MXPA98001407A - Antagonistas de la actividad oncogenica de la proteina mdm2, y su utilizacion en el tratamiento de los canceres - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la utilización de un compuesto capaz de antagonizar al menos parcialmente la actividad oncogénica de la proteína Mdm2, para la preparación de una composición farmacéutica destinada más particularmente al tratamiento de los cánceres en el contexto p53 nulo. Esta se refiere además a un vector viral que comprende una secuencia deácido nucleico que codifica para un compuesto capaz de inhibir al menos parcialmente la actividad oncogénica de la proteína Mdm2 y a una composición farmacéutica correspondiente.

Description

ANTAGONISTAS DE LA ACTIVIDAD ONCOGENICA DE LA PROTEINA MDM2, Y SU UTILIZACIÓN EN EL TRATAMIENTO DE LOS CÁNCERES DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un nuevo método de tratamiento de las patologías hiperproliferativas (cánceres, restenosis, etc . ) , así como a las composiciones farmacéuticas correspondientes . Está bien establecido hoy en día que una gran parte de los cánceres es provocada, al menos en parte, por anomalías genéticas que §e traducen ya sea en la sobreexpresión de uno o varios genes y/o la expresión de uno o de varios genes mutados o anormales. Por ejemplo, la expresión de oncogenes genera en la mayoría de los casos un cáncer. Se entiende por oncogen un gen genéticamente afectado, y cuyo producto de expresión perturba el funcionamiento biológico normal de las células, iniciando así un estado neoplásico. Un jran número de oncogenes han sido identificados hasta la fecha y han sido parcialmente caracterizados principalmente como los genes ras, myc , fos, erb, neu, raf, src , fms , j un y REF: 26775 abl cuyas formas mutadas parecen responsables de una desregulación de la proliferación celular. En un contexto celular normal, la proliferación de estos oncogenes es probablemente puesta al menos en parte, por la generación de genes denominados supresores de los tumores como p53 y Rb. No obstante, ciertos fenómenos pueden llegar a perturbar este mecanismo de autorregulación celular y favorecer luego el desarrollo de un estado neoplásico. Uno de estos eventos consiste en las mutaciones a nivel de los genes supresores de los tumores. Es así que la forma mutada por supresión y/o mutación del gen p53 está implicada en el desarrollo de la mayoría de los cánceres humanos (Baker y colaboradores, Science 244 (1989) 217) y que las formas inactivas del gen Rb han sido puestas en juego en diferentes tumores, y principalmente en los retinoblastomas o en los cánceres mesenquimatosos como los osteosarcomas . La proteína p53 es una fosfoproteína nuclear de 53 kD que es expresada en la mayor parte de los tejidos normales. Ésta está implicada en el control del ciclo celular (Mercer y colaboradores Critíc Rev. Eucar. Gene Express, 2, 251, 1992), la regulación transcripcional (Fields y colaboradores, Sciences (1990) 249, 1046), la replicación del ADN (Wilcoq y Lañe, (1991), Nature 349, 4290 y Bargonnetti y colaboradores, (1992) Cell 65 1083) y la inducción de la apoptosis (Shaw y colaboradores, (1992) P.N.A.S. USA 89, 4495) . Así pues, toda exposición de las células a los agentes capaces por ejemplo de perjudicar el ADN, inicia una cascada de señalización celular que da por consecuencia una modificación post-transcripcional de la proteína p53 y la activación transcripcional por p53 de un cierto número de genes tales como gadd45 (detención del crecimiento y daño al ADN) (Kastan y colaboradores, Cell, 71, 587-597, 1992), p21 WAF/CIP (EIDeiry y colaboradores, Cáncer Res., 54, 1169-1174, 1994) o bien mdm2 (ratón doble minuto) (Barak y colaboradores, EMBO J., 12, 461-468, 1993) . De lo precedente destaca claramente que la elucidación de las diferentes funciones biológicas del conjunto de las proteínas implicadas principalmente en esta vía de señalización celular, de sus modos de funcionamiento y de sus características, es de un interés principal para la comprensión de la cancerogénesis y la puesta a punto de los métodos terapéuticos eficaces, dirigidos contra el cáncer.

