SK287127B6 - Antagonisty onkogénnej aktivity proteínu Mdm2 a ich použitie na liečenie rakovín - Google Patents

Antagonisty onkogénnej aktivity proteínu Mdm2 a ich použitie na liečenie rakovín Download PDF

Info

Publication number
SK287127B6
SK287127B6 SK280-98A SK28098A SK287127B6 SK 287127 B6 SK287127 B6 SK 287127B6 SK 28098 A SK28098 A SK 28098A SK 287127 B6 SK287127 B6 SK 287127B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
mdm2
protein
use according
ser
glu
Prior art date
Application number
SK280-98A
Other languages
English (en)
Other versions
SK28098A3 (en
Inventor
Bruno Tocque
Marie-Christine Dubs-Poterszman
Bohdan Wasylyk
Original Assignee
Aventis Pharma S. A.
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pharma S. A., Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale filed Critical Aventis Pharma S. A.
Publication of SK28098A3 publication Critical patent/SK28098A3/sk
Publication of SK287127B6 publication Critical patent/SK287127B6/sk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4736—Retinoblastoma protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/027—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a retrovirus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Opisuje sa použitie zlúčeniny schopnej antagonizovať aspoň čiastočne onkogénnu aktivitu proteínu Mdm2 na prípravu farmaceutickej kompozície určenej predovšetkým na liečenie rakovín v súvislosti s p53 nul. Tiež sa opisujú vírusové vektory obsahujúce sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu zlúčeninu schopnú inhibovať aspoň čiastočne onkogénnu aktivitu proteínu Mdm2 a zodpovedajúca farmaceutická kompozícia.

