NO319160B1

NO319160B1 - Anvendelse av forbindelser som kan antagonisere den oncogeniske aktivitet av proteinet mdm2, anvendelse av en nukleinsyre som koder for slike forbindelser, en viral vektor, et farmasoytisk preparat, samt anvendelse av en nukleinsyresekvens som koder for intracellulaere antistoffer.

Info

Publication number: NO319160B1
Application number: NO19980905A
Authority: NO
Inventors: Bruno Tocque; Marie Christin Dubs-Poterszman; Bohdan Wasylyk
Original assignee: Aventis Pharma Sa; Inst Nat Sante Rech Med
Priority date: 1995-09-04
Filing date: 1998-03-02
Publication date: 2005-06-27
Also published as: FR2738151A1; NO980905L; MX9801407A; KR100592916B1; FR2738151B1; KR19990044356A; PT848720E; HU223597B1; HUP9900406A2; ZA967451B; US20140030319A1; US20040209834A1; SK28098A3; SK287127B6; ES2210386T3; HUP9900406A3; AU6933496A; WO1997009343A3; JPH11511980A; DE69631335T2

Description

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelsen av en forbindelse som er i stand til å antagonisere i det minste partielt den oncogeniske aktivitet av proteinet mdm2.

Oppfinnelsen angår videre anvendelsen av en nukleinsyre som koder for en forbindelse som er i stand til å antagonisere den oncogeniske aktivitet av proteinet mdm2.

Oppfinnelsen angår videre en viral vektor som omfatter en nukleinsyresekvens som koder en forbindelse som beskrevet ovenfor og oppfinnelsen angår også et farmasøytisk preparat som omfatter en slik forbindelse.

Til slutt angår oppfinnelsen anvendelsen av en nukleinsyresekvens som koder for intracellulære antistoffer.

Det er fastslått at en stors andel av cancere i større eller mindre grad forårsakes av genetiske anomalier som gir seg utslag enten ved overeksprimering av et eller flere gener og/eller ekspresjon av et eller flere muterte eller anormale gener. For eksempel skaper ekspresjonen av oncogener en cancer i de fleste tilfeller. Med oncogen menes et gen som genetisk er påvirket og der ekspresjonsproduktet forstyrrer den naturlige, biologiske funksjon av cellen og derved initierer en neoplastisk tilstand. Et stort antall oncogener er til i dag identifisert og partielt karakterisert, særlig genene ras, mye, fos, erb, neu, raf, src, fins, jun og abl er muterte former som synes ansvarlige for en deregulering av den cellulære proliferering.

I en normal cellekontekst blir prolifereringen av disse oncogener sannsynligvis i det minste delvis motvirket ved generering av gener kalt tumor-suppressorer som p53 og Rb. Imidlertid kan visse fenomener vise seg å forstyrre denne cellulære autoregulerings-mekanisme og derved favorisere utviklingen av en neoplastisk tilstand. Et av disse eve-nementer ligger i mutasjoner på nivå med tumor-suppressorgenene. Dette er hvorfor den ved delesjon eller mutasjon muterte form av genet p53 er implisert i utviklingen av de fleste humane cancere (Baker et coil., "Science" 244 (1989) 217) og de inaktiverte former av genet Rb er påvist i forskjellige tumorer og særlig i retinoblastomer og i mésen-chymatale cancere som ostéosarcomer.

Proteinet p53 er et nukleært fosfoprotein på 53 kD som uttrykkes i de fleste normale vev. Proteinet er implisert i kontrollen av den cellulære cyklus (Mercer et al., "Critic Rev. Eucar, Gene Express", 2,251,1992), den transkripsjonene regulering (Fields et al., "Sciences" (1990) 249,1046), replikeringen av DNA (Wilcoq and Lane, (1991), "Nature 349", 4290 og Bargonnetti et al., (1992), "Cell 65" 1083) og induksjon av apoptose (Shaw et al., (1992), P.N.A.S. USA 89,4495). Enhver eksposisjon av celler til midler som for eksempel kan skade DNA, initierer en kaskade av cellulær signalering som munner ut i en post-transkripsjonell modifisering av proteinet p53 og en transkripsjonen aktivering ved p53 av et antall gener som gadd45 (growth arrest and DNA damage)

(Kastan et coil. "Cell" 71, 587-597,1992), p21 WAF/CIP (ElDeiry et coil., "Cancer Res." 54,1169-1174,1994) eller også mdm2 (mouse double minute) (Barak et coil., "EMBO J ", 12, 461-468,1993).

Av kjent teknikk skal det videre henvises til Ping Leng et al., "Internation Journal of Oncology", vol. 6, nr. 1, 1995, s. 251-259. Denne artikkel beskriver det funn at mdm2 binder TATA bindingsproteinet. Innledningen til dette dokument inneholder mange re-feranse til binding av mdm2 til p53. Det siste avsnitt i diskusjonen konkluderer med at det beskrevne arbeid antyder at mdm2 kan ha en rolle ved aktivering av en spesifikk promoter. Det sies intet om cancerbehandling. Heller intet om at mdm har andre aktivi-teter.

Det skal videre henvises til WO 93/20238 som er basert på oppdagelsen at forsterkning av mdm2-genet inntrer i humantumorer. Det beskrives en metode for å detektere cance-riøst vev ved å detektere det forsterkede mdm2-gen og det beskrives forbindelser som interfererer med bindingen mellom mdm2 og p53. Dokumentet sier imidlertid intet om de oncogeniske egenskaper hos mdm2 som ikke er mediert av p53.

Fra det foregående er det klart at en oppklaring av de forskjellige biologiske funksjoner for alle de implikerte proteiner, særlig i denne cellulære signaleringsvei, deres funk-sjonsmåter og deres karakteristika, er av vesentlig interesse for forståelsen av cancero-genesen og utarbeidelse av terapeutiske metoder som effektivt kan rettes mot cancer.

Foreliggende oppfinnelse hører hjemme i denne kontekst og angår en ny funksjon for proteinet mdm2.

Proteinet mdm2 er et fosfoprotein med en molekylvekt på 90 kD, uttrykt fra genet mdm2 (murine double minute 2). Dette gen mdm2 er til å begynne med klonet i en spontan tumoral celle BALB/c 3T3 og det er fastslått at dets overekspresjon øker den tumorale kraft sterkt (Cahilly-Snyder et coil. "Somat.Cell.Mol.Genet." 13,235-244, 1987; Fakharzadeh et al., "EMBO J." 10, 1565-1569, 1991). Det er identifisert et komp-leks mdm2/p53 i flere cellulære linjer som inneholder både vill-p53 og muterte p53 proteiner (Martinez et coil., "Genes Dev." 5, 151-159, 1991). Videre er det vist at mdm2 inhiberer den transkripsjonene aktivitet av p53 på en promoter som den til kreatine muskelkinase, noe som indikerer at mdm2 kan regulere aktiviteten av p53 (Momand et coil., "Cell", 69,1237-1245,1992; Oliner et coil., "Nature", 362, 857-860,1993).