La presente invención se inscribe precisamente en este contexto produciendo una nueva función de la proteína Mdm2. La proteína Mdm2 es una fosfoproteína de peso molecular de 90 kD, expresada a partir del gen mdm-2 (mupno doble minuto 2). Este gen mdm2 ha sido clonado originalmente en una célula tumoral espontánea BALB/c 3T3 y se ha constatado que su sobreexpresión aumenta fuertemente el poder tumoral (Cahilly-Snyder y colaboradores, Somat. Cell. Mol. Genet., 13, 235-244, 1987; Fakharzadeh y colaboradores, EMBO J. 10, 1565- 1569, 1991). Ha sido identificado un complejo Mdm2/p53 en varias líneas celulares que contienen también tanto una proteína p53 silvestre como las proteínas p53 mutadas (Martínez y colaboradores, Genes Dev., 5, 151-159, 1991) . Además, se ha mostrado que Mdm2 inhibe la actividad t anscripcional de p53 sobre un promotor como aquel de la creatina-cinasa del músculo, indicando que Mdm2 puede regular la actividad de p53 (Mo and y colaboradores, Cell, 69, 1237-1245, 1992; Oliner y colaboradores, Nature, 362, 857-860, 1993) . En vista del conjunto de estos resultados, la proteína Mdm2 es pues a la fecha, esencialmente reconocida como un modulador de las actividades de p53. Formando un complejo con las proteínas p53 silvestres o mutadas, éstas inhiben su actividad transcripcional y contribuyen de esta manera a la desregulación de la proliferación celular. Por consecuencia, la explotación de estas informaciones sobre un plano terapéutico, consiste principalmente en buscar los medios para oponerse a este bloqueo por Mdm2 de la proteína p53. De manera inesperada, la solicitante ha puesto en evidencia que esta proteína Mdm2 poseía un carácter oncogénico propio, es decir totalmente distinto a aquel asociado a su forma en complejo con la proteína p53. De manera más precisa, la proteína Mdm2 desarrolla propiedades oncogénicas en un contexto p53 nulo. Para apoyar este descubrimiento para saber que las propiedades oncogénicas de Mdm2 son independientes de p53, y en particular no resultan de la inhibición de la actividad transactivadora de p53 silvestre, se ha mostrado que un mutante de p53 (p53 (14-19); Lm y colaboradores, Genes Dev., 1994, 8, 1235-1246) que ha conservado sus propiedades transactivadoras pero que no interactúa más con Mdm-2, es incapaz de bloquear las propiedades oncogénicas de Mdm-2. Se demuestra igualmente que Mdm-2 y en particular el dominio 1-134 de Mdm-2, es capaz de desbloquear una detención del ciclo celular en Gl, inducida por la sobreexpresión de pl07. Se comprueba pues que Mdm-2 es un regulador importante de los factores implicados en el control del ciclo celular, diferentes de p53. La presente invención resulta en parte de la puesta en evidencia de que la secuencia proteica 1-134 de la frecuencia identificada en la SEQ ID No. 1, de la proteína Mdm2 es suficiente para traducir el potencial oncogénico de dicha proteína. Ésta resulta igualmente de la puesta en evidencia de que es posible afectar este carácter oncogénico de la proteína Mdm2 utilizando compuestos capaces de interactuar con ésta. La presente invención describe igualmente los sistemas particularmente eficaces que permiten la distribución in vi vo, directamente en los tumores, de tales compuestos, y luchar así contra el desarrollo de los cánceres. La presente invención ofrece de este modo un nuevo procedimiento particularmente eficaz para el tratamiento de los tumores, en particular en el contexto de p53 nulo, tales como los cánceres siguientes: los adenocarcinomas de colon, cánceres de la tiroides, carcinomas del pulmón, leucemias mieloides, cánceres colorrectales, cánceres de mama, cánceres de pulmón, cánceres gástricos, cánceres del esófago, linfomas B, cánceres de ovario, cánceres de la vejiga, glioblastomas, etc... Un primer objetivo de la invención radica pues en la utilización de un compuesto capaz de antagonizar al menos parcialmente la actividad oncogénica de la proteína Mdm2 , para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de los cánceres en el contexto de p53 nulo. En el sentido de la invención, se entiende por cáncer en el contexto de p53 nulo, un cáncer donde p53 sería incapaz de ejercer sus funciones de gen supresor del tumor, mediante cualquier modificación o cualquier mecanismo diferente de la fijación de Mdm-2 sobre p53, impidiendo esta fijación que p53 juegue su papel de supresor del tumor, y que permite a las células escapar a un crecimiento regulado por p53. Se puede citar de manera "más exhaustiva entre estas modificaciones o mecanismos que bloquean la actividad supresora del tumor de p53, por ejemplo, las alteraciones genéticas del gen p53 (mutaciones puntuales, supresiones, etc.), interacción con otras proteínas diferentes de Mdm-2, la degradación proteolítica muy rápida de la proteína p53, ligada a la presencia de la proteína E6 del virus de los papilomas humanos con alto riesgo, tales como HPV-16 y HPV-18, etc. En el sentido de la invención, la inhibición de la actividad oncogénica de la proteína Mdm2 puede ser lograda de acuerdo a dos métodos. Ésta es preferentemente efectuada interviniendo directamente al nivel del dominio 1-134 de ésta. Es así que cualquier proteína capaz de ligarse a ese dominio tendrá un papel antagonista sobre las propiedades oncogénicas de Mdm2. No obstante, este efecto inhibidor puede igualmente ser logrado vía la interacción de un compuesto con un dominio cercano, como por ejemplo el dominio 135-491 de mdm2 , representado sobre la secuencia SEQ ID No. 1 o su secuencia C terminal representada sobre la secuencia SEQ ID No. 1. En consecuencia, la presente invención considera además la utilización de cualquier compuesto que, aunque no interactúa directamente con este dominio, es no obstante capaz de aceptar el carácter oncogénico. De acuerdo a un modo particular, la presente invención considera la utilización de un compuesto capaz de ligarse al nivel del dominio 1-134 de la secuencia representada en la SEQ ID No. 1 de la proteína Mdm2 con miras a preparar una composición farmacéutica destinada al tratamiento de los cánceres en el contexto p53 nulo. A manera de compuesto susceptible de interactuar directamente al nivel del dominio 1-134, de la proteína Mdm2, se pueden citar más particularmente los scFV dirigidos específicamente contra este dominio. Los ScFv son moléculas que tienen propiedades de unión comparables a aquellas de un anticuerpo, y activas intracelularmente . Se trata más particularmente de las moléculas constituidas de un péptido correspondiente al sitio de unión de la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo, unida por un ligador peptídico a un péptido correspondiente en el sitio de unión de la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo. Ha sido demostrado por la solicitante que tales ScFv podrían ser producidos ín vi vo mediante transferencia del gen (ver solicitud 094/29446) . Se puede tratar igualmente de péptidos o de proteínas ya conocidas por su aptitud para ligarse específicamente con el dominio 1-134 de Mdm2, como por ejemplo todo o parte del dominio de unión de la proteína p53 con la SEQ ID No. 1 y más particularmente todo o parte de los péptidos 1-52, 1-41 y 6-41 de la secuencia de p53 representada en la SEQ ID No. 2, (Oliner y colaboradores, Nature, 1993, 362, 857-860) o más simplemente todo o parte del péptido 16-25 cartografiado de manera más precisa (Lañe y colaboradores, Phil. Trans. R. Soc. London B., 1995, 347, 83-87), o incluso los péptidos 18-23 de los p53 humanos o murinos, o incluso los péptidos derivados parecidos a aquellos anteriormente citados, en los cuales estarán conservados los residuos críticos para la interacción con Mdm-2 (Picksley y colaboradores, Oncogene, 1994, 9, 2523-2529) . Se puede igualmente poner en operación, de acuerdo a la invención, los compuestos que se unen a los dominios cercanos al dominio 1-134 de Mdm2 representado en la SEQ ID No. 1, y que afectan por parte de esta unión la actividad oncogénica de la proteína Mdm2. De esta manera, se pueden citar aquellos que interactúan al nivel del dominio C terminal de dicha proteína, como por ejemplo, los factores transcripcionales TFII, TBP, y TaF250 lo mismo que las proteínas que interactúan al nivel del dominio 135-491 de Mdm2 representado en la SEQ ID No. 1, como por ejemplo las proteínas L5 (proteína ribosomal) y Rb (proteína retinoblastoma ) y el factor transcripcional E2F (regulado por Rb) .

Otro objetivo de la presente invención considera igualmente la utilización de scFV dirigidos específicamente contra este dominio 1-134 de la secuencia representada en la SEQ ID No. 1 de la proteína Mdm2, con miras a preparar una composición farmacéutica destinada al tratamiento de los cánceres. En el sentido de la invención, se entiende que el conjunto de las interacciones citadas anteriormente afectan de manera consecuente el carácter oncogénico de Mdm2. Además, estas proteínas pueden ser utilizadas, totalmente o en parte, en la medida donde se pone en operación su parte activa frente a uno de los dominios de unión con la proteína Mdm2, y que esta interacción conduce a una afectación del carácter oncogénico de ésta. En el marco de la presente invención, estos compuestos pueden ser utilizados tal cuales o, ventajosamente, bajo la forma de construcciones genéticas que permiten su expresión i n vi vo . Un modo de realización particularmente ventajoso de la presente invención consiste en poner en operación una secuencia nucleica que codifica para un compuesto capaz de antagonizar al menos parcialmente la actividad oncogénica de la proteína Mdm2 para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de los cánceres en este contexto p53 nulo. En esta perspectiva, los ácidos nucleicos utilizados en el marco de la invención, pueden ser de diferentes tipos. Se trata de manera preferentemente: de ácidos nucleicos antisentido, de oligorribonucleótidos capaces de fijarse directamente a uno de los dominios de la proteína Mdm2 e inhibir su actividad oncogénica (ligando oligonucleotídico) , de ácidos nucleicos que codifican totalmente o en parte para los péptidos o proteínas capaces de oligomerizarse con uno de los dominios de Mdm2 e inhibir su actividad oncogénica, - de ácidos nucleicos que codifican para los anticuerpos intracelulares (por ejemplo fragmentos variables de cadena única proveniente de un anticuerpo) dirigidos contra el dominio 1-134 de la secuencia SEQ ID No. 1 de la proteína Mdm2. De acuerdo a un modo particular de la presente invención, el ácido nucleico es un ácido nucleico antisentido. Este antisentido es un ADN que codifica para un ARN complementario del ácido nucleico, que codifica para la proteína Mdm2 y capaz de bloquear su transcripción y/o su traducción (ARN antisentido) o un ribosoma. Más recientemente, ha sido puesto en evidencia un nuevo tipo de ácidos nucleicos capaces de regular la expresión de los genes objetivo. Estos ácidos nucleicos no se hibridan con los ARNm celulares, pero sí directamente con el ADN genómico de doble hebra. Este nuevo procedimiento radica en la puesta en evidencia de que ciertos ácidos nucleicos son capaces de interactuar específicamente en el gran surco de la doble hélice de ADN, para formar localmente triples hélices, que conducen a una inhibición de la transcripción de los genes objetivo. Estos ácidos nucleicos reconocen selectivamente la doble hélice del ADN a nivel de las secuencias de oligopurina-oligopirimidina, es decir a nivel de las regiones que poseen una secuencia oligopúrica sobre una hebra, y una secuencia oligopirimídica sobre la hebra complementaria, y forman localmente una triple hélice. Las bases de la tercera hebra (ei oligonucleótido) forman puentes de hidrógeno (uniones Hoogsteen o Hoogsteen inversa) con las purinas de los pares de bases de Watson-Crick. Tales ácidos nucleicos han sido principalmente descritos por Pr. Héléne en Anti-Cancer drug design 6 (1991) 569.