Description

Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka nových metód liečenia hyperproliferatívnych patológií (rakovín, restenóz atď.) a zodpovedajúcich farmaceutických kompozícií.
Doterajší stav techniky
Veľký počet rakovín je spôsobený úplne alebo sčasti genetickými anomáliami, ktoré sa prejavujú buď silnou expresiou jedného alebo viac génov a/alebo expresiou jedného mutovaného génu alebo mutovaných génov alebo génov nenormálnych. Napríklad expresia onkogénov generuje vo väčšine prípadov rakovinu. Ide o onkogén génu geneticky určeného, ktorého produkt expresie narušuje biologickú funkciu normálnych buniek, iniciuje tak novo vytvorený stav. V súčasnosti bol identifikovaný a čiastočne charakterizovaný veľký počet onkogénov, najmä gény ras, myc, fos, erb, neu, raf, src, fms, jun a abl, ktorých mutované formy zodpovedajú poruchám proliferačných buniek.
V súvislosti s normálnymi bunkami proliferácia týchto onkogénov je pravdepodobne potlačená aspoň sčasti vytvorením génu takzvaného supresora tumorov ako p53 a Rb. Ale určité javy môžu porušiť tento mechanizmus bunkovej autoregulácie a uprednostniť tak vývoj novo vytvoreného stavu. Jeden z týchto dejov spočíva v mutáciách na úrovni génov supresorov tumorov. Týmto spôsobom takto mutovaná forma deléciou a/alebo mutáciou génu p53 je zahrnutá do vývoja väčšiny ľudských rakovín (Baker et coll., Science 244 (1989) 217) a inaktívne formy génu Rb sa dokázali v prípade rôznych nádorov najmä v retinoblastómoch alebo v rakovinách mezenchýmu ako napr. osteosarkómy.
Proteín p53 je jadrový fosfoproteín 53kD, ktorý je exprimovaný vo väčšine normálnych tkanív. Je zahrnutý do riadenia bunkového cyklu (Mercer et al. Critic Rev. Eucar. Gene Express, 2, 251, 1992), transkripčnej regulácie (Fields et al., Sciences (1990) 249, 1046), replikácie DNA (Wilcoq and Lane, (1991), Náture 349, 4290 a Bargonnetti et al., (1992) Celí 65, 1083) a indukcie apoptózy (Shaw et al., (1992) P. N. A. S. USA 89, 4495). Každá bunková expozícia k činiteľom schopným napríklad poškodiť DNA iniciuje kaskádu bunkovej signalizácie, ktorá vedie k posttranskripčnej modifikácii proteínu p53 a k transkripčnej aktivácii proteínom p53 určitého počtu génov, ako sú napr. gadd45 (growth arrest and DNA damage) (Kastan et coll. Celí, 71, 587 - 597, 1992), p21 WAF/CIP (Eldeiry et coll, Cancer Res., 54, 1169 - 1174, 1994) alebo tiež mdm2 (mouse double minuté) (Barak et coll., EMBO J., 12, 461 - 468, 1993).
Z toho jasne vyplýva, že vyjasnenie rôznych biologických funkcií súboru implikovaných proteínov najmä v spôsobe bunkovej signalizácie, ich spôsobu fungovania a ich charakteristických znakov je hlavný záujem na porozumenie karcinogenézy a upresnenie terapeutických účinných metód namierených proti rakovine.
Podstata vynálezu
Predložený vynález zapadá presne do tejto súvislosti uvádzajúc novú funkciu proteínu Mdm2,
Proteín Mdm2 je fosfoproteín, ktorého molekulová hmotnosť je 90 kD a je exprimovaný od génu mdm-2 (murine double minuté 2). Tento gén mdm2 bol klonovaný na začiatku v živej tumorálnej bunke BALB/c 3T3 a konštatovalo sa, že silná expresia silne zvyšuje tumorálnu schopnosť (Cahilly-Snyder et coll. Somat. Celí. Mol. Genet., 13, 235 - 244, 1987, Fakharzadeh et coll, EMBO J. 10, 1565 - 1569, 1991). Komplex Mdm2/p53 bol identifikovaný vo viacerých bunkových líniách obsahujúcich divý proteín p53 aj mutované proteíny p53 (Martinez et coll., Genes Dev., 5, 151 - 159, 1991). Okrem toho bolo ukázané, že Mdm2 inhibuje transkripčnú aktivitu proteínu p53 na promótore rovnako ako aktivitu svalovej kreatín-kinázy indikujúcu, že Mdm2 môže regulovať aktivitu proteínu p53 (Momand et coll., Celí, 69, 1237 - 1245, 1992, Oliner et coll. Náture, 362, 857 - 860, 1993).
Vzhľadom na súbor výsledkov proteín Mdm2 je teda v súčasnosti predovšetkým uznaný ako modulátor aktivít proteínu p53. Keď divé proteíny p53 alebo mutované proteíny vyvolávajú komplexy, inhibuje ich transkripčnú aktivitu a prispieva týmto spôsobom k deregulácii bunkovej proliferácie. Následkom toho využitie týchto informácií po stránke terapeutickej spočíva hlavne v hľadaní prostriedkov na zabránenie tejto blokácie proteínu p53 proteínom Mdm2.
Predkladateľ dokázal, že tento proteín Mdm2 má charakter čisto onkogénny, teda úplne odlišný od onkogénneho charakteru spojeného s jeho komplexnou formou s proteínom p53. Proteín Mdm2 rozvíja onkogénne vlastnosti v súvislosti s proteínom p53 nul. Na podporenie tohto objavu a to, že onkogénne vlastnosti Mdm-2 sú nezávislé od proteínu p53, a že najmä nevyplývajú z inhibicie transaktivačnej aktivity divého proteínu p53, sme pozorovali, že mutant proteínu p53 (p53 (14 - 19), Lin et al., Genes Dev., 1994, 8, 1235 - 1246), ktorý má zachované svoje transaktivačné vlastnosti, ale ktorý už neinteraguje s Mdm-2, je neschopný blokovať onkogénne vlastnosti Mdm-2. Predovšetkým je pozorované, že Mdm-2, predovšetkým oblasť 1
-134 Mdm-2, je schopný odblokovať zastavenie bunkového cyklu v G1 indukovateľného silnou expresiou p 107. Mdm-2 sa javí ako dôležitý regulátor faktorov, obsiahnutých v riadení bunkového cyklu, iných než p53.
Predložený vynález vyplýva čiastočne z preukázania, že proteínová sekvencia 1-134 identifikovanej sekvencie SEQ ID NO: 1 proteínu Mdm-2 je dostatočná na vyjadrenie onkogénneho potenciálu uvedeného proteínu.
Predložený vynález vyplýva tiež z preukázania, že je možné určiť tento onkogénny charakter proteínu Mdm2 použitím zlúčenín, ktoré sú schopné s ním interagovať. Predložený vynález opisuje tiež účinné systémy, najmä dovoľujúce odovzdanie in vivo, priamo do tumorov, takýchto zlúčenín a teda boj proti vývoju rakovín. Predložený vynález predkladá tiež nové prístupy účinné najmä na liečenie tumorov predovšetkým v súvislosti s p53 nul, napríklad na liečenie adenokarcinómov časti hrubého čreva, rakoviny štítnej žľazy, karcinómov pľúc, rakoviny prsníka, rakoviny pľúc, rakoviny žalúdka, rakoviny pažeráka, lymfómov B, rakoviny ovárií, rakoviny močového mechúra, glioblastómov atď.
Prvý predmet vynálezu spočíva v použití zlúčeniny schopnej antagonizovať najmä onkogénnu aktivitu proteínu Mdm2 na prípravu farmaceutickej kompozície určenej na liečenie rakovín v súvislosti s p53 nul.
V zmysle predloženého vynálezu sa chápe rakovinou v súvislosti s p53 nul rakovina, kde proteín p53 bude neschopný vykonávať svoje funkcie supresorového génu tumoru akoukoľvek modifikáciou alebo akýmkoľvek iným mechanizmom než fixáciou Mdm-2 na p53, fixáciou zabraňujúcou proteínu p53 vykonávať svoju úlohu supresora tumoru a umožňujúcou bunkám zabrániť v raste, ktorý je riadený proteínom p53. Medzi týmito modifikáciami alebo mechanizmami blokujúcimi aktivitu supresora tumoru p53 sa môžu citovať napríklad genetické poruchy génov p53 (bodové mutácie, delécie atď.), interakcie s inými proteínami než Mdm-2, veľmi rýchla proteolytická degradácia proteínu p53 spojená s prítomnosťou proteínu E6 vírusu vysoko nebezpečných ľudských papilómov, ako sú HPV-16 a HPV-18, atď.
V zmysle predloženého vynálezu onkogénna aktivita proteínu Mdm2 môže byť dosiahnutá podľa dvoch metód.
Prednostne je uskutočnená, keď zasahuje priamo na úrovni oblasti 1-134 proteínu. Každý proteín schopný viazať sa na túto oblasť, bude mať antagonistickú úlohu proti onkogénnym vlastnostiam proteínu Mdm2.
Ale účinok inhibítorov môže byť predovšetkým dosiahnutý interakciami zlúčenín zo susedných oblastí, ako napríklad oblasť 135-491 proteínu mdm2, vyjadrená sekvenciou SEQ ID NO: 1 alebo sekvenciou C-konca vyjadrenej sekvenciou SEQ ID NO: 1. Podľa toho predložený vynález sa týka okrem iného použitia každej takej zlúčeniny, ktorá neintraguje s touto oblasťou priamo a je predovšetkým schopná určiť onkogénnu vlastnosť.
Podľa zvláštneho spôsobu predložený vynález sa týka použitia zlúčeniny schopnej viazať sa na úrovni oblasti 1-134 sekvencie vyjadrenej SEQ ID NO: 1 proteínu Mdm2 z pohľadu prípravy farmaceutickej kompozície určenej na liečenie rakovín v súvislosti s p53 nul.
Zo zlúčenín schopných interagovať priamo na úrovni oblasti 1-134 proteínu Mdm2 sa môže citovať najmä scFV špecificky namierený proti tejto oblasti.
ScFv sú molekuly, ktoré majú väzbové vlastnosti porovnateľné s molekulami protilátok a sú intracelulárne aktívne. Zvlášť ide o molekuly tvorené peptidom zodpovedajúcemu väzbovému miestu variabilnej oblasti ľahkého reťazca protilátok znovu spojených peptidovou spojkou na peptid zodpovedajúce väzbové miesto variabilnej oblasti ťažkého reťazca protilátky. Predkladateľom je ukázané, že ScFv môžu byť produkované in vivo prenosom génu (pozri prihláška vynálezu WO 94/29446).
Môže najmä ísť o peptidy alebo proteíny, ktoré poznáme kvôli ich schopnosti špecificky sa viazať s oblasťou 1-134 proteínu Mdm2, ako napríklad s celkom alebo časťou viazanej domény proteínu p53 so sekvenciou SEQ ID NO: 1 a najmä o celok alebo časť jedného z peptidov 1-52, 1-41 a 6-41 sekvencie p53 vyjadrenej SEQ ID NO: 2 (Oliner et al., Náture, 1993, 362, 857-860) alebo jednoduchšie o celok alebo časť peptidu 16-25 (Lane et al., Phil. Trans. R. Soc. London B., 1995, 347, 83-87), alebo o rovnaké peptidy 18-23 ľudského proteínu p53 alebo myšieho, alebo tiež o blízke peptidy odvodené od peptidov už skôr citovaných, v ktorých kritické rezíduá pre interakciu s Mdm-2 by boli zachované (Picksley et al., Oncogene, 1994, 9, 2523 - 2529).
