MXPA97008877A - P62, sus variantes, las secuencias de acidos nucleicos que los codifican, y su utilizacion en terapia genica anti-cancerosa - Google Patents

Abstract

La presente invención describe un péptido novedoso designado como P62 o Sam68, las variantes del mismo, las secuencias deácidos nucleicos correspondientes, y los usos de los mismos, particularmente en terapia génica anticancerosa.

Description

?P62, SUS VARIANTES, LAS SECUENCIAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS QUE LOS CODIFICAN, Y SU UTILIZACIÓN EN TERAPIA GENICA ANTICANCEROSA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a un polipéptido novedoso, designado ?P62, sus variantes, las secuencias nucleicas correspondientes, y su utilización terapéutica, particularmente en terapia génica anti-cancerosa. Diferentes genes, llamados oncogenes y genes supresores, están implicados en el control de la división celular. Entre éstos, los genes ras, y sus productos, designados por lo general proteínas p21, desempeñan un papel clave en el control de la proliferación celular en todos los organismos eucarióticos en • donde han sido investigados. Particularmente, se ha demostrado que ciertas modificaciones especificas de estas proteínas les hacen perder su control normal, y los conducen a volverse cncogénicos. Asi, un gran número de tumores humanos ha sido asociado a la presencia de genes ras modificados. Asimismo, una sobreexpresión de estas proteínas p21 puede conducir a una alteración de la proliferación celular. La comprensión del papel exacto de estas proteínas p21 en las células, de su modo de funcionamiento y de sus características REF: 25930 constituye así una posición importante para la comprensión y la aproximación terapéutica de la génesis del cáncer. In vivo, no se conoce la naturaleza precisa de los acontecimientos responsables de la transducción de la señal iniciada por las proteínas p21. Sin embargo, un número creciente de resultados subraya la multiplicidad de los efectores, que interaccionan directamente y preferentemente con la forma activa (unida al GTP) de las proteínas ras. Entre estos efectores, la proteína GAP ha sido la primera cuya implicación en la transducción de la señal ha sido documentada. Se trata de una proteína citosólica presente en todos los organismos eucarióticos que poseen la facultad de acelerar fuertemente la hidrólisis del GTP, unida a la proteína normal. Ella posee dos dominios que aseguran funciones distintas. Su extremidad carboxi-terminal lleva la actividad catalítica que interacciona con las proteínas p21, y que aumenta su actividad de GTPasa. En su otro extremo, más abajo de la parte N-terminal, se encuentra una yuxtaposición de los dominios SH2 y SH3, que participan en la transducción del mensaje e interaccionan con otras proteínas. Entre estas proteínas se encuentran dos proteínas, p62 y pl90, respectivamente de 62 kDa y 190 kDa, que están fuertemente fosforiladas en la tirosina. Estas dos proteínas forman un complejo específico con GAP, y son mmunoprecipitadas por anticuerpos dirigidos contra diferentes epitopes de GAP. Se sabe en particular que es al nivel de los dominios SH2 del GAP que se producen las interacciones de pß2 con GAP. Los ammo ácidos 271 a 443 de pß2 contienen tirosmas fosforiladas, y parecen implicadas en estas interacciones. Estas mismas fosforilaciones parecen por otro lado participar en interacciones entre p62 y el adaptador GRB2. Por otra parte, a lo largo de la secuencia de p62. Están repartidos sitios de consenso, ricos en prolmas que participan en la unión a los dominios SH3 de las tirosma cmasas de la familia src, así como de la fosfolipasa C?. La proteina p62 (o también Sam68) ha sido identificada por Wong et al. (Cell 69 (1992) 551). Ella comprende 443 ammo ácidos, cuya secuencia ha sido descrita en la literatura (ver SEQ ID No. 1) . Ademas de las características mencionadas anteriormente, la proteína p62 presenta varias características propias de las hnRNP ("RiboNucleoProteina nuclear heterogénea") . - ella es rica en glicinas - ella posee regiones ricas en argininas - además, sus ammo ácidos 145 a 247 definen una región de fuerte homología con una hnRNP descrita anteriormente, la GRP33. Esta región contiene un sitio de consenso de unión al ARNs homólogo al contenido en la hnRNP K. Este sitio de consenso está designado dominio KH (KH = hnRNPK Homologo) . Los residuos conservados son esenciales para la unión a los ARNs, y el impacto de la no integridad de este dominio en una patología ha sido demostrado para FMR1, que es el producto del gen asociado al retardo metal que se observa en el síndrome del X-frágil (Siomi et al., Cell 77 33 (1994) ) . La presente invención reside particularmente en la demostración de la importancia de la proteína p62 (Sam68) en la proliferación y la muerte celulares. Ella se origina más particularmente de que se pone en evidencia que los derivados de p62 son capaces de interferir en el proceso de transformación celular, y particularmente de inhibir las señales transducidas por las proteínas ras y src. Ella resulta además de la demostración particularmente sorprendente de que estos derivados están igualmente dotados de propiedades apoptóticas, y así capaces de inducir la muerte celular. n primer objeto de la invención se relaciona así a cualquier derivado de p62 capaz de inhibir al menos en parte la interacción entre una proteína GAP y p62. Preferentemente, los derivados según la invención son capaces de inhibir al menos en parte el poder oncogénico de las proteínas ras y/o src. Aun más preferentemente, los derivados según la invención son capaces de inducir la muerte celular por apoptosis. Los derivados según la invención están igualmente caracterizados por la perdida de la capacidad de interaccionar con el ARN de p62. La presente invención describe en particular la puesta en evidencia, el clonado y la caracterización de una isoforma natural de la proteína p62. Esta isoforma, designada ?P62, (o ?Sam68) , presenta una supresión en la zona de homología a la protema GRP33, que cubre el dominio KH. En razón de esta supresión, ?P62 no posee la totalidad de las propiedades de p62. Asi, ?P62 posee un dominio de interacción con GAP y GRB2 intacto, así como las diferentes secuencias ricas en prolmas copartícipes de SH3 (Figura 1). Sin embargo, ?P62 ya no es capaz de interaccionar con los ácidos nucleicos, con motivo de la supresión del dominio de homología a la proteina GRP33. La Solicitante ha demostrado igualmente que la transferencia del ADNc de ?P62 a diferente modelos celulares normales o tumorales se opone a la cooperación entre p62 y Ras, e inhibe las señales transducidas por las proteínas Ras normales y oncogénicas. Sobreexpresada, la ?P62 interfiere así con los procesos de proliferación y de diferenciación y conduce, en los diferentes modelos celulares, a la muerte celular por apoptosis . Según un modelo preferido, la invención se relaciona más particularmente a cualquier derivado de p62 que lleva al menos una supresión en la zona de homología a la proteína GRP33. Mac particularmente, los derivados según la invención comprenden al menos una supresión en la región comprendida entre los residuos 145 a 247 de la proteina p62, tal como la representada sobre la secuencia SEQ ID No. 1, y que cubre el dominio KH. La supresión se da ventajosamente sobre más de 10 amino ácidos y, más preferiblemente, sobre más de 30 amino ácidos. Ella puede concernir a uno o varios sitios en el interior de esta región, en cuanto que el derivado resultante presente las propiedades descritas anteriormente. Ee una manera pa icularmente ventajosa, el derivado según la invención es un polipéptido que comprende todo o parte de ia secuencia SEQ ID No. 2, o una variante de la misma. El término variante en el sentido de la invención debi n cualquier