか、前記第２のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片が、ヒトレチノスキシンタンパク質もしくはその断片であるか、または前記第１のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片および前記第２のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片の両方が、ヒトレチノスキシンタンパク質もしくはその断片である、請求項１または２に記載の核酸構築物。
  4. 前記第１のコード配列が、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなるか、前記第２のコード配列が、ｃＤＮＡを含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれらからなるか、または前記第１のコード配列および前記第２のコード配列の両方が、ｃＤＮＡを含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  5. 前記第１のコード配列が、ヒトＲＳ１のエキソン２～６もしくはその縮重バリアントを含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなるか、前記第２のコード配列が、ヒトＲＳ１のエキソン２～６もしくはその縮重バリアントを含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなるか、または前記第１のコード配列および前記第２のコード配列の両方が、ヒトＲＳ１のエキソン２～６もしくはその縮重バリアントを含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  6. 前記第１のセグメントが、前記第１のコード配列の５’に位置するヒトＲＳ１の第１のイントロンの断片もしくは部分を含み、かつ／または前記第２のセグメントが、前記第２のコード配列の前記逆相補体の３’に位置するヒトＲＳ１の第２のイントロンの断片もしくは部分の逆相補体を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  7. 前記第１のレチノスキシンタンパク質またはその断片が、前記第２のレチノスキシンタンパク質またはその断片と同一である、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  8. 前記第２のコード配列が、前記第１のコード配列のコドン使用とは異なるコドン使用を採用する、請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  9. 前記第２のセグメントが、前記第１のセグメントに対する少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の相補性を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  10. 前記第２のセグメントが、前記第１のセグメントに対する約３０％未満、約３５％未満、約４０％未満、約４５％未満、約５０％未満、約５５％未満、約６０％未満、約６５％未満、約７０％未満、約７５％未満、約８０％未満、約８５％未満、約９０％未満、約９５％未満、約９７％未満、または約９９％未満の相補性を有する、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  11. 前記第２のコード配列の前記逆相補体が、
    （ａ）前記第１のコード配列に実質的に相補的ではないか、
    （ｂ）前記第１のコード配列の断片に実質的に相補的ではないか、
    （ｃ）前記第１のコード配列に高度に相補的であるか、
    （ｄ）前記第１のコード配列の前記断片に高度に相補的であるか、
    （ｅ）前記第１のコード配列の前記逆相補体に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％同一であるか、
    （ｆ）前記第１のコード配列の前記逆相補体に対して約５０％～約８０％同一であるか、または
    （ｇ）前記第１のコード配列の前記逆相補体に対して約６０％～約１００％同一である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  12. 前記第１のセグメントが、リンカーによって前記第２のセグメントに連結されている、請求項１～１１のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  13. 前記リンカーが、約５～約２０００ヌクレオチドの長さである、請求項１２に記載の核酸構築物。
  14. 前記第１のセグメントが、前記第１のコード配列の３’に位置する第１のポリアデニル化シグナル配列を含み、前記第２のセグメントが、前記第２のコード配列の前記逆相補体の５’に位置する第２のポリアデニル化シグナル配列の逆相補体を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  15. 前記第１のポリアデニル化シグナル配列が、前記第２のポリアデニル化シグナル配列とは異なる、請求項１４に記載の核酸構築物。
  16. 前記核酸構築物が、前記第１のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片または前記第２のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片の発現を駆動するプロモーターを含まない、請求項１～１５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  17. 前記第１のセグメントが、前記第１のコード配列の５’に位置する第１のスプライスアクセプター部位を含み、前記第２のセグメントが、前記第２のコード配列の前記逆相補体の３’に位置する第２のスプライスアクセプター部位の逆相補体を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  18. 前記第１のスプライスアクセプター部位が、ＲＳ１遺伝子に由来するか、前記第２のスプライスアクセプター部位が、ＲＳ１遺伝子に由来するか、または前記第１のスプライスアクセプター部位および前記第２のスプライスアクセプター部位の両方が、ＲＳ１遺伝子に由来する、請求項１７に記載の核酸構築物。
  19. 前記第１のスプライスアクセプター部位が、ヒトＲＳ１のイントロン１に由来するか、前記第２のスプライスアクセプター部位が、ヒトＲＳ１のイントロン１に由来するか、または前記第１のアクセプター部位および前記第２のスプライスアクセプター部位の両方が、ヒトＲＳ１のイントロン１に由来する、請求項１８に記載の核酸構築物。
  20. 前記核酸構築物が、ホモロジーアームを含まない、請求項１～１９のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  21. 前記核酸構築物が、ホモロジーアームを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  22. 前記核酸構築物が、一本鎖である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  23. 前記核酸構築物が、二本鎖である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  24. 前記核酸構築物が、ＤＮＡを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  25. 前記第１のコード配列が、宿主細胞における発現のためにコドン最適化され、前記第２のコード配列が、前記宿主細胞における発現のためにコドン最適化されるか、または前記第１のコード配列および前記第２のコード配列の両方が、前記宿主細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  26. 前記核酸構築物が、以下の末端構造：ヘアピン、ループ、末端逆位配列（ＩＴＲ）、またはトロイドのうちの１つ以上を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  27. 前記核酸構築物が、ＩＴＲを含む、請求項２６に記載の核酸構築物。
  28. 前記第１のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片および／または前記第２のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片が、配列番号５に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項１～２７のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  29. 前記第１のコード配列および／または前記第２のコード配列が、配列番号８または９に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項１～２８のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  30. 前記第１のコード配列が、配列番号８に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、
    前記第２のコード配列が、配列番号９に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項１～２９のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  31. 前記核酸構築物が、配列番号４６または４７に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項１～３０のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  32. 前記第２のセグメントが、前記第１のセグメントの３’に位置し、