Los ácidos nucleicos antisentido de acuerdo a la presente invención pueden ser secuencias de ADN que codifican para los ARN' s antisentido o para los ribosomas. Los ARN's antisentido producidos de este modo, pueden interactuar con un ARNm o un ADN genómico objetivo, y formar con éste dobles o triples hélices. Se puede tratar igualmente de secuencias (oligonucleotídicas) antisentido, eventualmente modificadas químicamente, capaces de interactuar directamente con el gen o el ARN objetivo. No obstante, de acuerdo a una modalidad preferida de realización de la presente invención, el ácido nucleico es un oligonucleótido antisentido tal como el que se define anteriormente, eventualmente modificado químicamente. Se puede tratar en particular de oligonucleótidos donde el esqueleto de fosfodiéster ha sido modificado, tales como por ejemplo los fosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos y fosforotioatos de oligonucleótidos que se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente O94/08003. Se puede tratar igualmente de oligonucleótidos alfa, o de oligonucleótidos conjugados con agentes tales como los compuestos acrilantes .

En el sentido de la presente invención, se entiende por oligonucleótido ligando, un oligorribonucleótido o un oligodesoxirribonucleótido capaz de fijarse específicamente a la proteína Mdm-2 con el fin de inhibir su función oncogénica. Tales nucleótidos pueden por ejemplo ser puestos en evidencia por las técnicas de "evolución i n vi tro" como por ejemplo la técnica SELEX (Edgington, Bio/technology, 1992, 10, 137-140; Solicitudes US 5,270,163 y WO 91/19813). De manera más general, estos ácidos nucleicos pueden ser de origen humano, animal, vegetal, bacteriano, viral, sintético, etc. Éstos pueden ser obtenidos mediante cualquier técnica conocida por el experto en la materia, y principalmente mediante selección de bancos, mediante síntesis química, o incluso mediante métodos mixtos que incluyen la modificación química o enzimática de las secuencias obtenidas por selección de bancos. Como se indico anteriormente, éstos pueden además ser incorporados en vectores, tales como los vectores plasmídicos, virales o químicos. Éstos pueden ser igualmente administrados tal cuales, bajo la forma de ADN desnudo de acuerdo a la técnica descrita en la solicitud WO 90/11092 o bajo la forma formada en complejo, por ejemplo con el DEAE-dextrano (Pagano y colaboradores, J. Virol. 1 (1967) 891), con proteínas nucleares (Kaneda y colaboradores, Science 243 (1989) 375), con lípidos o polímeros catiónicos (Felgner y colaboradores, PNAS 84 (1987) 7413), bajo la forma de liposomas (Fraley y colaboradores, J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431), etc. Preferentemente, la secuencia utilizada en el marco de la invención forma parte de un vector. El empleo de un vector de este tipo permite en efecto mejorar la administración del ácido nucleico en las células a tratar, e igualmente aumentar su estabilidad en dichas células, lo que permite obtener un efecto terapéutico durable. Además, es posible introducir varias secuencias del ácido nucleico en un mismo vector, lo que aumenta igualmente la eficacia del tratamiento . El vector utilizado puede ser de diversos orígenes, desde luego, que sea capaz de transformar las células animales, de preferencia las células cancerosas humanas. En una modalidad preferida de realización de la invención, se utiliza un vector viral, que puede ser elegido entre los adenovirus, los retrovirus, los virus adeno-asociados (AAV) o el virus del herpes.

A este respecto, la presente invención tiene igualmente por objetivo cualquier vector viral que comprenda, insertado en su genoma, un ácido nucleico que codifique para un compuesto capaz de antagonizar al menos parcialmente el carácter oncogénico de la proteína Mdm2. Más particularmente, ésta se refiere a cualquier virus recombinante que comprenda una secuencia de ácidos nucleicos que codifiquen para un compuesto capaz de ligarse a la proteína Mdm2, de manera para afectar su potencial oncogénico. En este contexto, la secuencia de ácidos nucleicos puede codificar para uno de los péptidos, proteínas o factores transcripcíonales anteriormente identificados. De manera más preferente, esta secuencia de ácidos nucleicos codifica para un scFv o un péptido capaz de interactuar a nivel del dominio 1-134 (SEQ ID No. 1) de la proteína Mdm2. Ventajosamente, los virus utilizados en el marco de la invención son preferentemente defectuosos, es decir que son incapaces de replicarse de manera autónoma en la célula infectada. En general, el genoma de los virus defectuosos utilizados en el marco de la presente invención está pues desprovisto al menos de las secuencias necesarias para la replicación de dicho virus en la célula infectada. Estas regiones pueden ser ya sea eliminadas (totalmente o en parte), o bien hechas no funcionales, o bien sustituidas por otras secuencias y principalmente por la secuencia que codifica para el compuesto que posee un papel antagonista sobre las propiedades oncogénicas de la proteína Mdm2. Preferentemente, el virus defectuoso conserva no obstante las secuencias de su genoma que son necesarias para la encapsidación de las partículas virales . Tratándose más particularmente de adenovirus, han sido caracterizados diferentes serotipos, donde la estructura y las propiedades varían un poco. Entre estos serotipos, se prefieren utilizar en el marco de la presente invención los adenovirus humanos del tipo 2 ó 5 (Ad2 o Ad5) o los adenovirus de origen animal (ver solicitud francesa FR 93 05954). Entre los adenovirus de origen animal utilizables en el marco de la presente invención se pueden citar los adenovirus de origen canino, bovino, murino, (ejemplo: Mavl, Beard y colaboradores, Virology 75 (1990) 81), ovino, porcino, aviar o incluso símico (ejemplo: SAV) . De preferencia, el adenovirus de origen animal es un adenovirus canino, más preferentemente un adenovirus CAV2 [cepa manhattan o A26/61 (ATCC VR-800) por ejemplo]. De preferencia, en el marco de la presente invención se utilizan los adenovirus de origen humano o canino o mixto. Preferentemente, los adenovirus defectuosos de la invención comprenden los ITR, una secuencia que permite la encapsidación y la secuencia que codifica para el modulador de las calpaínas. Todavía más preferentemente, en el genoma de los adenovirus de la invención, el gen El y al menos uno de los genes E2, E4, L1-L5 son no funcionales. El gen viral considerado puede ser hecho no funcional mediante cualquier técnica conocida por el experto en la materia, y principalmente por supresión total, sustitución, supresión parcial, o adición de una o varias bases en el o los genes considerados. Tales modificaciones pueden ser obtenidas i n vi tro (sobre el ADN aislado) o i n si t u, por ejemplo, por medio de técnicas de ingeniería genética, o incluso mediante tratamiento por medio de agentes mutagénicos. Los adenovirus recombinantes defectuosos de acuerdo a la invención pueden ser preparados mediante cualquier técnica conocida por el experto en la materia (Levrero y colaboradores, Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particular, éstos pueden ser preparados mediante recombinación homologa entre un adenovirus y un plásmido que incluye entre otras la secuencia de ADN que codifica para el inhibidor de los ETS. La recombinación homologa se produce después de la cotransfección de dichos adenovirus y el plásmido en una línea celular apropiada. La línea celular utilizada debe ser de preferencia (i) transformable por los elementos, y (ii) incluir las secuencias capaces de complementar la parte del genoma del adenovirus defectuoso, de preferencia bajo la forma integrada para evitar los riesgos de recombinación. A manera de ejemplo de línea, se puede mencionar la línea de riñon embrionario humano 293 (Graham y colaboradores, J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) que contiene principalmente, integrada en su genoma, la parte izquierda del genoma de un adenovirus Ad5 (12%) . Las estrategias de construcción de los vectores derivados del adenovirus han sido igualmente descritas en las solicitudes FR 93 05954 y FR 93 08596. En seguida, los adenovirus que se multiplican son recuperados y purificados de acuerdo a las técnicas clásicas de biología molecular, como se ilustra en los ejemplos.