polipépt do cuya estructura se distingue ae ia secuencia SEQ ID No. 2 por una o varias modificaciones ae naturaleza genética, bioquímica y/o química. Puede tratarse en particular de cualquier mutación, substitución, supresión, adición y/o modificación de uno o varios residuos. Tales derivados pueden ser generados con objetivos diferentes, tales como particularmente el de aumentar la afinidad del péptido por su sitio de interacción, el de mejorar sus niveles de producción, el de aumentar su resistencia a las proteasas, o de mejorar su paso a través de las membranas celulares, el de aumentar su eficacia terapéutica, o de reducir sus efectos secundarios, o el de conferirle nuevas propiedades farmacocinéticas y/o biológicas. Ventajosamente, las variantes comprenden supresiones o mutaciones que se llevan sobre amino ácidos cuya presencia no es determinante para la actividad del derivado. Tales amino ácidos pueden ser identificados por ejemplo por pruebas de actividad celular como las descritas en los ejemplos. De una manera particularmente preferida, los derivados de la invención retienen al menos una parte de la proteína p62 que permite la interacción con el dominio SH2 de GAP. Esta parte de p62 está constituida más particularmente de tirosinas fosforiladas, localizadas entre los residuos 200 a 450 de la proteína p62 (Comparar SEQ ID No. 1) . Un derivado preferido según la invención comprende así al menos (i) una supresión en la región comprendida entre los residuos 145 a 247 de p62 y (ii) una parte de p62 que permite la interacción con el dominio SH2 de GAP. Más preferiblemente, la supresión se da sobre los residuos 1 a En este respecto, la Solicitante ha demostrado igualmente que los derivados según ia invención que presentan propiedades particularmente interesantes pueden estar constituidos de polipéptidos que comprenden esencialmente la región que lleva las tirosmas fosfopladas de p62. Un ejemplo particularmente preferido de polipéptido según ia invención se representa por ei polipéptido ?P62 de secuencia SEQ ID No. 2, que posee una supresión de los residuos 170-208 de la secuencia de p62. Otro ejemplo se representa por el polipeptido p62-C, que comprende los residuos 203 a 443 de p62 (secuencia SEQ ID No. 3) . LOS resultados presentados en la presente solicitud muestran particularmente que ?P62 puede entrar en competencia con p62 frente a GAP. Siendo GAP uno de los efectores de las proteínas Ras, ?P62 bloquea las vías mitogénicas aependientes. Sobreexpresada por transferencia de gen (transfeccion, infección, microinyección, etc.) ?P62 induce la muerte celular por apoptosis en las células normales (f broblastos NIH3T3 y Swiss 3T3) o tumorales (H460; HCT116), y es capaz de inhibir la formación de focos inducidos por ras. Este mismo efecto se obtiene con el derivado p62-c (que comprende esencialmente la parte c-terminal de ?P62, que cubre la región comprendida entre los amíno ácidos 203 y 443, y que corresponde al dominio de interacción con los dominios SH2 de GAP y de GRB2) . Esta parte C-terminal contiene igualmente tres de los sitios de interacción con los dominios SH3, los que tienen más afinidad por Fyn. La actividad terapéutica importante de ios derivados según la invención está unida a sus propiedades múltiples, y particularmente a su poder de titulación de los dominios SH3 de las proteínas de la familia src (ejemplo: fyn), su capacidad de inhibición del reclutamiento de GRB2 titulando su dominio SH2, y su capacidad de inhibición de la función efectora de la proteina GAP para las vías de señalización que dependen se Ras . ütro objeto de la presente invención se relaciona a cualquier ácido nucleico que codifica para un polipéptido tai como el definido anteriormente. El ácido nucleico según la invención puede ser un acido ribonucleico (ARN) o desoxirribonucleico (ADN) . Además, pude tratarse de un ADN genómico (ADNg) o complementario (ADNc) . Puede ser de origen humano, animal, viral, sintético o semismtético. Puede ser obtenido de diferentes maneras, y particularmente por síntesis química, utilizando las secuencias presentadas en la solicitud, y por ejemplo un sintetizador de ácido nucleicos. Puede igualmente ser obtenido por examen de bancos por medio de sondas específicas, particularmente tales como las descritas en la solicitud (ver las secuencias SEQ ID No. 6 y 7 por ejemplo) . Puede además ser obtenido por técnicas mixtas, que incluyen la modificación química (elongación, supresión, substitución, etc.) de secuencias examinadas a partir de bancos. De una manera general, los ácidos nucleicos de la invención pueden ser preparados según cualquier técnica conocida por el experto en la técnica. De preferencia, el ácido nucleico según la invención es un ADNc o un ARN. El ácido nucleico según la invención ventajosamente se selecci na de entre: aj toda o parte de la secuencia SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 3 o de su hebra complementaria; (b) cualquier secuencia que se hibride con las secuencias de (a) y que codifiquen para un derivado según ia invención, (CÍ las vareantes de (a) y de (b) que resulten de la degeneración del código genético.

Como se indicó anteriormente, la solicitante ahora ha aislado y caracterizado secuencias novedosas de ácido nucleico que codifican para polipéptidos derivados de p62, que tienen propiedades antiproliferativas y apoptóticas completamente notables. Estos ácidos nucleicos ahora pueden ser utilizados como agentes terapéuticos, para producir en las células derivados según la invención, capaces de destruir o de corregir disfunciones celulares. Con este fin, la presente invención se relaciona igualmente a cualquier cásete de expresión que comprende un ácido nucleico tal como el definido anteriormente, un promotor que permite su expresión, y una señal de terminación de la transcripción. El promotor se selecciona ventajosamente entre los promotores funcionales en las células de mamíferos, de preferencia humanos. Más preferiblemente, se trata de un promotor que permite la expresión de un ácido nucleico en una célula hiperproliferativa (cancerosa, restenosa, etc.) A este respecto, pueden ser utilizados diferentes promotores. Puede tratarse por ejemplo del propio promotor del gen p62. Puede tratarse igualmente de regiones de origen diferente (responsables de la expresión de otras proteínas, o incluso sintéticas) . Puede tratarse así de cualquier promotor o secuencia derivada que estimule o reprima la transcripción de un gen de manera específica o no, inducible o no, fuerte o débil. Se pueden citar particularmente las secuencias promotoras de genes eucarióticos o virales. Por ejemplo, puede tratarse de secuencias promotoras que provienen del genoma de la célula objetivo. Entre los promotores eucarióticos, se pueden utilizar en particular promotores ubiquitarios (promotor de los genes HPRT, PGK, a-actina, tubulina, etc.), de promotores de los filamentos intermediarios (promotor de los genes GFAP, desmina, vimentina, neurofilamentos, queratina, etc.), de promotores de genes terapéuticos (por ejemplo el promotor de los genes MDR, CFTR, Factor VIII, ApoAI, et.), de promotores específicos de tejidos (promotor del gen de la piruvato cinasa, villina, proteína intestinal de unión de los ácidos grasos, a-actina del músculo liso, etc.) o aún de promotores que responden a un estímulo (receptor de ias hormonas esteroidales, receptor del ácido retinoico, etc.). Asimismo, puede tratarse de secuencias promotoras que provienen del genoma de un virus, tal como por ejemplo los promotores de los genes E1A y MLP de adenovirus, el promotor precoz de CMV, o aún el promotor de LTR del RSV, etc. Además, estas regiones promotoras pueden ser modificadas por adición de secuencias de activación, de regulación, o que permiten una expresión específica de un tejido o mayoritaria.