    前記第１のレチノスキシンタンパク質またはその断片および前記第２のレチノスキシンタンパク質またはその断片の両方が、ヒトレチノスキシンタンパク質またはその断片であり、
    前記第１のレチノスキシンタンパク質またはその断片が、前記第２のレチノスキシンタンパク質またはその断片に対して同一であり、
    前記第１のコード配列および前記第２のコード配列の両方が、ヒトＲＳ１のエキソン２～６またはその縮重バリアントを含む相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含み、
    前記第２のコード配列が、前記第１のコード配列のコドン使用とは異なるコドン使用を採用し、
    前記第１のセグメントが、前記第１のコード配列の３’に位置する第１のポリアデニル化シグナル配列を含み、前記第２のセグメントが、前記第２のコード配列の逆相補体の５’に位置する第２のポリアデニル化シグナル配列の逆相補体を含み、
    前記第１のセグメントが、前記第１のコード配列の５’に位置する第１のスプライスアクセプター部位を含み、前記第２のセグメントが、前記第２のコード配列の前記逆相補体の３’に位置する第２のスプライスアクセプター部位の逆相補体を含み、
    前記核酸構築物が、前記第１のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片または前記第２のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片の発現を駆動するプロモーターを含まず、
    前記核酸構築物が、ホモロジーアームを含まない、請求項１～３１のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  33. 請求項１～３２のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む、ベクター。
  34. 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項３３に記載のベクター。
  35. 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項３４に記載のベクター。
  36. 前記ＡＡＶが、一本鎖ゲノム（ｓｓＡＡＶ）を含む、請求項３５に記載のベクター。
  37. 前記ＡＡＶが、自己相補的ゲノム（ｓｃＡＡＶ）を含む、請求項３５に記載のベクター。
  38. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ７ｍ８からなる群から選択される、請求項３５～３７のいずれか一項に記載のベクター。
  39. 前記ベクターが、前記第１のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片または前記第２のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片の発現を駆動するプロモーターを含まない、請求項３３～３８のいずれか一項に記載のベクター。
  40. 前記ベクターが、ホモロジーアームを含まない、請求項３３～３９のいずれか一項に記載のベクター。
  41. 前記ベクターが、ホモロジーアームを含む、請求項３３～３９のいずれか一項に記載のベクター。
  42. 請求項１～３２のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む、脂質ナノ粒子。
  43. 請求項１～３２のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む、細胞。
  44. 前記細胞が、インビトロである、請求項４３に記載の細胞。
  45. 前記細胞が、インビボである、請求項４３に記載の細胞。
  46. 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項４３～４５のいずれか一項に記載の細胞。
  47. 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項４６に記載の細胞。
  48. 前記細胞が、網膜細胞である、請求項４３～４７のいずれか一項に記載の細胞。
  49. 前記細胞が、前記第１のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片、または前記第２のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片を発現する、請求項４３～４８のいずれか一項に記載の細胞。
  50. 前記核酸構築物が、前記標的ゲノム遺伝子座でゲノムに組み込まれる、請求項４３～４９のいずれか一項に記載の細胞。
  51. 前記標的ゲノム遺伝子座が、内因性ＲＳ１遺伝子座である、請求項５０に記載の細胞。
  52. 前記核酸構築物が、前記内因性ＲＳ１遺伝子座のイントロン１にゲノムに組み込まれる、請求項５０に記載の細胞。
  53. 内因性ＲＳ１エキソン１が、前記核酸構築物の第１のコード配列または第２のコード配列にスプライスする、請求項５２に記載の細胞。
  54. ゲノムに組み込まれた核酸構築物を含む修飾ＲＳ１遺伝子座が、配列番号２または４に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする、請求項５３に記載の細胞。
  55. 前記内因性ＲＳ１遺伝子座への前記核酸構築物の組み込みが、組み込み部位の下流の前記内因性ＲＳ１遺伝子の転写を妨げる、請求項５１～５４のいずれか一項に記載の細胞。
  56. 前記内因性ＲＳ１遺伝子座への前記核酸構築物の前記組み込みが、前記内因性レチノスキシンタンパク質の発現を低減または排除し、それを、前記核酸構築物によってコードされる前記レチノスキシンタンパク質またはその断片の発現で置き換える、請求項５５に記載の細胞。
  57. 前記内因性ＲＳ１遺伝子座が、Ｘ連鎖性若年網膜分離症を引き起こす変異を含む変異ＲＳ１遺伝子を含み、ゲノムに組み込まれた核酸構築物の前記発現が、前記変異ＲＳ１遺伝子の発現を低減または排除する、請求項５５または５６に記載の細胞。
  58. 標的ゲノム遺伝子座へのホモロジー非依存性標的化組み込みのための核酸構築物であって、前記核酸構築物が、ヌクレアーゼ剤のヌクレアーゼ標的配列と各側で隣接しているレチノスキシンタンパク質またはその断片のコード配列を含む、核酸構築物。
  59. 前記核酸構築物中の前記ヌクレアーゼ標的配列が、前記標的ゲノム遺伝子座への組み込みのためのヌクレアーゼ標的配列と同一であり、前記標的ゲノム遺伝子座における前記ヌクレアーゼ標的配列が、前記核酸構築物が正しい方向で挿入される場合、破壊されるが、前記核酸構築物が反対方向で前記標的ゲノム遺伝子座に挿入され場合、再形成される、請求項５８に記載の核酸構築物。
  60. 標的ゲノム遺伝子座との相同組換えのための核酸構築物であって、前記核酸構築物が、各側でホモロジーアームと隣接しているレチノスキシンタンパク質またはその断片のコード配列を含み、任意選択で、前記コード配列およびホモロジーアームが、ヌクレアーゼ剤のヌクレアーゼ標的配列と各側でさらに隣接しており、任意選択で、各ホモロジーアームが、約２５ヌクレオチド～約２．５ｋｂの長さである、核酸構築物。
  61. 前記レチノスキシンタンパク質またはその断片が、ヒトレチノスキシンタンパク質またはその断片である、請求項５８～６０のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  62. 前記レチノスキシンタンパク質またはその断片の前記コード配列が、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項５８～６１のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  63. 前記レチノスキシンタンパク質またはその断片の前記コード配列が、ヒトＲＳ１のエキソン２～６またはその縮重バリアントを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項５８～６２のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  64. 前記核酸構築物が、前記コード配列の５’に位置するヒトＲＳ１の第１のイントロンの断片または部分を含む、請求項５８～６３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  65. 前記核酸構築物が、前記レチノスキシンタンパク質またはその断片の発現を駆動するプロモーターを含まない、請求項５８～６４のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  66. 前記核酸構築物が、前記コード配列の３’に位置するポリアデニル化シグナル配列を含む、請求項５８～６５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  67. 前記核酸構築物が、前記コード配列の５’に位置するスプライスアクセプター部位を含む、請求項５８～６６のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  68. 前記スプライスアクセプター部位が、ＲＳ１遺伝子に由来する、請求項６７に記載の核酸構築物。
  69. 前記スプライスアクセプター部位が、ヒトＲＳ１のイントロン１に由来する、請求項６８に記載の核酸構築物。
  70. 前記核酸構築物が、一本鎖である、請求項５８～６９のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  71. 前記核酸構築物が、二本鎖である、請求項５８～６９のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  72. 前記核酸構築物が、ＤＮＡを含む、請求項５８～７１のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  73. 前記コード配列が、宿主細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項５８～７２のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  74. 前記構築物が、以下の末端構造：ヘアピン、ループ、末端逆位配列（ＩＴＲ）、またはトロイドのうちの１つ以上を含む、請求項５８～７３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  75. 前記コード配列およびヌクレアーゼ標的配列を含む前記核酸構築物の領域が、ＩＴＲと隣接している、請求項７４に記載の核酸構築物。