Ut fra totaliteten av disse resultater har proteinet mdm2 således til i dag i det vesentlige vært erkjent som en modulator for aktivitetene av p53. Ved å kompleksdanne vill- eller muterte proteiner p53 inhiberer det deres transkripsjonene aktivitet og bidrar på denne måte til en deregulering av den cellulære proliferering. Som en konsekvens består en eksploatering på et terapeutisk plan av disse informasjoner i i det vesentlige å søke efter midler for å motvirke denne blokkering ved mdm2 av proteinet p53.

På uventet måte har man nu kunnet påvise at dette protein mdm2 har en egen onco-genisk karakter, det vil si totalt distinkt fra det som er assosiert med den komplekse form med proteinet p53. Mer spesielt utvikler proteinet mdm2 oncogeniske egenskaper i en null p53 kontekst. For å understøtte denne oppdagelse, nemlig at de oncogeniske egenskaper hos mdm2 er uavhengige av p53 og spesielt ikke er et resultat av inhibering av den transaktiverende aktivitet av vill-p53, har søker vist at en mutant av p53 (p53 (14-19); Lin et al., "Genes Dev.", 1994,8,1235-1246) som har bevart sine transaktiverende egenskaper men som ikke lenger interagerer med mdm2, ikke er i stand til å blokkere de oncogeniske egenskaper av mdm2. Det er likeledes vist at mdm2 og særlig domenet 1-134 av mdm2, er i stand til å deblokkere en cellulær cyklus-stans ved Gl indusert ved overeksprimering av pl07. Mdm2 viser seg således som en viktig regulator for faktorer som er implikert i den cellulære cykluskontroll, til forskjell fra p53.

Foreliggende resultater er delvist basert på påvisningen at proteinsekvensen 1-134 av sekvensen som er identifisert som SEQ ID nr. 1 av proteinet mdm2 er tilstrekkelig til å overføre det oncogeniske potensial til proteinet.

Den er likeledes et resultat av påvisningen av at det er mulig å påvirke denne oncogeniske karakter av proteinet mdm2 under anvendelse av forbindelser som er i stand til å interagere med det. Oppfinnelsen beskriver likeledes systemer som spesielt effektivt tillater avlevering in vitro, direkte i tumorene, av slike forbindelser og derved kjempe mot utviklingen av cancere. Oppfinnelsen tilbyr således en ny og spesielt effektiv tilnærming for behandling av tumorer, særlig i null p53 kontekst som cancere som kolon adeno-carcinomer, tyroid-cancere, lungecarcinomer, myeloide leukemier, colorektale cancere, nyrecancere, lungecancere, gastriske cancere, oesofage cancere, B-lymfomer, ovariecancere, blærecancere, glioblastomer og så videre.

En første gjenstand for oppfinnelsen er således anvendelsen av en forbindelse i stand til å antagonisere i det minste partielt den oncogeniske aktivitet av proteinet mdm2 for fremstilling av et farmasøytisk preparat ment for behandling av cancere ved null p53-kontekst, idet det anvendes en forbindelse i stand til å forbinde seg på nivå med domenet 1-134 av sekvensen av proteinet mdm2, representert ved SEQ ID nr. 1.

Innenfor oppfinnelsens ramme menes med cancer ved p53 null kontekst en cancer der p53 ikke er i stand til å utøve sine funksjoner som tumor-suppressor-gen på grunn av en hvilken som helst modifikasjon eller mekanisme annen enn fiksering av mdm2 på p53 idet denne fiksering forhindrer at p53 utøver sin rolle som tumor-suppressor og tillater celler å slippe unna en vekst regulert av p53. Man kan på ikke-begrensende måte blant slike modifikasjoner eller mekanismer som blokkerer tumorsuppressoraktiviteten av p53 for eksempel nevne genetiske endringer på p53 (punkt-mutasjoner, delesjoner og så videre, interaksjon med andre proteiner enn mdm2, meget hurtig proteolytisk nedbrytning av proteinet p53 i forbindelse med nærvær av proteinet E6 av høyrisiko human papil-lom-viruser som HPV-16 og HPV-18 og så videre.

Innenfor oppfinnelsens ramme kan inhiberingen av den oncogeniske aktivitet av proteinet mdm2 oppnås i henhold til to metoder.

Den oppnås fortrinnsvis ved intervenering direkte på nivå med domene 1-134 av denne. Derfor har ethvert protein som er i stand til å binde seg til dette domene en antagonistisk rolle på de oncogeniske egenskaper av mdm2.

Videre kan denne inhibitor-effekt likeledes oppnås via interaksjon av en forbindelse med et nabo-domene som for eksempel domenet 135-491 av mdm2, vist i sekvensen SEQ JD nr. 1 eller dens C-terminale sekvens vist i sekvensen SEQ ID nr. 1. Som et resultat tar oppfinnelsen sikte på anvendelsen av enhver forbindelse som, selv om den ikke interagerer direkte med dette domene, ikke desto mindre er i stand til å påvirke den oncogeniske karakter.

I henhold til en særlig utførelsesform tar foreliggende oppfinnelse sikte på anvendelsen av en forbindelse i stand til å binde seg til domenet 1-134 av sekvensen representert ved

SEQ ID nr. 1 av proteinet mdm2 med henblikk på å fremstille et farmasøytisk preparat ment for behandling av cancere ved null p53 kontekst.

Som forbindelse som er i stand til å interagere direkte med domenet 1-134 av proteinet mdm2 kan særlig nevnes ScFv'er spesifikt rettet mot dette området. ScFv'er er molekyler med bindingsegenskaper sammenlignbare med de til et antistoff og de er intra-cellulært aktive. Det dreier seg mer spesielt om molekyler bestående av et peptid tilsvarende bindingssete av det variable området av den lette kjede av et antistoff for-bundet via en peptidisk linker til et tilsvarende peptid på bindingssetet av det variable området av den tunge kjede av et antistoff. Det er av foreliggende søkere påvist at slike ScFv'er kan produseres in vivo ved overføring av genet (jfr. WO 94/29446).

Det kan likeledes dreie seg om peptider eller proteiner som allerede er kjent for sin ten-dens til spesifikt å binde seg med domenet 1-134 av mdm2 som for eksempel hele eller en del av bindingsdomenet av proteinet p53 med SEQ ID nr. 1 og mer spesielt hele eller en del av peptidene 1-52,1-41 og 6-41 av sekvensen av p53 som er vist som SEQ ID nr. 2 (Oliner et al., "Nature", 1993,362, 857-860) eller ganske enkelt hele eller en del av peptidet 16-25 som nylig er kartografert (Lane et al., "Phil. Trans. R. Soc. London B.", 1995, 347, 83-87), eller også peptidene 18-23 av human eller murin p53, eller også av-ledede peptider nær de tidligere nevnte der kritiske rester for interaksjon med mdm2 er bevart (Picksley et al. "Oncogene", 1994, 9,2523-2529).

