JPH08508878A

JPH08508878A - 真核生物における遺伝子転移のためのトランスポジション・アセンブリー

Info

Publication number: JPH08508878A
Application number: JP6522836A
Authority: JP
Inventors: エリックヤコブス
Original assignee: トランスジーンソシエテアノニム
Priority date: 1993-04-16
Filing date: 1994-04-14
Publication date: 1996-09-24
Also published as: WO1994024300A1; FR2703996B1; AU686156B2; AU6571994A; US6346414B1; EP0694072A1; FR2703996A1; CA2160697A1

Abstract

(57)【要約】真核細胞のリボソーム核ＤＮＡに関心のあるＤＮＡフラグメントを転移するためのトランスポジション・アセンブリー。挿入手段、真核細胞、前記トランスポジション・アセンブリーを含む医薬組成物並びに前記ＤＮＡフラグメントをインビトロで転移するプロセスもまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】真核生物における遺伝子転移のためのトランスポジション・アセンブリー本発明は、関心のある遺伝子の、細胞または真核生物のゲノム中への転移（tr ansfer）を可能にするトランスポジション・アセンブリー（transposition asse mbly）に関する。そのようなアセンブリーは、遺伝子治療の目的に特に有用である。関心のある遺伝子の真核ゲノムへの組込み（integration）に活用され得る多くのエレメントが、従来技術の論文の中に記載された。慣用されているエレメントは、組込み型ベクター（integrative vector）、例えばレトロウィルスベクター、または非組込み型ベクター、例えばアデノウィルスベクターである。しかしながら、これらの従来技術のベクターは、利点を有するのみではない。事実、レトロウィルスベクターは、細胞ゲノム中に非特異的様式で、ランダムに組込まれる。従って、細胞に必須である遺伝子の不活性化、または腫瘍増殖を起こし得る腫瘍遺伝子の活性化、のいずれかに関連する挿入性突然変異誘発の危険性は、ヒトの遺伝子治療にその使用を企図する以前には、無視されることができない。非組込み型ベクターに関する限り、それらは、細胞ゲノム中へのそれらの非組込みを理由とする不安定性に関連する不利を被り、このことは、それらの定期的な繰り返しの投与を必須とさせる。人間に対して行うことを意図する遺伝子治療の枠組み内で、このことは長期的には、定期的に治療される患者において、組換えウィルスに対する免疫化の問題を生ずるという危険を生み出す。より最近記述された第３のタイプの方法は、相同組換えにより、関心のある遺伝子の、細胞ゲノムの定められた位置への転移を可能にする。しかしながら、相同組換えの技術は、再び、多くの技術的困難に直面する。さらに、非相同組換えの事象が同様に生じ、その結果、挿入性突然変異誘発の危険性が維持される。さらに、従来技術は長い間、真核生物におけるリボソームＤＮＡ（rDNA）の編制（organization）および発現のスキームを確立していた（Reeder、Trends Gen et．1990，6，390-395）。一般的に言うと、ｒＤＮＡは、対に編制された転写単位の複数コピーにより形成される。１つの転写単位は、リボソームの構成に加わる１８Ｓまたは１６Ｓ、５−８Ｓおよび２８Ｓまたは２６ＳｒＲＮＡをそれぞれコードする遺伝子（下記で、１８ＳｒＲＮＡ遺伝子などと称される）から構成される。各遺伝子は、その正確な役割が未だ明らかにされていない転写された配列により、次に続くものから分離される。転写単位の中に含まれる３つのｒＲＮＡ遺伝子は、１つの単位を次に続くものから分離する、非転写領域中の上流に位置するユニーク・プロモーター（unique promotor）の制御下に置かれている。ｒＲＮＡの単位は、ｒＲＮＡ前駆体（pre-rRNA）の長い分子中のＲＮＡポリメラーゼＩにより転写され、それは続いて成熟して、リボソーム・サブユニットに関連する３つの基本的タイプのｒＲＮＡを生ずる。多くの論文が、真核生物のｒＤＮＡ中に、外来性の遺伝要素（foreign geneti c elements）が頻繁に存在することを報告した。これらの遺伝要素の中で、クラスＩまたはIIのイントロン、および例えばクラスＲ１、Ｒ２またはＲ３のレトロポゾンが言及され得る。これらの外来性要素の存在は、ｒＤＮＡの転写単位の分画を可能な限り不活性化し得る。これは、それらを含む生物の生命に重大な帰結を有するようには見えない。この現象は、特に、ショウジョウバエ（drosophila）で記述された。クラスＩおよびIIのイントロンは、CechとBassにより定義された（1986，Annu ．Rev．Biochem 55，599-629）ようなクラスのそれぞれの特徴を示す構造的要素を形成する、保存された配列の存在により定義される。幾人かの著者が、クラスＩおよびIIの特定のイントロンが移動性（mobile）であることを観察した。それらは複製されることができ、それらを欠く（イントロン^-）遺伝子のコピー中に特異的に転移され得る。このトランスポジションのプロセスは、挿入位置の観点から、少なくとも大多数の場合、特異的であることが判明した。今までに特徴づけられた６０個ほどのクラスＩのイントロンの中で、大多数は、ミトコンドリアおよび葉緑体の遺伝子の中に局在している。従来技術は、３つのケースのみであるが、核の遺伝子中のクラスＩの移動性イントロンの存在について言及している。これらのイントロンは、下等な真核生物のｒＲＮＡ遺伝子の３種のレベルで証明され、それぞれ、テトラヒメナの幾つかの株の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子（KanとGall，1982，Nucl．Acids Res.，10，2809-2 821）およびフィサルム・ポリセファルム（Physarum polycephalum）のカロリナ（Carolina）株の２６ＳｒＲＮＡ遺伝子（MuscarellaとVogt，1989，Cell，56 ，443-454；この移動性イントロンは、下記でイントロン３と称されている）、および最後に、ニューモシスティス・カリニイ（Pneumocystis carinii）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（Edmanら、1988，Nature 334，519-522）においてである。今まで、高等な真核生物のｒＲＮＡ遺伝子に割り込むイントロンの存在を証明することはできなかった。 Physarum polycephalumのイントロン３は、最も特徴づけされている。その移動性は、実験的に証明された（MuscarellaとVogt，1989，Cell，56，443-454）。このイントロンは、１６０アミノ酸のタンパク質を一部分コードする（Muscar ellaら、1990，Mol．Cel．Biol.，10，3386-3396）。推定されている翻訳の開始コドンは、イントロンの上流、即ち、イントロンの５’末端に隣接するエクソン配列の３’末端に位置する。