Najmä sa môže podľa predloženého vynálezu preukázať, že zlúčeniny sa viažu na doménu susediacu s doménou 1-134 Mdm2 vyjadrenou SEQ ID NO: 1, pričom táto zlúčenina pôsobí v dôsledku tejto väzby na onkogénnu aktivitu proteínu Mdm2. Z tohto titulu sa môžu uviesť zlúčeniny interagujúce na úrovni oblasti C-konca uvedeného proteínu ako napríklad transkripčne faktory TFII, TBP a TaF250 rovnako ako proteíny interagujúce na úrovni oblasti 135-491 Mdm2 vyjadrené SEQ ID NO: 1, ako napríklad proteíny L5 (ribozomálny proteín) a Rb (retinoblastómový proteín) a transkripčný faktor E2F (riadený Rb).
Iný predmet predloženého vynálezu sa týka predovšetkým použitia scFV špecificky namiereného proti tejto oblasti 1-134 sekvencie vyjadrenej SEQ ID NO: 1 proteínu Mdm2 z pohľadu prípravy farmaceutickej kompozície určenej na liečenie rakovín.
V zmysle vynálezu sa rozumie, že súbor citovaných interakcií určuje dôsledne onkogénny charakter Mdm2. Okrem toho tieto proteíny môžu byť použité úplne alebo sčasti v prípadoch, kde je preukázaná ich aktívna časť oproti väzbovým doménam s proteínom Mdm2, a že táto interakcia vedie k chorobe onkogénneho charakteru.
V rámci predloženého vynálezu tieto zlúčeniny môžu byť použité také aké sú alebo výhodne vo forme genetických konštrukcií, umožňujúcich ich expresiu in vivo.
Predovšetkým výhodný spôsob uskutočnenia predloženého vynálezu spočíva v použití nukleovej sekvencie kódujúcej zlúčeniny schopné antagonizovať aspoň čiastočne onkogénnu aktivitu proteínu Mdm2 na prípravu farmaceutickej kompozície určenej na liečenie rakovín v súvislosti s p53 nul.
Z tejto perspektívy nukleové kyseliny použité v rámci vynálezu môžu byť rôznych typov. Sú to najmä:
- antimediátorové nukleové kyseliny,
- oligoribonukleotidy schopné fixovať priamo jednu z oblasti proteínu Mdm2 a inhibovať jeho onkogénnu aktivitu (oligonukleotidový ligand),
- nukleové kyseliny kódujúce celok alebo časť peptidov alebo proteínov schopných oligomerizovať sa s jednou z oblastí Mdm2 a inhibovať jeho onkogénnu aktivitu,
- nukleové kyseliny kódujúce intracelulárne protilátky (napríklad rôzne fragmenty jediného reťazca pochádzajúceho z protilátok) namierené proti oblasti 1-134 sekvencie SEQ ID NO: 1 proteínu Mdm2.
Podľa zvláštneho spôsobu predloženého vynálezu nukleová kyselina je antimediátorová nukleová kyselina. Táto antimediátorová kyselina je DNA kódujúca komplementárnu RNA nukleovej kyseliny kódujúcej proteín Mdm2 a je schopná blokovať jeho transkripciu a/alebo jeho transláciu (antimediátorová RNA) alebo ribozým.
Neskôr bol preukázaný nový typ nukleových kyselín schopných regulovať expresiu cieľového génu. Tieto nukleové kyseliny sa nehybridizujú s bunkovou mRNA, ale priamo s dvojvláknovou genómovou DNA. Tieto nové prístupy založené na preukázaniach, že určité nukleové kyseliny sú schopné špecificky interagovať vo veľkom pruhu dvojzávitnice DNA na úrovni oligopurín-oligopyrimidmovej sekvencie, teda na úrovni oblastí majúcich oligopurínové sekvencie na vlákne a oligopyrimidínové sekvencie na komplementárnom vlákne a tam tvorí trojzávitnicu. Báza tretieho vlákna (oligonukleotid) tvorí vodíkové väzby (Hognessove väzby alebo Hognessove inverzie) s purínmi bázových párov - Watson-Crickove párovanie báz. Nukleové kyseliny opísali najmä Pr. Helene v Anti-Cancer drug design 6 (1991) 569.
Antimediátorové nukleové kyseliny podľa predloženého vynálezu môžu byť sekvenciou DNA kódujúcou antimediátorovú RNA alebo ribozýmy. Takto vytvorené antimediátorové RNA môžu interagovať s mRNA alebo cieľovou genómovou DNA a tvoriť s ňou dvojvláknový alebo trojvláknový hélix. Môže najmä ísť o antimediátorové sekvencie (oligonukleotidy), prípadne chemicky modifikované, schopné interagovať priamo s génom alebo cieľovou RNA.
Vždy podľa uprednostňovaného spôsobu uvedenia predloženého vynálezu nukleová kyselina je taký antimediátorový oligonukleotid, aký bol už definovaný, prípadne chemicky modifikovaný. Môže najmä ísť o oligonukleotidy, ktorých fosfodiesterový skelet bol modifikovaný chemicky, napríklad fosfonátové oligonukleotidy, fosfotriesterové, fosforamidátové a fosfortiolátové, ktoré sú opísané napríklad v prihláške vynálezu W094/08003. Môže najmä ísť o oligonukleotidy alfa alebo konjugované oligonukleotidy s činiteľmi, ako sú akrylátové zlúčeniny.
V zmysle predloženého vynálezu ide o oligonukleotidové ligandy, oligoribonukleotidy alebo oligodeoxyribonukleotidy schopné špecificky sa viazať na proteín Mdm-2, aby inhiboval svoju onkogénnu funkciu. Takéto nukleotidy môžu byť napríklad preukázané technikami „vývoj in vitro“ ako napríklad technikou SELEX (Edgington, Bio/technology, 1992, 10, 137 - 140, Brevets US 5 270 163 a WO 91/198113).
Všeobecne tieto nukleové kyseliny môžu byť ľudského pôvodu, zvieracieho, rastlinného, bakteriálneho, vírusového, syntetického atď. Môžu byť získané všetkými odborníkmi známymi technikami a najmä chemickou syntézou alebo tiež zmiešanými metódami zahŕňajúcimi chemickú alebo enzýmovú modifikáciu sekvencií získaných triedením bánk.
Ako je naznačené ďalej, môžu byť včlenené do vektorov, ako napríklad plazmidových vektorov, vírusových lebo chemických. Môžu byť predovšetkým podávané samy osebe vo forme DNA podľa techník opísaných v prihláške vynálezu WO 90/11092 alebo vo forme komplexu napríklad vo forme komplexu s DEAE-dextránom (Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891), s nukleárnymi proteínmi (Kaneda et al., Science 234 (1989) 375) s lipidmi alebo katiónovými polymérmi (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413) alebo vo forme lipozómov (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431) atď.
Sekvencia použitá v rámci predloženého vynálezu tvorí časť vektora. Použitie takého vektora umožňuje naozaj zlepšenie podávania nukleovej kyseliny do buniek na ošetrenie a tiež umožňuje zvýšiť ich stabilitu v uvedených bunkách a tým umožňuje získať trvalý terapeutický účinok. Je možné vložiť viac sekvencii nukleovej kyseliny do toho istého vektora, tým sa zvýši tiež účinnosť liečenia.
SK 287127 Β6
Použitý vektor môže byť rôzneho pôvodu, vtedy, ako je schopný transformovať zvieracie bunky, najmä rakovinové ľudské bunky. V uprednostňovanom spôsobe uskutočnenia vynálezu sa používa vírusový vektor, ktorý môže byť vybraný medzi adenovírusmi, retrovírusmi, vírusmi AAV alebo vírusmi Herpes.
Z tohto pohľadu predložený vynález má tiež pre každý vírusový vektor zodpovednú, vloženú do svojho genómu, nukleovú kyselinu kódujúcu zlúčeninu schopnú antagonizovať aspoň čiastočne onkogénnu vlastnosť proteínu Mdm2.
Predložený vynález sa týka každého rekombinantného vírusu obsahujúceho sekvenciu nukleových kyselín kódujúcich zlúčeninu schopnú viazať sa na proteín Mdm2 tak, aby vytvoril svoj onkogénny potenciál. V tejto súvislosti sekvencie nukleových kyselín môžu kódovať jeden z peptidov, proteínov alebo transkripčných faktorov najskôr identifikovaných.
Táto sekvencia nukleových kyselín kóduje scFV alebo peptid schopný interagovať na úrovni domény 1-134 (SEQ ID NO: 1) proteínu Mdm2.
Výhodne vírusy použité v rámci vynálezu sú prednostne defektné, preto sú neschopné replikovať sa autonómnym spôsobom v infikovanej bunke. Všeobecne, genóm defektných vírusov, použitých v rámci predloženého vynálezu, je teda zbavený aspoň sekvencií nevyhnutných na replikáciu uvedeného vírusu v infikovanej bunke. Tieto oblasti môžu byť buď vylúčené (úplne alebo sčasti), alebo nefunkčné, alebo substituované inými sekvenciami, predovšetkým sekvenciou kódujúcou zlúčeniny, ktoré majú antagonistickú úlohu na onkogénne vlastnosti proteínu Mdm2. Defektný vírus viac-menej zachováva sekvencie svojho genómu, ktoré sú nutné na enkapsidáciu vírusových častíc.
Najmä ide o adenovírusy, rôzne sérotypy, ktorých štruktúra a vlastnosti sa tak trochu menia, a ktoré sa charakterizovali. Medzi týmito sérotypmi sa prednostne používajú v rámci predloženého vynálezu ľudské adenovírusy typu 2 alebo 5 (Ad2 alebo Ad5) alebo adenovírusy zvieracieho pôvodu. V rámci predloženého vynálezu sa môžu uviesť adenovírusy pôvodu psieho, hovädzieho, myšacieho (napríklad: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovčieho, prasacieho, vtáčieho alebo tiež opičieho (napríklad: SAV). Adenovírus zvieracieho pôvodu je adenovírus psí, predovšetkým adenovírus CAV2 (souche manhattan alebo A26/61 (ATCC VR-800) napríklad). V rámci predloženého vynálezu sa prednostne používa adenovírus ľudského pôvodu alebo psieho pôvodu, alebo ich zmes.
Defektné adenovírusy podľa predloženého vynálezu zahŕňajú ITR, sekvenciu umožňujúcu enkapsidáciu a sekvenciu kódujúcu modulátor. V genóme adenovírusu podľa vynálezu gén El a aspoň jeden z génov E2, E4, L1-L5 sú nefunkčné. Uvažovaný vírusový gén môže byť zbavený nefunkčnosti všetkými odborníkmi známymi technikami, a najmä totálnou supresiou, substitúciou, čiastočnou deléciou alebo adíciou jednej alebo viac bází v určitom alebo určitých génoch. Takéto modifikácie môžu byť dosiahnuté in vitro (na izolované DNA) alebo in situ napríklad prostredníctvom techník genetického odboru alebo znovu liečením prostredníctvom mutagénnych agentov.