Ifølge oppfinnelsen kan man likeledes anvende forbindelser som binder seg til domener som er naboer til domene 1 til 134 av mdm2 som vist ved SEQ ID nr. 1 og som fra denne binding påvirker den oncogeniske aktivitet av proteinet mdm2.1 denne forbindelse kan man nevne de som interagerer på nivå med det terminale C domenet av proteinet som for eksempel de transkripsjonene faktorer TFIL TBP, og TaF250 samt proteinene som interagerer på nivå med domenet 135-491 av mdm2 som vist i SEQ ID nr. 1 som for eksempel proteinene L5 (ribosomalt protein) og Rb (retinoblastom protein) og den transkripsjonene faktor E2F (regulert av Rb).

En annen gjenstand for oppfinnelsen er anvendelsen av ScFv rettet spesifikt mot domenet 1-134 av sekvensen SEQ ID nr. 1 av proteinet mdm2 med henblikk på fremstilling av et farmasøytisk preparat ment for behandling av cancere.

Innenfor oppfinnelsens ramme er det tatt sikte på at helheten av interaksjoner som angitt ovenfor på konsekvent måte påvirker den oncogeniske karakter av mdm2. Videre kan disse proteiner anvendes, helt eller delvis, dithen der man anvender deres aktive del vis-å-vis et av bindingsdomenene med proteinet mdm2 og der denne interaksjon fører til en påvirkning av denne sistnevnte oncogeniske karakter.

Innenfor rammen av oppfinnelsen kan disse forbindelser benyttes som sådanne eller fortrinnsvis i form av genetiske konstruksjoner som tillater deres ekspresjon in vivo.

En spesielt fordelaktig utførelsesform av oppfinnelsen ligger i å anvende en nuklein-sekvens som koder for en forbindelse som er i stand til i det minste partielt å antagonisere den oncogeniske aktivitet av proteinet mdm2 for fremstilling av et farmasøytisk preparat ment for behandling av cancere ved null p53 kontekst.

Som nevnt innledningsvis angår oppfinnelsen også anvendelse av en nukleinsyre som koder for en forbindelse i stand til å antagonisere den oncogeniske aktivitet av proteinet mdm2 for fremstilling av et farmasøytisk preparat ment for behandling av cancere ved null p53-kontekst, idet det anvendes

anti-retningsnukleinsyrer,

oligonukleotid-ligander i stand til fiksering direkte til et av domenene av proteinet mdm2 og å inhibere dets oncogeniske aktivitet,

nukleinsyrer som koder helt eller delvis for peptider eller proteiner i stand til oligomerisering med et av domenene av mdm2 og i stand til å inhibere dets

oncogeniske aktivitet,

nukleinsyrer som koder for intracellulære antistoffer rettet mot domenet 1-134

av sekvensen av proteinet mdm2 representert ved SEQ ID No. 1.

I henhold til en særlig foretrukken utførelsesform er nukleinsyren en anti-retningsnukleinsyre. Denne anti-retning er en DNA som koder for en RNA som er komplementær til nukleinsyren som koder for proteinet mdm2 og i stand til å blokkere dennes transkripsjon og/eller traduksjon (anti-retnings-RNA) eller et ribosym.

Nylig er en ny type nukleinsyre påvist som er i stand til å regulere ekspresjonen av mål-cellen. Disse nukleinsyrer hybriderer ikke med cellulær mRNA men direkte med det genomiske DNA i dobbeltstreng. Denne nye tilnærming er basert på påvisningen av at visse nukleinsyrer er i stand til spesifikt å interagere i den store furen av dobbeltskrue-DNA for lokalt å danne trippel-helikser, noe som fører til en inhibering av transkripsjonen av målgenene. Disse nukleinsyrer gjenkjenner selektivt dobbeltskinen av DNA på nivå med sekvensene oligopurin.oligopyrimidin, det vil si på nivå med regionene som har en oligopurin sekvens på en streng og en oligopyrimidinsekvens på den komp-lementære streng, og der lokalt danner en trippelheliks. Basene i den tredje streng (oli-gonukleotidet) danner hydrogenbindinger (Hoogsteen-bindinger eller inverse Hoogsten-bindinger) med purinene i Watson-Crick-base-parene. Slike nukleinsyrer er særlig beskrevet av Pr. Héléne i "Anti-Cancer drug design" 6 (1991) 569.

Anti-retningsnukleinsyrene ifølge oppfinnelsen kan være DNA-sekvenser som koder for anti-retnings-RNA eller for ribosymer. De således fremstilte anti-retnings-RNA'er kan interagere med en mål-mRNA eller en genomisk mål-DNA og med denne danne dobbelt- eller trippel-helikser. Det kan likeledes dreie seg om anti-retningssekvenser (oligonukleotider), eventuelt kjemisk modifisert, i stand til å interagere direkte med genet eller mål-RNA'en.

Også i henhold til en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen er nukleinsyren et anti-retning oligonukleotid som definert ovenfor, eventuelt kjemisk modifisert. Det kan særlig dreie seg om oligonukleotider hvis fosfodiesterskjelett er modifisert kjemisk som for eksempel oligonukleotidene fosfonater, fosfotriestere, fosforamidater og fosfor-tioater som for eksempel er beskrevet i WO 94/08003. Det kan likeledes dreie seg om a-oligonukleotider eller om oligonukleotider som er konjugert til midler som akryle-ringsforbindelser.

Innenfor rammen av oppfinnelsen mener man med en oligonukleotid-ligand et oligo-ribonukleotid eller et oligo-deoksy-ribonukleotid som er i stand til spesifikk fiksering til proteinet mdm2 for å inhibere dennes oncogeniske funksjon. Slike nukleotider kan for eksempel påvises ved "in vitro utviklings"-teknikker som for eksempel SELEX-teknikken (Edgington, Bio/technology, 1992,10,137-140; US 5,270,163 og WO 91/19813).

Mer generelt kan disse nukleinsyrer være av human, animalsk, vegetabilsk, bakteriell, viral, syntetisk opprinnelse og så videre. De kan oppnås på en hvilken som helst kjent måte og særlig ved avsøking av banker, ved kjemisk syntese eller også ved blandede metoder som inkluderer kjemisk eller enzymatisk modifikasjon av sekvenser som er oppnådd ved avsøking av banker.

Som nevnt ovenfor kan de videre innarbeides i vektorer som plasmidiske, virale eller kjemiske vektorer. De kan likeledes administreres som sådanne, i form av naken DNA i henhold til den teknikk som er beskrevet i WO 90/11092 eller i kompleksdannet form, for eksempel med DEAE-dekstran (Pagano et al, "J. Virol." 1 (1967) 891), med nukleære proteiner (Kaneda et al., "Science" 243 (1989) 375), med lipider eller kationiske polymerer (Felgner et al., "PNAS" 84, (1987) 7413), eller i form av liposomer (Fraley et al., "J.Biol.Chem.", 255 (1980) 10431), og så videre.