  76. 前記ヌクレアーゼ剤が、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡであり、前記ヌクレアーゼ標的配列が、ガイドＲＮＡ標的配列である、請求項５８～７５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  77. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、逆ガイドＲＮＡ標的配列である、請求項７６に記載の核酸構築物。
  78. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９である、請求項７６または７７に記載の核酸構築物。
  79. 前記レチノスキシンタンパク質またはその断片が、配列番号５に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項５８～７８のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  80. 前記レチノスキシンタンパク質またはその断片の前記コード配列が、配列番号８または９に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項５８～７９のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  81. 前記核酸構築物が、配列番号４５に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項５８～８０のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  82. 前記核酸構築物が、前記標的ゲノム遺伝子座へのホモロジー非依存性標的化組み込みのための前記核酸構築物であり、
    前記レチノスキシンタンパク質またはその断片が、ヒトレチノスキシンタンパク質またはその断片であり、
    前記レチノスキシンタンパク質またはその断片の前記コード配列が、ヒトＲＳ１のエキソン２～６またはその縮重バリアントを含む相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含み、
    前記核酸構築物が、前記レチノスキシンタンパク質またはその断片の発現を駆動するプロモーターを含まず、
    前記核酸構築物が、前記コード配列の３’に位置するポリアデニル化シグナル配列を含み、
    前記核酸構築物が、前記コード配列の５’に位置するスプライスアクセプター部位を含み、
    前記核酸構築物中の前記ヌクレアーゼ標的配列が、前記標的ゲノム遺伝子座への組み込みのためのヌクレアーゼ標的配列と同一であり、前記標的ゲノム遺伝子座における前記ヌクレアーゼ標的配列が、前記核酸構築物が正しい方向で挿入される場合、破壊されるが、前記核酸構築物が反対方向で前記標的ゲノム遺伝子座に挿入され場合、再形成される、請求項５８、５９、および６１～８１のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  83. 前記核酸構築物が、前記標的ゲノム遺伝子座との相同組換えのための前記核酸構築物であり、
    前記レチノスキシンタンパク質またはその断片が、ヒトレチノスキシンタンパク質またはその断片であり、
    前記レチノスキシンタンパク質またはその断片の前記コード配列が、ヒトＲＳ１のエキソン２～６またはその縮重バリアントを含む相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含み、
    前記核酸構築物が、前記レチノスキシンタンパク質またはその断片の発現を駆動するプロモーターを含まず、
    前記核酸構築物が、前記コード配列の３’に位置するポリアデニル化シグナル配列を含み、
    前記核酸構築物が、前記コード配列の５’に位置するスプライスアクセプター部位を含み、
    各ホモロジーアームが、約２５ヌクレオチド～約２．５ｋｂの長さである、請求項６０～８１のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  84. 請求項５８～８３のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む、ベクター。
  85. 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項８４に記載のベクター。
  86. 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項８５に記載のベクター。
  87. 前記ＡＡＶが、一本鎖ゲノム（ｓｓＡＡＶ）を含む、請求項８６に記載のベクター。
  88. 前記ＡＡＶが、自己相補的ゲノム（ｓｃＡＡＶ）を含む、請求項８６に記載のベクター。
  89. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ７ｍ８からなる群から選択される、請求項８６～８８のいずれか一項に記載のベクター。
  90. 前記ベクターが、前記レチノスキシンタンパク質またはその断片の発現を駆動するプロモーターを含まない、請求項８４～８９のいずれか一項に記載のベクター。
  91. 前記ベクターが、ホモロジーアームを含まない、請求項８４～９０のいずれか一項に記載のベクター。
  92. 請求項５８～８３のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む、脂質ナノ粒子。
  93. 請求項５８～８３のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む、細胞。
  94. 前記細胞が、インビトロである、請求項９３に記載の細胞。
  95. 前記細胞が、インビボである、請求項９３に記載の細胞。
  96. 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項９３～９５のいずれか一項に記載の細胞。
  97. 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項９６に記載の細胞。
  98. 前記細胞が網膜細胞である、請求項９３～９７のいずれか一項に記載の細胞。
  99. 前記細胞が、前記レチノスキシンタンパク質またはその断片を発現する、請求項９３～９８のいずれか一項に記載の細胞。
  100. 前記核酸構築物が、前記標的ゲノム遺伝子座でゲノムに組み込まれる、請求項９３～９９のいずれか一項に記載の細胞。
  101. 前記標的ゲノム遺伝子座が、内因性ＲＳ１遺伝子座である、請求項１００に記載の細胞。
  102. 前記核酸構築物が、前記内因性ＲＳ１遺伝子座のイントロン１にゲノムに組み込まれる、請求項１００に記載の細胞。
  103. 内因性ＲＳ１エキソン１が、前記核酸構築物中のレチノスキシンタンパク質またはその断片のコード配列にスプライスする、請求項１０２に記載の細胞。
  104. ゲノムに組み込まれた核酸構築物を含む修飾ＲＳ１遺伝子座が、配列番号２または４に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする、請求項１０３に記載の細胞。
  105. 前記内因性ＲＳ１遺伝子座への前記核酸構築物の組み込みが、組み込み部位の下流の前記内因性ＲＳ１遺伝子の転写を妨げる、請求項１０１～１０４のいずれか一項に記載の細胞。
  106. 前記内因性ＲＳ１遺伝子座への前記核酸構築物の前記組み込みが、前記内因性レチノスキシンタンパク質の発現を低減または排除し、それを、前記核酸構築物によってコードされる前記レチノスキシンタンパク質またはその断片の発現で置き換える、請求項１０５に記載の細胞。
  107. 前記内因性ＲＳ１遺伝子座が、Ｘ連鎖性若年網膜分離症を引き起こす変異を含む変異ＲＳ１遺伝子を含み、ゲノムに組み込まれた核酸構築物の前記発現が、前記変異ＲＳ１遺伝子の発現を低減または排除する、請求項１０５または１０６に記載の細胞。
  108. 細胞内でレチノスキシンを発現するのに使用するための、またはレチノスキシンタンパク質もしくはその断片のコード配列を細胞内の標的ゲノム遺伝子座に組み込むのに使用するための組成物であって、
    （ａ）前記標的ゲノム遺伝子座への組み込みのための前記レチノスキシンタンパク質またはその断片の前記コード配列を含む核酸構築物と、
    （ｂ）ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸と、を含み、前記ヌクレアーゼ剤が、前記標的ゲノム遺伝子座のヌクレアーゼ標的配列を標的とする、組成物。
  109. 細胞内でレチノスキシンを発現するのに使用するための、またはレチノスキシンタンパク質もしくはその断片のコード配列を細胞内の標的ゲノム遺伝子座に組み込むのに使用するための組成物であって、
    （ａ）請求項５８～８３のいずれか一項に記載の核酸構築物と、
    （ｂ）ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸と、を含み、前記ヌクレアーゼ剤が、前記標的ゲノム遺伝子座のヌクレアーゼ標的配列を標的とする、組成物。
  110. 前記標的ゲノム遺伝子座の前記ヌクレアーゼ標的配列が、前記核酸構築物の前記ヌクレアーゼ標的配列と同一である、請求項１０９に記載の組成物。
  111. 前記標的ゲノム遺伝子座における前記ヌクレアーゼ標的配列が、前記核酸構築物が正しい方向で挿入される場合、破壊されるが、前記核酸構築物が反対方向で前記標的ゲノム遺伝子座に挿入され場合、再形成される、請求項１１０に記載の組成物。