Rekombinantné defektné adenovírusy podľa predloženého vynálezu môžu byť pripravené všetkými odborníkmi známymi technikami (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573, Graham, EMBO J. (1984) 2917). Predovšetkým môžu byť pripravené všeobecnou rekombináciou medzi adenovírusom a plazmidom nesúcim medzi inými sekvenciu DNA kódujúci inhibítor ETS. Všeobecná rekombinácia nastáva po kotransfekcii spomínaného adenovírusu a plazmidu v línii prispôsobených buniek. Použitá bunková línia musí prednostne (i) byť transformovateľná uvedenými elementmi a (ii) obsahovať sekvencie schopné doplniť časť genómu defektného adenovírusu predovšetkým v integrovanej forme, aby sa zabránilo nebezpečiu rekombinácie. Ako príklad línia sa môže spomenúť ľudská obličková embryonálna línia 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), ktorá najmä obsahuje ľavú časť genómu adenovírusu Ad5 (12 %), zahrnutú vo svojom genóme. Stratégie konštrukcie vektorov riadených adenovírusmi boli tiež opísané v prihláškach vynálezu FR 93 05954 a FR 93 08596.
Adenovírusy, ktoré sú rozmnožené, sa získali a purifíkovali podľa klasických techník molekulárnej biológie, ako je naznačené v príkladoch.
Čo sa týka vírusov AAV, ide o vírusy DNA veľkosti relatívne malej, ktoré sa začleňujú do genómu buniek, ktoré sú infikované, stabilne a miestošpecificky. Sú schopné infikovať široké spektrum buniek bez toho, aby mali vplyv na indukciu rastu, morfológii alebo diferenciáciu buniek. Nezdá sa, že sú zahrnuté do patológií u ľudí. Genóm AAV sa klonoval, sekvenoval a charakterizoval. Obsahuje okolo 47 000 báz a obsahuje na každom konci oblasť obrátenej repetície (ITR) so 145 bázami, slúžiaci ako pôvodca replikácie pre vírus. Ostatok genómu je rozdelený na dve hlavné časti nesúce enkapsidačné funkcie: na ľavú časť genómu, ktorá obsahuje gén rep implikovaný do vírusovej replikácie a expresie vírusových génov a pravú časť genómu, ktorá obsahuje gén cap kódujúci kapsidové proteíny vírusu.
Použitie vektorov odvodených od AAV na prenos génov in vitro a in vivo bolo opísané v literatúre (pozri predovšetkým WO 91/18088, WO 93/09239, US 4 797 368, US5 139 941, EP 488 528). Tieto prihlášky vynálezu opisujú rôzne konštrukcie odvodené od AAV, v ktorých gény rep a/alebo cap sú deletované a nahradené génom záujmu a opisuje ich použitie na prenos in vitro (na bunkách v kultúre) alebo in vivo (priamo do organizmu) uvedeného génu záujmu. Rekombinantné defektné AAV podľa predloženého vynálezu môžu byť
SK 287127 Β6 pripravené kotransfekciou v bunkovej línii infikované pomocným ľudským vírusom (napríklad adenovírusom) plazmidu obsahujúceho sekvenciu kódujúcu inhibítor ETS ohraničený dvomi oblasťami obrátenej repetície (ITR) AAV a plazmidu nesúceho gény enkapsidácie (gény rep a cap) AAV. Rekombinantné produkty AAV sú potom purifikované klasickými technikami.
Co sa týka vírusov Herpes a retrovírusov, konštrukcia rekombinantných vektorov sa široko opísala v literatúre: pozri predovšetkým Breakfield et al., Mew Biologist 3 (1991) 203, EP 453242, EP 178220, Bemstein et al., Genet. Eng. 7 (1985) 235, McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689 atď. Predovšetkým retrovirusy sú integrované vírusy selektívne infikujúce bunky vo fáze delenia. Tvoria tak vektory záujmu na rakovinové aplikácie. Genóm retrovírusov zahŕňa najmä dve LTR, sekvenciu enkapsidácie a tri kódované oblasti (gag, pol a env). V rekombinantných vektoroch odvodených od retrovírusov gény gag, pol a env sú všeobecne deletované sčasti alebo úplne a nahradené heterológnou sekvenciou nukleovej kyseliny záujmu. Tieto vektory môžu byť vytvorené z rôznych typov takých retrovírusov, ako sú najmä MoMuLv („murine moloney leukémia vírus“, ešte nazvané MoMLV), MSV („murine moloney sarcoma vkus“), HaSV („harvey sarcoma virus“), SNV („spleen necrosis virus“) RSV („rous sarcoma virus“) alebo tiež Friendov vírus.
Na vytvorenie rekombinantných retrovírusov obsahujúcich sekvenciu záujmu je všeobecne konštruovaný plazmid obsahujúci zvlášť LTR, sekvenciu enkapsidácie a uvedenú sekvenciu záujmu, neskôr použitý na transfekciu bunkovej línie enkapsidácie schopnej preniesť retrovírusové chybné funkcie do plazmidu. Všeobecne línie enkapsidácie sú tak schopné exprimovať gény gag, pol a env. Takéto línie enkapsidácie boli opísané vo vedľajších odboroch, najmä línia PA317 (US 4,861,719), línie PsiCRIP (WO 90/02806) a línia GP+envAm-12 (WO 89/07150). Inak rekombinantné retrovirusy môžu zahŕňať modifikácie na úrovni LTR na účely zrušenia transkripčnej aktivity rovnako ako rozsiahlu sekvenciu enkapsidácie obsahujúcu časť génu gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Rekombinantné retrovírusové produkty sú potom purifikované klasickými technikami.
Vo vektoroch vynálezu sekvencie kódujúce zlúčeninu, ktorá má antagonistické vlastnosti proti onkogénnym vlastnostiam Mdm2, je umiestnený pod kontrolou signálov umožňujúcich svoju expresiu v tumorálnych bunkách. Prednostne ide o signály heterológnej expresie, totiž o rôzne signály prirodzene zodpovedné za expresiu inhibítora. Môže ísť najmä o sekvencie zodpovedné za expresiu iných proteínov alebo syntetickej sekvencie. Najmä môže ísť o sekvencie promótora eukaryotických génov alebo vírusových génov. Napríklad ide o sekvencie promótora pochádzajúce z genómu bunky, ktorá sa požaduje infikovať. Rovnako môže isť o sekvencie promótora vzniknutého z genómu vírusu, ktorý obsahuje použitý vírus. V tomto ohľade sa môžu citovať napríklad promótory E1A, MLP, CMV, LTR-RSV atď. Okrem toho tieto sekvencie expresie môžu byť modifikované adíciou aktivačných sekvencií, sekvencií regulačných alebo sekvencií umožňujúcich expresiu tkanivovo špecifickú. Môže byť zaujímavé použitie najmä signálov expresie špecificky aktívnych alebo väčšinovo aktívnych v tumorálnych bunkách tak, aby sekvencie DNA boli nielen exprimované, ale aj produkovala svojim účinkom vírus, ktorý efektívne infikoval tumorálnu bunku.
V spôsobe realizácie sa vynález týka rekombinantného defektného vírusu obsahujúceho sekvenciu cDNA kódujúcu zlúčeninu majúcu antagonistické vlastnosti na onkogénny charakter Mdm2 pod riadením vírusového promótora, vybraného výhodne medzi LTR-RSV a promótorom CMV.
Vždy v uprednostňovanom spôsobe vynález sa týka defektného rekombinantného vírusu obsahujúceho sekvenciu DNA kódujúcu zlúčeninu, ktorá má antagonistické vlastnosti na onkogénny charakter Mdm2 pod riadením promótora, ktorý umožňuje väčšinovú expresiu v tumorálnych bunkách.
Expresia je považovaná ako väčšinová v zmysle vynálezu aj tom prípade, keby zvyšková expresia sa pozorovala v iných bunkových typoch, úrovne expresie sú vyššie v tumorálnych bunkách.
Predložený vynález sa týka najmä nukleovej sekvencie kódujúcej intraceluláme protilátky alebo tiež scFV namierené proti oblasti 1-134 sekvencie proteínu Mdm2 vyjadrenej sekvencie SEQ ID NO: 1 na prípravu farmaceutickej kompozície určenej všeobecne na liečenie rakoviny.
Týka sa tiež každej farmaceutickej kompozície obsahujúcej zlúčeninu schopnú inhibovať onkogénnu aktivitu proteínu Mdm2 alebo sekvenciu nukleových kyselín kódujúcich takúto zlúčeninu. Podľa spôsobu realizácie vynálezu táto kompozícia zahŕňa nielen jeden alebo viac rekombinantných defektných vírusov takých, aké boli skôr opísané. Tieto farmaceutické kompozície môžu byť zostavené z pohľadu spôsobu podávania: topické, orálne, parenterálne, intraokulámc, intradermálne atď. Farmaceutické kompozície vynálezu prednostne obsahujú farmaceutické vehikulum vhodné na injikovateľnú formuláciu, predovšetkým na injikovanie priamo do tumoru pacienta. Môže najmä ísť o sterilné roztoky, izotonické roztoky alebo kompozície suché, najmä lyofilizované, ktoré pridaním podľa okolnosti sterilnej vody alebo fyziologického séra umožňujú konštitúciu injikovateľných roztokov. Injekcia priamo do tumoru pacienta je výhodná, pretože umožní sústrediť terapeutický účinok priamo na úroveň postihnutého tkaniva.
Dávky použitých rekombinantných defektných vírusov na injikáciu môžu byť prispôsobené vzhľadom na rôzne parametre, zvlášť vzhľadom na vírusové vektory, k spôsobu použitého podávania, k určitej patológii alebo tiež dĺžke skúmaného ošetrenia. Všeobecne sú rekombinantné adenovírusy podľa vynálezu formulované a podávané vo forme dávok obsahujúcich medzi 104 a 1014 pfu/ml, výhodnejšie 106 až 1010 pfu/ml. Termín pfu („plaque forming unit“) zodpovedá infekčnej schopnosti roztoku vírusov a je určený infekciou vhodnej bunkovej kultúry a počtom plakov infikovaných buniek po 48 hodinách. Techniky určenia titru vírusového roztoku sú dobre opísané v literatúre. Čo sa týka retrovírusov, kompozície podľa vynálezu môžu obsahovať priamo produkované bunky z pohľadu ich implantácie.
Farmaceutické kompozície podľa vynálezu sú najmä výhodné na neutralizáciu onkogénnej aktivity proteínov Mdm2 a preto na modulovanie proliferácie určitých bunkových typov.
