WO1994024300A1 - Ensemble de transposition pour le transfert de gene chez les eucaryotes - Google Patents

Ensemble de transposition pour le transfert de gene chez les eucaryotes Download PDF

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WO1994024300A1
WO1994024300A1 PCT/FR1994/000419 FR9400419W WO9424300A1 WO 1994024300 A1 WO1994024300 A1 WO 1994024300A1 FR 9400419 W FR9400419 W FR 9400419W WO 9424300 A1 WO9424300 A1 WO 9424300A1
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transposition
fragment
intron
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Eric Jacobs
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Transgene S.A.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses

Definitions

  • the subject of the present invention is a set of transposition allowing the transfer of genes of interest into the genome of a eukaryotic cell or organism. Such a set is particularly useful for the purpose of gene therapy.
  • the conventional elements are either integrative vectors, for example retroviral vectors, or non-integrative vectors, for example adenoviral vectors.
  • integrative vectors for example retroviral vectors
  • non-integrative vectors for example adenoviral vectors.
  • these vectors of the prior art do not only have advantages.
  • retroviral vectors integrate randomly in a non-specific way into the cell genome.
  • risk of insertional mutagenesis linked either to the inactivation of genes essential to the cell, or to the activation of oncogenes which can give rise to tumor proliferation should not be overlooked before considering their use in therapy human gene.
  • non-integrative vectors As regards the non-integrative vectors, they have drawbacks linked to instability due to their non-integration into the cell genome, which requires their regularly renewed administration. As part of gene therapy intended for humans, this risks posing long-term problems of immunization against the recombinant virus, patients regularly treated.
  • a third type of method allows the transfer of genes of interest by homologous recombination into a defined site of the cell genome.
  • the homologous recombination technique still faces many technical difficulties.
  • non-homologous recombination events may also occur, so that the risk of insertional mutagenesis remains.
  • rDNA ribosomal DNA
  • rDNA ribosomal DNA
  • a transcription unit is made up of the genes coding respectively for the 18S or 16S, 5-8S and 28S or 26S rRNAs, which enter into the constitution of the ribosome (hereinafter referred to as the 18S rRNA gene etc.).
  • 18S rRNA gene etc. Each gene is separated from the next by transcribed sequences, the exact role of which has not yet been defined.
  • the three rRNA genes included in a transcriptional unit are placed under the control of a single promoter located upstream in the non-transcribed region which separates one unit from the next.
  • the rDNA units are transcribed by RNA polymerase I into a long molecule of precursor rRNA (pre rRNA), which is then grown to produce the three main types of rRNA associated with ribosomal subunits.
  • the introns of classes I and II are defined by the existence of conserved sequences forming structural elements characteristic of each of the classes as defined by Cech and Bass (1 86, Annu. Rev. Biochem. 55_, 599-629).
  • Cech and Bass (1 86, Annu. Rev. Biochem. 55_, 599-629).
  • Several authors have observed that certain class I and II introns are mobile. They can be copied and transferred specifically into copies of genes which lack them (intron "). This transposition process, at least in most cases, turns out to be specific from the point of view of the region of insertion.
  • the sixty class I introns characterized so far, the majority are localized in the mitochondria and chloroplast genes.
  • introns have been demonstrated in the rRNA genes of three lower eukaryotic species, respectively the 26S rRNA genes of several strains of Tetrahymena (Kan and Gall, 1982, Nucl. Acids Res., 10, 2809-2821) and of the Carolina strain of Physarum polycephal m, (Muscarella and Vogt, 1989, Cell, 56, 443-454; this mobile intron being designated hereafter intron 3) and finally in the 16S rRNA gene of Pneumocystis carinii (Edman et al. , 1988, Nature, 334, 519-522). So far, it has not been possible to demonstrate the presence of introns interrupting the rRNA genes of higher eukaryotes.
  • the intron 3 of Physarum polycephalum is the best characterized. Its mobility has been demonstrated experimentally (Muscarella and Vogt, 1989, Cell, 56, 443-454). This intron partly codes for a protein of 160 amino acids (Muscarella et al., 1990,
  • the putative translation initiation codon is located upstream of the intron, at the 3 'end of the adjacent exon sequence 5' to the intron.
  • the protein, encoded by intron 3, is an endonuclease which recognizes a target sequence of at least 18 base pairs (bp) present in the insertion region and is capable of cleaving this sequence exactly at the insertion site intron 3 (Muscarella and Vogt, 1989, Cell, 56, 443-454).
  • the target sequence recognized by the endonuclease comprises the following sequence: 5'CTATGACTCTCTTAAGGTAGCCAAA3 '
  • intron 3 is initiated by the recognition of the particular target sequence by the endonuclease specifically encoded by intron 3, followed by cutting of the two strands of the DNA molecule at this level. particular sequence, thus freeing the insertion site. Then by an exchange of fibers involving the flanking sequences 5 ′ and 3 ′ of the insertion site, copy of the intronic sequence and recombination, intron 3 is inserted into the copy of the intron rRNA gene ", precisely and site -specific. Once intron 3 has been inserted into a copy of the intron gene ", the target sequence recognized by the endonuclease is interrupted by the intronic sequence as follows: 5'CTATGACTCTCT intron 3 TAAGGTAGCCAAA3 '
  • retroposons also seem to be present in the rDNA of certain eukaryotes. In general, retroposons form a very large and very heterogeneous group, in particular at the level of their nucleotide sequence.
  • LTR long terminal repeats
  • retroposons include one or more open reading frame (s) capable of coding for proteins having a homology with retroviral proteins, such as for example reverse transcriptase (Jakubczak et al., 1991, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 88, 3295-3299).
  • rRNA genes In a number of non-mammalian eukaryotes, notably insects, retroposons have been found with remarkable insertion specificity, localized at the level of the rRNA genes. The mobility of some of them has been observed. Several families (notably RI, R2 and R3) have been defined as a function of their specific region of insertion into the rRNA genes.
  • the retroposons of the classes RI and R2 are notably illustrated by the retroposons RIBm and R2Bm of Bombyx ori (Xiong and Eickbush, 1988, Cell, 55, 235-246; Xiong and Eickbush, 1988, Mol. Cell. Biol., 8, 1 14-123; Xiong et al., 1988, Nucl. Ac. Res., 16, 10561-10573) and the RIDm and R2Dm retroposons of Drosophila melanogaster (Jakubczak et al., 1990, J. Mol. Biol., 212, 37-52). They contain an open reading frame capable of coding for a large protein, the central part of which exhibits homology with the family of reverse transcriptases.
  • Xiong and Eickbush (1988, Cell, 55, 235-246) report that the protein encoded by the retroposon R2Bm from Bombyx mori also exhibits endonuclease activity. This nuclease recognizes and cleaves a target sequence contained in the R2Bm insertion region located in the 28S rRNA gene of the insect genome.
  • R3 A new class of ribosomal retroposons, designated R3, has recently been highlighted. A protein encoded by this element has not yet been characterized. However, the specific insertion region of the R3 element in the rDNA of Scaria coprophila has been described (Kerrebrock et al., J. Mol. Biol., 1989, 210, 1-13).
  • retroposons there are a large number of mobile genetic elements which have sometimes been referred to as retroposons by the authors describing them, but which have not yet been shown to code for a protein with homology. with the family of retroviral proteins, in particular reverse transcriptase. This type of element has also been found at the level of well-defined sequences of rRNA genes of the organisms containing them (see for example Back et al., 1984, EMBO J., 3, 2523-2529).
  • the subject of the present invention is a transposition assembly intended for the transfer of a DNA fragment of interest into the genome of a eukaryotic host cell, which comprises an integration cassette, essentially consisting of an element mobile genetics into which said DNA fragment of interest is inserted; said integration cassette being capable of integrating in a site-specific fashion into a specific insertion site located in the ribosomal nuclear DNA of said host cell.
  • a transposition set according to the invention has the advantage of allowing the integration of a DNA fragment of interest in a defined and nonessential region of the cell genome. Such a set is particularly useful for the purposes of gene therapy.
  • the integration cassette must contain a mobile genetic element which has the capacity to integrate by a site-specific mechanism, into nuclear rDNA, in particular at the level of the 28S, 18S rRNA gene. or 5-8S. More specifically, this mobile genetic element must integrate into an insertion site located in an insertion region whose sequence is conserved identically or not in the nuclear rDNA of the host cell.
  • insertion site defines the place between 2 nucleotides where a mobile genetic element is inserted.
  • insertion region is meant the nucleotide sequences 5 'and 3' of the insertion site which are required for site-specific transposition.
  • each mobile genetic element has a specific insertion region.
  • the region of insertion into the host cell is not required to contain the sequences of the region of natural insertion (in the organism of origin) identical.
  • the sequence of the insertion region of said mobile genetic element in the eukaryotic host cell will have a degree of homology with the sequence of the natural insertion region greater than 80%, advantageously greater than 90% and preferably greater than 95%.
  • the mobile genetic element is advantageously selected from mobile introns of class I or II, and retroposons such as retroposons of class RI R2 or R3.
  • a mobile genetic element can consist of a functional fragment or a variant of said element.
  • functional fragment is meant any fragment that has retained the ability to integrate with the complete element.
  • a variant may include one or more mutations with respect to the element's natural nucleotide sequence, in particular the substitution, addition or deletion of one or more nucleotide (s), provided that these mutations do not alter their function.
  • the mobile genetic element is selected from:
  • integrase a protein having an enzymatic activity allowing it to participate directly or indirectly in the transposition of the mobile genetic element specifically at its insertion site in the nuclear rDNA of a eukaryotic cell.
  • the integrase can be constituted in particular by: (1) a protein exhibiting endonuclease activity capable of recognizing a specific target sequence included in the insertion region of the mobile genetic element which codes for it and of cleaving said target sequence, or
  • the DNA fragment of interest can be introduced into the mobile genetic element by conventional techniques of genetic engineering. It can be integrated into or outside the open reading frame coding for a possible integrase.
  • the DNA fragment of interest is inserted into the open reading frame, in order to prevent the expression of the integrase. This introduces security to avoid the uncontrolled propagation of the integration cassette into the genome of the host cell.
  • the specific integrase of the mobile genetic element used in the transposition assembly according to the invention must be supplied to the host cell in a transient manner for a time long enough to allow the transposition of the cassette. Integration in its specific region of insertion.
  • the means of supplying a protein to a eukaryotic cell in trans are numerous and known to those skilled in the art.
  • the transposition assembly according to the invention can be introduced into a vector (as defined below), further comprising a cassette for expression of the specific integrase of the mobile genetic element present in the transposition set.