Fortrinnsvis utgjør sekvensen som benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen en del av en vektor. Anvendelsen av en slik vektor tillater å forbedre administreringen av nukleinsyren til celler som skal behandles og også å øke stabiliteten i cellene, noe som tillater å oppnå en varig terapeutisk effekt. Videre er det mulig å innføre flere nukleinsyre-sekvenser i en og samme vektor, noe som også øker behandlingens effektivitet.

Vektorer som kan benyttes kan være av diverse opprinnelser forutsatt at den er i stand til å transformere de animalske celler, fortrinnsvis humane cancerøse celler. I en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen benyttes det en viral vektor som kan velges blant adénoviruser, retroviruser, adénoassocierte viruser (AAV) eller herpes-virus.

I denne forbindelse angår oppfinnelsen, som også nevnt innledningsvis, en viral vektor som karakteriseres ved at den omfatter en nukleinsyresekvens som koder for en forbindelse i stand til i det minste partielt å inhibere den oncogeniske aktivitet av proteinet mdm2 ved null p53 kontekst, idet nukleinsyresekvensen koder for en scFV eller et peptid i stand til å interagere på nivå med domenet 1-134 (SEQ ID nr. 1) av proteinet mdm2.

Mer spesielt angår oppfinnelsen en hvilken som helst rekombinant virus som omfatter en nukleinsyre-sekvens som koder for en forbindelse som er i stand til å binde seg til proteinet mdm2 på en måte som påvirker dettes oncogeniske potensial. I denne kontekst kan nukleinsure-sekvensen kode for et av de ovenfor identifiserte peptider, proteiner eller transkripsjonene faktorer.

Mer spesielt koder denne nukleinsyresekvens for en ScFv eller et peptid som er i stand til å interagere på nivå med domenet 1-134 (SEQ ID nr. 1) av proteinet mdm2.

Fortrinnsvis er virusene som benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen preferensielt defektive, det vil si at de ikke er i stand til replikering på autonom måte i den infiserte celle. Generelt er således genomet av de defektive viruser som benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen berøvet for i det minste de sekvenser som er nødvendige for replikering av virusen i den infiserte celle. Disse regioner kan enten elimineres (helt eller delvis), gjøres ikke-funksjonelle eller erstattes med andre sekvenser og særlig med sekvensen som koder for forbindelsen som spiller en antagonist-rolle når det gjelder de oncogeniske egenskaper for proteinet mdm2. Fortrinnsvis bevarer imidlertid de defektive viruser sekvensene i sitt genom som er nødvendige for enkapsidering av de virale partikler.

Når det særlig dreier seg om adénoviruser er forskjellige sérotyper der strukturen og egenskapene varierer noe, karakterisert. Blant disse sérotyper foretrekker man innenfor rammen av oppfinnelsen å benytte de humane adénoviruser av type 2 eller 5 (Ad 2 eller Ad 5) eller adénoviruser av animalsk opprinnelse (se FR 93 05954). Blant adénoviruser av animalsk opprinnelse som kan benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen kan man særlig nevne adénoviruser av canin, bovin, murin (eksempel Mavl, Beard et al., "Viro-logy" 75 (1990) 81), ovin, porcin, aviair eller også simienne (eksempel: SAV) opprinnelse. Fortrinnsvis er adénovirusen av animalsk opprinnelse en canin adénovirus og aller helst en CAV2-adénovirus [for eksempel stamma manhattan eller A26/61 (ATCC VR-800)]. Fortrinnsvis benytter man adénoviruser av human eller canin eller blandet opprinnelse innenfor rammen av oppfinnelsen.

Fortrinnsvis omfatter de defektive adénoviruser ifølge oppfinnelsen rTR</>ene, en sekvens som tillater enkapsidering og sekvensen som koder for modulatoren for calpainene. Aller helst er, i genomet av adénovirusene ifølge oppfinnelsen, genet El og minst et av genene E2, E4, L1-L5, ikke funksjonelle. Det angjeldende virale gen kan gjøres ikke-funksjonelt på en hvilken som helst kjent måte og særlig ved total suppresjon, substitu-sjon, partiell delesjon eller addisjon av en eller flere baser i det eller de angjeldende gener. Slike modifikasjoner kan oppnås in vitro (på den isolerte DNA) eller in situ, for eksempel ved genetiske teknikker, eller også ved behandling med mutagene midler.

De rekombinante, defektive adénoviruser ifølge oppfinnelsen kan fremstilles på en hvilken som helst kjent måte (Levero et al., "Gene" 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, "EMBO J." 3 (1984) 2917). Særlig kan de fremstilles ved homologer i rekombinasjon mellom en adénovirus og et plasmid som blant annet bærer DNA-sekvensen som koder for inhibitoren av ETS. Den homologe rekombinasjon skjer efter ko-transfeksjon av adénovirusen og plasmidet i en egnet cellelinje. Cellelinjen som benyttes må fortrinnsvis (i) være transformerbar av elementene og (ii) omfatte sekvensene som er i stand til å komplettere delen av genomet av den defektive adénovirus, fortrinnsvis i integrert form for å unngå risiki for rekombinasjon. Som eksempel på linje kan nevnes den humane embryonyrelinje 293 (Graham et al., "J.Gen.Virol." 36 (1977) 59) som særlig, integrert i sitt genom, inneholder den venstre del av genomet av en adénovirus Ad 5 (12 %). Konstruksjonsstrategier for vektorer avledet fra adénoviruser er også beskrevet i FR 93 05954 og FR 93 08596.

Til slutt blir de multiplerte adénoviruser gjenvunnet og renset i henhold til klassiske teknikker i molekylærbiologien, som vist i eksemplene.

Når det gjelder de adénoassosierte viruser, AAV, dreier det seg om en virus med en DNA med relativt redusert størrelse som integrerer seg i genomet av cellene den infiserer på stabil og setespesifikk måte. De er i stand til å infisere et stort spektrum av celler uten å indusere noen virkning på cellulær vekst, morfologi eller differensiering. Heller ikke synes de implikert i patologier hos mennesker. Genomet av AAV(ene) er klonet, sekvensert og karakterisert. Den omfatter ca. 4700 baser og inneholder ved hver ende en invers, repetert region, ITR, på ca. 145 baser, som tjener som replikasjonsopprinnelse for virusen. Resten av genomet er delt i to regioner som i det vesentlige omfatter enkap-sideringsfunksj onene, den venstre del av genomet som inneholder genet rep som er implikert i den virale replikasjon og ekspresjonen av virale gener, den høyre del av genomet som inneholder genet cap som koder for vimsens kapsidproteiner.