La presente invención proporciona agentes terapéuticos novedosos que permiten, por sus propiedades antiproliferativas y/o apoptóticas interferir con numerosas disfunciones celulares. Con este objetivo, los ácidos nucleicos o casetes según la invención pueden ser inyectados tal cual al nivel del sitio a tratar, o incubados directamente con las células que se van a destruir o tratar. En efecto, se ha descrito que los ácidos nucleicos no podrían penetrar en las células sin un vector particular. Sin embargo, se prefiere en el marco de la presente invención utilizar un vector de administración, que permita mejorar (i) la eficacia de la penetración celular, (ii) el examen (iii) la estabilidad extra- e intra-celulares . En un modo de aplicación particularmente preferido de la presente invención, el ácido nucleico o el cásete se incorpora en un vector. El vector utilizado puede ser de origen químico (liposoma, nanopartícula, complejo peptídico, lípidos o polímeros catiónicos, etc.), viral (retrovirus, adenovirus, virus del herpes, AAV, virus de la vacuna, etc.) o plasmídico. La utilización de vectores virales se poya en las propiedades naturales de transfección de los virus. Así, es posible utilizar por ejemplo los adenovirus, los herpes virus, los retrovirus y los virus adeno asociados. Estos vectores se revelan particularmente muy eficientes en el aspecto de la transfección. En este respecto, un objeto preferido según la invención reside en un retrovirus recombinante defectivo, cuyo genoma comprende un ácido nucleico tal como el definido anteriormente. Otro objeto particular de la invención reside en un adenovirus recombinante defectivo, cuyo genoma comprende un ácido nucleico tal como el definido anteriormente. El vector según la invención puede igualmente ser un agente no viral, capaz de promover la transferencia y la expresión de ácidos nucleicos en células eucarióticas. Los vectores químicos o bioquímicos, sintéticos o naturales, representan una alternativa interesante a los virus naturales, en particular por razones de comodidad, de seguridad e igualmente por la ausencia de límite teórico en lo que concierne al tamaño del ADN a transfectar. Estos vectores sintéticos tienen dos funciones principales, compactar el ácido nucleico a transfectar, y promover su fijación celular, asi como su paso a través de la membrana plasmática y, llegado el caso, las dos membranas nucleares. Para compensar la naturaleza polianiónica de los ácidos nucleicos, los vectores no virales poseen todos cargas policatiónicas.

El ácido nucleico o el vector utilizado en la presente invención puede ser formulado para su administración por vía tópica, oral, parenteral, mtranasal, intravenosa, intramuscular, sub-cutánea, mtraocular, transdérmica, etc. De preferencia, el ácido nucleico o el vector se utiliza bajo una forma inyectable. Puede así ser mezclado con cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable para una formulación inyectable, particularmente para una inyección directa al nivel del sitio a tratar. Puede tratarse en particular de soluciones estériles, isotónicas, o de composiciones secas, particularmente liofilizadas, que, por adición según el caso de agua esterilizada o de suero fisiológico, permiten la constitución de soluciones inyectables. Una inyección directa del ácido nucleico en el tumor del paciente es interesante, pues ella permite concentrar el efecto terapéutico al nivel de los tejidos afectados. Las dosis del ácido nucleico utilizadas pueden ser aaaptadas en función de diferentes parámetros, y particularmente en función del gen, del vector, del modo de administración utilizado, de la patología concernida, o aun de la duración del tratamiento buscado. La invención concerne igualmente a toda composición farmacéutica que comprende al menos un ácido nucleico.

Ella concierne igualmente a toda composición farmacéutica que comprende al menos un vector tal como el definido anteriormente. Ella concierne también a toda composición farmacéutica que comprende al menos un derivado de p62 tal como el definido anteriormente. Debido a sus propiedades antiproliferativas, las composiciones farmacéuticas según la invención están muy particularmente adaptadas para el tratamiento de transtornos hiperproliferativos, tales como particularmente los cánceres y la restenosis. La presente invención proporciona así un método particularmente eficaz para la destrucción de células, particularmente de células hiperproliferativas. Ella puede ser utilizada in vitro o ex vivo. Ex vivo, ella consiste esencialmente en incubar las células en presencia de uno o varios ácidos nucleicos (o de un vector, o cásete o directamente del derivado) . In vivo, ella consiste en administrar al organismo una cantidad activa de un vector (o de un cásete) según la invención, de preferencia directamente al nivel del sitio a tratar (un tumor particularmente) . En este respecto, la invención tiene igualmente por objeto un método de destrucción de células hiperproliferativas, que comprende que se pongan en contacto las células o una parte de ellas con un ácido nucleico tal como el definido anteriormente. La presente invención se utiliza ventajosamente in vivo para la destrucción de células en hiperproliferación (es decir, en proliferación anormal) . Ella es así aplicable a la destrucción de las células tumorales, o células de músculo liso de la pared vascular (restenosis) . Ella es muy particularmente apropiada para el tratamiento de cánceres en los cuales está implicado un oncogen activado. A título de ejemplo, se pueden citar los adenocarcinomas de colon, los cánceres de la tiroides, los carcinomas del pulmón, las leucemias mieloides, los cánceres colorectales, los cánceres del seno, los cánceres del pulmón, los cánceres gástricos, los cánceres del esófago, los linfo as B, los cánceres de los ovarios, los cánceres de la vejiga, los glioblastomas, los hepatocarcinomas, los cánceres de los huesos, de la piel, del páncreas o aún los cánceres del riñon y de la próstata, etc. Los productos de la invención son igualmente útiles para la identificación de otros copartícipes de las vías de señalización de los oncogenes, por investigación de inhibidores, de agonistas, de competidores o de moléculas que interaccionan in vivo con estos productos.

Por otro lado, la invención se relaciona igualmente a las secuencias antisentido, cuya expresión en una célula objetivo permite controlar la transcripción y/o la traducción de ARNm celulares que codifican para ?62 o ?p62. Tales secuencias pueden por ejemplo ser transcritas en la célula objetivo en ARN complementarios de los ARNm celulares ?p62 o p62, y bloquear así su traducción en proteína según la técnica descrita en la patente EP 140 308. Tales secuencias pueden estar constituidas por todas o parte de las secuencias nucleicas SEQ ID No. 1, 2 o 3, transcritas en la orientación inversa. La presente invención se relaciona igualmente a la utilización de todo compuesto capaz de inducir la expresión o la sobreexpresión de ?p62 en una célula, para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de transtornos hiperpioliferativos . La presente invención se describirá más en detalle con la ayuda de los ejemplos que siguen, que deben ser considerados como ilustrativos y no limitantes. Textos de las Figuras Figura 1: Representación esquemática de los dominios estructurales de p62 y ?p62.

Figura 2 : Efecto de p62 y ?p62 sobre la transactivación por las proteínas ras de un RRE derivado del intensificador del virus de polioma. Figura 3: Evidencia de la muerte celular inducida por ?p62 en los fibroblastos NIH3T3. Figura 4: Evidencia de la expresión de ?p62 en fibroblastos embrionarios tratados con diferentes agentes citotóxicos y por privación de suero. Figura 5: Inhibición de. la formación de focos inducida or los oncogenes. Técnicas generales de biología molecular Los métodos utilizados de forma clásica en biología molecular, tales como las extracciones preparativas de ADN plasmídico, la centrifugación de ADN plasmídico en gradiente de cloruro de cesio, la electroforesis sobre geles de agarosa o de acrilamida, la purificación de fragmentos de ADN por electroelución, las extracciones de proteínas en fenol o en fenol-cloroformo, la precipitación de ADN en medio salino con etanol o isopropanol, la transformación en Escherichia coli, etc... son muy conocidas por el experto en la técnica, y están descritas abundantemente en la literatura [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982; Ausubel, F. M. et al., (editores), "Current Protocols m Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987] . Los plásmidos de tipo pBR322, pUC y los fagos de la serie M13 son de origen comercial (Bethesda Research Laboratories) . Para las ligaduras, los fragmentos de ADN pueden