  • the eukaryotic host cell can be transfected in parallel with a helper vector comprising an integrase expression cassette or the integrase can be supplied to the host cell in purified form.
  • the DNA fragment of interest can be any fragment capable of being transcribed into RNA to produce an antisense RNA, for example an RNA sequence complementary to a pathogenic gene capable of forming a duplex with a pathogenic transcript in order to inhibit translation into pathogenic protein.
  • a pathogenic gene is: (1) a gene which is not present in eukaryotic cells, for example a gene present in the genome of a pathogenic organism (bacteria, virus or parasite), or (2) a homologous gene or a mutated homologous gene, for example an oncogene, which is present but normally not expressed in normal eukaryotic cells and whose abnormally induced expression can cause a disease such as cancer.
  • the DNA fragment of interest can code for a protein of interest and, preferably, a protein whose absence of expression or expression in abnormal amount or in mutant form is associated with a disease. genetic.
  • the DNA fragment of interest can code for a mature protein or a precursor thereof. In the first case, it comprises the coding sequence for a mature protein allowing expression of the protein intracellularly. In the latter case, the DNA fragment of interest can also include a signal sequence allowing the secretion of said protein from the host cell.
  • the DNA fragment of interest can code for a chimeric protein originating from the fusion of sequences of various origins.
  • proteins that can be encoded by the DNA fragment of interest include:
  • cytokines such as alpha interferon, gamma interferon and different types of growth factors
  • membrane receptors such as receptors involved in the transmission of surface signals inside cells and receptors recognized by organisms pathogens, such as the CD4 receptor present on the surface of T lymphocytes and recognized by the envelope glycoprotein of the HIV virus (Human Immunodeficiency Virus)
  • - enzymes such as ribonucleases and thymidine kinase (TK) of the simplex virus herpes type I (HSV-1).
  • TK simplex virus herpes type I
  • the latter has a higher affinity compared to the mammalian cell enzyme TK for certain nucleoside analogues, such as acyclovir or gancyclovir.
  • the TK-HSV-1 enzyme converts analogs to precursors of nucleotides. These toxic precursors will therefore be incorporated into the DNA of cells in the replicating state.
  • This incorporation makes it possible to specifically kill dividing cells, such as cancer cells, - inhibitors of enzymatic activity, such as alpha antitrypsin, antithrombin III, protein C and inhibitors of proteases specific for a pathogenic organism , coagulation factors, like factor VIII, factor IX and thrombin, - proteins participating in ion channels, like protein CFTR
  • proteins capable of inhibiting the activity of a protein produced by a pathogenic gene such as the tumor suppressor antigen p53, variants of pathogenic proteins mutated so as to alter their biological function, as trans-dominant mutants of the TAT regulatory protein of the HIV virus capable of competing with the native viral protein for binding to the target sequence, preventing the activation of expression of viral genes and, antigenic epitopes allowing increase the immunity of the host cell.
  • a pathogenic gene such as the tumor suppressor antigen p53
  • variants of pathogenic proteins mutated so as to alter their biological function as trans-dominant mutants of the TAT regulatory protein of the HIV virus capable of competing with the native viral protein for binding to the target sequence, preventing the activation of expression of viral genes and, antigenic epitopes allowing increase the immunity of the host cell.
  • the DNA fragment of interest can be mutated in order to allow the expression of a protein of interest whose biological properties are modified, for example a variant of the alpha antitrypsin whose methionine residue at position 358 of the active site has been replaced by a leucine.
  • a variant is functional under oxidation conditions such as ignition conditions.
  • the DNA fragment of interest can be placed under the control of the promoter of the transcriptional unit of the rDNA of the host cell.
  • the DNA fragment of interest can be placed under the control of appropriate expression elements inserted into the mobile genetic element. Expression here means transcription into RNA and / or translation of this RNA into protein.
  • the expression control elements notably comprise an appropriate promoter.
  • Such promoters are well known to those skilled in the art and are inserted upstream of the DNA fragment of interest by conventional techniques of genetic engineering.
  • the promoter selected can be a promoter recognized by RNA polymerase I, so as to promote the expression of the DNA fragment of interest, after integration of the integration cassette into the rRNA genes of the eukaryotic host cell.
  • the DNA fragment of interest can be placed under the control of the regulatory elements included in the non-transcribed regions of the rDNA involved in the transcription of the rRNA genes.
  • Such promoters will be chosen so as to be functional in the eukaryotic host cell which has been retained.
  • the promoter chosen can be a promoter recognized by RNA polymerase II. Such promoters are well known to those skilled in the art.
  • the promoter can be isolated from a cell gene or from a virus. It can be ubiquitous allowing permanent expression of the DNA fragment of interest in all types of host cells.
  • the term promoter also includes a regulatable promoter, for example a tissue-specific promoter.
  • HMG gene Hydroxy-Methyl-Glutaryl coenzyme A reductase
  • TK gene of the HSV-1 virus of the HSV-1 virus
  • SV40 virus Simian virus 40
  • EIII and MLP Major Late Promoter
  • promoters of the adenovirus the LTR of the MoMuLV virus (Moloney Murine Leukemia Virus)
  • the promoter of the FIX gene conferring a liver-specific expression or the promoter of the immunoglobulin genes specific for lymphocyte cells.
  • the transposition assembly comprises, in addition to an integration cassette, elements allowing or promoting the site-specific integration of this cassette.
  • the transposition assembly according to the invention also comprises:
  • a region of at most 10kb having at least 80% homology with the sequences of the rRNA gene of the host cell immediately adjacent at 5' to said insertion site; and - at 3 'of the integration cassette, a region of at most 10kb, having at least 80% homology with the sequences of the rRNA gene of the host cell immediately adjacent at 3' to said insertion site.
  • the transposition involves a fiber exchange phenomenon as has been shown in particular for intron 3.
  • the fiber exchange involves the intron donor sequences "1" (from the transposition set) and recipient intron "sequences (from the host cell). Only the integration cassette will be transposed into the genome of the host cell. The sequences of the rRNA gene immediately adjacent 5 'and 3' from the insertion site are involved only in the transposition process.
  • a preferred transposition set will further include:
  • sequences of the rRNA gene immediately adjacent 5 ′ and 3 ′ to the insertion site can be isolated according to conventional techniques of genetic engineering, for example by cloning or PCR (Polymerase Chain Reaction) or chemical synthesis. More particularly, these sequences will have a length of at most 10 kb, advantageously of at most 3 kb and preferably of at most 0.4 kb.
  • the present invention also relates to a means for introducing a transposition assembly according to the invention into a eukaryotic cell.
  • a means for introducing a transposition assembly according to the invention into a eukaryotic cell are generally known to those skilled in the art.
  • the transposition assembly according to the invention can be introduced into an introduction means selected from delivery vehicles of the liposome and synthetic cationic lipid type and the cloning and expression vectors conventionally used in eukaryotic cells.
  • Encapsulation in a delivery vehicle and techniques of cloning into vectors are conventional techniques known to those skilled in the art.
  • other protocols allowing the introduction of a nucleic acid into a cell can also be used, such as for example calcium phosphate precipitation, the DEAE dextran technique, direct injection of the nucleic acid into a cell or the bombardment of nucleic acid-covered gold microparticles in animal cells.
  • the nucleic acid can be introduced in supercoiled, circular or linear form.
  • the means of introduction according to the invention is a vector comprising the elements suitable for its maintenance in the host cell during a long enough to allow the transfer of the integration cassette into the insertion region.
  • a vector must be able to enter an upper eukaryotic cell, preferably to remain in extrachromosomal form and to remain in the cell for a time long enough to allow the transposition of the integration cassette into the genome of the cell. host.
  • Such a vector can be in the form of a plasmid or a viral vector.
  • the introduction means according to the invention is a vector of non-integrative type. Mention may be made of a vector derived from the herpes simplex virus or from an adenovirus.
  • the means of introduction according to the invention is a vector derived from an adenovirus, such as for example adenovirus type 5.
  • the introduction means according to the invention may also contain an expression cassette allowing the production of the specific integrase of the transposition assembly.
  • Such an expression cassette comprises the DNA fragment coding for said integrase, placed under the control of appropriate elements allowing its expression.
  • appropriate elements allowing its expression is meant all of the elements allowing the transcription of said DNA fragment into mRNA and the translation of mRNA into protein.
  • These elements include in particular an appropriate promoter, preferably a promoter recognized by RNA polymerase II and allowing a strong and ubiquitous expression, for example the promoter SV40.
  • the means of introduction according to the invention may also comprise an expression cassette allowing the expression of a selection gene, allowing the detection and the isolation of the host cells comprising said means of introduction.
  • the gene encoding the selection marker can be under the control of appropriate elements allowing its expression in the host cell, as defined above.
  • the invention also relates to a process //; in vitro transfer of a DNA fragment of interest into the genome of a eukaryotic host cell at the level of ribosomal nuclear DNA, according to which a transposition assembly according to the invention or a means is introduced into said host cell of introduction according to the invention.
  • the invention also relates to a eukaryotic cell comprising a transposition assembly according to the invention or an introduction means according to the invention.
  • Said cell will advantageously be a mammalian cell, and preferably a human cell.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, as therapeutic agent, a transposition assembly according to the invention, a means of introduction according to the invention or a cell according to the invention, in association with an acceptable carrier of from a pharmaceutical point of view.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is in particular intended for the preventive or curative treatment of diseases such as:
  • - genetic diseases such as for example hemophilia or cystic fibrosis
  • cancers such as for example those induced by oncogenes or viruses
  • retroviral diseases such as for example AIDS (acquired immunodeficiency syndrome)
  • Recurrent viral diseases such as viral infections caused by the herpes virus.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can be manufactured in a conventional manner.
  • a therapeutically effective amount of a therapeutic agent is combined with a carrier such as a diluent.
  • a composition according to the invention can be administered by any conventional route used in the field of art, in particular by subcutaneous route, by intramuscular route, by intravenous route or by intra-tracheal route. The administration can take place in single dose or repeated one or more times after a certain interval of interval. The appropriate route and dosage will vary depending on various parameters, for example, the individual being treated or the DNA fragment of interest.
  • a pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable adjuvant.
  • the pharmaceutical composition according to the invention further comprises an integrase or an integrase expression cassette.
  • the invention also extends to a treatment method according to which a therapeutically effective amount of a transposition set according to the invention is administered, a means of introduction according to the invention or a cell according to the invention to a patient needing such treatment.
  • FIG. 1 schematically represents a transposition assembly (1) (large white box) which comprises from 5 'to 3': the sequences of the rRNA gene (6) (hatched box) 5 'from the insertion site (5) (black lines), an integration cassette (3) (small white box) consisting of a mobile genetic element (4) (horizontally striped box) into which is inserted a DNA fragment of interest (2) (dotted box) and the sequences of the rRNA gene (7) (hatched box) 3 'to the insertion site (5).