このイントロン３によってコードされるタンパク質は、挿入領域に存在する少なくとも１８塩基対（bp）の標的配列を認識するエンドヌクレアーゼであり、イントロン３の挿入部位のレベルでこの配列を正確に開裂することができる（MuscarellaとVogt，1989，Cell，56，44 3-454）。エンドヌクレアーゼにより認識される標的配列は、下記の配列を含む：イントロン３のトランスポジションは、イントロン３に特異的にコードされているエンドヌクレアーゼによる、特定の標的配列の認識によって開始され、その後、二本鎖ＤＮＡ分子をこの特定配列のレベルで切断し、こうして挿入部位を遊離させると想定される。次に、挿入部位の５’および３’末端のフランキング配列（flanking sequences）を含む繊維の交換、イントロン配列のコピーおよび組換えによって、イントロン３は、イントロン^-ｒＲＮＡ遺伝子のコピー中に、正確な部位特異的様式で挿入される。一旦、イントロン３がイントロン^-遺伝子のコピー中に挿入されると、エンドヌクレアーゼにより認識される標的配列は、以下のような様式のイントロン配列により割り込まれる：他方、レトロポゾンは、同様に、ある種の真核生物のｒＤＮＡ中に存在しているように見える。一般的に言うと、レトロポゾンは、特にそれらのヌクレオチド配列のレベルで、非常に大きく非常に不均一な（heterogeneous）群を形成する。レトロポゾンは、レトロウィルスに関連する要素で、長末端反復（LTR）を欠くものを意味すると理解されている。それらは、例えば、逆転写酵素のような、レトロウィルスのタンパク質と相同性を有するタンパク質をコードすることができる、１個以上のオープンリーディングフレームを含む（Jakubczakら、1991，P roc．Natl．Acad．Sci．USA，88，3295-3299）。一定の数の非哺乳動物の真核生物、特に昆虫において、挿入の顕著な特異性を有するレトロポゾンは、ｒＲＮＡ遺伝子のレベルに局在することが見い出された。これらの或るものの移動性が、観察された。幾つかのファミリー（特に、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３）が、ｒＲＮＡ遺伝子中へのそれらの特異的挿入部位のファンクション（function）として定義された。クラスＲ１およびＲ２のレトロポゾンは、ボンビクス・モリ（Bombyx mori）のレトロポゾンＲ１ＢｍおよびＲ２Ｂｍにより（XiongとEickbush、1988，C ell,55，235-246；XiongとEickbush、1988，Mol．Cell．Biol.，8，114-123；Xi ongら、1988，Nucl．Ac．Res.，16，10561-10573）、またドロソフィラ・メラノガスター（Drosophila melanogaster）のレトロポゾンＲ１ＤｍおよびＲ２Ｄｍ（Jakubczakら、1990，J．Mol．Biol.，212，37-52）により、特に説明されている。それらは、その中心的部分が、逆転写酵素ファミリーと相同性を有する大きなサイズのタンパク質をコードし得るオープンリーディングフレームを含む。Xi ongとEickbushは、Bombyx moriのレトロポゾンＲ２Ｂｍによってコードされるタンパク質が、さらにエンドヌクレアーゼ活性を有することを報告している（1988 ，Cell，55，235-246）。このヌクレアーゼは、昆虫ゲノムの２８ＳｒＲＮＡ遺伝子中に位置するＲ２Ｂｍの挿入領域に含まれる標的配列を、認識し開裂する。Ｒ３と称される、新規なクラスのリボソームのレトロポゾンが、最近証明された。この要素によりコードされるタンパク質は、未だ特徴づけらていない。しかしながら、スカリア・コプロフィラ（Scaria coprophila）のｒＤＮＡ中への、要素Ｒ３の特異的挿入領域が、記述された（Kerrebrockら、J．Mol．Biol.， 1989，210，1-13）。レトロポゾンに加えて、それらを記述する著者により時々レトロポゾンという名前の下に称された、多数の可動遺伝要素（mobile genetic elements）があるが、その中で、レトロウィルスタンパク質のファミリー、特に逆転写酵素と相同性を有するタンパク質をコードすると示されたものは未だなかった。このタイプの要素は、それらを含む生物のｒＲＮＡ遺伝子の十分に確定された配列のレベルに、等しく見い出された（例えば、Backら、1984，EMBO J.，3，2523-2529を参照）。驚くべきことに、一方で、そのデータが入手可能である２つの可動遺伝要素（Physarum polycephalumのイントロン３およびBombyx moriのレトロポゾンＲ２Ｂｍ）によりコードされるエンドヌクレアーゼによって認識される標的配列、および他方で、エンドヌクレアーゼをコードすると未だ示されておらず従来技術に開示された特定の可動遺伝要素の挿入領域（Jakubczakら、1991，Proc．Natl．Aca d．Sci．USA，88，3295-3299；PaskwitzとCollins、1989，Nucleic Acid Res．1 7，8125-8133；Kerrebrockら、1989，J．Mol．Biol.，210，1-13；KanとGall、1 9 82，Nucleic Acid Res.，10，2809-2821；Edmanら、1988，Nature，263，519-52 2）が、種々の哺乳動物、特にヒトおよびマウスのｒＲＮＡ遺伝子に保存されていることが現在見い出された。従って、テトラヒメナ、Pneumocystis cariniiおよびPhysarum polycephalumの移動性イントロン、およびBombyx moriのＲ２Ｂｍレトロポゾン、およびScaria coprophilaのＲ３の、挿入領域の配列は、哺乳動物のｒＲＮＡ遺伝子に同一に保存されている。他方、レトロポゾンＲ１ＤｍおよびＲ１Ｂｍの挿入領域の配列は、相同であるが、哺乳動物の２８ＳｒＲＮＡ遺伝子に存在する配列と同一ではない。結果として、本発明は、関心のあるＤＮＡフラグメントの真核宿主細胞への転移を意図したトランスポジション・アセンブリー（transposition assembly）に関し、該アセンブリーは、その中に関心のある該ＤＮＡフラグメントが挿入される可動遺伝要素により本質的に形成される組込みカセット（integration casset te）を含み；該組込みカセットは、該宿主細胞のリボソーム核ＤＮＡの中に位置する特異的挿入部位の中に、部位特異的様式で組込まれることが可能である。本発明によるトランスポジション・アセンブリーは、関心のあるＤＮＡフラグメントの、細胞ゲノムの確定された非必須領域中への組込みを可能にする利点を有する。そのようなアセンブリーは、遺伝子治療の目的に特に有用である。本発明の目的のために、組込みカセットは、それ自身を部位特異的メカニズムにより、核ｒＤＮＡの中に、特に２８Ｓ、１８Ｓまたは５−８ＳｒＲＮＡ遺伝子のレベルで組込む能力を有する、可動遺伝要素を含まねばならない。より正確には、この可動遺伝要素は、その配列が、宿主細胞の核ｒＤＮＡ中に同一または非同一の様式で保存されている挿入領域に位置する挿入部位中に、それ自身を組込まねばならない。より良い理解のために、用語「挿入部位」は、可動遺伝要素が挿入される、２個のヌクレオチドの間の場所を定義する、と明記される。