ser separados según su tamaño, por electroforesis en geles de agarosa o de acrilamida, extraídos en fenol o con una mezcla de fenol/cloroformo, precipitados con etanol y después incubados en presencia de la ADN ligasa del fago T4 (Biolabs) según las recomendaciones del proveedor. El relleno de los extremos 5' prominentes puede ser efectuado por el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli (Biolabs) según las especificaciones del proveedor. La destrucción de los extremos 3' prominentes se efectúa en presencia de la ADN polimerasa del fago T4 (Biolabs) utilizado según las recomendaciones del fabricante. La aestruccion de los extremos 5' prominentes se efectúa con un tratamiento facilitado por la nucleasa SI. La mutagenesis dirigida ín vitro por oligodesoxmucleótidos sintéticos puede ser efectuada según el método desarrollado por Taylor et al. [Nucleic Acids Res., 13 8749-8764 (1985)], utilizando el estuche distribuido por Amersham. La amplificación enzimática de fragmentos de ADN por la técnica llamada de RCP [Reacción en Cadena catalizada por Polimerasa, Saiki R. K. Et al., Science 230 1350-1354 (1985); Mullís, K. B. y Faloona, F. A., Meth. Enzym., 155 335-350 (1987)] puede ser efectuada utilizando un "ciclador térmico de ADN" (Perkin Elmer Cetus) según las especificaciones del fabricante. La verificación de las secuencias nucleotídicas puede ser efectuada por el método desarrollado por Sanger et al. [Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74 5463-5467 (1977)], utilizando el estuche distribuido por Amersham. Ejemplos Ejemplo 1; Aislamiento del ADN complementario de ?p62. El ADN complementario de ?p62 se aisló por RCP sobre una población de ADN complementario sintetizado a partir de AP" poli A+ extraídos de placenta humana. Se utilizó 1 µg de ADN, conjuntamente a los cebos derivados de la secuencia de p62, y que cubren los amino ácidos 123 a 131 por una parte (oligo 5') y 437 a 443 por otra parte (oligo 3'). Las secuencias de estos cebos son las siguientes: oligo 5' : CAGCTGCTGACGGCAGAAATTGAG (SEQ ID No. 4) oligo 3' : TTAATAACGTCCATATGGGTGCTC (SEQ ID No. 5) Las reacciones se condujeron a 55° C, y dieron dos productos, separados por electroforesis sobre gel de agarosa: - una banda de 987 pares de bases, que corresponde al producto de RCP de p62. - una banda de 870 pares de bases, que corresponde al producto de RCP de ?p62. Esta última banda se clonó, y su secuencia correspondió exactamente a la secuencia de p62, excepción hecha de una supresión de 117 pares de bases, en el dominio de homología a la GRP33. La secuencia completa de ?p62 se presenta en SEQ ID No. 2 (ver también la Figura 1) . La existencia de esta isoforma de p62 se confirmó por examen de un banco de ADN complementario de placenta humana establecido en el vector ?gt 11. El oligonucleótido utilizado para este examen es un 24-mer correspondiente a la unión específica de la supresión presente en ?p62. La secuencia de este oligonucleótido es: CAGTATCCCAAGGAGGAAGAGCTG (SEQ ID No. 6) Ejemplo 2: Construcción de vectores de expresión de ?p62 y p62-C. Este ejemplo describe la construcción de vectores utilizables para la transferencia de los ácidos nucleicos de la invención in vitro o in vivo. 2.1. Vector plasmídico: Para la construcción de vectores plasmídicos, se utilizaron 2 tipos de vectores. - El vector SV2, descrito en DNA Cloning, A practical approach Vol. 2, D. M. Glover (Ed.), IRL Press, Oxford, Washington, D. C, 1985. Este vector es un vector de expresión eucariótico. Los ácidos nucleicos que codifican para las variantes p62-C y ?p62 se insertaron en este vector, bajo la forma de los fragmentos EcoRI . Se colocaron así bajo el control del promotor del intensificador del virus SV40. - El vector pcDNA3 (Invitrogen) . Se trata igualmente de un vector de expresión eucariótico. Los ácidos nucleicos que codifican para las variantes ?62-C y ?p62, insertados en este vector bajo la forma de fragmentos EcoRI, se colocaron así bajo el control del promotor precoz de CMV. 2.2. Vector Viral Según un modo particular, la invención reside en la construcción y la utilización de vectores virales que permiten la transferencia y la expresión ín vivo de los ácidos nucleicos tales como los definidos anteriormente. Se trata más particularmente de adenovirus, de diferentes serotipos, cuya estructura y propiedades, que varían muy poco, han sido caracterizadas. Entre estos serotipos, se prefiere utilizar en el marco de la presente invención los adenovirus humanos del tipo 2 o 5 (Ad 2 o Ad ) , o los adenovirus de origen animal (ver la solicitud WO 94/26914). Entre los adenovirus de origen animal utilizables en el marco de la presente invención se pueden citar los adenovirus de origen canino, bovino, murino, (ejemplo: Mavl, Beard et al., Virology 75 81 (1990), ovino, porcino, aviar o aún símico (ejemplo: SAV) . De preferencia, ei adenovirus de origen animal es un adenovirus canino, más preferiblemente un adenovirus CAV2 [cepa manhattan o A26/61 (ATCC VR-800) por ejemplo] . De preferencia, se utilizan en el marco de ia invención adenovirus de origen humano o canino o mixto. De preferencia, los adenovirus defectivos de la invención comprenden los ITR, una secuencia que permite la encapsidación, y un acido nucleico según la invención. Aún más preferiblemente, en el genoma de los adenovirus de la invención, la región El al menos es no funcional. El gen viral considerado puede ser vuelto no funcional por cualquier técnica conocida por el experto en la técnica, y particularmente por supresión total, substitución, supresión parcial, o adición de una o varias bases en el o los genes considerados. Tales modificaciones pueden ser obtenidas ín vitro (sobre el ADN aislado) o m situ, por ejemplo, por medio de técnicas de ingeniería genética, o aún por tratamiento por medio de agentes mutagénicos. Otras regiones pueden ser igualmente modificadas, y particularmente la región E3 (WO95/02697) , E2 (W094/28938) , E4 (W094/28152, W094/12649), WO95/02697) y L5 (WO95/02697) . Según un modo preferido de aplicación, el adenovirus según la invención comprende una supresión en las regiones El y E4. Según otro modo de realización preferido, comprende una supresión en la región El al nivel de la cual se insertan la región E4 y el ácido nucleico de la invención (Comparar FR94 13355) . En el virus de la invención, la supresión en la región El se extiende de preferencia a los nucleótidos 455 a 3329 sobre la secuencia del adenovirus Ad5. Los adenovirus recombinantes defectivos según la invención pueden ser preparados por cualquier técnica conocida por el experto en la técnica (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particular, pueden ser preparadas por recombinación homologa entre un adenovirus y un plásmido que lleva entre otras la secuencia de ADN de interés. La recombinación homologa se produce después de la co-transfección de los adenovirus y plásmido en una línea celular apropiada. La línea celular utilizada debe de preferencia (i) ser transformable por los elementos, y (ii), comprender las secuencias capaces de complementar la parte del genoma del adenovirus defectivo, de preferencia bajo la forma integrada, para evitar los riesgos de recombinación. A título de ejemplo de línea, se puede mencionar la línea de riñon embrionario humano 293 (Graham et al., J. Gen. Virol., 36, (1977), 59), que contiene particularmente, integrada en su genoma, la parte izquierda del genoma de un adenovirus Ad5 (12 %), o líneas capaces de complementar las funciones El y E4 tales como las descritas particularmente en ias solicitudes Nos. WO 94/26914 y WO95/02697. A continuación, los adenovirus que se multiplican se recuperan y se purifican según las técnicas clásicas de biología molecular, como se ilustra en los ejemplos. Con relación a los virus adeno-asociados, (AAV) , se trata de virus con ADN de tamaño relativamente reducido, que se integran en el genoma de las células que infectan, de manera estable y sitio-especifica. Son capaces de infectar un gran espectro de células, sin inducir un efecto sobre el crecimiento, la morfología o la diferenciación celulares. Por otro lado, no parecen estar implicados en las patologías en el hombre. El genoma de los AAV ha sido clonado, se el determinó la secuencia y se caracterizó. Comprende alrededor de 4700 bases, y contiene en cada extremo una región repetida invertida (ITR) de 145 bases aproximadamente, que sirve de origen de replicación para el virus. El resto del genoma está dividido en 2 regiones esenciales que llevar '.as funciones de encapsidación: la parte izquierda del genoma, que contiene el gen rep implicado en la replicación viral y la expresión de genes virales; la parte derecha del genoma, que contiene el gen cap, que codifica para las proteínas del cápside del virus.