Concerniente a los virus adeno-asociados (AAV) , se trata de virus de ADN de tamaño relativamente reducido, que se integran en el genoma de las células que éstos infectan, de manera estable y específica del sitio. Éstos son capaces de infectar un gran espectro de células, sin inducir efecto sobre el crecimiento, la morfología o la diferenciación celulares. Por otro lado, éstos no parecen implicados en las patologías en el hombre. El genoma de los AAV ha sido clonado, secuenciado y caracterizado. Éste comprende aproximadamente 4700 bases, y contiene en cada extreme una región repetida invertida (ITR) de 145 bases aproximadamente, que sirve de origen de replicación" para el virus. El resto del genoma está dividido en dos genomas esenciales que incluyen las funciones de encapsidación: la parte izquierda del genoma, que contiene el gen rep implicado en la replicación viral y la expresión de los genes virales; la parte derecha del genoma, que contiene el gen cap que codifica para las proteínas de la cápside del virus . La utilización de vectores derivados de los AAV para la transferencia de genes ín vi tro e i n vi vo , ha sido descrita en la literatura (ver principalmente Patente Internacional No. WO 91/18088; Patente Internacional No. WO 93/09239; Patente Norteamericana No. 4,797,368, Patente Norteamericana No. 5,139,941, Patente Europea No. EP 488,528). Estas solicitudes describen diferentes construcciones derivadas de los AAV, en las cuales los genes rep y/o cap están suprimidos y reemplazados con un gen de interés, y su utilización para la transferencia in vi tro (sobre células en cultivo) o in vi vo (directamente en un organismo) el gen de interés. Los AAV recombinantes defectuosos de acuerdo a la invención pueden ser preparados mediante co-transfección, en una línea celular infectada con un virus auxiliar humano (por ejemplo un adenovirus), de un plásmido que contiene la secuencia que codifica para un inhibidor de los ETS, bordeado de dos regiones repetidas invertidas (ITR), de AAV, y de un plásmido que incluye los genes de la encapsidación (genes rep y cap) del AAV. Los AAV recombinantes producidos son en seguida purificados mediante las técnicas clásicas. Respecto a los virus del herpes y a los retrovirus, la construcción de los vectores recombinantes ha sido ampliamente descrita en la literatura: ver principalmente Breakfield y colaboradores, New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP 178220, Bernstein y colaboradores, Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particular, los retrovirus son virus integrativos, que infectan selectivamente las células en división. Éstos constituyen pues los vectores de interés para las aplicaciones en el cáncer. El genoma de los retrovirus comprende esencialmente dos LTR, una secuencia de encapsidación y tres regiones codificantes (gag, pol y env) . En los vectores recombinantes derivados de los retrovirus, los genes gag, pol y env están en general suprimidos, total o parcialmente, y reemplazados por una secuencia de ácido nucleico heterólogo de interés. Estos vectores pueden ser realizados a partir de diferentes tipos de retrovirus principalmente tales como el MoMuLV ("virus de la leucemia urina de moloney"; incluso designado MoMLV) , el MSV ("virus del sarcoma murino de moloney"), el HaSV ("virus del sarcoma de harvey"); el SNV ("virus de la necrosis esplénica"); el RSV ("virus del sarcoma de rous") o incluso el virus de Friend. Para construir los retrovirus recombinantes que incluyen una secuencia de interés, un plásmido que incluye principalmente los LTR, la secuencia de encapsidación y la denominada secuencia de interés, es en general construido, luego utilizado para transfectar una línea celular denominada de encapsidación, capaz de aportar en posición trans las funciones retrovirales deficientes en el plásmido. En general, las líneas de encapsidación son pues capaces de expresar los genes gag, pol y env. Tales líneas de encapsidación han sido descritas en la técnica anterior, y principalmente la línea PA317 (Patente Norteamericana No. 4,861,719); la línea PsiCRIP (Patente Internacional No. WO 90/02806) y la línea GP+envAm-12 (Patente Internacional No. WO 89/07150). Por otro lado, los retrovirus recombinantes pueden incluir modificaciones a nivel de los LTR, para suprimir la actividad transcripcional, así como las secuencias de encapsidación extendidas, que incluyen una parte del gen gag (Bender y colaboradores, J. Virol. 61 (1987) 1639). Los retrovirus recombinantes producidos son en seguida purificados mediante las técnicas clásicas. Ventajosamente, en los vectores de la invención, la secuencia que codifica para el compuesto que posee las propiedades antagonistas sobre el carácter oncogénico de Mdm2, es colocada bajo el control de las señales que permiten su expresión en las células tumorales. Preferentemente, se trata de señales de expresión heterólogas, es decir de señales diferentes de aquellas naturalmente responsables de la expresión del inhibidor. Se puede tratar en particular de secuencias responsables de la expresión de otras proteínas, o de secuencias sintéticas. Principalmente, se puede tratar de secuencias promotoras de los genes eucariotes o virales. Por ejemplo, se puede tratar de secuencias promotoras provenientes del genoma de la célula que se desea infectar. De igual modo, se puede tratar de secuencias promotoras provenientes del genoma de un virus, comprendido el virus utilizado. A este respecto, se pueden citar por ejemplo los promotores ElA, MLP, CMV, LTR-RSV, etc. Además, estas secuencias de expresión pueden ser modificadas mediante adición de secuencias de activación, de regulación, o que permiten una expresión específica del tejido. Puede ser en efecto particularmente interesante utilizar señales de expresión activas específica o mayoritariamente en las células tumorales, de manera que la secuencia de ADN no sea expresada y no produzca su efecto más que cuando el virus haya infectado efectivamente una célula tumoral. En un modo particular de realización, la invención concierne a un virus recombinante defectuoso que comprende una secuencia de ADNc que codifica para un compuesto que posee propiedades antagonistas sobre el carácter oncogénico de Mdm2, bajo el control de un promotor viral, elegido de preferencia entre los LTR-RSV y el promotor CMV. Siempre en una modalidad preferida, la invención se refiere a un virus recombinante defectuoso que comprende una secuencia de ADN que codifica para un compuesto que posee propiedades antagonistas sobre el carácter oncogénico de Mdm2, bajo el control de un promotor que permite una expresión mayoritaria en las células tumorales. La expresión es considerada como mayoritaria en el sentido de la invención cuando, incluso si es observada una expresión residual en otros tipos celulares, los niveles de expresión son superiores en las células tumorales. La presente invención se extiende igualmente a la utilización de una secuencia nucleica que codifica para los anticuerpos intracelulares o incluso scFV, dirigidos contra el dominio 1-134 de la secuencia de la proteína Mdm2 representada en la SEQ ID No. 1 para la preparación de una composición farmacéutica destinada de manera general al tratamiento del cáncer. Ésta se refiere igualmente a cualquier composición farmacéutica que comprende un compuesto capaz de inhibir la actividad oncogénica de la proteína Mdm2, o una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para un compuesto de este tipo. De acuerdo a una modalidad particular de realización de la invención, esta composición comprende uno o varios virus recombinantes defectuosos tales como los que se describen precedentemente. Estas composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas con miras a las administraciones por la vía tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraocular, transdérmica, etc. De preferencia, las composiciones farmacéuticas de la invención contienen un vehículo farmacéuticamente aceptable para una formulación inyectable, principalmente para una inyección directa en el tumor del paciente. Se puede tratar en particular de soluciones estériles, isotónicas, o de composiciones secas, principalmente liofilizadas, que, por adición según el caso de agua esterilizada o de suero fisiológico, permiten la constitución de solutos inyectables. La inyección directa en el tumor del paciente es ventajosa porque permite concentrar el efecto terapéutico a nivel de los tejidos afectados. Las dosis del virus recombinante defectuoso, utilizadas para la inyección, pueden ser adaptadas en función de diferentes parámetros, y principalmente en función del vector viral, del modo de administración utilizado, de la patología en cuestión, o incluso de la duración del tratamiento buscado. De una manera general, los adenovirus recombinantes de acuerdo a la invención son formulados y administrados bajo la forma de dosis comprendidas entre 104 y lO11 ufp/ml, y de preferencia 106 a 1010 ufp/ml. El término ufp ("unidad formadora de placa") corresponde al poder infeccioso de una solución del virus, y es determinada mediante infección de un cultivo celular apropiado, y midiendo, en general después de 48 horas, el número de zonas de células infectadas. Las técnicas de determinación del título de' ufp de una solución viral, están bien documentadas en la literatura. Respecto a los retrovirus, las composiciones de acuerdo a la invención pueden poseer directamente las células productoras, con miras a su implante. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo a la invención son particularmente ventajosas para neutralizar la actividad oncogénica de las proteínas Mdm2 y de hecho para modular la proliferación de ciertos tipos celulares. En particular, estas composiciones farmacéuticas son apropiadas para el tratamiento de los cánceres que poseen un p53 nulo, como por ejemplo los cánceres siguientes: los adenocarcinomas de colon, los cánceres de la tiroides, los carcinomas de pulmón, las leucemias mieloides, los cánceres colorrectales, los cánceres de seno, los cánceres de pulmón, los cánceres gástricos, los cánceres del esófago, los linfomas B, los cánceres de ovario, los cánceres de la vejiga, los glioblastomas, etc. La presente invención es ventajosamente utilizada i n vi vo para la destrucción de células en hiperproli feración (por ejemplo en proliferación anormal). Ésta es así aplicable para la destrucción de células tumorales o de células del músculo liso de la pared vascular (restenosis). Otras ventajas de la presente invención aparecerán a la lectura de los ejemplos y figuras siguientes, que deben de ser considerados como ilustrativos y no limitantes.