  112. 細胞内でレチノスキシンを発現するのに使用するための、またはレチノスキシンタンパク質もしくはその断片のコード配列を細胞内の標的ゲノム遺伝子座に組み込むのに使用するための組成物であって、
    （ａ）請求項１～３２のいずれか一項に記載の核酸構築物と、
    （ｂ）ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸と、を含み、前記ヌクレアーゼ剤が、前記標的ゲノム遺伝子座のヌクレアーゼ標的配列を標的とする、組成物。
  113. 前記標的ゲノム遺伝子座が、ＲＳ１遺伝子にある、請求項１０８～１１２のいずれか一項に記載の組成物。
  114. 前記標的ゲノム遺伝子座の前記ヌクレアーゼ標的配列が、前記ＲＳ１遺伝子の第１のイントロンにある、請求項１１３に記載の組成物。
  115. 前記内因性ＲＳ１遺伝子座への前記核酸構築物の組み込みが、組み込み部位の下流の前記内因性ＲＳ１遺伝子の転写を妨げる、請求項１１３または１１４に記載の組成物。
  116. 細胞内の前記内因性ＲＳ１遺伝子座への前記核酸構築物の前記組み込みが、前記内因性レチノスキシンタンパク質の発現を低減または排除し、それを、前記核酸構築物によってコードされる前記レチノスキシンタンパク質またはその断片の発現で置き換える、請求項１１５に記載の組成物。
  117. 前記核酸構築物が、ウイルスベクターにある、請求項１０８～１１６のいずれか一項に記載の組成物。
  118. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターである、請求項１１７に記載の組成物。
  119. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ７ｍ８からなる群から選択される、請求項１１８に記載のベクター。
  120. 前記ヌクレアーゼ剤が、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡであり、前記ヌクレアーゼ標的配列が、ガイドＲＮＡ標的配列である、請求項１０８～１１９のいずれか一項に記載の組成物。
  121. ガイドＲＮＡまたは前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む組成物であって、前記ガイドＲＮＡが、ＲＳ１遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするＤＮＡ標的化セグメントを含み、前記ガイドＲＮＡが、Ｃａｓタンパク質に結合し、前記ＲＳ１遺伝子の前記ガイドＲＮＡ標的配列への前記Ｃａｓタンパク質を標的とする、組成物。
  122. 前記組成物が、前記Ｃａｓタンパク質または前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項１２１に記載の組成物。
  123. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１２０または１２２に記載の組成物。
  124. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に由来する、請求項１２３に記載の組成物。
  125. 前記組成物が、タンパク質の形態の前記Ｃａｓタンパク質を含む、請求項１２０および１２２～１２４のいずれか一項に記載の組成物。
  126. 前記組成物が、前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸を含み、前記核酸が、前記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡを含み、任意選択で、前記組成物が、前記ガイドＲＮＡをコードする前記ＤＮＡを含む、請求項１２０および１２２～１２４のいずれか一項に記載の組成物。
  127. 前記組成物が、前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸を含み、前記核酸が、前記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡを含み、前記組成物が、前記ガイドＲＮＡをコードする前記ＤＮＡを含み、前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＤＮＡおよび前記ガイドＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、１つ以上のウイルスベクターにある、請求項１２６に記載の組成物。
  128. 前記１つ以上のウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターである、請求項１２７に記載の組成物。
  129. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ７ｍ８からなる群から選択される、請求項１２８に記載の組成物。
  130. 前記組成物が、前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸を含み、前記核酸が、前記Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡを含み、任意選択で、前記組成物が、ＲＮＡの形態の前記ガイドＲＮＡを含む、請求項１２０および１２２～１２４のいずれか一項に記載の組成物。
  131. 前記組成物が、前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸を含み、前記核酸が、前記Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡを含み、前記組成物が、ＲＮＡの形態の前記ガイドＲＮＡを含み、前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ガイドＲＮＡおよび前記メッセンジャーＲＮＡが、脂質ナノ粒子内にある、請求項１２０および１２２～１２４のいずれか一項に記載の組成物。
  132. 前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記メッセンジャーＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含む、請求項１３１に記載の組成物。
  133. 前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記メッセンジャーＲＮＡが、１つ以上またはすべてのウリジン位置に修飾ウリジンを含むように修飾される、請求項１３２に記載の組成物。
  134. 前記修飾ウリジンが、シュードウリジンである、請求項１３３に記載の組成物。
  135. 前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記メッセンジャーＲＮＡをシュードウリジンで完全に置換する、請求項１３３または１３４に記載の組成物。
  136. 前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記メッセンジャーＲＮＡが、５’キャップを含む、請求項１３２～１３５のいずれか一項に記載の組成物。
  137. 前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記メッセンジャーＲＮＡが、ポリ（Ａ）テールを含む、請求項１３２～１３６のいずれか一項に記載の組成物。
  138. 前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記メッセンジャーＲＮＡが、配列番号６２４３または６２４５に示される配列を含む、請求項１３０～１３７のいずれか一項に記載の組成物。
  139. 前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸が、哺乳動物細胞またはヒト細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項１２０および１２２～１３８のいずれか一項に記載の組成物。
  140. 前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号２７、６２４２、または６２４６に示される前記配列を含む、請求項１２０および１２２～１３９のいずれか一項に記載の組成物。
  141. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＲＳ１遺伝子のイントロンにある、請求項１２０～１４０のいずれか一項に記載の組成物。
  142. 前記イントロンが、前記ＲＳ１遺伝子の第１のイントロンである、請求項１４１に記載の組成物。
  143. 前記ＲＳ１遺伝子が、ヒトＲＳ１遺伝子である、請求項１２０～１４２のいずれか一項に記載の組成物。
  144. 前記ＤＮＡ標的化セグメントが、
    （ａ）配列番号３１４８～６２４１のうちのいずれか１つに示される前記配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、もしくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド、
    （ｂ）配列番号３１４８～４９８９のうちのいずれか１つに示される前記配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、もしくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド、
    （ｃ）配列番号３１４８～３１５１、３１５４～３１８６、３１８８～３２４７、および３２４９～４３５１のうちのいずれか１つに示される前記配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、もしくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド、
    （ｄ）配列番号３１５０、３１５１、３１５９、３６７５、４２９７、および４３０４のうちのいずれか１つに示される前記配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、もしくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド、または