  • a transposition assembly (1) large white box
  • the sequences of the rRNA gene (6) hatchched box
  • 5 'from the insertion site (5) black lines
  • an integration cassette (3) small white box
  • a mobile genetic element (4) horizontally striped box
  • EXAMPLE 1 Construction of a transposition assembly for site-specific integration into the 28 S rRNA genes of a human cell, using the intron 3 of Physarum polycephalum strain Carolina.
  • the example refers to a set of transposition which includes
  • intron 3 modified so as to create a unique Xhol restriction site in the intronic sequence.
  • the Xhol site will make it possible to introduce a DNA fragment of any interest.
  • the DNA fragment of interest can be isolated so as to present cohesive ends compatible with the ends generated by Xhol digestion (restriction fragment ⁇ 77 ⁇ I or Sali or Xhol-Sall or addition of linkers Xhol and / or Sali or site-directed mutagenesis to create the required Xhol and / or Sali sites).
  • the Xhol cloning site can be treated, for example with Mung bean nuclease, in order to generate blunt ends between which any blunt-ended DNA fragment of interest can be cloned.
  • the 0.94 kb DNA fragment comprising the intron 3 can be isolated in particular by cloning, PCR or chemically synthesized, and
  • Primers were defined using the sequence of the human 28S rRNA gene included in the DNAstar database (reference: HUMRGM, the reported sequence going from position + 1 to position + 5025).
  • the insertion site and the insertion region of intron 3 have been located (as reported in Muscarella and Vogt, 1989, Cell, 56, 443-454).
  • the insertion site is between nucleotides 3742 and 3743 of the human 28S rRNA gene.
  • a first DNA fragment corresponding to the fragment going from position 2324 to position 3742 of the human 28S rRNA gene is generated by PCR.
  • the primer corresponding to the coding strand (position 2324 to 2349) is reported in SEQ ID NO: 1. It also has a free 5 ′ end carrying the HindIII and Nhel sites.
  • the reverse primer is described in SEQ ID NO: 2 and has a 5 'end including the Spel and Xbal sites.
  • Thermus Aquaticus polymerase Perkin Elmer Cetus
  • Conventionally prepared human DNA is used as a matrix. The amplified product is checked on agarose gel and sequenced.
  • the second fragment of human 28S rRNA gene is also isolated by PCR. This is the portion of the gene going from position 3743 to 4438.
  • the two oligonucleotides used are reported in SEQ ID NO: 3 and 4.
  • the first primer has a Spel site at its 5 ′ end while the 'reverse primer contains from 5' to 3 'the EcoRI, NAel and Bgfll sites.
  • the amplification reaction is carried out using human genomic AD ⁇ prepared conventionally, under the standard conditions commonly used by those skilled in the art. The PCR fragment thus generated is verified on agarose gel and sequence.
  • the fragment comprising 1kb of human sequences immediately adjacent 5 ′ to the insertion site of intron 3 is digested with the enzymes HindIII and Spel.
  • the fragment comprising the sequences immediately adjacent at 3 ′ is digested with Spel and EcoRI.
  • the two fragments are then ligated into the plasmid pUC 19 (Yanisch-Perron et al., 1985, Gene, 33, 103-1 19) previously digested with HwdlII and EcoRI.
  • the ligation mixture is transformed into the Escherichia coli 5K strain (E. coli 5K) giving rise to the plasmid p ⁇ R ⁇ I.
  • Intron 3 of modified Physarum polycephalum. Intron 3 (0.94kb) is isolated by the PCR technique. The primers are established from the sequence data reported in the literature (Muscarella et al, 1990, Mol. Cell. Biol., 10, 3386-3996; Johansen et al, 1992, Curr. Genêt., 22, 297-304 ). The primers are described in SEQ ID NO: 5 and 6. They both include a Kpnl site in their 5 'region.
  • the amplification reaction is carried out from a genomic DNA library of Physarum polycephalum, Carolina strain (Muscarella and Vogt, 1989, Cell, 56, 443-454), applying the standard conditions known to man of job. After amplification, the size of the fragment obtained is checked on agarose gel and its sequence verified.
  • the PCR fragment is digested with Kpn1 and cloned into the Kpnl site of the vector pUC19 to give pINEI.
  • the pINEI vector is digested with Nhel, a unique site located in intron 3 of Physarum polycephalum.
  • the linearized pINEI vector is treated with Mung bean nuclease and ligated to a ⁇ 7? OI linker (Stratagene).
  • the resulting vector is designated pINEII and therefore has a unique Xhol site for the insertion of a DNA fragment of interest.
  • the KpnI fragment obtained by digestion of pINEII is treated with T4 polymerase to give a blunt-ended fragment whose 5 'and 3' ends correspond exactly to those of the intron.
  • pHREI is digested with the enzymes Xbal and Spel, then treated with Mung bean nuclease (according to the technique reported in Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Press). This generates a large fragment comprising the majority of the pHREI vector, the blunt ends of which correspond respectively to the nucleotides in position 3742 and 3743 of the human 28S rRNA gene.
  • the fragment from pINEII comprising the intron 3 of Physarum polycephalum is ligated to the vector pHREI treated as indicated above, to give the vector pHREII.
  • the pHREI vector will therefore comprise a transposition assembly allowing the insertion of an integration cassette (intron 3 comprising a DNA fragment of interest) in the rRNA gene 28S human.
  • EXAMPLE 2 Construction of an adenoviral vector for the integration of the neomycin (neo ⁇ ) gene into the human genome.
  • An adenoviral vector comprising:
  • the second expression cassette will allow the production of the endonuclease IPpo for a time long enough to allow transposition of the integration cassette into the genome of the host cell.
  • the codon initiating translation of IPpo is located in the 5 'exon sequence of intron 3 in the rRNA 26S gene of Physarum polycephalum. The sequence immediately adjacent 5 ′ to the insertion site isolated from the human 28S rRNA gene does not contain the initiating ATG present in the equivalent region in Physarum, and
  • a 167 nucleotide fragment containing the poly A region of SV40 (Fitzgerald and Shenk, 1981, Cell, 24, 251-260) is synthesized in the form of an H / ' /.dIII- EcoRI fragment using a automatic synthesizer (Milligen 7500).
  • a Bgl ⁇ l site is introduced just upstream from the EcoRI site.
  • a HindIII-BamHI fragment of pMSG-CAT (Pharmacia) comprising the early promoter of the SV40 virus is isolated.
  • the synthetic fragment H dlII-EcoRI and the fragment H / ' / jdlII-Zto / w ⁇ I are introduced into a derivative of the vector pUC19 (Hindlll 0 ) digested with Bam I and EcoRI.
  • the derivative is obtained after digestion of pUC19 with HwdlII and treatment with T4 polymerase.
  • the vector obtained is designated pSV40 ⁇ I.
  • a DNA fragment comprising the sequence coding for the IPpo nuclease is isolated in the form of a PCR fragment.
  • the sequence reported in the prior art (Muscarella et al., 1990, Mol. Cell. Biol, 10, 3386-3396) made it possible to define two primers, which are respectively described in S ⁇ Q ID NO: 7 and 8.
  • the 2 oligonucleotides have a HwdlII site at their 5 'end.
  • the amplification is carried out under standard conditions known to those skilled in the art from a genomic DNA library of Physarum polycephalum, strain Carolina.
  • the PCR fragment generated after verification on agarose gel and sequencing, is digested with HwdlII and introduced into the unique HwdlII site of the vector pSV40EI.
  • a clone is identified having a correct orientation of the sequence coding for IPpo with respect to the SV40 promoter. The clone is designated pSV40EII.
  • the vector p ⁇ REII is digested with BgH ⁇ and treated with T4 polymerase.
  • the vector pSV40EIl is digested by the enzymes Psû and BgRl.
  • the Pstl-BgHl fragment comprising the IPpo expression cassette is treated with Mung bean nuclease. Then the fragment thus treated is ligated to the vector p ⁇ REII giving rise to p ⁇ REIII.
  • the first expression cassette for the DNA fragment of interest comprises in sequence from 5 'to 3' respectively:
  • the 1.1 kb Xho -Sall fragment comprising said expression cassette is isolated from the plasmid pMClneo (Stratagene), is cloned into the vector p ⁇ REIII linearized by Xhol. The resulting vector is designated p ⁇ RE IV.
  • the Christmas fragment is isolated from the vector p ⁇ REIV comprising the transposition assembly (intron 3 into which the first neo expression cassette is introduced, flanked by the adjacent 5 ′ and 3 ′ sequences of the human AR ⁇ 28S gene) and the second cassette. expression of IPpo.
  • the purified fragment is treated with T4 polymerase before being inserted into the vector pXCX2 (Spessot et al., 1989, Virology, 168, 378-387).
  • the resulting vector is used to generate a recombinant adenovirus by conventional methods, such as, for example, the method reported in Spessot and al. (1989, Virology, 168, 378-387).
  • the recombinant adenoviral vector is constructed from a type 5 adenovirus deletion mutant (Thimmappaye et al. 1982, Cell, 31, 543-551).
  • the recombinant adenoviral vector thus obtained is used to infect human cells in culture.
  • the cells are cultured under conventional conditions known to those skilled in the art. 48 hours after infection, the cells are placed in a culture medium containing neomycin.
  • the presence of the neo gene in the cells can be checked by their neomycin resistance phenotype and verified by Southern blot.
  • the site-specific insertion of the integration cassette into the cell genome can be verified by PCR.
  • Use will preferably be made of a primer complementary to a sequence of the human 28S rRNA gene not present in the transposition set (5 ′ to position 2324 or 3 ′ to position 4438) and a primer complementary to a sequence of the integration cassette normally not present in the cell genome (for example intron 3 or the expression cassette for the neo gene).
  • a PCR fragment of a defined size will be obtained only in the event of site-specific integration of the integration cassette into the human 28S rRNA gene.
  • EXAMPLE 3 Construction of a plasmid vector (episomaP replicative for the integration of the neomycin gene into the human genome.
  • the Nhel fragment of Example 2.4 is inserted into the vector pREP4 (Grager et al., 1989, Gene, 81, 385-294; Invitrogen Corporation, British Bio-Technology Products LTD, Oxon, UK; reference V 004-50) at the level of the single N ⁇ el site.
  • the resulting vector is transfected into a human cell line in culture as indicated in Yates et al. (1985, Nature, 313, 812-815). By way of indication, mention is made of line 293, a human embryonic kidney line, available from ATCC. 48 hours after transfection the cells are placed in a selective culture medium. The presence of the neo gene integrated into the cell genome is verified as described in Example 2.4. LIST OF SEQUENCES
  • NAME Transgene S.A.