Figura 1: Representación de las proteínas Mdm-2 de la A a la F.

Figura 2: Gráfica de la transfección de las células Saos-2 con 1-os plásmidos que expresan diversas proteínas Mdm-2.

Figura 3: Representación esquemática de la inhibición de las propiedades transformantes de Mdm2 por diferentes p53.

Figura 4: Efecto de una sobreexpresión de Mdm2 sobre el ciclo celular.

Figura 5: Efecto de una sobreexpresión de Mdm2 sobre el ciclo celular.

Técnicas generales de biología molecular Son bien conocidos por el experto en la materia los métodos clásicamente utilizados en biología molecular, tales como las extracciones preparativas de ADN plasmídico, la centrifugación de ADN plasmídico en gradiente de cloruro de cesio, la electroforesis sobre geles de agarosa o de acrilamida, la purificación de fragmentos de ADN por electroelución, la extracción de proteínas con fenol o con fenol-cloroformo, la precipitación de ADN en medio salino con etanol o isopropanol, la transformación en Escheri chi a col i , etc., y son abundantemente descritos en la literatura [Maniatis T. y colaboradores, "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. y colaboradores (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]. Para las ligaduras, los fragmentos de ADN pueden ser separados de acuerdo a su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa o de acrilamida, extraídos con fenol o con una mezcla de fenol/cloroformo, precipitados con etanol y después incubados en presencia de la ADN-ligasa del fago T4 (Biolabs) según las recomendaciones del proveedor. El relleno de los extremos 5 ' sobresalientes puede ser efectuado por el fragmento de Klenow de la ADN-polimerasa I de E. coli (Biolabs) de acuerdo a las especificaciones del proveedor. La destrucción de los extremos 3' sobresalientes es efectuada en presencia de la ADN-polimerasa del fago T4 (Biolabs), utilizada de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. La destrucción de los extremos 5' sobresalientes es efectuada mediante un tratamiento proporcionado por la nucleasa SI . La mutagénesis dirigida i n vi tro por los oligodesoxinucleótidos sintéticos, puede ser efectuada de acuerdo al método desarrollado por Taylor y colaboradores [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] utilizando el equipo distribuido por Amersham. La amplificación enzimática de los fragmentos de ADN por la técnica denominada de PCR [reacción en cadena catalizada por polimerasa (Polymerase-catalized Chain Reaction, Saiki R.K, y colaboradores, Science 230 (1985) 1350-1354; Mullís K.B. y Faloona F.A., Meth. Enzym. 1_55 (1987) 335-350)] puede ser efectuado utilizando un "ciclador térmico de ADN" (Perkin Elmer Cetus) de acuerdo a las especificaciones del fabricante. La amplificación del ADN genómico es realizada más particularmente en las siguientes condiciones: 5 minutos a 100°C, 30 ciclos de un minuto a 95°C, 2 minutos a 58°C y después 3 minutos a 72°C por medio de sondas apropiadas. Los productos de amplificación son analizados mediante electroforesis sobre gel. La verificación de las secuencias nucleotídicas puede ser efectuada por el método desarrollado por Sanger y colaboradores [Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 7_4 (1977) 5463-5467] utilizando el equipo distribuido por Amersham.

Materiales y Métodos 1. Construcciones utilizadas: - el plásmido pBKCMV es comercializado por Stratagene y contiene el gen de resistencia a la neomicina. los plásmidos pC53ClN3 y p53-4.2. N3 que codifican respectivamente para p53 silvestre y para p53 R273H provienen de A. Levine (Hinds y colaboradores, Cell Growth and Diff. (1990, 1, 571). el plásmido pBKp53 (R273H) contiene el minigen humano p53. Éste ha sido obtenido a partir de PC53-4.2. N3. - el plásmido pBKMdm2 ha sido obtenido mediante clonación en pBKCMV de un cásete codificante que consiste en la región no traducida del extremo de la secuencia que codifica para la ß-globina, seguido de la secuencia que codifica para mdm2. - el plásmido pGKhygro expresa el gen de resistencia a la higromicina (Nature (1990) 348, 649- 651) . el plásmido pCMVNeoBam que permite la expresión del gen de resistencia a la neomicina (Hinds y colaboradores (1990) Cell. Growth and Diff., 1, 571-580) . los plásmidos pCMVpl07 y pCMVCD20 que permiten la expresión de la proteína pl07 y del marcador de superficie CD20 (Zhu y colaboradores (1993) Genes and Development, 7, 1111-1125) . los plásmidos pCMVE2F-4 y pCMVE2F-5 que permiten la expresión de las proteínas E2F-4 y E2F-5 (Sardet y colaboradores (1995) Proc. Nati. Acad. Sc., 92, 2403-2407) . los plásmidos pLexA, pLexA(6-41), pLexA(16-25) que permiten la expresión del dominio de fijación al ADN de LexA (aminoácidos 1 al 87) libre o fusionado en fase con p53(6-41) o p53 (16-25). pLexA(6-41) y pLexA(16-25) han sido obtenidos a partir del plásmido pLexApolylI construido en LGME (Estrasburgo) . los plásmidos de expresión eucariótica de pl07: pl07 (385-1068 ) , pl07(l-781) y pl07 ( 781-1068 ) (Zhu y colaboradores, EMBO J. 14(1995) 1904). el plásmido pSGKlHApl07 permite la expresión i n vi tro e in vi vo de pl07. pl07 está en el contexto de una secuencia Kozak y el epítope HA es expresado en fusión en el extremo C-terminal de pl07. los plásmidos pBC-MDM2 y pBC-MDM2 ( 1-13 ) han sido obtenidos mediante clonación de MDM2 y MDM2 (1-134) en pBC (Chatton y colaboradores, Biotechniques 18 (1995) 142). - los plásmidos pGex-MDM2 y pGex-MDM2(l- 177) han sido obtenidos mediante clonación de MDM2 y MDM2 (1-177) en pGex. 2. Método: La expresión de p53 es determinada mediante Manchado de Western sobre el extracto celular completo, con la ayuda de un anticuerpo monoclonal D01. La expresión de ARMm que codifica para la proteína Mdm2 es estimada por RT-PCR semi- cuantitativa . La ausencia de contaminación del ADN es verificada por PCR.

Ejemplo 1: Puesta en evidencia de las propiedades transformantes de mdm2.

Las células Saos-2 son transfectadas ya sea con un plásmido pBKMDM2, un plásmido testigo pBKp53 (R273H) o un plásmido testigo en p53 negativo pBKCMV, y después seleccionados para la resistencia a la Geneticina 418 (G418) . En un primer ensayo, los clones son seleccionados individualmente y propagados luego como en los otros 2 ensayos, los clones no aislados son colocados en cultivo en un medio de agar suave. Para esto, 10" células son sembradas por duplicado en 0.375% de agar suave. Después de 24 horas, se determina el número total de colonias con más de 50 células, así como el número de células por colonia (tamaño de las colonias) . Cada valor dado corresponde a una media de cuatro experimentos realizados por duplicado. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla I. Los clones en el ensayo No. 1 correspondientes a mdm2 son identificados bajo Ml al M6, aquellos de p53 (R273H) bajo p53-l a p53-6, y aquellos del testigo bajo Col a Co5) . Como se esperaba, Col y Co4 no expresan el mdm2 transfectado, y Col-3 la proteína p53.

TABLA I TABLA I (continuación) Ejemplo 2: La región N-terroinal de Mdm-2 (1-134) SEQ ID No. 1 es necesaria y suficiente para estimular el crecimiento en agar suave de las células Saos-2.