Anvendelsen av vektorer som er avledet fra AAV for overføring av gener in vitro og in vivo er beskrevet i litteraturen (se særlig WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, EP 488 528). Disse søknader beskriver forskjellige konstruksjoner avledet fra AAVer der genene rep og/eller cap er deletert og erstattet med et gen av interesse, samt deres anvendelse for overføring in vitro (på celler i kultur) eller in vivo (direkte i en orga-nisme) av genet av interesse. De defektive, rekombinante AAVer ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved ko-transfeksjon i en cellelinje infisert med en human hjelpe virus (for eksempel en adénovirus), et plasmid som inneholder sekvensen som koder for ETS-inhibitoren kantet av to inverse, repeterte regioner (ITR) av AAV, og et plasmid som bærer enkapsideirngsgenene (genene rep og cap) av AAV. De rekombinante AAVer som fremstilles blir derefter renset ved klassiske teknikker.

Når det gjelder herpesvirusene og retrovirusene er konstruksjonen av rekombinante vektorer beskrevet i litteraturen i utstrakt grad og det skal særlig henvises til Breakfield et al., "New Biologist" 3 (1991) 203; EP 453.242, EP 178.220, og til Bernstein et al., "Genet. Eng.", 7 (1985) 235, McCormick, BioTechnology 3 (1985), 689, og så videre. Særlig er retrovirusene integrative viruser som selektivt infiserer celler under deling. De utgjør således vektorer av interesse for cancer-applikasjoner. Genomet av retrovirusene omfatter i det vesentlige to LTR, en enkapsideringssekvens og tre kodende regioner

(gag, pol og env). I de rekombinante vektorer som er avledet fra retrovirusene er genene gag, pol og env generelt deletert, helt eller delvis, og erstattet med en heterolog nukleinsyresekvens av interesse. Disse vektorer kan realiseres fra forskjellige typer retroviruser som særlig MoMuLv ("murine moloney leukemia virus"; også kalt MoMLV), MSV ("murine moloney sarcoma virus"), HaSV ("harvey sarcoma virus"); SNV ("spleen necrosis virus"); RSV ("rous sarcoma virus") eller også Friends-virus.

For å konstruere rekombinante retroviruser som omfatter en sekvens av interesse blir det generelt konstruert et plasmid som omfatter særlig LTR'ene, enkapsideringssekvensen og sekvensen av interesse, og brukes så for å transfektere en cellelinje, kalt enkapsidering, i stand til i trans å tilveiebringe de defektive, retrovirale funksjoner i plasmidet. Generelt er enkapsideringslinjene således i stand til å uttrykke genene gag, pol og env. Slike enkapsideringslinjer er beskrevet i den kjente teknikk og særlig linjen PAI 37 (US 4,861,719); linjen PsiCRJJ? (WO 90/02806) og linjen GP+envAm-12 (WO 89/07150). Videre kan de rekombinante retroviruser omfatte modifikasjoner på nivå med LTR'ene for å supprimere transkripsjonen aktivitet samt de ventede enkapsideringssekvenser som omfatter en del av genet gag (Bender et al., "J. Virol." 61 (1987) 1639). De fremstilte, rekombinante retroviruser blir derefter renset ved klassiske teknikker.

Fortrinnsvis er, i vektorene ifølge oppfinnelsen, sekvensen som koder for forbindelsen som har antagonist-egenskapene på den oncogeniske karakter av mdm2, anbragt under kontroll av signaler som tillater dets ekspresjon i de tumorale celler. Fortrinnsvis dreier det seg om heterologe ekspresjonssignaler, det vil si signaler som er forskjellige fra de som naturlig er ansvarlig for ekspresjonen av inhibitoren. Det kan særlig dreie seg om sekvenser som er ansvarlige for ekspresjonen av andre proteiner, eller syntetiske sekvenser. Særlig kan det dreie seg om promoter-sekvenser for eucaryotiske eller virale gener. For eksempel kan det dreie seg om promoter-sekvenser som stammer fra genomet av cellen man ønsker å infisere. På samme måte kan det dreie seg om promoter-sekvenser som stammer fra genomet av en virus og derunder den benyttede virus. I denne forbindelse kan man for eksempel nevne promoteren EIA, MLP, CMV, LTR-RSV, og så videre. Videre kan ekspresjonssekvensene modifiseres ved addisjon av sekvenser for aktivering, regulering eller tillate en vev-spesifikk ekspresjon. Det kan således være av særlig interesse å benytte ekspresjonssignaler som spesifikt eller overveiende er aktive i tumorale celler slik at DNA-sekvensen ikke uttrykkes og ikke utøver sin virkning annet enn når virusen effektivt har infisert en tumoral celle.

I en spesielt foretrukken utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse en defektiv, rekombinant virus omfattende en cDNA-sekvens som koder for en forbindelse som har antagonist-egenskaper på den oncogene karakter av mdm2 under kontroll av en viral promoter, fortrinnsvis valgt blant LTR-RSV og CMV-promoteren.

Også på foretrukken måte angår oppfinnelsen en defektiv, rekombinant virus omfattende en DNA-sekvens som koder for en forbindelse som har antagonist-egenskaper på den oncogeniske karakter av mdm2 under kontroll av en promoter som tillater en majoritær ekspresjon i de tumorale celler.

Ekspresjonen anses som majoritær innenfor oppfinnelsens ramme når, selv om en rest-ekspresjon observeres i andre typer celler, ekspresjonsnivået er overlegent i de tumorale celler.

Foreliggende oppfinnelse angår som nevnt også anvendelsen av en nukleinsyresekvens som koder for intracellulære antistoffer, rettet mot domenet 1-134 (SEQ DD No. 1), av proteinet mdm2 for fremstilling av et farmasøytisk preparat ment for behandling av cancer.

Til slutt angår oppfinnelsen et farmasøytisk preparat som karakteriseres ved at det omfatter en forbindelse i stand til å inhibere den oncogeniske aktivitet av proteinet mdm2 som angitt i et av kravene 1 til 10 ved null p53 kontekst, idet nukleinsyre-sekvensen koder for en scFV eller et peptid i stand til å interagere på nivå med domenet 1-134 (SEQ JD No. 1) av proteinet mdm2.

I henhold til en særlig utførelsesform av oppfinnelsen omfatter dette preparatet en eller flere defektive, rekombinante adénoviruser som beskrevet ovenfor. Disse farmasøytiske preparater kan formuleres med henblikk på administrering ad topisk, oral, parenteral, intranasal, intravenøs, intramuskulær, subkutan, intraokkulær eller transdermal vei og så videre. Fortrinnsvis inneholder de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen en far-masøytisk akseptabel bærer for en injiserbar formulering, særlig for injeksjon direkte i pasientens tumor. Det kan særlig dreie seg om sterile, isotoniske oppløsninger eller tør-kede preparater og særlig lyofiliserte som, ved tilsetning av sterilisert vann eller fysiolo-giske serum, tillater konstituering av oppløste, injiserbare stoffer. Injeksjoner rettet mot pasientens tumor er fordelaktig da dette tillater å konsentrere den terapeutiske virkning på nivå med de påvirkede vev.