  • ORGANISM synthetic oligonucleotide
  • ORGANISM synthetic oligonucleotide
  • xi DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: CCCCAAACTA GTTCTAGAGA GAGTCATAGT TACTCCCGCC GT 42
  • ORGANISM synthetic oligonucleotide
  • ORGANISM synthetic oligonucleotide
  • ORGANISM synthetic oligonucleotide
  • xi DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: TTTGGGGTAC CCACCCCCTT AAATATGGCG CTC 33
  • ORGANISM synthetic oligonucleotide
  • ORGANISM synthetic oligonucleotide

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Abstract

La présente invention a trait à un ensemble de transposition destiné au transfert d'un fragment d'ADN d'intérêt dans l'ADN nucléaire ribosomal d'une cellule eucaryote. La présente invention concerne également un moyen d'introduction, une cellule eucaryote et une composition pharmaceutique comportant ledit ensemble de transposition, ainsi que le procédé de transfert in vitro dudit fragment d'ADN.

Description

ENSEMBLE DE TRANSPOSITION POUR LE TRANSFERT DE GENE CHEZ LES EUCARYOTES
La présente invention a pour objet un ensemble de transposition permettant le transfert de gènes d'intérêt dans le génome d'une cellule ou d'un organisme eucaryote. Un tel ensemble est particulièrement utile à des fins de thérapie génique.
De nombreux éléments pouvant être mis en oeuvre par l'intégration de gènes d'intérêt dans le génome eucaryote, ont été décrits dans les publications de l'art antérieur. Les éléments classiques sont soit des vecteurs intégratifs, par exemple des vecteurs rétroviraux soit des vecteurs non-intégratifs, par exemple des vecteurs adénoviraux. Toutefois ces vecteurs de l'art antérieur ne présentent pas que des avantages.
En effet, les vecteurs rétroviraux s'intègrent au hasard de façon non-spécifique dans le génome cellulaire. Ainsi, le risque de mutagenèse insertionnelle liée soit à l'inactivation de gènes essentiels à la cellule, soit à l'activation d'oncogènes pouvant donner lieu à une prolifération tumorale, n'est pas à négliger avant d'envisager leur utilisation en thérapie génique humaine.
En ce qui concerne les vecteurs non-intégratifs, ils présentent des inconvénients liés à une instabilité du fait de leur non-intégration dans le génome cellulaire, ce qui nécessite leur administration régulièrement renouvelée. Dans le cadre d'une thérapie génique destinée à l'homme, ceci risque de poser à long terme des problèmes d'immunisation contre le virus recombinant, des patients régulièrement traités.
Un troisième type de méthode, plus récemment décrite, permet le transfert de gènes d'intérêt par recombinaison homologue dans un site défini du génome cellulaire. Cependant, la technique de recombinaison homologue se heurte encore à de nombreuses difficultés techniques. De plus, des événements de recombinaison non- homologue peuvent également se produire, de sorte que le risque de mutagenèse insertionnelle subsiste.
D'autre part, l'art antérieur a depuis longtemps établi le schéma d'organisation et d'expression de l'ADN ribosomal (ADNr) chez les eucaryotes (Reeder, Trends Genêt. 1990, 6, 390-395). D'une manière générale, l'ADNr est constitué par des copies multiples d'unités de transcription arrangées en tandems. Une unité transcriptionnelle est composée des gènes codant respectivement pour les ARNr 18S ou 16S, 5-8S et 28S ou 26S, qui entrent dans la constitution du ribosome (ci-après désigné gène ARNr 18S etc.). Chaque gène est séparé du suivant par des séquences transcrites, dont le rôle exact n'est pas encore défini. Les trois gènes ARNr compris dans une unité transcriptionnelle sont placés sous le contrôle d'un promoteur unique situé en amont dans la région non-transcrite qui sépare une unité de la suivante. Les unités d'ADNr sont transcrites par l'ARN polymérase I en une longue molécule d'ARNr précurseur (pré ARNr), qui est ensuite ature pour produire les trois principaux types d'ARNr associés aux sous-unités ribosomales.
De nombreuses publications ont signalé la présence fréquente d'éléments génétiques étrangers dans l'ADNr d'eucaryotes. Parmi ces éléments génétiques, on peut citer des introns de classe I ou II et des rétroposons, par exemple de classe RI, R2 ou R3. La présence de ces éléments étrangers peut éventuellement inactiver une fraction des unités transcriptionnelles de l'ADNr. Cela ne semble pas avoir de conséquences graves pour la vie des organismes les contenant. Ce phénomène a surtout été décrit chez la drosophile.
Les introns de classes I et II sont définis par l'existence de séquences conservées formant des éléments structuraux caractéristiques de chacune des classes tels que définis par Cech et Bass (1 86, Annu. Rev. Biochem. 55_, 599-629). Plusieurs auteurs ont observé que certains introns de classes I et II sont mobiles. Ils peuvent être copiés et transférés spécifiquement dans des copies de gènes qui en sont dépourvus (intron"). Ce processus de transposition, au moins dans la plupart des cas, s'avère être spécifique du point de vue de la région d'insertion. Parmi la soixantaine d'introns de classe I caractérisés jusqu'à présent, la majorité est localisée dans les gènes des mitochondries et des chloroplastes. L'art antérieur mentionne, dans trois cas seulement, la présence d'introns mobiles de classe I dans les gènes nucléaires. Ces introns ont été mis en évidence au niveau des gènes ARNr de trois espèces d'eucaryotes inférieurs, respectivement les gènes ARNr 26S de plusieurs souches de Tetrahymena (Kan et Gall, 1982, Nucl. Acids Res., 10, 2809-2821) et de la souche Carolina de Physarum polycephal m, (Muscarella et Vogt, 1989, Cell, 56, 443-454 ; cet intron mobile étant désigné ci-après intron 3) et enfin dans le gène ARNr 16S de Pneumocystis carinii (Edman et al., 1988, Nature, 334, 519-522). Jusqu'à présent, on a pas pu mettre en évidence la présence d'introns interrompant les gènes ARNr d'eucaryotes supérieurs.
L'intron 3 de Physarum polycephalum est le mieux caractérisé. Sa mobilité a été démontrée expérimentalement (Muscarella et Vogt, 1989, Cell, 56, 443-454). Cet intron code en partie pour une protéine de 160 acides aminés (Muscarella et al., 1990,
Mol. Cel. Biol., 10, 3386-3396). Le codon d'initiation de la traduction putatif est situé en amont de l'intron, à l'extrémité 3' de la séquence exonique adjacente en 5' de l'intron.
La protéine codée par l'intron 3, est une endonucléase qui reconnaît une séquence cible d'au moins 18 paires de bases (pb) présente dans la région d'insertion et est capable de cliver cette séquence exactement au niveau du site d'insertion de l'intron 3 (Muscarella et Vogt, 1989, Cell, 56, 443-454).
La séquence cible reconnue par l'endonucléase comprend la séquence suivante : 5'CTATGACTCTCTTAAGGTAGCCAAA3'
On suppose que la transposition de l'intron 3 est initiée par la reconnaissance de la séquence cible particulière par l'endonucléase spécifiquement codée par l'intron 3, suivie d'une coupure des deux brins de la molécule d'ADN au niveau de cette séquence particulière, libérant ainsi le site d'insertion. Puis par un échange de fibres impliquant les séquences flanquantes en 5' et 3' du site d'insertion, copie de la séquence intronique et recombinaison, l'intron 3 est inséré dans la copie du gène ARNr intron", de manière précise et site-spécifique. Une fois l'intron 3 inséré dans une copie du gène intron", la séquence cible reconnue par l'endonucléase est interrompue par la séquence intronique de la manière suivante : 5'CTATGACTCTCT intron 3 TAAGGTAGCCAAA3'
D'autre part, des rétroposons semblent également être présents dans l'ADNr de certains eucaryotes. D'une manière générale, les rétroposons forment un groupe très vaste et très hétérogène, notamment au niveau de leur séquence nucléotidique. Par rétroposon, on entend des éléments apparentés aux rétrovirus, mais dépourvus de "long terminal repeats" (LTR). Us comprennent un ou des cadre(s) de lecture ouvert(s) susceptible(s) de coder pour des protéines présentant une homologie avec des protéines rétrovirales, comme par exemple la reverse-transcriptase (Jakubczak et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 3295-3299).
Chez un certain nombre d'eucaryotes non-mammifères, notamment les insectes, on a trouvé des rétroposons présentant une spécificité d'insertion remarquable, localisée au niveau des gènes ARNr. La mobilité de certains d'entre eux a été observée. Plusieurs familles (notamment RI , R2 et R3) ont été définies en fonction de leur région d'insertion spécifique dans les gènes ARNr.
Les rétroposons des classes RI et R2 sont notamment illustrés par les rétroposons RIBm et R2Bm de Bombyx ori (Xiong et Eickbush, 1988, Cell, 55, 235-246 ; Xiong et Eickbush, 1988, Mol. Cell. Biol., 8, 1 14-123 ; Xiong et al., 1988, Nucl. Ac. Res., 16, 10561-10573) et les rétroposons RIDm et R2Dm de Drosophila melanogaster (Jakubczak et al., 1990, J. Mol. Biol., 212, 37-52). Ils contiennent un cadre de lecture ouvert susceptible de coder pour une protéine de grande taille dont la partie centrale présente une homologie avec la famille des réverse-transcriptases. Xiong et Eickbush (1988, Cell, 55, 235-246) rapportent que la protéine codée par le rétroposon R2Bm de Bombyx mori présente en outre une activité endonucléase. Cette nucléase reconnaît et clive une séquence cible contenue dans la région d'insertion de R2Bm située dans le gène ARNr 28S du génome de l'insecte.
Une nouvelle classe de rétroposons ribosomaux, désignée R3, a récemment été mise en évidence. On n'a pas encore caractérisé de protéine codée par cet élément. Cependant, la région d'insertion spécifique de l'élément R3 dans l'ADNr de Scaria coprophila a été décrite (Kerrebrock et al., J. Mol. Biol., 1989, 210, 1-13).
A côté des rétroposons, il existe un grand nombre d'éléments génétiques mobiles qui ont été parfois désignés sous le nom de rétroposons par les auteurs les décrivant, mais dont on n'a pas encore montré qu'ils codent pour une protéine présentant une homologie avec la famille des protéines rétrovirales, notamment la reverse- transcriptase. On a également trouvé ce type d'éléments au niveau de séquences bien définies de gènes ARNr des organismes les contenant (voir par exemple Back et al., 1984, EMBO J., 3, 2523-2529).