Las células Saos-2 son transfectadas ya sea con los plásmidos pBKCMV que expresan a la vez la resistencia neo y las proteínas mdm-2 de la A a la F descritas en la Figura 1, o bien un plásmido testigo pBKCMV vacío, y después seleccionadas para la resistencia a G418. Las células supervivientes son reagrupadas, amplificadas y después probadas para la formación de colonias en agar suave. Los resultados de la Figura 2 son expresados en número de clones formados en agar suave con relación a aquel con mdm-2 completo (A) . Estos resultados son provenientes de dos experimentos representativos de transfección, independientes, en los cuales han sido probados entre 3 y 7 combinaciones de células diferentes, siguiendo la construcción. Éstos muestran claramente que el dominio N-terminal de mdm-2 posee propiedades oncogénicas. La construcción más eficaz corresponde a la proteína completa.

Ejemplo 3: Reversión de las proteínas oncogénicas de Mdm-2 por Ja p53 silvestre, los mutantes de p53 y los fragmentos de p53.

Un lote de células Saos-2 transformadas con Mdm-2 es cotransfectado con el plásmido pGKhygro y PC53C1N3 (p53) pC53-4.2N3 p53(R(273)H, p53 (1-52), pLexA(6-41), pLexA(16-25) , pLexA, p53 (Ll Q, Fl 9S) , p53 (L22Q,W23S) , o bien pCMVNeoBam, y después seleccionadas para la resistencia a la higromicina en presencia de G418. 100,000 células provenientes de 3 a 5 combinados independientes de células resistentes, son sembradas por duplicado en agar suave (0.375%). Después de 25 días de cultivo, las colonias que contienen al menos 50 células son contadas. La Figura 3 presenta los resultados de un experimento representativo y da una representación esquemática de las diferentes p53 probadas, para inhibir las propiedades transformantes de Mdm-2. De este experimento se desprende que únicamente las construcciones que permiten la expresión de las proteínas capaces de ligarse a la proteina mdm-2, en la aparición de p53, p53-R273H, p53(l-52), LexA(6-41), LexA(16-25) inhiben las propiedades oncogénicas de Mdm-2. Por el contrario, los dobles mutantes donde se demuestra que éstos han perdido la capacidad de unión a mdm-2 (Lin y colaboradores, Gene Dev., 1994, 8, 1235-1246) no tienen efecto inhibidor. El hecho de que el mutante p53 (14-19) que ha conservado las propiedades transactivadoras de la p53 silvestre, no inhiba la transformación por Mdm-2, confirma que las propiedades oncogénicas de Mdm-2 son independientes de la inhibición por Mdm-2 de las propiedades transactivadoras de p53.

Ejemplo 4: Mdm-2 inhibe el bloqueo en Gl del ciclo celular inducido por p!07 en las células Saos-2.

Las células Saos-2 son cotransfectadas con tres tipos de plásmidos, (i) un plásmido para la expresión de CD-20 (pCMVCD20, 2 µg, que codifica para el marcador de superficie celular CD-20), (ii) un plásmido (9 µg) de expresión de tipo CMV (promotor de citomegalovirus ) sin secuencia codificante o que codifica para Mdm-2 (PBKCMVMdm2) , por el dominio 1-134 de Mdm-2 ( PBKCMVMdm2 ( 1-134 )) , E2F-4 o E2F-5 (pCMVE2F-4, pCMVE2F-5) , y (iii) un vector de expresión de pl07 (pCMVpl07, 9 µg) . Las células son en seguida tratadas para el análisis con FACScan como se describe por Zhu y colaboradores, Gene Dev., 1993, 7, 1111-1125). Los resultados de un experimento representativo son representados en la Figura 4. Se demuestra claramente que en ausencia de pl07 sobreexpresado, la expresión de Mdm-2 o de su dominio 1-134 no tiene efecto sobre el ciclo celular. Por el contrario, la expresión de Mdm-2 y, con una eficacia, su dominio 1-134 son capaces de levantar la detención del ciclo celular en Gl inducida por pl07. Este ejemplo demuestra claramente que Mdm-2 no es más que un inhibidor de la actividad transactivadora de p53, pero también un regulador positivo del ciclo celular capaz de inhibir los factores implicados en el control de éste. En un experimento similar, las células Saos-2 son cotransfectadas con 1 µg de pl07 ( 385-1068 ) , 8 µg de pCMVNeoBam, 1 µg de pXJMDM2, 8 µg de pXJ41 y 2 µg de pCMVCD20. Los resultados de un experimento representativo son indicados en la Figura 5. Éstos muestran que la expresión de MDM2 puede levantar el bloqueo en Gl, inducido por pl07, y por el mutante de supresión pl 07 ( 385-1068 ) que es capaz de interactuar con MDM2.

Ejemplo 5: MDM2 interactúa in vi tro e i n vi vo con p_107.

Este ejemplo demuestra una interacción física entre MDM2 y pl07, tanto i n vi tro como in vi vo . Estos resultados son correlacionados con la actividad de MDM2 a nivel del ciclo celular (ejemplo 4). .1. In vi tro pl07 marcado en S35 in vi tro es puesto en contacto con la proteína GST-MDM2 (vector pGex- MDM2 ) o GST- MDM2 (1-177) (vector pGex- MDM2 (1-177)) inmovilizada sobre esferas de glutation-sefarosa . pl07 ligada a MDM2 es -r-evelada después del gel de poliacrilamida mediante autorradiografía . Los resultados obtenidos son presentados en la Tabla II siguiente. .2. In vi vo Las células Cos son cotransfectadas con un plásmido pBC- MDM2 o pBC- MDM2 (1-134) que expresan una proteína de fusión GST- MDM2 o GST- MDM2 (1-134), con un plásmido de expresión pl07 o de un mutante de pl07. Los complejos de proteínas GST- MDM2-pl07 provienen de estratos celulares totales y son aislados sobre esferas de glutation-sefarosa, y las proteínas pl07 son reveladas mediante Manchado de Western con un anticuerpo policlonal anti-pl07 (Santa Cruz pl07-C18). Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla II siguiente .

Tabla II (continuación) Los resultados demuestran que existe una interacción proteína-proteína entre MDM2 y pl07 i n vi tro, pero también en la célula. La región de MDM2 necesaria para la transformación celular (1-134) es la región que interactúa con pl07. Esta región ha sido localizada como situada más precisamente en una parte de "dominio de bolsa", región "A" y el "espaciador".