Dosene av defektive, rekombinante viruser som benyttes for injeksjon kan tilpasses som funksjon av forskjellige parametre og særlig som funksjon av den virale vektor, den benyttede administreringmåte, den angjeldende patologi eller også den tilsiktede behand-lingsvarighet. Rent generelt formuleres og administreres de rekombinante adénoviruser ifølge oppfinnelsen i form av doser som ligger mellom IO<4> og IO<14> pfu/ml og fortrinnsvis IO<6> til IO10 pfu/ml der uttrykket pfu eller "plaque forming unit" tilsvarer infeksjons-kraften til en virus-oppløsning og bestemmes ved infeksjon av en egnet cellulær kultur og måling, generelt efter 28 timer, av antallet infiserte cellepopulasjoner. Teknikkene for bestemmelse av pfu-titeren for en viral oppløsning er godt dokumentert i litteraturen. Når det gjelder retroviruser kan preparatene ifølge oppfinnelsen direkte omfatte produk-sjonscellene med henblikk på deres implantering.

De farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen er særlig fordelaktige for å nøytralisere den oncogeniske aktivitet av mdm2-proteinene og for å modulere prolifereringen av visse celletyper.

Særlig er disse farmasøytiske preparater hensiktsmessig for behandling av cancere som har en null p53 som for eksempel de følgende cancere: colon-adénocarcinomer, thyroid-cancere, lungecancere, myeloide leukemier, colorektale cancere, nyrecancere, lungecancere, gastriske cancere, oesofage cancere, B-lymfomer, ovariecancere, blærecancere, glioblastomer og så videre.

Foreliggende oppfinnelse anvendes fortrinnsvis in vivo for destruering av celler under hyper-proliferering (det vil si anormal proliferering). Den er også i stand til å destruere tumorale celler eller glattmuskelceller i den vaskulære vegg (restenose). Andre fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå av et studium av de følgende, illustrerende eksempler under samtidig henvisning til figurene der:

Figur 1: viser proteinene mdm2 A til F,

Figur 2: viser transfeksjonsgrafen for Saos-2-celler med plasmider som uttrykker

forskjellige mdm2-proteiner,

Figur 3: skjematisk viser inhibering av de transformante egenskaper av mdm2 ved

forskjellige p53,

Figur 4: viser virkningen av en overekspresjon av mdm2 på cellecyklusen, og Figur 5: viser virkningen av en overekspresjon av mdm2 på cellecyklusen.

Generelle teknikker innen molekylærbiologien

De klassiske metoder som benyttes innen molekylærbiologien som preparativ ekstrak-sjon av plasmidisk DNA, sentrifugering av plasmidisk DNA i cesiumklorid-gradient, elektroforese på agarose- eller akrylamidgel, rensing av DNA-fragmenter ved elektro-eluering, ekstrahering av proteiner med fenol eller fenol-kloroform, presipitering av DNA i saltoppløsningsmedium med etanol eller isopropanol, transformering i Escheri-chia coli, og så videre, er alle velkjente for fagmannen og rikelig beskrevet i litteraturen [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al., (eds.), "Current Proto-cols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987],

For ligaturene kan DNA-fragmentene separeres i henhold til størrelse ved elektroforese på agarose- eller akrylamidgel, ekstraheres med fenol eller med en fenohkloroform, pre-sipiteres med etanol og derefter inkuberes i nærvær av DNA-ligase av fagen T4 (Biolabs) i henhold til leverandørens anbefalinger.

Oppfyllingen av de proeminente 5'-ender kan gjennomføres med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I av E.coli (Biolabs) i henhold til leverandørens spesifikasjoner. Dest-rueringen av de proeminente 3'-ender gjennomføres i nærvær av DNA-polymerase av fagen T4 (Biolabs), benyttet i henhold til fabrikantens anbefalinger. Destruksjonen av de proeminente 5'-ender gjennomføres ved en behandling gjennomført med nukleasen Sl.

Den styrte mutagenese in vitro med syntetiske oligodeoksynukleotider kan gjennom-føres i henhold til den metode som er utviklet av Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13

(1985) 8749-8764] under anvendelse av den kit som markedsføres av Amersham.

Den enzymatiske forsterkning av DNA-fragmentene ved PCR-teknikken ["Polymérase-catalyzed Chain Reaction", Saiki R.K. et al., "Science" 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., "Meth.Enzym." 155 (1987) 335-350] kan gjennomføres under anvendelse av en "DNA thermal cycler" (Perkin Eimer Cetus) i henhold til fabrik-kantens spesifikasjoner. Forsterkningen av genomisk DNA gjennomføres mer spesielt under de følgende betingelser: 5 minutter ved 100°C, 30 cykler med 1 minutt ved 95°C, 2 minutter ved 58°C og derefter 3 minutter ved 72°C ved hjelp av egnede sonder. For-sterkningsproduktene analyseres ved elektroforese på gel.

Verifiseringen av nukleotidsekvensene kan gjennomføres ved den metode som er utviklet av Sanger et al. ["Proc.Natl.Acad.Sci." USA, 74 (1977) 5463-5467] under anvendelse av den kit som markedsføres av Amersham.

Materialer og metoder:

1. Benytter konstruksjon:

Plasmidet pBKCMV markedsføres av Stratagéne og inneholder neomycin

resistens-genet.

Plasmidene pC53ClN3 og p53-4.2. N3 som respektivt koder for vill-p53 og for p53 R273H stammer fra A. Levine (Hinds et al., "Cell Growth and Diff." (1990), 1,571).

Plasmidet pBKp53 (R273H) inneholder det humane minigen p53. Det oppnås fra

pC53-4.2. N3.

Plasmidet pBKMdm2 oppnås ved kloning i pBKCMV av en kodende kassett bestående av den ikke traduserte region av enden av sekvensen som koder for fi-globulin fulgt av sekvensen som koder for mdm2.

Plasmidet pGKhygro uttrykker hygromycinresistens-genet (Nature (1990) 348,

649-651).

Plasmidet pCMVNeoBam tillater ekspresjon av neomycin-resistens-genet

(Hinds et al. (1990) "Cell. Growth and Diff., 1,571-580).

Plasmidene pCMVpl07 og pCMVCD20 tillater ekspresjon av proteinet pl07 og overflatemarkøren CD20 (Zhu et al. (1993) "Genes and Development", 7,1111-1125).

Plasmidene pCMVE2F-4 og pCMVE2F-5 tillater ekspresjon av proteinet E2F-4

og E2F-5 (Sardet et al. (1995) "Proc.Natl.Acad.Sc", 92, 2403-2407).

Plasmidene pLexA, pLexA (6-41), pLexA (16-25) tillater ekspresjon av fikse-ringsomenet til DNA av LexA (aminosyrene 1 til 87), fri eller fusjonert i fase med p53 (6-41) eller p53 (16-25). pLexA (6-41) og pLexA (16-25) oppnås fra plasmidet pLexApolyU, konstruert ved LGME (Strasbourg).