同様に、「挿入領域」は、部位特異的トランスポジションに要求される挿入部位の５’および３’末端でのヌクレオチド配列を意味すると理解される。一般的に言うと、それぞれの可動遺伝要素は、それに特異的な挿入領域を有する。レトロポゾンＲ１ＢｍおよびＲ１ｄｍに関して上述したように、宿主細胞中の挿入領域は、同一の様式で、（起源である生物の）天然の挿入領域の配列を含むことは要求されない。従って、真核宿主細胞における該可動遺伝要素の挿入領域の配列は、天然の挿入領域の配列との、８０％より大きい、有利には９０％より大きい、および好ましくは９５％より大きい相同性を示す。可動遺伝要素は、クラスＩまたはIIの移動性イントロン、およびクラスＲ１Ｒ２またはＲ３のレトロポゾンのようなレトロポゾンの中から、有利に選択される。可動遺伝要素は、機能性フラグメントまたは該要素の変種（variant）により形成されることができる。機能性フラグメントは、完全な要素の組込まれる能力を保存した、あらゆるフラグメントを意味すると理解される。変種は、要素の天然のヌクレオチド配列に関して１つ以上の突然変異、特に、これらの突然変異が機能を変化させないという条件の下に、１つ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を含むことができる。より詳しくは、可動遺伝要素は、下記の中から選択される： −Physarum polycephalum、Carolina株のイントロン３、該イントロンのフラグメントまたは変種、 −テトラヒメナのクラスＩの移動性イントロン、該イントロンのフラグメントまたは変種、 −Pneumocystis cariniiのクラスＩの移動性イントロン、該イントロンのフラグメントまたは変種、 −Bombyx moriのレトロポゾンＲ２Ｂｍ、該レトロポゾンのフラグメントまたは変種および、 −Scaria coprophilaのレトロポゾンＲ３、該レトロポゾンのフラグメントまたは変種。この可動遺伝要素の中の、インテグラーゼをコードし得るオープンリーディングフレームの全部または一部の存在は、好ましい特徴である。一般的に言うと、インテグラーゼは、可動遺伝要素のトランスポジションに、特に真核細胞の核ｒＤＮＡ中のその挿入部位のレベルで、直接的または間接的に関与することを可能にする、酵素活性を有するタンパク質を意味するものとして理解される。有益には、インテグラーゼは、特に以下により形成されることができる：（１）それをコードする可動遺伝要素の挿入領域に含まれる、特定の標的配列を認識でき、かつ該標的配列を開裂できる、エンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質、または（２）逆転写酵素のファミリーと相同性を有するタンパク質。例えば、Physarum popycephalumのイントロン３により一部分コードされるエンドヌクレアーゼについて言及することができる。このエンドヌクレアーゼは、その標的配列を認識しＤＮＡ分子をこの特定配列のレベルで開裂するときに、イントロン３のトランスポジションを開始する。 Bombyx moriのレトロポゾンＲ２Ｂｍによりコードされるタンパク質について同様に言及することができる。該タンパク質のエンドヌクレアーゼ活性は、恐らく、その特定の挿入領域のレベルでのＲ２Ｂｍのトランスポジションに関連するが、そのメカニズムについては今日までわかっていない。関心のあるＤＮＡフラグメントは、遺伝子工学の慣用されている技術により、可動遺伝要素中に導入される（introduced）ことができる。それは、可能性のあるインテグラーゼをコードするオープンリーディングフレームの中または外側に、組込まれることができる。本発明の特に有利な局面によると、関心のあるＤＮＡフラグメントは、インテグラーゼの発現を妨げるように、オープンリーディングフレームに挿入される。これは、宿主細胞のゲノム中での、組込みカセットの制御不能な増殖を回避するために、安全面での特徴を導入する。この場合、本発明によるトランスポジション・アセンブリーに使用される可動遺伝要素の特異的インテグラーゼは、その特異的挿入領域中に組込みカセットのトランスポジションを可能にするのに十分な時間の間、一時的な（transitory）様式で、宿主細胞に供給されるべきである。タンパク質を真核細胞に途中で（in trans）供給する手段は、多数あり、当業者に公知である。例えば、本発明によるトランスポジション・アセンブリーは、ベクター（以下に定義されるような）中に導入されることができ、トランスポジション・アセンブリーに存在する可動遺伝要素の特異的インテグラーゼの発現カセットをさらに含む。別の様式では、真核宿主細胞は、インテグラーゼの発現カセットを含むヘルパーベクターと並行してトランスフェクトされることができるか、またはインテグラーゼは、精製された形態で宿主細胞に供給されることができる。関心のあるＤＮＡフラグメントは、病原性タンパク質への翻訳を阻害するように、アンチセンスＲＮＡ、例えば病原性転写物と二重らせん（duplex）を形成可能な病原性遺伝子の相補的ＲＮＡ配列を産生するためにＲＮＡに転写され得る、あらゆるフラグメントであることができる。病原性遺伝子とは以下のものである：（１）真核細胞に存在しない遺伝子、例えば、病原性生物（細菌、ウィルスまたは寄生生物）のゲノム中に存在する遺伝子、または（２）相同性遺伝子または突然変異した相同性遺伝子、例えば、腫瘍遺伝子であり、これは通常の真核細胞に存在するが通常には発現されず、その異常に誘導された発現は、癌のような疾患を引起こすことができる。それに代わる様式では、関心のあるＤＮＡフラグメントは、関心のあるタンパク質および、好ましい様式では、その発現の不存在または異常な量もしくは突然変異形態での発現が遺伝子的疾患と関連する、タンパク質をコードすることができる。関心のあるＤＮＡフラグメントは、成熟タンパク質またはこれの前駆体をコードすることができる。最初のケースでは、それは、タンパク質の発現を細胞中の様式で発現可能にする、成熟タンパク質をコードする配列を含む。最後のケースでは、関心のあるＤＮＡフラグメントは、宿主細胞の前記タンパク質の分泌を可能にするシグナル配列を同様に含むことができる。関心のあるＤＮＡフラグメントは、起源が様々な配列を融合して生ずるキメラタンパク質をコードすることができる。関心のあるＤＮＡフラグメントによりコードされ得るタンパク質の例は、以下ものを含む： −サイトカイン、例えば、αインターフェロン、γインターフェロンおよび種々のタイプの成長因子、 −膜レセプター、例えば、細胞の表面から内部にシグナルを伝達するのに関連するレセプター、および病原性生物により認識されるレセプター、例えば、Ｔリンパ球の表面に存在し、ＨＩＶウィルス（ヒト免疫不全ウィルス）のエンベロープ糖タンパク質により認識されるＣＤ４レセプター、 −酵素、例えば、単純ヘルペスウィルスＩ型（ＨＳＶ−１）のリボヌクレアーゼおよびチミジンキナーゼ（ＴＫ）。後者は、哺乳動物細胞のＴＫ酵素に関しヌクレオシドの特定のアナログ、例えばアシクロビア（acyclovir）またはガンシクロビア（gancyclovir ）に対し優れた親和性を有する。酵素ＴＫ−ＨＳＶ−１は、これらのアナログをヌクレオチドの前駆体に転換する。これらの毒性な前駆体は、次に、細胞のＤＮＡ中に、複製の状態で組込まれる（incorporated）。