De manière surprenante, on a maintenant trouvé que d'une part les séquences cibles reconnues par les endonucléases codées par les deux éléments génétiques mobiles pour lesquels les données sont disponibles (intron 3 de Physarum polycephalum et rétroposon R2Bm de Bombyx mon) et d'autre part les régions d'insertion de certains éléments génétiques mobiles dont on n'a pas encore montré qu'ils codent pour une endonucléase et qui ont été divulguées dans l'art antérieur (Jakubczak et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 3295-3299 ; Pask itz et Collins, 1989, Nucleic Acid Res., 17, 8125-8133 ; Kerrebrock et al., 1989, J. Mol. Biol., 210, 1-13 ; Kan et Gall, 1982, Nucleic Acid Res., 10, 2809-2821 ; Edman et al., 1988, Nature, 263, 519-522), sont conservées dans les gènes ARNr de divers mammifères, notamment l'homme et la souris. Ainsi, les séquences des régions d'insertion des introns mobiles de Telrahymena, de Pneumocystis carinii et de Physarum polycephalum, et des rétroposons R2Bm de Bombyx mori, et R3 de Scaria coprophila sont conservées à l'identique dans les gènes ARNr de mammifères. Par contre, les séquences de la région d'insertion des rétroposons RIDm et RIBm sont homologues mais non identiques à une séquence présente dans le gène ARNr 28 S de mammifère.
Par conséquent, la présente invention a pour objet un ensemble de transposition destiné au transfert d'un fragment d'ADN d'intérêt dans le génome d'une cellule hôte eucaryote, qui comprend une cassette d'intégration, essentiellement constituée d'un élément génétique mobile au sein duquel est inséré ledit fragment d'ADN d'intérêt ; ladite cassette d'intégration étant capable de s'intégrer d'une façon site-spécifique dans un site d'insertion spécifique situé dans l'ADN nucléaire ribosomal de ladite cellule hôte.
Un ensemble de transposition selon l'invention présente l'avantage de permettre l'intégration d'un fragment d'ADN d'intérêt dans une région définie et non essentielle du génome cellulaire. Un tel ensemble est notamment utile à des fins de thérapie génique.
Aux fins de la présente invention, la cassette d'intégration doit comporter un élément génétique mobile qui possède la capacité de s'intégrer par un mécanisme site- spécifique, dans de l'ADNr nucléaire, en particulier au niveau du gène ARNr 28S, 18S ou 5-8S. De manière plus précise, cet élément génétique mobile doit s'intégrer dans un site d'insertion situé dans une région d'insertion dont la séquence est conservée à l'identique ou non dans l'ADNr nucléaire de la cellule-hôte.
Pour une meilleure compréhension, on précise que le terme "site d'insertion" définit l'endroit entre 2 nucléotides où s'insère un élément génétique mobile. De même, par "région d'insertion", on entend les séquences nucléotidiques en 5' et 3' du site d'insertion qui sont requises pour la transposition site-spécifique. D'une manière générale, chaque élément génétique mobile possède une région d'insertion qui lui est spécifique. Comme mentionné précédemment pour les rétroposons RIBm et RIDm, il n'est pas exigé que la région d'insertion dans la cellule hôte comporte à l'identique les séquences de la région d'insertion naturelle (dans l'organisme d'origine). Ainsi, la séquence de la région d'insertion dudit élément génétique mobile dans la cellule hôte eucaryote présentera un degré d'homologie avec la séquence de la région d'insertion naturelle supérieur à 80%, de manière avantageuse supérieur à 90% et de préférence supérieur à 95%.
L'élément génétique mobile est avantageusement sélectionné parmi des introns mobiles de classe I ou II, et des rétroposons tels que les rétroposons de classe RI R2 ou R3.
Un élément génétique mobile peut être constitué par un fragment fonctionnel ou un variant dudit élément. Par fragment fonctionnel, on entend tout fragment ayant conservé la capacité à s'intégrer de l'élément complet. Un variant peut comporter une ou plusieurs mutations par rapport à la séquence nucléotide naturelle de l'élément, notamment la substitution, addition ou délétion d'un ou plusieurs nucléotide(s), à condition que ces mutations n'en altèrent pas la fonction.
De manière plus particulière, l'élément génétique mobile est sélectionné parmi :
- l'intron 3 de Physarum polycephalum, souche Caroîina, un fragment ou un variant dudit intron, l'intron mobile de classe I de Telrahymena, un fragment ou un variant dudit intron, l'intron mobile de classe I de Pneumocystis carinii, un fragment ou un variant dudit intron, le rétroposon R2Bm de Bombyx mori, un fragment ou un variant dudit rétroposon et, le rétroposon R3 de Scaria coprophila, un fragment ou un variant dudit rétroposon.
La présence dans cet élément génétique mobile, de tout ou partie d'un cadre de lecture ouvert susceptible de coder pour une intégrase, est une caractéristique préférée.
D'une manière générale, par intégrase, on entend une protéine présentant une activité enzymatique lui permettant de participer directement ou indirectement à la transposition de l'élément génétique mobile spécifiquement au niveau de son site d'insertion dans l'ADNr nucléaire d'une cellule eucaryote.
Avantageusement, l'intégrase peut être constituée notamment par : (1) une protéine présentant une activité endonucléase capable de reconnaître une séquence cible spécifique inclue dans la région d'insertion de l'élément génétique mobile qui code pour elle et de cliver ladite séquence cible, ou
(2) une protéine présentant une homologie avec la famille des réverse-transcriptases.
On peut citer, par exemple, l'endonucléase codée en partie par l'intron 3 de Physarum popycephalum . Cette endonucléase initie la transposition de l'intron 3 en reconnaissant sa séquence cible et clivant la molécule d'ADN au niveau de cette séquence spécifique.
On peut citer également la protéine codée par le rétroposon R2Bm de Bombyx mori. L'activité endonucléase de ladite protéine est probablement impliquée dans la transposition de R2Bm au niveau de sa région d'insertion spécifique mais par un mécanisme qui n'est pas connu à ce jour.
Le fragment d'ADN d'intérêt peut être introduit dans l'élément génétique mobile par les techniques classiques du génie génétique. Il peut être intégré dans ou en dehors du cadre de lecture ouvert codant pour une éventuelle intégrase.
Selon un aspect particulièrement avantageux de l'invention, le fragment d'ADN d'intérêt est inséré dans le cadre de lecture ouvert, afin d'empêcher l'expression de l'intégrase. Ceci introduit une sécurité pour éviter la propagation incontrôlée de la cassette d'intégration dans le génome de la cellule hôte.
Dans ce cas, l'intégrase spécifique de l'élément génétique mobile mis en oeuvre dans l'ensemble de transposition selon l'invention, devra être fournie à la cellule hôte de manière transitoire pendant un temps suffisamment long pour permettre la transposition de la cassette d'intégration dans sa région d'insertion spécifique. Les moyens de fournir en trans une protéine à une cellule eucaryote sont nombreux et connus de l'homme de l'art.
Par exemple, l'ensemble de transposition selon l'invention peut être introduit dans un vecteur (tel que défini ci-après), comprenant en outre une cassette d'expression de l'intégrase spécifique de l'élément génétique mobile présent dans l'ensemble de transposition.
D'une manière alternative, on peut transfecter parallèlement la cellule hôte eucaryote avec un vecteur helper comprenant une cassette d'expression de l'intégrase ou fournir à la cellule hôte, l'intégrase sous forme purifiée. Le fragment d'ADN d'intérêt peut être tout fragment capable d'être transcrit en ARN pour produire un ARN anti-sens, par exemple une séquence d'ARN complémentaire d'un gène pathogène susceptible de former un duplex avec un transcrit pathogène afin d'inhiber la traduction en protéine pathogène. Un gène pathogène est : (1) un gène qui n'est pas présent dans les cellules eucaryotes, par exemple un gène présent dans le génome d'un organisme pathogène (bactérie, virus ou parasite), ou (2) un gène homologue ou un gène homologue muté, par exemple un oncogène, qui est présent mais normalement pas exprimé dans les cellules eucaryotes normales et dont l'expression anormalement induite peut causer une maladie comme le cancer.
De façon alternative, le fragment d'ADN d'intérêt peut coder pour une protéine d'intérêt et de manière préférée, une protéine dont l'absence d'expression ou l'expression en quantité anormale ou sous forme mutante est associée à une maladie génétique.
Le fragment d'ADN d'intérêt peut coder pour une protéine mature ou un précurseur de celle-ci. Dans le premier cas, il comprend la séquence codante pour une protéine mature permettant l'expression de la protéine de façon intracellulaire. Dans le dernier cas, le fragment d'ADN d'intérêt peut également inclure une séquence signal permettant la sécrétion de ladite protéine de la cellule hôte. Le fragment d'ADN d'intérêt peut coder pour une protéine chimérique provenant de la fusion de séquences d'origines diverses.
Les exemples de protéines pouvant être codées par le fragment d'ADN d'intérêt comprennent :
des cytokines, comme l'interféron alpha, l'interféron gamma et différents types de facteurs de croissance, des récepteurs membranaires, comme les récepteurs impliqués dans la transmission des signaux de la surface à l'intérieur des cellules et les récepteurs reconnus par des organismes pathogènes, comme le récepteur CD4 présent à la surface des lymphocytes T et reconnu par la glycoprotéine d'enveloppe du virus VIH (Virus d'Immunodéficience Humaine), - des enzymes, comme les ribonucléases et la thymidine-kinase (TK) du virus simplex de l'herpès de type I (HSV-1). Cette dernière présente une affinité supérieure par rapport à l'enzyme TK de cellule mammifère pour certains analogues de nucléosides, comme l'acyclovir ou le gancyclovir. L'enzyme TK-HSV-1 convertit les analogues en précurseurs de nucléotides. Ces précurseurs toxiques seront donc incorporés dans l'ADN des cellules en état de réplication. Cette incorporation permet de tuer spécifiquement les cellules en division, comme les cellules cancéreuses, - des inhibiteurs d'une activité enzymatique, comme l'alphal antitrypsine, l'antithrombine III, la protéine C et les inhibiteurs de protéases spécifiques d'un organisme pathogène, des facteurs de coagulation, comme le facteur VIII, le facteur IX et la thrombine, - des protéines participant aux canaux ioniques, comme la protéine CFTR
(Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), des protéines capables d'inhiber l'activité d'une protéine produite par un gène pathogène, comme l'antigène supresseur de tumeur p53, des variants de protéines pathogènes mutés de façon à altérer leur fonction biologique, comme des mutants trans-dominants de la protéine de régulation TAT du virus VIH capables de compétition avec la protéine virale native pour la liaison à la séquence cible, empêchant l'activation de l'expression des gènes viraux et, des épitopes antigéniques permettant d'accroître l'immunité de la cellule hôte.