De eucaryotiske ekspresjonsplasmider av pl07: pl07 (385-1068), pl07 (1-781)

og pl07 (781-1068) (Zhu et al., "EMBO J." 14 (1995) 1904),

Plasmidet pSGKlHApl07 tillater ekspresjon in vitro og in vivo av pl07. pl07 er i konteksten av en Kozak-sekvens og epitopen HA uttrykkes ved fusjon til den C-terminale ende av pl07.

Plasmidene pBC-MDM2 pg pBC-MDM2 (1-134) oppnås ved kloning av MDM2

og MDM2 (1-134) i pBC (Chatton et al., Biotechniques 18 (1995) 142).

Plasmidene pGex-MDM2 og pGex-MDM2 (1-177) oppnås ved kloning av

MDM2 og MDM2 (1-177) i pGex.

2. Metode:

Ekspresjonen av p53 bestemmes ved Western Blotting på den totale celle-ekstrakt ved hjelp av et monoklonalt antistoff DO 1.

Ekspresjonen av mRNA som koder for proteinet mdm2 bedømmes ved semi-kvantitativ

RT-PCR.

Fraværet av kontaminering av DNA verifiseres ved PCR.

Eksempel 1: Påvisning av de transformante egenskaper av rodm2.

Saos-2-celler transfekteres med enten et plasmid pBKMDM2, et sammenligningsplasmid pBKp53 (R273H) eller et sammenligningsplasmid med negativ p53 pBKCMV, og seleksjoneres så for resistens mot Geniticin 418 (G418).

I en første prøve blir klonene seleksjonert individuelt og propagert mens, i to andre prø-ver, ikke isolerte kloner bringes i kultur i et bløtt agar-medium.

For dette formål blir 10<4> celler spredt ut i duplikata i 0,375 % bløt agar. Efter 24 timer bestemmer man det totale antall kolonier med mer enn 50 celler samt antall celler pr. koloni (koloni-størrelse). Hver gitte verdi tilsvarer et gjennomsnitt av 4 forsøk gjennom-ført dobbelt. De oppnådde resultater er vist i tabell I. Klonene i forsøk nr. 1 tilsvarende mdm2 er identifisert under Ml til M6, de av p53 (R273H) under p53-l til p53-6 og sammenligningsprøvene under Col til Co5.

Som ventet uttrykker Col og Co4 ikke transfektert mdm2 og Co 1-3 proteinet p53.

Eksempel 2: Det N- terminale området av mdm2 ( 1- 134) SEQ ID nr. 1 er nødvendig og tilstrekkelig for å stimulere vekst på mvk- agar av Saos- 2- celler.

Saos-2-celler transfekteres med enten plasmidene pBKCMV som uttrykker samtidig neo-resistens og proteinene mdm2 fra A til F som beskrevet i figur 1, eller et tomt sammenligningsplasmid pBKCMV og derefter seleksjonert for motstand mot G418. De overlevende celler regrupperes, forsterkes og testes på dannelse av kolonier på bløt agar. Resultatene i figur 2 uttrykkes i antall kloner som dannes på myk-agar i forhold til de med total mdm2 (A). Disse resultater stammer fra to representative, uavhengige trans-feksjonsforsøk der mellom 3 og 7 ansamlinger av forskjellige celler er testet, i henhold til konstruksjonen. Det viser seg klart at det N-terminale domenet av mdm2 har oncogeniske egenskaper. Den mest effektive konstruksjon tilsvarer det totale protein.

Eksempel 3: Reversjon av de oncogeniske egenskaper av mdm2 med vill- pS3. mutanter av p53 og fragmenter av p53

En lot av Saos-2-celIer, transformert med mdm2, ko-transfekteres med plasmidet pGKhygro ogpC53ClN3 (p53) pC53-4.2N3 p53 (R(273)H, p53 (1-52), pLexA (6-41), pLexA (16-25), pLexA, p53(L14Q,F19S), p53 (L22Q,W23S), eller pCMVNeoBam, og seleksjoneres så for hygromycinresistens i nærvær av G418.100 000 celler som stammer fra 3 til 5 uavhengige forråd av resistente celler spres i duplikat ut på bløt agar (0,375 %). Efter 25 dagers dyrking blir koloniene som inneholder minst 50 celler tellet. Figur 3 viser resultatene av et representativt forsøk og gir en skjematisk presentasjon av de forskjellige p53 som er testet for å inhibere de transformate egenskaper hos mdm2.

Det kan leses fra disse forsøk at kun konstruksjonene som tillater ekspresjon av proteiner som er i stand til å binde seg til proteinet mdm2 i nærvær av p53, p53 R273H, p53 (1-52), LexA (6-41), LexA (16-25) inhiberer de oncogeniske egenskaper hos mdm2. På den annen side har dobbeltmutantene der det er vist at de har mistet sin evne til binding til mdm2 (Lin et al., "Gene Dev.", 1994, 8,1235-1246), ingen inhibitor-virkning. Det faktum at mutanten p53 (14-19) som har bevart de transaktiverende egenskaper av vill-p53 ikke inhiberer transformasjon med mdm2 bekrefter at de oncogeniske egenskaper av mdm2 er uavhengige av inhiberingen av mdm2 av de transaktiverende egenskaper av p53.

Eksempel 4: mdm2 inhiberer blokkeringen av Gl i cellecyklusen indusert av pl07 i Saos- 2- celler.

Saos-2-celler kotransfekteres med tre typer plasmider, (i) et plasmid for ekspresjon av CD-20 (pCMVCD20,2 ug, koder for den cellulære overflatemarkør CD-20), (ii) et eks-presjonsplasmid (9 ug) av typen CMV (cyto-megaloviruspromoter) uten kodende sekvens eller som koder for mdm2 (PBKCMVMdm2), for området 1-134 av mdm2 (PBKCMVMdm2( 1-134)), E2F-4 eller E2F-5 (pCMVE2F-4, pCMVE2F-5), og (iii) en ekspresjonsvektor av pl07 (pCMVpl07,9 ug). Cellene behandles derefter for analyse ved FACScan som beskrevet av Zhu et al., i "Gene Dev.", 1993, 7,1111-1125). Resultatene for et representativt forsøk er vist i figur 4. Det viser klart at i fravær av over-eksprimert pl07 har ekspresjonen av mdm2 eller dets domene 1-134 ingen innvirkning på cellecyklusen. På den annen side er ekspresjonen av mdm2 og, med en effektivitet, dets domene 1-134, i stand til å bevirke stans av den cellulære cyklus ved Gl indusert av pl07. Dette eksempel viser klart at mdm2 ikke bare er en inhibitor for den transaktiverende aktivitet av p53 men også en positiv cellecyklus-regulator i stand til å inhibere faktorer som er implikert i kontrollen av denne.