LISTADO DE SECUENCIAS INFORMACIÓN GENERAL: i) SOLICITANTE: A) NOMBRE: RHONE POULENC RORER S.A. B) CALLE: 20, Avenue Raymond Aron C) CIUDAD: ANTONY E) PAÍS: FRANCIA F) CÓDIGO POSTAL: 92165 G) TELÉFONO: 40.91.69.22 H) TELECOPIA: (1) 40.91.72.96 ii) SOLICITANTE: A) NOMBRE: INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDÍCALE (INSERM) B) CALLE: 101, Rué de Tolbiac C) CIUDAD: PARÍS Cedex 123 E) PAÍS: FRANCIA F) CÓDIGO POSTAL: 75654 G) TELÉFONO: 44.23.60.61 H) TELECOPIA: 35.85.68.56 ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: ANTAGONISTAS DE LA ACTIVIDAD ONCOGÉNICA DE LA PROTEÍNA MDM2 Y SU UTILIZACIÓN EN EL TRATAMIENTO DE LOS CANCERES iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 2 iv) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: A) TIPO DE SOPORTE: Cinta B) COMPUTADORA: PC compatible con IBM C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (OEB) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 1: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 1476 pares de bases B) TIPO: nucleótido C) TIPO DE HEBRA: simple D) CONFIGURACIÓN: lineal ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc iii) HIPOTÉTICO: NO iv) ANTISENTIDO: NO ix) CARACTERÍSTICAS: A) NOMBRE/CLAVE: CDS B) LOCALIZACIÓN: 1..1476 xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No. 1: ATG TGC AAT ACC AAC ATG TCT GTA CCT ACT GAT GGT GCT GTA ACC ACC 48 Met Cys Asn Thr Asn Met Ser Val Pro Thr Asp Gly Ala Val Thr Thr 1 5 10 15 TCA CAG ATT CCA GCT TCG GAA CAÁ GAG ACC CTG GTT AGA CCA AAG CCA 96 Ser Gln He Pro Ala Ser Glu Gln Glu Thr Leu Val Arg Pro Lys Pro 20 25 30 TTG CTT TTG AAG TTA TTA AAG TCT GTT GGT GCA CAÁ AAA GAC ACT TAT 1 4 Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Ser Val Gly Ala Gln Lys Asp Thr Tyr 35 40 45 ACT ATG AAA GAG GTT CTT TTT TAT CTT GGC CAG TAT ATT ATG ACT AAA 192 Thr Met Lys Glu Val Leu Phe Tyr Leu Gly Gln Tyr He Met Thr Lys 50 55 60 CGA TTA TAT GAT GAG AAG CAÁ CAÁ CAT ATT GTA TAT TGT TCA AAT GAT 240 Arg Leu Tyr Asp Glu Lys Gln Gln His He Val Tyr Cys Ser Asn Asp 65 70 75 80 CTT CTA GGA GAT TTG TTT GGC GTG CCA AGC TTC TCT GTG AAA GAG CAC 288 Leu Leu Gly Asp Leu Phe Gly Val Pro Ser Phe Ser Val Lys Glu His 85 90 95 AGG AAA ATA TAT ACC ATG ATC TAC AGG AAC TTG GTA GTA GTC AAT CAG 336 Arg Lys He Tyr Thr Met He Tyr Arg Asn Leu Val Val Val Asn Gln 100 105 110 CAG GAA TCA TCG GAC TCA GGT ACÁ TCT GTG AGT GAG AAC AGG TGT CAC 38 Gln Glu Ser Ser Asp Ser Gly Thr Ser Val Ser Glu Asn Arg Cys His 115 120 125 CTT GAA GGT GGG AGT GAT CA AAG GAC CTT GTA CAÁ GAG CTT CAG GAA 432 Leu Glu Gly Gly Ser Asp Gln Lys Asp Leu Val Gln Glu Leu Gln Glu 130 135 140 GAG AAA CCT TCA TCT TCA CAT TTG GTT TCT AGA CCA TCT ACC TCA TCT 480 Glu Lys Pro Ser Ser Ser His Leu Val Ser Arg Pro Ser Thr Ser Ser 145 150 155 160 AGA AGG AGA GCA ATT AGT GAG ACÁ GAA GAA AAT TCA GAT GAA TTA TCT 528 Arg Arg Arg Ala He Ser Glu Thr Glu Glu Asn Ser Asp Glu Leu Ser 165 170 175 GGT GAA CGA CA AGA AAA CGC CAC AAA TCT GAT AGT ATT TCC CTT TCC 576 Gly Glu Arg Gln Arg Lys Arg His Lys Ser Asp Ser He Ser Leu Ser 180 185 190 TTT GAT GAA AGC CTG GCT CTG TGT GTA ATA AGG GAG ATA TGT TGT GAA 624 Phe Asp Glu Ser Leu Ala Leu Cys Val He Arg Glu He Cys Cys Glu 195 200 205 AGA AGC AGT AGC AGT GAA TCT ACÁ GGG ACG CCA TCG AAT CCG GAT CTT 672 Arg Ser Ser Ser Ser Glu Ser Thr Gly Thr Pro Ser Asn Pro Asp Leu 210 215 220 GAT GCT GGT GTA AGT GAA CAT TCA GGT GAT TGG TTG GAT CAG GAT TCA 720 Asp Ala Gly Val Ser Glu His Ser Gly Asp Trp Leu Asp Gln Asp Ser 225 230 235 240 GTT TCA GAT CAG TTT AGT GTA GAA TTT GAA GTT GAA TCT CTC GAC TCA 768 Val Ser Asp Gln Phe Ser Val Glu Phe Glu Val Glu Ser Leu Asp Ser 245 250 255 GAA GAT TAT AGC CTT AGT GAA GAA GGA CAÁ GAA CTC TCA GAT GAA GAT 816 Glu Asp Tyr Ser Leu Ser Glu Glu Gly Gln Glu Leu Ser Asp Glu Asp 260 265 270 GAT GAG GTA TAT CAÁ GTT ACT GTG TAT CAG GCA GGG GAG AGT GAT ACÁ 864 Asp Glu Val Tyr Gln Val Thr Val Tyr Gln Ala Gly Glu Ser Asp Thr 275 280 285 GAT TCA TTT GAA GAA GAT CCT GAA ATT TCC TTA GCT GAC TAT TGG AAA 912 Asp Ser Phe Glu Glu Asp Pro Glu He Ser Leu Ala Asp Tyr Trp Lys 290 295 300 TGC ACT TCA TGC AAT GAA ATG AAT CCC CCC CTT CCA TCA CAT TGC AAC 960 Cys Thr Ser Cys Asn Glu Met Asn Pro Pro Leu Pro Ser His Cys Asn 305 310 315 320 AGA TGT TGG GCC CTT CGT GAG AAT TGG CTT CCT GAA GAT AAA GGG AAA 1008 Arg Cys Trp Ala Leu Arg Glu Asn Trp Leu Pro Glu Asp Lys Gly Lys 325 330 335 GAT AAA GGG GAA ATC TCT GAG AAA GCC AAA CTG GAA AAC TCA ACÁ CAÁ 1056 Asp Lys Gly Glu He Ser Glu Lys Ala Lys Leu Glu Asn Ser Thr Gln 340 345 350 GCT GAA GAG GGC TTT GAT GTT CCT GAT TGT AAA AAA ACT ATA GTG AAT 1104 Ala Glu Glu Gly Phe Asp Val Pro Asp Cys Lys Lys Thr He Val Asn 355 360 365 GAT TCC AGA GAG TCA TGT GTT GAG GAA AAT GAT GAT AAA ATT ACÁ CAÁ 1152 Asp Ser Arg Glu Ser Cys Val Glu Glu Asn Asp Asp Lys He Thr Gln 370 375 380 GCT TCA CAÁ TCA CAÁ GAA AGT GAA GAC TAT TCT CAG CCA TCA ACT TCT 1200 Ala Ser Gln Ser Gln Glu Ser Glu Asp Tyr Ser Gln Pro Ser Thr Ser 385 390 395 400 AGT AGC ATT ATT TAT AGC AGC CAÁ GAA GAT GTG AAA GAG TTT GAA AGG 1248 Ser Ser He He Tyr Ser Ser Gln Glu Asp Val Lys Glu Phe Glu Arg 405 410 415 GAA GAA ACC CA GAC AAA GAA GAG AGT GTG GAA TCT AGT TTG CCC CTT 1296 Glu Glu Thr Gln Asp Lys Glu Glu Ser Val Glu Ser Ser Leu Pro Leu 420 425 430 AAT GCC ATT GAA CCT TGT GTG ATT TGT CAÁ GGT CGA CCT AAA AAT GGT 134 Asn Ala He Glu Pro Cys Val He Cys Gln Gly Arg Pro Lys Asn Gly 435 440 445 TGC ATT GTC CAT GGC AAA ACÁ GGA CAT CTT ATG GCC TGC TTT ACÁ TGT 1392 Cys He Val His Gly Lys Thr Gly His Leu Met Ala Cys Phe Thr Cys 450 455 .60 GCA AAG AAG CTA AAG AAA AGG AAT AAG CCC TGC CCA GTA TGT AGA CAÁ 14 0 Ala Lys Lys Leu Lys Lys Arg Asn Lys Pro Cys Pro Val Cys Arg Gln 465 470 475 480 CCA ATT CAÁ ATG ATT GTG CTA ACT TAT TTC CCC TAG 1476 Pro He Gln Met He Val Leu Thr Tyr Phe Pro * 485 490 2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA: SEQ ID No. 2: i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: A) LONGITUD: 1182 pares de bases B) TIPO: nucleótido C) TIPO DE HEBRA: simple D) CONFIGURACIÓN: lineal ií) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc iii) HIPOTÉTICO: NO iv) ÁNTISENTIDO: NO ix) CARACTERÍSTICAS: A) NOMBRE/CLAVE: CDS B) LOCALIZACIÓN: 1..1182 x i ) DE SCR I PC I ÓN DE LA SECUENC IA : SEQ I D No . 2 : ATG GAG GAG CCG CAG TCA GAT CCT AGC GTC GAG CCC CCT CTG AGT CAG 48 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln GAA ACÁ TTT TCA GAC CTA TGG AAA CTA CTT CCT GAA AAC AAC GTT CTG 96 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 TCC CCC TTG CCG TCC CAÁ GCA ATG GAT GAT TTG ATG CTG TCC CCG GAC 144 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp 35 40 45 GAT ATT GAA CAÁ TGG TTC ACT GAA GAC CCA GGT CCA GAT GAA GCT CCC 192 Asp He Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 AGA ATG CCA GAG GCT GCT CCC CCC GTG GCC CCT GCA CCA GCA GCT CCT 240 Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro 65 70 75 80 ACÁ CCG GCG GCC CCT GCA CCA GCC CCC TCC TGG CCC CTG TCA TCT TCT 288 Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser 85 90 95 GTC CCT TCC CAG AAA ACC TAC CAG GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC 336 Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly 100 105 110 TTC TTG CAT TCT GGG ACÁ GCC AAG TCT GTG ACT TGC ACG TAC TCC CCT 384 Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro 115 120 125 GCC CTC AAC AAG ATG TTT TGC CAÁ CTG GCC AAG ACC TGC CCT GTG CAG 432 Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln 130 135 140 CTG TGG GTT GAT TCC AC CCC CCG CCC GGC ACC CGC GTC CGC GCC ATG 480 Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met 145 150 155 160 GCC ATC TAC AAG CAG TCA CAG CAC ATG ACG GAG GTT GTG AGG CGC TGC 528 Ala He Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys 165 170 175 CCC CAC CAT GAG CGC TGC TCA GAT AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG 576 Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln 180 185 190 CAT CTT ATC CGA GTG GAA GGA AAT TTG CGT GTG GAG TAT TTG GAT GAC 62 His Leu He Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp 195 200 205 AGA AAC ACT TTT CGA CAT AGT GTG GTG GTG CCC TAT GAG CCG CCT GAG 672 Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu 210 215 220 GTT GGC TCT GAC TGT ACC ACC ATC CAC TAC AAC TAC ATG TGT AAC AGT 720 Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr He His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser 225 230 235 240 TCC TGC ATG GGC GGC ATG AAC CGG AGG CCC ATC CTC ACC ATC ATC ACÁ 768 Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro He Leu Thr He He Thr 245 250 255 CTG GAA GAC TCC AGT GGT AAT CTA CTG GGA CGG AAC AGC TTT GAG GTG 816 Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val 260 265 270 CGT GTT TGT GCC TGT CCT GGG AGA GAC CGG CGC ACÁ GAG GAA GAG AAT 864 Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn 275 280 285 CTC CGC AAG AAA GGG GAG CCT CAC CAC GAG CTG CCC CCA GGG AGC ACT 912 Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr 290 295 "~ 300 AAG CGA GCA CTG CCC AAC AAC ACC AGC TCC TCT CCC CAG CCA AAG AAG 960 Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys 305 310 315 320 AAA CCA CTG GAT GGA GAA TAT TTC ACC CTT CAG ATC CGT GGG CGT GAG 1008 Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln He Arg Gly Arg Glu 325 330 335 CGC TTC GAG ATG TTC CGA GAG CTG AAT GAG GCC TTG GAA CTC AAG GAT 1056 Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp 340 345 350 GCC CAG GCT GGG AAG GAG CCA GGG GGG AGC AGG GCT CAC TCC AGC CAC 1104 Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His 355 360 365 CTG AAG TCC AAA AAG GGT CAG TCT ACC TCC CGC CAT AAA AAA CTC ATG 1152 Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met 370 375 380 TTC AAG ACÁ GAA GGG CCT GAC TCA GAC TGA 1182 Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp * 385 390 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica" la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (25)