Le fragment d'ADN d'intérêt peut être muté afin de permettre l'expression d'une protéine d'intérêt dont les propriétés biologiques sont modifiées, par exemple un variant de l'alphal antitrypsine dont le résidu méthionine en position 358 du site actif a été remplacé par une leucine. Un tel variant est fonctionnel dans des conditions d'oxydation telle que des conditions d'inflammation.
Une fois la cassette d'intégration introduite dans l'ADNr de la cellule hôte, le fragment d'ADN d'intérêt peut être placé sous la dépendance du promoteur de l'unité transcriptionnelle de l'ADNr de la cellule hôte. De manière alternative, le fragment d'ADN d'intérêt peut être placé sous le contrôle d'éléments d'expression appropriés insérés dans l'élément génétique mobile. Expression signifie ici transcription en ARN et/ou traduction de cet ARN en protéine.
Selon cette alternative, les éléments de contrôle de l'expression comprennent notamment un promoteur approprié. De tels promoteurs sont bien connus de l'homme de l'art et sont insérés en amont du fragment d'ADN d'intérêt par les techniques conventionnelles du génie génétique. Le promoteur retenu peut être un promoteur reconnu par l'ARN polymérase I, de façon à favoriser l'expression du fragment d'ADN d'intérêt, après intégration de la cassette d'intégration dans les gènes ARNr de la cellule hôte eucaryote. Par exemple, le fragment d'ADN d'intérêt peut être placé sous le contrôle des éléments de régulation compris dans les régions non-transcrites de l'ADNr impliqués dans la transcription des gènes ARNr. De tels promoteurs seront choisis de manière à être fonctionnels dans la cellule hôte eucaryote qui a été retenue.
De manière alternative, le promoteur retenu peut être un promoteur reconnu par l'ARN polymérase II. De tels promoteurs sont bien connus de l'homme de l'art. Le promoteur peut être isolé d'un gène cellulaire ou d'un virus. Il peut être ubiquitaire permettant une expression permanente du fragment d'ADN d'intérêt dans tous les types de cellules hôtes. Le terme promoteur inclut également un promoteur régulable, par exemple un promoteur tissu-spécifique. On peut citer notamment le promoteur du gène HMG (Hydroxy-Methyl-Glutaryl coenzyme A réductase), du gène TK du virus HSV-1, du virus SV40 (Simian virus 40), les promoteurs EIII et MLP (Major Late Promoter) de l'adénovirus, le LTR du virus MoMuLV (Moloney Murine Leukemia Virus), le promoteur du gène FIX conférant une expression foie-spécifique ou le promoteur des gènes immunoglobulines spécifique des cellules lymphocytaires.
De manière avantageuse, l'ensemble de transposition comprend outre une cassette d'intégration des éléments permettant ou favorisant l'intégration site-spécifique de cette cassette. Selon un mode particulier de l'invention, notamment lorsque l'élément génétique mobile mis en oeuvre est un intron mobile de classe I ou II, l'ensemble de transposition selon l'invention comprend en outre :
en 5' de la cassette d'intégration une région d'au plus lOkb, présentant au moins 80% d'homologie avec les séquences du gène ARNr de la cellule hôte immédiatement adjacentes en 5' audit site d'insertion ; et - en 3' de la cassette d'intégration une région d'au plus lOkb, présentant au moins 80% d'homologie avec les séquences du gène ARNr de la cellule hôte immédiatement adjacentes en 3' audit site d'insertion.
En effet, il peut être avantageux de placer ladite cassette d'intégration dans un environnement ADNr, particulièrement lorsque la transposition implique un phénomène d'échange de fibres comme cela a été montré notamment pour l'intron 3. L'échange de fibres implique les séquences donneuses intron"1" (de l'ensemble de transposition) et les séquences receveuses intron" (de la cellule hôte). Seule la cassette d'intégration sera transposée dans le génome de la cellule hôte. Les séquences du gène ARNr immédiatement adjacentes en 5' et 3' du site d'insertion interviennent uniquement dans le processus de transposition.
Afin de favoriser la transposition de la cassette d'intégration, on préférera avoir une homologie parfaite entre les séquences donneuses et receveuses impliquées dans l'échange de fibre. Ainsi, un ensemble de transposition préféré comprendra en outre :
en 5' de la cassette d'intégration une région d'au plus lOkb, présentant 100% d'homologie avec les séquences du gène ARNr de la cellule hôte immédiatement adjacentes en 5' audit site d'insertion ; et en 3' de la cassette d'intégration une région d'au plus lOkb, présentant 100%o d'homologie avec les séquences du gène ARNr de la cellule hôte immédiatement adjacentes en 3' audit site d'insertion.
Les séquences du gène ARNr immédiatement adjacentes en 5' et 3' au site d'insertion peuvent être isolées selon les techniques classiques du génie génétique, par exemple par clonage ou PCR (Polymérase Chain Reaction) ou synthèse chimique. De manière plus particulière, ces séquences auront une longueur d'au plus lOkb, de manière avantageuse d'au plus 3kb et de préférence d'au plus 0,4 kb.
La présente invention concerne également un moyen d'introduction d'un ensemble de transposition selon l'invention dans une cellule eucaryote. De tels moyens consistant à introduire un acide nucléique dans une cellule eucaryote sont généralement connus de l'homme de l'art.
Aux fins de la présente invention, l'ensemble de transposition selon l'invention peut être introduit dans un moyen d'introduction sélectionné parmi les véhicules de délivrance de type liposomes et lipides cationiques synthétiques et les vecteurs de clonage et d'expression classiquement utilisés dans les cellules eucaryotes. L'encapsulation dans un véhicule de délivrance et les techniques de clonage dans des vecteurs constituent des techniques classiques connues de l'homme de l'art. Mais d'autres protocoles permettant d'introduire un acide nucléique dans une cellule peuvent également être employés, comme par exemple la précipitation au phosphate de calcium, la technique du DEAE dextrane, l'injection directe de l'acide nucléique dans une cellule ou le bombardement de microparticules d'or couvertes d'acide nucléique dans les cellules d'un animal. L'acide nucléique peut être introduit sous forme superenroulée, circulaire ou linéaire.
D'une manière avantageuse, le moyen d'introduction selon l'invention est un vecteur comprenant les éléments appropriés à sa maintenance dans la cellule hôte pendant un temps suffisamment long pour permettre le transfert de la cassette d'intégration dans la région d'insertion. Un tel vecteur doit être capable d'entrer dans une cellule eucaryote supérieure, de rester de préférence sous forme extrachromosomique et de se maintenir dans la cellule pendant un temps suffisamment long pour permettre la transposition de la cassette d'intégration dans le génome de la cellule hôte. Un tel vecteur peut être sous la forme d'un plasmide ou d'un vecteur viral.
De préférence, le moyen d'introduction selon l'invention est un vecteur de type non- intégratif. On peut citer un vecteur dérivé du virus de l'herpès simplex ou d'un adénovirus. D'une manière particulièrement préférée, le moyen d'introduction selon l'invention est un vecteur dérivé d'un adénovirus, comme par exemple l'adénovirus de type 5.
Selon un mode avantageux et comme évoqué précédemment, le moyen d'introduction selon l'invention peut contenir en outre une cassette d'expression permettant la production de l'intégrase spécifique de l'ensemble de transposition.
Une telle cassette d'expression comprend le fragment d'ADN codant pour ladite intégrase, placé sous le contrôle d'éléments appropriés permettant son expression. Par éléments appropriés permettant son expression, on entend l'ensemble des éléments permettant la transcription dudit fragment d'ADN en ARNm et la traduction de l'ARNm en protéine. Ces éléments comportent notamment un promoteur approprié, de préférence un promoteur reconnu par l'ARN polymérase II et permettant une expression forte et ubiquitaire, par exemple le promoteur SV40.
Le moyen d'introduction selon l'invention peut en outre comprendre une cassette d'expression permettant l'expression d'un gène de sélection, permettant la détection et l'isolement des cellules hôtes comprenant ledit moyen d'introduction. Dans le contexte de l'invention, le gène codant pour le marqueur de sélection peut être sous le contrôle d'éléments appropriés permettant son expression dans la cellule hôte, tels que définis ci- dessus.
L'invention est également relative à un procédé //; vitro de transfert d'un fragment d'ADN d'intérêt dans le génome d'une cellule hôte eucaryote au niveau de l'ADN nucléaire ribosomal, selon lequel on introduit dans ladite cellule hôte un ensemble de transposition selon l'invention ou un moyen d'introduction selon l'invention.
Avantageusement, on peut en outre fournir dans le procédé in vitro selon l'invention, l'intégrase spécifique de l'ensemble de transposition selon l'invention à la cellule hôte. L'invention a également pour objet une cellule eucaryote comprenant un ensemble de transposition selon l'invention ou un moyen d'introduction selon l'invention. Ladite cellule sera de manière avantageuse une cellule de mammifère, et de manière préférée une cellule humaine.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent thérapeutique, un ensemble de transposition selon l'invention, un moyen d'introduction selon l'invention ou une cellule selon l'invention, en association avec un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
La composition pharmaceutique selon l'invention, est en particulier destinée au traitement préventif ou curatif de maladies telles que :
- des maladies génétiques, comme par exemple l'hémophilie ou la mucoviscidose, des cancers, comme par exemple ceux induits par des oncogènes ou des virus, des maladies rétrovirales, comme par exemple le SIDA (syndrome de l'immunodéficience acquise), et des maladies virales récurrentes, comme par exemple les infections virales provoquées par le virus de l'herpès.
Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier, on associe une quantité thérapeutiquement efficace d'un agent thérapeutique à un support tel qu'un diluant. Une composition selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine de l'art, en particulier par voie sous-cutanée, par voie intramusculaire, par voie intraveineuse ou par voie intra-trachéale. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. La voie d'administration et le dosage appropriés varient en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu traité ou du fragment d'ADN d'intérêt. Une composition pharmaceutique peut comprendre en outre un adjuvant acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
Avantageusement, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend en outre une intégrase ou une cassette d'expression de l'intégrase. L'invention s'étend également à une méthode de traitement selon laquelle on administre une quantité thérapeutiquement efficace d'un ensemble de transposition selon l'invention, un moyen d'introduction selon l'invention ou une cellule selon l'invention à un patient ayant besoin d'un tel traitement.