La utilización de vectores derivados de los AAV para la transferencia de genes in vitro e in vivo ha sido descrita en la literatura (ver particularmente WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528). Estas solicitudes describen diferentes construcciones derivadas de los AAV, en las cuales los genes rep y/o cap son suprimidos y reemplazados por un gen de interés, y su utilización para transferir in vitro (sobre células en cultivo) , o in vivo (directamente en un organismo) el gen de interés. Los AAV recombinantes defectivos según la invención pueden ser preparados por co-transfección, en una línea celular infectada por un virus auxiliar humano (por ejemplo un adenovirus) , de un plásmido que contiene una secuencia nucleica de la invención de interés, bordeada de dos regiones repetidas invertidas (ITR) del AAV, y de un plásmido que lleva los genes de encapsidación (genes rep y cap) del AAV. Una línea celular utilizable es por ejemplo la línea 293. Los AAV recombinantes producidos se purifican a continuación por técnicas clásicas. Con relación a ios virus del herpes y los retrovirus, la construcción de vectores recombinantes ha sido descrita ampliamente en la literatura: ver particularmente Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP 178220, Bernstein et al., Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particular, los retrovirus son virus integrativos, que infectan selectivamente las células en división. Constituyen así vectores de interés para aplicaciones en cáncer. El genoma de los retrovirus comprende esencialmente dos LTR, una secuencia de encapsidación y tres regiones que codifican (gag, pol y env) . En los vectores recombinantes derivados de los retrovirus, los genes gag, pol y env están suprimidos por lo general, en su totalidad o en parte, y reemplazados por una secuencia del ácido nucleico heterólogo de interés. Esos vectores pueden ser fabricados a partir de diferentes tipos de retrovirus, tales como particularmente el MoMuLV ("virus de leucemia de moloney murino", también designado MoMLV) , el MSV ("virus del sarcoma de moloney murino") ; el HaSV ("virus del sarcoma de harvey") ; el SNV ("virus de necrosis de bazo (spleen)"); el RSV ("virus del sarcoma de rous") o aún el virus de Friend. Para construir retrovirus recombinantes según la invención que llevan un ácido nucleico según la invención, se construye un plásmido, que lleva particularmente los LTR, la secuencia de encapsidación y el ácido nucleico, y después se utiliza para transfectar una línea celular llamada de encapsidación, capaz de aportar en trans las funciones retrovirales deficientes en el plásmido. Por lo general, las líneas de encapsidación son así capaces de expresar los genes gag, pol y env. Tales líneas de encapsidación han sido descritas en la técnica anterior, y particularmente la línea PA317 (US 4,861,719); la línea PsiCRIP (WO 90/02806) y la linea GP + envAm - 12 (WO 89/07150) . Por otro lado, los retrovirus recombinantes pueden comprender modificaciones al nivel de los LTR para suprimir la actividad transcripcional, así como secuencias de encapsidación extensas, que comprenden una parte del gen gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Los retrovirus recombinantes producidos son en seguida purificados por técnicas clásicas. Para la aplicación de la presente invención, es muy particularmente ventajoso utilizar un adenovirus o un retrovirus recombinante defect'vo. Estos vectores poseen en efecto propiedades particularmente interesantes para la transferencia de genes a las células tumorales. 2.3. Vector químico Entre los vectores sintéticos desarrollados, se prefiere utilizar en el marco de la invención los polímeros catiónicos de tipo polilisina, (LKLK)-, (LKKL)n, polietilen imma y DEAE dextran, o también los lipidos catiónicos o lipofectantes. Ellos poseen la propiedad de condensar el ADN, y de promover su asociación con la membrana celular.

Entre estos últimos, se pueden citar las lipopoliaminas (lipofctamina, transfectam, etc.), diferentes lípidos catiónicos o neutros (DOTMA, DOGS, DOPE, etc.) así como péptidos de origen nuclear. Además, se ha desarrollado el concepto de la transfección dirigida, mediada por un receptor, que aprovecha el principio de condensar el ADN gracias al polímero catiónico, mientras dirige la fijación del complejo a la membrana, gracias a un acoplamiento químico entre el polímero catiónico y el ligando de un receptor de la membrana, presente en la superficie de tipo celular que se desea injertar. La dirección del receptor a la transferrina, a la insulina o del receptor de las asialoglicoproteínas de los hepatocitos también ha sido descrita. La preparación de una composición según la invención, que utiliza tal vector químico se realiza según cualquier técnica conocida por el experto en la técnica, por lo general simplemente poniendo en contacto los diferentes componentes. Ejemplo 3: Inhibición de la transactivación de R.R.E. (elementos responsivos a ras) debida a las formas oncogénicas de Ras (Figura 2) Se transfectaron fibroblastos NIH 3T3 por un gen transportador, el de la cloranfenicol acetil transferasa, se colocaron bajo el control de elementos de respuesta a Ras derivados del intensificador del virus del polioma. Estos elementos se estimularon de 15 a 20 veces cuando las células se co-transfectaron con un vector de expresión que llevaba el ADNc del oncogen Middle T(MT) de SV40. Esta estimulación se afecta poco cuando una co-transfección aporta los vectores de expresión de p62-C y de ?p62 (Comparar ejemplo 2) . Cuando se realiza la co-transfección, ya no con MT sino con la forma activada del oncogen Ha-ras (Val 12), la actividad de CAT se estimula de 30 a 40 veces por encima del nivel de la base. La expresión de la p62 afecta poco esta estimulación, mientras que p62-C y ?p62 inhiben casi totalmente toda actividad debida al Ras oncogénico. De la misma manera, la estimulación obtenida por co-transfección con el oncogen v-src es fuertemente inhibida por las proteínas p62-C y ?p62, pero no por la p62. Estas experiencias se realizaron con 0.5 µg de vector que permite la expresión de MT o de Ras VAL 12 o de v-src y µg de vector de expresión que lleva el ADNc de p62-C o de ?p62. Ellas demuestran claramente el poder de las proteínas de la invención de oponerse a las señales ras oncogénicas. Ejemplo 4: Evidencia de la muerte celular inducida por ?p62 en los fibroblastos NIH 3T3 (Figura 3) . Se transfectaron fibroblastos NIH 3T3 con una eficacia del 60 % con 5 µg de vector de expresión de ?p62 (ejemplo 2) . 24 horas después de la transfección, las células presentaron una alteración importante de su viabilidad con relación al testigo. El análisis de su ADN reveló después de la migración sobre gel de agarosa escalas de degradación características de los fenómenos de apoptosis. Los mismos fenómenos se observaron cuando p62-C se transfectó en las mismas condiciones que ?p62. Ejemplo 5: Evidencia de la expresión de ?p62 en fibroblastos embrionarios tratados con diferentes agentes citotóxicos y por privación de suero (Figura 4) . Se cultivaron fibroblastos embrionarios de ratón (1), se trataron con 0.5 µg de ácido okada?co (2), se trataron con 10 ng/ml de PMA y con 2 µg de ionomicina (3) , se sometieron a 1 µM de staurosporina (4) o a 2 µg/ml de camptotecina (5) y por último se privaron de suero. Se analizó la expresión de los ARN mensajeros de p62 y de ?p62 en estos fibroblastos, y en el curso de estos diferentes tratamientos. En cada tratamiento, se analizaron tres puntos. Estos puntos corresponden a tres tiempos del tratamiento: 6, 12 y 24 horas. Sonda 5' específica de ?p62 (SEQ ID No. 7) : CTGTCAAGCAGTATCCCAAGGAGG Sonda 5' específica de p62 (SEQ ID No. 8) : AAGGGCTCAATGAGAGACAAAGCC Sonda 3' común a p62 y a ?p62 (SEQ ID No. 9) : GTATGTATCATCATATCCATATTC En los fibroblastos cultivados en presencia de 10 % de suero de becerro fetal (SVF) , el ARNm de p62 se puso en evidencia, cuando el ARNm de ?p62 no se detectó incluso después de 24 horas de cultivo. La situación es la misma en el curso del tratamiento con ácido okada?co. En cambio, se observó una fuerte inducción del ARNm de ?p62 después de 6 a 12 horas de tratamiento con el PMA y la ionomicina. Este ARNm también es detectable después de la adición de staurosporina, y es inducido más fuertemente después de 12 horas de tratamiento con la camptotecina. Cuando los fibroblastos embrionarios se privan de suero, se observa una fuerte inducción de ?p62 al mismo tiempo que una desaparición del mensajero de p62. Estos resultados demuestran así que la expresión del ARNm de ?p62 se induce en el curso de ciertas situaciones apoptóticas en los fibroblastos. Ejemplo 6: Inhibición por ?p62 de la formación de focos inducida Dor ras Este ejemplo describe otro estudio que demuestra que ?p62 interfiere con el proceso de transformación inducido por los oncogenes. Más particularmente, este ejemplo demuestra que ?p62 es capaz de inhibir la formación de focos inducida por diferentes oncogenes (ras oncogénico, v-src) en las células NIH-3T3, cuando p62 no afecta este fenómeno .