この組込みは、癌細胞のような分裂している細胞（cells in division）を、特異的に殺させる。 −酵素活性の阻害剤、例えば、α１アンチトリプシン、アンチトロンビンIII 、プロテインＣおよび病原性生物の特異的なプロテアーゼ阻害剤、 −凝固因子、例えば、因子VIII、因子IXおよびトロンビン、 −イオンチャンネルに関わるタンパク質、例えば、プロテインＣＦＴＲ（嚢胞性線維症トランスメンブレン・コンダクタンス・レギュレイター（Cystic Fibro sis Transmembrane Conductance Regulator））、 −病原性遺伝子により産生されるタンパク質の活性を阻害し得るタンパク質、例えば、腫瘍抑制抗原ｐ５３、 −生物学的機能を変化させるために突然変異された病原性タンパク質の変種（variants）、例えば、標的配列に連結（linkage）するための天然ウィルスタンパク質と競合し、ウィルス遺伝子の発現活性を阻害し得る、ＨＩＶウィルスの調節タンパク質ＴＡＴのトランスに優性な突然変異体（transdominant mutants）および、 −宿主細胞の免疫を増大させる抗原性エピトープ。関心のあるＤＮＡフラグメントは、生物学的性質が修飾されている関心のあるタンパクを発現させるために突然変異され得る。例えば、活性部位の３５８位のメチオニン残基がロイシンで置換されているα₁抗トリプシンの変種である。そのような変種は、炎症条件のような酸化条件において機能しうる。いったん組込みカセットが宿主細胞のｒＤＮＡに導入されると、関心のあるＤＮＡフラグメントは、宿主細胞のｒＤＮＡの転写ユニットのプロモーターの依存下に置かれる。或いは、関心のあるＤＮＡフラグメントは、可動遺伝要素に挿入された適当な発現要素の制御下に置かれ得る。発現はここにおいてＲＮＡへの転写及び／又は、該ＲＮＡのタンパクへの翻訳を意味する。上記代替方法によると、発現の制御要素は特に、適当なプロモーターを有する。このようなプロモーターは当業者に良く知られており、通常の遺伝子工学の手法によって関心のあるＤＮＡフラグメントの上流に挿入される。保持されているプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩによって認識されるプロモーターであってもよく、それは真核宿主細胞のｒＲＮＡ遺伝子への組込みカセットの組込みの後、関心のあるＤＮＡフラグメントの発現を有利にするためである。例えば、関心のあるＤＮＡフラグメントは、ｒＲＮＡ遺伝子の転写に関係するｒＤＮＡの転写されない領域に包含される調節要素の制御下に置かれ得る。その様なプロモーターは保持されている真核宿主細胞において機能しうるように選択されるであろう。代替方法において、保持されているプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼIIに認識されるプロモーターであり得る。そのようなプロモーターは、当業者に良く知られている。該プロモーターは、細胞の遺伝子から、又はウイルスから単離され得る。それは遍在性であり、全ての種類の宿主細胞において関心のあるＤＮＡフラグメントを恒常的に発現させる。プロモーターという用語は、調節可能なプロモーターを同様に含み、例えば、組織特異的プロモーターである。ＨＭＧ遺伝子（ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａリダクターゼ）、ＨＳＶ−１ウイルスのＴＫ遺伝子及びＳＶ４０ウイルス（シミアンウイルス４０）のプロモーター、アデノウイルスのプロモーターＥＩＩＩ及びＭＬＰ（主要後期プロモーター（ＭａｊｏｒＬａｔｅＰｒｏｍｏｔｅｒ））、ＭｏＭｕＬＶウイルス（モロニーマウス白血病ウイルス）のＬＴＲ、肝特異的発現を与えるＦＩＸ遺伝子のプロモーター又はリンホサイト細胞の特異的免疫グロブリン遺伝子のプロモーターに特に言及することができる。有利な態様において、上記トランスポジション・アセンブリーはさらに要素の組込みカセットを包含し、それは該カセットの部位特異的組込みをさせる、又は有利にする。本発明の特徴的な態様によると、特に、用いられる可動遺伝的要素がクラスＩ又はIIの可動イントロンであるとき、本発明によるトランスポジション・アセンブリーはさらに以下のことを包含する： −組込みカセットの５’末端における多くて１０ｋｂの領域、前記挿入部位の５’末端のすぐ近くに隣接した宿主細胞のｒＲＮＡ遺伝子の配列と少なくとも８０％の相同を有する；及び −組込みカセットの３’末端における多くて１０ｋｂの領域、前記挿入部位の３’末端のすぐ近くに隣接した宿主細胞のｒＲＮＡ遺伝子の配列と少なくとも８０％の相同を有する。実際、前記組込みカセットをｒＤＮＡ環境に配置することは有利であり得、特に、示してきたように、トランスポジションが特にイントロン３に対するストランドの交換現象を有するとき有利であり得る。ストランドの交換は、（トランスポジション・アセンブリーの）イントロン⁺ドナー配列及び（宿主細胞の）イントロン^-レシピエント配列を包含する。組込みカセットのみが、宿主細胞のゲノムにトランスポジションされるであろう。挿入部位の５’及び３’末端のすぐ近くに隣接したｒＲＮＡ遺伝子の配列が、唯一トランスポジションの段階において介在する。組込みカセットのトランスポジションを有利にするために、ストランド交換に関係するドナー及びレシピエント配列間に完全な相同を有することが好ましい。従って、好ましいトランスポジション・アセンブリーは、さらに以下のことを包含するであろう： −組込みカセットの５’末端における多くて１０ｋｂの領域、前記挿入部位の５’末端のすぐ近くに隣接した宿主細胞のｒＲＮＡ遺伝子の配列と１００％の相同を有する；及び −組込みカセットの３’末端における多くて１０ｋｂの領域、前記挿入部位の３’末端のすぐ近くに隣接した宿主細胞のｒＲＮＡ遺伝子の配列と少なくとも１００％の相同を有する。挿入部位の５’及び３’末端のすぐ近くに隣接するｒＲＮＡ遺伝子の配列は、遺伝子工学の伝統的な技術、例えば、クローニング、又はＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）又は、化学的合成によって単離される。さらに詳細には、これら配列は、多くて１０ｋｂ、有利には多くて３ｋｂ、及び好ましくは多くて０．４ｋｂの長さを有するであろう。本発明は、同様に本発明に従うトランスポジション・アセンブリーを真核細胞に導入する手段に関する。核酸を真核細胞に導入することを含むこのような手段は、当業者に一般に知られている。本発明の目的のために、本発明によるトランスポジション・アセンブリーは、リポソームの送達媒体及び合成カチオン性リピッドタイプ（synthetic cationic lipid type）及び真核細胞において伝統的に用いられているクローニング及び発現ベクターの中から選択された導入手段によって導入される。送達媒体中へのカプセル化、及びベクターにおけるクローニングの技術は、当業者にとって公知の古典的技術である。しかしながら、核酸を細胞に導入させることのできる他のプロトコルが同様に使用され得る。例えばリン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥデキストラン技術、核酸の細胞への直接の注入又は動物の細胞における核酸に覆われた金の微粒子のボンバードが挙げられる。