L'invention est illustrée ci-après en référence à la figure 1 qui représente schématiquement un ensemble de transposition (1) (grande boîte blanche) qui comprend de 5' vers 3' : les séquences du gène ARNr (6) (boîte hachurée) en 5' du site d'insertion (5) (traits noirs), une cassette d'intégration (3) (petite boîte blanche) constituée d'un élément génétique mobile (4) (boîte rayée horizontalement) au sein duquel est inséré un fragment d'ADN d'intérêt (2) (boîte pointillée) et les séquences du gène ARNr (7) (boîte hachurée) en 3' du site d'insertion (5).
EXEMPLES :
EXEMPLE 1 : Construction d'un ensemble de transposition pour l'intégration site- spécifique dans les gènes ARNr 28 S d'une cellule humaine, mettant en oeuyre l'intron 3 de Physarum polycephalum souche Carolina.
L'exemple se réfère à un ensemble de transposition qui comporte
(1) l'intron 3 modifié de manière à créer un site unique de restriction Xhol dans la séquence intronique. Le site Xhol permettra d'introduire un fragment d'ADN d'intérêt quelconque. En effet le fragment d'ADN d'intérêt peut être isolé de manière à présenter des extrémités cohésives compatibles avec les extrémités générées par une digestion Xhol (fragment de restriction Λ77θI ou Sali ou Xhol-Sall ou addition de linkers Xhol et/ou Sali ou mutagenèse dirigée afin de créer les sites Xhol et/ou Sali requis). D'une manière alternative, le site de clonage Xhol peut être traité par exemple à la nucléase de haricot Mung afin de générer des extrémités franches entre lesquelles on peut cloner tout fragment d'ADN d'intérêt à bouts francs. Le fragment d'ADN de 0,94 kb comportant l'intron 3 peut être isolé notamment par clonage, PCR ou synthétisé chimiquement, et
(2) les séquences immédiatement adjacentes en 5' et 3' au site d'insertion de l'intron 3. Ces séquences sont isolées du gène ARNr 28S humain comprenant la région d'insertion de l'intron 3 parfaitement conservée. Ainsi l'intron mobile sera placé dans un environnement ADNr. L'échange de fibres impliquera des séquences parfaitement homologues puisque toutes deux d'origine humaine (séquences donneuses de la cassette d'intégration et séquences receveuses de la cellule humaine hôte). Les séquences immédiatement adjacentes en 5' et 3' peuvent être isolées notamment par clonage, PCR ou synthétisées chimiquement. 1. Clonage par PCR des séquences immédiatement adjacentes en 5' et 3' au site d'insertion de l'intron 3 à partir du gène humain ARNr 28S.
Des amorces ont été définies à l'aide de la séquence du gène ARNr 28S humain inclus dans la banque de donnée DNAstar (référence : HUMRGM, la séquence reportée allant de la position + 1 à la position + 5025). On a localisé le site d'insertion et la région d'insertion de l'intron 3 (tels que reportés dans Muscarella et Vogt, 1989, Cell, 56, 443- 454). Le site d'insertion est compris entre les nucléotides 3742 et 3743 du gène ARNr 28S humain.
Un premier fragment d'ADN correspondant au fragment allant de la position 2324 à la position 3742 du gène ARNr 28S humain est généré par PCR. L'amorce correspondant au brin codant (position 2324 à 2349) est reportée dans la SEQ ID NO: 1. Elle comporte en outre une extrémité 5' libre portant les sites Hindlll et Nhel. L'amorce reverse est décrite dans la SEQ ID NO: 2 et comporte une extrémité 5' incluant les sites Spel et Xbal. L'amplification est réalisée avec la polymérase de Thermus Aquaticus (Perkin Elmer Cetus) selon les conditions standards indiquées par le fabricant. On utilise comme matrice du DNA humain préparé classiquement. Le produit amplifié est vérifié sur gel d'agarose et séquence.
On isole également par PCR, le deuxième fragment de gène ARNr 28S humain. Il s'agit de la portion de gène allant de la position 3743 à 4438. Les deux oligonucléotides mis en oeuvre sont reportés dans les SEQ ID NO: 3 et 4. La première amorce comporte à son extrémité 5' un site Spel tandis que l'amorce reverse contient de 5' vers 3' les sites EcoRI, NAel et Bgfll. La réaction d'amplification est réalisée à partir de l'ADΝ génomique humain préparé classiquement, dans les conditions standards couramment employées par l'homme du métier. Le fragment PCR ainsi généré est vérifié sur gel d'agarose et séquence.
Le fragment comprenant lkb de séquences humaines immédiatement adjacentes en 5' au site d'insertion de l'intron 3, est digéré par les enzymes Hindlll et Spel. Le fragment comprenant les séquences immédiatement adjacentes en 3' est digéré par Spel et EcoRI. Les deux fragments sont ensuite ligués dans le plasmide pUC 19 (Yanisch- Perron et al., 1985, Gène, 33, 103-1 19) préalablement digéré par HwdlII et EcoRI. Le mélange de ligation est transformé dans la souche Escherichia coli 5K (E. coli 5K) donnant lieu au plasmide pΗRΕI.
2. Clonage de l'intron 3 de Physarum polycephalum modifié. On isole l'intron 3 (0,94kb) par la technique PCR. Les amorces sont établies à partir des données de séquence reportées dans la littérature (Muscarella et al, 1990, Mol. Cell. Biol., 10, 3386-3996 ; Johansen et al, 1992, Curr. Genêt., 22, 297-304). Les amorces sont décrites dans les SEQ ID NO: 5 et 6. Elles comprennent toutes deux un site Kpnl dans leur région 5'.
La réaction d'amplification est effectuée à partir d'une banque d'ADN génomique de Physarum polycephalum, souche Carolina (Muscarella et Vogt, 1989, Cell, 56, 443- 454), en appliquant les conditions standards connues de l'homme de métier. Après amplification, la taille du fragment obtenu est contrôlée sur gel d'agarose et sa séquence vérifiée.
Le fragment PCR est digéré par Kpnl et clone dans le site Kpnl du vecteur pUC19 pour donner pINEI.
Le vecteur pINEI est digéré par Nhel, site unique situé dans l'intron 3 de Physarum polycephalum. Le vecteur pINEI linéarisé est traité à la nucléase de haricot Mung et ligué à un linker Λ7?oI (Stratagène). Le vecteur en résultant est désigné pINEII et comporte donc un site unique Xhol pour l'insertion d'un fragment d'ADN d'intérêt.
3. Insertion de l'intron 3 de Physarum polycephalum (XhoD dans un environnement gène ARNr 28 S humain
Le fragment Kpnl obtenu par digestion de pINEII est traité à la polymérase de T4 pour donner un fragment à bouts francs dont les extrémités 5' et 3' correspondent exactement à celles de l'intron.
Parallèlement, pHREI est digéré par les enzymes Xbal et Spel, puis traité à la nucléase de haricot Mung (selon la technique reportée dans Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Press). Ceci génère un grand fragment comportant la majorité du vecteur pHREI, dont les extrémités franches correspondent respectivement aux nucléotides en position 3742 et 3743 du gène ARNr 28S humain.
Le fragment issu de pINEII comportant l'intron 3 de Physarum polycephalum est ligué au vecteur pHREI traité comme indiqué ci-dessus, pour donner le vecteur pHREII. Après introduction d'un fragment d'ADN d'intérêt, le vecteur pHREI comprendra donc un ensemble de transposition permettant l'insertion d'une cassette d'intégration (intron 3 comprenant un fragment d'ADN d'intérêt) dans le gène ARNr 28S humain. EXEMPLE 2 : Construction d'un vecteur adénoviral pour l'intégration du gène néomycine (neo~) dans le génome humain.
On construit un vecteur adénoviral comportant :
(1) l'intron 3 de Physarum polycephalum (Xho+) au niveau duquel on introduit une première cassette d'expression permettant l'expression du gène neo,
(2) une deuxième cassette d'expression, celle de l'endonucléase site-spécifique TPpo, codée en partie par l'intron 3. La deuxième cassette d'expression permettra la production de l'endonucléase IPpo pendant un temps suffisamment long pour permettre la transposition de la cassette d'intégration dans le génome de la cellule hôte. Le codon initiateur de la traduction de IPpo se situe dans la séquence exonique en 5' de l'intron 3 dans le gène ARNr 26S de Physarum polycephalum. La séquence immédiatement adjacente en 5' au site d'insertion isolée du gène ARNr 28S humain ne contient pas l'ATG initiateur présent dans la région équivalente chez Physarum, et
(3) Les éléments appropriés à la maintenance du vecteur dans la cellule hôte pendant un temps suffisamment long pour permettre la transposition de la cassette d'intégration.
1. Construction de la cassette d'expression de IPpo.
Un fragment de 167 nucléotides contenant la région poly A de SV40 (Fitzgerald et Shenk, 1981, Cell, 24, 251-260) est synthétisé sous forme d'un fragment H/'/.dIII- EcoRI à l'aide d'un synthétiseur automatique (Milligen 7500). Un site Bglïl est introduit juste en amont du site EcoRI.
On isole un fragment Hindlll-BamHl de pMSG-CAT (Pharmacia) comprenant le promoteur précoce du virus SV40. On introduit le fragment synthétique H dlII-EcoRI et le fragment H/'/jdlII-Zto/wΗI dans un dérivé du vecteur pUC19 (Hindlll0) digéré par Bam l et EcoRI. Le dérivé est obtenu après digestion de pUC19 par HwdlII et traitement à la polymérase de T4. Le vecteur obtenu est désigné pSV40ΕI.
Un fragment d'ADN comportant la séquence codant pour la nucléase IPpo est isolé sous forme d'un fragment PCR. La séquence reportée dans l'art antérieur (Muscarella et al., 1990, Mol. Cell. Biol, 10, 3386-3396) a permis de définir deux amorces, qui sont respectivement décrites dans les SΕQ ID NO: 7 et 8. Les 2 oligonucléotides comportent un site HwdlII à leur extrémité 5'. L'amplification est effectuée dans les conditions standards connues de l'homme de métier à partir d'une banque d'ADN génomique de Physarum polycephalum, souche Carolina.
Le fragment PCR généré, après vérification sur gel d'agarose et séquençage, est digéré par HwdlII et introduit dans le site unique HwdlII du vecteur pSV40EI. On identifie un clone présentant une orientation correcte de la séquence codant pour IPpo vis à vis du promoteur SV40. Le clone est désigné pSV40EII.
2. Clonage de la cassette d'expression de l'endonucléase IPpo dans le vecteur pΗREII.
Le vecteur pΗREII est digéré par BgHΛ et traité à la polymérase de T4. Le vecteur pSV40EIl est digéré par les enzymes Psû et BgRl. Le fragment Pstl-BgHl comportant la cassette d'expression de IPpo, est traité à la nucléase de haricot Mung. Puis on ligue le fragment ainsi traité au vecteur pΗREII donnant lieu à pΗREIII.