    （ｅ）配列番号４９９０～６２４１のうちのいずれか１つに示される前記配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、もしくは少なくとも２０の連続するヌクレオチド、を含む、請求項１２０～１４３のいずれか一項に記載の組成物。
  145. 前記ＤＮＡ標的化セグメントが、
    （ａ）配列番号３１４８～６２４１のうちのいずれか１つに示される前記配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるか、
    （ｂ）配列番号３１４８～４９８９のうちのいずれか１つに示される前記配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるか、
    （ｃ）配列番号３１４８～３１５１、３１５４～３１８６、３１８８～３２４７、および３２４９～４３５１のうちのいずれか１つに示される前記配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるか、
    （ｄ）配列番号３１５０、３１５１、３１５９、３６７５、４２９７、および４３０４のうちのいずれか１つに示される前記配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるか、または
    （ｅ）配列番号４９９０～６２４１のうちのいずれか１つに示される前記配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一である、請求項１２０～１４４のいずれか一項に記載の組成物。
  146. 前記ＤＮＡ標的化セグメントが、
    （ａ）配列番号３１４８～６２４１のうちのいずれか１つ、
    （ｂ）配列番号３１４８～４９８９のうちのいずれか１つ、
    （ｃ）配列番号３１４８～３１５１、３１５４～３１８６、３１８８～３２４７、および３２４９～４３５１のうちのいずれか１つ、
    （ｄ）配列番号３１５０、３１５１、３１５９、３６７５、４２９７、および４３０４のうちのいずれか１つ、または
    （ｅ）配列番号４９９０～６２４１のうちのいずれか１つ、に示される前記配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項１２０～１４５のいずれか一項に記載の組成物。
  147. 前記ＤＮＡ標的化セグメントが、配列番号３１５０、３１５１、３１５９、３６７５、４２９７、および４３０４のうちのいずれか１つに示される前記配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含む、請求項１２０～１４６のいずれか一項に記載の組成物。
  148. 前記ＤＮＡ標的化セグメントが、配列番号３１５０、３１５１、３１５９、３６７５、４２９７、および４３０４のうちのいずれか１つに示される前記配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、請求項１２０～１４７のいずれか一項に記載の組成物。
  149. 前記ＤＮＡ標的化セグメントが、配列番号３１５０、３１５１、３１５９、３６７５、４２９７、および４３０４のうちのいずれか１つに示される前記配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項１２０～１４８のいずれか一項に記載の組成物。
  150. 前記組成物が、ＲＮＡの形態の前記ガイドＲＮＡを含む、請求項１２０～１４９のいずれか一項に記載の組成物。
  151. 前記組成物が、前記ガイドＲＮＡをコードする前記ＤＮＡを含む、請求項１２０～１４９のいずれか一項に記載の組成物。
  152. 前記ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含む、請求項１２０～１５０のいずれか一項に記載の組成物。
  153. 前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項１５２に記載の組成物。
  154. 前記少なくとも１つの修飾が、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む、請求項１５２または１５３に記載の組成物。
  155. 前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイドＲＮＡの前記５’末端の最初の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾を含む、請求項１５２～１５４のいずれか一項に記載の組成物。
  156. 前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイドＲＮＡの前記３’末端の最後の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾を含む、請求項１５２～１５５のいずれか一項に記載の組成物。
  157. 前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイドＲＮＡの前記５’末端の最初の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む、請求項１５２～１５６のいずれか一項に記載の組成物。
  158. 前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイドＲＮＡの前記３’末端の最後の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む、請求項１５２～１５７のいずれか一項に記載の組成物。
  159. 前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイドＲＮＡの前記５’末端の最初の３つのヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項１５２～１５８のいずれか一項に記載の組成物。
  160. 前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイドＲＮＡの前記３’末端の最後の３つのヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項１５２～１５９のいずれか一項に記載の組成物。
  161. 前記少なくとも１つの修飾が、（ｉ）前記ガイドＲＮＡの前記５’末端の最初の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合と、（ｉｉ）前記ガイドＲＮＡの前記３’末端の最後の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合と、（ｉｉｉ）前記ガイドＲＮＡの前記５’末端の最初の３つのヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドと、（ｉｖ）前記ガイドＲＮＡの前記３’末端の最後の３つのヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドと、を含む、請求項１５２～１６０のいずれか一項に記載の組成物。
  162. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号４４の前記修飾ヌクレオチドを含む、請求項１５２～１６１のいずれか一項に記載の組成物。
  163. 前記ガイドＲＮＡが、単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１２０～１６２のいずれか一項に記載の組成物。
  164. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号３３～３９および５３のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項１６３に記載の組成物。
  165. 前記ガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む２つの別個のＲＮＡ分子を含む二重ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）である、請求項１２０～１６１のいずれか一項に記載の組成物。
  166. 前記ｃｒＲＮＡが、配列番号２９および５２のうちのいずれか１つに示される前記配列を含む、請求項１６５に記載の組成物。
  167. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、配列番号３０～３２のうちのいずれか１つに示される前記配列を含む、請求項１６５または１６６に記載の組成物。
  168. 前記組成物が、脂質ナノ粒子に関連し、任意選択で、前記組成物が、前記ガイドＲＮＡを含む、請求項１２０～１６７のいずれか一項に記載の組成物。
  169. 前記ガイドＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、ウイルスベクターにある、請求項１２０～１６７のいずれか一項に記載の組成物。
  170. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターである、請求項１６９に記載の組成物。
  171. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ７ｍ８からなる群から選択される、請求項１７０に記載のベクター。
  172. 前記組成物が、薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物である、請求項１２０～１７１のいずれか一項に記載の組成物。