Najmä tieto kompozície sú prijateľné na liečenie rakovín súvisiacich s p53 nul, ako napríklad nasledujúce rakoviny: adenokarcinómov časti hrubého čreva, rakoviny štítnej žľazy, karcinómov pľúc, rakoviny prsníkov, rakoviny pľúc, rakoviny žalúdka, rakoviny pažeráka, lymfómov B, rakoviny ováríí, rakoviny močového mechúra, glioblastómov atď.
Predložený vynález je výhodne použitý in vivo na deštrukciu hyperproliferatívnych buniek (v proliferácii nenormálnej). Je tak aplikovateľný na deštrukciu tumorálnych buniek alebo buniek hladkého svalstva vaskulámej steny (restenóza).
Nasledujúce obrázky a príklady bližšie ilustrujú vynález bez toho, aby v akomkoľvek smere obmedzovali jeho rozsah.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1: Znázornenie proteínov Mdm2 A až F.
Obrázok 2: Graf transfekcie buniek Saos-2 s plazmidmi exprimujúcimi rôzne proteíny Mdm-2.
Obrázok 3: Schematické znázornenie inhibície transformačných vlastností Mdm2 rôznymi p53.
Obrázok 4: Účinok silnej expresie Mdm2 na bunkový cyklus.
Obrázok 5: Účinok silnej expresie Mdm2 na bunkový cyklus.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Všeobecné techniky molekulárnej biológie
Metódy klasicky používané v molekulárnej biológii ako je preparatívna extrakcia plazmidovej DNA, centrifugácia plazmidovej DNA v gradiente chloridu cézneho, elektroforéza na agarózovom alebo akrylamidovom géli, purifikácia fragmentov DNA elektroelúciou, extrakcie proteínov fenolom alebo zmesou fenolu a chloroformu, zrážanie DNA vo fyziologickom prostredí etanolom alebo izopropanolom, transformácia v Escherichia coli atď., sú odborníkmi dobre známe metódy a sú obsiahle opísané v odbornej literatúre (Maniatis T. et al., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual“, Cold Sping Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982, Ausubel F.M. et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987).
Na vytvorenie väzieb fragmenty DNA môžu byť separované podľa ich veľkosti elektroforézou na agarózovom géli alebo akrylamidovom géli, extrahované fenolom alebo zmesou fenolu a chloroformu, zrážané etanolom, potom inkubované v prítomnosti DNA-ligázy fágu T4 (Biolabs) podľa doporučenia dodávateľa.
Doplňovanie vyčnievajúcich 5' koncov môže byť uskutočnené Klenowovým fragmentom DNA-polymerázy I Escherichia coli (Biolabs) podľa doporučenia dodávateľa. Deštrukcia vyčnievajúcich 3' koncov sa uskutočňuje v prítomnosti DNA-polymerázy I fágu T4 (Biolabs) podľa odporučenia výrobcu. Deštrukcia vyčnievajúceho 5' konca sa uskutočňuje pôsobením nukleázy SI.
Mutagenéza in vitro usmerňovaná syntetickými oligonukleotidmi môže byť uskutočnená podľa metódy vyvinutej Taylorom a kol. (Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749 - 8764) použitím súpravy distribuovanej Amersham.
Enzýmová amplifikácia fragmentov DNA technikou PCR (Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R. K. et al., Science 230 (1985) 1350 - 1354, Mullis K. B. et Faloona F. A., Meth. Enzým. 155 (1987) 335 - 350) môže byť uskutočnená použitím „DNA thermal cycler“ (Parkin Elmer Cetus) podľa odporučenia výrobcu. Amplifikácia genómovej DNA sa uskutočňuje predovšetkým za nasledovných podmienok: 5 minút pri teplote 100 °C, 30 jednominútových cyklov pri teplote 95 °C, 2 minúty pri teplote 58 °C, potom 3 minúty pri teplote 72 °C prostredníctvom vhodných sond. Produkty amplifikácie sa analyzujú elektroforézou na géli.
Overenie nukleotidových sekvencií sa môže uskutočňovať metódou podľa Sangera a kol. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463 - 5467) použitím súpravy distribuovanej Amersham.
Materiál a metódy
1. Použité konštrukcie:
- Plazmid pBKCMV je uvedený na trh Stratagenom a obsahuje gén rezistentný na neomycín.
- Plazmid pC53ClN3 a p53-4.2.N3 kódujúci divý p53 a p53 R273H pochádzajú od A. Levine (Hinds et al., Celí Growth and Diff. (1990), 1, 571).
- Plazmid pBKp53 (R273H) obsahuje ľudský minigén p53. Je získaný z pD53-4.2.N3.
- Plazmid pBKp53 bol získaný klonovaním v pBKCMV kazete, kódovanie spočívajúce v nevyjadrenej oblasti konca sekvencie kódujúcej súvislú /3-globin sekvenciu kódujúcu mdm2.
- Plazmid pGKhygro exprimuje gén rezistentný na hydromycín (Náture (1990) 348, 649 - 651).
- Plazmid pCMVNeoBam umožňujúci expresiu génu rezistentného na neomycín (Hinds et al. (1990) Celí. Growth and Diff., 1, 571 - 580).
- Plazmidy pCMVpl07 a pCMVCD20 umožňujúce expresiu proteínu pl07 a označenie povrchu CD20 (Zhu et al. (1993) Genes and Development, 7, 1111 - 1125).
- Plazmidy pCMVE2F-4 a pCMVE2F-5 umožňujúce expresiu proteínov E2F-4 a E2F-5 (Sardet et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sc, 92, 2403 - 2407).
- Plazmidy pLexA, pLexA(6-41), pLexA(16-25) umožňujúce expresiu DNA väzbovej oblasti LexA (aa 1 až 87) voľné alebo fixované s p53(6-41) alebo p53 (16-25). pLexA(6-41) a pLexA(16-25) sa získali z plazmidu pLexApolylI vytvoreného LGME (Strasbourg).
- Plazmidy eukaryotickej expresie pl07: (pl07 (385-1068), pl07(l-781) a pl07(781-l068) (Zhu et al., EMBOJ. 14 (1995) 1904).
- Plazmid pSGKlHAplO7 umožňuje expresiu in vitro a in vivo pl07. pl07 je v súvislosti so sekvenciou Kozák a epitop HA je exprimovaný vo fúzii na C-koniec pl07.
- Plazmidy pBC-MDM2 a pBC-MDM2(l-134) sa získali klonovaním MDM2 a MDM2(1-134) v pBC (Chattonet al., Biotechniques 18 (1995) 142).
- Plazmidy pGex-MDM2 a pGex-MDM2( 1-177) sa získali klonovaním MDM2 a MDM2(1-177) v pGex.
2. Metóda:
Expresia p53 je určená prenosom (Westem Blotting) na bunkovom extrakte pomocou monoklonálnych protilátok DO 1.
Expresia mRNA kódujúca proteín Mdm2 je určená semikvantitatívnej RT-PCR. Neprítomnosť kontaminácie DNA je overená PCR.
Príklad 1: Preukázanie transformovaných vlastností mdm2
Bunky Saos-2 sú transfekované buď plazmidom pBKMDM2, porovnávacím plazmidom pBKp53 (R273H) alebo porovnávacím plazmidom p53 negatívnym pBKCMV, potom sú vybrané na základe rezistencie ku Geneticínu 418(G418).
V prvom pokuse sa vybrali klony individuálne a rozmnožené tak, že v druhom pokuse neizolované klony boli umiestnené do kultivačnej agarovej pôdy soft.
104 buniek sa naočkovalo dvojmo do 0,375 % soft agaru. Po 24 hodinách sa určil celkový počet kolónií s viac než 50 bunkami a takisto aj počet buniek každej kolónie (veľkosť kolónií). Každá udaná hodnota zodpovedá priemerne štyrom dvojmo uskutočneným pokusom. Získané výsledky sú uvedené v tabuľke I. Klony v pokuse č. 1 zodpovedajúce mdm2 sú identifikované ako Ml až M6, klony proteínu p53 (R273H) ako p53-1 až p53-6 a klony kontrolné ako Col až Co5.
Ako sa očakávalo, Col a Co4 neexprimujú transfekovaný mdm2 a Col-3 neexprimujú proteín p53.
Tabuľka I
rast na kultivačnom médiu agar soft, kolónie (veľkosť) expresia
MDM2 P53
pokus 1 (izolované klony) MDM2 Ml 634 (100-600) + ND
M2 594 (100-600) ND
M3 460(100-600) + ND
M4 310(50-500) ND
M5 57 (50-200) +/- ND
M6 23 (50) + ND
kontrola Col 97 (50-200) - -
Co2 68 (50-200) ND -
Co3 35 (50-100) ND -
Co4 11(50) - ND
Co5 4(50) ND ND
p53R P«-l 190 (50-600) ND +++
rast na kultivačnom médiu agar soft, kolónie (veľkosť) expresia
MDM2 P53
(273)H p53-2 137 (50-300) ND +-H- -h
p53-3 88 (50-200) ND +++
p53-4 53 (50-200) ND +++
p53-5 47 (50-200) ND ++
p53-6 38 (50-100) ND +
pokus 2 MDM2 M-Pl 395 (100-1000) ++ ND
kontrola Co-PÍ 21 (50-200) ND ND
Co-P2 18(50-200) ND ND
pokus 3 MDM2 M-Pl 255 (50-300) ND ND
M-P2 220 (50-300) ND ND
kontrola Co-ΡΓ 110(50-200) ND ND
Co-P2 110(50-200) ND ND
Co-P3 100 (50-100) ND ND
Co-P4 75 (50-100) ND ND
Príklad 2: Oblasť N-konce Mdm2 (1-134) sekvencie SEQ ID NO: 1 je nutná a dostatočná na stimuláciu rastu buniek Saos-2 na agare soft.
Bunky Saos-2 sú transfekované buď s plazmidmi pBKCV, ktoré vyjadrujú zároveň rezistenciu neo a proteíny mdm-2 A až F opísané na obrázku 1, alebo s porovnávacím plazmidom pBKCMV, potom sú vybrané na základe rezistencie na G418. Ostávajúce bunky sú zhromaždené, amplifikované a testované na tvorbu kolónií na agare soft. Výsledky na obrázku 2 sú vyjadrené počtom vytvorených kolónií na agare soft vo vzťahu k počtu mdm-2 (A). Tieto výsledky pochádzajú z dvoch reprezentatívnych nezávislých pokusov transfekcie, v ktorých medzi 3 a 7 jamkou boli testované rôzne bunky, podľa konštrukcie. Jasne sa ukázalo, že oblasť N-konca mdm-2 má onkogénne vlastnosti. Najúčinnejšia konštrukcia zodpovedá úplnému proteínu.
Pokus 3: Reverzia onkogénnych vlastností Mdm-2 divým proteínom p53, mutantov proteínu p53 a fragmentov proteínu p53.
Časť buniek Saos-2 transformovaných Mdm-2 je kotransfekovaná s plazmidom pGKhygro alebo pC53ClN3 (p53) pC53-4.2N3 p53(R(273)H, p53 (1-52), pLexA(6-41), pLexA(16-25), pLexA, p53(L14Q,F19S), p53(L22Q,W23S) alebo pCMVNeoBam, potom vybraná na základe rezistencie na hydromycín v prítomnosti G418. 100 000 buniek pochádzajúcich z 3 až 5 jamiek nezávislých rezistentných buniek sú zaočkované dvojmo na agar soft (0, 375 %). Po 25 dňoch kultivácie boli spočítané kolónie, ktoré obsahujú aspoň 50 buniek. Obrázok 3 ukazuje výsledky reprezentatívneho pokusu a schematicky vyjadruje rôzne testované p53 na inhibíciu transformačných vlastností Mdm-2. Z tohto pokusu vyplýva, že samotné konštrukcie umožňujú expresiu proteínov schopných sa viazať s proteínom mdm-2 prípadne s p53, p53 R273H, p53( 1 -52), LexA(6-41), LexA(16-25) inhibujú onkogénne vlastnosti Mdm-2. Naproti tomu dvojnásobné mutanty, ktoré sú uvedené, ktoré stratili svoju schopnosť viazať mdm-2 (Lin et al., Gene Dev., 1994, 8, 1235 - 1246), nemajú účinok inhibítora. Skutočnosť, že mutant p53(14 - 19), ktorý má zachované transaktivačné vlastnosti divého proteínu p53, neinhibuje transformáciu proteínom Mdm-2, potvrdzuje, že onkogénne vlastnosti proteínu Mdm-2 sú nezávislé od inhibície transaktivačných vlastností proteínu p53 proteínom Mdm-2.