REIVINDICACIONES

1. El uso de un compuesto capaz de antagonizar al menos parcialmente la actividad oncogénica de la proteína Mdm2 para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de los cánceres en el contexto p53 nulo.

2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, de un compuesto capaz de ligarse al nivel del dominio 1-134 de la secuencia de la proteína Mdm2 representada en la SEQ ID No. 1.

3. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el compuesto es un scFV dirigido contra el dominio 1-134 de la proteína Mdm2.

4. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el compuesto es representado total o parcialmente por uno de los péptidos 1-52, 1-41, 6-41, 16-25, 18-23 de la secuencia representada en la SEQ ID No. 2 o de sus derivados .

5. El uso de conformidad con la reivindicación 1, de un compuesto capaz de ligarse a un dominio cercano al dominio 1-134 representado en la SEQ ID No. 1 de la proteína Mdm2, y que afecta por parte de esta unión, la actividad oncogénica de dicha proteína .

6. El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 5, caracterizado porque el compuesto interactúa con el dominio C terminal de la proteína Mdm2 ,

7. El uso de conformidad con la reivindicación 1, 5 ó 6, caracterizado porque éste es un factor transcripcional elegido entre TFIT, TBP y TAF250.

8. El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 5, caracterizado porque el compuesto interactúa con el dominio 135-491 de la proteína Mdm2.

9. El uso de conformidad con la reivindicación 1, 5 u 8, caracterizado porque se trata de toda o parte de una proteína elegida entre las proteínas Rb, L5 y el factor transcripcional E2F.

10. El uso de un scFV dirigido contra el dominio 1-134 de la proteína Mdm2 para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de los cánceres.

11. El uso de un ácido nucleico que codifica para un compuesto capaz de antagonízar la actividad oncogénica de la proteína Mdm2 para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de los cánceres en el contexto p53 nulo.

12. El uso de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque se trata de: ácidos nucleicos antisentido, oligonucleótidos ligandos capaces de fijarse directamente a uno de los dominios de la proteína Mdm2 y de inhibir su actividad oncogénica, los ácidos nucleicos que codifican para toda o parte de los péptidos o proteínas capaces de oligomerizarse con uno de los dominios de Mdm2 y de inhibir su actividad oncogénica, los ácidos nucleicos que codifican para los anticuerpos intracelulares dirigidos contra el dominio 1-134 de la secuencia de la proteína Mdm2 representada en la SEQ ID No. 1.

13. El uso de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el ácido nucleico antisentido es un ADN que codifica para un ARN complementario del ácido nucleico que codifica para la proteína Mdm2, y capaz de bloquear su transcripción y/o su traducción (ARN antisentído) o una ribozima.

14. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a_ la 13, caracterizado porque el ácido nucleico es utilizado bajo la forma formada en complejo con el DEAE-dextrano, con las proteínas nucleares, o con los lípidos o polímeros catiónicos, bajo la forma de liposomas e incluso tal cual.

15. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a la 13, caracterizado porque el ácido nucleico forma parte de un vector.

16. El uso de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el ácido nucleico forma parte de un vector viral, elegido entre los adenovirus, los retrovirus y los virus adeno-asociados.

17. Un vector viral, caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un compuesto capaz de inhibir al menos parcialmente la actividad oncogénica de la proteína Mdm2.

18. El vector viral de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la secuencia de ácidos nucleicos codifica para un scFV o un péptido capaz de interactuar a nivel del dominio 1-134 (SEQ ID No. 1) de la proteína Mdm2.

19. El vector viral de conformidad con la reivindicación 17 ó 18, caracterizado porque éste se elige entre los adenovirus, los retrovirus y los virus adeno-asociados.

20. El vector viral de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a la 19, caracterizado porque se t-rata de un adenovirus o de un retrovirus .

21. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un compuesto capaz de inhibir la actividad oncogénica de la proteína Mdm2 tal como se define de conformidad con las reivindicaciones 1 a la 11.

22. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para un compuesto capaz de inhibir la actividad oncogénica de la proteína Mdm2, tal como se define de conformidad con la reivindicación 12 ó 13.

23. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque ésta comprende al menos un vector viral de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a la 20.

24. La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque es formulada con miras a una administración intra-tumoral .

25. El uso de una secuencia nucleica que codifica para los anticuerpos intracelulares, dirigidos contra el dominio 1-134 (SEQ ID No. 1) de la proteína Mdm2, para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento del cáncer.