該核酸は、超らせん、環状又は鎖状の形態で導入される。有利には、本発明に記載の導入手段は、挿入領域に組込みカセットを転移させるのに充分な時間、宿主細胞の中に自身を保持するための適当な要素を有するベクターである。そのようなベクターは、高等な真核細胞に入ること、好ましくは染色体外の形態を維持すること、及び宿主細胞のゲノム中への組込みカセットのトランスポジションをさせるのに充分な時間、細胞中に保持されることが可能でなくてはならない。そのようなベクターは、プラスミド又は、ウイルスベクターの形態で存在し得る。好ましくは、本発明に記載の導入手段は、非組込み型のベクターである。単純ヘルペスウイルス又はアデノウイルスに由来するベクターに言及することが可能である。特に好ましくは、本発明に記載の導入方法は、例えばタイプ５アデノウイルスのようなアデノウイルスに由来するベクターである。有利な方法によると、及び上記から想起されるように、本発明に記載の導入手段は、トランスポジション・アセンブリーの特異的インテグラーゼを生成させる発現カセットをさらに包含し得る。そのような発現カセットは、該インテグラーゼをコードするＤＮＡフラグメントを含み、その発現をさせる適当な要素の制御下に置かれる。その発現をさせる適当な要素は、該ＤＮＡフラグメントのメッセンジャーＲＮＡへの転写及びメッセンジャーＲＮＡのタンパクへの翻訳をさせる全ての要素を意味すると理解される。これら要素は、特に適当なプロモーターを有し、好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼIIによって認識され、強力かつ、遍在的な発現を許すプロモーター、例えばプロモーターＳＶ４０を含む。本発明に記載の導入手段は、さらに、前記の導入手段を包含し宿主細胞の検出及び単離をさせる選択遺伝子の発現をさせる発現カセットを有し得る。本発明の枠組みより、選択マーカーをコードする遺伝子は、上記のように定義された、宿主細胞においてその発現をさせる適当な要素の制御下に存在し得る。本発明は、同様にリボソーム核ＤＮＡのレベルにおける、関心のあるＤＮＡフラグメントの真核宿主細胞のゲノム中へのインビトロでの転移プロセスに関する。それに従い、本発明に記載のトランスポジション・アセンブリー又は本発明に記載の導入手段は、該宿主細胞中に導入される。有利には、本発明に記載のトランスポジション・アセンブリーの特異的なインテグラーゼをさらに本発明に記載のインビトロのプロセスにおいて宿主細胞に供給することが可能である。本発明は、同様に本発明に記載のトランスポジション・アセンブリーを包含する真核細胞または本発明に記載の導入手段に関する。該細胞は、哺乳類の細胞、好ましくはヒトの細胞であると有利である。本発明は、同様に治療薬として本発明に記載のトランスポジション・アセンブリー、本発明に記載の導入手段又は本発明に記載の細胞を薬学的観点から許容されるキャリアーとともに包含する医薬組成物に関する。本発明に記載の医薬組成物は、特に以下のような疾患の予防的な又は治療的な処置のためのものである： −例えば、血友病又は膵臓線維症のような遺伝的疾患、 −例えば、腫瘍遺伝子又はウイルスによって誘導されたガン、 −例えば、エイズ（後天性免疫不全症候群）のようなレトロウイルス疾患、及び −例えば、ヘルペスウイルスが原因のウイルス性の感染のような再発性ウイルス疾患。本発明に記載の医薬組成物は、通常の方法によって製造できる。特に、治療剤の薬学的に有効な量は、希釈剤のようなサポート（support）と結合される。本発明に記載の組成物は、当該技術分野において用いられているどのような通常の経路によっても投薬され得、特に皮下経路、筋肉内経路、静脈内の経路又は気管内の経路によってなされる。投薬は、１回の投与量において、又は一定の時間間隔の後１回又はそれ以上の回数繰り返されて起こり得る。投与経路及び適当な投与量は、例えば治療される個体又は関心のあるＤＮＡフラグメントといった様々なパラメーターの関数として変化する。医薬組成物は、さらに薬学的観点から許容されるアジュバントを包含し得る。有利には、本発明に記載の医薬組成物は、さらにインテグラーゼ又はインテグラーゼ発現カセットを包含する。本発明は、同様に本発明に記載のトランスポジション・アセンブリー、本発明に記載の導入手段又は本発明に記載の細胞が、そのような治療を必要としている患者に投与される治療方法にも拡張される。本発明は、図１を参照して以下に明らかにされ、図１は、概略的に５’から３ ’までに：挿入部位（５）（実線）の５’末端におけるｒＲＮＡ遺伝子の配列（６）（ハッチングされた箱）、その中に関心のあるＤＮＡのフラグメント（２）（点刻された箱）が挿入された可動遺伝要素（４）（水平に線を引かれた箱）により形成される組込みカセット（３）（小さな空白の箱）および挿入部位（５）の３’末端におけるｒＲＮＡ遺伝子（７）（ハッチングされた箱）を包含するトランスポジション・アセンブリー（１）（大きな空の箱）を図解的に示す。実施例：実施例１：Physarum polycephalum Carolina株のイントロン３を用いるヒト細胞の２８ＳｒＲＮＡ遺伝子への部位特異的組込みのためのトランスポジション・アセンブリーの構築本実施例は、以下のものを含むトランスポジション・アセンブリーに関する：（１）イントロン配列中にユニーク制限部位XhoＩを作製するために修飾されたイントロン３。該部位XhoＩは、いかなる関心のあるＤＮＡフラグメントであっても導入されることが可能であろう。事実、関心のあるＤＮＡフラグメントは、XhoＩ消化により生じる末端と適合性のある粘着末端を有するように単離される（制限フラグメントXhoＩ又はSalＩまたはXhoＩ-SalＩ、或いはXhoＩ及び／又はSalＩリンカーの付加、或いは要求される部位XhoＩ及び／又はSalＩを創製するために向けられた突然変異）。或いは、クローニング部位XhoＩは、例えば、その間に遊離末端（free end）を有する関心のあるあらゆるＤＮＡフラグメントをクローン化できる遊離末端を得るためにヤエナリ（Mung bean）ヌクレアーゼで処理することができる。イントロン３を含む０．９４ｋｂのＤＮＡフラグメントが、特にクローニング又はＰＣＲ、あるいは化学的に合成されることにより単離され得る、及び（２）イントロン３の挿入部位の５’及び３’末端のすぐ近くに隣接する配列。これらの配列は、完全に保存されたイントロン３の挿入領域を含むヒト２８ＳｒＲＮＡ遺伝子から単離される。移動性イントロンは、かくしてｒＤＮＡ環境中に置かれる。ストランドの交換は、どの２つ（組込みカセットのドナー配列及びヒト宿主細胞のレシピエント配列（recipient sequence））もヒト起源であるので、完全に相同な配列を含むであろう。５’及び３’末端のすぐ近くに隣接する該配列は、特にクローニング又はＰＣＲ、あるいは化学的に合成されることにより単離され得る。１．２８ＳヒトｒＲＮＡ遺伝子から始まるイントロン３の挿入音位の５’及び３ ’末端のすぐ近くに隣接する配列のＰＣＲによるクローニングプライマーは、ＤＮＡスター・ドナー・バンク（DNAstar donor bank）（リファレンス：ＨＵＭＲＧＭ、＋１位から＋５０２５位にわたる報告された配列）に含まれるヒト２８ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の補助により定義された。