  173. 第２のガイドＲＮＡまたは前記第２のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡをさらに含み、前記第２のガイドＲＮＡが、前記ＲＳ１遺伝子の第２のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするＤＮＡ標的化セグメントを含み、前記第２のガイドＲＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質に結合し、前記ＲＳ１遺伝子の前記第２のガイドＲＮＡ標的配列への前記Ｃａｓタンパク質を標的とする、請求項１２０～１７２のいずれか一項に記載の組成物。
  174. 請求項１０８～１７３のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞。
  175. 請求項１０８～１２０および１２３～１７３のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞。
  176. 前記細胞が、インビトロである、請求項１７５に記載の細胞。
  177. 前記細胞が、インビボである、請求項１７５に記載の細胞。
  178. 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１７５～１７７のいずれか一項に記載の細胞。
  179. 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項１７８に記載の細胞。
  180. 前記細胞が網膜細胞である、請求項１７５～１７９のいずれか一項に記載の細胞。
  181. 前記細胞が、前記第１のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片、または前記第２のレチノスキシンタンパク質もしくはその断片を発現する、請求項１７５～１８０のいずれか一項に記載の細胞。
  182. 前記核酸構築物が、前記標的ゲノム遺伝子座でゲノムに組み込まれる、請求項１７５～１８１のいずれか一項に記載の細胞。
  183. 前記標的ゲノム遺伝子座が、内因性ＲＳ１遺伝子座である、請求項１８２に記載の細胞。
  184. 前記核酸構築物が、前記内因性ＲＳ１遺伝子座のイントロン１にゲノムに組み込まれる、請求項１８２に記載の細胞。
  185. 内因性ＲＳ１エキソン１が、前記核酸構築物の第１のコード配列または第２のコード配列にスプライスする、請求項１８４に記載の細胞。
  186. ゲノムに組み込まれた核酸構築物を含む修飾ＲＳ１遺伝子座が、配列番号２または４に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする、請求項１８５に記載の細胞。
  187. 前記内因性ＲＳ１遺伝子座への前記核酸構築物の組み込みが、組み込み部位の下流の前記内因性ＲＳ１遺伝子の転写を妨げる、請求項１８３～１８６のいずれか一項に記載の細胞。
  188. 前記内因性ＲＳ１遺伝子座への前記核酸構築物の前記組み込みが、前記内因性レチノスキシンタンパク質の発現を低減または排除し、それを、前記核酸構築物によってコードされる前記レチノスキシンタンパク質またはその断片の発現で置き換える、請求項１８７に記載の細胞。
  189. 前記内因性ＲＳ１遺伝子座が、Ｘ連鎖性若年網膜分離症を引き起こす変異を含む変異ＲＳ１遺伝子を含み、ゲノムに組み込まれた核酸構築物の前記発現が、前記変異ＲＳ１遺伝子の発現を低減または排除する、請求項１８７または１８８に記載の細胞。
  190. レチノスキシンタンパク質またはその断片のコード配列を標的ゲノム遺伝子座に組み込み、細胞内で前記レチノスキシンタンパク質またはその断片を発現させる方法であって、請求項１０８～１２０および１２３～１７３のいずれか一項に記載の組成物を前記細胞に投与することを含み、前記コード配列が、前記標的ゲノム遺伝子座に組み込まれ、前記レチノスキシンタンパク質またはその断片が、前記細胞内で発現される、方法。
  191. 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１９０に記載の方法。
  192. 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項１９１に記載の方法。
  193. 前記細胞が、網膜細胞である、請求項１９０～１９２のいずれか一項に記載の方法。
  194. 前記細胞が、インビトロである、請求項１９０～１９３のいずれか一項に記載の方法。
  195. 前記細胞が、インビボである、請求項１９０～１９３のいずれか一項に記載の方法。
  196. 前記細胞が、網膜細胞であり、投与が、網膜下注射または硝子体内注射を含む、請求項１９５に記載の方法。
  197. Ｘ連鎖性若年網膜分離症を有する対象を治療する方法であって、請求項１０８～１２０および１２３～１７３のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与することを含み、前記核酸構築物が、前記対象の１つ以上の網膜細胞の前記標的ゲノム遺伝子座に組み込まれ、そこから発現され、治療上有効なレベルのレチノスキシン発現が前記対象において達成される、方法。
  198. 前記対象が、ヒトである、請求項１９７に記載の方法。
  199. 前記対象が、Ｘ連鎖性若年網膜分離症に関連するかまたはそれを引き起こす少なくとも１つの変異を含む内因性ＲＳ１遺伝子を有する、請求項１９７または１９８に記載の方法。
  200. 前記変異が、Ｒ１４１Ｃ変異である、請求項１９９に記載の方法。
  201. 前記投与が、網膜下注射または硝子体内注射を含む、請求項１９７～２００のいずれか一項に記載の方法。
  202. 前記核酸構築物の組み込みが網膜構造の回復をもたらす、請求項１９７～２０１のいずれか一項に記載の方法。
  203. 前記核酸構築物および前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記核酸が、異なる送達ビヒクルで投与される、請求項１９０～２０２のいずれか一項に記載の方法。
  204. 前記核酸構築物および前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記核酸が、同じ送達ビヒクルで投与される、請求項１９０～２０２のいずれか一項に記載の方法。
  205. 前記核酸構築物および前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記核酸が、同時に投与される、請求項１９０～２０４のいずれか一項に記載の方法。
  206. 前記核酸構築物および前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記核酸が、任意の順序で連続して投与される、請求項１９０～２０３のいずれか一項に記載の方法。
  207. 前記核酸構築物が、前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記核酸の前に投与される、請求項２０６に記載の方法。
  208. 前記核酸構築物が、前記ヌクレアーゼ剤または前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記核酸の後に投与される、請求項２０６に記載の方法。
  209. 前記連続投与間の時間が、約２時間～約４８時間である、請求項２０７または２０８に記載の方法。
  210. 前記標的ゲノム遺伝子座が、内因性ＲＳ１遺伝子にある、請求項１９０～２０９のいずれか一項に記載の方法。
  211. 前記標的ゲノム遺伝子座の前記ヌクレアーゼ標的配列が、前記内因性ＲＳ１遺伝子の第１のイントロンにある、請求項２１０に記載の方法。
  212. 前記核酸構築物が、前記内因性ＲＳ１遺伝子座のイントロン１にゲノムに組み込まれ、内因性ＲＳ１エキソン１が、前記核酸構築物中の前記レチノスキシンタンパク質またはその断片の前記コード配列にスプライスする、請求項２１１に記載の方法。
  213. ゲノムに組み込まれた核酸構築物を含む修飾ＲＳ１遺伝子座が、配列番号２または４に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質をコードする、請求項２１２に記載の方法。
  214. 前記内因性ＲＳ１遺伝子座への前記核酸構築物の組み込みが、組み込み部位の下流の前記内因性ＲＳ１遺伝子の転写を妨げる、請求項２１０～２１３のいずれか一項に記載の方法。
  215. 前記内因性ＲＳ１遺伝子座への前記核酸構築物の前記組み込みが、前記内因性ＲＳ１遺伝子座からの前記内因性レチノスキシンタンパク質の発現を低減または排除し、それを、前記核酸構築物によってコードされる前記レチノスキシンタンパク質またはその断片の発現で置き換える、請求項２１４に記載の方法。
  216. 細胞内のＲＳ１遺伝子を修飾する方法であって、請求項１２２～１７３のいずれか一項に記載の組成物を前記細胞に投与することを含み、前記ガイドＲＮＡが、Ｃａｓタンパク質に結合し、前記ＲＳ１遺伝子の前記ガイドＲＮＡ標的配列への前記Ｃａｓタンパク質を標的し、前記Ｃａｓタンパク質が、前記ガイドＲＮＡ標的配列を切断する、方法。
  217. 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項２１６に記載の方法。
  218. 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項２１７に記載の方法。
  219. 前記細胞が、網膜細胞である、請求項２１６～２１８のいずれか一項に記載の方法。
  220. 前記細胞が、インビトロである、請求項２１６～２１９のいずれか一項に記載の方法。
  221. 前記細胞が、インビボである、請求項２１６～２１９のいずれか一項に記載の方法。
  222. 前記細胞が、網膜細胞であり、投与が、網膜下注射または硝子体内注射を含む、請求項２２１に記載の方法。
  223. 前記ガイドＲＮＡ標的配列が、前記ＲＳ１遺伝子の第１のイントロンにある、請求項２１６～２２２のいずれか一項に記載の方法。
JP2022524995A 2019-11-08 2020-11-07 Ｘ連鎖性若年網膜分離療法のためのｃｒｉｓｐｒおよびａａｖ戦略 Pending JP2022553573A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962932608P 2019-11-08 2019-11-08
US62/932,608 2019-11-08