I et tilsvarende forsøk blir Saos-2-celler kotransfektert med 1 ug pl07 (385-1068), 8 ug pCMVNeoBam, 1 ug pXJMDM2, 8 ug pXJ41 og 2 ug pCMVCD20. Resultatene av et representativt forsøk er antydet i figur 5. Dette viser at ekspresjonen av mdm2 for å ut-løse blokkering ved Gl indusert av pl07 og av mutanten av delesjonen pl07 (385-1068) som er i stand til å interagere med mdm2.

Eksempel 5: mdm2 interagerer in vitro og in vivo med pl07

Dette eksempel viser at en fysisk interaksjon mellom mdm2 og pl07, in vitro som in vivo. Disse resultater er korrelert med aktiviteten av mdm2 i den cellulære cyklus (eksempel 4).

Eksempel 5. 1. In vitro

pl07 markert på S35 in vitro bringes i kontakt med GST-mdm2 (vektor pGex- mdm2) eller GST- mdm2 (1-177) (vektor pGex- mdm2 (1-177) immobilisert på sefarose gluta-tionkuler. pl07 bundet til mdm2 påvises ved autoradiografi etter polyakrylamidgel. De oppnådde resultater er vist i tabell 2 nedenfor.

Eksempel 5 . 2 . In vivo

Cos-celler kotransfekteres med et plasmid pBC- mdm2 eller pBC- mdm2 (1-134) som uttrykker et fusjonsprotein GST- mdm2 eller GST- mdm2 (1-134), med et ekspresjons-plasmid av pl07 eller en mutant av pl07. Proteinkompleksene GST- mdm2-pl07 som stammer fra totale celle-ekstrakter isoleres på cefarose glutation-kuler og proteinene pl07 påvises ved Western blot med et polyklonalt anti-pl07-antistoff (Santa Cruz pl07-C18). De oppnådde resultater er vist i tabell 2.

Resultatene viser at det er en protein-protein-interaksjon mellom mdm2 og pl07 in vitro men også i cellen. Det området av mdm2 som er nødvendig for cellulær transformasjon (1-134) er områder som interagerer med pl07. Dette området er lokalisert til å befinne seg mer spesielt i en del av "lomme-domenet", regionen "A" og "spacer".

Claims

1. Anvendelse av en forbindelse i stand til å antagonisere i det minste partielt den oncogeniske aktivitet av proteinet mdm2 for fremstilling av et farmasøytisk preparat ment for behandling av cancere ved null p53-kontekst, idet det anvendes en forbindelse i stand til å forbinde seg på nivå med domenet 1-134 av sekvensen av proteinet mdm2, representert ved SEQ ED No. 1.

2. Anvendelse ifølge krav 1 der forbindelsen er et scFV rettet mot domenet 1-134 av proteinet mdm2.

3. Anvendelse ifølge krav 1 der forbindelsen helt eller delvis er representert ved et av peptidene 1-52,1-41,6-41,16-25,18-23 av sekvensen vist ved SEQ ID No. 2 eller et deri-vat derav.

4. Anvendelse ifølge krav 1 der forbindelsen er i stand til å binde seg til et nabo-domene av domenet 1-134 representert ved SEQ ID No. 1 av proteinet mdm2 og fra denne binding påvirker den oncogeniske aktivitet av proteinet.

5. Anvendelse ifølge krav 1 til 4 der forbindelsen interagerer med det C-terminale domenet av proteinet mdm2.

6. Anvendelse ifølge et av kravene 1,4 eller 5 av en transkripsjonen faktor valgt blant TFJJ, TBP og TAF250.

7. Anvendelse ifølge krav 1 eller 4 der forbindelsen interagerer med domenet 135-491 av proteinet mdm2.

8. Anvendelse ifølge krav 1, 4 eller 7 der det helt eller delvis dreier seg om et protein valgt blant proteinene Rb, L5 eller den transkripsjonene faktor E2F.

9. Anvendelse av en scFV rettet mot domenet 1-134 av proteinet mdm2 for fremstilling av et farmasøytisk preparat ment for behandling av cancere.

10. Anvendelse av en nukleinsyre som koder for en forbindelse i stand til å antagonisere den oncogeniske aktivitet av proteinet mdm2 for fremstilling av et farmasøytisk preparat ment for behandling av cancere ved null p53-kontekst, idet det anvendes anti-retningsnukleinsyrer, oligonukleotid-ligander i stand til fiksering direkte til et av domenene av protei net mdm2 og å inhibere dets oncogeniske aktivitet, nukleinsyrer som koder helt eller delvis for peptider eller proteiner i stand til oligomerisering med et av domenene av mdm2 og i stand til å inhibere dets oncogeniske aktivitet, nukleinsyrer som koder for intracellulære antistoffer rettet mot domenet 1-134 av sekvensen av proteinet mdm2 representert ved SEQ ID No. 1.

11. Anvendelse ifølge krav 10 av, som anti-retningsnukleinsyre, en DNA som koder for en komplementær RNA av nukleinsyren som koder for proteinet mdm2 og i stand til å blokkere dets transkripsjon og/eller traduksjon (anti-retnings-RNA) eller et ribosym.

12. Anvendelse ifølge et av kravene 10 og 11 av nukleinsyren i form av kompleksdannet form med DEAE-dekstran, nukleære proteiner eller med lipider eller kanoniske polymerer, i form av liposomer eller også som sådanne.

13. Anvendelse ifølge et av kravene 10 og 11 av en nukleinsyre som del av en vektor.

14. Anvendelse ifølge krav 13 av nukleinsyren som del av en viral vektor valgt blant adénoviruser, retroviruser og adénoassosierte viruser.

15. Viral vektor, karakterisert ved at den omfatter en nukleinsyresekvens som koder for en forbindelse i stand til i det minste partielt å inhibere den oncogeniske aktivitet av proteinet mdm2 ved null p53 kontekst, idet nukleinsyre-sekvensen koder for en scFV eller et peptid i stand til å interagere på nivå med domenet 1 -134 (SEQ DD Nr. 1) av proteinet mdm2.

16. Viral vektor ifølge krav 15, karakterisert ved at den er valgt blant adénoviruser, retroviruser eller adénoassosierte viruser.

17. Viral vektor ifølge krav 15 eller 16, karakterisert ved at den er en adénovirus eller en retrovirus.

18. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse i stand til å inhibere den oncogeniske aktivitet av proteinet mdm2 som angitt i et av kravene 1 til 10 ved null p53 kontekst, idet nukleinsyre-sekvensen koder for en scFV eller et peptid i stand til å interagere på nivå med domenet 1-134 (SEQ DD No. 1) av proteinet mdm2.

19. Farmasøytisk preparat ifølge krav 18, karakterisert ved at de omfatter minst en viral vektor i henhold til et av kravene 12 til 17.

20. Farmasøytisk preparat ifølge krav 19, karakterisert v e d at det er formulert med henblikk på en intratumoral administrering.

21. Anvendelse av en nukleinsyresekvens som koder for intracellulære antistoffer, rettet mot domenet 1-134 (SEQ JD No. 1), av proteinet mdm2 for fremstilling av et farmasøytisk preparat ment for behandling av cancer.