イントロン３の挿入部位及び挿入領域は、局在している（Muscarella及びVogt，1989，Ce ll，56，443-454）。挿入部位は、ヒト２８ＳｒＲＮＡ遺伝子の３７４２及び３７４３のヌクレオチドの間に含まれる。ヒト２８ＳｒＲＮＡ遺伝子の２３２４位〜３７４２位にわたるフラグメントに相当するＤＮＡの第一のフラグメントは、ＰＣＲにより生産される。コード化ストランドに相当するプライマー（位置２３２４〜２３４９）は、配列番号１に報告される。それは、さらにHind IIIおよびNhe Ｉ部位を運ぶ遊離の５’末端を含む。リバース・プライマーは、配列番号２に記載され、Spe Ｉ及びXba Ｉ部位を含む５’末端を包含する。増幅は、製造元により指示された標準条件に従いテルムス・アクアティクス（Thermus Aquaticus）（パーキン・エルマー・シータス（Perkin Elmer Cetus））のポリメラーゼを用いて行われる。使用されるマトリクスは、慣用的に調製されるヒトＤＮＡである。増幅産物は、アガロースゲル上で調ベられ、配列決定される。ヒト２８ＳｒＲＮＡ遺伝子の第二のフラグメントは、同様にＰＣＲにより単離される。それは、位置３７４３〜４４３８にわたる遺伝子の一部である。使用された２つのオリゴヌクレオチドが、配列番号３及び４に報告されている。第一のプライマーは、その５’末端においてSpe Ｉ部位を含み、一方リバース・プライマーは、５’から３’にEcoRＩ，Nhe ＩおよびBg l II部位を含む。増幅反応は、専門家により現在用いられている標準的な条件下に慣用的に調製されるゲノムヒトＤＮＡから始めて行われる。かくして得られたＰＣＲフラグメントは、アガロースゲル上で調べられ、配列決定される。イントロン３の挿入部位の５’末端のすぐ近くに隣接する１ｋｂのヒト配列を含む該フラグメントは、酵素Hind III及びSpe Ｉにより消化される。３’のすぐ近くに隣接する配列を含む該フラグメントは、Spe ＩおよびEcoRＩで消化される。この２つのフラグメントは、次いで、事前にHind IIIおよびEcoRＩで消化されたプラスミドｐＵＣ１９中に連結される（Yanisch-Perronら，1985，Gene，33， 103-119）。連結混合物は、プラスミドｐＨＲＥＩを生じさせる株大腸菌５Ｋ（E ．coli ５K）中に形質転換される。２．修飾されたPhysarum polycephalumのイントロン３のクローニングイントロン３（０．９４ｋｂ）をＰＣＲ技術により単離する。プライマーは、文献（Muscarellaら，1990，Mol Cell．Biol.，10，3386-3996；Johansenら，19 92，Curr．Genet.，22，297-304）に報告された配列データから始めて確定される。該プライマーは、配列番号５及び６に記載される。これらは両方ともその５ ’領域でKpnＩ部位を含む。増幅反応は、専門家に知られている標準的な条件を適用し、Physarum polycep halum 、Carolina株（Muscarella及びVogt，1989，Cell，56，443-454）のゲノムＤＮＡバンクから始めて行われる。増幅後、得られたフラグメントのサイズはアガロースゲル上でチェックされ、配列が調べられる。該ＰＣＲフラグメントは、KpnＩで消化され、ベクターｐＵＣ１９のKpnＩ部位でクローン化されてｐＩＮＥＩを得る。該ベクターｐＩＮＥＩは、NheＩによりPhysarum polycephalumのイントロン３に位置するユニーク部位で消化される。直鎖状にされたｐＩＮＥＩベクターは、ヤエナリ（Mung bean）ヌクレアーゼで処理され、XhoＩリンカー（ストラタジーン（Stratagene））に連結される。これから得られたベクターは、ｐＩＮＥＩＩと名付けられ、従って、関心のあるＤＮＡのフラグメントの挿入のためのユニークXhoＩ部位を含む。３．Physarum polycephalumのイントロン３（XhoＩ）のヒト２８ＳｒＲＮＡ遺伝子環境への挿入ｐＩＮＥＩＩの消化により得られるフラグメントKpnＩは、Ｔ４ポリメラーゼで処理され、その５’及び３’末端が正確にイントロンのそれに相当するその末端を含むフラグメントを得る。並行して、ｐＨＲＥＩは酵素XbaＩおよびSpeＩにより消化され、次いでヤエナリ（Mung bean）ヌクレアーゼで処理される（Sambrookら，1989，Cold Spring H arbor Pressに報告された技術に従う）。これはベクターｐＨＲＥＩの主要部を含む大きなフラグメントを生産し、その遊離末端は、各々ヒト２８ＳｒＲＮＡ遺伝子の位置３７４２および３７４３のヌクレオチドに相当する。 Physarum polycephalumのイントロン３を含むｐＩＮＥＩＩから形成されるフラグメントは、上記のようにして処理されたベクターｐＨＲＥＩに連結され、ベクターｐＨＲＥＩＩを得る。関心のあるＤＮＡのフラグメントの導入後、ベクターｐＨＲＥＩは組込みカセット（関心のあるＤＮＡフラグメントを含むイントロン３）のヒト２８ＳｒＲＮＡ遺伝子への挿入を可能にするトランスポジション・アセンブリーを含む。実施例２：ヒトゲノムへのネオマイシン遺伝子の組込みのためのアデノウイルスベクターの構築以下のものを含むアデノウイルスベクターが構築される：（１）そのレベルで、ネオ遺伝子（neo gene）の発現を可能にする第一発現カセットを導入するPhysarum polycephalum（Xho⁺）のイントロン３、（２）第二発現カセット、部位特異的エンドヌクレアーゼＩＰｐｏのそれであり、イントロン３により一部分がコードされる。第二発現カセットは、組込みカセットの宿主細胞ゲノムへのトランスポジションを可能にするのに十分に長い時間エンドヌクレアーゼＩＰｐｏの産生を許容するであろう。ＩＰｐｏの翻訳の開始コドンは、Physarum polycephalumの２６ＳｒＲＮＡ遺伝子中のイントロン３の５’末端のエクソン配列に位置する。ヒト２８ＳｒＲＮＡ遺伝子の単離された挿入部位に５’末端ですぐ近くに隣接する配列は、Physarumの同等な領域に存在するＡＴＧ開始点（initiator）を含まない、及び（３）組込みカセットのトランスポジションを許容するのに十分長い時間宿主細胞中でベクターを維持するための適当な要素。１．ＩＰｐｏの発現カセットの構築ＳＶ４０のポリＡ領域を含む１６７ヌクレオチドのフラグメント（Fitzgerald 及びShenk，1981，Cell，24，251-260）が、自動合成機（Milligen 7500）の助けによりHindIII-EcoRＩフラグメントの形態で合成される。BglII部位は、EcoR Ｉ部位のすぐ上流に導入される。ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターを含むpMSG-CAT（ファルマシア）のHind III-BamHＩフラグメントが、単離される。HindIII-EcoRＩ合成フラグメント及び HindIII-BamHＩフラグメントは、BamHＩ及びEcoRＩにより消化されたベクターｐＵＣ１９の誘導体（HindIII⁰）に導入される。該誘導体は、HindIIIによるｐＵＣ１９の消化およびＴ４ポリメラーゼで処理された後に得られる。得られたベクターはｐＳＶ４０ＥＩと名付けられる。ヌクレアーゼＩＰｐｏをコードする配列を含むＤＮＡフラグメントは、ＰＣＲフラグメントの形態で単離される。