Príklad 4: Mdm-2 inhibuje zastavenie G1 bunkového cyklu indukovaného pl07 v bunkách Saos-2.
Bunky Saos-2 sú kotransfekované s tromi typmi plazmidov, (i) plazmidom na expresiu CD-20, (pCDVCD20, 2 pg, kódujúci značenie povrchu bunky CD-20), (ii) plazmidom (9 pg) expresia typu CMV (promótor cytomegalovírusu) bez kódovanej sekvencie alebo kódujúcim Mdm-2 (PBKCMVMdm2), oblasť 1-134 Mdm-2 (PBKCMVdm2(l-134), E2F-4 alebo E2F-5 (pCMVE2F-4, pCMVE2F-5) a (iii) vektorom expresie pl07 (pCMVplO7, 9 pg). Bunky sú potom spracované na analýzu FACScan, ako opísal Zhu et al., Gene Dev., 1993, 7, 1111 - 1125). Výsledky reprezentatívneho pokusu sú uvedené na obrázku 4. Je jasne ukázané, že v neprítomnosti silne exprimovaného pl07, expresia Mdm-2 alebo jeho oblasti 1-134 nemá vplyv na bunkový cyklus. Oproti tomu expresia Mdm-2 a jeho oblastí 1-134 je schopná zrušiť zastavenie bunkového cyklu G1 indukovaného pl07. Tento príklad jasne ukazuje, že Mdm-2 nie je iba inhibítor transaktivačnej aktivity proteínu p53, ale tiež pozitívny regulátor bunkového cyklu, schopný inhibovať implikované faktory v riadení tohto cyklu.
V podobnom pokuse bunky Saos-2 boli transfekované s 1 pg pl07 (385-1068), 8 pg pCMVNeoBam, 1 pg pXJMDM2, 8 pg pXJ41 a 2 pg pCMVCD20. Výsledky reprezentatívneho pokusu sú vyznačené na obrázku
5. Ukazujú, že expresia MDM2 môže ukončiť blokáciu G1 indukovanú pl07 a mutantom delécie pl07 (385-1068), ktorý je schopný integrovať s MDM2.
Príklad 5: MDM2 interaguje in vitro a in vivo s p 107
Tento príklad ukazuje fyzikálnu interakciu medzi MDM2 a pl07 in vitro a in vivo. Tieto výsledky sú korelované s aktivitou MDM2 na úrovni bunkového cyklu (príklad 4).
5.1. In vitro pl07 značený S35 in vitro je uvedený do kontaktu s proteínom GST-MDM2 (vektor pGex-MDM2) alebo GST-MDM2 (1-177) (vektor pGex-MDM2(l-177)), ktoré sú imobilizované na guľôčkach glutation sepharózy. P107 viazaný na MDM2 je potom detekovaný autorádiograficky na polyakrylamidovom géli. Získané výsledky sú uvedené v tabuľke II.
5.2. In vivo
Bunky Cos sú kotransfekované s plazmidom pBC-MDM2 alebo pBC-MDM2 (1-134), ktoré exprimujú proteínovú fúziu GTS-MDM2 alebo GST-MDM2 (1-134) s plazmidom expresie pl07 alebo mutantom pl07. Komplexy proteínov GST-MDM2-pl07 pochádzajúce z bunkových extraktov sú izolované na guľôčkach glutation sepharózy a proteíny pl07 sú detekované pomocou prenosu (Westem blotting) s polyklonálnou protilátkou anti-pl07 (šanta Cruz pl07-C18). Získané výsledky sú uvedené v tabuľke II.
Tabuľka II
pl07 pl07 (385-1068) pl07(l-781) pl07 (385-1068)
In Vivo
GST-MDM2 + +
GST-MDM2( 1-134) + nd nd nd
In Vitro
GST-MDM2 + nd nd nd
GST-MDM2(1-177) + nd nd nd
Výsledky ukazujú prítomnosť interakcie proteín-proteín medzi MDM2 a pl07 in vitro, ale aj v bunke. Oblasť MDM2, dôležitá pre bunkovú transformáciu (1-134), je oblasť, ktorá interaguje s pl07. Táto oblasť sa lokalizovala, ako sa zistilo, najmä v časti „obalovej oblasti“, oblasti „A“ a oblasti „medzerník“.
Zoznam sekvencii (1) Všeobecné informácie:
(i) podávateľ:
(A) Meno: RHONE-POULENC RORER S. A.
(B) Ulica: 20, Raymond ARON (C) Mesto: ANTONY (E) Krajina: Francúzsko (F) Smerovacie číslo: 92165 (G) Telefón: 40.91.69.22 (H) Fax: (1)40.91.72.96 (ii) podávateľ:
(A) Meno: INŠTITÚT DE LA ŠANTE ET DE LA
RECHERCHE MEDICALE (INSERM) (B) Ulica: 101, Rue de Tolbiac (C) Mesto: Paríž Cedex 13 (E) Krajina: Francúzsko (F) Smerovacie číslo: 75654 (G) Telefón: 44.23.60.61.
(H) Fax: 45.85.68.56.
(ii) názov vynálezu: Antogonisty onkogénnej aktivity proteínu MDM2 a ich použitie na liečenie rakovín.
(iii) počet sekvencii: 2 (iv) počítačová forma:
(A) Typ nosiča: tápe (B) počítač: IBM PC kompatibilný (C) systém využitia: PC-DOS/MS-DOS (D) logika: Patentin Relase #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) Informácie o sekvencií SEQ ID NO: 1:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 1476 párov báz (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: nie (iv) anti-sense: nie (ix) charakteristika:
(A) názov/CLE: CDS (B) umiestenie: 1...1476 (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 1:
ATG TGC AAT ACC AAC ATG TCT GTA CCT ACT GAT GGT GCT GTA 42
Met Cys Asn Thr Asn Met Ser Val Pro Thr Asp Gly Ala Val
1 5 10
ACC ACC TCA CAG ATT CCA GCT TCG GAA CAA GAG ACC CTG GTT 84
Thr Thr Ser Gin íle Pro Ala Ser Glu Gin Glu Thr Leu Val
15 20 25
AGA CCA AAG CCA TTG CTT TTG AAG TTA TTA AAG TCT GTT GGT 126
Arg Pro Lys Pro Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Ser Val Gly
30 35 40
GCA CAA ΆΆΆ GAC ACT TAT ACT ATG AAA GAG GTT CTT TTT TAT 168
Ala Gin Lys Asp Thr Tyr Thr Met Lys Glu Val Leu Phe Tyr
45 50 55
CTT GGC TAG TAT ATT ATG ACT AAA CGA TTA TAT GAT GAG AAG 210
Leu Gly Gin Tyr íle Met Thr Lys Arg Leu Tyr Asp Glu Lys
60 65 70
CAA CAA CAT ATT GTA TAT TGT T CA AAT GAT CTT CTA GGA GAT 252
Gin Gin His íle Val Tyr Cys Ser Asn Asp Leu Leu Gly Asp
75 80
TTG TTT GGC GTG CCA AGC TTC TCT GTG AAA GAG CAC AGG AAA 2 94
Leu Phe Gly Val Pro Ser Phe Ser Val Lys Glu His Arg Lys
85 90 95
ATA TAT ACC ATG AT ' C TAC AGG AAC TTG GTA GTA GTC AAT CAG 336
íle Tyr Thr Met íle Tyr Arg Asn Leu Val Val Val Asn Gin
100 105 110
CAG GAA TCA TCG TAC TCA GGT ACA TCT GTG AGT GAG AAC AGG 378
Gin Glu Ser Ser Asp Ser Gly Thr Ser Val Ser Glu Asn Arg
115 120 125
TGT CAC CTT GAA GGT GGG AGT GAT CAA AAG GAC CTT CTA CAA 420
Cys His Leu Glu Gly Gly Ser Asp Gin Lys Asp Leu Val Gin
130 135 140
GAG CTT CAG GAA GAG AAA CCT TCA TCT TCA . CAT TTG GTT TCT 462
Glu Leu Gin Glu Glu Lys Pro Ser Ser Ser His Leu Val Ser
145 150
AGA CCA TCT ACC TCA TCT AGA AGG AGA GCA ATT AGT GAT ACA 504
Arg Pro Ser Thr Ser Ser Arg Arg Arg Ala íle Ser Glu Thr
155 160 165
SK 287127 Β6
GAA . GAA . AAT ' TCA . GAT 1 GAA . TTA . TCT 1 GGT GAA . CGA . CAA . AGA . AAA 546
Glu Glu Asn . Ser Asp Glu . Leu Ser Gly Glu Arg Gin Arg Lys
170 175 180
CGC CAC AAA TCT GAT AGT ATT TCC CTT TCC TTT GAT GAA AGC 588
5 Arg His Lys Ser Asp Ser íle Ser Leu Ser Phe Asp Glu Ser
185 190 195
CTG GCT CTG TGT GTA ATA AGG GAG ATA TGT TGT GAA AGA AGT 630
Leu Ala Leu Cys Val íle Arg Glu íle Cys Cys Glu Arg Ser
200 205 210
10 AGT AGC AGT GAA TCT ACA GGG ACG CCA TCG AAT CCG GAT CTT 672
Ser Ser Ser Glu Ser Thr Gly Thr Pro Ser Asn Pro Asp Leu
215 220
GAT GCT GGT GTA AGT GAA CAT TCA GGT GAT TGG TTG GAT CAG 714
Asp Ala Gly Val Ser G1U His Ser Gly Asp Trp Leu Asp Gin
15 225 230 235
GAT TCA GTT TCA GAT CAG TTT AGT GTA GAA CCC GAA GTT GAA 756
Asp Ser Val Ser Asp Gin Phe Ser Val Glu Phe Glu Val Glu
240 245 250
TCT CTC GAC TCA GAA GAT TAT AGC CTT AGT GAA GAA GGA CAA 798
20 Ser Leu Asp Ser Glu Asp Tyr Ser Leu Ser Glu Glu Gly Gin
255 260 265
GAA CTC CTA GAT GAA GAT GAT GAG GTA TAT CAA GTT ACT GTG 840
Glu Leu Ser Asp Glu Asp Asp Glu Val Tyr Gin Val Thr Val
270 275 280
25 TAT CAG GCA GGG GAG AGT GAT ACA GAT TCA TTT GAA GAA GAT 882
Tyr Gin Ala Gly Glu Ser Asp Thr Asp Ser Phe Glu Glu Asp
285 290
CCT GAA ATT TCC TTA GCT GAC TAT TGG AAA TGC ACT TCA TGC 924
Pro Glu íle Ser Leu Ala Asp Tyr Trp Lys Cys Thr Ser Cys
30 295 300 305
AAT GAA ATG AAT CCC CCC CTT CCA TCA CAT TGC AAC AGA TGT 966
Asn Glu Met Asn Pro Pro Leu Pro Ser His Cys Asn Arg Cys
310 315 320
TGG GCC CTT CGT GAG AAT TGG CTT CCT GAA GAT AAA GGG AAA 1008
35 Trp Ala Leu Arg Glu Asn Trp Leu Pro Glu Asp Lys Gly Lys
325 330 335
GAT AAA GGG GAA ATC TCT GAG AAA GCC AAA CTG GAA AAC TCA 1050
Asp Lys Gly Glu íle Ser Glu Lys Ala Lys Leu Glu Asn Ser
340 345 350
40 ACA CCA GCT GAA GAG GGC TTT GAT GTT CCT GAT TGT AAA AAA 1092
Thr Gin Ala Glu Glu Gly Phe Asp val Pro Asp Cys Lys Lys
355 360
ACT ATA GTG AAT GAT TTC AGA GAG TCA TGT GTT GAG GAA AAT 1134
Thr íle Val Asn Asp Ser Arg Glu Ser Cys Val Glu Glu Asn
45 365 370 375
GAT GAT AAA ATT ACA CAA GCT TCA CAA TCA CAA GAA AGT GAA 1176
Asp Asp Lys íle Thr Gin Ala Ser Gin Ser Gin Glu Ser Glu
380 385 390
GAC TAT TCT CAG CCA TCA ACT TCT AGT AGC ATT ATT TAT AGC 1218
50 Asp Tyr Ser Gin Pro Ser Thr Ser Ser Ser íle íle Tyr Ser
395 400 405
AGC CAA GAA GAT GTG AAA GAG TTT GAA AGG GAA GAA ACC CAA 1260
Ser Gin Glu Asp Val Lys Glu Phe Glu Arg Glu Glu Thr Gin
410 415 420
55 GAC AAA GAA GAG AGT GTG GAA TCT AGT TTG CCC CTT AAT GTC 1302
Asp Lys Glu Glu Ser Val Glu Ser Ser Leu Pro Leu Asn Ala
425 430
ATT GAA CCT TGT GTG ATT TGT CAA GGT CGA CCT AAA AAT GGT 1344
íle Glu Pro Cys Val íle Cys Gin Gly Arg Pro Lys Asn Gly
60 435 440 445
TGC ATT GTC CAT GGC AAA ACA GGA CAT CTT ATG GCC TGC TGG 1386
Cys íle Val His Gly Lys Thr Gly His Leu Met Ala Cys Phe
450 455 460
ACA TGT GCA AAG AAG CTA AAG AAA AGG AAT AAG CCC TGC CCA 1428
Thr Cys Ala Lys Lys Leu Lys Lys Arg Asn Lys Pro Cys Pro