Se co-transfectaron fibroblastos NIH 3T3 con 0.1 µg de vector de expresión de v-Src o Ha-Ras Vall2 y con 4 mg de vector de expresión de p62, de ?p62 o vacante (ejemplo 2) . Las células se mantuvieron en medio que contenía 10 % de suero de becerro recién nacido, y se determinó el número de focos después de fijación y coloración de las células en presencia de fenol-fuchsina. Los experimentos se realizaron por triplicado. Los resultados obtenidos se presentan en la Figura 5. Ellos muestran que ?p62 disminuye el número de focos inducidos por v-src y Ha-Ras Vall2 en aproximadamente 50 %. Este efecto refleja un poder antagonista específico de la transformación por v-src y Ha-Ras oncogénicos, puesto que ?p62 no afecta la formación de focos inducida por v-Raf. Además, el efecto observado no está unido a una toxicidad del producto, puesto que el número de colonias resistentes a la neomicina después de la transfección con p62, ?p62 o un vector vacante es comparable. Estos resultados confirman así el papel inhibidor de las moléculas de la invención en el proceso de transformación inducido por los oncogenes. Estos resultados confirman así la utilidad de estos productos en la aproximación de la corrección de los procesos de proliferación celular inducidos por los oncogenes, así como herramienta para la identificación de otras moléculas activas y/o implicadas en las vías de señalización de estos oncogenes. Ejemplo 7: Evidencia de una interacción con src in vivo Este ejemplo el estudio de la interacción de ?p62 con otras moléculas. Demuestra que p62 y ?p62 son capaces de interaccionar in vivo con src. Se transfectaron fibroblastos NIH 3T3 con un vector de expresión de p62 o de ?p62 que comprendía un marcador myc ("myc teg") (ejemplo 2) . Las células transfectadas se mantuvieron en crecimiento asincrónico, o se bloquearon en fase mitótica por tratamiento con nocodazole. Las células se co-transfectaron en seguida con un vector de expresión de v-Src o vacante. 48 horas después, las células se usaron, y los complejos formados se inmunodetectaron por medio de anticuerpos anti-myc (anticuerpos 9E10) y anticuerpos anti-Src (anticuerpos N16) . Los resultados obtenidos muestran que p62 y ?p62 son capaces de interaccionar in vivo con src. Además, cuando la interacción entre p62 y src parece producirse únicamente en las células mitóticas, ?p62 se une de manera significativa a Src incluso en las células asincrónicas. Esta interacción está intensificada en las células mitóticas.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE (A) NOMBRE: RHONE POULENC RORER S. A. (B) DOMICILIO: 20, AVENUE RAYMOND ARON (C) CIUDAD: ANTONY (E) PAÍS: FRANCIA (F) CÓDIGO POSTAL: 92165 (G) TELEFONO: (1) 40.91.69.22 (H) FAX: (1) 40.91.72.91 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: ?P62, SUS VARIANTES, LAS SECUENCIAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS QUE LOS CODIFICAN, Y SU UTILIZACIÓN EN TERAPIA GENICA ANTI-CANCEROSA (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 9 (v) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) ELEMENTOS DE PROGRAMACIÓN: PatentIn Reléase # 1.0, Versión # 1.30 (OEB) (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1332 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: no (iv) ANTI-SENTIDO: no (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) POSICIÓN: 1...1332 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1: ATG CAG CGC CGG GAC GAC CCC CCC CCC CGC ATG AGC CGG TCT TCG GGC 48 Met Gln Arg Arg Asp Asp Pro Ala Ala Arg Met Ser Arg Ser Ser Gly 1 5 10 15 CGT AGC GGC TCC ATC CAC CCC TCC GCT GCC CAC CCC TCG GTG CGT CAG 96 Arg Ser Gly Ser Met Asp Pro Ser Gly Ala His Pro Ser Val Arg Gln 20 25 30 ACG CCG TCT CGG CAG CCG CCG CTG CCT CAC CGG TCC CGG GGA GGC GGA 144 Thr Pro Ser Arg Gln Pro Pro Leu Pro His Arg Ser Arg Gly Gly Gly 35 4C 45 GGG GGA TCC CGC GGG CCC GCC CGG CCC TCG CCC GCC ACG CAG CCG CCA 1 2 Gly Gly Ser Arg Gly Gly Ala Arg Ala Ser Pro Ala Thr Gln Pro Pro 50 55 60 CCG CTG CTG CCG CCC TCG GCC ACG GGT CCC GAC GCG ACA GTG GGC GGG 240 Pro Leu Leu Pro Pro Ser Ala Thr Gly Pro Asp Ala Thr Val Gly Gly 65 70 75 80 CCA GCG CCG ACC CCG CTG CTG CCC CCC TCG GCC ACA GCC TCG GTC AAG 288 Pro Ala Pro Thr Pro Leu Leu Pro Pro Ser Ala Thr Ala Ser Val Lys 85 90 95 ATG GAG CCA GAG AAC AAG TAC CTG CCC GAA CTC ATG CC GAG AAG GAC 336 Met Glu Pro Glu Asn Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Met Ala Glu Lys Asp 100 105 110 TCG CTC GAC CCG TCC ACT CAC GCC ATG CAG CTG CTG ACG GCA GAA 384 Ser Leu Asp Pro Ser Phe Thr His Ala Met Gln Leu Leu Thr Ala Glu 115 120 125 ATT GAG AAG ATT CAG AAA GGA GAC TCA AAA AAG GAT GAT GAG GAG AAT 432 He Glu Lys He Glp Lys Gly Asp Ser Lys Lys Asp Asp Glu Glu Asn 130 135 140 TAC TTG GAT TTA TTT CT CAT AAG AAC ATG AAA CTG AAA GAG CGA GTG 480 Tyr Leu Asp Leu Phe Ser His Lys Asn Met Lys Leu Lys Glu Arg Val 145 150 155 160 CTG ATA CCT GTC AAG T?T CCC AAG AAT TTT GTG GGG AAG ATT 528 Leu He Pro Val Lys Gl¡_ Tyr Pro Lys Phe Asn Phe Val Gly Lys He 165 170 175 CTT GGA CCA CAÁ GGG AAT ACA ATC AAA AGA CTG CAG GAA GAG ACT GGT 576 Leu Gly Pro Glp Gl As:. Thr He Lys Arg Leu Gln Glu Glu Thr Gly 180 155 190 GCA AAG ATC GTA .TG GGA AAG GGC TCA ATG AGA GAC AAA GCC AAG 624 Ala Lys He Ser Val Leu Gly Lys Gly Ser Met Arg Asp Lys Ala Lys 195 200 205 GAG GAA GAG CTG CGC A?A GGT GGA GAC CCC AAA TAT GCC CAC TTG AAT 672 Glu Glu Glu Leu Arg Lys Gly Gly Asp Pro Lys Tyr Ala His Leu Asn 210 215 220 ATG GAT CTG CAT GTC ATT AA GTC TTT GGA CCC CCA TGT GAG GCT 720 Met Asp Leu HiS Val Phe He Glu Val Phe Gly Pro Pro Cys Glu Ala 225 230 235 240 TAT GCT CTT ATG GCC CAT GCC ATG GAG GAA GTC AAG AAA TTT CTA GTA 768 Tyr Ala Leu Met Ala HlS Ala Met Glu Glu Val Lys Lys Phe Leu" Val 245 250 255 CCG GAT ATG ATG GAT GAT ATC TGT CAG GAG CAÁ TTT CTA GAG CTG TCC 816 Pro Asp Met Met Asp Asp He Cys Gln Glu G n Phe Leu Glu Leu Ser 260 265 270 TAC TTG AAT GGA GTA CCT GAA CCC TCT CGT GGA CGT GGG GTG CCA GTG 864 Tyr Leu Asn Gly Val Pro Glu Pro Ser Arg Gly Arg Gly Val Pro Val 275 280 285 AGA GGC CGG GGA GCT GCA CCT CCT CCA CCA CCT GTT CCC AGG u ^ CGT 912 Arg Gly Arg Gly Ala Ala Pro Pro Pro Pro Pro val Pro Arg Gly Arg 290 295 300 GGT GTT GGA CCA CCT CGG GGG GCT TTG GTA CGT GGT ACA CCA GTA AGG 960 Gly Val Gly Pro Pro Arg Gly Ala Leu Val Arg Gly Thr Pro Val Arg 305 3'0 315 320 GGA GCC ATC ACC AGA ACT GTG ACT CGA GGC GTG CCA CCC CCA 1008 Gly Ala Thr Arg Gl Ala Thr Val Thr Arg Gly Val Pro Pro Pro 325 330 335 CCT ACT GTG AGG G2Z* CCA CCA CCA AGA GCA CGG ACA GGC ATC 1056 Pro Thr Val Arg Gly Ala Pro Ala Pro Arg Ala Arg Thr Ala Gly He 340 345 350 CAG AGG ATA CCT TTG CCT CCA CCT CCT GCA CCA GAA ACA TAT GAA GAA 1104 Gln Arg He Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ala Pro Glu Thr Tyr Glu Glu 355 360 365 TAT GGA TAT GAT GAT ACA TAC GCA GAA CAÁ AGT TAC GAA GGC TAC GAA 1152 Tyr Gly Tyr Asp Asp Thr Tvr Ala Glu C r. Ser Tyr Glu Gly Tyr Glu 370 . '- . 