従来技術で報告された配列（Muscarellaら，1990，Mol．Cell．Bio l.，10，3386-3396）は、各々配列番号７及び８に記載される定義された２つのプライマーを与える。２つのオリゴヌクレオチドは、その５’末端にHindIII部位を含む。増幅はPhysarum polycephalum、Carolina株のゲノムＤＮＡバンクから開始し、専門家に知られた標準条件下に実行される。得られたＰＣＲフラグメントは、アガロースゲル上で調べられ、配列決定された後、HindIIIにより消化されベクターｐＳＶ４０ＥＩのユニークHindIII部位に導入される。プロモーターＳＶ４０に関し、ＩＰｐｏをコードする配列の正確な配向を有するクローンが同定される。該クローンはｐＳＶ４０ＥＩＩと名付けられる。２．ベクターｐＨＲＥＩＩ中のエンドヌクレアーゼＩＰｐｏの発現カセットのクローニングベクターｐＨＲＥＩＩは、BglIIにより消化され、Ｔ４ポリメラーゼで処理される。ベクターｐＳＶ４０ＥＩＩは、酵素PstＩおよびBglIIにより消化される。ＩＰｐｏの発現カセットを含むフラグメントPstＩ-BglIIフラグメントは、ヤエナリ（Mung bean）ヌクレアーゼで処理される。かくして処理されたフラグメントは、ベクターｐＨＲＥＩＩに連結されてｐＨＲＥＩＩＩを生成する。３．イントロン３への関心のあるＤＮＡフラグメントの発現カセットの導入関心のあるＤＮＡのフラグメントの第一発現カセットは、各々５’から３’の配列中に以下のものを含む：（１）ＨＳＶウイルスのＴＫプロモーター（２）ネオマイシン遺伝子、及び（３）ＳＶ４０ウイルスのポリＡ領域。前記発現カセットを有する1.1kbのXhoＩ-SalＩフラグメントは、プラスミドｐＭＣｌネオ（ストラタジーン）から単離され、XhoＩにより直鎖状にされたベクターｐＨＲＥＩＩＩ中にクローン化される。この結果得られるベクターは、ｐＨＲＥＩＶと名付けられる。４．アデノウイルスベクターのクローニング及び宿主細胞の感染トランスポジション・アセンブリー（ヒト２８ＳｒＲＮＡ遺伝子の隣接する５’及び３’配列により隣接された第一ネオ発現カセットが導入されたイントロン３）を含むNheＩラグメント及びＩＰｐｏの第二発現カセットがｐＨＲＥＩＶベクターから単離される。精製されたフラグメントは、ベクターｐＸＣＸ２に挿入される前にＴ４ポリメラーゼで処理される（Spessotら，1989，Virolog y，168，378-387）。この結果得られたベクターは、常法、例えばSpessotら（1989，Virology，168 ，378-387）に報告された方法により組換えアデノウイルスを生産するのに使用される。該組換えアデノウイルスベクターは、タイプ５アデノウイルスの欠失突然変異（thimmappayeら，1982，Cell，31，543-551）から始めて構築される。かくして得られた組換えアデノウイルスベクターは、培養中のヒト細胞を感染するのに使用される。該細胞は、当業者に知られた通常の条件下に培養される。感染の４８時間後、細胞はネオマイシンを含む培養培地中に置かれる。細胞中のネオ遺伝子の存在は、ネオマイシンに対する耐性表現型によりチェックされ、サザンブロットにより調べられる。細胞性ゲノムへの組込みカセットの部位特異的挿入は、ＰＣＲにより調べることができる。トランスポジション・アセンブリー（位置２３２４の５’末端又は位置４４３８の３’末端）中に存在しないヒト２８ＳｒＲＮＡ遺伝子配列に相補性のプライマー及び細胞性のゲノム中に通常存在しない組込みカセット（例えば、イントロン３又はネオ遺伝子の発現カセット）の配列に相補性のプライマーが好適に使用されるであろう。ユニークに定められたサイズのＰＣＲフラグメントが、組込みカセットのヒト２８ＳｒＲＮＡ遺伝子への部位特異的組込みの場合に得られるであろう。実施例３：ネオマイシン遺伝子をヒトゲノムに組み込むための複製（エピソーム）プラスミドベクターの構築実施例２．４のNheＩフラグメントが、ユニークNheＩ部位のレベルでｐＲＥＰ４ベクター（Gragerら，1989，Gene，81，385-294；Invitrogen Corporation，B ritish Bio-Technology Priducts LTD，Oxon，UK；reference V 004-50）に挿入される。この結果得られたベクターは、Yatesら（1985，Nature，313，812-815）に示されたように培養中のヒト細胞株にトランスフェクトされる。表示能力（indica tive capacity）において、ＡＴＣＣ．から入手できる胚ヒト腎臓株（embryonic human kidney line）、２９３株が言及され、トランスフェクトの４８時間後に、該細胞は選択培養培地中に置かれる。細胞ゲノム中に組み込まれたネオ遺伝子の存在は、実施例２．４に記載されたように証明される。配列表（１）一般的情報：（ｉ）出願人（A）名前：トランスジーンソシエテアノニム（B）ストリート：１１リュドゥモルシャイ（C）シティ：ストラスブール（E）国：フランス国（F）郵便番号：６７０８２（G）電話番号：（33）88 27 91 00 （H）ＦＡＸ番号：（33）88 22 58 07 （ｉｉ）発明の名称：真核細胞のゲノム中に関心のある遺伝子を転移するためのトランスポジション・アセンブリー（ｉｉｉ）配列の数：８（ｉｖ）コンピュータ・リーダブル・フォーム（A）メディウムタイプ：テープ（B）コンピュータ：ＩＢＭＰＣコンパティブル（C）オペレーティングシステム：PC-DOS/MS-DOS （D）ソフトウエア：パテントインリリース＃1.0 バーション＃1.25（OEB）（２）配列番号：１の情報（ｉ）配列の特徴（A）長さ：４４塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：１本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ（iii）アンチセンス：Ｎｏ（vi）起源：（A）生物名：合成オリゴヌクレオチド（xi）配列：配列番号：１（２）配列番号：２の情報（ｉ）配列の特徴（A）長さ：４２塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：１本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ（iii）アンチセンス：Ｙｅｓ（vi）起源：（A）生物名：合成オリゴヌクレオチド（xi）配列：配列番号：２（２）配列番号：３の情報（ｉ）配列の特徴（A）長さ：３７塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：１本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ（iii）アンチセンス：Ｎｏ（vi）起源：（A）生物名：合成オリゴヌクレオチド（xi）配列：配列番号：３（２）配列番号：４の情報（ｉ）配列の特徴（A）長さ：４８塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：１本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ（iii）アンチセンス：Ｙｅｓ（vi）起源：（A）生物名：合成オリゴヌクレオチド（xi）配列：配列番号：４（２）配列番号：５の情