PCT/US2020/059568 WO2021092513A1 (en) 2019-11-08 2020-11-07 Crispr and aav strategies for x-linked juvenile retinoschisis therapy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022553573A true JP2022553573A (ja) 2022-12-23
JPWO2021092513A5 JPWO2021092513A5 (ja) 2023-09-27

Family

ID=73654921

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022524995A Pending JP2022553573A (ja) 2019-11-08 2020-11-07 Ｘ連鎖性若年網膜分離療法のためのｃｒｉｓｐｒおよびａａｖ戦略

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20230001019A1 (ja)
EP (1) EP4054651A1 (ja)
JP (1) JP2022553573A (ja)
KR (1) KR20220097414A (ja)
CN (1) CN114746125A (ja)
AU (1) AU2020379046A1 (ja)
BR (1) BR112022008861A2 (ja)
CA (1) CA3156277A1 (ja)
IL (1) IL292605A (ja)
MX (1) MX2022005572A (ja)
WO (1) WO2021092513A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113025618B (zh) * 2019-12-24 2024-02-06 朗信启昇(苏州)生物制药有限公司 一种x连锁遗传性视网膜劈裂症的基因治疗方案与应用
JP2023512758A (ja) * 2020-02-07 2023-03-29 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド カリクレイン（ｋｌｋｂ１）遺伝子編集のための組成物および方法
CN116790559B (zh) * 2023-07-07 2023-11-28 山东舜丰生物科技有限公司 一种融合HNH结构域的V型Cas酶及其应用

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
US20030104526A1 (en) 1999-03-24 2003-06-05 Qiang Liu Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US20050144655A1 (en) 2000-10-31 2005-06-30 Economides Aris N. Methods of modifying eukaryotic cells
JP2004537260A (ja) 2000-12-07 2004-12-16 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド ジンクフィンガータンパク質による血管新生の調節
CA2435394C (en) 2001-01-22 2018-01-09 Sangamo Biosciences, Inc. Modified zinc finger binding proteins
WO2002057308A2 (en) 2001-01-22 2002-07-25 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger polypeptides and their use
US8106255B2 (en) 2002-01-23 2012-01-31 Dana Carroll Targeted chromosomal mutagenasis using zinc finger nucleases
AU2003218382B2 (en) 2002-03-21 2007-12-13 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
AU2003298574B2 (en) 2002-09-05 2008-04-24 California Institute Of Technology Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US7972854B2 (en) 2004-02-05 2011-07-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
AU2005287278B2 (en) 2004-09-16 2011-08-04 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions and methods for protein production
CA2651494C (en) 2006-05-25 2015-09-29 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered cleavage half-domains
EP2765195A1 (en) 2006-05-25 2014-08-13 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for gene inactivation
WO2008076290A2 (en) 2006-12-14 2008-06-26 Dow Agrosciences Llc Optimized non-canonical zinc finger proteins
WO2008133938A2 (en) 2007-04-26 2008-11-06 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration into the ppp1r12c locus
JP2011517838A (ja) 2008-04-11 2011-06-16 ユーティーシー パワー コーポレイション マニホルド・サンプを備えたバイポーラプレートおよび燃料電池
EP3156494B8 (en) 2008-12-04 2018-09-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Genome editing in rats using zinc-finger nucleases
US20110239315A1 (en) 2009-01-12 2011-09-29 Ulla Bonas Modular dna-binding domains and methods of use
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
JP5932632B2 (ja) 2009-03-20 2016-06-15 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 改変された亜鉛フィンガータンパク質を使用したｃｘｃｒ４の修飾
US8772008B2 (en) 2009-05-18 2014-07-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for increasing nuclease activity
US20120178647A1 (en) 2009-08-03 2012-07-12 The General Hospital Corporation Engineering of zinc finger arrays by context-dependent assembly
WO2011020014A1 (en) 2009-08-14 2011-02-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Promoter-regulated differentiation-dependent self-deleting cassette
WO2011059799A1 (en) 2009-10-29 2011-05-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multifunctional alleles
PL2510096T5 (pl) 2009-12-10 2018-06-29 Regents Of The University Of Minnesota Modyfikacja DNA zależna od efektora TAL
US8771985B2 (en) 2010-04-26 2014-07-08 Sangamo Biosciences, Inc. Genome editing of a Rosa locus using zinc-finger nucleases
CA2798988C (en) 2010-05-17 2020-03-10 Sangamo Biosciences, Inc. Tal-effector (tale) dna-binding polypeptides and uses thereof
CA2833870C (en) * 2011-04-22 2020-03-10 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
WO2013044008A2 (en) 2011-09-21 2013-03-28 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of transgene expression
AU2012328682B2 (en) 2011-10-27 2017-09-21 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modification of the HPRT locus
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