380 GGC TAT TAC AGC CAG AGT CAÁ GGG GAC TCA GAA TAT TAT GAC TAT GGA 1200 Gly Tyr Tyr Ser Clr. Ser Glr. Gly Asp Ser Glu Tyr Tyr Asp Tyr Gly 385 390 395 400 CAT GGG GAG GTT CAÁ GAT TCT TAT GAA GCT TAT GGC CAG GAC GAC TGG 1248 His Gly Glu Val Gln Asp Ser Tyr Glu Ala Tyr Gly Gln Asp Asp Trp 405 410 415 AAT GGG ACC AGG CCG TCG CTG AAG GCC CCT CCT GCT AGG CCA GTG AAG 1296 •sn Gly Thr Arg Pro Ser Leu Lys Ala Pro Pro Ala Arg Pro Val Lys 420 425 430 GA GCA TAC AGA GAG CAC CCA TAT GCA CGT TAT TAA 1332 Gly Ala Tyr Arg Glu His Pro Tyr Gly Arg Tvr (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1215 pares de bases (B) TIPO: nucleótido 5 (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (íii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO 10 (IX) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) POSICIÓN: 1....1215 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: ATG CAG CCC CGG GAC G?C CCC GCC GCG CGC ATG AGC CGG TCT TCG GGC 48 ]_5 Met Gln Arg Arg Asp Asp Pro Ala Ala Arg Met Ser Arg Ser Ser Gly 1 5 10 15 CGT AGC GGC TCC ATC GAC CCC TCC GGT CCC C?C CCC TCG GTG CGT CAG 96 Arg Ser Gly Ser Met Asp Pro Ser Gly ?la His Pro Ser Val Arg Gln 20 25 30 ACG CCG TCT CCC CAG CCC CCG CTC CCT CAC CCC TCC CGG GGA GGC GGA 144 Thr Pro Ser Arg G r. Pro Prc Leu Pro Kis Arg Ser Arg Gly Gly Gly 35 40 45 <=- U 3 - j GGA TCC C GCC GGC GCC CGC CZZ" TCG CCC GZC ACG CAG CCG CCA 192 Gly Gly Ser Arg Gly Cl- ?la Arg Ala Ser Pro Ala Thr Gln Pro Pro 50 55 60 CCG CTG CTG CCG CCC TCG CCC ACG GGT CCC GAC GCG ACA GTG GGC GGG 240 Pro Leu Leu Pro Pro Ser Ala Thr Gly Pro Asp Ala Thr Val Gly Gly 65 "O 75 80 CCA GCG CCG ACC CCG CTG CTG CCC CCC TCG GCC ACA GCC TCG GTC AAG 288 Pro Ala Pro Thr Pro Leu Leu Pro Pro Ser Ala Thr Ala Ser Val Lys 65 90 95 ATG GAG CCA GAG AAC AAG TAC CTG CCC GAA CTC ATG GCC GAG AAG GAC 336 Met Glu Pro Glu Asn Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Met Ala Glu Lys Asp 100 105 110 TCG CTC GAC CCG TCC TTC ACT CAC GCC ATG CAG CTG CTG ACG GCA GAA 384 Ser Leu Asp Pro Ser Phe Thr His Ala Met Gln Leu Leu Thr Ala Glu 115 120 125 5 ATT GAG AAG ATT CAG AAA GCA GAC TCA AAA AAG GAT GAT GAG GAG AAT 432 He Asp Glu Glu Asn TAC TTG GAT TTA TTT TCT C?T AAG AAC ATG AAA CTG AAA GAG CGA GTG 480 Tyr Leu Asp Leu Phe Ser His Lys Asn Met Lys Leu Lys Glu Arg Val 145 '5C " 155 160 CTG ATA CCT GTC AAG CAC TAT CCC AAG GAG GAA GAG CTG CGC AAA GGT 528 10 Leu He Pro Val Lys Glr. Tyr Pro Lys Glu Glu Glu Leu Arg Lys Gly 165 170 175 GGA GAC CCC AAA TAT GCC CAC TTG AAT ATG GAT CTG CAT GTC TTC ATT 576 Gly Asp Pro Lys Tyr Ala Kis Leu Asn Met Asp Leu His Val Phe He 180 185 190 GAA GTC TTT GGA CCC CC?-. TGT GAG GCT TAT GCT CTT ATG GCC CAT GCC 624 Glu Val Phe Gly Pro Pro Cys Glu Ala Tyr Ala Leu Met Ala His Ala 195 200 205 i-* ATG GAG GAA GTC AAG ??? TTT CTA CTA CCC C?T ?TG ATG GAT GAT ATC 672 Met Clu Glu Val Lys LYS Phe Leu Val Pro ?sp Met Met Asp Asp He 210 * " 2 ' . 220 __A j oi-. «A.-. _. - * ^. „ _ . -. A t\ ~. . . *• i A ^ * UAA 720 Cys Glr. Clu Clr. Phe Leu Glu Leu Ser Tyr Leu Asn Gly Val Pro Glu 225 230 135 240 W_.C * ^ . c u * 'vj'-jA c . uou . ' • ." c . Vj . . f. w u ._ c u u uutt Ge *. 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GGG GAG GTT CAÁ GAT TCT 1104 Gly Asp Ser Glu Tyr Tyr Asp Tyr Gly KÍS Gly Glu Val Gln Asp Ser 355 360 365 TAT GAA GCT TAT GGC CAG GAC GAC TGG AAT GGG ACC AGG CCG TCG CTG 1152 Tyr Glu Ala Tyr Gly Gln Asp Asp Trp Asn Gly Thr Arg Pro Ser Leu 370 3 5 380 AAG GCC CCT CCT GCT AGG CCA GTG AAG GGA GCA TAC AGA GAG CAC CCA 1200 Lys Ala Pro Pro Ala ?rg Pro Val Lys Gly Ala Tyr Arg Glu His Pro 385 390 " 395 400 TAT GGA CGT TAT TAA 1 2 1 5 Tyr Gly Arg Tyr 405 ( 2 ) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO : 3 : ( i ) CARACTERÍ STICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 726 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: 'lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS 5 (B) POSICIÓN: 1...726 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: ATG AGA GAC AAA GCC AAG GAG GAA GAG CTG CGC AAA GGT GGA GAC CCC 48 Met Arg Asp Lys Ala Lys Glu Glu Glu Leu Arg Lys Gly Gly Asp Pro 1 5 10 15 AAA TAT GCC CAC TTG AAT ATG GAT CTG CAT GTC TTC ATT GAA GTC TTT 96 i Q Lys Tyr Ala His Leu Asn Met Asp Leu His Val Phe He Glu Val Phe 20 25 30 GGA CCC CCA TGT GAG GCT TAT GCT CTT ATG GCC CAT GCC ATG GAG GAA 144 Gly Pro Pro Cys Glu Ala Tyr Ala Leu Met Ala His Ala Met Glu Glu 35 40 45 GTC AAG AAA TTT CTA GTA CCG GAT ATG ATG GAT GAT ATC TGT CAG GAG 192 Val Lys Lys Phe Leu Val Pro Asp Met Met Asp Asp He Cys Gln Glu 50 55 60 15 CAÁ TTT CTA GAG CTG TCC TAC TTG AAT GGA GTA CCT GAA CCC TCT CGT 240 Gln Phe Leu Glu Leu Ser Tyr Leu Asn Gly Val Pro Glu Pro Ser Arg 65 70 75 80 GGA CGT GGG GTG CCA GTG AGA GGC CGG GGA GCT GCA CCT CCT CCA CCA 288 Gly Arg Gly Val Pro Val Arg Gly Arg Gly Ala Ala Pro Pro Pro Pro 85 90 95 CCT GTT CCC AGG GGC CGT GGT GTT GGA CCA CCT CGG GGG GCT TTG GTA 336 20 Pro Val Pro Arg Gly Arg Gly Val Gly Pro Pro Arg Gly Ala Leu Val 100 105 110 CGT GGT ACA CCA GTA AGC CGA CCC ATC ACC AGA GGT GCC ACT GTG ACT 384 Arg Gly Thr Pro Val Arg Gly Ala He Thr Arg Gly Ala Thr Val Thr 115 120 125 CGA GGC GTG CCA CCC CCA CCT ACT GTG AGG GGT GCT CCA GCA CCA AGA 432 Arg Gly Val Pro Pro Pro Pro Thr Val Arg Gly Ala Pro Ala Pro Arg 130 "35 140 GCA CGG ACA GCG GGC ATC CAG AGG ATA CCT TTG CCT CCA CCT CCT GCA 480 Ala Arg Thr Ala Gly