報（ｉ）配列の特徴（A）長さ：３３塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：１本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ（iii）アンチセンス：Ｎｏ（vi）起源：（A）生物名：合成オリゴヌクレオチド（xi）配列：配列番号：５（２）配列番号：６の情報（ｉ）配列の特徴（A）長さ：３１塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：１本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ（iii）アンチセンス：Ｙｅｓ（vi）起源：（A）生物名：合成オリゴヌクレオチド（xi）配列：配列番号：６（２）配列番号：７の情報（ｉ）配列の特徴（A）長さ：３０塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：１本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ（iii）アンチセンス：Ｎｏ（vi）起源：（A）生物名：合成オリゴヌクレオチド（xi）配列：配列番号：７（２）配列番号：８の情報（ｉ）配列の特徴（A）長さ：３４塩基対（B）型：核酸（C）鎖の数：１本鎖（D）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ＤＮＡ（genomic）（iii）ハイポセティカル：Ｎｏ（iii）アンチセンス：Ｙｅｓ（vi）起源：（A）生物名：合成オリゴヌクレオチド（xi）配列：配列番号：８

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．真核宿主細胞のゲノムに関心のあるＤＮＡフラグメント（２）を転移するためのトランスポジション・アセンブリー（１）であって、その中に関心のある前記ＤＮＡフラグメントが挿入された可動遺伝要素（４）により実質的に形成される組込みカセット（３）を含み；前記組込みカセットが、前記宿主細胞のリボソーム核ＤＮＡ中に位置する特異的挿入部位（５）に部位特異的様式で組み込まれることができるトランスポジション・アセンブリー。２．可動遺伝要素が、クラスＩまたはIIのイントロン、およびクラスＲ１、Ｒ２またはＲ３のレトロポゾンを含む群の中から選ばれる請求項１に記載のトランスポジション・アセンブリー。３．可動遺伝要素が、下記の中から選択される請求項２に記載のトランスポジション・アセンブリー： −Physarum polycephalum、Carolina株のイントロン３、該イントロンのフラグメントまたは変種、 −テトラヒメナのクラスＩの移動性イントロン、該イントロンのフラグメントまたは変種、 −Pneumocystis cariniiのクラスＩの移動性イントロン、該イントロンのフラグメントまたは変種、 −Bombyx moriのＲ２Ｂｍのレトロポゾン、該レトロポゾンのフラグメントまたは変種および、 −Scaria coprophilaのレトロポゾンＲ３、該レトロポゾンのフラグメントまたは変種。４．可動遺伝要素が、インテグラーゼをコードするオープンリーディングフレームの全部または一部を含む請求項１〜３のいずれかに記載のトランスポジション・アセンブリー。５．関心のあるＤＮＡフラグメントが、前記インテグラーゼをコードするオープンリーディングフレームに挿入される請求項４に記載のトランスポジション・アセンブリー。６．関心のあるＤＮＡフラグメントが、アンチセンスＲＮＡを生産するために、或いは前記ＲＮＡの翻訳後に関心のある蛋白質を生産するためにＲＮＡに転写されることができる請求項１〜５のいずれかに記載のトランスポジション・アセンブリー。７．関心のあるＤＮＡフラグメントが、さらに前記ＤＮＡフラグメントの真核宿主細胞中での発現を可能にする適当な要素の制御下に置かれる請求項６に記載のトランスポジション・アセンブリー。８．適当な要素が、プロモーターを含み、該プロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩにより及びＲＮＡポリメラーゼIIにより認識されるプロモーターの群の中から選択される請求項７に記載のトランスポジション・アセンブリー。９．さらに以下のものを含む請求項１〜８のいずれかに記載のトランスポジション・アセンブリー、 −組込みカセットの５’末端における多くて１０ｋｂの領域（６）、前記挿入部位の５’末端のすぐ近くに隣接した宿主細胞のｒＲＮＡ遺伝子の配列と少なくとも８０％の相同を有する；及び −組込みカセットの３’末端における多くて１０ｋｂの領域（７）、前記挿入部位の３’末端のすぐ近くに隣接した宿主細胞のｒＲＮＡ遺伝子の配列と少なくとも８０％の相同を有する。１０．さらに以下のものを含む請求項９に記載のトランスポジション・アセンブリー、 −組込みカセットの５’末端における多くて１０ｋｂの領域、前記挿入部位の５ ’末端のすぐ近くに隣接した宿主細胞のｒＲＮＡ遺伝子の配列と１００％の相同を有する；及び −組込みカセットの３’末端における多くて１０ｋｂの領域、前記挿入部位の３’末端のすぐ近くに隣接した宿主細胞のｒＲＮＡ遺伝子の配列と１００％の相同を有する。１１．請求項１〜１０のいずれかに記載のトランスポジション・アセンブリーの真核細胞への導入手段。１２．リポソームの送達媒体及び合成カチオン性リピッドタイプ及びクローニング及び発現ベクターの中から選択された請求項１１に記載の導入手段。１３．前記導入手段が、組込みカセットの挿入領域への転移を可能にするのに十分長い時間宿主細胞中に維持するために適当な要素を含むベクターである請求項１２に記載の導入手段。１４．ベクターが非組込型のベクターである請求項１３に記載の導入手段。１５．ベクターがアデノウイルス由来のベクターである請求項１４に記載の導入手段。１６．ベクターがさらにトランスポジション・アセンブリーの特異的インテグラーゼの生産を可能にする発現カセットを含む請求項１１〜１５のいずれかに記載の導入手段。１７．ベクターかさらに選択遺伝子（selection g ene）の発現を可能にする発現カセットを含む請求項１１〜１６のいずれかに記載の導入手段。１８．リボソーム核ＤＮＡのレベルで真核宿主細胞のゲノムに関心のあるＤＮＡフラグメントを転移するインビトロでのプロセスであって、該方法に従い請求項１〜１０のいずれかに記載のトランスポジション・アセンブリーまたは請求項１１〜１７のいずれかに記載の導入手段が前記宿主細胞に導入されるプロセス。１９．トランスポジション・アセンブリーの特異的インテグラーゼがさらに宿主細胞に供給される請求項１８に記載のプロセス。２０．請求項１〜１０のいずれかに記載のトランスポジション・アセンブリーまたは請求項１１〜１７のいずれかに記載の導入手段を含む真核細胞。２１．前記細胞が哺乳動物細胞である請求項２０に記載の真核細胞。２２．前記細胞がヒト細胞である請求項２１に記載の真核細胞。２３．請求項１〜１０のいずれかに記載のトランスポジション・アセンブリー、請求項１１〜１７のいずれかに記載の導入手段または請求項２０〜２２のいずれかに記載の細胞を治療剤として、薬学的観点から受け入れられる担体と共に含む医薬組成物。２４．さらにインテグラーゼ又はインテグラーゼ発現カセットを含む請求項２３に記載の医薬組成物。