EA038924B1 (ru) 2012-05-25 2021-11-10 Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния Способы и композиции рнк-специфической модификации днк-мишени и рнк-специфической модуляции транскрипции
WO2014033644A2 (en) 2012-08-28 2014-03-06 Novartis Ag Methods of nuclease-based genetic engineering
CN105441440B (zh) 2012-10-23 2020-12-15 基因工具股份有限公司 包含特异于靶dna的向导rna和cas蛋白质编码核酸或cas蛋白质的用于切割靶dna的组合物及其用途
KR102531576B1 (ko) 2012-12-06 2023-05-11 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 Crispr-기초된 유전체 변형과 조절
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
ES2883590T3 (es) 2012-12-12 2021-12-09 Broad Inst Inc Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas
RU2766685C2 (ru) 2012-12-17 2022-03-15 Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж Рнк-направляемая инженерия генома человека
WO2014127196A1 (en) * 2013-02-15 2014-08-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Aav8 retinoschisin expression vector for treating x-linked retinoschisis
US10350306B2 (en) * 2013-02-15 2019-07-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Methods and compositions for treating genetically linked diseases of the eye
WO2014130706A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetic modification of rats
WO2014131833A1 (en) 2013-02-27 2014-09-04 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases
CN112301024A (zh) 2013-03-15 2021-02-02 通用医疗公司 使用RNA引导的FokI核酸酶(RFN)提高RNA引导的基因组编辑的特异性
CN115261411A (zh) 2013-04-04 2022-11-01 哈佛学院校长同事会 利用CRISPR/Cas系统的基因组编辑的治疗性用途
WO2015048577A2 (en) 2013-09-27 2015-04-02 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions
MX2016016833A (es) 2014-06-16 2017-10-04 Univ Johns Hopkins Composiciones y metodos para la expresion de arns guias crispr que usan el promotor h1.
US20150376587A1 (en) 2014-06-25 2015-12-31 Caribou Biosciences, Inc. RNA Modification to Engineer Cas9 Activity
CN106794141B (zh) 2014-07-16 2021-05-28 诺华股份有限公司 将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法
WO2016106236A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 The Broad Institute Inc. Rna-targeting system
ES2785329T3 (es) 2014-12-23 2020-10-06 Syngenta Participations Ag Métodos y composiciones para identificar y enriquecer células que comprenden modificaciones genómicas específicas para el sitio
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
US11279928B2 (en) 2015-06-29 2022-03-22 Massachusetts Institute Of Technology Compositions comprising nucleic acids and methods of using the same
US11845933B2 (en) 2016-02-03 2023-12-19 Massachusetts Institute Of Technology Structure-guided chemical modification of guide RNA and its applications
BR112018069795A2 (pt) 2016-03-30 2019-01-29 Intellia Therapeutics Inc formulações de nanopartículas lipídicas para componentes de crispr/cas
EP3551757A1 (en) 2016-12-08 2019-10-16 Intellia Therapeutics, Inc. Modified guide rnas
MX2020001178A (es) 2017-07-31 2020-09-25 Regeneron Pharma Celulas madre embrionarias de raton transgenico con cas y ratones y usos de los mismos.
JP2021500863A (ja) 2017-09-29 2021-01-14 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド ゲノム編集用のポリヌクレオチド、組成物および方法

Also Published As

Publication number Publication date
IL292605A (en) 2022-07-01
CA3156277A1 (en) 2021-05-14
AU2020379046A1 (en) 2022-04-21
EP4054651A1 (en) 2022-09-14
WO2021092513A1 (en) 2021-05-14
CN114746125A (zh) 2022-07-12
KR20220097414A (ko) 2022-07-07
US20230001019A1 (en) 2023-01-05
MX2022005572A (es) 2022-06-09
BR112022008861A2 (pt) 2022-08-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2019239880B2 (en) Transcription modulation in animals using CRISPR/Cas systems
US11866794B2 (en) Cas-ready mouse embryonic stem cells and mice and uses thereof
US20210261985A1 (en) Methods and compositions for assessing crispr/cas-mediated disruption or excision and crispr/cas-induced recombination with an exogenous donor nucleic acid in vivo
EP3585162B1 (en) Rodents comprising a humanized ttr locus and methods of use
AU2019403015B2 (en) Nuclease-mediated repeat expansion
US20230001019A1 (en) Crispr and aav strategies for x-linked juvenile retinoschisis therapy
US20190032156A1 (en) Methods and compositions for assessing crispr/cas-induced recombination with an exogenous donor nucleic acid in vivo
US20230102342A1 (en) Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use
US20230081547A1 (en) Non-human animals comprising a humanized klkb1 locus and methods of use
WO2023108047A1 (en) Mutant myocilin disease model and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230919

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230919