He Gln Arg He Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ala 145 150 155 160 CCA GAA ACA TAT GAA GAA TAT GGA TAT GAT GAT ACA TAC GCA GAA CAÁ 528 Pro Glu Thr Tyr Glu Glu Tyr Gly Tyr Asp Asp Thr Tyr Ala Glu Gln 165 170 175 AGT TAC GAA GGC TAC GAA CGC TAT TAC AGC CAG AGT CAÁ GGG GAC TCA 576 Ser Tyr Glu Gly Tyr Glu Gly Tyr Tyr Ser Gln Ser Gln Gly Asp Ser 180 185 ' 190 GAA TAT TAT GAC TAT GGA CAT GGG GAG GTT CAÁ GAT TCT TAT GAA GCT 624 Glu Tyr Tyr Asp Tyr Gly His Gly Glu Val Gln Asp Ser Tyr Glu Ala 195 200 205 TAT GGC CAG GAC GAC TGG AAT GGG ACC AGG CCG TCG CTG AAG GCC CCT 6"2 Tyr Gly Gln Asp Asp Trp Asn Gly Thr Arg Pro Ser Leu Lys Ala Pro 210 215 220 CCT GCT AGG CCA GTG AAG GGA GCA TAC AGA GAG CAC CCA TAT GGA CGT 720 Pro Ala Arg Pro Val Lys Gly Ala Tyr Arg Glu His Pro Tyr Gly Arg 225 230 235 240 TAT TAA 726 Tyr * (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4 CAGCTGCTGA CGGCAGAAAT TGAG 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: TTAATAACGT CCATATGGGT GCTC 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (IV) ANTI-SENTIDO: NO (xi) 'DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: CAGTATCCCA AGGAGGAAGA GCTG 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (IV) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: CTGTCAAGCA GTATCCCAAG GAGG 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (IV) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8: AAGGGCTCAA TGAGAGACAA AGCC 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ll) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ni) HIPOTÉTICA: NO (IV) ANTI-SENTIDO: NO (xi 1 DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9: GTATGTATCA TCATATCCAT ATTC 24 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (25)

1. REIVINDICACIONES 1. Derivado de p62 capaz de inhibir al menos en parte la interacción entre una proteína GAP y p62, caracterizado porque ha perdido la capacidad de p62 de mteraccionar con el ARN, y porque comprende una parte de p62 que permite la interacción con el dominio SH2 de GAP.
2. 2. Derivado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque inhibe al menos parcialmente las señales transducidas por ras.
3. 3. Derivado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque comprende al menos una supresión en la zona de homología a la proteína GRP33.
4. 4. Derivado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se trata de un polipéptido que comprende toda o parte de la secuencia SEQ ID No. 2, o una variante de la misma.
5. 5. Polipéptido ?p62, caracterizado porque tiene la secuencia SEQ ID No. 2.
6. 6. Derivado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende esencialmente la región que lleva las tirosmas fosforiladas de p62.
7. 7. Derivado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque se trata de un polipéptido que comprende toda o parte de la secuencia SEQ ID No. 3.
8. 8. Polipéptido p62-C, caracterizado porque tiene la secuencia de SEQ ID No. 3.
9. 9. Acido nucleico caracterizado porque codifica para un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. 10. Acido nucleico de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque se trata de un ADNc o de un ARN.
11. 11. Acido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, caracterizado porque se selecciona de: (a) toda o parte de la secuencia SEQ ID No. 2 o SEQ ID No. 3, o de su hebra complementaria, i b ) toda secuencia que se hibride con las secuencias de »a) y que codifique para un derivado según la reivindicación 1, (c) las variantes de (a) y (b) que resulten de la degeneración del código genético.
12. 12. Acido nucleico caracterizado porque tiene la sec encia de SEQ ID No. 2.
13. 13. Acido nucleico caracterizado porque tiene la secuencia de SEQ ID No. 3.
14. 14. Cásete de expresión caracterizado porque comprende un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, un promotor que permite su expresión, y una señal de terminación de la transcripción.
15. 15. Vector caracterizado porque comprende un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, o un cásete de conformidad con la reivindicación 14.
16. 16. Vector de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque se trata de un v-ector plasmídico.
17. 17. Vector de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque se trata de un vector viral.
18. 18. Vector de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el vector viral se deriva de un adenovirus, de un retrovirus, de un virus de AAV o de un virus del herpes.
19. 19. Retrovirus recombinante defectivo caracterizado porque su genoma comprende un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, o un cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 14.
20. 20. Adenovirus recombinante defectivo caracterizado porque su genoma comprende un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, o un cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 14.
21. 21. Composición farmacéutica caracterizada porque comprende al meaos un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 9.
22. 22. Composición farmacéutica caracterizada porque comprende al menos un vector de conformidad con la reivindicación 15.
23. 23. Composición farmacéutica caracterizada porque comprende al menos un derivado de conformidad con la reivindicación 1.
24. 24. Composición farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 21 a 23, caracterizada porque es para el tratamiento de los cánceres.
25. 25. Utilización de un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 9, o de un vector de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque es para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de los transtornos hiperproliferativos . ?P62, SUS VARIANTES, LAS SECUENCIAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS QUE LOS CODIFICAN, Y SU UTILIZACIÓN EN TERAPIA GENICA ANTICANCEROSA RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención describe un péptido novedoso designado como ?P62 o ?Sam68, las variantes del mismo, las secuencias de ácidos nucleicos correspondientes, y los usos de los mismos, particularmente en terapia génica anticancerosa.