465 470 475
GTA TGT AGA CAA CCA ATT CAA ATG ATT GTG CTA ACT TAT TTC 1470
Val Cys Arg Gin Pro íle Gin Met íle Val Leu Thr Tyr Phe
480 485 490
CCC TAG 1476
Pro * (2) Informácie o sekvencií SEQ ID NO: 2:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 1182 párov báz (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno:
(D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: nie (iv) anti-sense: nie (ix) charakteristika:
(A) názov/CLE: CDS (B) umiestnenie: 1...1182 (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO: 2:
ATG GAG GAG CCG CAG TCA GAT CCT AGC GTC GAG CCC CCT CTG 42
Met Glu Glu Pro Gin Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu
1 5 10
AGT CAG GAA ACA TTT TCA GAC CTA TGG AAA CTA CTT CCT GAA 84
Ser Gin Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu
15 20 25
AAC AAC GTT CTG TCC CCC TTG CCG TCC CAA GCA AT G GAT GAT 126
Asn Asn Val Leu Ser Pro Leu Pro Ser Gin Ala Met Asp Asp
30 35 40
TTG ATG CTG TCC CCG GAC GAT ATT GAA CAA TGG TTC ACT GAA 168
Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp íle Glu Gin Trp Phe Thr Glu
45 50 55
GAC CCA GGT CCA GAT GAA GCT CCC AGA ATG CCA GAG GCT GCT 210
Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro Arg Met Pro Glu Ala Ala
60 65 70
CCC CCC GTG GCC CCT GCA CCA GCA GCT CCT ACA CCG GCG GCC 252
Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala
75 80
CCT GCA CCA GCC CCC TCC TGG CCC CTG CCA TCT TCT GTC CCT 2 94
Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro
85 90 95
TCC CAG AAA ACC TAC CAG GGC AGC TAC GGT TTC CGT CTG GGC 336
Ser Gin Lys Thr Tyr Gin Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly
100 105 110
TTC TTG CAT TCT GGG ACA GCC AAG TCT GTG ACT TGC ACG TAC 378
Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr
115 120 125
TCC CCT GCC CTC AAC AAG ATG TTT TGC CAA CTG GTC AAG ACC 420
Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gin Leu Ala Lys Thr
130 135 140
TGC CCT GTG CAG CTG TGG GTT GAT TCC ACA CCC CCG CCC GGC 462
Cys Pro Val Gin Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly
145 150
ACC Thr 155 ATG CGC GTC Arg Val CGC Arg GTT GCC ATG GCC ATG TAC AAG CAG TCA CAG CAC 504 546
Ala Met Ala CGC íle TGC Tyr CCC Lys CAC Gin 165 CAT Ser Gin His
GTG 160 AGG GAG CGC TGC
ACG GAG
5 Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg Cys
170 175 180
TCA GAT AGC GAT GGT CTG GCC CCT CCT CAG CAT CTT ATC CGA 588
Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gin His Leu íle Arg
185 190 195
10 GTG GAA GGA AAT TTG CGT GTG GAG TAT TTG GAT GAC AGA AAC 630
Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg Asn
200 205 210
ACT TTT CGA CAT AGT GTG GTG GTG CCC TAT GAT CCG CCT GAG 672
Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu
15 215 220
GTT GGC TCT GAC TGT ACC ACC ATC CAC TAC AAT TAC ATG TGT 714
Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr íle His Tyr Asn Tyr Met Cys
225 230 235
AAC AGT TCC TGC ATG GGC GGC ATG AAC CGG AGG CCC ATC CTC 756
20 Asn Ser Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro íle Leu
240 245 250
ACC ATC ATC ACA CTG GAA GAC TCC AGT GGT AAT CTA CTG GGA 798
Thr íle íle Thr Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly
255 260 265
25 CGG AAC AGC TTT GAG GTG CGT GTT TGT GCC TGT CCT GGG AGA 840
Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg
270 275 280
GAC CGG CGC ACA GAG GAA GAG AAT CTC CGC AAG AAA GGG GAG 882
Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys Gly Glu
30 285 290
CCT CAC CAC GAG CTG CCC CCA GGG AGC ACT AAG CGA GCA CTG 924
Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu
295 300 305
CCC AAC AAC ACC AGC TCC TCC CCC CAG CCA AAG AAG AAA CCA 966
35 Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gin Pro Lys Lys Lys Pro
310 315 320
CTG GAT GGA GAA TAT TTC ACC CTT GAG ATC CGT GGG CGT GAG 1088
Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gin íle Arg Gly Arg Glu
325 330 335
40 CGC TTC GAG ATG TTC CGA GAG CTG AAT GAG GCC TTG GAA CTC 1050
Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu
340 345 350
AAG GAT 1 GCC CAG GCT ' GGG ; AAG : GAG ; cca . GGG GGG AGG AGG GCT 1092
Lys Asp Ala Gin Ala . Gly ' Lys Glu . Pro Gly Gly Ser Arg Ala
45 355 360
CAC TCC AGC CAC CTG AAG TCC AAA AAG GGT CAG TCT ACC TCC 1134
His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gin Ser Thr Ser
365 370 375
CGC CAT AAA AAA CTC ATG TTC AAG ACA GAA GGG CCT GAC TCA 1176
50 Arg His Lys Lys Leu Met Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser
380 385 390
GAC TGA 1182
Asp •k
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (21)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Použitie zlúčeniny schopnej antagonizovať aspoň čiastočne onkogénnu aktivitu proteínu Mdm
  2. 2 na prípravu farmaceutickej kompozície určenej na liečenie rakovín v súvislosti s p53 nul.
    60 2. Použitie podľa nároku 1 zlúčeniny schopnej viazať sa na úrovni domény 1-134 sekvencie proteínu
    Mdm2 reprezentovanej v SEQ ID NO: 1.
  3. 3. Použitie podľa jedného z nárokov 1 alebo 2, vyznačujúce sa tým, že zlúčenina je scFV namierená proti doméne 1-134 uvedeného proteínu Mdm2.
  4. 4. Použitie podľa jedného z nárokov 1 alebo 2, vyznačujúce sa tým, že zlúčenina je reprezentovaná čiastočne alebo úplne peptidmi 1-52, 1-41, 6-41, 16-25, 18-23 sekvencie reprezentovanej v SEQ ID NO: 2 alebo ich derivátmi.
  5. 5. Použitie podľa nároku 1 zlúčeniny schopnej viazať sa na doménu susediacu s doménou 1-134 reprezentovanou v SEQ ID NO: 1 proteínu Mdm2, pričom táto zlúčenina pôsobí v dôsledku tejto väzby na onkogénnu aktivitu uvedeného proteínu.
  6. 6. Použitie podľa nároku 1 alebo 5, vyznačujúce sa tým, že zlúčenina interaguje s oblasťou C-konca proteínu Mdm2.
  7. 7. Použitie podľa nároku 1, 5 alebo 6, vyznačujúce sa tým, že ide o transkripčný faktor vybraný medzi TFII, TBP a TAF250.
  8. 8. Použitie podľa nároku 1 alebo 5, vyznačujúce sa tým, že zlúčenina interaguje s oblasťou 135-491 proteínu Mdm2.
  9. 9. Použitie podľa nároku 1, 5 alebo 8, vyznačujúce sa tým, že ide čiastočne alebo úplne o proteín vybraný medzi proteínmi Rb, L5 a transkripčným faktorom E2F.
  10. 10. Použitie scFV namiereného proti oblasti 1-134 proteínu Mdm2 na prípravu farmaceutickej kompozície určenej na liečenie rakovín.
  11. 11. Použitie nukleovej kyseliny kódujúcej zlúčeninu schopnú antagonizovať onkogénnu aktivitu proteínu Mdm2 na prípravu farmaceutickej kompozície určenej na liečenie rakovín v súvislosti s p53 nul.
  12. 12. Použitie podľa nároku 11, vyznačujúce sa tým, že ide o: - antimediátorové nukleové kyseliny, - oligonukleotidové ligandy schopné viazať sa priamo na oblasť proteínu Mdm2 a inhibovať jeho onkogénnu aktivitu, - nukleové kyseliny kódujúce čiastočne alebo úplne peptidy alebo proteíny schopné oligomerizovať s jednou z oblastí Mdm2 a inhibovať jeho onkogénnu aktivitu, - nukleové kyseliny kódujúce intraceluláme protilátky namierené proti oblasti 1-134 sekvencie proteínu Mdm2 reprezentovanej SEQ ID NO: 1.
  13. 13. Použitie podľa nároku 12, vyznačujúce sa tým, že antimediátorová nukleová kyselina je DNA kódujúca komplementárnu RNA nukleovej kyseliny kódujúcej proteín Mdm2 a je schopná blokovať jeho traskripciu a/alebo jeho transláciu (antimediátorová RNA), alebo ribozým.
  14. 14. Použitie podľa jedného z nárokov 11 až 13, vyznačujúce sa tým, že nukleová kyselina je použitá vo forme komplexu s DEAE-dextránom, s nukleovými proteínmi alebo s lipidmi, alebo s katiónovými polymérmi vo forme lipozómov, alebo sama osebe.
  15. 15. Použitie podľa jedného z nárokov 11 až 13, vyznačujúce sa tým, že nukleová kyselina tvorí časť vektora.
  16. 16. Použitie podľa nároku 15, vyznačujúce sa tým, že nukleová kyselina tvorí časť vírusového vektora vybraného medzi adenovírusmi, retrovírusmi a adeno-asociovanými vírusmi.
  17. 17. Vírusový vektor obsahujúci sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej zlúčeninu schopnú aspoň čiastočne inhibovať onkogénnu aktivitu proteínu Mdm2.
  18. 18. Vírusový vektor podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že sekvencia nukleovej kyseliny kóduje scFv alebo peptid schopný interagovať na úrovni domény 1-134 (SEQ ID NO: 1) proteínu Mdm2.
  19. 19. Vírusový vektor podľa nároku 17 alebo 18, vyznačujúci sa tým, že je vybraný medzi adenovírusmi, retrovírusmi a adeno-asociovanými vírusmi.
  20. 20. Vírusový vektor podľa nárokov 17 až 19, v y z n a č u j ú c i sa tým, že ide o adenovírus alebo retrovírus.
  21. 21. Použitie nukleovej sekvencie kódujúcej intraceluláme protilátky namierené proti doméne 1-134 (SEQ ID NO: 1) proteínu Mdm2 na prípravu farmaceutickej kompozície určenej na liečenie rakovín.
SK280-98A 1995-09-04 1996-09-02 Antagonisty onkogénnej aktivity proteínu Mdm2 a ich použitie na liečenie rakovín SK287127B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9510331A FR2738151B1 (fr) 1995-09-04 1995-09-04 Antagonistes de l'activite oncogenique de la proteine mdm2, et leur utilisation dans le traitement des cancers
PCT/FR1996/001340 WO1997009343A2 (fr) 1995-09-04 1996-09-02 Antagonistes de l'activite oncogenique de la proteine mdm2, et leur utilisation dans le traitement des cancers