3. Introduction de la cassette d'expression d'un fragment d'ADN d'intérêt dans l'intron 3.
La première cassette d'expression du fragment d'ADN d'intérêt comprend en séquence de 5' vers 3' respectivement :
(1) le promoteur TK du virus ΗSV,
(2) le gène néomycine, et
(3) la région polyA du virus SV40.
Le fragment Xho -Sall de 1,1 kb comprenant ladite cassette d'expression est isolé du plasmide pMClneo (Stratagène), est clone dans le vecteur pΗREIII linéarisé par Xhol. Le vecteur en résultant est désigné pΗRE IV.
4. Clonage dans un vecteur adénoviral et infection de cellules hôtes.
On isole du vecteur pΗREIV le fragment NΛel comprenant l'ensemble de transposition (intron 3 dans lequel est introduit la première cassette d'expression neo, flanqué des séquences adjacentes 5' et 3' du gène ARΝ 28S humain) et la deuxième cassette d'expression de IPpo. Le fragment purifié est traité à la polymérase de T4 avant d'être inséré dans le vecteur pXCX2 (Spessot et al., 1989, Virology, 168, 378-387).
Le vecteur en résultant est utilisé pour générer un adénovirus recombinant par les méthodes conventionnelles, comme par exemple, la méthode reportée dans Spessot et al. (1989, Virology, 168, 378-387). Le vecteur adénoviral recombinant est construit à partir d'un mutant de délétion de l'adénovirus de type 5 (Thimmappaye et al. 1982, Cell, 31, 543-551). Le vecteur adénoviral recombinant ainsi obtenu est utilisé pour infecter des cellules humaines en culture.
On cultive les cellules dans les conditions conventionnelles connues de l'homme de l'art. 48 heures après l'infection, les cellules sont placées dans un milieu de culture contenant de la néomycine.
La présence du gène neo dans les cellules peut être contrôlée par leur phénotype de résistance à la néomycine et vérifiée par Southern blot. L'insertion site-spécifique de la cassette d'intégration dans le génome cellulaire peut être vérifiée par PCR. On utilisera de préférence, une amorce complémentaire à une séquence du gène ARNr 28S humain non présente dans l'ensemble de transposition (en 5' de la position 2324 ou en 3' de la position 4438) et une amorce complémentaire à une séquence de la cassette d'intégration normalement non présente dans le génome cellulaire (par exemple de l'intron 3 ou de la cassette d'expression du gène neo). On obtiendra un fragment PCR d'une taille définie uniquement en cas d'intégration site-spécifique de la cassette d'intégration dans le gène ARNr 28S humain.
EXEMPLE 3 : Construction d'un vecteur plasmidique (épisomaP réplicatif pour l'intégration du gène néomycine dans le génome humain.
Le fragment Nhel de l'exemple 2.4 est inséré dans le vecteur pREP4 (Grager et al., 1989, Gène, 81, 385-294 ; Invitrogen Corporation, British Bio-Technology Products LTD, Oxon, UK ; référence V 004-50) au niveau du site unique Nλel.
Le vecteur en résultant est transfecté dans une lignée de cellules humaines en culture comme indiqué dans Yates et al. (1985, Nature, 313, 812-815). A titre indicatif, on mentionne la lignée 293, lignée de rein embryonnaire humain, disponible à l'ATCC. 48 heures après la transfection les cellules sont placées dans un milieu de culture sélectif. On vérifie la présence du gène neo intégré dans le génome cellulaire comme décrit dans l'exemple 2.4. LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: Transgene S.A.
(B) RUE: 11 rue de Molsheim
(C) VILLE: Strasbourg
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 67082
(G) TELEPHONE: (33) 88 27 91 00 (H) TELECOPIE: (33) 88 22 58 07
(ii) TITRE DE L* INVENTION: Ensemble de transposition destine au transfert d'un gène d'intérêt dans le génome d'une cellule eucaryote.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 8
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 44 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide de synthèse
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: GGGAAAAGCT TGCTAGCGGA TCTTGGTGGT AGTAGCAAAT ATTC 44
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 42 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide de synthèse (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: CCCCAAACTA GTTCTAGAGA GAGTCATAGT TACTCCCGCC GT 42
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide de synthèse
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: CCCCAAACTA GTAAGGTAGC CAAATGCCTC GTCATCT 37
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 48 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide de synthèse
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: AAAAGGGAAT TCGCTAGCAG ATCTCTGCTT CACAATGATA GGAAGAGC 48
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide de synthèse (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: TTTGGGGTAC CCACCCCCTT AAATATGGCG CTC 33
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 31 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide de synthèse
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: TTTGGGGTAC CGCTGATTCC AAACTCGGGT G 31
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide de synthèse
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: CCCCAAAGCT TAAACAAACC ACCGCATGGA 30
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 34 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: OUI
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: oligonucleotide de synthèse (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: CCCAAAAGCT TCAGTGCTCT GGATGTTAAA ATGG 34

Claims

Revendications
1. Un ensemble de transposition (1) destiné au transfert d'un fragment d'ADN d'intérêt (2) dans le génome d'une cellule hôte eucaryote, qui comprend une cassette d'intégration (3), essentiellement constituée d'un élément génétique mobile (4) au sein duquel est inséré ledit fragment d'ADN d'intérêt ; ladite cassette d'intégration étant capable de s'intégrer d'une façon site-spécifique dans un site d'insertion spécifique (5) situé dans l'ADN nucléaire ribosomal de ladite cellule hôte.
2. Un ensemble de transposition selon la revendication 1, dans lequel l'élément génétique mobile est sélectionné parmi le groupe comprenant les introns de classe I ou II et les rétroposons de classe RI, R2 ou R3.
3. Un ensemble de transposition selon la revendication 2, dans lequel l'élément génétique mobile est sélectionné parmi : l'intron 3 de Physarum polycephalum, souche Carolina, un fragment ou un variant dudit intron, l'intron mobile de classe I de Tetrahymena, un fragment ou un variant dudit intron, l'intron mobile de classe I de Pneumocystis carinii, un fragment ou un variant dudit intron, le rétroposon R2Bm de Bombyx mori, un fragment ou un variant dudit rétroposon et, le rétroposon R3 de Scaria coprophila, un fragment ou un variant dudit rétroposon.
4. Un ensemble de transposition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel l'élément génétique mobile comprend tout ou partie d'un cadre de lecture ouvert codant pour une intégrase.
5. Un ensemble de transposition selon la revendication 4, dans lequel le fragment d'ADN d'intérêt est inséré dans le cadre de lecture ouvert codant pour ladite intégrase.
6. Un ensemble de transposition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel le fragment d'ADN d'intérêt est susceptible d'être transcrit en ARN pour produire un ARN anti-sens ou après traduction dudit ARN, pour produire une protéine d'intérêt.
7. Un ensemble de transposition selon la revendication 6, dans lequel le fragment d'ADN d'intérêt est en outre placé sous le contrôle d'éléments appropriés permettant l'expression dudit fragment d'ADN dans la cellule hôte eucaryote.
8. Un ensemble de transposition selon la revendication 7, dans lequel les éléments appropriés comprennent un promoteur, ledit promoteur étant sélectionné parmi le groupe des promoteurs reconnus par l'ARN polymérase I et par l'ARN polymérase II.
9. Un ensemble de transposition selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, qui comprend en outre :
en 5' de la cassette d'intégration une région d'au plus lOkb (6), présentant au moins 80% d'homologie avec les séquences du gène ARNr de la cellule hôte immédiatement adjacentes en 5' audit site d'insertion ; et
en 3' de la cassette d'intégration une région d'au plus lOkb (7), présentant au moins 80% d'homologie avec les séquences du gène ARNr de la cellule hôte immédiatement adjacentes en 3' audit site d'insertion.
10. Un ensemble de transposition selon la revendication 9, qui comprend en outre :
en 5' de la cassette d'intégration une région d'au plus lOkb, présentant 100% d'homologie avec les séquences du gène ARNr de la cellule hôte immédiatement adjacentes en 5' audit site d'insertion ; et
en 3' de la cassette d'intégration une région d'au plus lOkb, présentant 100% d'homologie avec les séquences du gène ARNr de la cellule hôte immédiatement adjacentes en 3' audit site d'insertion.
11. Moyen d'introduction dans une cellule eucaryote d'un ensemble de transposition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.
12. Moyen d'introduction selon la revendication 11, sélectionné parmi les véhicules de délivrance de type liposomes et lipides cationiques synthétiques et les vecteurs de clonage et d'expression.
13. Moyen d'introduction selon la revendication 12, dans lequel ledit moyen d'introduction est un vecteur comprenant les éléments appropriés à sa maintenance dans la cellule hôte pendant un temps suffisamment long pour permettre le transfert de la cassette d'intégration dans la région d'insertion.
14. Moyen d'introduction selon la revendication 13, dans lequel le vecteur est un vecteur de type non-intégratif.
15. Moyen d'introduction selon la revendication 14, dans lequel le vecteur est un vecteur dérivé d'un adénovirus.
16. Moyen d'introduction selon l'une quelconque des revendications 1 1 à 15, dans lequel le vecteur contient en outre une cassette d'expression permettant la production de l'intégrase spécifique de l'ensemble de transposition.
17. Moyen d'introduction selon l'une quelconque des revendications 1 1 à 16, dans lequel le vecteur contient en outre une cassette d'expression permettant l'expression d'un gène de sélection.
18. Procédé in vitro de transfert d'un fragment d'ADN d'intérêt dans le génome d'une cellule hôte eucaryote au niveau de l'ADN nucléaire ribosomal, selon lequel on introduit dans ladite cellule hôte un ensemble de transposition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou un moyen d'introduction selon l'une quelconque des revendications 1 1 à 17.
19. Procédé selon la revendication 18, selon lequel on fournit en outre l'intégrase spécifique de l'ensemble de transposition à la cellule hôte.
20. Cellule eucaryote comprenant un ensemble de transposition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou un moyen d'introduction selon l'une quelconque des revendications 1 1 à 17.
21. Cellule eucaryote selon la revendication 20, selon laquelle ladite cellule est une cellule de mammifère.
22. Cellule eucaryote selon la revendication 21, selon laquelle ladite cellule est une cellule humaine.
23. Composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent thérapeutique, un ensemble de transposition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, un moyen d'introduction selon l'une quelconque des revendications 11 à 17 ou une cellule selon l'une quelconque des revendications 20 à 22, en association avec un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
24. Composition pharmaceutique selon la revendication 23, comprenant en outre une intégrase ou une cassette d'expression de l'intégrase.
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