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK28098A3 SK28098A3 (en) 1998-08-05
SK287127B6 true SK287127B6 (sk) 2009-12-07

Family

ID=9482234

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK280-98A SK287127B6 (sk) 1995-09-04 1996-09-02 Antagonisty onkogénnej aktivity proteínu Mdm2 a ich použitie na liečenie rakovín

Country Status (20)

Country Link
US (4) US20030060432A1 (sk)
EP (1) EP0848720B1 (sk)
JP (2) JPH11511980A (sk)
KR (1) KR100592916B1 (sk)
AT (1) ATE257711T1 (sk)
AU (1) AU722782B2 (sk)
BR (1) BR9610386A (sk)
CA (1) CA2228667C (sk)
CZ (1) CZ298806B6 (sk)
DE (1) DE69631335T2 (sk)
DK (1) DK0848720T3 (sk)
ES (1) ES2210386T3 (sk)
FR (1) FR2738151B1 (sk)
HU (1) HU223597B1 (sk)
IL (1) IL123514A (sk)
NO (1) NO319160B1 (sk)
PT (1) PT848720E (sk)
SK (1) SK287127B6 (sk)
WO (1) WO1997009343A2 (sk)
ZA (1) ZA967451B (sk)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9620028D0 (en) 1996-09-26 1996-11-13 Ludwig Inst Cancer Res Factors which interact with oncoproteins
US6013786A (en) * 1997-08-22 2000-01-11 Hybridon, Inc. MDM2-specific antisense oligonucleotides
US6238921B1 (en) 1998-03-26 2001-05-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of human mdm2 expression
EP0947494A1 (en) * 1998-03-30 1999-10-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Derivatives of phenoxy acetic acid and phenoxymethyltetrazole having antitumor activity
GB9819860D0 (en) 1998-09-12 1998-11-04 Zeneca Ltd Chemical compounds
DE10109813A1 (de) * 2001-03-01 2002-09-12 Thomas Stanislawski Tumor-Peptidantigen aus humanem mdm2 Proto-Onkogen
EP2118123B1 (en) * 2007-01-31 2015-10-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Stabilized p53 peptides and uses thereof
WO2008121767A2 (en) 2007-03-28 2008-10-09 President And Fellows Of Harvard College Stitched polypeptides
US20090018078A1 (en) * 2007-07-09 2009-01-15 Vinod Labhasetwar Apoptosis-Modulating Protein Therapy for Proliferative Disorders and Nanoparticles Containing the Same
US20130149314A1 (en) 2010-02-09 2013-06-13 Jörn Bullerdiek p19Arf, HMGA2 and MDM2 For Use in the Diagnosis and Treatment of Aberrant Cell Growth
RU2615143C2 (ru) 2010-03-24 2017-04-04 Адвирна Самодоставляющие PHKi соединения уменьшенного размера
WO2012021876A2 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles
AU2012326026B2 (en) 2011-10-18 2017-04-13 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocyles
KR102112373B1 (ko) 2012-02-15 2020-05-18 에일러론 테라퓨틱스 인코포레이티드 펩티드모방체 마크로사이클
US8987414B2 (en) 2012-02-15 2015-03-24 Aileron Therapeutics, Inc. Triazole-crosslinked and thioether-crosslinked peptidomimetic macrocycles
SG11201503052RA (en) 2012-11-01 2015-05-28 Aileron Therapeutics Inc Disubstituted amino acids and methods of preparation and use thereof
US10934550B2 (en) 2013-12-02 2021-03-02 Phio Pharmaceuticals Corp. Immunotherapy of cancer
CA2947270A1 (en) * 2014-04-28 2015-11-05 Rxi Pharmaceuticals Corporation Methods for treating cancer using nucleic acids targeting mdm2 or mycn
WO2016049359A1 (en) 2014-09-24 2016-03-31 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles and uses thereof
CN107106642B (zh) 2014-09-24 2021-02-26 艾瑞朗医疗公司 拟肽大环化合物及其制剂
AU2016235424A1 (en) 2015-03-20 2017-10-05 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles and uses thereof
CN108368161A (zh) 2015-09-10 2018-08-03 艾瑞朗医疗公司 作为mcl-1调节剂的拟肽大环化合物
WO2017201449A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Genentech, Inc. Protac antibody conjugates and methods of use
WO2020159504A1 (en) * 2019-01-30 2020-08-06 Nomocan Pharmaceuticals Llc Antibodies to m(h)dm2/4 and their use in diagnosing and treating cancer
AU2018306436A1 (en) 2017-07-27 2020-02-13 Nomocan Pharmaceuticals Llc Antibodies to M(H)DM2/4 and their use in diagnosing and treating cancer
US11091522B2 (en) 2018-07-23 2021-08-17 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles and uses thereof
WO2023056069A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Angiex, Inc. Degrader-antibody conjugates and methods of using same

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5411860A (en) * 1992-04-07 1995-05-02 The Johns Hopkins University Amplification of human MDM2 gene in human tumors
DE69333202T2 (de) * 1992-06-26 2004-03-18 The Trustees Of Princeton University Verfahren zur erkennung von krebszellen oder ihren vorstadien mittels p90 und p53-antikörper oder p90 und p53-sonden
FR2706486B1 (fr) * 1993-06-16 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Séquences nucléiques, vecteurs les contenant, compositions pharmaceutiques et utilisations thérapeutiques.
US5770377A (en) * 1994-07-20 1998-06-23 University Of Dundee Interruption of binding of MDM2 and P53 protein and therapeutic application thereof

Also Published As

Publication number Publication date
FR2738151A1 (fr) 1997-03-07
NO980905L (no) 1998-03-02
MX9801407A (es) 1998-05-31
KR100592916B1 (ko) 2006-11-07
FR2738151B1 (fr) 1997-09-26
KR19990044356A (ko) 1999-06-25
PT848720E (pt) 2004-05-31
HU223597B1 (hu) 2004-10-28
HUP9900406A2 (hu) 1999-05-28
ZA967451B (en) 1997-03-10
US20140030319A1 (en) 2014-01-30
US20040209834A1 (en) 2004-10-21
SK28098A3 (en) 1998-08-05
ES2210386T3 (es) 2004-07-01
HUP9900406A3 (en) 2002-04-29
AU6933496A (en) 1997-03-27
WO1997009343A3 (fr) 1997-05-29
JPH11511980A (ja) 1999-10-19
DE69631335T2 (de) 2004-12-02
IL123514A (en) 2006-10-31
CZ63098A3 (cs) 1998-06-17
ATE257711T1 (de) 2004-01-15
NO319160B1 (no) 2005-06-27
US20030060432A1 (en) 2003-03-27
BR9610386A (pt) 1999-10-13
NO980905D0 (no) 1998-03-02
WO1997009343A2 (fr) 1997-03-13
EP0848720B1 (fr) 2004-01-14
CA2228667A1 (fr) 1997-03-13
DK0848720T3 (da) 2004-04-19
IL123514A0 (en) 1998-10-30
US20080311608A1 (en) 2008-12-18
CA2228667C (fr) 2013-06-04
CZ298806B6 (cs) 2008-02-06
JP2011225571A (ja) 2011-11-10
AU722782B2 (en) 2000-08-10
EP0848720A2 (fr) 1998-06-24
DE69631335D1 (de) 2004-02-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK287127B6 (sk) Antagonisty onkogénnej aktivity proteínu Mdm2 a ich použitie na liečenie rakovín
JPH11510378A (ja) 蛋白質ｐ５３の変異体及び治療への使用
SK131197A3 (en) Conditional expression system
US6852509B1 (en) Anti-P53 single-chain antibody fragments and their uses
KR19980701449A (ko) 과대증식성 질환의 병용 치료 방법(combined therapeutical treatment of hyperproliferative diseases)
AU718889B2 (en) deltaP62, its variants, nucleic acid sequences and their uses
MXPA98001407A (en) Antagonists of the oncogenic activity of the mdm2 protein, and its use in the treatment of the cance
MXPA97008877A (en) P62, its variants, the nucleic acid sequences that code them, and its use in anti-cancer gene therapy
MXPA97006928A (es) Sistema de expresion condicional

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20140902